EP3899630A2

EP3899630A2 - Mikroskop

Info

Publication number: EP3899630A2
Application number: EP19835647.9A
Authority: EP
Inventors: Werner Knebel; Florian Fahrbach
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2021-10-27
Also published as: JP2022514666A; US20220113523A1; WO2020127726A2; DE102019110869A1; WO2020127726A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop (10) mit einer Weitfeld-Beleuchtungseinheit (12) zur Beleuchtung zumindest eines ausgewählten Bereichs einer Probe (14) und mit einer Strahlteilereinheit (16, 16') zur Erzeugung eines ersten Detektionsstrahlengangs (18) und eines zweiten Detektionsstrahlengangs (20). Das Mikroskop (10) umfasst ferner eine innerhalb des ersten Detektionsstrahlengangs (18) angeordnete Kamera-Detektionseinheit (20) zur Aufnahme von Bildern des ausgewählten Bereichs der Probe (14) und eine innerhalb des zweiten Detektionsstrahlengangs (20) angeordnete Punkt-Detektionseinheit (24) zur Erfassung eines innerhalb des ausgewählten Bereichs liegenden vorbestimmten Teilbereichs der Probe (14). Innerhalb des ersten und zweiten Detektionsstrahlengangs (18, 20) ist objektseitig der Strahlteilereinheit (16, 16') ein Detektionsobjektiv (26) angeordnet, das als gemeinsames Detektionsobjektiv für die Kamera- Detektionseinheit (22, 22') und die Punkt-Detektionseinheit (24) vorgesehen ist.

Description

Mikroskop

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Weitfeld-Beleuchtungseinheit zur Be leuchtung zumindest eines ausgewählten Bereichs einer Probe. Das Mikroskop umfasst ferner eine Kamera-Detektionseinheit zur Aufnahme von Bildern des ausgewählten Be reichs der Probe.

Mikroskope mit einer Kamera-Detektionseinheit, damit ist im Folgenden insbesondere eine Detektionseinheit gemeint, die einen ortsauflösenden Detektor umfasst, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Kamera-Detektionseinheit erlaubt eine Paralleli sierung des Detektionsvorgangs, da hiermit ein Bild eines ausgewählten Bereichs der Probe in nur einer Messung erstellt werden kann. Jedoch besitzen Kamera-Detektions- einheiten nicht die für bestimmte Mikroskopieanwendungen, wie beispielsweise Fluo reszenzlebensdauer-Mikroskopie („fluorescence lifetime imaging microscopy", FLIM) o- der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie („fluorescence correlation spectroscopy", FCS), nötige Zeitauflösung und/oder spektrale Auflösung.

Aus der US 6,867,899 B2 ist ein konfokales Mikroskop bekannt, das eine Lichtquelle zur Beleuchtung einer Probe und ein Spektrometer, das von der Probe ausgehendes Detek tionslicht detektiert, umfasst. Das Mikroskop umfasst ferner einen akustooptischen De flektor (AOD), der von der Lichtquelle ausgehendes Beleuchtungslicht auf die Probe lenkt und das von der Probe ausgehende Detektionslicht in das Spektrometer lenkt. Das Spektrometer ist ein Punktdetektor, d.h. ein nichtortsauflösender Detektor. Ein Bild ei nes ausgewählten Bereichs wird in mehreren aufeinanderfolgenden Messungen mit dem Spektrometer, d.h. seriell, erzeugt. Hierbei werden mitunter mehr hochaufgelöste Daten erzeugt als tatsächlich benötigt werden.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskop anzugeben, dass die Vorteile einer paralle len Detektion mit den Vorteilen einer seriellen Detektion kombiniert. Diese Aufgabe wird durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.

Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst eine Weitfeld-Beleuchtungseinheit zur Be leuchtung zumindest eines ausgewählten Bereichs einer Probe und eine Strahlteilerein heit zur Erzeugung eines ersten Detektionsstrahlengangs und eines zweiten Detektions strahlengangs. Das Mikroskop umfasst ferner eine innerhalb des ersten Detektions strahlengangs angeordnete Kamera-Detektionseinheit zur Aufnahme von Bildern des ausgewählten Bereichs der Probe und eine innerhalb des zweiten Detektionsstrahlen gangs angeordnete Punkt-Detektionseinheit zur Erfassung eines innerhalb des ausge wählten Bereichs liegenden vorbestimmten Teilbereichs der Probe. Innerhalb des ers ten und zweiten Detektionsstrahlengangs ist objektseitig der Strahlteilereinheit ein De tektionsobjektiv angeordnet, das als gemeinsames Detektionsobjektiv für die Kamera- Detektionseinheit und die Punkt-Detektionseinheit vorgesehen ist.

Die Kamera-Detektionseinheit kann insbesondere als eine Mehr-Kanal-Kamera oder eine Farbkamera ausgebildet sein. Die Punkt-Detektionseinheit kann auch mehrere De tektoren umfassen. Insbesondere können der oder die Detektoren der Punkt-Detekti- onseinheit ein oder mehrere Flächendetektoren sein, die für eine punktweise, d.h. nicht ortsaufgelöste Detektion verwendet werden. Alternativ ist es auch möglich, dass ein Teil der Detektoren der Punkt-Detektionseinheit durch Punktdetektoren, d.h. nicht ortsauflösende Detektoren, und ein weiterer Teil der Detektoren der Punkt-Detektions- einheit durch Flächendetektoren, die für eine nicht ortsaufgelöste Detektion verwendet werden, gebildet sein. Insbesondere können mehrere Punkte des ausgewählten Be reichs der Probe gleichzeitig erfasst werden. Dies kann beispielsweise erfolgen, indem zur Detektion verwendetes Licht mittels einer Mikrospiegelaktoreinheit (DMD) auf ver schiedene Punktdetektoren oder die verschiedenen Bereiche eines Flächendetektors der Punkt-Detektionseinheit verteilt werden. Das erfindungsgemäße Mikroskop kombiniert die Vorteile der parallel detektierenden Kamera-Detektionseinheit mit den Vorteilen der seriell detektierenden Punkt-Detekti- onseinheit. Unter einer Kamera-Detektionseinheit soll insbesondere eine ortsauflö- sende Detektionseinheit verstanden werden, während unter einer Punkt-Detektions- einheit eine nichtortsauflösende Detektionseinheit verstanden werden soll. Die Ka- mera-Detektionseinheit nimmt schnell und probenschonend große Mengen an Bildern des ausgewählten Bereichs auf. Die Punkt-Detektionseinheit erfasst schnell und mit ei ner hohen zeitlichen und/oder spektralen Auflösung den innerhalb des ausgewählten Bereichs liegenden vorbestimmten Teilbereich. Damit kann das erfindungsgemäße Mik roskop insbesondere für die effiziente Messung hochaufgelöster Spektren, für die Ein zelmolekülanalyse oder in bestimmten Mikroskopieanwendungen (wie z.B. FLIM oder FCS) eingesetzt werden. Auch ermöglicht das erfindungsgemäße Mikroskop die gezielte Beobachtung und Verfolgung von dynamischen Prozessen und Ereignissen. Bei den vor genannten Anwendungen ist es oft nicht erforderlich, den gesamten ausgewählten Be reich der Probe mit einer hohen zeitlichen und/oder spektralen Auflösung zu erfassen.

Im Allgemeinen sind Punkt-Detektionseinheiten in der Erfassung etwa um die Anzahl von Bildpunkten (Pixel) einer vergleichbaren Kamera-Detektionseinheit schneller, da hier nur ein einziger Pixel pro Messung ausgelesen werden muss. Vorzugsweise ist die Punkt-Detektionseinheit ausgebildet Messungen mit MHz-Rate durchzuführen. Die Bildrate einer Kamera-Detektionseinheit kann allgemein dadurch maximiert werden, dass nur wenige Zeilen eines Sensorelementes der Kamera-Detektionseinheit ausgele sen werden. Die Bildrate kann aber in der Regel nicht gesteigert werden, indem die Zahl der auszulesenden Spalten reduziert wird. Daher liegt die Höchstgeschwindigkeit für Kamera-Detektionseinheiten, hier beispielhaft mit einem Sensorelement mit 8 Zeilen ä 2500 Pixel, typischerweise um einen Faktor 20000 unterhalb der Rate, die für einen Punktdetektor mit vergleichbarer Elektronik, d.h. insbesondere Verstärker und Analog- Digital-Konverter, erreicht werden kann. Punkt-Detektoren sind gegenüber Aberrationen des Fokus, die im Detektionsstrahlen gang beispielswiese durch Filter/Strahlteileroptiken induziert werden, weitestgehend unempfindlich, da diese nur die Lichtstärke und nicht deren Verteilung messen. Das er höht die Flexibilität und erlaubt z.B. die Verwendung von schräggestellten Filtern auch in nicht-kollimierten Teilen des Strahlengangs und somit platzsparende und kosten günstigere Optiken.

In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst das Mikroskop eine Steuereinheit. Die Steuereinheit steuert wenigstens die Punkt-Detektionseinheit in Abhängigkeit des vor bestimmten Teilbereichs der Probe und/oder in Abhängigkeit eines vorbestimmten Zeitpunkts für eine mithilfe der Punkt-Detektionseinheit durchführbare Messung. Die durch die Steuereinheit gesteuerte Messung erfolgt wesentlich genauer in Bezug auf die Erfassung des vorbestimmten Teilbereichs der Probe und/oder in Abhängigkeit des vorbestimmten Zeitpunkts als beispielsweise eine manuell gesteuerte Messung. Insbe sondere für bestimmte Mikroskopieanwendungen, wie beispielsweise FLIM, ist es er forderlich, dass die Erfassung durch die Punkt-Detektionseinheit präzise zu dem vorbe stimmten Zeitpunkt erfolgt. Die Steuereinheit kann insbesondere eine Eingrenzung des vorbestimmten Teilbereichs der Probe, eine Einstellung einer Beleuchtungsintensität und/oder eine Einstellung der Wellenlänge, des Wellenlängenbereichs oder der Wel lenlängenbereiche des zur Beleuchtung der Probe oder des vorbestimmten Teilbereichs der Probe verwendeten Lichts vornehmen. Ferner kann die Steuereinheit, insbesondere wenn das Mikroskop für eine FLIM-Messungen verwendet wird, eine gepulste Beleuch tung mit einer Detektion durch die Kamera-Detektionseinheit und/oder die Punkt-De- tektionseinheit synchronisieren, d.h. eine Erfassung und/oder Steuerung der Zeit punkte der Aussendung eines Beleuchtungs-Lichtpulses und einer insbesondere zeit aufgelösten Erfassung eines Fluoreszenzsignals.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung ist der vorbestimmte Teilbereich der Probe und/oder der vorbestimmte Zeitpunkt in der Steuereinheit voreingestellt gespei chert. Der vorbestimmte Teilbereich der Probe und/oder der vorbestimmte Zeitpunkt können dabei beispielsweise durch eine Bedienperson eingegeben werden. Insbeson dere können als Grundlage für die Eingabe des vorbestimmten Teilbereichs und/oder des vorbestimmten Zeitpunkts die von der Kamera-Detektionseinheit aufgenommenen Bilder des ausgewählten Bereichs der Probe dienen. Beispielsweise kann die Bedienper son einen interessanten Teilbereich („region of interest", ROI) innerhalb eines der von der Kamera-Detektionseinheit aufgenommenen Bilder als vorbestimmten Teilbereich auswählen.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung umfasst das Mikroskop eine mit der Steu ereinheit gekoppelte Bildverarbeitungseinheit. Die Bildverarbeitungseinheit ermittelt den vorbestimmten Teilbereich der Probe und/oder den vorbestimmten Zeitpunkt auf Grundlage mindestens eines der durch die Kamera-Detektionseinheit aufgenommenen Bilder, und stellt den vorbestimmten Teilbereich der Probe und/oder den vorbestimm ten Zeitpunkt für die Steuereinheit zur Steuerung der Punkt-Detektionseinheit bereit. Die Bildverarbeitungseinheit gestattet eine schnellere und präzisere Bestimmung des vorbestimmten Teilbereichs der Probe und/oder des vorbestimmten Zeitpunkts als bei spielsweise eine manuelle Bestimmung durch die Bedienperson.

Bei der Bildverarbeitungseinheit kann es sich insbesondere um eine intelligente Bildver arbeitungseinheit handeln, d.h. eine Einheit, die beispielsweise insbesondere unter An wendung eines Maschinenlernverfahrens gelernt hat, in welchen Teilbereich der Probe eine detaillierte Messung lohnenswert ist. Ferner ist es vorteilhaft, wenn Ereignisse, beispielsweise die Expression eines bestimmten Proteins, durch den Nutzer vor einer Zeitreihenmessung festgelegt werden können. Die Expression kann sich insbesondere durch den Anstieg des an einer bestimmten Stelle gemessenen Fluoreszenz-Signals äu ßern. Diese Ereignisse können als Auslöser für eine Detektion mit der Punkt-Detektions- einheit in einem bestimmten Teilbereich der Probe dienen. Die Bildverarbeitungsein heit kann insbesondere auch darauf trainiert worden sein, auf bestimmte Ereignisse, beispielsweise die vorgenannte Expression, zu reagieren. Eine mögliche Ausführungsform eines mittels der vorteilhaften Weiterbildung durchge führten Verfahrens sieht wie folgt aus: Mittels der Kamera-Detektionseinheit wird eine probenschonende Zeitreihenaufnahme einer mittels eines Lichtblatt beleuchteten Probe durchgeführt, z.B. über mehrere Stunden. Die aufgenommenen Bilddaten wer den durch die trainierte oder den Benutzer vorkonfigurierte Bildverarbeitungseinheit auf Ereignisse untersucht, wie z.B. verstärkte Signale oder allgemein die Veränderung der Signalstärke in bestimmten Bildbereichen. Werden Ereignisse festgestellt so schal tet das Mikroskop kurzzeitig in den Punkt-Detektionsmodus und untersucht die ermit telten Bildbereiche.

Mit der Punktdetektionseinheit können Messungen der Lebensdauer der angeregten Fluoreszenz durchgeführt werden. Insbesondere wenn die Kamera-Detektionseinheit als eine Mehr-Kanal-Kamera oder Farbkamera ausbildet ist, können hochauflösende Spektren ermittelt werden. um die mit einer Mehr-Kanal-Kamera bzw. Farb-Kamera auf genommen Daten beispielsweise mittels der Steuereinheit nach Farbstoffen zu tren nen. Eine solche Trennung wird auch als„spectral unmixing" bezeichnet. Die Trennung der mit einer Mehr-Kanalkamera aufgenommenen Daten mittels„spectral unmixing" ist grundsätzlich auch ohne weitere Information möglich, jedoch ist die Zahl der Kanäle bei einer Kamera-basierten Detektion in der Regel auf 3 bis 4 Kanäle eingeschränkt. Hier kann die zusätzliche Messung hochaufgelöster Spektren mit deutlich mehr Kanälen hilf reich sein, um das„spectral unmixing" der Bilder, die mit der Mehr-Kanal Kamera auf genommen wurden, zu unterstützen, indem dem Algorithmus (oder der trainierten Bildverarbeitungseinheit) zusätzliche Information über die spektrale Beschaffenheit von einer Probe ausgehenden Lichts zur Verfügung gestellt wird.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung steuert die Steuereinheit die Weitfeld- Beleuchtungseinheit in Abhängigkeit des vorbestimmten Teilbereichs der Probe und/o der in Abhängigkeit des vorbestimmten Zeitpunkts. Dies erlaubt beispielsweise eine Synchronisation der Weitfeldbeleuchtung mit der durch die Punkt-Detektionseinheit durchgeführten Messung, die bei bestimmten Mikroskopieanwendungen, wie bei spielsweise FLIM, erforderlich ist.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung ist die Strahlteilereinheit durch ein durch die Steuereinheit schaltbares Spiegelelement gebildet. Das schaltbare Spiegelelement ist derart ausgebildet, dass in einem ersten Schaltzustand Detektionslicht, das von der Probe ausgeht, auf die Kamera-Detektionseinheit gelenkt wird, und dass in einem zwei ten Schaltzustand das von der Probe ausgehende Detektionslicht auf die Punkt-Detek- tionseinheit gelenkt wird. Hierdurch ist ein einfach aufgebauter Strahlteiler realisiert, der es auf mechanische Weise erlaubt, eine Detektion wahlweise mit der Kamera-De- tektionseinheit oder der Punkt-Detektionseinheit durchzuführen. Die Pixel, die in dem mittels der Kamera-Detektionseinheit erfassten Bild fehlen, können insbesondere durch die Detektion der Punkt-Detektionseinheit ergänzt werden.

In einer alternativen vorteilhaften Weiterbildung ist die Strahlteilereinheit durch eine durch die Steuereinheit steuerbare Mikrospiegelaktoreinheit („digital mirror device", DMD) gebildet. Die Mikrospiegelaktoreinheit ist derart ausgebildet, dass wenigstens ein erster, dem vorbestimmten Teilbereich der Probe zugeordneter Teil von Detektions licht, das von dem ausgewählten Bereich ausgeht, auf die Punkt-Detektionseinheit ge lenkt wird und ein zweiter Teil des von dem ausgewählten Bereich ausgehenden Detek tionslichts, der zu dem ersten Teil komplementär ist, auf die Kamera-Detektionseinheit gelenkt wird. Hierdurch erlaubt es die Mikrospiegelaktoreinheit, das gesamte von vor bestimmten Teilbereich der Probe ausgehende Detektionslicht selbst dann auf die Punkt-Detektionseinheit zu lenken, wenn der vorbestimmte Teilbereich eine komplexe geometrische Gestalt hat. Hierdurch kann der gesamte vorbestimmte Teilbereich in ei ner Messung erfasst werden. Ferner besitzen die Spiegel der Mikrospiegelaktoreinheit jeweils eine geringere Masse als beispielsweise ein einzelner Galvanometerspiegel, wodurch sich die durch die Mikrospiegelaktoreinheit gebildete Strahlteilereinheit schneller schalten lässt. Die Schaltung der Mikrospiegelaktoreinheit kann innerhalb we niger Mikrosekunden und darunter erfolgen, so dass eine schnelle punktaufgelöste Messung mittels der Punkt-Detektionseinheit an einem Punkt oder in mehreren Berei chen der Probe auch während einer einzigen Belichtungszeit der Kamera-Detektions- einheit möglich ist.

Die Mikrospiegelaktoreinheit besteht aus einer Vielzahl wenige Mikrometer großer, schaltbarer Mikrospiegel, die einzeln angesteuert werden können. Jeder Mikrospiegel ist derart ausgebildet, dass er in einem ersten Schaltzustand Detektionslicht, das von der Probe ausgeht, auf die Kamera-Detektionseinheit lenkt, und dass er in einem zwei ten Schaltzustand das von der Probe ausgehende Detektionslicht auf die Punkt-Detek- tionseinheit lenkt.

In einer weiteren alternativen vorteilhaften Weiterbildung ist die Strahlteilereinheit durch einen neutralen Strahlteiler (Neutralstrahlteiler), einen Polarisationsstrahlteiler (polarisierende Strahlteiler) oder einen dichroitischen Spiegel gebildet. In diesem Fall besitzt die Strahlteilereinheit keine mechanisch beweglichen Bauteile und hat damit eine geringe Fehleranfälligkeit. Ferner ist die Verwendung einer solchen Strahlteilerein heit mit geringen Fertigungskosten verbunden. Mit einer solchen Strahlteilereinheit kann eine Aufspaltung des Detektionslichts nach Farben (dichroitischer Spiegel) und/o der Polarisationsrichtungen (Polarisationsstrahlteiler) erfolgen.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung umfasst das Mikroskop eine erste Tubus linse. Die erste Tubuslinse ist zwischen dem Detektionsobjektiv und der Strahlteilerein heit angeordnet und wird durch die Kamera-Detektionseinheit und die Punkt-Detekti- onseinheit gemeinsam genutzt. Diese Weiterbildung ist besonders platzsparend, da hier die Notwendigkeit von bildseitig der Strahlteilereinheit angeordneten separaten Tubus linse in dem ersten Detektionsstrahlengang und dem zweiten Detektionsstrahlengang entfällt. In einer alternativen vorteilhaften Weiterbildung umfasst das Mikroskop eine erste Tu buslinse und eine zweite Tubuslinse. Die erste Tubuslinse ist zwischen der Strahlteile reinheit und der Kamera-Detektionseinheit angeordnet. Die zweite Tubuslinse ist zwi schen der Strahlteilereinheit und der Punkt-Detektionseinheit angeordnet.

In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst die Punkt-Detektionseinheit einen durch die Steuereinheit steuerbaren Kippspiegel, der bildseitig der Strahlteilereinheit in dem zweiten Detektionsstrahlengang angeordnet ist. Die Steuereinheit steuert den Kipp spiegel insbesondere derart, dass wenigstens ein Teil des von dem vorbestimmten Teil bereich ausgehenden Detektionslicht erfasst wird. Hierdurch kann der vorbestimmte Teilbereich in mehreren aufeinanderfolgenden Messungen abgerastert und vollständig seriell erfasst werden.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung umfasst die Punkt-Detektionseinheit eine von der Strahlteilereinheit verschiedene, durch die Steuereinheit steuerbare Mikrospie gelaktoreinheit (DMD), die bildseitig der Strahlteilereinheit in dem zweiten Detektions strahlengang angeordnet ist. Jeder Mikrospiegel dieser Mikrospiegelaktoreinheit ist derart ausgebildet, dass er in einem ersten Schaltzustand von der Probe ausgehendes Detektionslicht entlang des zweiten Detektionsstrahlengangs auf eine Detektionsein heit lenkt und dass er in einem zweiten Schaltzustand das von der Probe ausgehende Detektionslicht beispielsweise auf einen Absorber oder eine weitere Detektionseinheit lenkt. Die Mikrospiegelaktoreinheit ist dabei vorzugsweise in einer zur Bildebene der Kamera-Detektionseinheit konjugierten Ebene angeordnet.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung ist die Punkt-Detektionseinheit derart ausgebildet, dass von dem vorbestimmten Teilbereich der Probe ausgehendes Detekti onslicht spektral aufgelöst erfasst wird. Beispielsweise kann die Punkt-Detektionsein- heit ein fasergekoppeltes Spektrometer umfassen. Dies erlaubt neben der Erzeugung hochaufgelöster Spektraldaten insbesondere auch die Identifizierung sich in dem vor bestimmten Teilbereich überlagernder Fluorophore, die mithilfe der Kamera-Detekti- onseinheit allein nicht möglich ist.

Vorzugsweise umfasst die Punkt-Detektionseinheit ein dispersives Element, das ein in die Punkt-Detektionseinheit einfallendes Lichtbündel spektral aufspaltet. Die Punkt-De- tektionseinheit umfasst einen Spektraldetektor, der als eine aus mehreren Detektorein heiten bestehende Anordnung zur Detektion des spektral aufgespaltenen Lichtbündels ausgebildet ist. Hierdurch wird die spektral aufgelöste Erfassung des vorbestimmten Teilbereichs der Probe ermöglicht.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung ist die Weitfeld-Beleuchtungseinheit zur Erzeugung eines Lichtblattes ausgebildet. Mithilfe des Lichtblattes können dünne Schichten der Probe beleuchtet und zur Fluoreszenz angeregt werden. Hierdurch wird eine höhere Auflösung als bei anderen Methoden zur Weitfeldbeleuchtung erreicht.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung ist das Detektionsobjektiv als Beleuch tungsobjektiv der Weitfeld-Beleuchtungseinheit ausgebildet. Hierdurch kann das Mik roskop besonders platzsparend ausgestaltet werden. Derartige Anordnungen finden insbesondere in der Schiefebenenmikroskopie („oblique plane microscopy", OPM) und der„swept confocally-aligned planar excitation" (SCAPE) Mikroskopie Verwendung.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschrei bung, welche die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren näher erläutert.

Es zeigen:

Figur 1 ein Ausführungsbeispiel eines Mikroskops mit einer Kamera-Detektions- einheit und einer Punkt-Detektionseinheit, Figur 2 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops mit einer Kamera-

Detektionseinheit und einer Punkt-Detektionseinheit,

Figur 3 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops mit einer Kamera-

Detektionseinheit und einer Punkt-Detektionseinheit, und

Figur 4 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops mit einer Kamera-

Detektionseinheit und einer Punkt-Detektionseinheit und

Figur 5 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops mit einer Kamera-

Detektionseinheit und einer Punkt-Detektionseinheit.

Figur 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Mikroskop 10a. Das Mikroskop 10a umfasst eine Weitfeld-Beleuchtungseinheit 12, eine Strahlteilereinheit 16, eine Kamera-Detek- tionseinheit 22, eine Punkt-Detektionseinheit 24 und eine Steuereinheit 28.

Die Weitfeld-Beleuchtungseinheit 12 umfasst eine Lichtquelle 40, ein Beleuchtungsob jektiv 42 und einen Umlenkspiegel 44. Die Lichtquelle 40 erzeugt Beleuchtungslicht, aus dem mithilfe des Beleuchtungsobjektivs 42 und des Umlenkspiegels 44 ein in der Ob jektebene liegendes Lichtblatt erzeugt wird. Das Lichtblatt beleuchtet wenigstens einen ausgewählten Bereich einer Probe 14. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Beleuch tungslicht um Licht, das in der Probe 14 befindliche Fluorophore zur Fluoreszenz/Phos phoreszenz anregt.

Die Strahlteilereinheit 16 ist bildseitig der Probe 14 angeordnet und in Figur 1 beispiel haft als ein Strahlteilerwürfel ausgebildet. Alternativ kann die Strahlteilereinheit 16 als eine Strahlteilerplatte, ein Neutraldichtefilter, ein Polarisationsfilter, ein chromatisches oder dichromatisches Filter, ein mechanisch in den Strahlengang einbringbarer und ver- schiebbarer Spiegel, ein elektronisch schaltbarer Spiegel oder ein Bauteil sein, das ver schiedene Merkmale der vorgenannten Bauteile kombiniert. Zwischen der Probe 14 und der Strahlteilereinheit 16 ist ein Detektionsobjektiv 26 angeordnet. Die Strahlteile reinheit 16 teilt von der Probe 14 ausgehendes Detektionslicht nach Durchtritt durch das Detektionsobjektiv 26 durch Transmission auf einen ersten Detektionsstrahlengang 18 und durch Reflexion auf einen zweiten Detektionsstrahlengang 20 auf. Sowohl der erste Detektionsstrahlengang 18 als auch der zweite Detektionsstrahlengang 20 begin nen auf der Objektebene, d.h. in der Probe 14. Das Detektionsobjektiv 26 liegt somit gleichsam sowohl in dem ersten Detektionsstrahlengang 18 als auch in dem zweiten Detektionsstrahlengang 20.

Die Kamera-Detektionseinheit 22 ist insbesondere als eine Mehr-Kanal-Kamera oder Farbkamera ausgebildet und innerhalb des ersten Detektionsstrahlengangs 18 angeord net. Zwischen der Strahlteilereinheit 16 und der Kamera-Detektionseinheit 22 ist eine erste Tubuslinse 32 angeordnet. Hierdurch ist in dem ersten Detektionsstrahlengang 18 eine Anordnung zur Aufnahme von Bildern des ausgewählten Bereichs der Probe 14 realisiert.

Die Punkt-Detektionseinheit 24 ist innerhalb des zweiten Detektionsstrahlengangs 20 angeordnet. Die Punkt-Detektionseinheit 24 umfasst einen steuerbaren Kippspiegel 36, einen Detektor 46 und weitere optische Elemente, die hier allgemein mit dem Bezugs zeichen 48 bezeichnet werden, wie beispielsweise (Loch-)Blenden, Filter oder Linsen. Insbesondere kann eine (Loch-)Blende vor dem Detektor 46 angeordnet sein. Durch den Kippspiegel 36 kann einzelnen Punkten oder punktförmigen Bereichen auf der Probe 14 zugeordnetes Detektionslicht auf den Detektor 46 gelenkt werden. Durch Verkippen des Kippspiegels längs zweier zueinander senkrechter Achsen kann in aufeinanderfol genden Messungen ein vorbestimmter Teilbereich (z.B. ein ausgewählter interessanter Bereich oder ein Bereich, in dem sich mehrere verschiedene Fluorophore überlagen), der insbesondere innerhalb des ausgewählten Bereichs liegt, vollständig erfasst wer- den. Der Detektor 46 ist ausgebildet, das über den zweiten Detektionsstrahlengang ein fallende Detektionslicht spektral und/oder zeitlich hochaufgelöst zu detektieren. Bei spielsweise ist der Detektor 46 durch ein fasergekoppeltes Spektrometer oder eine La winenphotodiode („avalanche photodiode", APD) gebildet. Der Detektor 46 kann auch durch ein dispersives Element, das ein in die Punkt-Detektionseinheit 24 einfallendes Lichtbündel spektral aufspaltet, und eine aus mehreren Detektoreinheiten bestehende Anordnung zur Detektion des spektral aufgespaltenen Lichtbündels gebildet sein.

Zwischen der Strahlteilereinheit 16 und der Punkt-Detektionseinheit 24 ist in dem zwei ten Detektionsstrahlengang 20 eine zweite Tubuslinse 34 angeordnet. Hierdurch ist in dem zweiten Detektionsstrahlengang 20 eine Anordnung zur seriellen Erfassung des vorbestimmten Bereichs gleichsam wie mit einem Konfokalmikroskop gebildet.

Das Detektionsobjektiv 26 und die zweite Tubuslinse 34 bilden in dem gezeigten Aus führungsbeispiel ein System aus zwei Linsen im Abstand ihrer Brennweiten, das auch 4f-System genannt wird. Ein solches 4f-System ist telezentrisch und hat dadurch posi tive Abbildungseigenschaften, beispielsweise hängt die Vergrößerung nicht von dem Abstand zwischen der Gegenstandsebene und der Bildebene ab. Dies bedeutet, dass zwischen dem Detektionsobjektiv 26 und der zweiten Tubuslinse 34 ein Unendlich- Strahlengang vorliegt, also ein Teil des Strahlengangs in dem das Licht kollimiert ist. Die Strahlteilereinheit 16 definiert eine gegenüber der Normalen zur optischen Achse ver kippte Grenzfläche zwischen zwei Medien, z.B. Glas und Luft, und ist daher innerhalb dieses Unendlich-Strahlengang angeordnet. Durch die Anordnung im Unendlich-Strah- lengang wird das Entstehen von Aberrationen vermieden. Dies wird insbesondere in Bezug auf das weiter unten anhand von Figur 4 beschriebene Ausführungsbeispiel deut lich, bei dem die Strahlteilereinheit 16 in einem nicht-kollimierten Strahlengang ange ordnet ist und daher das durch die Strahlteilereinheit 16 transmittierte (und damit ab- errierte) Licht auf die gegenüber Aberrationen unempfindliche Punkt-Detektionseinheit 24 gelenkt wird. Allgemein können Strahlteiler in einem unendlich-Strahlengang (kolli- mierte Lichtbündel) als Platten ausgestaltet sein, während diese in nicht-nicht-unend- lich Strahlengängen (fokussiertes oder defokussierte Lichtbündel) vorteilhafterweise als Würfel realisiert werden um zu Aberrationen zu vermeiden. Eine Ausnahme hierzu wird in Figur 4 dargestellt. Strahlteilerplatten haben typischerweise gegenüber Strahlteiler würfeln Vorteile hinsichtlich ihre spektralen Teilungseigenschaften und sind oft auch kostengünstiger.

In einer alternativen Ausführungsform bilden das Detektionsobjektiv 26 und die zweite Tubuslinse 34 keine telezentrische 4f-Optik. Um dennoch keine Aberrationen zu erzeu gen, ist beispielsweise das Detektionsobjektiv 26 derart auskorrigiert, dass im Zusam menspiel mit einer entsprechend positionierten Tubuslinse Licht, das aus einer proben seitigen Ebene des Detektionsobjektivs 26 stammt, scharf auf einen Detektor abgebil det wird, dieses Licht jedoch nicht kollimiert zwischen dem Detektionsobjektiv 26 und der zweiten Tubuslinse 34 verläuft. Hierbei ist die abgebildete probenseitige Ebene nicht deckungsgleich mit der definitionsgemäßen Fokusebene des Detektionsobjektivs 26. Weitere alternative Ausführungsformen sind denkbar. Entscheidend ist, dass kein Fokus zwischen dem Detektionsobjektiv 26 und der zweiten Tubuslinse 34 gebildet wird.

Ferner bilden die Linsen 48 eine telezentrische 4f-Optik. Dies stellt sicher, dass durch den Kippspiegel 36 keine Aberrationen induziert werden.

Die Steuereinheit 28 ist derart ausgebildet, dass der vorbestimmte Teilbereich der Probe 14 und/oder ein vorbestimmter Zeitpunkt (z.B. der Zeitpunkt eines interessanten biologischen Ereignisses in der Probe 14) für eine Messung mit der Punkt-Detektions- einheit 24 in der Steuereinheit 28 speicherbar ist. Beispielsweise können der vorbe stimmte Teilbereich und/oder der vorbestimmte Zeitpunkt durch eine Bedienperson in die Steuereinheit 28 eingegeben werden. Die Steuereinheit 28 umfasst ferner eine Bild verarbeitungseinheit 30, die ausgebildet ist, den vorbestimmten Teilbereich der Probe 14 und/oder den vorbestimmten Zeitpunkt für die Messung mit der Punkt-Detektions- einheit 24 zu ermitteln und für die Steuereinheit 28 bereitzustellen. Die Steuereinheit 28 ist ferner mit der Kamera-Detektionseinheit 22 und der Strahlteilereinheit 16 ver bunden und ausgebildet, diese zu steuern. Insbesondere kann die Strahlteilereinheit 16 gesteuert werden, um flexibel und automatisiert Filter, beispielsweise für bestimmte Bildbereiche, zu wechseln.

Die Ermittlung des vorbestimmten Teilbereichs der Probe 14 und/oder des vorbestimm ten Zeitpunkts für die Messung mit der Punkt-Detektionseinheit 24 durch die Bedien person und/oder die Bildverarbeitungseinheit 30 erfolgt insbesondere auf Grundlage der von der Kamera-Detektionseinheit 22 aufgenommenen Bilder des ausgewählten Bereichs der Probe 14. Beispielsweise kann die Bildverarbeitungseinheit 30 Bildpunkte (Pixel) in den durch die Kamera-Detektionseinheit 22 aufgenommenen Bilder identifi zieren, in denen sich verschiedene Fluorophore überlagen, und diese als vorbestimm ten Teilbereich bestimmen. Mithilfe der Punkt-Detektionseinheit 24 kann dann eine spektral aufgelöste Messung erfolgen, die eine eindeutige Identifizierung der Fluoro phore des vorbestimmten Teilbereichs erlaubt. Als Grundlage für die Bestimmung des vorbestimmten Zeitpunkts können beispielsweise in der Probe 14 stattfindende physi ologische oder neurologische Ereignisse dienen, die durch die Bildverarbeitungseinheit 30 identifiziert werden.

Die Steuereinheit 28 steuert den Kippspiegel 36 der Punkt-Detektionseinheit 24 und die Weitfeld-Beleuchtungseinheit 12 dabei in Abhängigkeit des vorbestimmten Teilbe reichs der Probe 14 und/oder des vorbestimmten Zeitpunkts für die Messung mit der Punkt-Detektionseinheit 24. Durch die Steuereinheit 28 wird der Kippspiegel 36 der Punkt-Detektionseinheit 24 derart gesteuert, dass mit der Punkt-Detektionseinheit 24 in aufeinanderfolgenden Messungen der gesamte vorbestimmte Teilbereich der Probe 14 erfasst wird. Die Punkt-Detektionseinheit 24 wird beispielsweise durch die Steuer einheit 28 derart gesteuert, dass durch Verändern des Durchmessers einer Lochblende die Größe eines in einer Messung abgerasterten, insbesondere punkt- oder kreisförmi gen Bereichs verändert wird, über den ein Detektor der Punkt-Detektionseinheit 24 in tegriert. Die Steuereinheit 28 kann ferner beispielsweise die Wellenlänge des von der Weitfeld-Beleuchtungseinheit 12 erzeugten Beleuchtungslichts steuern.

Die Kombination eines Punkt-Detektors mit einer Lichtblattbeleuchtung eröffnet neue Freiheiten. Bei einem üblichen punktscannenden Konfokalmikroskop kann der Bereich, über den bei einer einzelnen Messung integriert wird, nicht ohne weiteres variiert wer den. Die numerische Apertur eines Beleuchtungsstrahls definiert die Verteilung des Be leuchtungslichts. Der beleuchtete Bereich kann also z.B. nicht einfach vergrößert wer den. Dies würde ein Abblenden bzw. eine Reduktion der numerischen Apertur der Be leuchtung erfordern und damit einhergehend eine ungewollte Verlängerung der Schär fentiefe des Beleuchtungsfokus. Alternativ könnte dies auch durch eine Vergrößerung des Durchmessers einer Lochblende eines in üblichen punktscannenden Konfokalmik- roskopen verwendeten Punktdetektors erreicht werden. Hierdurch wird jedoch die Schärfentiefe der Detektion (Tiefendiskriminerung) deutlich verschlechtert. Die Be leuchtung mit einem Lichtblatt ist daher ein wichtiger Baustein, um die Freiheit bei der Abtastung mit der Punkt-Detektionseinheit zu erhöhen. Eine über einen größeren Be reich der Probe aufintegrierte Messung mittels eines Detektors kann beispielsweise die Sensitivität und/oder die zeitliche Auflösung der Messung erhöhen.

Figur 2 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops 10b. Das in Figur 2 ge zeigte Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von dem in Figur 1 gezeigten Ausfüh rungsbeispiel dadurch, dass die Punkt-Detektionseinheit 24 eine Mikrospiegelaktorein heit 38 („digital mirror device", DMD) anstelle eines steuerbaren Kippspiegels 36 auf weist.

Die Mikrospiegelaktoreinheit 38 ist bildseitig der Strahlteilereinheit 16 im zweiten De tektionsstrahlengang 20 in einer zur Bildebene der Kamera-Detektionseinheit 22 konju gierten Ebene angeordnet. Die Mikrospiegelaktoreinheit 38 besteht aus einer Vielzahl wenige Mikrometer großer, schaltbarer Mikrospiegel, die einzeln, beispielsweise durch die Steuereinheit 28, angesteuert werden können. Jeder Mikrospiegel der Mikrospie gelaktoreinheit 38 ist derart ausgebildet, dass in einem ersten Schaltzustand das von der Probe 14 ausgehende Detektionslicht auf den Detektor 46 gelenkt wird, und dass in einem zweiten Schaltzustand das von der Probe 14 ausgehende Detektionslicht auf ei nen Absorber gelenkt wird. Da die Mikrospiegelaktoreinheit 38 in der zur Bildebene der Kamera-Detektionseinheit 22 konjugierten Ebene angeordnet ist, kann durch Schalten einzelner Mikrospiegel der Mikrospiegelaktoreinheit 38 gezielt den einzelnen Bildpunk ten der von der Kamera-Detektionseinheit 22 aufgenommen Bilder jeweils zugeordne tes Detektionslicht auf den Detektor 46 gelenkt werden. Die Mikrospiegelaktoreinheit 38 wirkt gleichsam als Blende der Punkt-Detektionseinheit 24, da sie das in den Detek tor 46 fallende Detektionslicht begrenzen kann.

Die Detektionslichtstrahlen 20 treffen kollimiert auf den Detektor 46. Es werden also keine zwei Punkte auf den Detektor 46 abgebildet, sondern zwei gegeneinander ver kippte kollimierte Strahlengänge treffen auf den Detektor 46. Der Detektor 46 integriert also das Signal über die von der Mikrospiegelaktoreinheit 38 selektierten Punkte. Die Mikrospiegelaktoreinheit 38 liegt in dem in Figur 2 gezeigten Ausführungsbeispiel in ei ner zur Fokusebene des Detektionsobjektivs 26 konjugierten Ebene.

Figur 3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops 10c. Das in Figur 3 ge zeigte Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von dem in Figur 1 gezeigten Ausfüh rungsbeispiel zum einen dadurch, dass die Strahlteilereinheit 16' durch eine durch die Steuereinheit 28 gesteuerte Mikrospiegelaktoreinheit gebildet ist. Zum anderen um fasst die Weitfeld-Beleuchtungseinheit 12 in dem in Figur 3 gezeigten Ausführungsbei spiel neben der Lichtquelle 40 eine Zylinderoptik 50 zur Erzeugung eines Lichtblatts.

Jeder Mikrospiegel der den Strahlteiler 16' bildenden Mikrospiegelaktoreinheit ist der art ausgebildet, dass in einem ersten Schaltzustand Detektionslicht, das von der Probe 14 ausgeht, auf die Kamera-Detektionseinheit 22' gelenkt wird, und dass in einem zwei ten Schaltzustand das von der Probe 14 ausgehende Detektionslicht auf die Punkt-De- tektionseinheit 24 gelenkt wird. Durch Schalten einzelner Mikrospiegel der Mikrospie gelaktoreinheit kann gezielt das einzelnen Bildpunkten der von der Kamera-Detektions- einheit 22' aufgenommen Bilder jeweils zugeordnete Detektionslicht in die Punkt-De- tektionseinheit 24 gelenkt werden. Somit lässt sich der vorbestimmte Teilbereich unab hängig von seiner konkreten geometrischen Gestalt in einer oder mehreren Messungen vollständig erfassen.

In dem in Figur 3 gezeigten Ausführungsbeispiel entfällt die Notwendigkeit für die zweite Tubuslinse 34, da die Punktdetektionseinheit keine hohe Abbildungsgüte erfor dert.

Figur 4 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops lOd. Bei diesem Aus führungsbeispiel erzeugt die Strahlteilereinheit 16 aus dem von der Probe 14 ausgehen den Detektionslicht durch Reflexion den ersten Detektionsstrahlengang 18 und durch Transmission den zweiten Detektionsstrahlengang 20. Die durch die Transmission indu zierten Aberrationen sind für eine Messung mit der im zweiten Detektionsstrahlengang 20 angeordneten Punkt-Detektionseinheit 24 unkritisch. Durch diese Anordnung ent fällt die Notwendigkeit einer bildseitig der Strahlteilereinheit 16 angeordneten separa ten Tubuslinse (d.h. die Tubuslinsen 32, 34 für jeden Detektionsstrahlengang 18, 20 der Mikroskope 10 nach den Figuren 1 und 2 entfallen hier). Die einzige Tubuslinse 32 ist zwischen der Strahlteilereinheit 16 und dem Detektionsobjektiv 26 angeordnet.

Figur 5 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops lOe. Das in Figur 5 ge zeigte Mikroskop lOe unterscheidet sich von dem in Figur 1 gezeigten Mikroskop 10a im Wesentlichen dadurch, dass die Punkt-Detektionseinheit 24 einen ersten Detektor 46a und einen zweiten Detektor 46b umfasst. Gleiche oder gleichwirkende Elemente sind in den Figuren 1 und 5 mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Die Mikrospie gelaktoreinheit 38 der Punkt-Detektionseinheit 24 ist derart ausgebildet, dass durch Schalten einzelner Mikrospiegel der Mikrospiegelaktoreinheit 16 das Detektionslicht, das einzelnen Bildpunkten der von der Kameradetektionseinheit 22 aufgenommenen Bilder jeweils zugeordnet ist, wahlweise auf den ersten Detektor 46a oder den zweiten Detektor 46b gelenkt werden kann. Die Punkt-Detektionseinheit 24 ermöglicht so die zeitgleiche Erfassung mehrerer Punkte.

Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen es, in einem einzigen Mikroskop 10 die Stärken einer Kamera-Detektion mit denen der Punkt-Detektion zu kombinieren.

Bezugszeichenliste

10a bis lOd Mikroskop

12 Weitfeld-Beleuchtungseinheit

14 Probe

16, 16' Strahlteilereinheit

18, 20 Detektionsstrahlengang 22, 22' Kamera-Detektionseinheit

24 Punkt-Detektionseinheit

26 Detektionsobjektiv

28 Steuereinheit

30 Bildverarbeitungseinheit

32, 34 Tubuslinse

36 Kippspiegel

38 Mikrospiegelaktoreinheit

40 Lichtquelle

42 Beleuchtungsobjektiv

44 Umlenkspiegel

46 Detektor

48 optische Elemente

Claims

Ansprüche

1. Mikroskop (10), mit einer Weitfeld-Beleuchtungseinheit (12) zur Beleuchtung zumindest eines ausgewählten Bereichs einer Probe (14), mit einer Strahlteilereinheit (16, 16') zur Erzeugung eines ersten Detektions strahlengangs (18) und eines zweiten Detektionsstrahlengangs (20), mit einer innerhalb des ersten Detektionsstrahlengangs (18) angeordneten Ka- mera-Detektionseinheit (22, 22') zur Aufnahme von Bildern des ausgewählten Bereichs der Probe (14), mit einer innerhalb des zweiten Detektionsstrahlengangs (20) angeordneten Punkt-Detektionseinheit (24) zur Erfassung eines innerhalb des ausgewählten Bereichs liegenden vorbestimmten Teilbereichs der Probe (14), und mit einem innerhalb des ersten und zweiten Detektionsstrahlengangs (18, 20) objektseitig der Strahlteilereinheit (16, 16') angeordneten Detektionsobjektiv (26), das als gemeinsames Detektionsobjektiv für die Kamera-Detektionseinheit (22, 22') und die Punkt-Detektionseinheit (24) vorgesehen ist.

2. Mikroskop (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (10) eine Steuereinheit (28) umfasst, und dass die Steuereinheit (28) wenigstens die Punkt-Detektionseinheit (24) in Abhängigkeit des vorbestimmten Teilbe reichs der Probe (14) und/oder in Abhängigkeit eines vorbestimmten Zeitpunkts für eine mithilfe der Punkt-Detektionseinheit (24) durchführbare Messung steu ert.

3. Mikroskop (10) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der vorbe stimmte Teilbereich der Probe (14) und/oder der vorbestimmte Zeitpunkt in der Steuereinheit (28) voreingestellt gespeichert ist.

4. Mikroskop (10) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (10) eine mit der Steuereinheit (28) gekoppelte Bildverarbeitungseinheit (30) umfasst, die den vorbestimmten Teilbereich der Probe (14) und/oder den vor bestimmten Zeitpunkt auf Grundlage mindestens eines der durch die Kamera- Detektionseinheit (22, 22' ) aufgenommenen Bilder ermittelt, und die den vor bestimmten Teilbereich der Probe (14) und/oder den vorbestimmten Zeitpunkt für die Steuereinheit (28) zur Steuerung der Punkt-Detektionseinheit (24) bereit stellt.

5. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (28) die Weitfeld-Beleuchtungseinheit (12) in Abhängigkeit des vorbestimmten Teilbereichs der Probe (14) und/oder in Abhängigkeit des vorbestimmten Zeitpunkts steuert.

6. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilereinheit (16, 16') durch ein durch die Steuereinheit (28) schaltba res Spiegelelement gebildet ist, das derart ausgebildet ist, dass in einem ersten Schaltzustand Detektionslicht, das von der Probe (14) ausgeht, auf die Kamera- Detektionseinheit (22, 22') gelenkt wird, und dass in einem zweiten Schaltzu stand das von der Probe (14) ausgehende Detektionslicht auf die Punkt-Detekti- onseinheit (24) gelenkt wird.

7. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilereinheit (16, 16') durch eine durch die Steuereinheit (28) steuer bare Mikrospiegelaktoreinheit (DMD) gebildet ist, die derart ausgebildet ist, dass wenigstens ein erster, dem vorbestimmten Teilbereich der Probe (14) zu geordneter Teil von Detektionslicht, das von dem ausgewählten Bereich aus geht, auf die Punkt-Detektionseinheit (24) gelenkt wird, und dass ein zweiterTeil des von dem ausgewählten Bereich ausgehenden Detektionslichts, der zu dem ersten Teil komplementär ist, auf die Kamera-Detektionseinheit (22, 22' ) gelenkt wird.

8. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilereinheit (16, 16') durch einen neutralen Strahlteiler oder einen dichroitischen Spiegel gebildet ist.

9. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (10) eine erste Tubuslinse (32) umfasst, dass die erste Tubuslinse (32) zwischen dem Detektionsobjektiv (26) und der Strahlteilereinheit (16, 16') angeordnet ist, und dass die erste Tubuslinse (32) durch die Kamera-Detektions- einheit (22, 22' ) und die Punkt-Detektionseinheit (24) gemeinsam genutzt wird.

10. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (10) eine erste Tubuslinse (32) und eine zweite Tubuslinse (34) umfasst, dass die erste Tubuslinse (32) zwischen der Strahlteilereinheit (16, 16') und der Kamera-Detektionseinheit (22, 22') angeordnet ist, und dass die zweite Tubuslinse (34) zwischen der Strahlteilereinheit (16, 16') und der Punkt-Detek- tionseinheit (24) angeordnet ist.

11. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Punkt-Detektionseinheit (24) einen durch die Steuereinheit (28) steu erbaren Kippspiegel (36) umfasst, der bildseitig der Strahlteilereinheit (16, 16') in dem zweiten Detektionsstrahlengang (20) angeordnet ist.

12. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Punkt-Detektionseinheit (24) eine von der Strahlteilereinheit (16, 16') verschiedene, durch die Steuereinheit (28) steuerbare Mikrospiegelaktoreinheit (DMD) (38) umfasst, die bildseitig der Strahlteilereinheit (16, 16') in dem zweiten Detektionsstrahlengang (20) angeordnet ist.

13. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Punkt-Detektionseinheit (24) derart ausgebildet ist, dass von dem vor bestimmten Teilbereich der Probe (14) ausgehendes Detektionslicht spektral aufgelöst erfasst wird.

14. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Punkt-Detektionseinheit (24) ein dispersives Element umfasst, das ein in die Punkt-Detektionseinheit (24) einfallendes Lichtbündel spektral aufspaltet, und dass die Punkt-Detektionseinheit (24) einen Spektraldetektor umfasst, der als eine aus mehreren Detektoreinheiten bestehende Anordnung zur Detektion des spektral aufgespaltenen Lichtbündels ausgebildet ist.

15. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Weitfeld-Beleuchtungseinheit (12) zur Erzeugung eines Lichtblattes ausgebildet ist.

16. Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsobjektiv als Beleuchtungsobjektiv der Weitfeld-Beleuch tungseinheit (12) ausgebildet ist.