EP2176419A1 - Erfindung betreffend expression und permanente sekretion von caninen interleukinen - Google Patents

Erfindung betreffend expression und permanente sekretion von caninen interleukinen

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Publication number
EP2176419A1
EP2176419A1 EP08784319A EP08784319A EP2176419A1 EP 2176419 A1 EP2176419 A1 EP 2176419A1 EP 08784319 A EP08784319 A EP 08784319A EP 08784319 A EP08784319 A EP 08784319A EP 2176419 A1 EP2176419 A1 EP 2176419A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
interleukin
cells
cell line
canine
line according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08784319A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eberhard H. Burkhardt
Vladimir Kocoski
Sandra Preis
Norbert Tautz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Justus Liebig Universitaet Giessen
Original Assignee
Justus Liebig Universitaet Giessen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Justus Liebig Universitaet Giessen filed Critical Justus Liebig Universitaet Giessen
Publication of EP2176419A1 publication Critical patent/EP2176419A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12

Definitions

  • the present invention relates to a method for the specific expression and permanent secretion of canine interleukins, especially interleukin-2 (clL-2) or interleukin-12 (clL-12) from transfected BHK-Tet-on cells.
  • canine interleukins especially interleukin-2 (clL-2) or interleukin-12 (clL-12) from transfected BHK-Tet-on cells.
  • LAK lymphokine-activated killer cells
  • tumor immunotherapy Because of the inadequate efficacy of classical tumor therapies in some tumor patients (surgical removal of the tumor, radiation and chemotherapy) in the complete removal of tumor metastases and remaining tumor cells, different components of the immune system, which are also used by the body itself against the tumor, provide as one Possibility to fight the tumor specifically and on a single cell level. All approaches that use the components of the immune system against tumors fall under the so-called tumor immunotherapy.
  • One of the approaches to tumor immunotherapy is the use of cytotoxic lymphocytes (a subpopulation of T cells and NK cells) that are pre-stimulated with cytokines that enhance their cytolytic and anti-tumoral effects and injected into the patient.
  • interleukin-2 and interleukin-12 are particularly well suited for the preparation of a medicament for use in tumor therapy.
  • JP 62032885 is known to produce human interleukin 2 in eukaryotic cells, wherein the human IL-2 gene is expressed together with a PVUII fragment of the bovine papillomavirus. From CN1373221 it is known to produce interleukin 12 recombinantly from human blood cells. CN 1347622 discloses a method of recombinantly producing human interleukin-12 in insect virus strains.
  • US 2007053873 discloses a method for the preparation and activation of canine lymphocytes in the presence of anti-canine CD3 antibodies and human interleukin-2 (IL-2) as well as the treatment of tumors in dogs.
  • the disadvantage here is that the use of CD3 antibodies is complicated and also strong side effects can not be excluded by the additional antibodies.
  • CD3 + lymphocytes (T lymphocytes) are stimulated here, which require prior antigen contact to develop their effect (acquired immunity). In contrast, natural killer cells do not require prior antigenic contact as part of the innate immune response.
  • the object of the present invention is to overcome the disadvantages described in the prior art and to provide cell lines for the permanent secretion of canine interleukins, which are suitable for the preparation of an agent for tumor therapy. Solution of the task
  • BHK Tet-On cells that are transfected with nucleic acid molecules containing interleukin-coding sequences so that is released after induction interleukin.
  • BHK Tet-On cells which release canine interleukin-2 (clL-2) or canine interleukin-12 (clL-12) are useful in the preparation of an anticancer agent.
  • the permanent canine interleukin releasing cell line is made by BHK Tet-on cells, which are transfected with nucleic acid molecules containing interleukin-encoding sequences so that they release interleukin after induction.
  • lymphokine-activated killer cells which are effective in tumor immunotherapy in dogs, are permanently generated in a special procedure.
  • the present invention encompasses cells, preferably BHK cells (baby hamster kidney cells) transfected with the gene sequences for canine interleukin-2 (cIL-2) or canine interleukin-12 (clL-12) in the Tet-on system and then, after stimulation with doxycycline, permanently release canine interleukin-2 (clL-2) or canine interleukin-12 (clL-12).
  • BHK cell lines come from the hamster and are xenogenic. This ensures that no cell-specific proteins are secreted by these cell lines, which would be disturbing.
  • cytokine concentration of 5-50 ng interleukin / ml cell culture supernatant of canine interleukin-2 (clL-2) or canine interleukin-12 (clL-12) is achieved.
  • Natural killer cells for example cells isolated from a tumor patient, are activated by interleukins 2 and / or 12 to lymphokine activated killer (LAK) cells, and are transmitted to the patient as agents for treating tumor diseases.
  • LAK lymphokine activated killer
  • the present invention further encompasses the production of lymphokine activated killer cells (LAK) from isolated cells of tumor patients, preferably mammals, particularly preferably dogs, by permanent stimulation with canine IL-2 or IL-12 in vitro and thus the production of a suitable agent for adoptive tumor immunotherapy.
  • LAK lymphokine activated killer cells
  • a particular advantage of the invention is that the patient does not come into direct contact with genetically modified organisms during the treatment, since the activation of the lymphokine-activated killer cells by transfected BHK-Tet-on cells preferably takes place outside the patient.
  • telomeres For the cloning of the plasmid pTRUE-IL2 cll_-2-mRNA is isolated from dog blood lymphocytes, the lymphocytes are previously stimulated with concanavalin A.
  • the purification of the mRNA is carried out by a method known to those skilled in the acid guanidine isothiocyanate phenol-chloroform extraction with TRIzol ® reagent (Invitrogen GmbH, Düsseldorf), for example, described in CHOMCZYNSKI (1987).
  • the isolated clL-2 mRNA is amplified by RT-PCR and transcribed into cDNA.
  • the GeneAmp ® RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems) is used, for example.
  • primers are preferably used: Forward primer: 5 'TGA TGA GTG CAT TGG AG 3' and
  • Reverse primer 5 'GAT TCT TTT TGT AAG CCC 3'.
  • the sequence of the IL-2 is checked by sequencing.
  • the amplified PCR product is by standard methods into an appropriate sequencing vector for example, using the TOPO TA Cloning ® Kit in the pCR ® II-TOPO ® - cloned vector (both Invitrogen, Carlsbad, USA) and the correct sequence of the cloned IL-2 Fragment checked according to classical standard methods.
  • the gene for clL-2 is introduced into a tet-on system, preferably in the
  • Vector pTRUE is cloned, which represents part of the tet-on system.
  • the commercially available pTRUE vector (Clontech) exhibits a modification according to the invention since the originally existing Multiple Cloning Site (MCS) of pTRUE is replaced by the MCS of the likewise commercially available plasmid pCITE (Novagene).
  • MCS Multiple Cloning Site
  • pCITE Novagene
  • recognition sequences for the restriction enzymes KpnI and MIuI are introduced flanking to the clL-2 gene in the vector pTRUE with the MCS of the plasmid pCITE. These are preferably used as primers:
  • Reverse primer 5 'ACG CGT CAA GTC AGT GTT GAG AAG ATG CTT TGA CAA AAG G 3'
  • the vector pTRUE with the MCS of the plasmid pCITE is cut with the restriction enzymes Kpn ⁇ and Pst ⁇ and the reporter gene luciferase is cut with the restriction enzymes Mlu ⁇ and Pst ⁇ .
  • the fusion of three fragments into plasmid takes place pTRUE-IL2 from reporter gene luciferase, the vector pTRUE with the MCS of the plasmid pCITE and the clL-2 gene.
  • Seq. ID 1 shows the nucleic acid sequence of the clL-2 gene
  • Figure 1 shows a schematic representation of plasmid pTRUE-IL2.
  • IRS ribosomal entry site
  • the resulting plasmid pTRUE-IL2 ( Figure 1) is transfected after linearization in a BHK cell line, which has already stably integrated the plasmid pEF-Tet-on ( Figure 1) in their genome.
  • the selection of successfully transfected cells is carried out by the resistance genes for puromycin and G418.
  • reporter gene luciferase is used by way of example only, and alternatively by either other reporter genes such as GFP and the like. be replaced or completely absent.
  • Seq.lDI shows in bold the nucleic acid sequence of the clL-2 gene, the underlined regions representing the recognition sequences for the restriction enzymes KpnI and MIuI and thin-flanking vector sequences are given.
  • doxycycline an inducer of the Tet-on expression system
  • RPMI medium is used as cell culture medium
  • other media suitable for the cultivation of lymphocytes may be used, eg DMEM or Ham 's F12.
  • IL-2-dependent CTLL-2 cells mouse T cell tumor line
  • MTT -Proliferation test mitochondria of living cells convert MTT to formazan crystals, the concentration of which can be determined photometrically after dissolution of the crystals.
  • an IL-2 dilution series with defined rhlL-2 concentrations (50 ng IL-2 / ml - 0 ng IL-2 / ml) is prepared, in which also CTLL-2 cells are incubated.
  • the CTLL-2 cells show marked proliferation in the clL-2-containing supernatants of the transfected BHK cells, whereas BHK supernatants from both untransfected and non-doxycycline-induced lines do not induce CTLL-2 proliferation.
  • the clL-2 released into the cell culture supernatant is thus biologically active.
  • the cloning of the plasmid pTRUE-IL-12 is carried out by inserting into the pTRE the cDNA sequences of the genes coding for the dog's IL-12 p35 and p40 (Büttner M, et al., 1998, Cytokines 10 (4), 241-8) Vector are cloned together so that they encode for a recombinant canine single RCA-12 fusion protein.
  • the commercially available pTRUE vector (Clontech) exhibits a modification according to the invention since the originally existing Multiple Cloning Site (MCS) of pTRUE is replaced by the MCS of the likewise commercially available plasmid pCITE (Novagene). The methods for this cloning are familiar to the skilled worker and disclosed in common laboratory protocols.
  • the two subunits of canine IL-12, p35 and p40 are individually amplified by PCR.
  • the following primers are used:
  • Forward primer p40 5 'ggtaccatgcatcctcagcagttggtc 3'; Reverse primer p40: 5'cgtctcaggacaccgactcccgggacactgcaggacacagatgcccagtc3 '; Forward primer p35: 5 'cgtctcggtcccaggtgtcggtatgtgcccgcgcgcggctcc 3' Reverse primer p35: 5 'acgcgtttaggaagaattcagataactcatcattctatcgatggtcaccg 3'.
  • PCR amplification is carried out according to the technique known to the person skilled in the art using the methods described in Büttner M. et al. (1998, Cytokines 10 (4), 241-8) disclosed cDNA of the p35 and p40 genes of the dog.
  • the peculiarity of this is that the two cDNAs (for p35 and p40) are now ligated together into a cDNA which codes for the ORF (open reading frame) of a fusion protein.
  • a sequence of 30 nucleotides is introduced by the "primer extension" known to the person skilled in the art.
  • This sequence codes for 10 amino acids of the bovine elastin and permits a normal and unimpaired folding of the two sequences, so that the activity Figure 2 shows plasmid pTRUE-IL-12.
  • Seq.lD2 shows the nucleic acid sequence of plasmid pTRUE-IL-12, it contains the first 987 nucleotides of the p40 cDNA, then 30 nucleotides which code for 10 amino acids of the bovine elastin and then the nucleotides of p35 which code for P35 protein. Sequencing and purification of the amplificates is carried out according to the standard protocol.
  • the amplicon of the common sequence (SEQ ID2) is cloned into a commercially available pTRE vector together with the luciferase-encoding cDNA.
  • the interfaces Sac II, MIuI and PstI correspondingly listed in FIG. 2 are used.
  • Puromycin is preferably used as a selection marker in the cloning.
  • RPMI medium for example, used as a cell culture medium, alternatively, other media suitable for the cultivation of lymphocytes can be used, for example, DMEM or Ham's F12.
  • the cells successfully transfected with the rcsclL-12-pTRE / luciferase vector are screened by luciferase assay and induced by the addition of doxycycline to the RPMI medium.
  • the doxycycline addition causes the canine IL-12 gene to be induced and secreted into the culture supernatant after induction.
  • Seq. ID 2 shows the nucleic acid sequence of the IL-12 fusion protein. It starts with P40 without stop codon, followed by 10 amino acids of bovine elastin, highlighted by an underlined area, followed by the nucleic acid sequence of the P35 protein starting at the 26th amino acid (starting with agg for arginine). The fusion protein ends with the stop codon of the P35 protein taa.
  • the determination of the bioactivity of the IL-12 secreted from the BHK Tet-on cell line according to the invention takes place, for example, via the measurement of IFN-gamma, since IFN-gamma is only specifically formed after the stimulation of PMBCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) with the IL-12 and this is measured by a canine IFN-gamma specific ELISA (R & D Systems) and compared to a standard control.
  • PMBCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • the PBMCs are incubated once with the supernatant of the IL-12-releasing cell line according to the invention and additionally with IL-12 from the standard.
  • the results show that the IL-12 secreted from the BHK Tet-on cell line according to the invention has the same effect and triggers the formation of IFN-gamma, such as IL-12 from the standard solution.
  • the measurement of the amount of IL-12 released is carried out by incubating the PMBCs additionally with 1 ⁇ g / ml of an anti-canine IL-12 antibody (R & D Systems). It shows that the amount of released IL-12 is greatly increased.
  • lymphokine-activated killer cells Production of lymphokine-activated killer cells and use of the lymphokine-activated killer cells for the preparation of an agent for the treatment of tumors in dogs.
  • Natural killer cells belong to the lymphocytes and are able to recognize and eliminate abnormal cells such as tumor cells via specific receptors.
  • the activity of natural killer cells is enhanced by cytokines e.g. IL-2 and IL12 released by macrophages in vivo are activated. After activation, they produce large amounts of interferon-gamma (IFN-gamma).
  • cytokines e.g. IL-2 and IL12 released by macrophages in vivo are activated. After activation, they produce large amounts of interferon-gamma (IFN-gamma).
  • IFN-gamma interferon-gamma
  • interleukin-activated lymphokine activated killer (LAK) cells represents a major advance in tumor therapy in patients (mammals, especially dogs).
  • the natural killer cells are isolated from a tumor patient and cocultured with the BHK Tet-on cell lines according to the invention, which specifically secrete IL-2 or IL-12, over a period of 7 days to 2 weeks in a suitable medium, so that the NK Cells to lymphokine-activated killer (LAK) cells, which, as agents for the treatment of tumor diseases, are transmitted to the patient.
  • RPMI medium is used as cell culture medium
  • other media suitable for the cultivation of lymphocytes may be used, eg DMEM or Ham 's F12.
  • the natural killer cells isolated by the patient are cultured together with the particular BHK Tet-on cell lines according to the invention in a bioreactor.
  • bioreactors are known for example from the production of monoclonal antibodies and preferably have two chambers separated by a semipermeable membrane.
  • the cytokine-producing BHK Tet-on cell lines (IL-2 and / or IL-12) according to the invention are located in one chamber and the NK cells of the other chamber isolated from the dog, so that the secreted interleukin freely diffuses through the membrane ,
  • the continuous release of interleukin releases the natural killer cells into an in vivo-like state of lymphokine-activated killer (LAK) cells and is used as a treatment for malignant tumors.
  • LAK lymphokine-activated killer
  • NK cells are more efficiently stimulated. After the desired incubation period (preferably 7 to 21 days), the stimulated NK cells are infused into the tumor patient.
  • the continuous formation of IL-2 / IL-12 provides the NK cells with ever-new cytokine molecules and avoids a decrease in the cytokine concentration.
  • the physician is able to determine how best to deliver to the patient the 11-2 and / or IL-12 lymphokine-activated killer (LAK) and what amounts of cells are used, making it therapeutic in treatment malignant tumors makes sense.
  • the lymphokine-activated killer cells (LAK) can also be administered as part of a pharmaceutically acceptable composition or as a prodrug.
  • patient according to the invention refers to humans and vertebrates.
  • the invention can be used in human and veterinary medicine. Particularly suitable is the application on the dog.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung, spezifische Expression und permanente Sekretion von caninen Interleukinen, speziell lnterleukin-2 (clL-2) oder lnterleukin-12 (clL-12), aus transfizierten BHK-Tet-on-Zellen sowie die Verwendung der damit hergestellten Lymphokin-aktivierten Killerzellen zur Tumortherapie beim Hund.

Description

Patentanmeldung
Erfindung betreffend Expression und permanente Sekretion von caninen Interleukinen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Expression und permanenten Sekretion von caninen Interleukinen, speziell lnterleukin-2 (clL-2) oder lnterleukin-12 (clL-12) aus transfizierten BHK-Tet-on-Zellen.
Diese Zellen erzeugen permanent lnterleukin-2 bzw. lnterleukin-12 und werden zur Herstellung eines Arzneimittels zur dauernden Stimulation von Lymphokin- aktivierten Killerzellen (LAK) eingesetzt, welches für die Anwendung in der Tumortherapie speziell beim Hund geeignet ist.
Stand der Technik
Wegen der mangelhaften Wirksamkeit der klassischen Tumortherapien bei manchen Tumorpatienten (chirurgische Entfernung des Tumors, Strahlen- und Chemotherapie) bei der vollständigen Entfernung von Tumormetastasen und verbleibenden Tumorzellen bieten sich unterschiedliche Komponenten des Immunsystems, die auch vom Körper selbst gegen den Tumor eingesetzt werden, als eine Möglichkeit, spezifisch und auf Einzelzellebene den Tumor zu bekämpfen. Alle Ansätze, die die Komponenten des Immunsystems gegen Tumoren ausnutzen, fallen unter die sogenannte Tumorimmuntherapie. Eine der Ansatzmöglichkeiten der Tumorimmuntherapie ist die Verwendung von cyto- toxischen Lymphozyten (eine Subpopulation der T-Zellen und der NK-Zellen), die mit Cytokinen, die ihre cytolytische und anti-tumorale Wirkung verstärken, vorstimuliert und dem Patient injiziert werden.
Es ist aus der Literatur und aus eigenen wissenschaftlichen Ergebnissen beim Hund bekannt, dass lnterleukin-2 und lnterleukin-12 zahlreiche anti-tumorale
Effekte aufweisen, z.B. erhöhte cytolytische Wirkung durch Moleküle, die Nekrose oder Apoptose bei den Tumorzellen verursachen, und auch synergistisch mit T- und NK-Zellen zusammenwirken. Daher sind lnterleukin-2 und lnterleukin-12 einzeln oder in Kombination besonders gut zur Herstellung eines Medikamentes zum Einsatz in der Tumortherapie geeignet.
Vom Stand der Technik ist aus JP62032885 bekannt, humanes Interleukin 2 in eukaryotischen Zellen herzustellen, wobei das humane IL-2-Gen gemeinsam mit einem PVUII Fragment des bovinen Papillomavirus exprimiert wird. Aus CN1373221 ist bekannt, Interleukin 12 aus humanen Blutzellen rekombinant herzustellen. CN 1347622 offenbart ein Verfahren, humanes lnterleukin-12 rekombinant in Insektenvirus-Stämmen herzustellen.
Nachteilig ist daran, dass diese rekombinant erzeugten Interleukine zur Anwendung am Patienten noch einmal in weiteren Schritten aufgereinigt werden müssen, um frei von Virus- oder Bakterienzellen zu sein. Weiterhin müssen sie extern den Tumorzellen bzw. dem Patienten zugeführt werden, was zu an- und absteigenden Cytokinkonzentrationen führt. Dies kann bei systemischer Gabe mit starken Nebenwirkungen für den Patienten verbunden sein. Eine zielgerichtete, annähernd gleiche und damit eher physiologische Zytokinkonzentration ist unbedingt wünschenswert. Weitere Nachteile liegen in der Tatsache begründet, dass es sich um humane Zytokine handelt. Da die Therapie bei Hunden durchgeführt werden soll, sind kanine Interleukine als allogene Proteine zu bevorzugen. Die Beteiligung xenogener Proteine soll vermieden werden, um möglichst physiologische Bedingungen zu erreichen.
Zur Tumortherapie am Hund offenbart US 2007053873 ein Verfahren zur Präparation und Aktivierung von caninen Lymphocyten in Gegenwart von anti- caninen CD3-Antikörpern und humanem lnterleukin-2 (IL-2) sowie die Behandlung von Tumoren bei Hunden. Nachteilig ist dabei, dass die Verwendung von CD3- Antikörpern aufwendig ist und ebenfalls starke Nebenwirkungen durch die zusätzlichen Antikörper nicht ausgeschlossen werden können. Weiterhin werden hierbei CD3+ Lymphozyten (T-Lymphozyten) stimuliert, die zur Entfaltung ihrer Wirkung vorherigen Antigen-Kontakt benötigen (erworbene Immunität). Als Teil der angeborenen Immunantwort benötigen hingegen Natürliche Killerzellen keinen vorherigen Antigenkontakt.
Es gibt derzeit keine stabil transfizierte Zelllinie, die als konstante Quelle für Zytokine dient und die zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen am Hund eingesetzt werden kann.
Aufgabe
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die im Stand der Technik beschriebenen Nachteile zu beheben und Zelllinien zur permanenten Sekretion von caninen Interleukinen bereitzustellen, die zur Herstellung eines Mittels für die Tumortherapie geeignet sind. Lösung der Aufgabe
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Ansprüche gelöst, durch BHK Tet- On-Zellen, die mit Nukleinsäuremolekülen, die Interleukin-kodierende Sequenzen enthalten transfiziert werden, so dass nach Induktion Interleukin freigesetzt wird. Im Besonderen handelt es sich um BHK Tet-On-Zellen, die canines lnterleukin-2 (clL-2) bzw. canines lnterleukin-12 (clL-12) freisetzen und zur Herstellung eines Mittels zur Tumortherapie geeignet sind.
Die permanent canines Interleukin freisetzende Zelllinie wird hergestellt durch BHK Tet-on Zellen, die mit Nukleinsäuremolekülen, die Interleukin-kodierende Sequenzen enthalten, transfiziert werden, so dass sie nach Induktion Interleukin freigesetzen.
Mit den sezernierten Cytokinen 2 bzw. 12 werden in einem speziellen Verfahren permanent Lymphokin-aktivierte Killerzellen generiert, die in der Tumorimmun- therapie am Hund wirkungsvoll sind.
Besondere Eigenschaften der BHK-Tet-On Zelllinie
Die vorliegende Erfindung umfasst Zellen, vorzugsweise BHK-Zellen (Baby Hamster Kidney Zellen), die mit den Gensequenzen für canines lnterleukin-2 (cIL- 2) bzw. canines lnterleukin-12 (clL-12) im Tet-On-System transfiziert sind und daraufhin nach Stimulation mit Doxycyclin permanent canines lnterleukin-2 (clL-2) bzw. canines lnterleukin-12 (clL-12) freisetzen. Die BHK-Zelllinien stammen vom Hamster ab und sind damit xenogen. Somit ist gewährleistet, dass von diesen Zelllinien keine Hunde-spezifischen Proteine sezerniert werden, die störend wären.
In der Zellkultur wird nach Transfektion der kodierenden Gene vorzugsweise eine annähernd konstante Cytokinkonzentration von 5 - 50 ng Interleukin/ml Zellkulturüberstand an caninem lnterleukin-2 (clL-2) bzw. caninem lnterleukin-12 (clL-12) erreicht. Natürliche Killerzellen beispielsweise aus einem Tumorpatienten isolierte Zellen werden durch die Interleukine 2 und/oder 12 zu Lymphokin- aktivierten Killerzellen (LAK) aktiviert, und als Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen dem Patienten übertragen. Das große Problem im Stand der Technik bei Behandlung von Tumorerkrankungen, nämlich die Schwankungen in der Cytokinkonzentration durch Injektion von rekombinantem Interleukin werden damit behoben. Es ist ebenfalls damit zur rechnen, dass erheblich weniger Nebenwirkungen am Patienten zu bemerken sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Herstellung der Lymphokin- aktivierten Killerzellen (LAK) aus isolierten Zellen von Tumorpatienten, vorzugsweise Säugetieren besonders bevorzugt Hunde, durch permanente Stimulation mit kaninem IL-2 bzw. IL-12 in vitro und damit die Herstellung eines geeigneten Mittels zur adoptiven Tumorimmuntherapie.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, dass der Patient bei der Behandlung nicht mit gentechnisch veränderten Organismen direkt in Kontakt kommt, da die Aktivierung der Lymphokin-aktivierten Killerzellen durch transfizierte BHK-Tet-On- Zellen vorzugsweise außerhalb des Patienten erfolgt.
Ausführungsbeispiele
1. Herstellung einer permanent canines Interleukin (IL)-2 produzierenden Zelllinie nach Transfektion des für canines IL-2 kodierenden Gens in die BHK- Tet-on-Zelllinie
1.1. Klonierung von IL-2
Für die Klonierung des Plasmids pTRUE-IL2 wird cll_-2-mRNA aus Hundeblut- Lymphozyten isoliert, wobei die Lymphozyten zuvor mit Concanavalin A stimuliert werden. Die Aufreinigung der mRNA erfolgt nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren der sauren Guanidin-Isothiozyanat-Phenol-Chloroform- Extraktion mit TRIzol® Reagenz (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) z.B. beschrieben in CHOMCZYNSKI (1987).
Die isolierte clL-2-mRNA wird mit RT-PCR amplifiziert und in cDNA umgeschrieben. Dazu wird beispielsweise das GeneAmp® RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems) verwendet. Als Primer werden vorzugsweise eingesetzt: Forward-Primer: 5' TGA TGA GTG CAT TGG AG 3' und
Reverse-Primer: 5' GAT TCT TTT TGT AAG CCC 3'.
Alternativ wird die Sequenz des IL-2 durch Sequenzierung überprüft. Dazu wird das amplifizierte PCR-Produkt nach Standardverfahren in einen geeigneten Sequenziervektor z.B. mit Hilfe des TOPO TA Cloning® Kit in den pCR®ll-TOPO®- Vektor (beides Invitrogen, Carlsbad, USA) einkloniert und die korrekte Sequenz des einklonierten IL-2-Fragmentes nach klassischen Standardmethoden überprüft.
Das Gen für clL-2 wird in ein Tet-on-System eingebracht, vorzugsweise in den
Vektor pTRUE einkloniert, der einen Teil des Tet-on-Systems darstellt. Der kommerziell erhältliche pTRUE Vektor (Clontech) weist eine erfindungsgemäße Modifikation aus, da die ursprünglich vorhandene Multiple Cloning Site (MCS) von pTRUE durch die MCS des ebenfalls kommerziell erhältlichen Plasmids pCITE (Novagene) ausgetauscht wird. Die Verfahren zu dieser Klonierung sind dem Fachmann geläufig und in gängigen Laborprotokollen offenbart.
Mittels PCR werden Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme Kpnl und MIuI links und rechts flankierend an das clL-2-Gen im Vektor pTRUE mit der MCS des Plasmids pCITE eingeführt. Dazu werden vorzugsweise als Primer verwendet:
Forward-Primer: 5' GGT ACC ATG TAC AAA ATG CAA CTC TTG 3' (der unterstrichene Bereich repräsentiert die Restriktionsschnittstelle für Kpnl) und
Reverse-Primer: 5' ACG CGT CAA GTC AGT GTT GAG AAG ATG CTT TGA CAA AAG G 3'
(der unterstrichene Bereich repräsentiert die Restriktionsschnittstelle für MIuI).
Der Vektor pTRUE mit der MCS des Plasmids pCITE wird mit den Restriktionsenzymen Kpn\ und Pst\ geschnitten und das Reportergen Luciferase wird mit den Restriktionsenzymen Mlu\ und Pst\ geschnitten. In einer Dreifachligation erfolgt der Zusammenschluss von drei Fragmenten zu Plasmid pTRUE-IL2 aus Reportergen Luciferase, dem Vektor pTRUE mit der MCS des Plasmids pCITE und dem clL-2-Gen. Seq. ID 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz des clL-2 Gens Figur 1 zeigt in einer schematischen Darstellung Plasmid pTRUE-IL2. Vorzugsweise befindet sich unmittelbar vor dem Reportergen Luciferase eine Ribosomal Entry Site (IRES), die die Translation von zwei einzelnen Proteinen ermöglicht, nämlich clL-2 und Luciferase.
Das so entstandene Plasmid pTRUE-IL2 (Figur 1) wird nach Linearisierung in eine BHK-Zelllinie transfiziert, die bereits das Plasmid pEF-Tet-on (Figur 1) stabil in ihr Genom integriert hat. Die Selektion erfolgreich transfizierter Zellen erfolgt durch die Resistenzgene für Puromycin und G418.
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass das Reportergen Luciferase nur beispielhaft verwendet wird und alternativ entweder durch weitere Reportergene wie GFP u.a. ersetzt werden oder vollständig fehlen kann.
Seq.lDI zeigt in Fettschrift die Nukleinsäuresequenz des clL-2 Genes, wobei die unterstrichenen Bereiche die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme Kpnl und MIuI darstellen und in Dünnschrift flankierende Vektorsequenzen angegeben sind.
Seq.lD 1 agctctcccatatggtcgacctgcaggcggccgcactagtgattggtaccatgtacaaaa! .tgcaactcttgtcttgcatcgcactgacgcttgtacttgtcgcaaacagtgcacctatta cttcaagctctacaaaggaaacagagcaacagatggagcaattactgctggatttacagt tgcttttgaatggagttaataattatgagaacccccaactctccaggatgctcacattta agttttacacgcccaagaaggccacagaatttacacaccttcaatgtctagcagaagaac tcaaaaacctggaggaagtgctaggtttacctcaaagcaaaaacgttcacttgacagaca ccaaggaattaatcagcaatatgaatgtaacacttctgaaactaaagggatctgaaacaa gttacaactgtgaatatgatgacgagacagcaaccattacagaatttctgaacaaatgga ttacctttfcgtcaaagcatcttctcaacactgaettgacgcgtaatcccgcggccatggc ggccgggagcatgcgacgtcgggcccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcac 1.2. Freisetzung von IL-2
Die BHK-Zellen, die mit den Gensequenzen für canines lnterleukin-2 (clL-2) im Tet-On-System transfiziert sind setzen nach Stimulation mit Doxycyclin permanent canines lnterleukin-2 (clL-2) frei.
Dazu wird dem Zellkulturmedium Doxycyclin, ein Induktor des Tet-on- Expressionssystems, zugegeben, um so die Expression der einklonierten Proteine clL2 und des Reportergen Luciferase anzuschalten. Als Zellkulturmedium wird beispielsweise RPMI-Medium verwendet, alternativ können auch andere Medien, die für die Kultivierung von Lymphozyten geeignet sind verwendet werden, z.B. DMEM oder Ham's F12.
In einem geeigneten Assay werden die Zellkulturüberstände auf den Gehalt an biologisch aktivem clL-2 überprüft. Dazu werden IL-2-abhängige CTLL-2-Zellen (T Zell-Tumorlinie der Maus), die sowohl bei Zugabe von humanem als auch caninem IL-2 proliferieren, den BHK- Überständen für 72 h ausgesetzt und deren Proliferation anschließend in einem MTT-Proliferationstest nachgewiesen. Mitochondrien lebender Zellen setzen MTT zu Formazankristallen um, deren Konzentration nach Lösen der Kristalle photometrisch bestimmt werden kann. Als Kontrolle und gleichzeitig als IL-2- Standard zur Ermittlung der IL-2-Konzentration wird eine IL-2-Verdünnungsreihe mit definierten rhlL-2 Konzentrationen (50 ng IL-2/ml - 0 ng IL-2/ml) hergestellt, in welcher ebenfalls CTLL-2-Zellen inkubiert werden. Die CTLL-2-Zellen zeigen in den clL-2-haltigen Überständen der transfizierten BHK-Zellen deutliche Proliferation, wohingegen BHK-Überstände sowohl nicht transfizierter als auch nicht mit Doxycyclin induzierter Linien keine CTLL-2-Proliferation hervorrufen. Das in den Zellkulturüberstand abgegebene clL-2 ist somit biologisch aktiv. 2. Herstellung einer permanent canines lnterleukin (IL)-12 produzierenden Zelllinie nach Transfektion der für canines IL-12 kodierenden Gene in die BHK- Tet-on-Zelllinie
Die Klonierung des Plasmids pTRUE-IL-12erfolgt, indem die cDNA Sequenzen der für das IL-12 des Hundes kodierenden Gene p35 und p40 (Büttner M, et al., 1998, Cytokine 10 (4), 241-8) in den pTRE Vektor gemeinsam so kloniert werden dass sie für ein rcsclL-12 Fusionsprotein (recombinant canine Single chain) kodieren. Der kommerziell erhältliche pTRUE Vektor (Clontech) weist eine erfindungsgemäße Modifikation aus, da die ursprünglich vorhandene Multiple Cloning Site (MCS) von pTRUE durch die MCS des ebenfalls kommerziell erhältlichen Plasmids pCITE (Novagene) ausgetauscht wird. Die Verfahren zu dieser Klonierung sind dem Fachmann geläufig und in gängigen Laborprotokollen offenbart.
Zur Klonierung werden die beiden Untereinheiten des caninen IL-12, p35 und p40, einzeln durch PCR amplifiziert. Vorzugsweise werden dazu die folgenden Primer verwendet:
Forward-Primer p40: 5' ggtaccatgcatcctcagcagttggtc 3'; Reverse-Primer p40: 5'cgtctcaggacaccgactcccgggacactgcaggacacagatgcccagtc3'; Forward-Primer p35: 5' cgtctcggtcccaggtgtcggtatgtgcccgccgcgcggcctcc 3' Reverse-Primer p35: 5' acgcgtttaggaagaattcagataactcatcattctatcgatggtcaccg 3'.
Die PCR-Amplifizierung erfolgt nach der dem Fachmann bekannten Technik unter Verwendung der in Büttner M. et al. (1998, Cytokine 10 (4), 241-8) offenbarten cDNA der Gene p35 und p40 des Hundes. Die Besonderheit dabei ist, dass die beiden cDNAs (für p35 und p40) nun zusammen in eine cDNA ligiert werden, die für das ORF (open reading frame) eines Fusionsproteins kodiert. Zwischen den beiden Sequenzen wird durch die dem Fachmann bekannte „Primer Verlängerung" (primer extension) eine Sequenz von 30 Nukleotiden eingebracht. Diese Sequenz kodiert für 10 Aminosäuren des bovinen Elastins. Sie ermöglicht eine normale und ungestörte Faltung der beiden Sequenzen, so dass die Aktivität des Proteins gewährleistet ist. Figur 2 zeigt Plasmid pTRUE-IL-12. Seq.lD2 zeigt die Nukleinsäuresequenz von Plasmid pTRUE-IL-12, es enthält die ersten 987 Nukleotide der p40 cDNA, dann 30 Nukleotide die für 10 Aminosäuren des bovinen Elastin kodieren und anschließend die Nukleotide des p35 die für P35-Protein kodieren. Sequenzierung und Reinigung der Amplifikate erfolgt nach Standardprotokoll.
Anschließend wird das Amplifikat der gemeinsame Sequenz (Seq. ID2) in einen kommerziell erhältlichen pTRE-Vektor zusammen mit der für die Luciferase kodierenden cDNA kloniert. Für diese dreifache Ligation werden die in der Figur 2 entsprechend aufgeführten Schnittstellen Sac II, MIuI und Pstl benutzt. Danach erfolgt nach Vorgaben des Herstellers die Transfektion des rcsclL-12- pTRE/Luciferase Vectors durch Lipofektion in kommerziell erhältliche BHK Baby Hamster Kidney Tet-On Zellen.
Als Selektionsmarker bei der Klonierung wird vorzugsweise Puromycin verwendet. Als Zellkulturmedium wird beispielsweise RPMI-Medium verwendet, alternativ können auch andere Medien, die für die Kultivierung von Lymphozyten geeignet sind verwendet werden, z.B. DMEM oder Harn 's F12.
Die erfolgreich mit dem rcsclL-12-pTRE/Luciferase Vektor (Figur 2) transfizierten Zellen werden durch Luciferase-Assay überprüft und durch Zugabe von Doxycyclin zum RPMI Medium induziert.
Die Doxycyclin-Zugabe bewirkt, dass das canine IL-12-Gen induziert und nach der Induktion in den Kulturüberstand sezerniert wird.
Seq. ID 2 zeigt die Nukleinsäuresequenz des IL-12 Fusionsproteins. Es beginnt mit P40 ohne Stopp-Codon, daran schließen sich 10 Aminosäuren des bovinen Elastins an, die durch einen unterstrichenen Bereich hervorgehoben sind und diesem folgt die Nukleinsäuresequenz des P35 Proteins ab der 26. Aminosäuren (Start mit agg für Arginin). Das Fusionsprotein endet mit dem Stopp-Codon des P35 Proteins taa. Seq.lD 2 atgcatcctcagcagttggtcatctcctggttttccctcgttttgctggcgtcttccctca tgaccatatgggaactggagaaagatgtttatgttgtagagttggactggcaccctgatgc ccccggagaaatggtggtcctcacctgccatacccctgaagaagatgacatcacttggacc tcagcgcagagcagtgaagtcctaggttctggtaaaactctgaccatccaagtcaaagaat ttggagatgctggccagtatacctgccataaaggaggcaaggttctgagccgctcactcct gttgattcacaaaaaagaagatggaatttggtccactgatatcttaaaggaacagaaagaa tccaaaaataagatctttctgaaatgtgaggcaaagaattattctggacgtttcacatgct ggtggctgacggcaatcagtactgatttgaaattcagtgtcaaaagtagcagaggcttctc tgacccccaaggggtgacatgtggagcagtgacactttcagcagagagggtcagagtggac aacagggattataagaagtacacagtggagtgtcaggaaggcagtgcctgcccctctgccg aggagagcctacccatcgaggtcgtggtggatgctattcacaagctcaagtatgaaaacta caccagcagcttcttcatcagagacatcatcaaaccagacccacccacaaacctgcagctg aagccattgaaaaattctcggcacgtggaggtcagctgggaataccccgacacctggagca ccccacattcctacttctccctgacattttgcgtacaggcccagggcaagaacaatagaga aaagaaagatagactctgcgtggacaagacctcagccaaggtcgtgtgccacaaggatgcc aagatccgcgtgcaagcccgagaccgctactatagttcatcctggagcgactgggcatctg tgtcctgcagtgtcccgggagtcggtgtcecaggtgtcggtaggagcctccccacagcctc accgagcccaggaatattccagtgcctcaaccactcccaaaacctgctgagagccgtcagc aacacgcttcagaaggccagacaaactctagattatattccctgcacttccgaagagattg atcatgaagatatcacaaaggataaaaccagcacagtggaggcctgcttaccactggaatt aaccatgaatgagagttgcctggcttccagagagatctctttgataactaacgggagttgc ctggcctctggaaaggcctcttttatgacggtcctgtgccttagcagcatctatgaggact tgaagatgtaccagatggaattcaaggccatgaacgcaaagcttttaatggatcccaagag gcagatctttctggatcaaaacatgttgacagctatcgatgagctgttacaggccctgaat ttcaacagtgtgactgtgccacagaaatcctcccttgaagagccggatttttataaaacta aaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgtgcggtgaccatcgatagaat gatgagttatctgaattcttcctaa Nachweis der Bioaktivität des im Überstand erzeugten IL-12
Die Bestimmung der Bioaktivität des aus der erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinie sezernierte IL-12 erfolgt beispielsweise über die Messung von IFN- gamma, da IFN-gamma nach der Stimulation von PMBCs (Peripheral Blood Mononuclear CeIIs) mit dem IL-12 erst spezifisch gebildet wird und dies über einen caninen IFN-gamma spezifischen ELISA (R&D Systems) gemessen und mit einer Standardkontrolle verglichen wird.
Die PBMCs werden dazu einmal mit dem Überstand der IL-12 freisetzenden erfindungsgemäßen Zelllinie inkubiert und zusätzlich mit IL-12 aus dem Standard. Die Ergbnisse zeigen, dass das aus der erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinie sezernierte IL-12 die gleiche Wirkung aufweist und die Bildung von IFN-gamma auslöst, wie IL-12 aus der Standardlösung.
Die Messung der Menge an freigesetztem IL-12 erfolgt, indem die PMBCs zusätzlich mit 1 μg/ml eines anti-canines IL-12 Antikörper (R&D Systems) inkubiert werden. Dabei zeigt sich, dass die Menge an freigesetztem IL-12 stark erhöht ist.
3. Herstellung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen und Verwendung der Lymphokin-aktivierten Killerzellen zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Tumoren beim Hund.
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) gehören zu den Lymphozyten und sind in der Lage abnormale Zellen, wie Tumorzellen über spezifische Rezeptoren zu erkennen und zu eliminieren. Die Aktivität der natürlichen Killerzellen wird durch Cytokine z.B. IL-2 und IL12, die in vivo von Makrophagen abgegeben werden, aktiviert. Nach der Aktivierung produzieren sie große Mengen an Interferon- Gamma (IFN-gamma).
Der Einsatz von bereits in vitro durch Interleukin aktivierten Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) stellt einen großen Fortschritt in der Tumortherapie von Patienten (Säugetieren, vor allem Hunden) dar. Dazu werden die natürlichen Killerzellen aus einem Tumorpatienten isoliert und mit den erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinien, die spezifisch IL-2 bzw. IL-12 sezernieren, über eine Zeitraum von 7 Tagen bis zu 2 Wochen in geeignetem Medium cokultiviert, so dass die NK-Zellen zu Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) werden, die, als Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen dem Patienten übertragen werden.
Als Zellkulturmedium wird beispielsweise RPMI-Medium verwendet, alternativ können auch andere Medien, die für die Kultivierung von Lymphozyten geeignet sind verwendet werden, z.B. DMEM oder Ham's F12.
Im Besonderen werden die vom Patienten, vorzugsweise Hund nach Standardprotokoll isolierten natürlichen Killerzellen zusammen mit der jeweiligen erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinien in einem Bioreaktor kultiviert. Solche Bioreaktoren sind beispielsweise aus der Herstellung monoklonaler Antikörper bekannt und weisen vorzugsweise zwei durch eine semipermeable Membran getrennte Kammern auf. Dabei befinden sich die Cytokin-produzierenden erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinien (IL-2 und/oder IL-12) in einer Kammer und die, aus dem Hund isolierten NK Zellen der anderen Kammer, so dass durch die Membran das sezernierte Interleukin frei diffundiert. Durch die kontinuierliche Interleukin Freisetzung werden die natürlichen Killerzellen in einen, dem in vivo ähnlichen Zustand der Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) versetzt und werden als Mittel zur Behandlung von malignen Tumoren eingesetzt. Anders als bei Injektion von rekombinantem Interleukin werden die NK-Zellen effizienter stimuliert. Nach der gewünschten Inkubationszeit (vorzugsweise 7 bis 21 Tage) werden die stimulierten NK Zellen dem Tumorpatienten infundiert.
Zusätzlich zu dem im Körper ähnlichem Vorgang der Stimulation, werden durch die kontinuierliche Bildung vom IL-2/IL-12 den NK-Zellen immer neue Cytokinmoleküle zur Verfügung gestellt und ein Absinken der Cytokinkonzentration vermieden. Dem Arzt ist es mit seinem Fachwissen möglich zu bestimmen, wie dem Patienten die 11-2 und/oder IL-12 Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) am besten zugeführt werden und welche Mengen an Zellen eingesetzt werden, so dass es therapeutisch bei der Behandlung maligner Tumore sinnvoll ist. Die Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) können dabei auch als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition oder als Prodrug verabreicht werden.
Der Begriff Patient bezieht sich erfindungsgemäß auf Menschen und Wirbeltiere. Damit kann die Erfindung in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Besonders geeignet ist die Anwendung am Hund.

Claims

Ansprüche
1. Zelllinie zur permanenten Freisetzung von Interleukin, dadurch gekennzeichnet dass es sich um BHK Tet-on Zellen handelt, die mit Nukleinsäuremolekülen, die Interleukin-kodierende Sequenzen enthalten transfiziert werden, so dass nach Induktion Interleukin freigesetzt wird.
2. Zelllinie gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass, die Interleukin- kodierenden Sequenzen für Interleukin 2 oder Interleukin 12 kodieren
3. Zelllinie gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet dass, die Zelllinie 5-50 ng Interleukin/ml Zellkulturüberstand freisetzt
4. Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass, das freigesetzte Interleukin im MTT Proliferationstest biologisch aktiv ist
5. Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass, das freigesetzte Interleukin im IFN-Gamma Test biologisch aktiv ist
6. Zelllinie gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass, sie mit natürlichen Killerzellen cokultiviert wird, so dass Lymphkin-aktivierte Killerzellen entstehen.
7. Verfahren zur Herstellung einer permanenten canines Interleukin freisetzenden Zelllinie nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass BHK Tet-on Zellen mit Nukleinsäuremolekülen, die Interleukin-kodierende Sequenzen enthalten transfiziert werden, so dass sie nach Induktion Interleukin freigesetzen
8. Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet dass, die Interleukin- kodierenden Sequenzen für Interleukin 2 oder Interleukin 12 kodieren
9. Verfahren gemäß Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet dass die für Interleukin 12 codierenden Sequenzen für ein Fusionsprotein bestehend aus p35 und p40 kodieren
10.Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet dass, die Induktion mit Doxycyclin erfolgt
11.Verwendung einer Zelllinie gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen
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