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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Expression
und permanenten Sekretion von caninen Interleukinen, speziell Interleukin-2
(cIL-2) oder Interleukin-12 (cIL-12) aus transfizierten BHK-Tet-on-Zellen.
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Diese
Zellen erzeugen permanent Interleukin-2 bzw. Interleukin-12 und
werden zur Herstellung eines Arzneimittels zur dauernden Stimulation
von Lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK) eingesetzt, welches
für die Anwendung in der Tumortherapie speziell beim Hund
geeignet ist.
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Stand der Technik
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Wegen
der mangelhaften Wirksamkeit der klassischen Tumortherapien bei
manchen Tumorpatienten (chirurgische Entfernung des Tumors, Strahlen-
und Chemotherapie) bei der vollständigen Entfernung von
Tumormetastasen und verbleibenden Tumorzellen bieten sich unterschiedliche
Komponenten des Immunsystems, die auch vom Körper selbst
gegen den Tumor eingesetzt werden, als eine Möglichkeit,
spezifisch und auf Einzelzellebene den Tumor zu bekämpfen.
Alle Ansätze, die die Komponenten des Immunsystems gegen Tumoren
ausnutzen, fallen unter die sogenannte Tumorimmuntherapie. Eine
der Ansatzmöglichkeiten der Tumorimmuntherapie ist die
Verwendung von cytotoxischen Lymphozyten (eine Subpopulation der
T-Zellen und der NK-Zellen), die mit Cytokinen, die ihre cytolytische
und anti-tumorale Wirkung verstärken, vorstimuliert und dem
Patient injiziert werden.
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Es
ist aus der Literatur und aus eigenen wissenschaftlichen Ergebnissen
beim Hund bekannt, dass Interleukin-2 und Interleukin-12 zahlreiche
anti-tumorale Effekte aufweisen, z. B. erhöhte cytolytische
Wirkung durch Moleküle, die Nekrose oder Apoptose bei den
Tumorzellen verursachen, und auch synergistisch mit T- und NK-Zellen
zusammenwirken. Daher sind Interleukin-2 und Interleukin-12 einzeln
oder in Kombination besonders gut zur Herstellung eines Medikamentes
zum Einsatz in der Tumortherapie geeignet.
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Vom
Stand der Technik ist aus
JP62032885 bekannt,
humanes Interleukin 2 in eukaryotischen Zellen herzustellen, wobei
das humane IL-2-Gen gemeinsam mit einem PVUII Fragment des bovinen
Papillomavirus exprimiert wird.
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Aus
CN 1373221 ist bekannt,
Interleukin 12 aus humanen Blutzellen rekombinant herzustellen.
CN 1347622 offenbart ein
Verfahren, humanes Interleukin-12 rekombinant in Insektenvirus-Stämmen
herzustellen.
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Nachteilig
ist daran, dass diese rekombinant erzeugten Interleukine zur Anwendung
am Patienten noch einmal in weiteren Schritten aufgereinigt werden
müssen, um frei von Virus- oder Bakterienzellen zu sein. Weiterhin
müssen sie extern den Tumorzellen bzw. dem Patienten zugeführt
werden, was zu an- und absteigenden Cytokinkonzentrationen führt.
Dies kann bei systemischer Gabe mit starken Nebenwirkungen für
den Patienten verbunden sein. Eine zielgerichtete, annähernd
gleiche und damit eher physiologische Zytokinkonzentration ist unbedingt
wünschenswert. Weitere Nachteile liegen in der Tatsache
begründet, dass es sich um humane Zytokine handelt. Da
die Therapie bei Hunden durchgeführt werden soll, sind
kanine Interleukine als allogene Proteine zu bevorzugen. Die Beteiligung
xenogener Proteine soll vermieden werden, um möglichst physiologische
Bedingungen zu erreichen.
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Zur
Tumortherapie am Hund offenbart
US
2007053873 ein Verfahren zur Präparation und Aktivierung von
caninen Lymphocyten in Gegenwart von anticaninen CD3-Antikörpern
und humanem Interleukin-2 (IL-2) sowie die Behandlung von Tumoren
bei Hunden. Nachteilig ist dabei, dass die Verwendung von CD3-Antikörpern
aufwendig ist und ebenfalls starke Nebenwirkungen durch die zusätzlichen
Antikörper nicht ausgeschlossen werden können.
Weiterhin werden hierbei CD3
+ Lymphozyten
(T-Lymphozyten) stimuliert, die zur Entfaltung ihrer Wirkung vorherigen
Antigen-Kontakt benötigen (erworbene Immunität).
Als Teil der angeborenen Immunantwort benötigen hingegen
Natürliche Killerzellen keinen vorherigen Antigenkontakt.
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Es
gibt derzeit keine stabil transfizierte Zelllinie, die als konstante
Quelle für Zytokine dient und die zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen am Hund eingesetzt
werden kann.
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Aufgabe
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, die im Stand der Technik beschriebenen
Nachteile zu beheben und Zelllinien zur permanenten Sekretion von
caninen Interleukinen bereitzustellen, die zur Herstellung eines
Mittels für die Tumortherapie geeignet sind.
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Lösung der Aufgabe
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Ansprüche
gelöst, durch BHK Tet-On-Zellen, die mit Nukleinsäuremolekülen,
die Interleukin-kodierende Sequenzen enthalten transfiziert werden,
so dass nach Induktion Interleukin freigesetzt wird. Im Besonderen
handelt es sich um BHK Tet-On-Zellen, die canines Interleukin-2
(cIL-2) bzw. canines Interleukin-12 (cIL-12) freisetzen und zur
Herstellung eines Mittels zur Tumortherapie geeignet sind.
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Die
permanent canines Interleukin freisetzende Zelllinie wird hergestellt
durch BHK Tet-on Zellen, die mit Nukleinsäuremolekülen,
die Interleukin-kodierende Sequenzen enthalten, transfiziert werden,
so dass sie nach Induktion Interleukin freigesetzen.
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Mit
den sezernierten Cytokinen 2 bzw. 12 werden in einem speziellen
Verfahren permanent Lymphokin-aktivierte Killerzellen generiert,
die in der Tumorimmuntherapie am Hund wirkungsvoll sind.
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Besondere Eigenschaften der
BHK-Tet-On Zelllinie
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Die
vorliegende Erfindung umfasst Zellen, vorzugsweise BHK-Zellen (Baby
Hamster Kidney Zellen), die mit den Gensequenzen für canines
Interleukin-2 (cIL-2) bzw. canines Interleukin-12 (cIL-12) im Tet-On-System
transfiziert sind und daraufhin nach Stimulation mit Doxycyclin
permanent canines Interleukin-2 (cIL-2) bzw. canines Interleukin-12
(cIL-12) freisetzen.
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Die
BHK-Zelllinien stammen vom Hamster ab und sind damit xenogen. Somit
ist gewährleistet, dass von diesen Zelllinien keine Hunde-spezifischen
Proteine sezerniert werden, die störend wären.
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In
der Zellkultur wird nach Transfektion der kodierenden Gene vorzugsweise
eine annähernd konstante Cytokinkonzentration von 5–50
ng Interleukin/ml Zellkulturüberstand an caninem Interleukin-2
(cIL-2) bzw. caninem Interleukin-12 (cIL-12) erreicht. Natürliche
Killerzellen beispielsweise aus einem Tumorpatienten isolierte Zellen
werden durch die Interleukine 2 und/oder 12 zu Lymphokinaktivierten
Killerzellen (LAK) aktiviert, und als Mittel zur Behandlung von
Tumorerkrankungen dem Patienten übertragen.
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Das
große Problem im Stand der Technik bei Behandlung von Tumorerkrankungen,
nämlich die Schwankungen in der Cytokinkonzentration durch
Injektion von rekombinantem Interleukin werden damit behoben. Es
ist ebenfalls damit zur rechnen, dass erheblich weniger Nebenwirkungen
am Patienten zu bemerken sind.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Herstellung der Lymphokinaktivierten
Killerzellen (LAK) aus isolierten Zellen von Tumorpatienten, vorzugsweise
Säugetieren besonders bevorzugt Hunde, durch permanente
Stimulation mit kaninem IL-2 bzw. IL-12 in vitro und damit die Herstellung
eines geeigneten Mittels zur adoptiven Tumorimmuntherapie.
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Ein
besonderer Vorteil der Erfindung ist es, dass der Patient bei der
Behandlung nicht mit gentechnisch veränderten Organismen
direkt in Kontakt kommt, da die Aktivierung der Lymphokin-aktivierten
Killerzellen durch transfizierte BHK-Tet-On-Zellen vorzugsweise
außerhalb des Patienten erfolgt.
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Ausführungsbeispiele
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1. Herstellung einer permanent canines
Interleukin (IL)-2 produzierenden Zelllinie nach Transfektion des
für canines IL-2 kodierenden Gens in die BHK–Tet-on-Zelllinie
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1.1. Klonierung von IL-2
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Für
die Klonierung des Plasmids pTRUE-IL2 wird cIL-2-mRNA aus Hundeblut-Lymphozyten
isoliert, wobei die Lymphozyten zuvor mit Concanavalin A stimuliert
werden. Die Aufreinigung der mRNA erfolgt nach einem dem Fachmann
bekannten Verfahren der sauren Guanidin-Isothiozyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion mit
TRIzol® Reagenz (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe) z. B. beschrieben in CHOMCZYNSKI (1987).
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Die
isolierte cIL-2-mRNA wird mit RT-PCR amplifiziert und in cDNA umgeschrieben.
Dazu wird beispielsweise das GeneAmp
® RNA
PCR Core Kit (Applied Biosystems) verwendet. Als Primer werden vorzugsweise
eingesetzt:
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Alternativ
wird die Sequenz des IL-2 durch Sequenzierung überprüft.
Dazu wird das amplifizierte PCR-Produkt nach Standardverfahren in
einen geeigneten Sequenziervektor z. B. mit Hilfe des TOPO TA Cloning® Kit in den pCR®II-TOPO®-Vektor (beides Invitrogen, Carlsbad,
USA) einkloniert und die korrekte Sequenz des einklonierten IL-2-Fragmentes
nach klassischen Standardmethoden überprüft.
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Das
Gen für cIL-2 wird in ein Tet-on-System eingebracht, vorzugsweise
in den Vektor pTRUE einkloniert, der einen Teil des Tet-on-Systems
darstellt.
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Der
kommerziell erhältliche pTRUE Vektor (Clontech) weist eine
erfindungsgemäße Modifikation aus, da die ursprünglich
vorhandene Multiple Cloning Site (MCS) von pTRUE durch die MCS des
ebenfalls kommerziell erhältlichen Plasmids pCITE (Novagene)
ausgetauscht wird. Die Verfahren zu dieser Klonierung sind dem Fachmann
geläufig und in gängigen Laborprotokollen offenbart.
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Mittels
PCR werden Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme
KpnI und MluI links und rechts flankierend an das cIL-2-Gen im Vektor
pTRUE mit der MCS des Plasmids pCITE eingeführt. Dazu werden vorzugsweise
als Primer verwendet:
Forward-Primer: 5' GGT ACC ATG TAC AAA
ATG CAA CTC TTG 3'
(der unterstrichene Bereich repräsentiert
die Restriktionsschnittstelle für KpnI)
und
Reverse-Primer:
5' ACG CGT CAA GTC AGT GTT GAG AAG ATG CTT TGA CAA AAG G 3'
(der
unterstrichene Bereich repräsentiert die Restriktionsschnittstelle
für MluI).
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Der
Vektor pTRUE mit der MCS des Plasmids pCITE wird mit den Restriktionsenzymen
KpnI und PstI geschnitten und das Reportergen Luciferase wird mit
den Restriktionsenzymen MluI und PstI geschnitten. In einer Dreifachligation
erfolgt der Zusammenschluss von drei Fragmenten zu Plasmid pTRUE-IL2
aus Reportergen Luciferase, dem Vektor pTRUE mit der MCS des Plasmids
pCITE und dem cIL-2-Gen.
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Seq.
ID 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz des cIL-2 Gens 1 zeigt
in einer schematischen Darstellung Plasmid pTRUE-IL2.
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Vorzugsweise
befindet sich unmittelbar vor dem Reportergen Luciferase eine Ribosomal
Entry Site (IRES), die die Translation von zwei einzelnen Proteinen
ermöglicht, nämlich cIL-2 und Luciferase.
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Das
so entstandene Plasmid pTRUE-IL2 (1) wird
nach Linearisierung in eine BHK-Zelllinie transfiziert, die bereits
das Plasmid pEF-Tet-on (1) stabil in ihr Genom integriert
hat. Die Selektion erfolgreich transfizierter Zellen erfolgt durch
die Resistenzgene für Puromycin und G418.
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Dem
Fachmann ist ersichtlich, dass das Reportergen Luciferase nur beispielhaft
verwendet wird und alternativ entweder durch weitere Reportergene
wie GFP u. a. ersetzt werden oder vollständig fehlen kann.
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Seq.
ID 1 zeigt in Fettschrift die Nukleinsäuresequenz des cIL-2
Genes, wobei die unterstrichenen Bereiche die Erkennungssequenzen
für die Restriktionsenzyme KpnI und MluI darstellen und
in Dünnschrift flankierende Vektorsequenzen angegeben sind. Seq.
ID 1
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1.2. Freisetzung von IL-2
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Die
BHK-Zellen, die mit den Gensequenzen für canines Interleukin-2
(cIL-2) im Tet-On-System transfiziert sind setzen nach Stimulation
mit Doxycyclin permanent canines Interleukin-2 (cIL-2) frei.
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Dazu
wird dem Zellkulturmedium Doxycyclin, ein Induktor des Tet-on-Expressionssystems,
zugegeben, um so die Expression der einklonierten Proteine cIL2
und des Reportergen Luciferase anzuschalten. Als Zellkulturmedium
wird beispielsweise RPMI-Medium verwendet, alternativ können
auch andere Medien, die für die Kultivierung von Lymphozyten
geeignet sind verwendet werden, z. B. DMEM oder Ham's F12.
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In
einem geeigneten Assay werden die Zellkulturüberstände
auf den Gehalt an biologisch aktivem cIL-2 überprüft.
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Dazu
werden IL-2-abhängige CTLL-2-Zellen (T Zell-Tumorlinie
der Maus), die sowohl bei Zugabe von humanem als auch caninem IL-2
proliferieren, den BHK-Überständen für
72 h ausgesetzt und deren Proliferation anschließend in
einem MTT-Proliferationstest nachgewiesen. Mitochondrien lebender
Zellen setzen MTT zu Formazankristallen um, deren Konzentration
nach Lösen der Kristalle photometrisch bestimmt werden kann.
Als Kontrolle und gleichzeitig als IL-2-Standard zur Ermittlung
der IL-2-Konzentration wird eine IL-2-Verdünnungsreihe
mit definierten rhIL-2 Konzentrationen (50 ng IL-2/ml – 0
ng IL-2/ml) hergestellt, in welcher ebenfalls CTLL-2-Zellen inkubiert
werden. Die CTLL-2-Zellen zeigen in den cIL-2-haltigen Überständen
der transfizierten BHK-Zellen deutliche Proliferation, wohingegen
BHK-Überstände sowohl nicht transfizierter als auch
nicht mit Doxycyclin induzierter Linien keine CTLL-2-Proliferation
hervorrufen. Das in den Zellkulturüberstand abgegebene
cIL-2 ist somit biologisch aktiv.
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2. Herstellung einer permanent canines
Interleukin (IL)-12 produzierenden Zelllinie nach Transfektion der
für canines IL-12 kodierenden Gene in die BHK–Tet-on-Zelllinie
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Die
Klonierung des Plasmids pTRUE-IL-12erfolgt, indem die cDNA Sequenzen
der für das IL-12 des Hundes kodierenden Gene p35 und p40
(Büttner M, et al., 1998, Cytokine 10 (4), 241-8)
in den pTRE Vektor gemeinsam so kloniert werden dass sie für
ein rescIL-12 Fusionsprotein (recombinant canine single chain) kodieren.
Der kommerziell erhältliche pTRUE Vektor (Clontech) weist
eine erfindungsgemäße Modifikation aus, da die
ursprünglich vorhandene Multiple Cloning Site (MCS) von
pTRUE durch die MCS des ebenfalls kommerziell erhältlichen
Plasmids pCITE (Novagene) ausgetauscht wird. Die Verfahren zu dieser
Klonierung sind dem Fachmann geläufig und in gängigen
Laborprotokollen offenbart.
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Zur
Klonierung werden die beiden Untereinheiten des caninen IL-12, p35
und p40, einzeln durch PCR amplifiziert. Vorzugsweise werden dazu
die folgenden Primer verwendet:
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Die
PCR-Amplifizierung erfolgt nach der dem Fachmann bekannten Technik
unter Verwendung der in Büttner M. et al. (1998,
Cytokine 10 (4), 241-8) offenbarten cDNA der Gene p35 und
p40 des Hundes. Die Besonderheit dabei ist, dass die beiden cDNAs
(für p35 und p40) nun zusammen in eine cDNA ligiert werden,
die für das ORF (open reading frame) eines Fusionsproteins
kodiert. Zwischen den beiden Sequenzen wird durch die dem Fachmann
bekannte „Primer Verlängerung" (primer extension)
eine Sequenz von 30 Nukleotiden eingebracht. Diese Sequenz kodiert
für 10 Aminosäuren des bovinen Elastins. Sie ermöglicht
eine normale und ungestörte Faltung der beiden Sequenzen,
so dass die Aktivität des Proteins gewährleistet
ist. 2 zeigt Plasmid pTRUE-IL-12.
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Seq.
ID 2 zeigt die Nukleinsäuresequenz von Plasmid pTRUE-IL-12,
es enthält die ersten 987 Nukleotide der p40 cDNA, dann
30 Nukleotide die für 10 Aminosäuren des bovinen
Elastin kodieren und anschließend die Nukleotide des p35
die für P35-Protein kodieren. Sequenzierung und Reinigung
der Amplifikate erfolgt nach Standardprotokoll.
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Anschließend
wird das Amplifikat der gemeinsame Sequenz (Seq. ID 2) in einen
kommerziell erhältlichen pTRE-Vektor zusammen mit der für
die Luciferase kodierenden cDNA kloniert. Für diese dreifache
Ligation werden die in der 2 entsprechend
aufgeführten Schnittstellen SacII, MluI und PstI benutzt.
Danach erfolgt nach Vorgaben des Herstellers die Transfektion des
rcscIL-12-pTRE/Luciferase Vectors durch Lipofektion in kommerziell
erhältliche BHK Baby Hamster Kidney Tet-On Zellen.
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Als
Selektionsmarker bei der Klonierung wird vorzugsweise Puromycin
verwendet. Als Zellkulturmedium wird beispielsweise RPMI-Medium
verwendet, alternativ können auch andere Medien, die für
die Kultivierung von Lymphozyten geeignet sind verwendet werden,
z. B. DMEM oder Ham's F12.
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Die
erfolgreich mit dem rescIL-12-pTRE/Luciferase Vektor (2)
transfizierten Zellen werden durch Luciferase-Assay überprüft
und durch Zugabe von Doxycyclin zum RPMI Medium induziert.
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Die
Doxycyclin-Zugabe bewirkt, dass das canine IL-12-Gen induziert und
nach der Induktion in den Kulturüberstand sezerniert wird.
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Seq.
ID 2 zeigt die Nukleinsäuresequenz des IL-12 Fusionsproteins.
Es beginnt mit P40 ohne Stopp-Codon, daran schließen sich
10 Aminosäuren des bovinen Elastins an, die durch einen
unterstrichenen Bereich hervorgehoben sind und diesem folgt die
Nukleinsäuresequenz des P35 Proteins ab der 26. Aminosäuren
(Start mit agg für Arginin). Das Fusionsprotein endet mit
dem Stopp-Codon des P35 Proteins taa. Seq.
ID 2
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Nachweis der Bioaktivität des
im Überstand erzeugten IL-12
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Die
Bestimmung der Bioaktivität des aus der erfindungsgemäßen
BHK Tet-On Zelllinie sezernierte IL-12 erfolgt beispielsweise über
die Messung von IFNgamma, da IFN-gamma nach der Stimulation von PMBCs
(Peripheral Blood Mononuclear Cells) mit dem IL-12 erst spezifisch
gebildet wird und dies über einen caninen IFN-gamma spezifischen
ELISA (R&D Systems)
gemessen und mit einer Standardkontrolle verglichen wird.
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Die
PBMCs werden dazu einmal mit dem Überstand der IL-12 freisetzenden
erfindungsgemäßen Zelllinie inkubiert und zusätzlich
mit IL-12 aus dem Standard. Die Ergbnisse zeigen, dass das aus der
erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinie sezernierte
IL-12 die gleiche Wirkung aufweist und die Bildung von IFN-gamma auslöst,
wie IL-12 aus der Standardlösung.
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Die
Messung der Menge an freigesetztem IL-12 erfolgt, indem die PMBCs
zusätzlich mit 1 μg/ml eines anti-canines IL-12
Antikörper (R&D
Systems) inkubiert werden. Dabei zeigt sich, dass die Menge an freigesetztem
IL-12 stark erhöht ist.
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3. Herstellung von Lymphokin-aktivierten
Killerzellen und Verwendung der Lymphokin-aktivierten Killerzellen zur
Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Tumoren beim Hund.
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Natürliche
Killerzellen (NK-Zellen) gehören zu den Lymphozyten und
sind in der Lage abnormale Zellen, wie Tumorzellen über
spezifische Rezeptoren zu erkennen und zu eliminieren. Die Aktivität
der natürlichen Killerzellen wird durch Cytokine z. B.
IL-2 und 1112, die in vivo von Makrophagen abgegeben werden, aktiviert. Nach
der Aktivierung produzieren sie große Mengen an Interferon-Gamma
(IFN-gamma).
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Der
Einsatz von bereits in vitro durch Interleukin aktivierten Lymphokin-aktivierten
Killerzellen (LAK) stellt einen großen Fortschritt in der
Tumortherapie von Patienten (Säugetieren, vor allem Hunden)
dar.
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Dazu
werden die natürlichen Killerzellen aus einem Tumorpatienten
isoliert und mit den erfindungsgemäßen BHK Tet-On
Zelllinien, die spezifisch IL-2 bzw. IL-12 sezernieren, über
eine Zeitraum von 7 Tagen bis zu 2 Wochen in geeignetem Medium cokultiviert,
so dass die NK-Zellen zu Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK)
werden, die, als Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen dem
Patienten übertragen werden.
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Als
Zellkulturmedium wird beispielsweise RPMI-Medium verwendet, alternativ
können auch andere Medien, die für die Kultivierung
von Lymphozyten geeignet sind verwendet werden, z. B. DMEM oder
Ham's F12.
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Im
Besonderen werden die vom Patienten, vorzugsweise Hund nach Standardprotokoll
isolierten natürlichen Killerzellen zusammen mit der jeweiligen
erfindungsgemäßen BHK Tet-On Zelllinien in einem
Bioreaktor kultiviert. Solche Bioreaktoren sind beispielsweise aus
der Herstellung monoklonaler Antikörper bekannt und weisen
vorzugsweise zwei durch eine semipermeable Membran getrennte Kammern
auf. Dabei befinden sich die Cytokin-produzierenden erfindungsgemäßen
BHK Tet-On Zelllinien (IL-2 und/oder IL-12) in einer Kammer und
die, aus dem Hund isolierten NK Zellen der anderen Kammer, so dass
durch die Membran das sezernierte Interleukin frei diffundiert.
Durch die kontinuierliche Interleukin Freisetzung werden die natürlichen
Killerzellen in einen, dem in vivo ähnlichen Zustand der
Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) versetzt und werden als
Mittel zur Behandlung von malignen Tumoren eingesetzt. Anders als
bei Injektion von rekombinantem Interleukin werden die NK-Zellen
effizienter stimuliert. Nach der gewünschten Inkubationszeit
(vorzugsweise 7 bis 21 Tage) werden die stimulierten NK Zellen dem
Tumorpatienten infundiert. der in vivo-Situation oder beigeben die
Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK), Zusätzlich zu
dem im Körper ähnlichem Vorgang der Stimulation,
werden durch die kontinuierliche Bildung vom IL-2/IL-12 den NK-Zellen
immer neue Cytokinmoleküle zur Verfügung gestellt
und ein Absinken der Zytokinkonzentration vermieden.
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Dem
Arzt ist es mit seinem Fachwissen möglich zu bestimmen,
wie dem Patienten die II-2 und/oder IL-12 Lymphokin-aktivierten
Killerzellen (LAK) am besten zugeführt werden und welche
Mengen an Zellen eingesetzt werden, so dass es therapeutisch bei
der Behandlung maligner Tumore sinnvoll ist.
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Die
Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) können dabei auch
als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition oder als Prodrug
verabreicht werden.
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Der
Begriff Patient bezieht sich erfindungsgemäß auf
Menschen und Wirbeltiere. Damit kann die Erfindung in der Human-
und Veterinärmedizin verwendet werden. Besonders geeignet
ist die Anwendung am Hund. SEQUENCE
LISTING
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - JP 62032885 [0005]
- - CN 1373221 [0006]
- - CN 1347622 [0006]
- - US 2007053873 [0008]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Büttner
M, et al., 1998, Cytokine 10 (4), 241-8 [0036]
- - Büttner M. et al. (1998, Cytokine 10 (4), 241-8) [0038]
