DE60219692T2

DE60219692T2 - Polymorphismen der kationentransporter octn1 und octn2 welche mit entzündlichen darmerkrankungen in zusammenhang stehen

Info

Publication number: DE60219692T2
Application number: DE60219692T
Authority: DE
Inventors: Vanya D. Ellipsis Bio Toronto PELTEKOVA; Richard F. Ellipsis Bio Toronto WINTLE; Laurence A. Ellipsis Bio Toronto RUBIN; Peter H. Toronto ST. GEORGE-HYSLOP; Katherine A. Toronto SIMINOVITCH
Original assignee: Ellipsis Biotherapeutics Corp
Current assignee: Ellipsis Biotherapeutics Corp
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2022-12-21
Also published as: EP1470156A2; ATE360030T1; EP1470156B1; DE60219692D1; US20060105381A1; JP2005526491A; US20040197777A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein die Analyse von biologischem Material. Insbesondere betrifft die Erfindung die diagnostische Analyse für Marker, die mit entzündlichen Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts assoziiert sind, und deren Verwendung für die Entwicklung neuer therapeutischer Behandlungen für entzündliche Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Morbus Crohn (CD) ist ein idiopathischer Zustand, charakterisiert durch chronische, relapsierende intestinale Entzündung, wobei die meisten Patienten Symptome im frühen Erwachsenenalter entwickeln. Es ist eine Untergruppe der entzündlichen Darmerkrankungen (Inflammatory Bowel Diseases; IBD), welche Morbus Crohn, unbestimmte Colitis (indeterminate colitis; IC) und Colitus ulcerosa (UC) umfassen.
Diese Zustände betreffen einen relativ großen Teil der Bevölkerung, mit unterschiedlichen Schätzungen der Prävalenz von etwa 300.000 in Nordamerika. Entzündliche Darmerkrankungen haben hohe ökonomische Auswirkungen mit Kosten, die sich auf Milliarden Dollar belaufen.
Genetische Studien haben das Vorhandensein verschiedener Loci angezeigt, welche gegenüber entzündlichen Darmerkrankungen prädisponieren, wobei die am weitesten replizierten auf den Chromosomen 16 (verursacht durch Mutationen in dem NOD2/CARD15-Gen), 12, 6 und 14 liegen. Ein Locus auf Chromosom 5q31, als IBD5 bezeichnet, welcher zu einer Prädisposition für Morbus Crohn mit frühem Krankheitsbeginn (mit einem Beginn der Krankheit mit 16 Jahren oder früher) führt, wurde von Rioux JD et al., Nature Genet. 29, 223-228 (2001) beschrieben. Dieser Locus ist gekennzeichnet durch einen Risikohaplotyp von 11 Einzelnukleotidpolymorphismen (Single Nucleotide Polymorphismen; SNPs) über einen Bereich von ungefähr 250 kb. Der Bereich enthält eine Mehrzahl von Kandidatengenen, umfassend Gene für organische Kationentransporter (OCTN1/SLC22A4 und OCTN2/SLC22A5), das Gen für ein LIM-Domänen-enthaltendes Protein (RIL/PDLIM3), das Gen für die α2-Untereinheit der Prolin-4-hydroxylase (P4HA2) und ein Gen von unbekannter Funktion (NCBI UniGene identifier Hs.70932).
WO 01/42511 offenbart mehrere Einzelnukleotidpolymorphismen, welche mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert sind. Ein Suszeptibilitätslocus für Morbus Crohn wurde in der 5q31-33-Region identifiziert. Tamai I. et al., FEBS Letters, 419, 107 bis 111 (1997) offenbart die Aminosäuresequenz von OCTN 1. EP 1 020 518 offenbart die Nukleotidsequenzen von cDNAs von humanem OCTN 1 und humanem OCTN 2. EP 1 111 041 offenbart, dass Mutationen im OCTN 2-Gen mit Carnitin-Defizienz assoziiert sind. Nezu J. et al., Nature Genetics, 21, 91-94 (1999) offenbart ebenfalls den Zusammenhang zwischen Mutationen in OCTN 2 und systemischer Carnitin-Defizienz.
Infolge von umfassendem Linkage Disequilibrium (LD) in diesem Bereich ist es zuvor nicht möglich gewesen, die SNP-Karte weiter zu verfeinern und ein einzelnes Suszeptilitätsgen eindeutig zu identifizieren.
So besteht ein Bedarf der Medizin für genetische Marker von Morbus Crohn und für Hinweise für die Verwendung solcher Marker.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zum Diagnostizieren von entzündlichen Darmerkrankungen, unter Verwendung von genetischen Markern, die in schweren Morbus Crohn (CD) mit frühem Krankheitsbeginn impliziert sind. Die Erfindung stellt auch Mutationen der codierenden Sequenz in dem OCTN 1-Gen (dem humanen OCTN 1-Gen, auch bekannt als "Homo sapiens solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 4 (SLC22A4)") zur Verfügung, welche seine Fähigkeit, das organische Kation Carnitin zu transportieren, signifikant vermindern. Die Erfindung stellt des Weiteren Mutationen in dem Promotorbereich von OCTN 2 (dem menschlichen OCTN 2-Gen, auch bekannt als "Homo sapiens solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 5 (SLC22A5)") zur Verfügung, welche sowohl die basale Transkription als auch die durch entweder Hitzeschock oder Arachidonsäure induzierte Transkription herunterregulieren. Dieser Transkriptionsunterschied ist offenbar ausgelöst durch die Störung einer Bindungsstelle für Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1). Die Erfindung stellt des weiteren einen Haplotyp dieser zwei Mutationen in Kombination zur Verfügung. Die beiden Gene, OCTN 1 und OCTN 2, zeigen signifikante Herunterregulation in entzündetem Morbus Crohn-Gewebe.
Die identifizierten OCTN 1- und OCTN 2-Sequenzvariationen sind von diagnostischem und pharmakogenetischem Nutzen und zeigen einen molekularen Pathway, der mit der Krankheit zusammenhängt, welcher als Ziel für therapeutische Interventionen dienen kann. Die OCTN 1- und OCTN 2-Gene sind in entzündetem und nicht entzündetem Darmgewebe von CD-Patienten differenziell exprimiert. Beide Gene enthalten Krankheits-assoziierte DNA-Sequenzvariationen (Polymorphismen). Die identifizierten Polynukleotidpolymorphismen sind somit die Basis für einen diagnostischen und prognostischen Test, der die Empfindlichkeit gegenüber entzündlichen Darmerkrankungen in bestimmten Individuen beschreibt. Die Erfindung stellt auch die Identifizierung und Verwendung dieser Polynukleotide und codierter Polypeptidsequenzen als Ziele für die Entwicklung von therapeutischen Verbindungen zur Verfügung, die bei der Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen und Entzündung im Allgemeinen nützlich sein sollen.
Die Erfindung stellt auch ein Modell für Morbus Crohn zur Verfügung, worin die kombinierten Effekte dieser beiden Mutationen in einem insgesamt schlechten Carnitin-Transport resultieren, insbesondere als Antwort auf Entzündung. Da Carnitin ein Cofaktor ist, der für die Aufnahme von langkettigen Fettsäuren in die Mitochrondrien für die anschließende β-Oxidation benötigt wird, führt der Effekt dieses Mutationshaplotyps zu metabolischem Stress, welcher zur entzündlichen Schädigung des Gastrointestinaltraktgewebes in Morbus Crohn-Patienten beiträgt. Zusätzlich stellt die Erfindung Hinweise auf eine Assoziation zwischen OCTN 1- und OCTN 2-Genen und allgemeinen entzündlichen Antworten zur Verfügung. Dieses Modell stellt die Basis für die therapeutische Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen zur Verfügung. Die Erfindung stellt auch ein Modell für Morbus Crohn zur Verfügung, worin der Effekt von Mutationen in OCTN 1 in einem insgesamt schlechten Efflux von Molekülen aus der Zelle resultiert. Diese Moleküle können toxische Metaboliten, bakterielle Endotoxine, Xenobiotika, pharmazeutische Verbindungen, die verwendet werden, um Entzündung zu behandeln, oder freie Radikale umfassen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Set von Northern-Blots, die eine differenzielle Expression von OCTN 1 und OCTN 2 in entzündetem Gewebe zeigen. Auf der linken Seite von 1 werden Northern-Blots gezeigt, mit OCTN 1, OCTN 2 oder GAPDH als Sonde. Säulen der relativen optischen Dichte (normalisiert auf GAPDH), korrespondierend zur Expression von OCTN 1- (rechte Seiten, oben) oder OCTN 2-Expression (rechte Seite, unten) sind auf der rechten Seite gezeigt, mit dem Wert ± Standardfehler des Mittelwerts auf der Säule aufgetragen. p-Werte der Signifikanz werden oberhalb der Säulen gezeigt, die zu entzündlichem Gewebe korrespondieren. HC: normaler menschlicher Darm. J: Jurkat-T-Zell-Leukämiezellen. UC-N: nicht entzündetes Gewebe von einem Colitis ulcerosa-Patienten. UC-I: entzündetes Gewebe von einem Colitis ulcerosa-Patienten. CD-N: nicht entzündetes Gewebe von einem Morbus Crohn-Patienten. CD-I: entzündetes Gewebe von einem Morbus Crohn-Patienten.
2 ist ein Satz von Säulendiagrammen, die zeigen, dass eine G-207C-Mutation in dem Hitzeschock-Enhancer (HSE) der Promotorregion des OCTN 2-Gens in einer Herunterregulation des Luciferase-Reportergens unter Hitzeschock und Arachidonatbehandlung resultiert. HeLa-Zellen, die mit Konstrukten transfiziert wurden, enthaltend das Luciferase-Reportergen, fusioniert an die 2,7-kb-Region des OCTN 2-Promoters mit Wildtyp (G-207) oder mutierten (G-207C)-Allelen. Die relative Lumineszenz der transfizierten OCTN 2-Promotorkonstrukte wurde in unbehandelten Kontrollzellen gemessen (37°C), und in Zellen, die einem Standard-Hitzeschock (42°C), oder 20 μM Arachidonsäure (Arachidonat) ausgesetzt wurden. Die Werte sind der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken sind der SEM (Standardfehler vom Mittelwert). G: Nicht-Risikoallel an Position –207 des OCTN 2-Promotors; C: Risikoallel.
3 ist ein Satz an Säulendiagrammen, die den Carnitin-Transport von menschlichen HeLa-Zellen (3A) und menschlichen OCTN 2-defizienten Zelllinien (3B), transfiziert mit OCTN 1-cDNA mit L503 oder dem mutierten L1503F-Allel, zeigen. Zellen, die mit dem pcDNA3-Vektor allein transfiziert wurden, dienten als Kontrolle. Die Aufnahme von [³H]-Carnitin (20 nM) wurde bei pH 7,5 in einem Medium, enthaltend NaCl, gemessen. Carnitin-Aufnahme wurde berechnet als cpm/mg Protein/min, Werte wurden korrigiert für Transfektionseffizienz, und die Aufnahme wurde in Bezug auf den Wert der scheintransfizierten Zellen normalisiert. Die Punkte sind Mittelwerte ± Standardfehler von drei (3A) bis sechs (3B) Bestimmungen in drei (3A) oder zwei (3B) unabhängigen Experimenten.
4 ist ein Satz an Säulendiagrammen, die den TEA-Efflux der mutierten 503F- und Wildtyp-503L-Varianten von OCTN 1 zeigen. Die intrazelluläre Zurückhaltung von radiomarkiertem TEA wird als ein Prozentsatz der maximal zurückgehaltenen Menge bei Zeit Null gezeigt. OCTN 1-F: L503F-Variante von OCTN 1. OCTN 1-L: Wildtyp-503L-Variante von OCTN 1. Die Punkte sind Mittelwerte ± Standardfehler von drei Bestimmungen.
5 ist ein Satz an Säulendiagrammen, der die Luciferase-Aktivitäten des pRL-null-Vektors, enthaltend 2,7 kb OCTN 2-Promotorregion, zeigt.
6 zeigt die genomische DNA-Sequenz, umfassend das OCTN-2-Gen. Die Bereiche der Exons sind gelb hervorgehoben. Die Bereiche der Primersequenzen, die verwendet wurden, sind in grün hervorgehoben (beachte, dass der O2X1F-Primer innerhalb Exon 1 gelegen ist, und der O2X1R das Rückwärts-Komplement der gezeigten Sequenz darstellt). Start- und Stopp-Codons der codierenden Sequenz sind in rot hervorgehoben. Mutationen innerhalb der 5'-Region des Gens sind hervorgehoben und mit Standard-DNA-Nomenklatur für polymorphe Basen gezeigt, d.h., "K" bedeutet G oder T, "Y" bedeutet C oder T, "R" bedeutet A oder G, und "S" bedeutet C oder G.
7 zeigt in graphischer Form das Expressionsniveau des OCTN2-Gens, ausgedrückt als relative optische Dichte ("ROD") des autoradiographischen Signals des OCTN 2-Gens im Vergleich zu dem Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasegen (GAPDH). Blaue Säulen stellen die Expressionsniveaus von RNA, extrahiert aus chirurgisch entferntem nicht entzündetem Gastrointestinal-(GI)-Traktgewebe dar, und rote Säulen stellen die Expressionslevel von RNA, extrahiert aus chirurgisch entferntem entzündetem GI-Traktgewebe dar. Individuelle RNA-Proben werden unter den Säulen mit einer einzigartigen Identifizierungsnummer (z.B. 7403) und der Diagnose des Patienten ("UC" für Colitis ulcerosa, "CD" für Morbus Crohn) identifiziert. Gesunde Kontrollproben sind als "HC männlich" und "HC weiblich) bezeichnet und sind von Individuen ohne entzündliche Darmerkrankung. 7A-D zeigen jeweils Daten eines einzelnen "Northern Blots" (d.h. eines DNA:RNA-Hybridisierungsexperiments); für jeden Blot sind individuelle Probenergebnisse in dem oberen Paneel dargestellt, und der Durchschnitt der Ergebnisse für entzündete und nicht entzündete Proben wird in dem unteren Paneel gezeigt. In dem unteren Paneel ist jedes Säule mit dem Durchschnittswert und Standardfehler der Mittelwerte (SEM) bezeichnet. Statistische p-Werte sind in dem unteren Paneel ebenso dargestellt. 7E zeigt individuelle Probenergebnisse für Paare von entzündeten und nicht entzündeten Gewebeproben von dem gleichen Individuum. Die individuellen Identifizierungsnummern und Diagnosen, Werte und Standardfehler sind wie in 5A-F angezeigt, zeigt die gemittelten Ergebnisse für alle betroffenen und nicht betroffenen Proben. Individuelle Identifizierungsnummern und Diagnosen, Werte und Standardfehler sind angezeigt, wie in 7A-D gezeigt.
8 zeigt die genomische DNA-Sequenz, umfassend das OCTN 1-Gen. Die Positionen von Exons sind in gelb hervorgehoben. Die Positionen von Oligonukleotid-Primersequenzen, die verwendet wurden, sind in grün hervorgehoben (Merke, dass der O1X9R-Primer das Rückwärts-Komplement der gezeigten Sequenz ist). Start- und Stopp-Codons der codierenden Sequenz sind in rot hervorgehoben. Die Mutation im Exon 9 des Gens ist hervorgehoben und wird in der Standard-DNA-Nomenklatur für polymorphe Basen gezeigt, d.h. "Y" bedeutet C oder T.
9 zeigt die Aminosäuresequenz, wie sie von bekannten mRNA-Sequenzen für OCTN 1 bestimmt wurde. Jeder Buchstabe stellt eine einzelne Aminosäure dar, wie durch Standard-Nomenklatur definiert. Die Position der geänderten Aminosäure, die verursacht wird durch die OCTN 1-Exon 9-Mutation wird als "(L/F)" gezeigt, was bedeutet, dass, wo in der genomischen DNA das "C"-Allel präsent ist, Leucin ("L") die korrespondierende Aminosäure in dem OCTN 1-Protein ist, und wo in der genomischen DNA das "T"-Allel vorhanden ist, Phenylalanin ("F") die korrespondierende Aminosäure in dem OCTN 1-Protein ist.
10 zeigt in graphischer Form das Expressionsniveau des OCTN 1-Gens, ausgedrückt als relative optische Dichte ("ROD") des autoradiographischen Signals des OCTN 1-Gens im Vergleich zu dem Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-(GAPDH)-Gen. Blaue Säulen stellen Expressionsniveaus von RNA, extrahiert aus chirurgisch entferntem nicht entzündetem GI-Traktgewebe, dar, und rote Säulen stellen Expressionsniveaus für RNA, extrahiert aus chirurgisch entferntem entzündetem GI-Traktgewebe, dar. Individuelle RNA-Proben werden unter den Säulen mit einer einzigartigen Identifizierungsnummer (z.B. 7403) und der Diagnose des Patienten ("UC" für Colitis ulcerosa, "CD" für Morbus Crohn) identifiziert. Nicht betroffene Kontrollproben werden als "HC männlich" und "HC weiblich" bezeichnet und sind von Individuen ohne entzündliche Darmerkrankung. 10A-C zeigen jeweils Daten von einem einzelnen "Northern Blot" (d.h. DNA:RNA-Hybridisierungsresultate); für jeden Blot sind individuelle Probenergebnisse in dem oberen Paneel dargestellt, und der Durchschnitt der Ergebnisse für entzündete und nicht entzündete Proben wird in dem unteren Paneel gezeigt. In dem unteren Paneel ist jedes Säule mit dem Durchschnittswert und Standardfehler der Mittelwerte (SEM) bezeichnet. Statistische p-Werte sind in dem unteren Paneel ebenso dargestellt. 10D zeigt individuelle Probenergebnisse für Paare von entzündeten und nicht entzündeten Gewebeproben von dem gleichen Individuum. Die individuellen Identifizierungsnummern und Diagnosen sind wie in 10A-C gezeigt. 10E zeigt die gemittelten Ergebnisse für alle betroffenen und nicht betroffenen Proben. Individuelle Identifizierungsnummern und Diagnosen, Werte und Standardfehler sind angezeigt, wie in 10A-C gezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zusammenfassung. Eine funktionelle Analyse und ein detailliertes Mutations-Screening von Kandidatengenen wurde in der 250 kb-Region von Chromosom 5q31 durchgeführt, beschrieben von Rioux JD et al., Nature Genet. 29, 223-228 (2001). Es wurden auch die Gene in der Region auf Expressionsniveauunterschiede in entzündetem und nicht entzündetem Gastrointestinal-(GI)-Traktgewebe von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen untersucht. Zwei Gene, OCTN 1 (SEQ ID NO: 1) und OCTN 2 (SEQ ID NO: 3), zeigten signifikante Herunterregulation in entzündetem Morbus Crohn-Gewebe. Eine Mutation der codierenden Sequenz in dem OCTN 1-Gen, welche deren Fähigkeit, das organische Kation Carnitin und das prototypische organische Kationensubstrat Tetraethylammonium (TEA) zu transportieren, signifikant reduziert, wurde detektiert. Zusätzlich wurde gefunden, dass eine Mutation in der Promotorregion von OCTN 2 sowohl die basale Transkription als auch die Transkription, induziert durch entweder Hitzeschock oder Arachidonsäure, herunterreguliert. Dieser Transkriptionsunterschied ist offenbar eine Folge der Unterbrechung der Bindungsstelle für den Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1).
Mutationsdetektion. Für die Detektion und Analyse von Mutationen wurde bidirektionales Sequenzieren von Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizierten Exons der OCTN 1- und OCTN 2-Gene durchgeführt auf ABI 377 oder 3700 Sequenzern. Die detektierten Mutationen wurden durch visuelle Inspektion von sowohl Vorwärts- als auch Rückwärts-Elektropherogrammen verifiziert. PCR-Primer für genomische DNA wurden auf der Basis der genomischen Sequenzen von menschlichem OCTN 1 und OCTN 2 entworfen, wie in GenBank (Loci AC008599 und AC004628 auf Chromosom 5q) berichtet. Primer waren ~ 60 bp Upstream oder Downstream von jedem Exon, was das Sequenzieren der Spleißdonor- und Spleißakzeptorsequenzen und der Lariat-Abzweigungsstelle ermöglicht. Im Fall der OCTN 2-Promotorregion, PCR-Amplifikation eines 1,3 kb-Fragments unter Verwendung von PCR-Primern, wurden zwei Primer, OCTN 2-Vorwärts-Promotor (O2PF): 5'-CTGCACGGAAATAACTAATCTGTG-3' (SEQ ID NO: 5) und OCTN 2-Rückwärts-Promotor (O2PR): 5'-GAGAGGAGCTCGGGTTCAAG-3' (SEQ ID NO: 6) verwendet. PCR wurde unter Verwendung des PCRx-Enhancer-Systems (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA) durchgeführt unter Hinzufügen einer 1× Endkonzentration der PCRx-Enhancer-Lösung, um der GC-reichen Natur dieser Region zu begegnen, und mit Platinum Taq High Fidelity DNA-Polymerase (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA). Das PCR-Protokoll umfasst 30 Zyklen von 94°C (für 40 s), 54°C (für 1 min) und 72°C (für 2 min) mit einer 5-min-Extension bei 98°C im ersten Zyklus und einer 10-min-Extension bei 72°C im letzten Zyklus.
SNP-Risiko-Haplotypen wurden bestimmt anhand von Daten zuvor durch Rioux JD et al., Nature Genet. 29: 223-228 (2001) beschriebener SNP und OCTN 1- und OCTN 2-Mutationsdaten wurden mit SNP-Haplotypen durch visuelle Inspektion von Stammbäumen in Phase gebracht. Signifikanzniveaus für Allelfrequenzunterschiede zwischen den Gruppen (siehe Tabelle 1, nachfolgend) wurden anhand einer zwei mal zwei chi-squared-Kontingenztabelle berechnet. Relative Risikoberechnung (formal, Wahrscheinlichkeitsverhältnisse) wurden berechnet wie von Bland JM & Altmann DG, BMJ 320:1468 (2000) beschrieben.
Mutationen wurden ursprünglich durch Sequenzieren von Exons detektiert, Spleiß-Junktions und Promotorregionen der OCTN 1- und OCTN 2-Gene von einem Paneel von 16 nicht verwandten Patienten, die entweder heterozygot oder homozygot für den Morbus Crohn-SNP-Risikohaplotyp bei 5q31 waren.
Zwei Mutationen, die mit dem SNP-Risiko-Haplotyp co-segregierten, wurden identifiziert, ein C nach T Austausch in Exon 9 von OCTN 1, welcher den Leucinrest an Position 503 zu Phenylalanin verändert (L503F; SEQ ID NO: 7), und einen G nach C Austausch 207 bp 5' des Start-Codons von OCTN 2 (G-207C; SEQ ID NO: 8). Die G-207C-Mutation verändert eine Consensus-Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1)-Bindungsstelle. Sequenzierung der anderen Kandidatengene in der Region zeigte keinerlei Mutationen, die beständig auf dem Risikohaplotyp-Hintergrund gefunden wurden.
Wir sequenzierten dann Exon 9 von OCTN 1 und die Promotorregion von OCTN 2 in Individuen von 46 Familien, die für die vorangehende SNP-Analyse verwendet worden waren, Rioux JD et al., Nature Gent. 29, 223-228 (2001). Einundvierzig dieser Familien segregieren zumindest eine Kopie des SNP-Haplotyps, und fünf segregieren keine Kopien dieses Haplotyps. Untersuchung der SNP-Haplotypen in nicht verwandten Kindern dieser Familien zeigte, dass der zuvor definierte SNP-Risikohaplotyp immer sowohl die Phenylalaninvariante von L503F und das C-Allel von G-207 trug.
Als Nächstes genotypisierten wir diese zwei Mutationen in einem Paneel von gesunden Kontrollen, und in einem Paneel von Patienten, von denen bekannt war, dass sie keine Kopien des SNP-Risiko-Haplotyps trugen. Die L503F-(SEQ ID NO: 7) und G-2070-(SEQ ID NO: 8) Mutantenallele waren signifikant häufiger in nicht verwandten Patienten aus diesen Familien als in gesunden Kontrollen, und sie wurden beinahe niemals in Patienten gefunden, die homozygot für den Nicht-Risiko-Haplotyp waren (nur ein L503F-Allel in 25 Patienten (50 Chromosomen) und ein G-207C-Allel in 16 Patienten (32 Chromosomen). Allelfrequenzen in der Kontrollgruppe wichen nicht von dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ab. Allelfrequenzen werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Allelfrequenzen von OCTN 1- und OCTN 2-Mutationen
Die Anzahl von Chromosomen wird für jedes Allel gezeigt, und das Signifikanzniveau für den Unterschied zur gesunden Kontrollgruppe wird für die zwei Morbus Crohn-Patientengruppen gezeigt.
Wahrscheinlichkeitsverhältnisse für Morbus Crohn Suszeptibilität werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Relatives Risiko für Morbus Crohn
Northern-Blot-Analyse. Northern-Blot-Analyse von RNA aus Gastrointestinaltraktgewebe von Colitis ulcerosa und Morbus Crohn-Patienten zeigte eine signifikante Herunterregulation von sowohl OCTN 1 und OCTN 2 in aktiv entzündetem Gewebe im Vergleich zu nicht entzündetem Gewebe. Um in Bezug auf die Variabilität in den Expressionsniveaus zwischen Individuen zu kontrollieren, untersuchten wir auch gematchte entzündete und nicht entzündete Gewebeprobenpaare von demselben Patient. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl OCTN 1 und OCTN 2 in entzündetem Gewebe eine signifikante Herunterregulation zeigten. Siehe 1.
Chirurgische Gewebeproben wurden von Patienten erhalten, an denen geplante Operationen für entweder Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa durchgeführt wurden. Die ethische Genehmigung und informierte Zustimmung wurden vor der Probenentnahme erhalten. Proben wurden in RNAlater (Ambion) vor der RNA-Extraktion konserviert. Ein angrenzender Gewebeschnitt wurde für eine Standard-pathologische Untersuchung verwendet, um die Diagnose (Morbus Crohn, UC), den Bereich des Gastrointestinaltrakts und den Status (entzündet, nicht entzündet) des Gewebes zu verifizieren. Kontroll-Colon-RNA von nicht betroffenen Individuen wurde von Clontech erworben. Gesamt-RNA wurde aus dem Gewebe unter Verwendung von Trizol (Gibco BRL) extrahiert. RNA-Proben (15 μg pro Bahn) wurden in einem denaturierenden Gel mit 1% Agarose und 3,7% Formaldehyd aufgetrennt, transferiert auf MSI-Nylontransfermembran (Osmonics Laboratory Products) und vernetzt mit Ultraviolettbestrahlung.
Die Membranen wurden mit ³²P-markierten komplementären Sonden für OCTN 1 und OCTN 2 hybridisiert. OCTN 1-Transkripte wurden detektiert mit einem 0,8-kb NotI/EcoRI-Fragment von OCTN 1 (ResGen), enthaltend den 5'-Teil der codierenden Region des menschlichen OCTN 1-Gens. OCTN 2-Transkripte wurden detektiert mit einem 2,2 kb NotI/SalI-Fragment von OCTN 1 (ResGen), enthaltend den 3'-Teil der codierenden Region des menschlichen OCTN 1-Gens. Die Sonden wurden radiomarkiert mit [α³²P]-dCTP unter Verwendung von Zufallspriming (Roche Diagnostics GmbH). Die nicht inkorporierten radiomarkierten Nukleotide wurden durch eine ProbeQuant G-50 Mikrosäule (Amersham Pharmacia Biotech) entfernt. Die Northern-Blots, enthaltend Gesamt-RNA von menschlichen Geweben wurden in einer QuickHyb-Hybrisisierungslösung (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) bei 68°C für 2 Stunden hybridisiert. Die Blots wurden dann zweimal in 2 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, bei Raumtemperatur für 15 Minuten und einmal bei 60°C für 30 Minuten mit 0,1 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, gewaschen.
Densitometrie der Northern-Blots wurde durchgeführt unter Verwendung der Scion Imaging Software (Scion Corporation), normalisiert auf G3PDH, und ausgedrückt als relative optische Dichteeinheiten. Daten wurden analysiert mit GraphPad Prism.
Gewebeexpressionsanalyse. Für die Expressionsanalyse wurde RT-PCR für mehrere Gewebeexpressionspaneele (Clontech) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Erst-Strang-cDNA-Präparationen aus menschlichem Gastrointestinal-(GI)-Trakt und aus menschlichem Immunsystem, normalisiert gegen verschiedene Haushaltsgene, wurde verwendet, um die Gewebespezifität und relative Häufigkeit von OCTN 1- und OCTN 2-mRNA zu untersuchen. 5 μl (0,2 ng/μl) von jeder cDNA wurden als Vorlage für RT-PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern verwendet.
Für OCTN 1 war der Vorwärtsprimer 5'-ACCATCGCCAACTTCTCGGC-3' (SEQ ID NO: 9) und der Rückwärtsprimer war 5'-CTTTCTGCTGCTTCAGGGGA-3' (SEQ ID NO. 10).
Für OCTN 2 war der Vorwärtsprimer 5'-CCATCGCCAACTTCTCGG-3' (SEQ ID NO: 11) und der Rückwärtsprimer war 5'-AATGTTGTGGGACTGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 12).
Nach 32 Zyklen wurden 5 μl Probe jedes PCR-Produkts auf einem 2%igen Agarose/Ethidiumbromidgel laufen gelassen. G3PDH PCR-Primer und eine Kontroll-cDNA wurden als positive Kontrollen verwendet.
RT-PCR-Expressionsanalyse von mehreren Gewebepaneelen des Gastrointestinal-(GI)-Trakts und des Immunsystems von gesunden Kontrollindividuen zeigten weit verbreitete niedrige Niveaus von Expression von OCTN 1 und OCTN 2, wobei OCTN 1 am höchsten war in dem aufsteigenden Colon und fötaler Leber, und OCTN 2 am höchsten im Colon und der Plazenta. RT-PCR-Ergebnisse werden in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3 RT-PCR-Expressionsanalyse von OCTN 1 and OCTN 2
Transiente Expression von OCTN 1 (Transporterassays) und OCTN 2 (Luciferase-Promotorassays). Für die transiente Expression des Wildtyps oder der Mutante (L503F; SEQ ID NO: 7) wurden HeLa-Zellen einer Dichte von 1,5 × 10⁶ - 10⁵ Zellen/Gefäß in 100-mm Kunststoffkulturgefäßen ausplattiert (Falcon), und Carnitin-defiziente menschliche Fibroblasten (GM 10665) wurden bei einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/Well in 6-Wellkunststoffkulturgefäßen (Falcon) 24 h vor der Transfektion mit LipofectAMINE PLUS^TM-Reagenz (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA), wie vom Hersteller empfohlen, ausplattiert.
Für die HeLa-Zellkultur wurden menschliche HeLa-Zellen in D-MEM kultiviert, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Für die Kultur von Carnitin-defizienten menschlichen Fibroblasten von einem Patienten mit einer primären Carnitin-Defizienz, beschrieben durch Scaglia F. et al, Genet. Med. 1,34-39 (1998) (siehe Beschreibung des Patienten GM 10665 in dem Katalog des National Institute of General Medical Sciences) wurden erhalten von dem National Institute of General Medical Sciences Human Genetic Mutant Cell Repository, Coriell Cell Repositories (Camden, New Jersey, USA). Fibroblasten wurden kultiviert in D-MEM, supplementiert mit 15% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin und einer einfachen Konzentration von nicht-essentiellen Aminosäuren. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C bei einer Mischung von 5 CO2 und 95% Luft kultiviert.
Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Medien entfernt und durch Earle's ausgewogene Salzlösung (Earle's balanced salt solution) ersetzt, enthaltend D-Glucose (5,5 mM) und supplementiert mit 0,5% BSA.
Für die OCTN 1-Transporterassays wurden Carnitin-Transportmessungen bei Raumtemperatur unter Verwendung von L-[3H]Carnitin als Substrat durchgeführt (spezifische Aktivität 81 Ci/mmol, Moravek Biochemicals Inc.). Der Transportpuffer war zusammengesetzt aus 25 mM HEPES/Tris, pH 7,5, supplementiert mit 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgSO₄ und 5 mM Glucose. Das Transportmedium, enthaltend das radiomarkierte Carnitin wurde präinkubiert bei 37°C und dann zu den Zellen hinzugefügt. Nach Inkubation für 30 Minuten bei 37°C wurde der Transport beendet durch Aufsaugen des Puffers, gefolgt durch vier Waschungen mit eiskaltem Transportpuffer. Die Zellen wurden dann mit einem Zellkulturlysereagenz (Promega) solubilisiert, und die damit assoziierte Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeitsszintillationszähler quantifiziert. Zellulärer Proteingehalt wurde gemäß der Bicinchoninsäure-Methode von PK Smith et al., Anal. Biochem. 150: 76-85 (1985) bestimmt, unter Verwendung des BCA-Standardproteinassayreagenzkits (Pierce). Um die Transfektionseffizienz zu normalisieren, wurden Zellen mit 20-fach geringerer Konzentration eines Feuerkäufer-Luciferaseplasmid-pGL3-P-Vektor co-transfiziert. Die Luciferaseaktivität wurde auf einem manuellen Luminometer (Lumat LB 9501, Berthold) gemessen. Zellen, die unter vergleichbaren Bedingungen mit einem leeren Vektor transfiziert wurden, dienten als Kontrolle. Alle Untersuchungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
Für die OCTN 2-Luciferase-Promotorassays wurde ein Dual-Luciferase-Reporterassaysystem (Promega) verwendet, um die Auswirkung der Mutation der OCTN 2-Promotorregion zu untersuchen. Die OCTN 2-Promotor-Luciferasereportergen-Konstrukte wurden durch PCR-Amplifikation von ungefähr 2,7 kb OCTN 2-Promotorfragmenten unter Verwendung genomischer DNA von einem Patienten erzeugt, der homozygot für das G-Allel war als Vorlage und Ligieren in die BglII/MluI-Stelle des promotorlosen Luciferasevektors pRL-null (Promega), der die Luciferase von Renilla reniformis als Report verwendet. Als PCR-Primer wurden zwei Primer, OCTN 2-BglII:
5'-GAAGATCTTGGAAGGCTCAGGTGGGAGG-3' (SEQ ID NO: 13) und OCTN 2-MluI: 5'-CGACGCGTGGCAGCAGGCGACCCAAGAC-3' (SEG ID NO: 14) verwendet. PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des PCRx-Enhancersystems (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA) unter Hinzufügen einer einfachen Endkonzentration der PCRx-Enhancer-Lösung und mit Platinum Taq High Fidelity-DNA-Polymerase (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA), gemäß einem Standardprotokoll mit 30 Zyklen bei 94°C (für 4 0 Sekunden), 61°C (für 1 Minute) und 72°C (für 3 Minuten) mit einer 5-minütigen Verlängerung bei 98°C im ersten Zyklus und einer 10-minütigen Verlängerung bei 72°C im letzten Zyklus.
Das mutante C-Konstrukt wurde dann erzeugt durch Ersetzen des 600 bp-Fragments, umfassend die Position –207 durch Verdau mit EcoNI/NdeI, gefolgt von Ligieren des korrespondierenden Fragments, amplifiziert aus einem Patienten, der homozygot für das C-Allel war.
Die Konstrukte wurden komplett sequenziert, um die Möglichkeit von PCR-induzierten Fehlern auszuschließen.
Um die Aktivität der experimentellen Reporter zu normalisieren, wurden Konstrukte mit 20-fach weniger Feuerkäfer-Luciferase-Plasmid pGL3-P als eine interne Kontrolle mit LipofectAMINE PLUS^TM-Reagenz (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA) entsprechend dem Protokoll des Herstellers co-transfiziert in HeLa-Zellen. 24 Stunden nach der Transfektion wurden HeLa-Zellen, die einer Arachidonatbehandlung unterworfen worden waren, für 6 Stunden in serumfreiem Medium ausgehungert. Nach dem Aushungern wurden die Zellen bei 37°C mit 20 μM Arachidonat für 30 Minuten behandelt, gefolgt durch 2× Waschen mit PBS. Kontrollzellen wurden mit einer entsprechenden Konzentration von Ethanol behandelt. Danach wurden die Zellen in komplettem Medium in einen Inkubator für zusätzlich 18 Stunden gestellt. Zellen, die 24 Stunden nach der Transfektion hitzegeschockt wurden, wurden bei 42°C für 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann in den 37°C-Inkubator für zusätzliche 18 Stunden zurückgestellt. Die Lumineszenz von (Renilla luciferase-Reaktion ("experimenteller" Reporter α:) wurde gleichzeitig gemessen mit der Aktivität der Feuerkäfer-Luciferase ("Kontroll"-Reporter) unter Verwendung des Dual-Luciferase-Reporterassaysystems (Promega). Es wurde ein manuelles Luminometer (Lumat LB 9501, Berthold) verwendet. Zellen, die unter ähnlichen Bedingungen mit dem leeren Vektor transfiziert worden waren, dienten als Kontrolle. Alle Untersuchungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
Die Transfektion des Luciferase-Konstrukts mit dem C-Allel der G-207C-Mutation eines 2,7 kb-Fragments des OCTN 2-Promotors in HeLa-Zellen resultierte in einer durchschnittlichen 2,8-fachen Abnahme an basaler Expression im Vergleich mit dem Wildtyp (G)-Allel. Transfektion nach dem Hitzeschock bei 42°C resultierte in einer 3,1-fachen Reduktion der Hitzeschock-induzierten Expression. Transfektion nach Bedingung mit 20 μM Arachidonsäure bei 37°C resultierte ebenso in einer 3,3-fach verringerten Expression im Vergleich zu den Arachidonat-induzierten Niveaus. Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
Für OCTN 2-Gel-Shift-Assays wurden menschliche HeLa-Zellen in D-MEM, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamat, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin bei 37°C in T-75-Gewebekulturfläschchen (Sarstedt) kultiviert. Hitze-geschockte Zellen wurden hergestellt durch Inkubieren der Fläschchen in einem Gewebekulturinkubator bei 42°C für 3 Stunden. Für das Arachidonatexperiment wurden am Tag zuvor die HeLa-Zellen in serumfreiem D-MEM über Nacht ausgehungert. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann für 30 Minuten mit 20 mM Arachidonat bei 37°C behandelt. Die Arbeitskonzentrationen wurden aus Natriumarachidonat (Sigma) hergestellt und in kaltem absolutem Ethanol als 100 mM Vorratslösung gelagert. Kontrollzellen wurden mit einer entsprechenden Konzentration von Ethanol behandelt. Nukleäre Extrakte wurden durch NP-40-basierte Fraktioniert hergestellt. Diese Prozedur ist eine Abänderung der Prozedur, die beschrieben wird durch R. Baler, G. Dahl R. Voellmy, Mol. Cell. Biol. 13: 2486-2496 (1993). Kurz gesagt wurden 2,5 × 10⁶ Zellen pelletiert, zweimal in 1 × PBS gewaschen und resuspendiert in 1 ml Niedrigsalzpuffer (A), enthaltend 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Die Nuklei wurden durch Zentrifugation bei 7000 g für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet (die unaufgereinigten Nuklei) wurden in 50 μl Hochsalzpuffer (B), enthalten 20 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 20% Glycerin, 300 mM NaCl, 0,5 mM PMSF, resuspendiert. Nach Inkubation für 15 Minuten bei 4°C wurde die Probe für 5 Sekunden ultrabeschallt, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert, und die resultierenden Extrakte waren die nukleäre Fraktion. Die nukleären Extrakte wurden bei –80°C gelagert. Die Proteinkonzentration der Extrakte wurde unter Verwendung des Bradford-Assays (BioRad) gemessen.
Für Gelmobilitäts-Shift-Assays (EMSA) wurden die Bindungsreaktionen in einem 20 μl Volumen ausgeführt, enthaltend 10 μg des nukleären Extrakts, 0,5 ng ³²P-markierte Oligonukleotidsonde, 1 μg poly(dI-dC) und 10 μg BSA, in 10 mM Tris HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5% Glycerin für 2 Stunden auf Eis. Die Antikörper-Supershift-Experimente wurden durchgeführt durch Inkubieren von 2 μl von HSF1- und HSF2-Antikörpern (TransCruz^TM Gel-Supershift-Antikörper), vor dem Hinzufügen der markierten Sonden. Für die Kompetitionsexperimente wurde ein 100-facher molarer Überschuss der nicht markierten Oligonukleotide zu jeder Reaktion hinzugefügt. Die Kompetitoren, die als positive Kontrollen verwendet wurden, waren wie folgt:
WT-OCTN 2 (P)-Antisense: 5'-CAGGCCCGGAACCTTCCCTGGTCGT-3' (SEQ ID NO: 15); WT-OCTN 2 (P)-Sense:
5'-ACGACCAGGGAAGGTTCCGGGCCTG-3' (SEQ ID NO: 16); mutiertes OCTN 2 (P)-Antisense: 5'-CAGGCCCGCAACCTTCCCTGGTCGT-3' (SEQ ID NO: 17); und mutiertes OCTN 2 (P)-Sense:
5'-ACGACCAGGGAAGGTTGCGGGCCTG-3' (SEQ ID NO: 18).
Das Design der Oligonukleotide für typische HSE für humanes HSP70 war wie folgt: Sense 5'-TCGGCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCGA-3' (SEQ ID NO. 19 und Antisense: 5'-TCGGCTGCCAGGTCGGGAATATTCCAGCCGA-3' (SEQ ID NO: 20).
Die Reaktionsprodukte wurden elektrophoretisch getrennt auf einem 4%igen Polyacrylamidgel für 3 h bei 200 V, getrocknet und ein Film exponiert und durch Autoradiographie nachgewiesen.
Gel-Shift-Assays der Region, die die OCTN2 G-207C-Promotormutation umgibt, zeigten eine spezifische Interaktion zwischen einem nukleären Faktor und einem Oligonukleotid, enthaltend die Region, umgebend das Wildtyp-G-Allel. Bindung an dieses Oligo war spezifisch, insoweit als es kompetitiert werden konnte durch einen Überschuss an Wildtyp-Oligo, aber nicht durch ein Oligo, enthaltend das mutierte C-Allel, noch durch ein zufällig ausgewähltes Kontroll-Oligo ohne Bezug zu dem OCTN 2-Promotor. Die Bindung dieses Faktors wurde induziert nach Inkubation bei 42°C und Arachidonsäure, aber nicht bei 37°C und war identisch in Bezug auf die Mobilität zu einem Faktor, welcher an ein Oligo bindet, das zu dem Hitzestresselement (HSE) des HSP70-Gens korrespondiert. Bindung an das G-Allel des OCTN 2-Promotors wurde auch kompetitiv beeinflusst durch einen Überschuss an HSP70 HSE-Oligo, was weiter nahe legt, dass der Faktor ein Hitzeschocktranskriptionsfaktor war. Da die G-207C-Mutation eine Consensus-HSF1-Bindungsstelle verändert, stellten wir die Hypothese auf, dass dieser Faktor HSF1 war. Anti-HSF1-, aber nicht Anti-HSF2-Antikörper löste einen Supershift des Komplexes aus, wodurch der unbekannte Faktor positiv als HSF1 identifiziert wurde. HSF1-Bindung an den OCTN 2-Promotor wurde komplett durch das Vorhandensein des C-Allels unter allen getesteten Bedingungen unterbunden.
OCTN 1-Transporterassays. Für OCTN 1-Transporterassays wurde Volllängen-OCTN 1-cDNA (2,24 kb) erhalten als ein Volllängen-Genoskopklon ID CS0DJ 003YB03 (ResGen, Invitrogen, La Jolla, Kalifornien, USA). Der cDNA-Klon wurde subkloniert in die EcoRI/NotI-Stellen des pcDNA3-Vektors. Das Konstrukt wurde vollständig sequenziert, und es wurde gefunden, dass es das Leucinallel an Position 503 (L503) enthielt. Das Konstrukt wurde als Vorlage für PCR-basierte site-directed Mutagenese (QuikChange^TM, Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) verwendet, um das Phenylalaninallel (L503F) zu erzeugen. Eltern-DNA-Stränge wurden entfernt durch DpnI-Verdau, und die eingeschnittene (nicked) zirkuläre DNA wurde verwendet, um XL-10-Gold-superkompetente Zellen zu transformieren (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA).
Die mutagenen Primer, die verwendet wurden, um die L503F-Mutante herzustellen, waren wie folgt:
5'-GACTGTCCTGATTGGAATCTTCACCCTTTTTTTCCCTGA-3' (Vorwärts) (SEQ ID NO: 21) und
5'-TCAGGGAAAAAAAGGGTGAAGATTCCAATCAGGACAGTC-3' (Rückwärts) (SEQ ID NO: 22).
Das Phenylalaninallel der L503F-Mutation resultierte in einer 3,6-fachen Reduktion gegenüber des "Vektor alleine" Hintergrunds in Bezug auf die Aufnahme von radiomarkiertem Carnitin nach transienter Transfektion in HeLa-Zellen ( 3A), im Vergleich mit einem identischen Konstrukt, enthaltend das Leucinallel. In einer Zelllinie von einem Individuum, dem OCTN 2-Expression fehlt, resultierte die OCTN 1-L503F-Mutation in einer 5,2-fachen Reduktion gegenüber dem Vektorhintergrund in Bezug auf die Aufnahme von radiomarkiertem Carnitin im Vergleich zu dem Leucinallel (3B).
TEA-Effluxassayss Die Messung des Efflux von radiomarkiertem TEA zeigte, dass es eine signifikante Abnahme des Efflux durch die CD-assoziierte Phenylalanin (L503F)-Variante des OCTN 1 gab, im Vergleich mit der Leucinvariante (L503). Siehe 4.
Transfizierte Phoenix-Mausfibroblastenzellen wurden beladen mit ¹⁴C-markiertem TEA für 30 Minuten bei 37°C, zweimal in kaltem Transportpuffer gewaschen, und dann in dem Transportmedium resuspendiert. Efflux wurde bei 37°C initiiert und bei 0, 4, 8, 12 und 30 Minuten gemessen. Messungen wurden genommen durch zweimaliges Waschen in kaltem Transportpuffer, Solubilisieren mit 1× Zellkulturlysereagenz (Promega) und Quantifizieren des zurück behaltenen ¹⁴C aus 150 μl Aliquots. Der zelluläre Proteingehalt wurde bestimmt entsprechend der BCA-Methode. Für Natrium-freie Experimente wurden Zellen in einem Medium suspendiert, in dem Natrium durch N-Methyl-D-glucamin isotonisch ersetzt war.
Diskussion. Die zwei hier beschriebenen Mutationen co-segregieren zusammen mit dem zuvor beschriebenen SNP-Haplotyp, werden in Nicht-Risiko-Haplotypen nicht gefunden, und tragen zu der genetischen Suszeptibilität zu Morbus Crohn in etwa gleichem Ausmaß bei (Tabelle 2). Offenbar schätzten JD Rioux et al., Nature Genet. 29: 223-228 (2001) das genetische Risiko etwas zu niedrig ein (d.h. zweifaches Genom-relatives Risiko für einen SNP-Haplotyp, 6-fach für zwei), wahrscheinlich da die Allelfrequenz des Risiko-Haplotyps zuvor geschätzt wurde anhand von nicht weitergegebenen Eltern-Chromosomen und nicht anhand eines unabhängigen Kontrollsatzes, so wie wir es hier getan haben.
Die Mutation, die die Veränderung L503F in OCTN 1 verursacht, ist zuvor identifiziert worden als ein SNP unbekannter Funktion (dbSNP-Identifizierer rs1050152), obwohl keine Allelfrequenz oder funktionelle Daten zuvor erhältlich waren. Die L503F-Mutation liegt in der allgemeinen Bevölkerung häufig vor. Dies ist wahrscheinlich der Grund, warum die Phenylalanin-Variante (von der wir hier zeigen, dass sie mit der Morbus Crohn-Suszeptibilität assoziiert ist) ursprünglich als die Wildtyp-Form des Transporters berichtet wurde. I. Tamai et al., FEBS Lett. 419, 107-111 (1997). Zuvor durchgeführte Funktionsassays des OCTN 1-Transporters sind durchgeführt worden unter Verwendung der Phenylalanin-Variante, ohne Berücksichtigung anderer Varianten an dieser Position, wie hierin gezeigt.
Für Wildtyp-Varianten ist die Aminosäure, die zur Position 503 von OCTN 1 korrespondiert, entweder Leucin, Isoleucin, Methionin oder Valin in allen anderen bekannten organischen Kationentransportern aus Maus, Ratte oder Mensch. G. Burckhardt & NA Wolff, Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 278, F853-F866 (2000). Die Änderung zu einem ausladenden Phenylalaninrest mag strukturelle Effekte auf das Protein haben. Dieser Rest ist in der Transmembrandomäne 11 von OCTN 1 gelegen, in einem Bereich, von dem zuvor gezeigt worden ist, dass er am Carnitin-Transport teilnimmt. Unsere Transporterassayergebnisse zeigen, dass die Leucinvariante von OCTN 1 signifikant besser ist beim Transport von Carnitin als die Phenylalaninvariante. Dieses Ergebnis ist nicht in Übereinstimmung mit früheren funktionalen Analysen von OCTN 1, welche die Phenylalaninvariante verwendeten (I. Tamai et al. FEBS Lett. 419, 107-111 (1997)) und welche nahe legten, dass die in vivo-Funktion von OCTN 1 tatsächlich die eines Carnitin-Transporters anstelle eines einfachen polyspezifischen Kationentransporters sein könnte.
In Bezug auf OCTN 2 zeigen diese Daten, dass basale Transkription herunterreguliert ist durch das C-Allel von G-207C, und dass dieses Allel die Fähigkeit von OCTN 2 unterbricht, herauf reguliert zu werden in Antwort auf Hitzeschock oder Arachidonsäure als ein Ergebnis der gestörten HSF1-Bindung und anschließenden transkriptionalen Aktivierung.
Der Mechanismus, durch welchen diese organischen Kationentransporter zu der Pathologie von Morbus Crohn beitragen, betrifft die in vivo-metabolische Bedeutung von Carnitin. Carnitin erleichtert den Transport langkettiger Fettsäuren über die innere Mitochondrienmembran für die anschließende β-Oxidation, und ist auch wichtig in der Beibehaltung zellulärer CoA-Niveaus. Carnitin-Aufnahme in Lymphozyten, zusammen mit einer korrespondierenden Abnahme von Plasmaniveaus, ist eine physiologische Antwort auf Entzündung. Symptome der verwandten Colitis ulcerosa mögen die Folge einer Energiedefizienz im Colonepithelium sein, sekundär zur schlechten Mitrochrondrienfunktion infolge des verringerte Transports langkettiger Fettsäuren zu den Mitochondrien. WE Poediger, Lancet 2, 712-715 (1980). Der Haplotyp der Mutationen in Morbus Crohn-Patienten, der durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt wird, mag die zellulären metabolischen Energieniveaus in entzündetem Gewebe beeinflussen durch Kombinieren von beeinträchtigter OCTN 1-Transporterfunktion mit Herunterregulation und Unfähigkeit auf Hitze oder inflammatorischen Stress durch das OCTN 2-Gen zu reagieren.
Hitzeschockproteine und Arachidonsäuren sind involviert in der Antwort auf eine Vielzahl von zellulären Stressarten, umfassend Sepsis, metabolischer Stress und Ischämie. Die Hitzeschockantwort moduliert Entzündung durch Modulation der NF-κB-Aktivierung. OCTN 2 ist zuvor nicht als ein Hitzestress induzierbares Protein beschrieben worden, aber anhand der Ergebnisse dieser Erfindung ist OCTN 2 ein Hitzestress-induzierbares Protein. So ist das OCTN 2-Gen normalerweise herauf reguliert in Antwort auf Entzündung durch Bindung des HSF1-Proteins an seinen Promotor. Dies wiederum mobilisiert Carnitin und unterstützt den Metabolismus des entzündeten Gewebes. Beeinträchtigte OCTN 1-Carnitin-Transporteraktivität und niedrigere OCTN 2-Expressionsniveaus resultieren in verringertem Metabolismus und lösen zellulären Stress in Bereichen der Entzündung aus, oder verschlechtern diesen.
Die zwei OCTN-Transporter mögen daher in der inflammatorischen Pathologie von Morbus Crohn eine Rolle spielen. Bezeichnenderweise gibt es Berichte, dass eine oberflächliche Bewässerung des Colons mit Propyonil-L-carnitin (PLC) manche Symptome der Colitis ulcerosa verbessern kann (A. Giancaterini et al., Am. J. Gastroenterol. 96, 2275-2276 (2001)), und PLC auch die Entzündung in verschiedenen Modellen der vaskulären Entzündung in Nagetieren inhibiert. A. Caruso et al., Pharmacol. Res. 31, 67-72 (1995); M. Amico-Roxas et al., Drugs Exp. Clin. Res. 19, 213-217 (1993). Zusätzlich ist OCTN 1 ein polyspezifischer Kationentransporter und mag eine Rolle spielen bei der Aufnahme von Wirkstoffen, die verwendet werden, um CD aus dem Darm zu behandeln. Mutationen, wie L503F, können daher dazu dienen, die Krankheit zu verschlechtern durch das Reduzieren der Bioverfügbarkeit von therapeutischen Verbindungen, oder durch Verringerung der Fähigkeit der Zellen toxische Verbindungen, wie freie Radikale, toxische Metaboliten oder bakterielle Toxine, durch Efflux zu entfernen.
Mutationen des OCTN 2-Gens und Verwendungen in der Diagnose von Entzündung. wie oben beschrieben, ist OCTN 2 ein Transporterprotein mit der Fähigkeit, Carnitin in einer Natrium-abhängigen Weise zu transportieren. Missense-Mutationen und Nonsense-Mutationen in dem organischen Kationentransporter OCTN 2 sind zuvor in Patienten mit primärer Systemischer Carnitin-Defizienz (SCD; (OMIM 212 140)) identifiziert worden, einer autosomalen rezessiven Erkrankung, charakterisiert durch progressive Kardiomyopathie, Skelettmuskelmyopathie, Hypoglykämie und Hyperammonämie. Im Gegensatz stellt die Erfindung Polynukleotidpolymorphismen in dem OCTN 2-Gen upstream des Start-Codons in Exon 1 zur Verfügung (siehe 6), von welchen hier gezeigt wird, dass eine Beziehung zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs), Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) besteht. Die oben identifizierte G-207C-Mutation von OCTN 2 ist, obwohl sie auch die basalen Transkriptionsniveaus reduziert, am relevantesten für die Transkription, die induziert wird durch Hitzestress oder Entzündung. In Kombination mit der begleitenden OCTN 1-Mutation resultiert dieser Haplotyp von Mutationen in der Suszeptibilität gegenüber Morbus Crohn.
Die Erfindung stellt Polynukleotidpolymorphismen, wie in der folgenden SEQ ID NO: 23 gezeigt, zur Verfügung:
Die Erfindung stellt andere Polynukleotide mit Sequenzen zur Verfügung, die Fragmente von SEQ NO: 23 sind. Zum Beispiel können die Fragmente Sequenzen sein, die 20 Basen (oder Vielfache davon) lang sind.
Des Weiteren stellt die Erfindung Verwendungen für Polynukleotide, enthaltend die 410-Mutation (z.B. taagccga(c/g)cccgggcta, SEQ ID NO: 24), zur Verfügung.
Alternativ stellt die Erfindung Verwendungen für Polynukleotide, enthaltend die G-207C-Mutation (z.B. ccaggcccg(c/g)aaccttccc, SEQ ID NO: 25) zur Verfügung. Andere Polynukleotide, die durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden, umfassen cggcggtgtcagctc(t/g)cgagcctaccctccgc (SEQ ID NO: 26); ggacggtcttgggtc(t/g)cctgctgcctggcttg (SEQ ID NO: 27); und cctggtcggcgg(cg/ta)ggtgccccgcgcgcacgc ("TA"; SEQ ID NO: 28). Andere Polynukleotide können anhand der Untersuchung von 6 bestimmt werden.
OCTN 2-Promotorregion. Tabelle 2 zeigt die Allelfrequenzen der OCTN 2-G-207C-Promotorregion-Mutation. Daten bezüglich der G-207C-Polymorphismusallelfrequenzen sind zuvor in keiner Population erhalten worden (gesund oder erkrankt).
Allele werden in Tabelle 4 anhand einer Nummer (1 oder 2) und des DNA-Nukleotids aufgelistet, welches an dieser Position vorhanden ist (C oder G). Die Anzahl der Chromosomen, die jedes Allel tragen, wird für entweder nicht-verwandte gesunde Kontrollindividuen ("gesunde" Säule) oder Morbus Crohn-Patienten aus Familien mit einem genetischen Risiko, verursacht durch den Chromosom-5-Locus, der zuvor beschrieben worden war ("CD"-Säule) gezeigt. Die Frequenz jedes Allels in Prozent des Gesamten wird in Klammern gezeigt, und die gesamte Anzahl von Chromosomen ("n") wird am Ende jeder Säule gezeigt. Die Ergebnisse eines 2 × 2 Kontingenztabellen-Chi-squared Tests werden am Ende der Tabelle 4 gezeigt, und zeigen einen signifikanten Unterschied in der Allelfrequenz zwischen den "gesunden" und "CD"-Klassen (Chi-squared Statistik von 10,2640, p-Wert mit einem Freiheitsgrad (0,0014). Tabelle 4 Allelfrequenzdaten für OCTN 2-G-207C-Mutation
Tabelle 5 zeigt Allelfrequenzdaten für drei Polymorphismen des OCTN 2-Gens (insbesondere den 410-, G-207C- und "TA"-Polymorphismus). Allelfrequenzen sind ausgedrückt als die Anzahl von Chromosomen, die ein spezifisches Allel tragen, gefolgt von dem Prozentsatz der gesamten Chromosomen ("n"), die dieses Allel tragen (z.B. für die G-207C-Mutation in gesunden Kontrollen, 52 bis 110 Chromosomen (d.h. 47%) tragen das "C"-Allel). Die untersuchten Populationen sind wie folgt: gesunde Kontrollen ("gesund"): DNA-Proben von venösem Blut von Individuen ohne Vorgeschichte von IBD; RA-Geschwister ("RA): DNA-Proben von venösem Blut von gesunden Geschwistern von Patienten mit rheumatoider Arthritis, aber keiner Vorgeschichte von IBD; Wegener's Granulomatosis ("WG"): DNA-Proben von venösem Blut von Patienten mit Wegener's Granulomatosis, aber keiner Vorgeschichte von IBD; Krebs/Polyp-Operation ("Krebs"): DNA-Proben von venösem Blut von Patienten, die operiert werden wegen eines Colonkrebses oder Colonpolypen, aber keiner Vorgeschichte von IBD; Eltern von chr(5)-Patienten: DNA-Proben von venösem Blut oder kultivierten weißen Blutzellen von Eltern von CD-Patienten aus Familien mit einer Kopplung zu Chromosom 5; nicht-verwandte chr(5)-Morbus Crohn (CD)-Patienten ("chr(5) CD"): DNA-Proben von venösem Blut oder kultivierten weißen Blutzellen von nicht-verwandten Patienten aus Familien, die eine Kopplung zu Chromosom 5 zeigen; CD-Operation: DNA-Proben von venösem Blut von Patienten, denen Darmgewebe infolge von CD chirurgisch entfernt wird; und UC-Operation: DNA-Proben von venösem Blut von Patienten, denen Darmgewebe infolge von Colitis ulcerosa (UC) entfernt wird. Tabelle 5 Allel-Frequenzen von OCTN 2-Polymorphismen in verschiedenen Populationen
Tabelle 6 zeigt die statistische Chi-squared Analyse der Allelfrequenzen in den in Tabelle 5 beschriebenen Populationen. Die Anzahl von Allelen, die in diesen Populationen vorhanden sind, ist dieselbe wie in Tabelle 5. Für jeden Test werden die Ergebnisse gezeigt für die 410-, G-207C- und "TA"-Polymorphismen. Die verglichenen Populationen werden oben für jede 2 × 2-Kontingenztabelle angegeben (z.B. "gesund", "c5-Patienten"), individuelle Allele werden aufgelistet auf der linken Seite und die Gesamtzahl der gezählten Allele für jeden Polymorphismus wird unter der Tabelle gezeigt (z.B. 110 für den G-207C-Polymorphismus in der ersten solchen Tabelle). Auf der rechten Seite jeder Tabelle ("Statistik"-Säule) ist der Chi-squared-Wert (oben) und der assoziierte p-Wert auf Basis einer einseitigen Chi-squared-Verteilung mit einem Freiheitsgrad (z.B. chi-squared für die erste solche Tabelle ist 9,7806, und der assoziierte p-Wert ist 0,0018) aufgelistet. Manche Populationen sind für diese Analysen zusammen gruppiert. Wo dies getan wurde, wurde der Nomenklatur von Tabelle 5 gefolgt, abgesehen von dem Folgenden: "alle CD" bedeutet "chr(5) CD und CD-Operation kombiniert"; und "Alle IBD" bedeutet "chr(5) CD und CD-Operation und UC-Operation kombiniert". Tabelle 6 Statistische Analyse der Allelfrequenzen
Die häufigste OCTN 2-DNA-Sequenzvariation (Mutation), die identifiziert wurde, zeigt eine signifikant erhöhte Frequenz in Morbus Crohn-Patienten. Diese Beobachtung ist statistisch hoch signifikant (p = 0,0014). Das Risikoallel wird beinahe immer auf dem Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP)-Risikohaplotyp-Hintergrund in diesen Patienten gefunden, in Übereinstimmung mit unserem genetischen Modell der Suszeptibilität gegenüber Morbus Crohn in dieser Region.
Zusätzlich haben wir eine Assoziation zwischen dem OCTN 2-Gen und generalisierten Entzündungsantworten detektiert. Wir haben einen Gel-Shift-Assay durchgeführt, der eine Verbindung zwischen einer Mutation in dem OCTN 2-Gen, dem spezifischen Protein, das an die Promotorregion des OCTN 2-Gens bindet (HSF1; Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1, NCBI UniGene, identifiziert Hs.1499), und eine HSF1-Beteiligung an Entzündung zeigte. Die spezifische Interaktion des HSF1-Proteins mit der OCTN 2-Promotorregion wird durch das Vorhandensein des G-207"C"-Allels zerstört.
Keine Komplexe mit Wildtyp- oder mutierten Oligos (in denen die OCTN 2-Promotorregion durch das Vorhandensein des G-207C "C"-Allels zerstört wurde) wurden detektiert (durch Hybridisierung mit ³²P-markierten Sonden) in der Abwesenheit von nukleärem Extrakt. Keine Komplexe wurden zwischen Wildtyp-Oligo oder nukleärem Extrakt aus Zellen gebildet, die nicht-hitzegeschockt waren. Wildtyp-Oligo bildet einen Komplex mit nukleärem Extrakt aus hitzegeschockten Zellen, das spezifisch kompetitiert wird durch kalten (50-facher Überschuss über ³²P-markiertes Testoligonukleotid) Wildtyp-Oligo und durch kalten Oligo, enthaltend einen bekannten Hitzeschock-Enhancer (HSE). Dieser Komplex wurde nicht kompetitiert durch kalten mutierten Oligo oder kalten unverwandten Oligo. Dieser Komplex war in Bezug Gelmobilität identisch zu dem Komplex zwischen markierten Oligo, enthaltend einen bekannten HSE und nukleäres Extrakt. Dieser Komplex wird supergeshifted, d.h. weiter in der Mobilität reduziert, infolge des Bildens eines Komplexes höherer Ordnung mit Anti-HSF1-Antikörper, was darauf hindeutet, dass die Proteinkomponente des nukleären Extrakts, welche zu dem Komplex bindet, HSF1 ist. Keine Komplexe werden zwischen markiertem mutiertem Oligo und nukleärem Extrakt gesehen, unabhängig von der Gegenwart eines kompetitiven Oligos oder Anti-Hsf1-Antikörpers.
So bildet die OCTN 2-G-2070-Mutation spezifische Komplexe mit dem HSF1-Protein, und die Bindung von HSF1 ist komplett durch das Vorhandensein des G-2070-mutierten ("C") Allels zerstört.
So wird ein Verfahren zum Identifizieren eines antiinflammatorischen Mittels offenbart. Ein Komplex wird in vivo oder in vitro gebildet, zwischen dem Hitzeschockfaktor 1-(HSF1)-Protein und einem Polynukleotid, enthaltend eine Mutation in der OCTN 2-Promotorregion. Zum Beispiel kann die Mutation die G-207C-Mutation in der OCTN 2-Promotorregion sein. Der Komplex wird mit einem Mittel in Berührung gebracht, wie einem Wirkstoff, von dem angenommen wird, dass er den Komplex dissoziiert. Die Detektion der Dissoziierung des Komplexes identifiziert das Mittel als ein Mittel, das ein antiinflammatorisches Mittel ist.
Primer, die für PCR-Amplifikationen von Teilen des OCTN 2-Gens nützlich sind, umfassen OCTN 2 2.4: gccaggttaggttccctttc (SEQ ID NO: 29); OCTN2 2.2: agcagcccaaattcttaaagg (SEQ ID NO: 30); O2X1v3: gaatcacctcgctgcttttt (SEQ ID NO: 31); O2X1v4: aaatgtggaaagggcatct (SEQ ID NO: 32); O2X1600up: attaggcggtgtcaagagca (SEQ ID NO: 33); O2X1F: ggtcgtgcgccatatgtaag (SEG ID NO: 34); und O2X1R1: gagaggagctcgggttcaag (SEQ ID NO: 35.
Mutationen des OCTN 1-Gens und Verwendungen in der Diagnose von Entzündung. Wie oben beschrieben, ist OCTN 1 ein Transporterprotein mit der Fähigkeit, Carnitin in einer Natrium-abhängigen Weise zu transportieren. OCTN 1, welches in Maus (553 Aminosäuren) und in menschlicher fötaler Leber (551 Aminosäuren) kloniert und charakterisiert worden ist, trägt ein Nukleotid Bindungsstellenmotiv. OCTN 1 wird stark exprimiert in adulter Niere, Trachea, Knochenmark und fötaler Leber und verschiedenen Tumorzellen von Erwachsenen, aber nicht in menschlicher Leber von Erwachsenen. OCTN 1 mediiert die Aufnahme von TEA in einer pH-abhängigen Weise.
8 zeigt die Nukleotidsequenz des OCTN 1-Gens, umfassend den Einzelnukleotidpolymorphismus in Exon 9. Dieser Polymorphismus wird in der dbSNP-Datenbank als rs1050152 dargestellt. Die Allelfrequenz dieses SNP ist in keiner Population (Kontrolle oder krankheitsbezogen) bestimmt worden. Die Nukleotidsequenz von Exon 9 wird zur Verfügung gestellt:
gtgcttacaacagaatgctgccctacatcgtcatgggtagtctgactgtcctgattggaatcYtcaccctttttttccctgaaagtttgggaatgactcttccagaaaccttagagcagatgcagaaagtgaaatg (SEQ ID NO:36).
Die Nukleotidsequenz des gespleißten Exons wird zur Verfügung gestellt als:
9 zeigt die Aminosäuresequenz, abgeleitet von dem OCTN 1-Gen, umfassend die Position des Aminosäureaustausches, verursacht durch die OCTN 1-Exon 9-Mutation (SEQ ID NO: 38). Oligonukleotidprimer zur Amplifikation der OCTN 1-Exon 9-Mutationsstelle umfassen O1X9F: gtgcccagagagtcctccta (SEQ ID NO: 39) und O1X9R: ttctccctaaggcattttggt (SEQ ID NO: 40).
Tabelle 7 zeigt die Allelfrequenzen der OCTN 1-Exon 9-Mutation (siehe 8 und 9). Allele sind aufgelistet anhand einer Nummer (1 oder 2), und dem DNR-Nukleotid, das an der Stelle vorhanden ist (C oder T) und der Aminosäure, die durch das Codon, die dieses Nukleotid umfasst, codiert wird (Phe für Phenylalanin oder Leu für Leucin). Die Anzahl der Chromosomen, die jedes Allel trägt, wird für entweder nicht-verwandte gesunde Kontrollindividuen ("gesunde" Säule) oder Morbus-Crohn-Patienten von Familien mit einem genetischen Risiko, vermittelt durch den zuvor beschriebenen Chromosom 5-Locus ("CD"-Säule) gezeigt. Die Frequenz jedes Allels als eine Prozentzahl vom Gesamten wird in Klammern gezeigt, und die Gesamtzahl der Chromosomen ("n") wird am Ende jeder Säule gezeigt. Die Ergebnisse eines 2 × 2-Kontingenztabellen-Chi-squarded-Tests werden am Ende der Tabelle gezeigt, und zeigen einen signifikanten Unterschied in der Allelfrequenz zwischen den "gesunden" und "CD"-Klassen (Chi-squared Statistik von 13,1422, p-Wert mit einem Freiheitsgrad 0,0003). Tabelle 7 Allelfrequenzdaten für OCTN 1-Exon 9-Mutation
Die Beschreibung offenbart auch andere Polynukleotide mit Sequenzen, welche Fragmente der SEQ ID NOS: 37 oder 38 sind. Zum Beispiel können die Fragmente Sequenzen haben, die 20 Basen (oder Vielfache davon) lang sind.
Zusätzlich mag eine Assoziation zwischen dem OCTN 1-Gen und allgemeinen Entzündungsreaktionen vorhanden sein. Ein spezifisches Protein (HSF1) mag an die Promotorregion des OCTN 1-Gens binden. Dementsprechend sind Entzündungserkrankungen im Allgemeinen im Bereich der vorliegenden Erfindung.
So wird ein Verfahren zum Identifizieren von antiinflammatorischen Mitteln offenbart. Ein Komplex wird entweder in vivo oder in vitro, zwischen dem Hitzeschockfaktor 1 (HSF1)-Protein und einem Polynukleotid, enthaltend die OCTN 1-Promotorregion, gebildet. Der Komplex mit einem Mittel, wie einem Wirkstoff, von dem vermutet wird, dass er in der Lage ist, den Komplex zu dissoziieren. Das Detektieren der Dissoziation des Komplexes identifiziert das Mittel als ein Mittel, das ein antiinflammatorisches Mittel ist.
OCTN 1- und OCTN 2-Polyukleotide. Die Erfindung stellt Polymorphismen von OCTN 1 und OCTN 2, wie in den Ansprüchen definiert, zur Verfügung. Der Begriff "Polynukleotid" umfasst RNA und DNA, umfassend cDNA, genomische DNA und synthetische (z.B. chemisch synthetisierte) DNA. Das Polynukleotid kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Wo es einzelsträngig ist, kann das Polynukleotid der Sensestrang oder Antisensestrang sein. Die offenbarten Polynukleotide stellen so Material zur Herstellung von OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptiden zur Verfügung.
Das Polynukleotid kann als Basis für die Entwicklung diagnostischer Wirkstoffe für entzündliche Darmerkrankungen dienen. Zusätzlich zu der strukturellen Information, die zur durch das Polynukleotid der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, wird die Assoziierungsinformation durch die genetische Analyse zur Verfügung gestellt. Verfahren zur Verwendung der Polynukleotide der Erfindung im Zusammenhang mit weiterer genetischer Analyse von komplexen genetischen Merkmalen sind dem Fachmann bekannt (siehe, E. Lauder & L. Kruglyak, Nature Genet. 11: 241-247 (1995); J. Ott, Nature 379: 772-773 (1996)); ebenso sind Verfahren zum Untersuchen des relativen Risikos von Morbus Crohn für Individuen bekannt, die heterozygot, homozygot oder Verbindungs-heterozygot für die identifizierten genetischen Loci sind (siehe z.B. J.-P. Hugot et al., Nature 411: (2001); IBD International Genetics Consortium, Am. J. Hum. Genet. 68: 1165-1171 (2001)).
Als "isoliertes Polynukleotid" wird DNA bezeichnet, die nicht unmittelbar mit beiden der codierenden Sequenzen fortlaufend ist, mit denen es unmittelbar fortlaufend ist (einer an dem 5'-Ende und einer an dem 3'-Ende) in dem natürlich vorkommenden Genom des Organismus, von dem es abgeleitet ist. So könnte ein rekombinantes Polynukleotid die gesamte oder einen Teil der 5'-nicht-codierenden (d.h. Promotor) Sequenzen umfassen, welche unmittelbar fortlaufend sind mit der codierenden Sequenz. Der Begriff umfasst daher z.B. eine rekombinante DNA, welche in einen Vektor inkorporiert ist; in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus, wie ein Retrovirus; oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten, oder welches als separates Molekül (z.B. ein cDNA- oder ein genomisches DNA-Fragment, hergestellt durch PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung) existiert, unabhängig von anderen Sequenzen. Es umfasst auch eine rekombinante DNA, die Teil eines hybriden Gens ist, umfassend zusätzliche Polypeptidsequenzen.
"Im wesentlichen identisch" bedeutet ein Polypeptid oder Polynukleotid mit einer Sequenz, die zumindest 85%, vorzugsweise 90% und noch bevorzugter 95% oder mehr identisch ist zu der Sequenz der Referenzaminosäure- oder Polynukleotidsequenzen. Für Polypeptide wird die Länge der Referenzpolypeptidsequenz im Allgemeinen zunächst 16 Aminosäuren, vorzugsweise zumindest 20 Aminosäuren, noch bevorzugter zumindest 25 Aminosäuren und am bevorzugtesten 35 Aminosäuren sein. Für Polynukleotide wird die Länge der Referenzpolynukleotidsequenz im Allgemeinen zumindest 50 Nukleotide, vorzugsweise zumindest 60 Nukleotide, noch bevorzugter zumindest 75 Nukleotide und am bevorzugtesten zumindest 110 Nukleotide sein.
Um die Prozent-Identität von zwei Polynukleotiden zu bestimmen, werden die Sequenzen für den Zweck des optimalen Vergleichs ausgerichtet (z.B. können Lücken in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Polynukleotidsequenz für die optimale Ausrichtung mit einer zweiten Aminosäure- oder Polynukleotidsequenz eingeführt werden. Die Aminosäurereste oder Nukleotide an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch denselben Aminosäurerest oder Nukleotid besetzt ist, wie die korrespondierende Position in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die Prozentidentität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der identischen Positionen, die von den Sequenzen geteilt wird (d.h. Prozent-Identität = # der identischen Positionen/Gesamt-# der Positionen (z.B. überlappende Positionen) × 100). Vorzugsweise haben die zwei Sequenzen die gleiche Länge.
Die Bestimmung der Prozent-Homologie zwischen zwei Sequenzen kann durchgeführt werden unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus. Ein bevorzugtes, nicht-begrenzendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, verwendet für den Vergleich von zwei Sequenzen, ist der Algorithmus von Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990), modifiziert wie in Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873-5877 (1993). Solch ein Algorithmus wird in die BLASTX- und BASTN-Programme von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) inkorporiert. BLAST-Nukleotidsuchen können durchgeführt werden mit dem NBLAST-Programm, Score=100, Wortlänge=12, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die homolog sind zu den OCTN 2-Polynukleotidmolekülen der Erfindung. BLAST-Proteinsuchen können mit dem BLASTX-Programm, Score=50, Wortlänge=3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog sind zu den OCTN 2-Proteinmolekülen der Erfindung. Um Ausrichtungen mit Lücken zum Zweck des Vergleichs zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997) beschrieben. Alternativ kann PSI-Blast verwendet werden, um eine iterative Suche durchzuführen, die entfernte Verwandtschaft zwischen Molekülen detektiert. Id. Wenn BLAST-, Gapped BLAST- und PSI-Blast-Programme verwendet werden, können die Default-Parameter der jeweiligen Programme (z.B. BLASTX und BLASTN) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.qov. Ein weiteres bevorzugtes, nicht-limitierendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen verwendet werden kann, ist der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Solch ein Algorithmus ist in das ALIGN-Programm (Version 2.0) inkorporiert, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignment-Softwarepakets ist. Wenn das ALIGN-Programm zum Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120-Gewichtsresttabelle (weight residue table), eine Lückenlängestrafe (gap length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von 4 verwendet werden.
Die Prozent-Identität zwischen zwei Sequenzen kann bestimmt werden unter Verwendung von Techniken, die ähnlich sind zu den oben beschriebenen, mit oder ohne dem Zulassen von Lücken. Bei der Berechnung von Prozent-Identität werden nur exakte Übereinstimmungen gezählt.
Offenbart sind auch Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen zu einem Polynukleotid hybridisieren, welches ein OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid codieren. Beispiele stringenter Bedingungen umfassen: 1) Hybridisierung bei 50°C in Church-Puffer (7% SDS, 0,5% NaHPO₄, 1 mM EDTA, 1% BSA) und Waschen bei 50°C in 2 × SSC; und 2) Hybridisierung in 6× Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt durch einen oder mehrere Waschschritt(e) in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50-65°C. Andere stringente Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y. 1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Die hybridisierenden Teile der hybridisierenden Polynukleotide sind vorzugsweise 20, 30, 50 oder 70 Basen lang. Vorzugsweise ist der hybridisierende Teil des hybridisierenden Polynukleotids 95% oder sogar 98% identisch zu der Sequenz eines Teils des Polynukleotids, das ein OCTN 2-Polypeptid codiert. Hybridisierende Polynukleotide des oben beschriebenen Typs können verwendet werden als Klonierungssonde, Primer (z.B. ein PCR-Primer) oder eine diagnostische Sonde. Bevorzugte Hybridisierungspolynukleotide codieren ein Polypeptid mit den biologischen Aktivitäten, die einem natürlich vorkommenden OCTN 1 oder OCTN 2 innewohnen, oder einem Teil dieser Aktivitäten. Hybridisierende Polynukleotide können Spleißvarianten sein, codiert durch eines der OCTN 1- oder OCTN 2-Gene, die hierin beschrieben werden. So können sie ein Protein codieren, das länger oder kürzer ist als die verschiedenen Formen von OCTN 1 oder OCTN 2, die hierin beschrieben werden. Hybridisierende Polynukleotide können auch Proteine codieren, welche zu OCTN 1 oder OCTN 2 verwandt sind (z.B. Proteine, codiert durch Gene, welche einen Teil umfassen, der einen relativ hohen Grad an Identität zu einem hierin beschriebenen OCTN 1- oder OCTN 2-Gen aufweist).
Die Beschreibung betrifft auch isolierte Polynukleotidsequenzen, die einen Teil von OCTN 1 oder OCTN 2 codieren. Beispiele von detektierbaren Markern umfassen β-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), alkalische Phosphatase (AP), Adenosindeaminase (ADA), Aminoglycosidphosphotransferase (neo^r, G418^r), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-phosphotransferase (HPH), Thymidinkinase (TK), β-Galactosidase und Xanthinguaninphosphoribosyl-Transferase (XGPRT).
Die Polypeptide umfassen rekombinante Polypeptide, natürliche Polypeptide, hergestellt aus Polynukleotiden der Erfindung mit einem hierin offenbarten Polymorphismus, und synthetische Polypeptide sowie Polypeptide, welche Präproteine oder Proproteine sind. Die Polypeptide können exprimiert werden in Fusion mit anderen Polypeptiden, z.B. einem Markerpolypeptid oder Fusionspartner. Zum Beispiel kann das Polypeptid fusioniert sein an einen Hexahistidin-Tag, um die Reinigung von bakteriell exprimiertem Protein zu erleichtern oder Hämagglutinin-Tag, um die Reinigung eines Proteins, das eukaryontischen Zellen exprimiert wurde, zu erleichtern.
Die Beschreibung betrifft transformierte Zellen, die ein Polynukleotid enthalten. Die Beschreibung betrifft auch Vektoren, die ein Polynukleotid der Erfindung umfassen, welches in geeigneter Weise für die Expression positioniert ist. Zum Beispiel kann der Vektor ein Expressionsvektor sein und kann ein oder mehrere regulatorische Elemente umfassen. Regulatorische Elemente, die Expression des in den Vektor inserierten Polynukleotids beeinflussen können, wie regulatorische Elemente, die Gewebe-spezifische Expression steuern, sind dem Fachmann wohl bekannt. Beispiele regulatorischer Elemente umfassen das Cytomegalovirus hCMV-immediate-early gene, den frühen Promotor von SV40-Adenovirus, den späten Promotor von SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die Hauptoperator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase, die Promotoren von Säurephosphatase, und die Promotoren der Hefe-α-Matingfaktoren. Der Vektor kann ein Plasmid sein oder ein Virus, wie ein Retrovirus.
"Transformierte Zelle" bedeutet eine Zelle, in welche (oder in eine Abstammungszelle davon) durch rekombinante DNA-Techniken ein DNA-Molekül, codierend für (wie hierin verwendet) ein OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid, eingeführt worden ist.
"Positioniert für Expression" bedeutet, dass das ausgewählte DNA-Molekül benachbart zu einem oder mehreren Sequenzelementen positioniert ist, welche direkte Transkription und/oder Translation der Sequenz in einer solchen Weise steuern, dass die Sequenzelemente die Transkription oder/oder Translation der selektierten DNA kontrollieren (d.h. die ausgewählte DNA ist operativ assoziiert mit den Sequenzelementen). Solche operativ assoziierten Elemente können verwendet werden, um die Herstellung von einem OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid zu erleichtern.
Antagonisten können eine oder mehrere Funktionen von OCTN 1 oder OCTN 2 inhibieren. Geeignete Antagonisten können große oder kleine Moleküle (d.h. organische Moleküle), Antikörper gegen OCTN 1 oder OCTN 2, und OCTN 1 oder OCTN 2-Polypeptide, welche mit der natürlichen Form von OCTN 1 oder OCTN 2 kompetitieren, umfassen. Agonisten von OCTN 1 oder OCTN 2 werden eine oder mehrere der Funktionen von OCTN 1 oder OCTN 2 verstärken oder erleichtern. Geeignete Agonisten können z.B. große oder kleine Moleküle (d.h. organische Moleküle) umfassen und Antikörper gegen OCTN 1 oder OCTN 2. Polynukleotidmoleküle, die verwendet werden können, um mit OCTN 1- oder OCTN 2-Expression zu interferieren, z.B. Antisense-Moleküle oder Ribozyme, sind ebenfalls im Bereich der Erfindung.
Die Beschreibung betrifft auch eine Zelle, welche ein rekombinantes Polynukleotid, codierend für ein OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid, enthält; einen Vektor, welcher ein Polynukleotid, codierend für ein OCTN 2-Polypeptid, umfasst.
Verfahren. Offenbart ist ein Verfahren zum Detektieren von entzündlichen Darmerkrankungen. Dieses Verfahren umfasst (a) Erhalten einer biologischen Probe; (b) Kontaktieren der Probe mit einer Sonde, welche selektiv an OCTN 1- oder OCTN 2-Polynukleotide bindet; und (c) Bestimmen der Menge der selektiv an besagte biologische Probe gebundenen Sonde als Messung des Expressionsniveaus von v. Dieses Niveau wiederum dient als biologischer Marker für Krankheitsaktivität und/oder Progression in Individuen mit inflammatorischen Darmerkrankungen. So stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, um Veränderungen des Expressionsniveaus in entzündlichen Darmerkrankungen als ein diagnostisches oder prognostisches Werkzeug nachzuvollziehen oder zu überwachen.
Im Allgemeinen können OCTN 1- oder OCTN 2-Proteine und Fusionsproteine gemäß der Erfindung hergestellt werden unter Verwendung des Polynukleotids der Erfindung durch Transformation (Transfektion, Transduktion oder Infektion) einer Wirtszelle mit dem Gesamten oder einem Teil eines OCTN 1-codierenden oder OCTN 2-codierenden DNA-Fragments (z.B. der hierin beschriebene cDNA) in einem geeigneten Expressionsvehikel. Geeignete Expressionsvehikel umfassen Plasmide, virale Partikel und Phagen. Für Insektenzellen sind Baculovirusexpressionsvektoren geeignet. Das gesamte Expressionsvehikel oder ein Teil davon kann in das Wirtszellengenom integriert werden. Unter manchen Umständen ist es wünschenswert, einen induzierbaren Expressionsvektor zu verwenden, z.B. das LACSWITCH^TM Induzierbare Expressions-System (Stratagene; La Jolla, Kalifornien, USA).
Der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wird verstehen, dass eine große Vielzahl von Expressionssystemen verwendet werden kann, um das rekombinante Protein zur Verfügung zu stellen. Die genaue Wirtszelle, die verwendet wird, ist nicht kritisch für die Erfindung. Das OCTN 1- oder OCTN 2-Protein kann in einem prokaryontischen Wirt (z.B. E. coli oder B. subtilis) oder in einem eukaryontischen Wirt (z.B. Saccharomyces oder Pichia, Säugerzellen, z.B. COS, NIH 3T3, CHO, BHK, 293 oder HeLa-Zellen; oder Insektenzellen) hergestellt werden.
Pflanzenzellen können auch Proteine oder Polypeptide herstellen. Für Pflanzenzellen sind virale Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus (cauliflower mosaic virus) und Tabakmosaikvirus) und Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) geeignet. Solche Zellen sind von einer weiten Vielzahl von Quellen erhältlich (z.B. der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA, siehe auch z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1994)). Die Verfahren der Transformation oder Transfektion und die Wahl des Expressionsvehikels werden von dem ausgewählten Wirtssystem abhängen. Transformations- und Transfektionsverfahren sind z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1994) beschrieben; Expressionsvehikel können ausgewählt werden von jenen, die z.B. in Cloning Vectors: A Laboratory Manual, P.H. Pouwels et al. (1985, Supp. 1987) zur Verfügung gestellt werden.
Die Wirtszelle, die das Expressionsvehikel enthält, kann in konventionellen Nährmedien kultiviert werden, welche adaptiert sind, wie benötigt für die Aktivierung eines gewählten Gens, Unterdrückung eines gewählten Gens, Auswahl von Transformanten oder Amplifikation eines ausgewählten Gens.
OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptide können hergestellt werden als Fusionsproteine. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791, 1983) verwendet werden, um lacZ-Fusionsproteine zu erzeugen. Die pGEX-Vektoren können verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können einfach von lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen gereinigt werden, gefolgt durch Elution in der Gegenwart von freiem Glutathion. Die pGEX-Vektoren sind entworfen, um Thrombin oder Faktor Xa-Proteasespaltstellen zu enthalten, so dass das klonierte Zielgenprodukt freigesetzt werden kann von der GST-Einheit.
In einem Insektenzellexpressionssystem wird Autographa californica-nukleärer Polyhidrosevirus (AcNPV), welches in Spodoptera frugiperda-Zellen wächst, als ein Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Eine OCTN 1- oder OCTN 2-codierende Sequenz kann individuell in nicht-essentielle Regionen (z.B. das Polyhedringen) des Virus kloniert werden und unter Kontrolle eines AcNPV-Promotors gestellt werden, z.B. dem Polyhedrinpromotor. Erfolgreiche Insertion eines Gens, codierend ein OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid oder -Protein wird in der Inaktivierung des Polyhedringens resultieren und der Herstellung eines nicht-okkludierten rekombinanten Virus (d.h. Virus, dem der proteinhaltige Mantel fehlt, der durch das Polyhedringen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das eingeführte Gen exprimiert wird (siehe z.B. Smith et al., J. Virol. 46:584, 1983; Smith, US-Patent Nr. 4,215,051).
In Säugerwirtszellen kann eine Anzahl von Virus-basierten Expressionssystemen verwendet werden. In dem Fall, wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die OCTN 1- oder OCTN 2-Polynukleotidsequenz an einen Adenovirustranskriptions/translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z.B. dem späten Promotor und Tripartit-Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirusgenom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination eingeführt werden. Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, der lebensfähig ist und in der Lage ist, ein OCTN 1- oder OCTN 2-Genprodukt in infizierten Wirtszellen zu exprimieren. Siehe z.B. Logan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655 (1984).
Spezifische Initiationssignale können auch benötigt werden für die effiziente Translation von inserierten Polynukleotidsequenzen. Diese Signale umfassen das ATG-Start-Codon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, wo ein komplettes natives OCTN 1- oder OCTN 2-Gen oder cDNA, umfassend ihre eigenen Start-Codons und benachbarten Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, werden unter Umständen keine zusätzlichen Translationskontrollsignale benötigen. In anderen Fällen müssen exogene Translationskontrollsignale, umfassend, möglicherweise, das ATG-Start-Codon, zur Verfügung gestellt werden. Des Weiteren muss das Start-Codon in Phase mit dem Leserahmen der gewünschten codierenden Sequenz sein, um die Translation der gesamten Einfügung zu gewährleisten. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können von einer Vielzahl von Ursprüngen sein, sowohl natürlich und auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann verbessert werden durch Einschließen geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminatoren. Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:516 (1987).
Zusätzlich kann eine Wirtszelle ausgewählt werden, welche die Expression der eingeführten Sequenzen moduliert, oder das Genprodukt in einer spezifischen, gewünschten Weise prozessiert und modifiziert. Solche Modifikationen (z.B. Glycosylierung) und Prozessierung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten können wichtig sein für die Funktion des Proteins. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Prozessierung und Modifikation von Proteinen und Genprodukten. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des fremden exprimierten Proteins zu gewährleisten. Zu diesem Zweck können eukaryontische Wirtszellen, welche die zellulären Mechanismen für das richtige Prozessieren des primären Transkripts, der Gycosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen, verwendet werden. Solche Säugerwirtszellen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, und insbesondere Zelllinien des choroiden Plexus.
Eine beliebige bekannte Technik kann verwendet werden, um ein OCTN 2-Transgen in Tiere einzuführen, um die Erzeugerlinien für transgene Tiere zu bilden. Solche Techniken umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf pronukleäre Mikroinjektion (US-Patent Nr. 4,873,191); Retrovirus-vermittelter Gentransfer in Keimzellen (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148 (1985)); Gentargeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., Cell 56:313 (1989)); und Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803, 1983).
Die vorliegende Erfindung stellt nicht-menschliche transgene Tiere zur Verfügung, die das OCTN 2-Transgen in all ihren Zellen tragen, sowie Tiere, die das Transgen in manchen aber nicht allen ihrer Zellen tragen, d.h. mosaikartige Tiere. Das Transgen kann integriert sein als einzelnes Transgen oder in Concatameren, z.B. Kopf-an-Kopf-Tandems oder Kopf-an-Ende-Tandems. Das Transgen kann auch selektiv eingeführt werden und aktiviert werden in einer bestimmten Zellart. Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232 (1992). Die für solch eine Zelltyp-spezifische Aktivierung benötigten regulatorischen Sequenzen werden von der bestimmten Zellart von Interesse abhängen, und werden dem Fachmann offensichtlich sein.
Wenn es erwünscht ist, dass das OCTN 1- oder OCTN 2-Transgen an der chromosomalen Stelle des endogenen OCTN 2-Gens integriert wird, wird Gentargeting bevorzugt. Kurz gesagt werden, wenn solch eine Technik verwendet werden soll, Vektoren entworfen, die einige Nukleotidsequenzen enthalten, die homolog sind zu einem endogenen OCTN 1- oder OCTN 2-Gen, für den Zweck des Integrierens, durch homologe Rekombination mit chromosomalen Sequenzen, in das endogene Gen und Unterbrechen der Funktion der Nukleotidsequenz desselben.
Das Transgen kann auch selektiv eingeführt werden in eine bestimmte Zellart, wodurch das endogene OCTN 1- oder OCTN 2-Gen nur in dieser Zellart inaktiviert wird. Gu et al., Science 265:103 (1984). Die für eine solche Zelltyp-spezifische Inaktivierung benötigten regulatorischen Sequenzen werden von der besonderen Zellart von Interesse abhängen, und werden dem Fachmann bekannt sein.
Sobald die nicht-menschlichen transgenen Tiere erzeugt worden sind, kann die Expression des rekombinanten OCTN 1- oder OCTN 2-Gens untersucht werden unter Verwendung von Standardverfahren. Anfängliches Screening kann bewerkstelligt werden durch Southern-Blot-Analyse oder PCR-Techniken, um Tiergewebe zu analysieren, um zu bestimmen, ob die Integration des Transgens stattgefunden hat. Das Niveau von mRNA-Expression von dem Transgen in den Geweben der transgenen Tiere kann auch untersucht werden unter Verwendung von Verfahren, welche umfassen, jedoch nicht limitiert sind auf, Northern-Blot-Analyse von Gewebeproben, erhalten von dem Tier, in situ-Hybridisierungsanalyse und RT-PCR. Proben von OCTN 1- oder OCTN 2-Gen-exprimierendem Gewebe können auch immunzytochemisch evaluiert werden unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch sind für das transgene OCTN 1- oder OCTN 2-Produkt.
Antisense-Polynukleotide. Antisense-Ansätze umfassen das Entwerfen von Oligonukleotiden (entweder DNA oder RNA), die komplementär sind zu OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA. Die Antisense-Oligonukleotide binden an die komplementäre OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA-Transkripte und verhindern die Translation. Absolute Komplementarität wird, obwohl bevorzugt, nicht benötigt. Eine Sequenz-"Komplementarität" zu einem Teil einer RNA, wie hierin bezeichnet, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um in der Lage zu sein mit der RNA unter Bildung einer stabilen Duplex zu hybridisieren; im Fall eines doppelsträngigen Antisense- Polynukleotids kann ein Einzelstrang der Duplex-DNA getestet werden, oder die Triplexbindung kann untersucht werden. Die Fähigkeit zu hybridisieren wird sowohl vom Grad der Komplementarität abhängen als auch von der Länge des Antisense-Polynukleotids. Im Allgemeinen kann das hybridisierende Polynukleotid umso mehr Nicht(Mismatches)Übereinstimmungen mit einer RNA enthalten, umso länger das hybridisierende Polynukleotid ist, und immer noch eine stabile Duplex (oder Triplex, je nachdem) bilden. Der Fachmann kann einen tolerierbaren Grad an Nichtübereinstimmungen bestimmen unter Verwendung von Standardverfahren, um den Schmelzpunkt des hybridisierten Komplexes zu bestimmen.
Oligonukleotide, die komplementär sind zu dem 5'-Ende der Message, z.B. die 5'-nicht-translatierte Sequenz bis zu und umfassend das AUG-Start-Codon, sollten am effizientesten funktionieren beim Inhibieren der Translation. Vor kurzem ist jedoch gezeigt worden, dass auch Sequenzen, die zu den 3'-nicht-translatierten Sequenzen von mRNAs komplementär sind, beim Inhibieren der Translation von mRNAs effektiv sind. Wagner, Nature 372:333 (1984). So könnten Oligonukleotide, die komplementär sind zu den 5'- oder 3'-nicht-translatierten, nicht-codierenden Regionen des OCTN 1- oder OCTN 2-Gens, z.B. den menschlichen Genen, die in 8 und 6 gezeigt sind, in Antisense-Ansätzen verwendet werden, um die Translation von endogener OCTN 2-mRNA zu inhibieren. Oligonukleotide, die komplementär sind zu der 5'-nicht-translatierten Region der mRNA sollten das Komplement des AUG-Start-Codons umfassen.
Antisense-Oligonukleotide, die komplementär sind zu mRNA-codierenden Regionen, sind weniger effiziente Inhibitoren der Translation. Egal ob sie entworfen sind, um an die 5'-, 3'- oder codierende Region von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA zu hybridisieren, sollten Antisense-Polynukleotide zumindest 6 Nukleotide lang sein, und sind bevorzugt Oligonukleotide mit einer Länge im Bereich von 6 bis etwa 50 Nukleotiden. In bestimmten Aspekten haben die Oligonukleotide zumindest 10 Nukleotide, zumindest 17 Nukleotide, zumindest 25 Nukleotide oder zumindest 50 Nukleotide.
Unabhängig von der Wahl der Zielsequenz ist es bevorzugt, dass zunächst in vitro-Studien durchgeführt werden, um die Fähigkeit des Antisense-Oligonukleotids, die Genexpression zu inhibieren, zu quantifizieren. Es ist bevorzugt, dass diese Studien Kontrollen verwenden, die zwischen Antisense-Geninhibition und nicht-spezifischen biologischen Effekten der Oligonukleotide unterscheiden. Es ist auch bevorzugt, dass diese Studien die Niveaus der Ziel-RNA oder des Proteins vergleichen mit dem einer internen Kontroll-RNA oder eines Proteins. Zusätzlich ist geplant, dass Ergebnisse erhalten und unter Verwendung der Antisense-Oligonukleotide verglichen werden mit jenen, die erhalten wurden unter Verwendung von Kontroll-Oligonukleotiden. Es ist bevorzugt, dass das Kontroll-Oligonukleotid von in etwa der gleichen Länge ist wie das Test-Oligonukleotid und dass sich die Nukleotidsequenz des Oligonukleotids von der Antisense-Sequenz nicht mehr unterscheidet als nötig ist, um spezifische Hybridisierung an die Zielsequenz zu verhindern.
Die Oligonukleotide können DNA- oder RNA- oder chimäre Mischungen oder Derivate oder modifizierte Versionen davon, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die Oligonukleotide können z.B. am Basenteil, Zuckerteil oder Phosphatrückgrat modifiziert sein, um die Stabilität des Moleküls, die Hybridisierung etc. zu verbessern. Die Oligonukleotide können andere angehängte Gruppen umfassen, wie Peptide (z.B. zum Abzielen auf Wirtszellrezeptoren in vivo), oder Mittel, die den Transport über die Zellmembran erleichtern (wie beschrieben z.B. in Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:648 (1987); PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810) oder die Bluthirnschranke (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134), oder Hybridisierungs-ausgelöste Spaltmittel (siehe z.B. Krol et al., BioTechniques 6:958 (1988)), oder interkalierende Mittel (siehe z.B. Zon, Pharm. Res. 5:539 (1988)). Zu diesem Zweck können die Oligonukleotide konjungiert sein mit anderen Molekülen, z.B. einem Peptid, Hybridisierungs-ausgelösten Vernetzungsmitteln, Transportmitteln oder Hybridisierungs-ausgelöstem Spaltmittel.
Die Antisense-Oligonukleotide können zumindest eine modifizierte Baseneinheit umfassen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend, aber nicht limitiert auf, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xantin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethyl-aminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracin, 2-Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-theouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 2-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Die Antisense-Oligonukleotide können auch zumindest einen modifizierten Zuckerteil haben, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend, jedoch nicht limitiert auf, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
Zum Beispiel umfasst das Antisense-Oligonukleotid zumindest ein modifiziertes Phosphatrückgrat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphorthioat, ein Phosphordithioat, ein Phosporamidothioat, ein Phosphoramidat, ein Phosphordiamidat, ein Methylphosphonat, ein Alkylphosphotriester und ein Formacetal, oder ein Analog von irgendeinem dieser Rückgrate.
Zum Beispiel ist das Antisense-Oligonukleotid ein α-anomeres Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid bildet spezifische Doppelbindungshybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen. Gautier et al., Nucl. Acids. Res. 15:6625 (1987). Das Oligonukleotid ist ein 2'-0-Methylribonukleotid (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131 (1987)), oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. FEBS Lett. 215:327 (1987)).
Antisense-Oligonukleotide können synthetisiert werden durch Standardverfahren, die bekannt sind, z.B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers (wie solchen, die kommerziell erhältlich sind von Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Als Beispiele können Phosphorthioatoligonukleotide synthetisiert werden durch das Verfahren von Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), und Methylphosphonatoligonukleotide können hergestellt werden unter der Verwendung kontrollierter Porenglaspolymerträger. Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448 (1988).
Während Antisense-Nukleotide, die zu den OCTN 1- oder OCTN 2-codierenden Sequenzen komplementär sind, verwendet werden könnten, sind jene, die komplementär zu den transkribierten, nicht-translatierten Regionen sind, am bevorzugtesten.
Die Antisense-Moleküle können an die Zellen geliefert werden, die OCTN 1 oder OCTN 2 in vivo exprimieren, z.B. Zellen des Gastrointestinaltrakts und des Immunsystems. Eine Anzahl von Verfahren sind entwickelt worden, um Antisense-DNA oder -RNA an Zellen zu liefern, z.B. Antisense-Moleküle können direkt in die Gewebestelle injiziert werden, oder modifizierte Antisense-Moleküle, die entworfen sind, um auf die erwünschte Zelle zu zielen (z.B. Antisense, gekoppelt an Peptide oder Antikörper, die spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf der Zielzelloberfläche exprimiert werden), können systemisch verabreicht werden, um intrazelluläre Konzentrationen des Antisense-Moleküls zu erreichen, die ausreichend sind, um die Translation von endogenen mRNAs zu unterdrücken, und sind dem Fachmann bekannt.
Ribozyme. Ribozymmoleküle, die entworfen sind, um katalytisch OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA-Transkripte zu spalten, können auch verwendet werden, um die Translation von OCTN 2-mRNA und Expression von OCTN 2 zu verhindern (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/11364; Saraver et al., Science 247:1222 (1990)). Während verschiedene Ribozyme, die mRNA an spezifischen Erkennungssequenzstellen spalten, verwendet werden können, um OCTN 1- oder OCTN 2-mRNAs zu zerstören, ist die Verwendung von Hammerkopfribozymen bevorzugt. Hammerkopfribozyme spalten mRNAs an Positionen, die durch die flankierenden Regionen bestimmt werden, welche komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA bilden. Die einzige Voraussetzung ist, dass die Ziel-mRNA die folgende Sequenz von zwei Basen aufweist: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Herstellung von Hammerkopfribozymen ist dem Fachmann wohl bekannt. Haseloff et al., Nature 334:585 (1988).
Die Ribozyme umfassen auch RNA-Endoribonukleasen (im Weiteren "Cech-artige Ribozyme"), so wie jenes, das in Tetrahymena thermophila natürlich auftritt (bekannt als IVS oder L-19 IVS RNA), und welche umfassend beschrieben wurde durch Cech und seine Mitarbeiter. Zaug et al., Science 224:574 (1984); Zaug et al., Science 231:470 (1986); Zug et al., Nature 324:429 (1986); PCT-Anmeldung Nr. WO 88/04300; und Been et al., Cell 47:207 (1986). Die Cech-artigen Ribozyme umfassen eine 8-Basenpaarsequenz, die an die Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach Spaltung der Ziel-RNA stattfindet. Die Erfindung umfasst diese Cech-artigen Ribozyme, die auf aktive Stellensequenzen von acht Basenpaaren, die in OCTN 2 vorhanden sind, abzielen.
Verfahren zur Modulation von OCTN 1- oder OCTN 2-Expression. Endogene OCTN 1- oder OCTN 2-Genexpression kann auch durch Inaktivieren oder "Ausknocken" des OCTN 1- oder OCTN 2-Gens oder seines Promotors unter Verwendung von gezielter homologer Rekombination reduziert werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,464,764). Zum Beispiel kann ein mutiertes, nicht-funktionales OCTN 2 (oder eine komplett unverwandte DNA-Sequenz), flankiert durch DNA, die homolog ist zu dem endogenen OCTN 2-Gen (entweder der codierenden Region oder regulatorischen Regionen des OCTN 2-Gens), verwendet werden, mit oder ohne einem selektierbaren Marker und/oder einem negativen selektierbaren Marker, um Zellen zu transfizieren, die OCTN 2 in vivo exprimieren. Insertion des DNA-Konstrukts über gezielte homologe Rekombination resultiert in der Inaktivierung des OCTN 1- oder OCTN 2-Gens. Ein solcher Ansatz ist insbesondere geeignet zur Verwendung im landwirtschaftlichen Bereich, wo die Modifikation von ES-(embryonaler Stamm-)Zellen verwendet werden können, um Tiere mit inaktiviertem OCTN 1 oder OCTN 2 zu erzeugen. Jedoch kann dieser Ansatz adaptiert werden für die Verwendung in Menschen, vorausgesetzt, die rekombinanten DNA-Konstrukte werden direkt administriert oder zielen ab auf die benötigten Stellen in vivo unter Verwendung geeigneter viraler Vektoren, z.B. Herpes-Virus-Vektoren zum Liefern an Hirngewebe; z.B. den Nucleus arcuatus oder den Plexus choroideus.
Modulatoren von der OCTN 1- oder OCTN 2-Expression werden in einem Verfahren identifiziert, in welchem eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung kontaktiert wird und die Expression von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Protein in der Zelle bestimmt wird. Das Niveau der Expression von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Protein in der Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit dem Niveau der Expression von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Protein in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Diese Kandidatenverbindung kann dann als ein Modulator der OCTN 1- oder OCTN 2-Expression auf Basis dieses Vergleichs identifiziert werden. Zum Beispiel wird, wenn die Expression von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Protein in der Gegenwart der Kandidatenverbindung größer ist (statistisch signifikant größer) als in ihrer Abwesenheit, die Kandidatenverbindung als ein Stimulator von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Proteinexpression identifiziert. Alternativ wird, wenn die Expression von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Protein in der Gegenwart der Kandidatenverbindung geringer ist (statistisch signifikant geringer) als in ihrer Abwesenheit, die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor der OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Proteinexpression identifiziert. Die Niveaus von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Proteinexpression in den Zellen können durch Verfahren bestimmt werden, die hierin zum Detektieren von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA oder -Protein beschrieben werden.
Beispiele von Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken können im Stand der Technik gefunden werden, z.B. in: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994); Zuckermann et al., J. med. Chem. 37:2678 (1994); Cho et al., Science 261:1303 (1993); Carrell et al., Angew. Chemie Int., Hrsg. Engl. 33:2059 (1994); Carell et al., Angew. Chemie Int., Hrsg. Engl. 33:2061 (1994); und Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 (1994).
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung präsentiert werden (z.B. Houghten, Bio/Techniques 13:412-421 (1992)) oder auf Kügelchen (Lam, Nature 354:82-84 (1991)), Chips (Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), Bakterien (US-Patent Nr. 5,223,409), Sporen (US-Patent Nrn. 5,571,698; 5,403,484; und 5,223,409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:1865-1869 (1992)) oder Phagen (Scott & Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin; Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); und Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991).
Diagnostische Anwendungen. Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper der Erfindung sind nützlich zum Identifizieren jener Teile von Säugerzellen, die Proteine enthalten, die wichtig sind für die Funktion von OCTN 1 oder OCTN 2. Antikörper, die spezifische sind für OCTN 1 oder OCTN 2 können wie oben beschrieben hergestellt werden. Die übliche Lokalisierung des Proteins wird dann bestimmt entweder in situ oder unter Verwendung von fraktionierten Zellen durch ein beliebiges Standard-immunologisches oder -immunhistochemisches Verfahren (siehe z.B. Ausubel et al., a.a.O.; Bancroft & Stevens, Theory and Practice of Histological Techniques (Churchill Livingstone, 1982).
Alternativ kann die OCTN 1- oder OCTN 2-Expression untersucht werden durch Standard-Northern-Blot-Analyse oder kann unterstützt werden durch PCR (siehe z.B. Ausubel et al., a.a.O.; PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification; Hrsg. H. A. Ehrlich (Stockton Press, N.Y.). Siehe auch oben für Arbeitsbeispiele. Falls erwünscht oder nötig, kann die Analyse durchgeführt werden, um Punktmutationen der OCTN 2-Sequenz zu detektieren (z.B. unter Verwendung wohl bekannter Polynukleotid-Mismatch-Detektionsverfahren). Alle der obigen Verfahren können ausgeführt werden anhand der hierin beschriebenen OCTN 1- oder OCTN 2-Sequenzen.
Dementsprechend können die Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper der Erfindung in einem Verfahren zur Bestimmung verwendet werden, ob ein Patient eine Krankheit assoziiert mit anormaler Expression von OCTN 1 oder OCTN 2 hat. Das Verfahren kann ausgeführt werden durch Quantifizieren der Niveaus der Expression von OCTN 1 oder OCTN 2 in einer biologischen Probe, erhalten von dem Patienten. Als Kontrolle kann die Quantifizierung ausgeführt werden unter Verwendung einer biologischen Probe, erhalten von einem Subjekt, das gesund ist.
OCTN 1- oder OCTN 2-Expression kann untersucht werden auf dem Niveau der Genexpression, z.B., durch Quantifizieren des Niveaus von OCTN 1- oder OCTN 2-mRNA-Expression in der biologischen Probe, oder auf dem Niveau der Proteinexpression durch Quantifizierung des Niveaus des exprimierten OCTN 1- oder OCTN 2-Proteins. Quantifizierung kann unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken ausgeführt werden, welche der Fachmann anhand seiner Fähigkeiten durchführen kann.
Sollte bestimmt werden, dass ein Patient eine Erkrankung hat, die assoziiert ist mit anormaler Expression oder Aktivität von OCTN 1 oder OCTN 2, kann dem Patienten eine Verbindung verabreicht werden, die die Expression oder Aktivität moduliert. Zum Beispiel kann der Patient eine Verbindung erhalten, wie einen niedermolekularen Wirkstoff (small molecule), ein Antisense-Polynukleotidmolekül oder ein Ribozym, welches die Expression von OCTN 2 inhibiert. Der Patient kann auch eine Verbindung erhalten, die die Aktivität von OCTN 1 oder OCTN 2 inhibiert. Ein Antikörper, der spezifisch OCTN 1 oder OCTN 2 bindet, kann für diesen Zweck verwendet werden. Alternativ kann der Patient eine Verbindung erhalten, die die Expression oder Aktivität von OCTN 2 verstärkt. Verbindungen, die die Expression oder Aktivität von OCTN 2 inhibieren oder verstärken, können synthetische Moleküle umfassen. Diese Verfahren der Behandlung können verwendet werden, um entzündliche Darmerkrankungen und verwandte Erkrankungen, die mit zellulärer Proliferation assoziiert sind, zu behandeln.
Die Details einer oder mehrer Ausführungsformen der Erfindung werden in der obigen Beschreibung dargetan. Obwohl jegliche Verfahren oder Materialien, die ähnlich oder äquivalent sind zu den hierin beschriebenen, in der Praxis bei dem Ausführen oder Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Andere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung und aus den Ansprüchen offenbar. In der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen umfasst die Form des Singulars auch den Bezug auf die Mehrzahl, es sei denn, der Zusammenhang macht eindeutig etwas Anderes nötig. Soweit sie nicht anders definiert sind, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie im Allgemeinen von einem Fachmann des Gebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden.
Die voran stehende Beschreibung ist nur für den Zweck der Illustration präsentiert worden, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie die Erfindung auf die genaue offenbarte Form limitiert, sondern dass dies durch die beigefügten Ansprüche erfolgt. SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes OCTN 1-Polynukleotidfragment der Nukleinsäure codierend SEQ ID NO: 7, wobei das Fragment mindestens 20 Nukleotide in der Länge umfaßt und eine Sequenz enthält, die zu dem L503F Rest von SEQ ID NO: 7 korrespondiert.
Polynukleotidfragment gemäß Anspruch 1, umfassend SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 22.
Isolierter OCTN 1-Primer, umfassend SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 40.
Vektor, umfassend das Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Herstellungsartikel, umfassend das Komplement des Polynukleotids gemäß Anspruch 1 als Polynukleotid-Hybridisierungssonde für die Diagnose einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen homolog zu und spezifisch bindend an ein OCTN 1-Polynukleotid.
Herstellungsartikel gemäß Anspruch 5, weiterhin umfassend eine Hybridisierungssonde, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen homolog zu und spezifisch bindend an ein Polynukleotid, ausgewählt aus 1) SEQ ID NO: 1 oder Fragmenten davon von mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge von SEQ ID NO: 1, 2) SEQ ID NO: 36 oder Fragmenten davon von mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge, 3) SEQ ID NO: 37 oder Fragmenten davon von mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge, 4) dem Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 5) SEQ ID NO: 36, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend Phenylalanin an einer Position korrespondierend zu Position 503 von SEQ ID NO: 7 oder Fragmenten davon mit mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend Phenylalanin an einer Position korrespondierend zu Position 503 von SEQ ID NO: 7, 6) SEQ ID NO: 37, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend Phenylalanin an einer Position korrespondierend zu Position 503 von SEQ ID NO: 7 oder Fragmenten davon mit mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend Phenylalanin an einer Position korrespondierend zu Position 503 von SEQ ID NO: 7.
Isoliertes OCTN 2-Polynukleotidfragment gemäß SEQ ID NO: 8, wobei das Fragment mindestens zwanzig Nukleotide in der Länge umfaßt und eine Sequenz enthält, korrespondierend zu dem G-207C-Rest von SEQ ID NO: 8.
Polynukleotidfragment gemäß Anspruch 7, umfassend SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 18.
Vektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Anspruch 7 oder 8.
Herstellungsartikel, umfassend das Komplement des Polynukleotids gemäß Anspruch 7 als Polynukleotid-Hybridisierungssonde für die Diagnose einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen homolog zu und spezifisch bindend an ein OCTN 2-Polynukleotid.
Herstellungsartikel gemäß Anspruch 10, weiterhin umfassend eine Hybridisierungssonde, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen homolog zu und spezifisch bindend an ein Polynukleotid, ausgewählt aus 1) SEQ ID NO: 3 oder Fragmenten davon von mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge, 2) SEQ ID NO: 23 oder Fragmenten davon von mindestens zwanzig Nukleotiden in der Länge, 3) dem Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, 4) SEQ ID NO: 3, umfassend eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu dem G-207C-Rest von SEQ ID NO: 8 oder Fragmenten davon mit einer Länge von mindestens zwanzig Nukleotiden, umfassend eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu dem G-207C-Rest von SEQ ID NO: 8, 5) SEQ ID NO: 23, umfassend eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu dem G-207C-Rest von SEQ ID NO: 8 oder Fragmenten davon mit einer Länge von mindestens zwanzig Nukleotiden, umfassend eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu dem G-207C-Rest von SEQ ID NO: 8, 6) SEQ ID NO: 25.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung einer Empfänglichkeit gegenüber einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung (IBD) bei einem Säuger, umfassend: (a) Kontaktieren einer biologischen Probe, die von einem Säuger erhalten wurde, mit einer Polynukleotidsonde, die selektiv an ein OCTN 1-Polynukleotid oder ein OCTN 2-Polynukleotid bindet, und (b) Bestimmung der Expression des OCTN 1-Polynukleotids oder des OCTN 2-Polynukleotids als Maß der Empfänglichkeit des Säugers gegenüber einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Expression des OCTN 1-Polynukleotids oder des OCTN 2-Polynukleotids in der biologischen Probe bei Säugern mit einer Empfänglichkeit gegenüber einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung im Vergleich zu Säugern, die gegenüber der entzündlichen Verdauungstrakterkrankung nicht empfänglich sind, reduziert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei die biologische Probe aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Gastrointestinaltraktgewebe und einem Immunsystemgewebe.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die biologische Probe von einem entzündeten Gewebe gewählt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der Säuger menschlich ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die entzündliche Verdauungstrakterkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Morbus Crohn (CD), einer Colitis indeterminata (IC) und einer Colitis ulcerosa. (UC).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei die Bestimmung der Expression durch eine Northern-Analyse geschieht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei die Bestimmung der Expression durch eine Polymerasekettenreaktion geschieht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei die Expression von sowohl dem OCTN 1-Polynukleotid als auch dem OCTN 2-Polynukleotid in der biologischen Probe bestimmt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die Basaltranskription des OCTN 2-Gens herabreguliert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei die Transkription des OCTN 2-Gens, induziert entweder durch Hitzeschock oder durch Arachidonsäure, herabreguliert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei sowohl die Basaltranskription des OCTN 2-Gens als auch die Transkription des OCTN 2-Gens, induziert entweder durch Hitzeschock oder durch Arachidonsäure, herabreguliert ist.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung einer Empfänglichkeit gegenüber einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung (IBD) bei einem Menschen, umfassend: (a) Bestimmung der Polynukleotidsequenz des OCTN 1-Gens oder des OCTN 2-Gens für einen Menschen und (b) Bestimmung, daß die Polynukleotidsequenz des OCTN 1-Gens oder des OCTN 2-Gens für den Menschen einen Polymorphismus enthält, der zu einer reduzierten Expression von OCTN 1 oder OCTN 2 beim Menschen führt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Polynukleotidsequenzen von sowohl dem OCTN 1-Gen als auch dem OCTN 2-Gen für den Menschen bestimmt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei die Polynukleotidsequenz des OCTN 1-Gens mindestens einen L503F-Polymorphismus enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Polynukleotidsequenz des OCTN 1-Gens die Fähigkeit des codierten OCTN 1-Polypeptids zum Transport von Carnitin signifikant reduziert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die Polynukleotidsequenz des OCTN 2-Gens mindestens einen Polymorphismus enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus G-207C, 410 und TA.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die Polynukleotidsequenz des OCTN 2-Gens mindestens einen Polymorphismus in der OCTN 2-Promotorregion enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei der Polymorphismus die Bindung des Hitzeschock- Transkriptionsfaktors 1 (HSF1) an den OCTN 2-Promotor verändert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei der Polymorphismus des OCTN 2-Gens die basale Transkription herabreguliert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei der Polymorphismus des OCTN 2-Gens die Transkription herabreguliert, die entweder durch Hitzeschock oder durch Arachidonsäure induziert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei der Polymorphismus des OCTN 2-Gens sowohl die basale Transkription als auch die entweder durch Hitzeschock oder durch Arachidonsäure induzierte Transkription herabreduziert.
Verfahren zur Identifizierung eines antientzündlichen Mittels, umfassend: (a) Bildung eines Komplexes zwischen dem Hitzeschockfaktor 1-(HSF1)-protein und einem Polynukleotid, umfassend eine OCTN 2-Promotorregion; (b) Kontaktieren des Komplexes mit einem Mittel, von dem man vermutet, daß es den Komplex dissoziiert; und (c) Nachweis der Dissoziation des Komplexes, wobei die Dissoziation des Komplexes das Mittel als ein Mittel identifiziert, bei dem es sich um ein antientzündliches Mittel handelt.
In-vitro-Verfahren zum Nachweis eines Nukleotid-Polymorphismus bei einem Säuger OCTN 1-Gen oder einem Säuger OCTN 2-Gen, assoziiert mit einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Nachweis einer Variation in einer Sequenz eines Gens codierend OCTN 1 oder OCTN 2, erhalten von einem Säuger, der eine Diagnose einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung hat oder bei dem diese vermutet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei der Säuger menschlich ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35 oder 36, wobei die Expression des OCTN 1-Gens in dem entzündeten Gewebe des Säugers signifikant herabreguliert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Expression des OCTN 2-Gens in dem entzündeten Gewebe des Säugers signifikant herabreguliert ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung zur Behandlung einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Kontaktieren einer Testverbindung mit einem System zur Messung der Carnitin-Transportaktivität, wobei das System ein OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid oder ein funktionelles Fragment eines OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptids umfaßt und ein Substrat zur Messung des Carnitin-Transports durch das System; und (b) Nachweis eines Anstiegs der Carnitin-Transportaktivität in Gegenwart der Testverbindung im Vergleich zu der Carnitin-Transportaktivität in Abwesenheit der Testverbindung.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die Testverbindung ein kleines Molekül ist.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die Testverbindung ein intrazellulärer Faktor ist, der an das OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid bindet.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die Testverbindung ein extrazellulärer Faktor ist, der an das OCTN 1- oder OCTN 2-Polypeptid bindet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 42, wobei das Substrat zur Messung des Carnitin-Transports ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carnitin, Tetraethylammonium (TEA) und anderen Verbindungen, die durch die OCTN 1- oder OCTN 2-Transporter transportiert werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 43, wobei das OCTN 1-Polypeptid durch eine Nukleotidsequenz codiert wird, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7 und funktionellen Fragmenten davon, enthaltend eine Sequenz korrespondierend zu dem L503F-Rest der SEQ ID NO: 7.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 44, wobei das OCTN 2-Polypeptid durch eine Nukleotidsequenz codiert wird, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 8 und funktionellen Fragmenten davon, enthaltend eine Sequenz korrespondierend zu dem G-207C-Rest der SEQ ID NO: 8.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung zur Modulation des Carnitin-Transports, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Kontaktieren einer Testverbindung mit einem System zur Messung der Carnitin-Transportaktivität, wobei das System ein OCTN 1- oder ein OCTN 2-Polypeptid oder ein funktionelles Fragment von einem OCTN 1- oder einem OCTN 2-Polypeptid umfaßt und ein Substrat zur Messung des Carnitin-Transports durch das System; und (b) Nachweis einer Modulation in der Carnitin-Transportaktivität in Gegenwart der Testverbindung im Vergleich zu der Carnitin-Transportaktivität in Abwesenheit der Testverbindung.
Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei die Verbindung die Transporterfunktion von OCTN 1 verstärkt.
Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei die Verbindung die Transporterfunktion von OCTN 1 reduziert oder blockiert.
Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei die Verbindung die Transporterfunktion von OCTN 2 verstärkt.
Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei die Verbindung die Transporterfunktion von OCTN 2 reduziert oder blockiert.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung zur Behandlung einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Erhalt eines transgenen Säugers oder eines mutierten Säugers, wobei der Säuger einen Nukleotid-Polymorphismus in einem OCTN 1- oder dem OCTN 2-Gen aufweist, wobei der Polymorphismus in dem OCTN 1-Gen oder dem OCTN 2-Gen die Gewebeexpression des OCTN 1-Gens oder des OCTN 2-Gens reduziert, wobei der Säuger ein nicht-menschlicher Säuger ist; (b) Kontaktieren des Säugers mit einer Testverbindung; und (c) Nachweis einer Verbesserung eines Zustands des Säugers als Reaktion auf die Testverbindung, wobei der Zustand ein Symptom einer entzündlichen Verdauungstrakterkrankung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 51, wobei der Säuger eine Mutation sowohl in dem OCTN 1- als auch dem OCTN 2-Gen aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 51 oder 52, wobei die entzündliche Verdauungstrakterkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Morbus Crohn (CD), der Colitis indeterminata (IC) und der Colitis ulcerosa (UC).