EP3334537B1

EP3334537B1 - Verfahren zum beschichten von proben

Info

Publication number: EP3334537B1
Application number: EP16717136.2A
Authority: EP
Inventors: Günes Barka
Original assignee: SunChrom Wissenschaftliche Gerate GmbH
Current assignee: SunChrom Wissenschaftliche Gerate GmbH
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2020-10-07
Anticipated expiration: 2036-04-15
Also published as: EP3334537A1; US20180236470A1; WO2017025205A1; DE102015113170A1

Description

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einem Verfahren zum Beschichten von Proben durch Besprühen mit einer Lösung unter Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welchem die Probe (112) nacheinander mehrfach besprüht wird, wobei ein nachfolgender Sprühauftrag erst dann durchgeführt wird, wenn die zuvor aufgetragene Schicht abgetrocknet ist.
Derartige Verfahren werden im Bereich der MALDI-Technik (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) eingesetzt. Wird diese Technik auf Gewebeproben angewendet, wird sie als "MALDI Imaging" bezeichnet. Sie hat im Rahmen der bildgebenden Massenspektrometrie eine Vorreiterfunktion übernommen, die sich seit etwa 10 Jahren in der Krebsforschung, der pharmazeutischen Entwicklung und in der Proteinforschung etabliert hat. Der Vorteil der MALDI-Technik besteht darin, dass die Gewebeproben ohne großen Aufwand für die Untersuchung vorbereitet werden können, wobei nicht nur frisch gefrorene, sondern auch durch Formalin fixierte und in Silikon eingebettete und dadurch praktisch unbegrenzt haltbare Proben für diese neue und sehr empfindliche Untersuchungsmethode zugänglich sind, ebenso wie beispielsweise auch sehr altes Probenmaterial, das bis über 100 Jahre alt sein kann.
Die Grundlage der MALDI-Technik besteht darin, dass die Gewebeschnitte auf als Target bezeichnete Stahlplatten oder auf Objektträger aufgelegt werden, auf denen sie nach dem Trocknen dauerhaft haften und sich selbst fixieren. Anschließend werden die Schnitte mit einer als Matrix bezeichneten, meist polaren organischen Verbindung beschichtet, die die Eigenschaft hat, dass sie bei einer Bestrahlung mit Laserstrahlen im UV-Bereich das Licht absorbieren und dann durch den hohen Energieeintrag verdampfen. Dabei werden auch solche Stoffe der Gewebeprobe mit in die Dampfphase gerissen, die eigentlich gar nicht verdampfbar sind und bei normaler Erwärmung verbrennen würden. Durch die extrem rasche Verdampfung ist es aber möglich, derartige Proben zu verdampfen. In einem elektrischen Feld werden diese Moleküle ionisiert und von einem Massenspektrometer aufgenommen. In diesen Massenspektrometern werden Sie dann nach Ladung und Größe getrennt, wobei eine Software aus diesen zwei Parametern die Zusammensetzung entschlüsselt und identifiziert.
Es sind unterschiedliche Methoden bekannt, die Matrix auf die Gewebeproben aufzubringen, wobei sich die gewählte Methode nach den Analyten richten kann, die man untersuchen oder nachweisen möchte. Insbesondere ist zu erwähnen, dass Bio-Moleküle oder schwer verdampfbare Moleküle eine Extraktion und einen Einbau in die Kristallstruktur der Matrix benötigen, um in einer Weise verdampft werden zu können, dass sie anschließend mittels des Massenspektrometers ausgewertet werden können. Andere Verbindung wie Lipide brauchen als leicht verdampfbare Stoffe nur eine einfache Beschichtung ohne Extraktion. Für den letzteren Fall existiert mit der Sublimation mit einer Abscheidung der Matrix direkt aus der Gasphase bereits ein Auftragsverfahren mit einer sehr feinen Kristallstruktur, das sich aber nicht für die Extraktion eignet, da keine flüssige Phase vorhanden ist. Nachteilig ist auch, dass eine komplette Fläche auch neben der Probe und nicht nur die Probe selbst mit der Matrix überzogen wird, wodurch sich ein hoher Verbrauch an Matrixlösung einstellt, was insbesondere bei teuren Matrizes ins Gewicht fällt. Ohnehin eignen sich nur wenige Matrizes für diese Methode, während sie beispielsweise für Enzymlösungen nicht anwendbar ist.
Um bei einer Beschichtung durch Sublimation dennoch eine Extraktion bewirken zu können, werden durch Sublimation beschichtete Objekte in einer wassergesättigten Umgebung 24 bis 72 Stunden aufbewahrt, wobei durch die Umgebungsfeuchtigkeit ein gewisses Maß an Extraktion stattfindet. Die extrem lange Probenvorbereitungszeit steht einer weiten Verbreitung dieser Methode entgegen.
Von den übrigen Sprühmethoden, beispielsweise der manuellen Sprühmethode, der Ultraschallversprühung oder der Elektrospray-Technik, ist die modifizierte Airbrush-Methode hervorzuheben, bei welcher ein optimierter Sprühkopf mit einer exakten Flüssigkeitsmenge pro Zeiteinheit beschickt wird. Ansonsten setzt ein derartiger Sprühkopf, wie der Name schon sagt, die Airbrush-Technik ein, bei welcher der Luftstrom nach dem Ejektor-Prinzip die Flüssigkeit mitreißt und fein verteilt. Eine derartige Methode eignet sich sehr gut für die Extraktion, wobei die erzielbaren Kristallgrößen nach dem Abtrocken der Matrix sich in einer Größenordnung von 30 bis 100 µm bewegen.
Die Auflösung beim MALDI-Imaging wird durch die Kristallgröße der Matrix und den Laserdurchmesser bestimmt. Je kleiner die Auflösung dieser beiden Parameter, desto detailliertere Informationen erhält man über das Gewebe, wie z. B. Leber, Niere, Haut und Gehirn sowie allen anderen inneren Organen, bzw. ihrer Feinstruktur. Dies ermöglicht eine Fülle von neuen Informationen beispielsweise über die Entwicklung eines Krebses oder die neuen Verbindungen, die durch den Krebs neu entstehen, was wiederum eine frühe Erkennung der Krankheit ermöglicht.
In der Pharmaforschung erhält man sehr detaillierte Informationen über die Verteilung eines Medikaments im lebenden Körper und deren Metabolite sowie die Ausscheidung aus dem Körper.
Neuere Entwicklungen in der Lasertechnik haben für die Laserdurchmesser Dimensionen von ca. 1 µm geschaffen. Mit dieser Entwicklung können die bisherigen Kristallgrößen die durch die üblichen Sprühverfahren aufgetragen wird, nicht mithalten. Wie bereits erwähnt, liegt die Grenze in einer Größenordnung von 30 µm bis 100 µm als kleinste Kristallgröße, insbesondere dann, wenn eine Extraktion erforderlich ist, wenn größere Moleküle wie Peptide oder Proteine in einem Molekulargewichtsbereich von >100 bis über 100 000 Dalton erfasst werden sollen. Wenn jedoch die Kristallgröße in einer Größenordnung von 30 µm aufwärts liegt, hat dies zur Folge, dass bei einem Auftreffen des Laserstrahles selbst dann, wenn dieser einen Durchmesser von ca. 1 µm hat, der komplette Kristall verdampft, so dass die Auflösung in diesem Fall durch die Matrixkristallgröße und nicht durch den Laserdurchmesser bestimmt wird.
Beispiele für derartige Verfahren sind in der US 5 772 964 A und der WO 03/041869 A1 beschrieben. Auch die Veröffentlichungen "Sarah A. Schwartz et al: Direct tissue analysis using matrix assisted" und "Yanfend Chen et al: Imaging MALDI Mass Spectrometry" befassen sich mit solchen Verfahren.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend zu verbessern, dass eine Bildung kleinerer Kristalle der Maxtrix in der Beschichtung nach dem Abtrocknen ermöglicht ist. Die Beschichtung soll auch möglichst homogen ausgebildet sein, um die Erfassung der Moleküle nicht nur qualitativ sondern auch semi-quantitativ oder quantitativ zu ermöglichen.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art, bei welchem die erste aufgetragene Schicht mit einer kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht wird, die Menge bei den nachfolgenden Schichten erhöht werden, bis eine bestimmte Menge an Lösung pro Fläche erreicht wird, die für die letzte Schicht oder für mehrere Schichten mehrfach wiederholt aufgetragen wird.
Es hat sich gezeigt, dass sich durch das mehrfache Auftragen der Sprühlösung unter zwischenzeitlichem Abtrocknen unerwünschte Effekte vermeiden lassen, die bisher bei zu großer Flüssigkeitsmenge auftraten, nämlich dass kleinere Moleküle ihre ursprünglichen Lage verlassen und anfangen in verschiedene Richtungen zu diffundieren, so dass am Ende die Exaktheit der Lageinformationen bei der Massenspektroskopie verloren geht. Durch das schichtweise Auftragen kann eine 1.-3., recht dünne Schicht in der Art einer Fixierschicht eingesetzt werden, die die Lageinformationen sicherstellt und zum anderen eine Art saugfähige Unterlage für weitere Schichten bildet, die dann bei geeigneter Menge an Matrixlösung auch dazu geeignet sind, die gewünschte Extraktion größerer Moleküle in der gewünschten Art und Weise in die Matrixstruktur zu erreichen. Entsprechend sieht eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens vor, dass die erste aufgetragene Schicht mit einer kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht wird, die Menge bei den nachfolgenden Schichten erhöht wird, bis eine bestimmte Menge an Matrix pro Fläche erreicht wird, und diese Menge an Lösung pro Fläche für die letzten Schichten mehrfach wiederholt aufgetragen wird. Eine typische Anzahl von Schichten liegt im Bereich zwischen 5 bis 10, beispielsweise 8 Schichten, so dass sich insgesamt eine zweckmäßige Dicke der Matrix ergibt, die bei Bestrahlung mit dem Laser dann lokal auf einer auf die erreichte Kristallgröße reduzierten Fläche verdampft. Die ersten 1-3 Schichten, die mit der kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht werden, trocknen dabei sehr schnell ab, so dass keine Lageveränderungen kleiner Moleküle zu befürchten sind.
Beispielsweise kann von einer ersten Menge an Lösung pro Fläche für die erste Schicht ausgehend die Menge beim Auftragen der zweiten Schicht verdoppelt und beim Auftragen der dritten Schicht verdreifacht werden, bis bei der dritten bis sechsten Schicht ein Maximum erreicht wird, das für alle nachfolgenden Schichten zur Anwendung kommt.
Da in der Regel der mittels einer in üblicher Art und Weise mit einer zweckmäßigen Geometrie des Sprühkopfes ausgebildeten Sprühvorrichtung eine Fläche mit einem Durchmesser von z.B. 2 mm besprüht werden kann, ist es bei entsprechend größeren Proben zweckmäßig, dass diese unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer Verstellbarkeit in der X- und Y-Richtung zum Aufbringen einer Schicht zeilenweise besprüht wird. Nach dem zeilenweisen Besprühen der Probe und entsprechen vollständigem Aufbringen einer Schicht, fährt der Sprühkopf dann in die Ausgangslage zurück und wiederholt den Auftrag zeilenweise für die nächste Schicht.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht die Verwendung einer Sprühvorrichtung vor, bei welcher der Flüssigkeitsauslass am Ende einer Kapillarleitung vorgesehen ist, die beispielsweise mittig über den Gasauslass hinaus hervorsteht.
Es hat sich gezeigt, dass mit einer solchen Sprühvorrichtung bedingt durch den über den Gasauslass überstehenden Flüssigkeitsauslass eine besonders feine Tröpfchengröße erreichbar ist, die letzten Endes zu einer Matrixschicht auf der Probe führt, die nach dem Trocknen eine kleinere Kristallgröße bei homogener Schichtbildung aufweist. Überraschenderweise ergibt sich der Effekt gerade dadurch, dass der Gasauslass im Verhältnis zum Flüssigkeitsauslass zurückgesetzt vorgesehen ist, so dass das Gas bis zum Erreichen der Flüssigkeit verwirbelt wird und dieses nicht mehr, wie bisher, nach dem Ejektorprinzip mitreißt, sondern dass die feine Tröpfchenbildung in dem verwirbelten Gas ausgebildet wird.
Als Gase eignen sich im übrigen Luft oder auch Stickstoff, je nach Art der zu versprühenden Matrixlösung und zu untersuchenden Probe.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das Ende der Kapillarleitung an seinem Außenumfang verjüngt ist, vorzugsweise konisch verjüngt ist. Es hat sich gezeigt, dass durch diese Maßnahme eine besonders feine Tröpfchenbildung ermöglicht ist, weil durch die Verjüngung, vorzugsweise in konischer Form, der verwirbelte Gasstrom besonders effektiv in Richtung des Flüssigkeitsauslasses umgelenkt wird.
In jedem Fall erfolgt unabhängig von der Ausbildung des Endes der Kapillarleitung eine aktive Zufuhr der Matrixlösung z. B. mittels einer geeigneten Pumpe, die in der Lage ist, die sehr kleinen Flüssigkeitsmengen zu fördern, die beim Auftrag der Schichten benötigt werden. Auf typische Flussmengen wird später noch im Rahmen der Ausführungsbeispiele eingegangen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Gasauslass durch einen Ringspalt zwischen der Außenwandung der Kapillarleitung und einem Führungsschlauch oder -rohr ausgebildet. Der Führungsschlauch oder das Führungsrohr dient dabei gleichzeitig zur Stabilisierung der empfindlichen Kapillarleitung, die in der Regel als Quarzkapillare ausgebildet ist.
Der Führungsschlauch oder das Führungsrohr, das beispielsweise aus PEEK (Polyethereetherketon) bestehen kann, kann wiederum von einem größeren Durchmesser stabilisiert sein, wobei letzten Endes das Führungsrohr und/oder die Kapillarleitung vorzugsweise in einem Gehäuse gasdicht gehalten sind. Das Gehäuse hat zum Einen die Aufgabe, die Position des Düsenkopfes exakt zu definieren, zum anderen besitzt das Gehäuse vorzugsweise einen Gasanschluss für die Gaszufuhr, wobei in dem Gehäuse ein Gasdurchlass in einem Ringspalt zwischen dem Führungsrohr oder dem Führungsschlauch und der Kapillarleitung vorgesehen ist. Auf diese Weise kommt dem Gehäuse die Funktion zu, den Gasstrom von der Gaszufuhr in den Ringspalt zwischen den Führungsschlauch oder dem Führungsrohr und der Kapillarleitung zu leiten.
In der Regel durchragt die Kapillarleitung des Gehäuse und ist an ihrem anderen Ende mit einer bereits erwähnten Förderpumpe für die Flüssigkeitszufuhr verbunden, wobei anstelle einer Pumpe auch ein Dispenser mit einer geeigneten hohen Auflösung, beispielsweise 24.000 Schritten pro Spritzenfüllung eingesetzt werden kann. Um den rückwärtigen Austritt der Kapillarleitung aus dem Gehäuse gasdicht zu verschließen, ist vorzugsweise auf der dem Sprühkopf abgewandten Seite des Gehäuses ein Stopfen vorgesehen, der das Gehäuse gegen die Außenwandung der Kapillarleitung gasdicht verschließt.
Um die bereits angesprochene Positionierung des Düsenkopfes besonders exakt vornehmen zu können, verfügt das Gehäuse vorzugsweise über einen Absatz, der in einem definierten Abstand zum Flüssigkeitsauslass angeordnet ist. Der Flüssigkeitsauslass definiert mit seiner exakten Lage die Position des Düsenkopfes.
Vorzugsweise ist der Düsenkopf an einer Verfahrvorrichtung gehalten, die ein Verfahren der Position des Düsenkopfes in der X-, Y- und/oder Z-Richtung ermöglicht. Grundsätzlich ist die Verfahrmöglichkeit in X- und Y-Richtung wichtiger, da ggf. auch mit einer festen Position, d. h. einem festen Abstand des Flüssigkeitsauslasses zur Probenoberfläche gearbeitet werden kann. Der Düsenkopf wird beispielsweise mit Hilfe des zuvor beschriebenen Absatzes an dem Gehäuse in eine definierte Position bezüglich der Gewebeoberfläche gebracht.
Nachfolgend wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher auf ein Ausführungsbeispiel der Erfindung eingegangen. Es zeigen:

Fig. 1: einen Schnitt einer Gesamtansicht eines Sprühkopfes einer Sprühvorrichtung;
Fig. 2: eine Detailansicht der Austrittsbereiche des Sprühkopfes;
Fig. 3: eine schematische Ansicht einer Sprühvorrichtung mit verstellbarem Sprühkopf.

In Fig. 1 ist ein Düsenkopf 10 gezeigt, der auch als Sprühkopf bezeichnet werden kann. Der Düsenkopf 10 ist über ein rückwärtiges Ende 12 einer Quarzkapillare 14 als Kapillarleitung mit einer Flüssigkeitszufuhr verbunden, die nicht im Detail gezeigt ist. Diese Flüssigkeitszufuhr kann durch eine konstant fördernde Spritzenpumpe oder durch einen Dispenser mit einer sehr hohen Auflösung von 24.000 Schritten pro Spritzenfüllung übernommen werden, um möglichst exakte Flüssigkeitsmengen durch die Kapillarleitung der Quarzkapillare 14 zu einem Flüssigkeitsaustritt 16 (siehe auch Fig. 2) zu fördern.
Die Quarzkapillarleitung 14 ist durch ein Gehäuse 18 hindurch geführt, das an seinem rückwärtigen Ende mit Hilfe einer Überwurfmutter 20 verschlossen ist, wobei die Überwurfmutter 20 in einem Gewinde 22 in das Gehäuse 18 eingreift und das Gehäuse 18 gegen den Außenumfang der Quarzkapillare 14 abdichtet. Das Gehäuse selbst ist gestuft mit einem Absatz 24 ausgebildet, auf dessen Funktion später noch näher eingegangen wird.
Das Gehäuse ist innenseitig mit einer mittigen Bohrung 26 versehen, die mit einem radialen Gasanschluss 28 in Verbindung steht, der mit einer Gaszufuhr (nicht gezeigt) zu verbinden ist. Die Gaszufuhr sorgt durch geeignete Pumpmittel für die Zufuhr von Luft oder einem anderen geeigneten Gas wie z. B. Stickstoff, unter einem Druck von üblicherweise 2 bis 3 Bar, der im Betrieb konstant gehalten wird, wobei auch andere Druckwerte realisierbar sind.
An dem der Überwurfmutter 20 gegenüberliegenden Ende des Gehäuses 18 sitzt in einem erweiterten Bohrungsabschnitt 30 ein erster Führungsschlauch 32, der auch als Führungsrohr ausgebildet sein kann, innerhalb welchem ein weiterer Führungsschlauch 34 druckdicht eingelassen ist. Der zweite Führungsschlauch 34 umschließt die Quarzkapillare 14 an ihrem Außenumfang mit einem Ringspalt, d. h. zwischen dem zweiten Führungsschlauch 34 und der Quarzkapillare besteht ein Gasdurchlass zwischen der Bohrung 26 des Gehäuses 10 und einem Gasauslass 36 (siehe Fig. 2) am Ende des zweiten Führungsschlauches 34, in dessen Mitte die Quarzkapillare 14 um ein bestimmtes Wegstück über das Ende des zweiten Führungsschlauches 34 übersteht.
Wie aus Fig. 2 gut zu erkennen ist, ist der Ringspalt 38 dazu vorgesehen, das durch den Gasanschluss 28 zugeführte Gas am Ende des zweiten Führungsschlauches 34 auszublasen, was durch die Pfeile angedeutet ist. Der Flüssigkeitsaustritt 16 erfolgt dabei mit einem Abstand zu dem Gasaustritt 36 und ist durch die skizzierten Tropfen veranschaulicht. Durch den Abstand zwischen dem Gasauslass 36 und dem Flüssigkeitsauslass 16 kann der Gasstrom leicht verwirbeln, wobei das Ende der Glaskapillare 14 mit einer konischen Verjüngung 40 vorgesehen ist, die den verwirbelten Gasstrom in Richtung des dosiert geförderten, aus dem Flüssigkeitsaustritt 16 austretenden Flüssigkeitsstroms fördert. Durch diese konische Verjüngung, die auch ballig ausgebildet sein kann, erfolgt eine besonders feine Tröpfchenbildung, wobei der Gasstrom die feinen Flüssigkeitstropfen weiter in Richtung einer unterhalb des Flüssigkeitsauslasses 16 angeordneten Probe fördert.
Der in Fig. 1 und 2 gezeigte Düsenkopf ist in einer Sprühvorrichtung 100 montiert, wobei der Absatz 24 in einer definierten Position einer Aufnahme ruht, so dass der Flüssigkeitsauslass 16 in einem definierten Abstand zu auf einem Tisch angeordneten metallischen Targets 110 liegt, auf welchen zur Vorbereitung für weitergehende Untersuchungen zu besprühendes Gewebe 112 aufgebracht ist. Die Aufnahme 102 des Düsenkopfes 10 ist seitlich in einer Y-Richtung verfahrbar an einem Träger 104 angeordnet, der wiederum in einer X-Richtung verfahrbar an einer Schiene 106 angebracht ist, so dass der Düsenkopf durch Verfahren der Aufnahme 102 am Träger 104 und Verfahren des Trägers 104 auf der Schiene 106 in der X- und Y-Richtung verstellbar ist. Die Aufnahme 102 kann in der Z-Richtung verstellbar sein, um den Flüssigkeitsauslass 16 in seinem Abstand zu den Targets 110 oder vorbereiteten Glasträgern einstellen zu können. In der Regel ist aber während des eigentlichen Sprühvorgangs eine Verstellung des Abstandes zwischen dem Sprühkopf 10 und den Targets 110 nicht erforderlich.
Normalerweise erfolgt das Besprühen des Gewebes 112 in der Weise, dass der Düsenkopf 10 die zu besprühende Fläche zeilenweise abfährt, da in der Regel der durch den Sprühstrahl erfasste Bereich kleiner ist als die Fläche des zu besprühenden Gewebes. Typischerweise erfasst die versprühte Matrixlösung bei einem zeilenweisen Verfahren eine streifenförmige Fläche von einer Breite von ungefähr 2 mm.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel im Detail beschreiben, bei dem einige Parameter explizit genannt werden, auch wenn sie sich im Rahmen der Erfindung in einem weiten Bereich bewegen können.
Es wurde eine Matrixlösung versprüht, die im Bereich des Düsenkopfes 10 mit einem unter einem konstanten Druck von 2,5 bar zugeführten Luftstrom vermischt worden ist. Der Außendurchmesser der gewählten Quarzkapillare betrug 280 µm, wobei zwischen dem zweiten Führungsschlauch 34 und dem Außendurchmesser der Quarzkapillare 14 ein Ringspalt mit einer Höhe von 60 µm vorgesehen war, d. h. der Innendurchmesser des aus PEEK gefertigten zweiten Führungsschlauches betrug 400 µm. Die Quarzkapillare 14 besaß einen inneren Kanal 42 mit einem Durchmesser von 75 µm.
Unter einem fest eingestellten Abstand von 40 mm zwischen dem Flüssigkeitsaustritt 16 und der Oberfläche des Targets 110, wurde letzteres zeilenweise abgefahren, bis eine gewünschte Fläche vollständig mit der Matrixlösung besprüht worden war. Dabei wird bei der gewählten Düsengeometrie und dem gewählten Gasdruck ein Bereich von ca. 2 mm direkt besprüht, wobei die Zeilenabstände so gewählt sind, dass eine Überdeckung benachbarter besprühter Zeilen nur minimal vorhanden ist, um abweichende Schichtdicken im Überlappungsbereich zu vermeiden.
Beim Aufbringen einer ersten Schicht, ist eine Flüssigkeitszufuhr von 10 µl pro Minute gewählt worden, wobei die Verfahrgeschwindigkeit 200 cm pro Minute betrug.
Nach dem Aufbringen der ersten Schicht, wurde eine zweite Schicht durch Versprühen aufgebracht, die bei ansonsten gleichen Verfahrensparametern unter ein Verdopplung der Flüssigkeitszufuhr auf 20 µl pro Minute durchgeführt worden ist. Eine dritte Schicht wurde mit 30 µl pro Minute, eine vierte mit 40 µl pro Minute aufgebracht, wobei insgesamt 8 Schichten aufgebracht wurden, die ab der vierten Schicht alle unter einer Flüssigkeitszufuhr von 40 µl pro Minute aufgebracht worden sind.
Eine elektronenmikroskopische Untersuchung der Schicht ergab, dass sich Matrixkristalle einer sehr konstanten Kristallgröße im Bereich zwischen 130 bis 140 nm ausgebildet hatten. Mit derartigen Kristallgrößen eignete sich die Probe hervorragend für die weitere Untersuchung im Rahmen der MALDI-Technik der neusten Generation mit einem Laser, dessen Lichtstrahl auf 1 µm Größe fokussiert war. Durch die kleinen Kristalle ist die Auflösung der massenspektrometrischen Untersuchung durch den extrem kleinen Querschnitt des Laserstrahls von 1 µm definiert, was unterhalb der Größe einer menschlichen Zelle von bis zum 10 µm liegt, so dass im Rahmen dieser Untersuchung das Gewebe nach einzelnen Zellen analysiert werden konnte.
Das beschriebene Ausführungsbeispiel ist mit seinen Eckdaten nicht zwingend. Insbesondere können die Dimensionen der Quarzkapillare und des Führungsschlauches deutlich abweichen, aber auch die Flüssigkeitsmenge kann je nach Art zu versprühenden Matrixlösung deutlich von den genannten Werten abweichen. Auch bei der Gaszufuhr sind Abweichungen von dem gewählten Druck möglich, um je nach gewünschter Untersuchung entsprechend unterschiedliche Schichten aufbringen zu können.

Claims

Verfahren zum Beschichten von Proben (112) durch Besprühen mit einer Lösung unter Verwendung einer Sprühvorrichtung , bei welchem die Probe (112) nacheinander mehrfach besprüht wird, wobei ein nachfolgender Sprühauftrag erst dann durchgeführt wird, wenn die zuvor aufgetragene Schicht abgetrocknet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die erste aufgetragene Schicht mit einer kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht wird, die Menge bei den nachfolgenden Schichten erhöht wird, bis eine bestimmte Menge an Lösung pro Fläche erreicht wird, die für die letzte Schicht oder für mehrere Schichten mehrfach wiederholt aufgetragen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Menge Lösung pro Fläche für die erste Schicht beim Auftragen der zweiten Schicht verdoppelt, bei Auftragen der dritten Schicht verdreifacht und ggf. bis zu einem Maximum bei einer weiteren Schicht weiter erhöht wird, das für alle nachfolgenden Schichten beim Auftrag eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zum Aufbringen einer jeweiligen Schicht zeilenweise besprüht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung zum Besprühen von Proben (112) mit einer Lösung, wobei eine Flüssigkeitszufuhr zum dosierten Zuführen der Lösung und eine Gaszufuhr vorgesehen sind, die über Zuleitungen an einen Düsenkopf (10) angeschlossen sind, der einen Gas- (36) und einen Flüssigkeitsauslass (16) aufweist, um die Lösung zu versprühen, dass der Flüssigkeitsauslass (16) am Ende einer Kapillarleitung (14) vorgesehen ist, die über den Gasauslass (36) hinaus hervorsteht.
Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welcher das Ende der Kapillarleitung (14) an seinem Außenumfang verjüngt ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welcher der Gasauslass (36) durch einen Ringspalt zwischen einem Außenumfang der Kapillarleitung (14) und einem Führungsschlauch (34) oder Führungsrohr ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welcher der Führungsschlauch (34) und/oder die Kapillarleitung (14) in einem Gehäuse (18) gasdicht gehalten sind.
Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, deren Gehäuse (18) einen Gasanschluss (28) für die Gaszufuhr aufweist und in dem Gehäuse ein Gasdurchlass in einen Ringspalt zwischen dem Führungsschlauch (34) oder -rohr und der Kapillarleitung (14) vorgesehen ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welcher das Gehäuse (10) auf einer dem Flüssigkeitsauslass (16) abgewandten Seite mit einem Gewindestopfen (20) versehen ist, der das Gehäuse (10) gegen die Außenwandung der Kapillarleitung (14) gasdicht verschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welcher das Gehäuse einen Absatz (24) aufweist, der in einem definierten Abstand zum Flüssigkeitsauslass (16) angeordnet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Sprühvorrichtung, bei welcher der Düsenkopf (10) an einer Verfahrvorrichtung (100) gehalten ist, die ein Verfahren der Position des Düsenkopfes (10) in der X-, Y-, und/oder Z-Richtung ermöglicht.