WO2017025205A1 - Sprühvorrichtung und verfahren zum beschichten von proben - Google Patents

Sprühvorrichtung und verfahren zum beschichten von proben Download PDF

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WO2017025205A1
WO2017025205A1 PCT/EP2016/058451 EP2016058451W WO2017025205A1 WO 2017025205 A1 WO2017025205 A1 WO 2017025205A1 EP 2016058451 W EP2016058451 W EP 2016058451W WO 2017025205 A1 WO2017025205 A1 WO 2017025205A1
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capillary
solution
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PCT/EP2016/058451
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Günes Barka
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SunChrom Wissenschaftliche Geräte GmbH
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    • B05B7/02—Spray pistols; Apparatus for discharge
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    • B05B7/062—Spray pistols; Apparatus for discharge with at least one outlet orifice surrounding another approximately in the same plane with only one liquid outlet and at least one gas outlet
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    • B05B7/1606—Spraying apparatus for discharge of liquids or other fluent materials from two or more sources, e.g. of liquid and air, of powder and gas incorporating means for heating or cooling the material to be sprayed the spraying of the material involving the use of an atomising fluid, e.g. air
    • B05B7/1613—Spraying apparatus for discharge of liquids or other fluent materials from two or more sources, e.g. of liquid and air, of powder and gas incorporating means for heating or cooling the material to be sprayed the spraying of the material involving the use of an atomising fluid, e.g. air comprising means for heating the atomising fluid before mixing with the material to be sprayed

Definitions

  • the present invention relates to a spray device for spraying samples with a solution, wherein a liquid supply for the metered feeding of the solution and a gas supply are provided, which are connected via supply lines to a nozzle head having a gas and a liquid outlet, to spray the solution.
  • MALDI Imaging Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
  • MALDI Imaging Applied to tissue samples, this technique is referred to as "MALDI Imaging.” It has pioneered imaging mass spectrometry, which has been established in cancer research, pharmaceutical development, and protein research for about 10 years MALDI technique is that the tissue samples can be prepared without great effort for the ban ⁇ chung, whereby not only fresh frozen but fixed by formalin and embedded in silicone and thus virtually unlimited shelf life, samples for this new and highly sensitive method of analysis to ⁇ are accessible, as well as, for example, very old Pro ⁇ benmaterial that may be over 100 years old.
  • the basis of the MALDI technique is that the tissue sections are placed on steel plates designated as target or on microscope slides on which they adhere permanently after drying and fix themselves. Subsequently, the sections are coated with a mostly polar organic compound called matrix, which has the property of irradiation with laser beams absorb the light in the UV range and then evaporate due to the high energy input.
  • matrix a mostly polar organic compound called matrix
  • those substances of the tissue sample to be drawn back into the vapor phase which are not vaporized Eigent ⁇ Lich and would burn at normal warming. Due to the extremely rapid evaporation, it is possible to evaporate such samples.
  • these molecules are ionized and absorbed by ei ⁇ nem mass spectrometer. In these mass spectrometers, they are then separated according to their charge and size, whereby software decodes and identifies the composition from these two parameters.
  • the modified airbrush method is produced annul ⁇ , wherein an optimized spray head with an exact amount of liquid per unit of time is fed.
  • the airbrush technique in which the air flow entrains the liquid according to the ej ector principle and finely distributed.
  • Such a method is very well suited for extraction, the achievable crystal sizes after the drying of the matrix are in the order of 30 to 100 ym.
  • the resolution in MALDI imaging is determined by the crystal size of the matrix and the laser diameter. The smaller the resolution of these two parameters, the more detailed information is obtained through the tissue, such as the tissue. As liver, kidney, skin and brain and all other internal organs, or their fine structure. This provides a wealth of new information, for example about the development of a cancer or the new compounds that are newly created by the cancer, which in turn allows early detection of the disease.
  • very detailed Informa ⁇ functions on the distribution of a drug in a living body and their metabolites as well as the elimination from the body is obtained.
  • the object of the present invention is to improve a spray device of the type mentioned in that formation of smaller crystals of Maxtrix in the coating after drying is made possible.
  • the coating should also be formed as homogeneously as possible in order to enable the detection of the molecules not only qualitatively but also semi-quantitatively or quantitatively.
  • the object of the present invention is achieved by a spray device of the type mentioned at the outset, in which the liquid outlet is provided at the end of a capillary line. is seen, for example, protrudes centrally through the gas outlet ⁇ out.
  • gases or nitrogen are suitable as gases, depending on the type of matrix solution to be sprayed and the sample to be investigated.
  • the end of the capillary is tapered at its outer periphery, preferably tapered conically. It has been shown that a particularly fine droplet formation is made possible by this measure, because by the taper, preferably in a conical shape, the swirling
  • Gas flow is particularly effectively deflected in the direction of sosstechniksaus ⁇ let.
  • the gas outlet is formed by an annular gap between the outer wall of the capillary and a guide tube or tube.
  • the guide tube or the guide tube serves at the same time to stabilize the sensitive capillary, which is usually designed as a quartz capillary.
  • the guide tube or the guide tube which may for example consist of PEEK (polyether ether ketone), may in turn be stabilized by a larger diameter, wherein in the end the guide tube and / or the capillary are preferably kept gas-tight in a housing.
  • the Ge ⁇ housing has on the one hand the task of defining the position of the nozzle head exactly on the other hand, the housing preference ⁇ as a gas connection for the gas supply, in which Ge ⁇ housing a gas passage in an annular gap between the Füh ⁇ extension tube or the Guide tube and the capillary is provided. In this way, the housing comes to the functi ⁇ on to direct the gas flow from the gas supply into the annular gap between the guide tube or the guide tube and the capillary.
  • the capillary line of the housing extends through and is connected at its other end with an already mentioned feed pump for the liquid supply, wherein instead of a pump and a dispenser with a suitable high resolution, for example 24,000 steps per Spritzen spal ⁇ ment can be used.
  • a pump and a dispenser with a suitable high resolution for example 24,000 steps per Spritzen spal ⁇ ment can be used.
  • the housing has front ⁇ preferably via a shoulder, which is arranged at a defined distance from the liquid outlet.
  • The gives the position of the SI ⁇ senkopfes with its exact position.
  • the nozzle head is held on a traversing device, which allows a method of the position of the nozzle head in the X, Y and / or Z direction.
  • the Verfahr fürkeit in X- and Y-direction is important, since, if necessary, that is a fixed distance from the liquid outlet to the sample surface gearbei ⁇ tet can also be at a fixed position.
  • the nozzle head is brought, for example with the aid of the paragraph described above on the housing in a defi ⁇ ned position with respect to the tissue surface.
  • the subject of the present invention is also a method for coating samples by spraying with a solution using the spraying device described above. This is used in such a way that the sample is sprayed successively several times, wherein a subsequent spraying is carried out only when the previously applied layer is dried.
  • a preferred embodiment of the method provides that the first applied layer is sprayed with a smaller amount of solution per area, the amount in the subsequent layers is increased until a certain amount of matrix per area is reached, and this amount of solution is repeatedly applied several times per area for the last layers.
  • a typical number of Schich ⁇ th is in the range between 5 to 10, for example, 8 layers, so that the overall result is an appropriate thickness of the matrix, which then evaporates upon irradiation with the laser locally on a reduced down to the nearest crystal size surface.
  • the first 1-3 layers, which are sprayed with the smaller amount of solution per area, thereby dry very quickly, so that no changes in position of small molecules are to be feared.
  • the spray head then moves back into the initial position and repeats the on ⁇ supporting line by line for the next layer.
  • FIG. 1 shows a section of an overall view of a spray head of a spray device.
  • Fig. 2 is a detailed view of the exit areas of the spray head ⁇ ;
  • Fig. 3 is a schematic view of a sprayer with adjustable spray head.
  • a nozzle head 10 is shown, which can also be referred to as a spray ⁇ head.
  • the nozzle head 10 is connected via a rear end 12 of a quartz capillary 14 as Kapillarlei ⁇ tion with a liquid supply, which is not shown in detail.
  • This fluid delivery can be achieved by a constant-delivery syringe pump or a dispenser with a very high resolution of 24,000 steps per
  • Syringe filling are adopted to promote the most accurate amounts of liquid through the capillary of the quartz capillary 14 to a liquid outlet 16 (see also Fig. 2).
  • the Quarzkapillar effet 14 is guided through a housing 18 which is closed at its rear end by means of a union nut 20, the union nut 20 engages in a thread 22 in the housing 18 and the housing 18 against the outer circumference of the quartz capillary 14 seals off ⁇ ,
  • the housing itself is stepped with a shoulder 24, whose function will be discussed in more detail later.
  • the housing is internally provided with a central bore 26 which communicates with a radial port 28 in gas connection, which is connected to a gas supply (not shown) to ver ⁇ bind.
  • the gas supply provides by suitable pumping means for the supply of air or other suitable gas such. As nitrogen, under a pressure of usually 2 to 3 bar, which is kept constant during operation, although other pressure values can be realized.
  • a first guide tube 32 which may also be formed as a guide tube, within which a further guide tube 34 is inserted pressure-tight.
  • the second guide ⁇ hose 34 surrounds the quartz capillary 14 on its outer ⁇ circumference with an annular gap, ie between the second guide tube 34 and the quartz capillary is a gas passage between the bore 26 of the housing 10 and a gas outlet 36 (see FIG. 2) at the end of the second guide Sly ⁇ ches 34, the quartz capillary 14 protrudes in the middle of a ⁇ be-determined span over the end of the second guide Sly ⁇ ches 34th As can be clearly seen from Fig.
  • the annular gap 38 is provided to blow out the gas supplied through the gas port 28 at the end of the second guide tube 34, which is indicated by the arrows.
  • the liquid outlet 16, he ⁇ thereby follows with a distance from the gas outlet 36 and is illustrated by the outlined drops. Due to the distance between the gas outlet 36 and the liquid outlet 16, the gas flow can easily swirl, with the end of the glass capillary 14 is provided with a conical taper 40, which promotes the fluidized gas flow in the direction of dosed promoted, exiting from the liquid outlet 16 liquid stream.
  • this conical taper which may also be formed spherical, there is a particularly fine droplet formation, wherein the gas stream further promotes the fine liquid droplets in the direction of a arranged below the liquid outlet 16 sample.
  • the nozzle head shown in Fig. 1 and 2 is mounted in a spray device 100, wherein the shoulder 24 rests in a defined position of a receptacle, so that the liquid ⁇ outlet 16 is at a defined distance to arranged on a table metallic targets 110, on which is applied to prepare for further investigation to be sprayed tissue 112.
  • the receptacle 102 of the nozzle head 10 is laterally arranged in a Y-direction movable on a support 104, which in turn is movably mounted on a rail 106 in an X-direction, so that the nozzle ⁇ head by moving the receptacle 102 on the carrier 104 and Method of the carrier 104 on the rail 106 in the X and Y direction is adjustable.
  • the receptacle 102 may be adjustable in the Z direction in order to set the liquid outlet 16 in its distance from the targets 110 or prepared Glasträ ⁇ like. In general, but during the actual spraying an adjustment of the distance between the spray head 10 and the targets 110 not erforder ⁇ lich.
  • the spraying of the tissue 112 in such a manner takes place, that the nozzle head 10 which leaves zei ⁇ lenweise surface to be sprayed, as is usually the detected through the spray area is smaller than the area of spraying ⁇ the tissue.
  • the sprayed solution Matrixlö ⁇ detects a strip-shaped area of a width of about 2 mm at a line-wise manner.
  • the outer diameter of the selected quartz capillary was 280 ym, wherein between the second guide tube 34 and 14, an annular gap with a Hö ⁇ he was provided of 60 ym to the outer diameter of the quartz capillary, that is, the inner diameter of the fabricated from PEEK second guide tube was 400 ym.
  • the quartz capillary 14 had an inner channel 42 with a diameter of 75 ym.
  • the latter was run line by line until a desired area had been completely sprayed with the matrix solution. It is at the selected nozzle geometry and the selected 2 mm directly sprayed, wherein the line spacing is selected so that an overlap neigh ⁇ barter sprayed lines only minimally exists to avoid deviating layer thicknesses in the overlap region.
  • a second layer was applied by spraying, which has been carried out in otherwise moving ⁇ chen process parameters under a doubling of the liquid supply 20 ⁇ per minute.
  • Egg ⁇ ne third layer was washed with 30 ⁇ per minute, a fourth with 40 ⁇ per minute is applied, wherein a total of 8 layers have been applied, all under ei ⁇ ner hydration of 40 ⁇ from the fourth layer have been applied per minute.
  • Differ quartz capillary and the guide hose significantly, but also the amount of liquid may differ significantly from the values depending on the type to versprü ⁇ Henden matrix solution. Deviations from the selected pressure are also possible with the gas supply in order to be able to apply correspondingly different layers depending on the desired examination.

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Abstract

Die Sprühvorrichtung dient zum Besprühen von Proben mit einer Lösung, wobei eine Flüssigkeitszufuhr zum dosierten Zuführen der Lösung und eine Gaszufuhr vorgesehen sind, die über Zuleitungen an einen Düsenkopf (10) angeschlossen sind, der einen Gas- (36) und einen Flüssigkeitsauslass (16) aufweist, um die Lösung zu versprühen. Um eine Bildung kleinerer Kristalle der Matrix in einer möglichst homogenen Beschichtung nach dem Abtrocknen zu ermöglichen, wird vorgeschlagen, dass der Flüssigkeitsauslass (16) am Ende einer Kapillarleitung (14) vorgesehen ist, die über den Gasauslass (36) hinaus hervorsteht.

Description

Sprühvorrichtung und Verfahren zum Beschichten von Proben
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einer Sprühvorrichtung zum Besprühen von Proben mit einer Lösung, wobei eine Flüssigkeitszufuhr zum dosierten Zuführen der Lösung und eine Gaszufuhr vorgesehen sind, die über Zuleitungen an einen Düsenkopf angeschlossen sind, der einen Gas- und einen Flüs- sigkeitsauslass aufweist, um die Lösung zu versprühen.
Derartige Sprühvorrichtungen werden im Bereich der MALDI- Technik (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) eingesetzt. Wird diese Technik auf Gewebeproben angewendet, wird sie als „MALDI Imaging" bezeichnet. Sie hat im Rahmen der bildgebenden Massenspektrometrie eine Vorreiterfunktion übernommen, die sich seit etwa 10 Jahren in der Krebsforschung, der pharmazeutischen Entwicklung und in der Proteinforschung etabliert hat. Der Vorteil der MALDI-Technik besteht darin, dass die Gewebeproben ohne großen Aufwand für die Untersu¬ chung vorbereitet werden können, wobei nicht nur frisch gefrorene, sondern auch durch Formalin fixierte und in Silikon eingebettete und dadurch praktisch unbegrenzt haltbare Proben für diese neue und sehr empfindliche Untersuchungsmethode zu¬ gänglich sind, ebenso wie beispielsweise auch sehr altes Pro¬ benmaterial, das bis über 100 Jahre alt sein kann.
Die Grundlage der MALDI-Technik besteht darin, dass die Gewe¬ beschnitte auf als Target bezeichnete Stahlplatten oder auf Objektträger aufgelegt werden, auf denen sie nach dem Trocknen dauerhaft haften und sich selbst fixieren. Anschließend werden die Schnitte mit einer als Matrix bezeichneten, meist polaren organischen Verbindung beschichtet, die die Eigenschaft hat, dass sie bei einer Bestrahlung mit Laserstrahlen im UV-Bereich das Licht absorbieren und dann durch den hohen Energieeintrag verdampfen. Dabei werden auch solche Stoffe der Gewebeprobe mit in die Dampfphase gerissen, die eigent¬ lich gar nicht verdampfbar sind und bei normaler Erwärmung verbrennen würden. Durch die extrem rasche Verdampfung ist es aber möglich, derartige Proben zu verdampfen. In einem elektrischen Feld werden diese Moleküle ionisiert und von ei¬ nem Massenspektrometer aufgenommen. In diesen Massenspektro- metern werden Sie dann nach Ladung und Größe getrennt, wobei eine Software aus diesen zwei Parametern die Zusammensetzung entschlüsselt und identifiziert.
Es sind unterschiedliche Methoden bekannt, die Matrix auf die Gewebeproben aufzubringen, wobei sich die gewählte Methode nach den Analyten richten kann, die man untersuchen oder nachweisen möchte. Insbesondere ist zu erwähnen, dass Bio- Moleküle oder schwer verdampfbare Moleküle eine Extraktion und einen Einbau in die Kristallstruktur der Matrix benötigen, um in einer Weise verdampft werden zu können, dass sie anschließend mittels des Massenspektrometers ausgewertet wer¬ den können. Andere Verbindung wie Lipide brauchen als leicht verdampfbare Stoffe nur eine einfache Beschichtung ohne Ex¬ traktion. Für den letzteren Fall existiert mit der Sublimation mit einer Abscheidung der Matrix direkt aus der Gasphase bereits ein Auftragsverfahren mit einer sehr feinen Kristallstruktur, das sich aber nicht für die Extraktion eignet, da keine flüssige Phase vorhanden ist. Nachteilig ist auch, dass eine komplette Fläche auch neben der Probe und nicht nur die Probe selbst mit der Matrix überzogen wird, wodurch sich ein hoher Verbrauch an Matrixlösung einstellt, was insbesondere bei teuren Matrizes ins Gewicht fällt. Ohnehin eignen sich nur wenige Matrizes für diese Methode, während sie beispiels¬ weise für Enzymlösungen nicht anwendbar ist. Um bei einer Beschichtung durch Sublimation dennoch eine Extraktion bewirken zu können, werden durch Sublimation beschichtete Objekte in einer wassergesättigten Umgebung 24 bis 72 Stunden aufbewahrt, wobei durch die Umgebungsfeuchtigkeit ein gewisses Maß an Extraktion stattfindet. Die extrem lange Probenvorbereitungszeit steht einer weiten Verbreitung dieser Methode entgegen.
Von den übrigen Sprühmethoden, beispielsweise der manuellen Sprühmethode, der Ultraschallversprühung oder der Elektro- spray-Technik, ist die modifizierte Airbrush-Methode hervor¬ zuheben, bei welcher ein optimierter Sprühkopf mit einer exakten Flüssigkeitsmenge pro Zeiteinheit beschickt wird. An¬ sonsten setzt ein derartiger Sprühkopf, wie der Name schon sagt, die Airbrush-Technik ein, bei welcher der Luftstrom nach dem Ej ektor-Prinzip die Flüssigkeit mitreißt und fein verteilt. Eine derartige Methode eignet sich sehr gut für die Extraktion, wobei die erzielbaren Kristallgrößen nach dem Abtrocken der Matrix sich in einer Größenordnung von 30 bis 100 ym bewegen.
Die Auflösung beim MALDI-Imaging wird durch die Kristallgröße der Matrix und den Laserdurchmesser bestimmt. Je kleiner die Auflösung dieser beiden Parameter, desto detailliertere Informationen erhält man über das Gewebe, wie z. B. Leber, Niere, Haut und Gehirn sowie allen anderen inneren Organen, bzw. ihrer Feinstruktur. Dies ermöglicht eine Fülle von neuen Informationen beispielsweise über die Entwicklung eines Krebses oder die neuen Verbindungen, die durch den Krebs neu entstehen, was wiederum eine frühe Erkennung der Krankheit ermöglicht . In der Pharmaforschung erhält man sehr detaillierte Informa¬ tionen über die Verteilung eines Medikaments im lebenden Körper und deren Metabolite sowie die Ausscheidung aus dem Körper .
Neuere Entwicklungen in der Lasertechnik haben für die Laserdurchmesser Dimensionen von ca. 1 ym geschaffen. Mit dieser Entwicklung können die bisherigen Kristallgrößen die durch die üblichen Sprühverfahren aufgetragen wird, nicht mithalten. Wie bereits erwähnt, liegt die Grenze in einer Größen¬ ordnung von 30 ym bis 100 ym als kleinste Kristallgröße, ins¬ besondere dann, wenn eine Extraktion erforderlich ist, wenn größere Moleküle wie Peptide oder Proteine in einem Moleku¬ largewichtsbereich von >100 bis über 100 000 Dalton erfasst werden sollen. Wenn jedoch die Kristallgröße in einer Größenordnung von 30 ym aufwärts liegt, hat dies zur Folge, dass bei einem Auftreffen des Laserstrahles selbst dann, wenn die¬ ser einen Durchmesser von ca. 1 ym hat, der komplette Kristall verdampft, so dass die Auflösung in diesem Fall durch die Matrixkristallgröße und nicht durch den Laserdurchmesser bestimmt wird.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Sprühvorrichtung der eingangs genannten Art dahingehend zu verbessern, dass eine Bildung kleinerer Kristalle der Maxtrix in der Beschichtung nach dem Abtrocknen ermöglicht ist. Die Beschichtung soll auch möglichst homogen ausgebildet sein, um die Erfassung der Moleküle nicht nur qualitativ sondern auch semi-quantitativ oder quantitativ zu ermöglichen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch eine Sprühvorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, bei welcher der Flüssigkeitsauslass am Ende einer Kapillarleitung vorge- sehen ist, die beispielsweise mittig über den Gasauslass hin¬ aus hervorsteht.
Es hat sich gezeigt, dass mit der erfindungsgemäßen Sprühvorrichtung bedingt durch den über den Gasauslass überstehenden Flüssigkeitsauslass eine besonders feine Tröpfchengröße er¬ reichbar ist, die letzten Endes zu einer Matrixschicht auf der Probe führt, die nach dem Trocknen eine kleinere Kris¬ tallgröße bei homogener Schichtbildung aufweist. Überra¬ schenderweise ergibt sich der Effekt gerade dadurch, dass der Gasauslass im Verhältnis zum Flüssigkeitsauslass zurückge¬ setzt vorgesehen ist, so dass das Gas bis zum Erreichen der Flüssigkeit verwirbelt wird und dieses nicht mehr, wie bis¬ her, nach dem Ej ektorprinzip mitreißt, sondern dass die feine Tröpfchenbildung in dem verwirbelten Gas ausgebildet wird.
Als Gase eignen sich im übrigen Luft oder auch Stickstoff, je nach Art der zu versprühenden Matrixlösung und zu untersuchenden Probe .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das Ende der Kapillarleitung an seinem Außenumfang verjüngt ist, vorzugsweise konisch verjüngt ist. Es hat sich gezeigt, dass durch diese Maßnahme eine besonders feine Tröpfchenbildung ermöglicht ist, weil durch die Verjüngung, vorzugsweise in konischer Form, der verwirbelte
Gasstrom besonders effektiv in Richtung des Flüssigkeitsaus¬ lasses umgelenkt wird.
In jedem Fall erfolgt unabhängig von der Ausbildung des Endes der Kapillarleitung eine aktive Zufuhr der Matrixlösung z. B. mittels einer geeigneten Pumpe, die in der Lage ist, die sehr kleinen Flüssigkeitsmengen zu fördern, die beim Auftrag der Schichten benötigt werden. Auf typische Flussmengen wird spä¬ ter noch im Rahmen der Ausführungsbeispiele eingegangen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Gasauslass durch einen Ringspalt zwischen der Außenwandung der Kapillarleitung und einem Führungsschlauch oder -rohr ausgebildet. Der Führungsschlauch oder das Führungsrohr dient dabei gleichzeitig zur Stabilisierung der empfindlichen Kapillarleitung, die in der Regel als Quarzkapillare ausgebildet ist.
Der Führungsschlauch oder das Führungsrohr, das beispielsweise aus PEEK ( Polyethereetherketon) bestehen kann, kann wiederum von einem größeren Durchmesser stabilisiert sein, wobei letzten Endes das Führungsrohr und/oder die Kapillarleitung vorzugsweise in einem Gehäuse gasdicht gehalten sind. Das Ge¬ häuse hat zum Einen die Aufgabe, die Position des Düsenkopfes exakt zu definieren, zum anderen besitzt das Gehäuse vorzugs¬ weise einen Gasanschluss für die Gaszufuhr, wobei in dem Ge¬ häuse ein Gasdurchlass in einem Ringspalt zwischen dem Füh¬ rungsrohr oder dem Führungsschlauch und der Kapillarleitung vorgesehen ist. Auf diese Weise kommt dem Gehäuse die Funkti¬ on zu, den Gasstrom von der Gaszufuhr in den Ringspalt zwischen den Führungsschlauch oder dem Führungsrohr und der Kapillarleitung zu leiten.
In der Regel durchragt die Kapillarleitung des Gehäuse und ist an ihrem anderen Ende mit einer bereits erwähnten Förderpumpe für die Flüssigkeitszufuhr verbunden, wobei anstelle einer Pumpe auch ein Dispenser mit einer geeigneten hohen Auflösung, beispielsweise 24.000 Schritten pro Spritzenfül¬ lung eingesetzt werden kann. Um den rückwärtigen Austritt der Kapillarleitung aus dem Gehäuse gasdicht zu verschließen, ist vorzugsweise auf der dem Sprühkopf abgewandten Seite des Ge- häuses ein Stopfen vorgesehen, der das Gehäuse gegen die Außenwandung der Kapillarleitung gasdicht verschließt.
Um die bereits angesprochene Positionierung des Düsenkopfes besonders exakt vornehmen zu können, verfügt das Gehäuse vor¬ zugsweise über einen Absatz, der in einem definierten Abstand zum Flüssigkeitsauslass angeordnet ist. Der Flüssigkeitsaus- lass definiert mit seiner exakten Lage die Position des Dü¬ senkopfes .
Vorzugsweise ist der Düsenkopf an einer Verfahrvorrichtung gehalten, die ein Verfahren der Position des Düsenkopfes in der X-, Y- und/oder Z-Richtung ermöglicht. Grundsätzlich ist die Verfahrmöglichkeit in X- und Y-Richtung wichtiger, da ggf. auch mit einer festen Position, d. h. einem festen Abstand des Flüssigkeitsauslasses zur Probenoberfläche gearbei¬ tet werden kann. Der Düsenkopf wird beispielsweise mit Hilfe des zuvor beschriebenen Absatzes an dem Gehäuse in eine defi¬ nierte Position bezüglich der Gewebeoberfläche gebracht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Beschichten von Proben durch Besprühen mit einer Lösung unter Verwendung der zuvor beschriebenen Sprühvorrichtung. Diese wird derart eingesetzt, dass die Probe nacheinander mehrfach besprüht wird, wobei ein nachfolgender Sprühvorgang erst dann durchgeführt wird, wenn die zuvor aufgetragene Schicht abgetrocknet ist.
Es hat sich gezeigt, dass sich durch das mehrfache Auftragen der Sprühlösung unter zwischenzeitlichem Abtrocknen unerwünschte Effekte vermeiden lassen, die bisher bei zu großer Flüssigkeitsmenge auftraten, nämlich dass kleinere Moleküle ihre ursprünglichen Lage verlassen und anfangen in verschie- dene Richtungen zu diffundieren, so dass am Ende die Exakt¬ heit der Lageinformationen bei der Massenspektroskopie verlo¬ ren geht. Durch das schichtweise Auftragen kann eine 1.-3., recht dünne Schicht in der Art einer Fixierschicht eingesetzt werden, die die Lageinformationen sicherstellt und zum anderen eine Art saugfähige Unterlage für weitere Schichten bil¬ det, die dann bei geeigneter Menge an Matrixlösung auch dazu geeignet sind, die gewünschte Extraktion größerer Moleküle in der gewünschten Art und Weise in die Matrixstruktur zu erreichen. Entsprechend sieht eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens vor, dass die erste aufgetragene Schicht mit einer kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht wird, die Menge bei den nachfolgenden Schichten erhöht wird, bis eine bestimmte Menge an Matrix pro Fläche erreicht wird, und diese Menge an Lösung pro Fläche für die letzten Schichten mehrfach wiederholt aufgetragen wird. Eine typische Anzahl von Schich¬ ten liegt im Bereich zwischen 5 bis 10, beispielsweise 8 Schichten, so dass sich insgesamt eine zweckmäßige Dicke der Matrix ergibt, die bei Bestrahlung mit dem Laser dann lokal auf einer auf die erreichte Kristallgröße reduzierten Fläche verdampft. Die ersten 1-3 Schichten, die mit der kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht werden, trocknen dabei sehr schnell ab, so dass keine Lageveränderungen kleiner Moleküle zu befürchten sind.
Beispielsweise kann von einer ersten Menge an Lösung pro Flä¬ che für die erste Schicht ausgehend die Menge beim Auftragen der zweiten Schicht verdoppelt und beim Auftragen der dritten Schicht verdreifacht werden, bis bei der dritten bis sechsten Schicht ein Maximum erreicht wird, das für alle nachfolgenden Schichten zur Anwendung kommt. Da in der Regel der mittels einer in üblicher Art und Weise mit einer zweckmäßigen Geometrie des Sprühkopfes ausgebilde¬ ten Sprühvorrichtung eine Fläche mit einem Durchmesser von z.B. 2 mm besprüht werden kann, ist es bei entsprechend grö¬ ßeren Proben zweckmäßig, dass diese unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer Verstellbarkeit in der X- und Y- Richtung zum Aufbringen einer Schicht zeilenweise besprüht wird. Nach dem zeilenweisen Besprühen der Probe und entsprechen vollständigem Aufbringen einer Schicht, fährt der Sprühkopf dann in die Ausgangslage zurück und wiederholt den Auf¬ trag zeilenweise für die nächste Schicht.
Nachfolgend wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher auf ein Ausführungsbeispiel der Erfindung eingegangen. Es zeigen:
Fig. 1 einen Schnitt einer Gesamtansicht eines Sprühkopfes einer Sprühvorrichtung;
Fig. 2 eine Detailansicht der Austrittsbereiche des Sprüh¬ kopfes;
Fig. 3 eine schematische Ansicht einer Sprühvorrichtung mit verstellbarem Sprühkopf.
In Fig. 1 ist ein Düsenkopf 10 gezeigt, der auch als Sprüh¬ kopf bezeichnet werden kann. Der Düsenkopf 10 ist über ein rückwärtiges Ende 12 einer Quarzkapillare 14 als Kapillarlei¬ tung mit einer Flüssigkeitszufuhr verbunden, die nicht im Detail gezeigt ist. Diese Flüssigkeitszufuhr kann durch eine konstant fördernde Spritzenpumpe oder durch einen Dispenser mit einer sehr hohen Auflösung von 24.000 Schritten pro
Spritzenfüllung übernommen werden, um möglichst exakte Flüssigkeitsmengen durch die Kapillarleitung der Quarzkapillare 14 zu einem Flüssigkeitsaustritt 16 (siehe auch Fig. 2) zu fördern . Die Quarzkapillarleitung 14 ist durch ein Gehäuse 18 hindurch geführt, das an seinem rückwärtigen Ende mit Hilfe einer Überwurfmutter 20 verschlossen ist, wobei die Überwurfmutter 20 in einem Gewinde 22 in das Gehäuse 18 eingreift und das Gehäuse 18 gegen den Außenumfang der Quarzkapillare 14 ab¬ dichtet. Das Gehäuse selbst ist gestuft mit einem Absatz 24 ausgebildet, auf dessen Funktion später noch näher eingegangen wird.
Das Gehäuse ist innenseitig mit einer mittigen Bohrung 26 versehen, die mit einem radialen Gasanschluss 28 in Verbindung steht, der mit einer Gaszufuhr (nicht gezeigt) zu ver¬ binden ist. Die Gaszufuhr sorgt durch geeignete Pumpmittel für die Zufuhr von Luft oder einem anderen geeigneten Gas wie z. B. Stickstoff, unter einem Druck von üblicherweise 2 bis 3 Bar, der im Betrieb konstant gehalten wird, wobei auch andere Druckwerte realisierbar sind.
An dem der Überwurfmutter 20 gegenüberliegenden Ende des Gehäuses 18 sitzt in einem erweiterten Bohrungsabschnitt 30 ein erster Führungsschlauch 32, der auch als Führungsrohr ausgebildet sein kann, innerhalb welchem ein weiterer Führungsschlauch 34 druckdicht eingelassen ist. Der zweite Führungs¬ schlauch 34 umschließt die Quarzkapillare 14 an ihrem Außen¬ umfang mit einem Ringspalt, d. h. zwischen dem zweiten Führungsschlauch 34 und der Quarzkapillare besteht ein Gasdurch- lass zwischen der Bohrung 26 des Gehäuses 10 und einem Gas- auslass 36 (siehe Fig. 2) am Ende des zweiten Führungsschlau¬ ches 34, in dessen Mitte die Quarzkapillare 14 um ein be¬ stimmtes Wegstück über das Ende des zweiten Führungsschlau¬ ches 34 übersteht. Wie aus Fig. 2 gut zu erkennen ist, ist der Ringspalt 38 dazu vorgesehen, das durch den Gasanschluss 28 zugeführte Gas am Ende des zweiten Führungsschlauches 34 auszublasen, was durch die Pfeile angedeutet ist. Der Flüssigkeitsaustritt 16 er¬ folgt dabei mit einem Abstand zu dem Gasaustritt 36 und ist durch die skizzierten Tropfen veranschaulicht. Durch den Abstand zwischen dem Gasauslass 36 und dem Flüssigkeitsauslass 16 kann der Gasstrom leicht verwirbeln, wobei das Ende der Glaskapillare 14 mit einer konischen Verjüngung 40 vorgesehen ist, die den verwirbelten Gasstrom in Richtung des dosiert geförderten, aus dem Flüssigkeitsaustritt 16 austretenden Flüssigkeitsstroms fördert. Durch diese konische Verjüngung, die auch ballig ausgebildet sein kann, erfolgt eine besonders feine Tröpfchenbildung, wobei der Gasstrom die feinen Flüssigkeitstropfen weiter in Richtung einer unterhalb des Flüssigkeitsauslasses 16 angeordneten Probe fördert.
Der in Fig. 1 und 2 gezeigte Düsenkopf ist in einer Sprühvorrichtung 100 montiert, wobei der Absatz 24 in einer definierten Position einer Aufnahme ruht, so dass der Flüssigkeits¬ auslass 16 in einem definierten Abstand zu auf einem Tisch angeordneten metallischen Targets 110 liegt, auf welchen zur Vorbereitung für weitergehende Untersuchungen zu besprühendes Gewebe 112 aufgebracht ist. Die Aufnahme 102 des Düsenkopfes 10 ist seitlich in einer Y-Richtung verfahrbar an einem Träger 104 angeordnet, der wiederum in einer X-Richtung verfahrbar an einer Schiene 106 angebracht ist, so dass der Düsen¬ kopf durch Verfahren der Aufnahme 102 am Träger 104 und Verfahren des Trägers 104 auf der Schiene 106 in der X- und Y- Richtung verstellbar ist. Die Aufnahme 102 kann in der Z- Richtung verstellbar sein, um den Flüssigkeitsauslass 16 in seinem Abstand zu den Targets 110 oder vorbereiteten Glasträ¬ gern einstellen zu können. In der Regel ist aber während des eigentlichen Sprühvorgangs eine Verstellung des Abstandes zwischen dem Sprühkopf 10 und den Targets 110 nicht erforder¬ lich.
Normalerweise erfolgt das Besprühen des Gewebes 112 in der Weise, dass der Düsenkopf 10 die zu besprühende Fläche zei¬ lenweise abfährt, da in der Regel der durch den Sprühstrahl erfasste Bereich kleiner ist als die Fläche des zu besprühen¬ den Gewebes. Typischerweise erfasst die versprühte Matrixlö¬ sung bei einem zeilenweisen Verfahren eine streifenförmige Fläche von einer Breite von ungefähr 2 mm.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel im Detail beschrei- ben, bei dem einige Parameter explizit genannt werden, auch wenn sie sich im Rahmen der Erfindung in einem weiten Bereich bewegen können.
Es wurde eine Matrixlösung versprüht, die im Bereich des Dü¬ senkopfes 10 mit einem unter einem konstanten Druck von
2,5 bar zugeführten Luftstrom vermischt worden ist. Der Außendurchmesser der gewählten Quarzkapillare betrug 280 ym, wobei zwischen dem zweiten Führungsschlauch 34 und dem Außendurchmesser der Quarzkapillare 14 ein Ringspalt mit einer Hö¬ he von 60 ym vorgesehen war, d. h. der Innendurchmesser des aus PEEK gefertigten zweiten Führungsschlauches betrug 400 ym. Die Quarzkapillare 14 besaß einen inneren Kanal 42 mit einem Durchmesser von 75 ym.
Unter einem fest eingestellten Abstand von 40 mm zwischen dem Flüssigkeitsaustritt 16 und der Oberfläche des Targets 110, wurde letzteres zeilenweise abgefahren, bis eine gewünschte Fläche vollständig mit der Matrixlösung besprüht worden war. Dabei wird bei der gewählten Düsengeometrie und dem gewählten Gasdruck ein Bereich von ca. 2 mm direkt besprüht, wobei die Zeilenabstände so gewählt sind, dass eine Überdeckung benach¬ barter besprühter Zeilen nur minimal vorhanden ist, um abweichende Schichtdicken im Überlappungsbereich zu vermeiden.
Beim Aufbringen einer ersten Schicht, ist eine Flüssigkeits¬ zufuhr von 10 μΐ pro Minute gewählt worden, wobei die Ver- fahrgeschwindigkeit 200 cm pro Minute betrug.
Nach dem Aufbringen der ersten Schicht, wurde eine zweite Schicht durch Versprühen aufgebracht, die bei ansonsten glei¬ chen Verfahrensparametern unter ein Verdopplung der Flüssigkeitszufuhr auf 20 μΐ pro Minute durchgeführt worden ist. Ei¬ ne dritte Schicht wurde mit 30 μΐ pro Minute, eine vierte mit 40 μΐ pro Minute aufgebracht, wobei insgesamt 8 Schichten aufgebracht wurden, die ab der vierten Schicht alle unter ei¬ ner Flüssigkeitszufuhr von 40 μΐ pro Minute aufgebracht worden sind.
Eine elektronenmikroskopische Untersuchung der Schicht ergab, dass sich Matrixkristalle einer sehr konstanten Kristallgröße im Bereich zwischen 130 bis 140 nm ausgebildet hatten. Mit derartigen Kristallgrößen eignete sich die Probe hervorragend für die weitere Untersuchung im Rahmen der MALDI-Technik der neusten Generation mit einem Laser, dessen Lichtstrahl auf 1 μιη Größe fokussiert war. Durch die kleinen Kristalle ist die Auflösung der massenspektrometrischen Untersuchung durch den extrem kleinen Querschnitt des Laserstrahls von 1 μιη de¬ finiert, was unterhalb der Größe einer menschlichen Zelle von bis zum 10 μιη liegt, so dass im Rahmen dieser Untersuchung das Gewebe nach einzelnen Zellen analysiert werden konnte. Das beschriebene Ausführungsbeispiel ist mit seinen Eckdaten nicht zwingend. Insbesondere können die Dimensionen der
Quarzkapillare und des Führungsschlauches deutlich abweichen, aber auch die Flüssigkeitsmenge kann je nach Art zu versprü¬ henden Matrixlösung deutlich von den genannten Werten abweichen. Auch bei der Gaszufuhr sind Abweichungen von dem gewählten Druck möglich, um je nach gewünschter Untersuchung entsprechend unterschiedliche Schichten aufbringen zu können.

Claims

Ansprüche
1. Sprühvorrichtung zum Besprühen von Proben (112) mit einer Lösung, wobei eine Flüssigkeitszufuhr zum dosierten Zuführen der Lösung und eine Gaszufuhr vorgesehen sind, die über Zuleitungen an einen Düsenkopf (10) angeschlossen sind, der einen Gas- (36) und einen Flüssigkeitsauslass (16) aufweist, um die Lösung zu versprühen, dadurch gekennzeichnet, dass der Flüssigkeitsauslass (16) am Ende einer Kapillarleitung (14) vorgesehen ist, die über den Gasauslass (36) hinaus hervorsteht.
2. Sprühvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ende der Kapillarleitung (14) an seinem Außenumfang verjüngt ist.
3. Sprühvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Gasauslass (36) durch einen Ringspalt zwischen einem Außenumfang der Kapillarleitung (14) und einem Führungsschlauch (34) oder Führungsrohr ausgebildet ist .
4. Sprühvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Führungsschlauch (34) und/oder die Kapillarleitung (14) in einem Gehäuse (18) gasdicht gehalten sind.
5. Sprühvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (18) einen Gasanschluss (28) für die Gaszufuhr aufweist und in dem Gehäuse ein Gasdurchlass in einen Ringspalt zwischen dem Führungsschlauch (34) oder - rohr und der Kapillarleitung (14) vorgesehen ist.
6. Sprühvorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (10) auf einer dem Flüssig- keitsauslass (16) abgewandten Seite mit einem Gewinde¬ stopfen (20) versehen ist, der das Gehäuse (10) gegen die Außenwandung der Kapillarleitung (14) gasdicht verschließt .
7. Sprühvorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse einen Absatz (24) aufweist, der in einem definierten Abstand zum Flüs- sigkeitsauslass (16) angeordnet ist.
8. Sprühvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Düsenkopf (10) an einer Verfahrvorrichtung (100) gehalten ist, die ein Verfahren der Position des Düsenkopfes (10) in der X-, Y-, und/oder Z-Richtung ermöglicht.
9. Verfahren zum Beschichten von Proben (112) durch Besprühen mit einer Lösung unter Verwendung einer Sprühvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (112) nacheinander mehrfach besprüht wird, wobei ein nachfolgender Sprühauftrag erst dann durchgeführt wird, wenn die zuvor aufgetragene
Schicht abgetrocknet ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die erste aufgetragene Schicht mit einer kleineren Menge an Lösung pro Fläche besprüht wird, die Menge bei den nachfolgenden Schichten erhöht werden, bis eine bestimmte Menge an Lösung pro Fläche erreicht wird, die für die letzte Schicht oder für mehrere Schichten mehrfach wie¬ derholt aufgetragen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Menge Lösung pro Fläche für die erste Schicht beim Auftragen der zweiten Schicht verdoppelt, bei Auf¬ tragen der dritten Schicht verdreifacht und ggf. bis zu einem Maximum bei einer weiteren Schicht weiter erhöht wird, das für alle nachfolgenden Schichten beim Auftrag eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 unter Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zum Aufbringen einer jeweiligen Schicht zeilenweise besprüht wird.
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