EP2152311A1 - Ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto- immune ou d'une maladie infectieuse - Google Patents

Ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto- immune ou d'une maladie infectieuse

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EP2152311A1
EP2152311A1 EP08805512A EP08805512A EP2152311A1 EP 2152311 A1 EP2152311 A1 EP 2152311A1 EP 08805512 A EP08805512 A EP 08805512A EP 08805512 A EP08805512 A EP 08805512A EP 2152311 A1 EP2152311 A1 EP 2152311A1
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EP
European Patent Office
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antibody
cell
autoimmune
disease
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08805512A
Other languages
German (de)
English (en)
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Christophe De Romeuf
Nathalie Fournier
Nadine Fernandez
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LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
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Publication date
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates generally to a treatment of a malignant pathology, an autoimmune disease, or an infectious disease, in particular via an effector cell that expresses a Fc ⁇ R receptor on its surface.
  • the tissues or organs most commonly affected by autoimmune disease are hematopoietic cells, blood vessels, connective tissues, endocrine glands, muscles, joints, and skin.
  • Autoimmune diseases are often associated with chronic inflammatory conditions. The most common case is rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis, which are two types of inflammatory arthritis.
  • Arthritis is a general term for inflammation of the joints. Most treatments have many side effects or do not completely prevent the progression of the disease.
  • B cells are the cells producing the autoantibodies often responsible for the development of autoimmune diseases, their destruction by administration of a monoclonal antibody specific for this cell type can only be beneficial for patients, as has been demonstrated for rituximab which has just been approved for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • infectious diseases are a persistent and significant problem in modern medicine.
  • the most common disease, the common cold is an infectious disease in the same way as AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome), the most feared disease. It has been proven that some neurological disorders classified as degenerative diseases were actually related to an infection. Infectious diseases will remain a major medical problem in the future.
  • monoclonal antibodies can have two complementary roles: a role of neutralization of the pathogen or toxins secreted during the acute phase of infection and a role in the destruction of reservoir cells during the passage to chronicity.
  • the destruction of the host cells allowing the low-noise duplication of the pathogen could prevent the transition to a chronic phase, most often leading to the development of serious pathologies such as autoimmune disease or cancer.
  • Today despite the existence of a real need, there is virtually no effective anti-infective treatment in the treatment of chronic phases.
  • the beneficial effects of small molecules (antibiotics, antiparasitic, anti-viral) during the acute phases of infections are increasingly compromised by the development of cross-resistance.
  • the appearance of multidrug-resistant bacteria poses a public health problem with 6% to 7% of hospitalizations complicated by nosocomial infection more or less serious, approximately
  • the cells resistant to a particular agent administered in the current protocol are unfortunately also resistant to other drugs, including those acting by a mechanism different from that used by the agent administered in the treatment protocol.
  • This phenomenon known as multidrug resistance, is often at the root of the therapeutic failure of standard chemotherapy protocols.
  • Chronic lymphocytic leukemia B (CLB-B), a disease characterized by malignant proliferation of B-lymphocytes (BBCs), is the most common form of leukemia.
  • the current treatment is essentially based on therapeutic abstention for the early stages of the disease.
  • patients are classically treated with corticosteroids alone or association with anti-mitotic molecules.
  • resistance to treatment is established in the more or less long term. It usually results in the failure of the therapeutic effort with the appearance of chemo-resistant cells.
  • Chemotherapy is responsible for major side effects including myelotoxicity generating an immune deficiency responsible for the appearance of serious infections, sometimes fatal, in patients.
  • Several therapeutic approaches aimed at destroying tumor B cells as specifically as possible have been evaluated.
  • the specific expression of the CD20 molecule by tumor LB (and normal) allowed the development of therapies based on the use of human anti-CD20 monoclonal antibodies.
  • rituximab (Rituxan, Genentech and Mabthera, Roche)
  • rituximab is currently available on the market. It is indicated for the treatment of patients with stage III-IV follicular lymphoma and in combination with chemotherapy for the treatment of patients with diffuse aggressive large B-cell CD20-positive non-Hodgkin's lymphoma (NHL).
  • NEL non-Hodgkin's lymphoma
  • Rituximab has also been evaluated in patients with B-CLL. Since this antibody was only weakly effective when used as monotherapy, it is currently being administered in combination with chemotherapy.
  • ⁇ .tuximab In order to increase the efficacy of ⁇ .tuximab, its association with macrophages activated ex vivo in the presence of ⁇ -interferon (IFN- ⁇ ) was evaluated in vitro in a test of CL-B primary cell lysis ( Lefebvre ML, Stefan W Krause, Salcedo M, Nardin Ex vivo activated hunnan macrophages kill chromium lymphocytic leukemia cells presence of Rituximab: Mechanism of antibody-dependent cellular cytotoxicity and impact of human serum. J.
  • CL-B primary cell lysis Lefebvre ML, Stefan W Krause, Salcedo M, Nardin Ex vivo activated hunnan macrophages kill chromium lymphocytic leukemia cells presence of Rituximab: Mechanism of antibody-dependent cellular cytotoxicity and impact of human serum.
  • This inhibition is related to the competition by the polyclonal immunoglobulins present in the serum with respect to the binding of the rituximab-LLC complex to the different RFCs expressed on the surface of the macrophages.
  • the intensity of this inhibition depends on the concentrations of rituximab and the ratio of effector cells: target cells
  • the cell expressing CD16 on its surface is chosen from monocytes expressing CD16, macrophages and dendritic cells.
  • the cell derived from monocyte or monocyte precursor, which expresses CD16 on its surface is a macrophage.
  • the monoclonal antibody is not displaced by the polyclonal immunoglobulins, particularly those present in the serum, this because of the high affinity of the Fc region of said monoclonal antibody for CD16.
  • the monoclonal antibody binds CD16 of said monocyte derived cell or a monocyte precursor with a higher affinity than 2.10 6 M "1.
  • the monoclonal antibody is directed against an antigen selected from the antigen 5C5 (tumor antigen expressed by renal cell carcinoma cells), the BCR (B CeIl Receptor), an idiotype such as that inhibitory anti-FVIIl antibodies, the antigen 5C5 (tumor antigen expressed by renal cell carcinoma cells), the BCR (B CeIl Receptor), an idiotype such as that inhibitory anti-FVIIl antibodies, the antigen 5C5 (tumor antigen expressed by renal cell carcinoma cells), the BCR (B CeIl Receptor), an idiotype such as that inhibitory anti-FVIIl antibodies, the antigen 5C5 (tumor antigen expressed by renal cell carcinoma cells), the BCR (B CeIl Receptor), an idiotype such as that inhibitory anti-FVIIl antibodies, the antigen 5C5 (tumor antigen expressed by renal cell carcinoma cells), the BCR (B CeIl Receptor), an idiotype such as that inhibitory anti-FVIIl antibodies,
  • TCR T CeII Receptor
  • the monoclonal antibody is directed against CD20.
  • the anti-CD20 antibody is produced by the cell line R509 deposited at the CNCM on November 8, 2004 under the accession number 1-3314, or by the cell line R603 deposited. at the CNCM on November 29, 2005 under the accession number I-3529 (CNCM: National Collection of Cultures of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15 - France).
  • the set of means of the invention is intended for use in therapy simultaneously, sequentially or separately.
  • the monoclonal antibody induces cytotoxicity by ADCC activity or by phagocytosis of said target cell of the antibody in the presence of an effector cell expressing CD16.
  • Another object of the invention relates to the use of the set of means of the invention for the manufacture of a medicament.
  • the malignant pathology is selected from solid tumors and malignant hemopathies.
  • the solid tumors are selected from melanomas, carcinomas, sarcomas, gliomas and cutaneous cancers.
  • the carcinomas are selected from the group consisting of carcinomas of the kidney, breast, oral cavity, lungs, gastrointestinal tract, ovaries, prostate, uterus, bladder, carcinoma. pancreas, liver, gallbladder, skin and testes.
  • Another subject of the invention relates to the use of the set of means of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of a primary or secondary autoimmune and / or inflammatory disease, specific for organs or systemic and associated or not with pathogenic autoantibodies.
  • Another object of the invention relates to the use of the set of means of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of an infectious disease.
  • the combination of means of the invention is a drug combination containing, as active substance, an effector cell which expresses CD16 on its surface and a monoclonal antibody in which the affinity of the Fc region of this monoclonal antibody for CD16 is greater than the affinity of the Fc region of polyclonal immunoglobulins for CD16 for simultaneous, separate or sequential use in the treatment of malignancies, autoimmune diseases, or infectious diseases.
  • the set of means of the invention may also be in the form of a mixture.
  • Such cells are thus capable of inducing ADCC activity in the presence of the monoclonal antibodies of the invention, due to the binding between the Fc region of the monoclonal antibodies and the CD16 receptor expressed by the cell.
  • the effector cell is a macrophage.
  • this culture step may advantageously be preceded by a separation step, on the one hand, of the mononuclear cells, and, on the other hand, red blood cells, granulocytes and a part of the platelets contained in the composition derived from blood obtained by cytapheresis, and by a step of removing, by washing, a portion of blood platelets and anticoagulants remaining after the previous step.
  • any other method for obtaining macrophages, leading to the expression of CD16 on their surface is also applicable to the invention.
  • the terms “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” refer to a preparation of antibody molecules derived from a cell clone and having identical and unique specificity.
  • variable parts The region that determines the specificity of the antibody for the antigen is carried by the variable parts, while the constant parts can interact with the Fc receptors of effector cells or molecules such as complement proteins to induce different functional properties.
  • the antibody according to the invention is a chimeric, humanized or human antibody.
  • the antibody according to the invention is chimeric.
  • the chimeric antibodies according to the invention can be produced by co-transfection or simple transfection into a host cell of the light chain expression vector and the heavy chain or single vector expression vector using a well known method. of the skilled person (by for example, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, microinjection, etc.).
  • variable domain sequence of a murine antibody is compared to a library of known human variable region sequences and the human variable sequence closest to the raurin sequence is retained as a FR region.
  • Framework of the humanized antibody [Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24): 10029-33 (1989); Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993)].
  • humanized antibodies according to the invention are preferred for use in in vitro diagnostic methods, or in vivo prophylactic and / or therapeutic treatment.
  • the monoclonal antibodies of the invention may be produced by an isolated cell, for example selected from SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, Namalwa human myeloma, PERC6, CHO lines, especially CHO-KI, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil -2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653, this list not being limiting.
  • an isolated cell for example selected from SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, Namalwa human myeloma, PERC6, CHO lines, especially CHO-KI, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil -2
  • the monoclonal antibody of the invention is produced by the transgenic animal in its milk.
  • the gene coding for the protein of interest is associated with regulatory elements of genes specifically expressed in milk (for example the WAP gene promoter, whey acidic protein).
  • the expression vector thus obtained is microinjected under a microscope into mammalian embryos at the unicellular stage. Embryos are then transferred to recipient females. For example, after one month of gestation, the first mammals that have integrated the transgene (FO) into their genome are born and are identified by PCR analysis of ear biopsy. They will serve as founders to give birth to the second generation of transgenic mammals. The founders are selected for their efficiency in producing the protein of interest in their milk and for generating the second generation of transgenic rabbits (F1).
  • the CD16 receptor is traditionally referred to as a "low affinity receptor", and is expressed constitutionally on PMNs (polymorphonuclear neutrophils), a subpopulation of monocytes, macrophages, dendritic cells and Natural Killer cells (NK cells).
  • PMNs polymorphonuclear neutrophils
  • NK cells Natural Killer cells
  • CD16 participates in multiple effector functions, such as phagocytosis, opsonization of immune particles or complexes, and ADCC activity.
  • the monoclonal antibody of the set of means of the invention has a Fc region having a high affinity for Fc receptors present on the effector cells of the invention, and in particular for CD16.
  • the invention describes the synergism between the Fc region of the monoclonal antibodies of the invention and the CD16 of the effector cells of the set of means. This affinity is such that the addition of human polyvalent plasma IgG (important constituent of peripheral blood) in the medium containing antibodies and effector cells has little or no influence on the ADCC activity generated by the association. between the monoclonal antibody and the effector cells. This is because the affinity of the Fc region of the monoclonal antibody for CD16 is greater than that of human IgG present under physiological conditions.
  • polyvalent immunoglobulins also called polyvalent plasma IgG or polyclonal IgG or serum IgG.
  • the monoclonal antibody of the set of means induces activation of the effector cells via the Fc receptors including CD16 and CD64 leading to cell lysis by ADCC or phagocytosis. It is now generally accepted that polyvalent plasma IgGs inhibit the mechanism of lysis of effector cells via CD64, the latter being saturated in the presence of polyvalent IgGs.
  • the monoclonal antibody is not displaced by the polyvalent IgGs in the case of the addition of human plasma IgG. Due to the high affinity of the Fc region of the antibody for CD16, the monoclonal antibody binds the effector cells, and this binding is not displaced by human polyvalent plasma IgG even at high serum concentrations. Accordingly, the set of means of the invention allows optimal lysis of the target cells even at low concentrations of the monoclonal antibody.
  • the concentration of the monoclonal antibody of the set of means is less than the concentration of an antibody of the same specificity, traditionally used as monotherapy, for the treatment of malignant diseases, autoimmune or infectious diseases.
  • the Fc region of the monoclonal antibody of the invention has a CD16 association constant of at least 2.10 6 M -1 .
  • association constant of the antibody of the invention is measured according to the method described in FIG. Maenaka et al. (Katsumi Maeneka, P. Anton van der Merwe, David I. Stuart, E. Yvonne Jones, and Peter Sondermann, The Human Low Affinity Fc7 receptors IIa, Hb and III Bind IgG with Fast Kinetics and Distinct Thermodynamic Properties, J. Biol. Chem., Vol 276, Issue 48, 44898-44904, November 30, 2001).
  • the monoclonal antibody of the invention may be prepared using the method described in patent application WO 01/77181.
  • This process for the preparation of a monoclonal antibody capable of activating the effector cells expressing CD16 comprises the following steps: a) purification of monoclonal antibodies obtained from different clones originating from cell lines selected from hybridomas, in particular hetero-hybridomas and animal or human cell lines transfected with a vector comprising the gene coding for said antibody; b) adding each antibody obtained in step a) to a separate reaction mixture comprising: i. the target cells of said antibodies, ii. effector cells comprising cells expressing Fc ⁇ RIII, iii. polyvalent IgG, c) determination of the percentage of lysis of the target cells and selection of the monoclonal antibodies which activate the effector cells causing significant lysis of the target cells (Fc ⁇ RIII dependent ADCC activity).
  • the monoclonal antibody composition is produced by a cell having a low enzymatic activity allowing the addition of fucose to N-acetylglucosamine of the reducing end, such an enzyme being preferably the fucosyltransferase.
  • an enzyme for example fucosidase, so to obtain a composition of monoclonal antibodies comprising such a fucose level.
  • the monoclonal antibody composition is produced in YB2 / 0 (ATCC CRL-1662).
  • the effector cells are administered at a dose of between 10 4 and 10 9 effector cells per injection.
  • the effector cells are administered repeatedly up to 10 times, the time interval between each administration being between 2 days and 12 months.
  • the monoclonal antibody is administered repeatedly up to 10 times, the time interval between each administration being between 2 days and 12 months.
  • the monoclonal antibody and the effector cells are administered simultaneously.
  • the macrophages are incubated with varying concentrations (0 to 83 ⁇ g / ml) of anti-CD20 antibodies (EMAB6, EMAB603 or rituximab) and anti-CD16 3G8 antibody coupled to a fluorochrome (3G8-PE) at a fixed concentration.
  • EMAB6, EMAB603 or rituximab anti-CD20 antibodies
  • 3G8-PE fluorochrome
  • the binding of the 3G8-PE antibody to the CD16 receptor of the macrophages is evaluated by flow cytometry.
  • Antibodies with the ability to bind to CD16 compete with the binding of the 3G8 antibody and, therefore, induce a decrease in the MFI (Mean Fluorescence Intensity or Mean Fluorescence Intensity).
  • MFI mean Fluorescence Intensity or Mean Fluorescence Intensity
  • Example 4 Activity ADCC anti-D / Rh + red blood cells / macrophages. Role of polyvalent IVIg (Tegeline). The cytotoxic capacity of the anti-D antibodies is studied by the ADCC technique. Anti-D antibodies, macrophages
  • the two anti-D antibodies, EMABling R297 and AD1 have an ADCC activity of the order of 29%.
  • the EMABling antibody appears at least 20 times more active (23% lysis per 1% with AD1). This advantage persists at higher concentrations of polyvalent immunoglobulins (25 mg / ml), the respective percentages of lysis for the EMABling antibody and AD1 being 16 and 1%.
  • the percentage of doubly labeled macrophages PKH67 / PKH26 increases in the absence of IVIg for the two antibodies tested, R297 EMABling and AD1. In the presence of IVIg, only the EMABling antibody has the capacity to phagocyte red blood cells
  • PKH67 / PKH26 increases in the absence of IVIg for the two antibodies tested, R603 anti-CD20 and Rituxan.
  • the EMABling antibody has a higher capacity, of the order of

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Abstract

Ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto-immune ou d'une maladie infectieuse, comprenant une cellule effectrice qui exprime le récepteur FcγRIII (CD16) à sa surface, et un anticorps monoclonal, l'affinité de la région Fc dudit anticorps monoclonal pour le CD16 étant supérieure à l'affinité de la région Fc des immunoglobulines polyclonales pour CD16.

Description

ENSEMBLE DE MOYENS POUR LE TRAITEMENT D'UNE PATHOLOGIE MALIGNE, D'UNE MALADIE AUTO-IMMUNE OU D'UNE MALADIE
INFECTIEUSE
La présente invention se rapporte de manière générale à un traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto- immune, ou d'une maladie infectieuse, notamment par le biais d'une cellule effectrice qui exprime un récepteur FcγR à sa surface.
INTRODUCTION ET ART ANTERIEUR
De plus en plus utilisés en recherche, les anticorps constituent également des outils de choix en diagnostic et en thérapeutique, où ils représentent une alternative aux traitements conventionnels.
De nombreuses préparations d'anticorps à usage thérapeutique, d'origine plasmatique ou issue des biotechnologies, sont actuellement sur le marché, ou en phase de développement clinique. Leurs propriétés sont exploitées pour obtenir des outils thérapeutiques capables de se lier de manière spécifique à leur cible, et de recruter de manière efficace les cellules du système immunitaire.
Ces dernières années, la recherche s'est orientée sur l'amélioration de l'efficacité des anticorps, et, plus particulièrement, vers la manipulation de leur région constante Fc. C'est cette dernière qui est responsable des propriétés « effectrices » des anticorps, car elle permet la mobilisation des cellules effectrices du système immunitaire et des protéines du complément. Cette faculté est rendue possible par la présence, sur certaines cellules effectrices, de glycoprotéines i.e. les récepteurs Fc (RFc). Ces récepteurs sont capables de lier la région constante des anticorps, une fois que ces derniers se sont fixés, par leur région variable, sur l'antigène cible. La liaison de la région Fc des anticorps sur les RFc portés par les cellules effectrices induit chez ces dernières l'activation de mécanismes cytotoxiques comme la phagocytose et l 'ADCC (cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ou Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) . Lors d'une maladie auto-immune, le système immunitaire, dont le rôle naturel est de protéger l'organisme des agressions, provoque une réponse inflammatoire en l'absence de corps étranger et ainsi induit lui-même des lésions tissulaires en attaquant "par erreur" les molécules du soi . Il existe différentes pathologies auto-immunes qui affectent différents tissus ou différentes fonctions du corps. Par exemple, le cerveau est atteint chez les personnes souffrant de sclérose en plaques, les intestins sont la cible chez les patients atteints de la maladie de Crohn et la synovie, les os et les cartilages sont touchés chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde. Lors du développement de la maladie auto-immune, il peut se produire plusieurs phénomènes comme la destruction progressive d'un ou plusieurs types de tissus, la croissance anormale d'un organe ou des modifications de la ou des fonctions de l'organe atteint. Les tissus ou organes les plus souvent atteints lors d'une maladie auto-immune sont les cellules hématopoïétiques, les vaisseaux sanguins, les tissus connectifs, les glandes endocrines, les muscles, les articulations et la peau. Les maladies auto-immunes sont souvent associées à une pathologie inflammatoire chronique. Le cas le plus fréquent est représenté par la polyarthrite rhumatoïde et l'arthrite rhumatoïde juvénile qui sont deux types d'arthrite inflammatoire. L'arthrite est un terme général qui désigne l'inflammation des articulations. La plupart des traitements présentent de nombreux effets secondaires ou ne préviennent pas complètement la progression de la maladie. Actuellement, il n'existe pas de traitement idéal et aucun ne permet de guérir les patients, ce qui génère un besoin évident pour de nouvelles thérapies plus efficaces et surtout curatives.
Les lymphocytes B (LB) étant les cellules productrices des auto-anticorps souvent responsables du développement de maladies auto-immunes, leur destruction par administration d'un anticorps monoclonal spécifique de ce type cellulaire ne peut être que bénéfique pour les patients, comme cela a été démontré pour le rituximab qui vient d'être approuvé pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde .
Par ailleurs, malgré les progrès considérables réalisés dans l'amélioration des conditions sanitaires, en immunisation et dans les thérapies anti -microbiennes, les maladies infectieuses représentent un problème persistant et significatif de la médecine moderne. La maladie la plus répandue, le simple rhume est une maladie infectieuse au même titre que le SIDA (Syndrome d ' immunodéficience acquise), maladie la plus redoutée. Il a été prouvé que certains désordres neurologiques classés comme maladies dégénératives étaient en fait liés à une infection. Les maladies infectieuses resteront dans le futur un problème médical majeur .
Lors d'une maladie infectieuse, les anticorps monoclonaux peuvent avoir deux rôles complémentaires: un rôle de neutralisation de l'agent pathogène ou des toxines sécrétées lors de la phase aiguë de l'infection et un rôle dans la destruction des cellules réservoirs lors du passage à la chronicité. La destruction des cellules de l'hôte permettant la duplication à bas bruit de l'agent pathogène pourrait permettre de prévenir le passage à une phase chronique aboutissant le plus souvent au développement de pathologies graves comme une maladie auto-immune ou un cancer. De nos jours, malgré l'existence d'un réel besoin, il n'existe quasiment pas de traitement anti-infectieux efficaces dans le traitement des phases chroniques. D'autre part, les effets bénéfiques des petites molécules (antibiotiques, antiparasitaires, anti-viraux) lors des phases aiguës des infections sont de plus en plus compromis par le développement de résistance croisée. Ainsi l'apparition de bactéries multi- résistantes aux antibiotiques pose un problème de santé publique avec 6% à 7% des hospitalisations compliquées par une infection nosocomiale plus ou moins grave, soit environ
750 000 cas sur les 15 millions d'hospitalisations annuelles
(http://www.senat.fr/rap/r05-42l/r05-4211.htmltttocl3) . Au total, les infections nosocomiales seraient donc en cause pour 9 000 décès par an, dont 4 200 concernent des patients pour lesquels le pronostic vital n'était pas engagé à court terme à leur entrée à l'hôpital (http://www.senat.fr/rap/rO5-42l/rO5-
4213.html) . Ainsi, il apparaît nécessaire de développer des médicaments innovants qui offriront une alternative thérapeutique aux médecins et à leurs patients.
Une tumeur correspond à une masse néoplasique résultant de la prolifération incontrôlée de cellules qui peut être bénigne ou maligne. Les tumeurs bénignes restent généralement localisées. Les tumeurs malignes sont appelées collectivement cancers. Le terme "malin" signifie en général que la tumeur est capable d'envahir et détruire les structures adjacentes et de diffuser vers des sites distants provoquant à terme la mort du patient (Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122) . Un cancer peut survenir dans de nombreuses localisations différentes et se comporter différemment en fonction de son origine tissulaire. Actuellement, les moyens de traitement des cancers sont la chirurgie, la chimiothérapie, la thérapie hormonale et/ou l'irradiation pour éradiquer les cellules tumorales présentes chez le patient (Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, Eds . , Chapter 12) . Tous ces traitements présentent des inconvénients majeurs. Par exemple, malgré la disponibilité d'une grande variété de molécules chimiques, la chimiothérapie induit de nombreux effets secondaires comme les nausées sévères, l'aplasie médullaire, 1 ' immunosuppression, etc. La gravité de certains de ces effets oblige parfois le médecin à arrêter le traitement. De plus, malgré l'administration d'une combinaison de plusieurs molécules chimiques, la plupart des cellules tumorales sont résistantes ou développent une résistance aux agents de chimiothérapie. De fait, les cellules résistantes à un agent particulier administré dans le protocole en cours, sont malheureusement aussi résistantes à d'autres drogues, y compris celles agissant par un mécanisme différent de celui utilisé par l'agent administré dans le protocole de traitement. Ce phénomène, connu sous le nom de résistance multidrogues, est souvent à l'origine de l'échec thérapeutique des protocoles standards de chimiothérapie.
II existe donc un réel besoin pour des thérapies anticancéreuses innovantes en particulier pour le traitement des cancers réfractaires aux traitements classiques tels que la chirurgie, l'irradiation, la chimiothérapie ou la thérapie hormonale . Une alternative prometteuse est l'immunothérapie, dans laquelle les cellules tumorales sont spécifiquement ciblées par les anticorps spécifiques des antigènes tumoraux. Des efforts majeurs ont été réalisés afin d'exploiter la spécificité de la réponse immune, par exemple la technologie des hybridomes a permis le développement des anticorps monoclonaux spécifiques d'antigènes exprimés par les cellules tumorales (Green M. C. et al., 2000 Cancer Treat Rev. , 26: 269-286; Weiner L M, 1999 Semin Oncol . 26(suppl. 14):43-51).
La destruction des cellules délétères de l'hôte ou des agents pathogènes correspond au mécanisme recherché d'efficacité des anticorps monoclonaux quelle que soit la pathologie ciblée. Il est donc critique que ces anticorps soient améliorés de façon à interagir de manière optimale avec les cellules effectrices du système immunitaire du patient.
La leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) , maladie caractérisée par une prolifération maligne des lymphocytes B (LB), est la forme de leucémie la plus fréquente. Le traitement actuel est essentiellement basé sur l'abstention thérapeutique pour les stades précoces de la maladie. En cas de symptomatologie clinique ou hématologique, les patients sont classiquement traités par des corticoïdes seuls ou en association avec des molécules anti-mitotiques . Chez la plupart des patients, une résistance au traitement s'installe à plus ou moins long terme. Elle aboutit généralement à l'échec de l'effort thérapeutique avec apparition de cellules chimio-résistantes . La chimiothérapie est responsable d'effets secondaires majeurs avec notamment une myélotoxicité générant un déficit immunitaire responsable de l'apparition d'infections graves, parfois mortelles, chez les patients. Plusieurs approches thérapeutiques visant à détruire le plus spécifiquement possible les cellules B tumorales ont été évaluées. L'expression spécifique de la molécule CD20 par les LB tumoraux (et normaux) a permis le développement de thérapies basées sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-CD20 humain.
Un seul anticorps monoclonal anti-CD20 non radiomarqué, le rituximab (Rituxan , Genentech et Mabthéra , Roche) , est actuellement disponible sur le marché. Il est indiqué pour le traitement de patients atteints de lymphomes folliculaires de stade III-IV et en association à une chimiothérapie pour le traitement des patients présentant un lymphomes non-hodgkinien (NHL) agressif diffus à grandes cellules B, CD20 positives. Son efficacité restant variable et souvent modeste lorsqu'il est utilisé comme agent unique (Teeling et al. 2004, Blood 104 (6) :1793-800) , il est le plus souvent utilisé en association à de la chimiothérapie.
Le rituximab a aussi été évalué chez les patients atteints de LLC-B. Cet anticorps n'ayant présenté qu'une efficacité faible lorsqu'il était utilisé en monothérapie, il est actuellement administré en association avec la chimiothérapie.
Plusieurs raisons peuvent expliquer l'échec de la monothérapie par le rituximab chez les patients atteints de LLC-B: d'une part, le rituximab induit in vitro une faible activité ADCC sur des cellules B, d'autre part, contrairement aux LB normaux et dans les NHL, les LB de LLC-B n'expriment que peu de molécules CD20 à leur surface (densité environ 5 fois inférieure, mesure quantitative par cytométrie en flux), limitant ainsi la quantité d'anticorps à la surface cellulaire et ainsi les fonctions cytotoxiques associées (ADCC et activité complément notamment) .
Il est donc de première importance de mettre au point des thérapies alternatives parmi lesquelles des anticorps spécifiques de l'antigène CD20 et capables d'induire efficacement la lyse des cellules tumorales, y compris celles exprimant faiblement l'antigène.
Les macrophages, cellules effectrices de l'immunité innée, jouent un rôle majeur dans les réponses anti-tumorales . Naturellement présents sous une forme inactivée (en l'absence de toute pathologie) , ils peuvent être activés m vivo ou in vitro par différentes voies comme l'ingestion de pathogènes ou la liaison aux récepteurs exprimés en surface de complexes immuns (liaison aux RFc via la région Fc des anticorps) ou de cytokmes, molécules immuno-modulatrices produites notamment lors d'un phénomène inflammatoire L ' activation induit chez les macrophages une activité lytique, et donc anti- tumorale, accrue (Adams D. and Hamilton T.: Activation of macrophages for tumor cell kill effector mechanism and régulation In Heppner & Fulton (Eds) , Macrophages and cancer. CRC Press, 1988, p. 27, Fidler I - Macrophages and métastases. A biological approach to cancer therapy. Cancer Res, 45: 4714, 1985) De plus, les macrophages, ou autres cellules dérivées des monocytes ou de leurs précurseurs, sont des cellules présentatrices d'antigènes. De par leur importante capacité d ' endocytose, de digestion et de présentation aux lymphocytes T des peptides antigéniques associés aux molécules du complexe majeur d ' histocompatibilité (CMH), ils sont capables d'induire une réponse immune spécifique
Dans le but d'accroître l'efficacité du πtuximab, son association avec des macrophages activés ex vivo en présence d ' mterféron-γ (IFN- γ) a été évaluée m vitro dans un test de lyse de cellules primaires de LLC-B (Lefebvre ML, Stefan W Krause, Salcedo M, Nardin A Ex vivo activated hunnan macrophages kill chrome lymphocytic leukemia cells m the présence of Rituximab: mechanistn of antibody-dépendent cellular cytotoxicity and impact of human sérum. J.
Imraunother; vol. 29, n°4 : 388-397, 2006). Les résultats indiquent que la lyse importante des cellules de LLC-B par les macrophages activés en présence de rituximab est fortement inhibée par des concentrations croissantes de sérum humain.
Cette inhibition est liée à la compétition par les immunoglobulines polyclonales présentes dans le sérum vis à vis de la liaison du complexe rituximab-cellule LLC aux différents RFc exprimés à la surface des macrophages.
L'intensité de cette inhibition dépend des concentrations de rituximab et du ratio cellules effectrices : cellules cibles
(Effector rTarget ou E:T) utilisés.
En dépit de l'existence de nombreux outils thérapeutiques pour le traitement des cancers, des maladies auto-immunes, ou des maladies infectieuses, il existe encore un grand besoin de nouveaux produits d'immunothérapie, faisant preuve d'une meilleure efficacité et d'une meilleure sécurisation que les produits existants.
RESUME DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto-immune ou d'une maladie infectieuse, comprenant une cellule effectrice qui exprime le récepteur FcγRIII (CD16) à sa surface, et un anticorps monoclonal, dans lequel l'affinité de la région Fc dudit anticorps monoclonal pour le CD16 est supérieure à l'affinité de la région Fc des immunoglobulines polyclonales pour le CDl6.
Avantageusement, la cellule effectrice qui exprime le récepteur FcγRIII (CD16) à sa surface est un monocyte ou une cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte qui exprime le récepteur FC7RIII (CD16) à sa surface.
Avantageusement, cette cellule est choisie parmi les monocytes exprimant le CD16, les macrophages, les cellules Natural Killer (NK), les cellules dendritiques et l'ensemble des cellules mononucléées du sang périphérique (Peripheral Blood Mononuclear CeIl ou PBMC) .
Avantageusement, la cellule exprimant le CD16 à sa surface est choisie parmi les monocytes exprimant le CD16, les macrophages et les cellules dendritiques.
Plus particulièrement, la cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte, qui exprime le CDl6 à sa surface, est un macrophage . Avantageusement, l'anticorps monoclonal n'est pas déplacé par les immunoglobulines polyclonales, particulièrement celles présentes dans le sérum, ceci en raison de l'affinité élevée de la région Fc dudit anticorps monoclonal pour le CD16.
Avantageusement, l'anticorps monoclonal lie le CD16 de ladite cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte avec une affinité supérieure à 2.106 M"1.
D'une manière particulièrement avantageuse, l'anticorps monoclonal est produit sous forme d'une composition d'anticorps monoclonaux, dans laquelle chaque anticorps possède des chaînes de sucre liées en N au site de glycosylation Fcγ (asparagine 297, selon Kabat ) , et dans laquelle parmi toutes les chaînes de sucre liées en N audit site de glycosylation de tous les anticorps de ladite composition, le taux de fucose est inférieur à 65%.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'anticorps monoclonal est dirigé contre un antigène choisi parmi l'antigène 5C5 (antigène tumoral exprimé par les cellules des carcinomes rénaux) , le BCR (B CeIl Receptor) , un idiotype comme celui des anticorps inhibiteurs anti-FVIIl, le
TCR (T CeIl Receptor), CD2 , CD3 , CD4 , CD8 , CD14, CD15, CD19,
CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD45, CD30, CD33, CD37, CD38,
CD40, CD40L, CD46, CD52 , CD54 , CD66 (a,b,c, d) , CD74, CD80,
CD86, CD126, CD138, CD154, MUCl (Mucine 1), MUC2 Mucine 2), MUC3 (Mucine 3), MUC4 (Mucine 4), MUC16 (Mucine 16), la HMl.24
(antigène spécifique des plasmocytes sur-exprimé dans les myélomes multiples) , tenascin (protéine de la matrice extra- cellulaire) , GGT (gamma-glutamyltranspeptidase) , VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) , EGFR (Endothelial Growth Factor receptor) , CEA (carcinoembryonic antigen) , CSAp (colon- specific antigen-p) , ILGF (Insulin-Like Growth factor) , placental growth factor, Her2/neu, anhydrase carbonique IX, IL-6, les protéines SlOO (famille multigénique de protéines se liant au calcium) , MART-I (antigène tumoral de différentiation associé au mélanome) , TRP-I (tyrosinase related protein 1), TRP-2 (tyrosinase related protein 2) , gplOO (glycoprotéine 100 kDa) , les protéines amyloïdes, l'antigène rhésus D, les molécules du CMH de classe I et II comme HLA-DR) , un antigène résultant de l'expression de gènes mutés notamment des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur, un antigène dérivé de virus oncogènes exprimés par certaines tumeurs bien définies, un antigène ubiquitaire surexprimé dans certaines tumeurs et faiblement exprimés dans certains tissus normaux comme par exemple le récepteur de type II de l'hormone Mûllérienne , une protéine glycosylée ou pas, un phospholipide , une molécule du soi ou du non soi exprimée ou exposée à la membrane par les cellules infectées comme la phosphatidylsérine , et une protéine exprimée ou sécrétée par un agent pathogène (toxine bactérienne, les protéines complexes de la paroi bactérienne ou parasitaire, les glycoprotéines d'enveloppe virale, par exemple de virus HIV, HBV, HCV et RSV, etc.).
Préférentiellement , l'anticorps monoclonal est dirigé contre le CD20.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'anticorps anti-CD20 est produit par la lignée cellulaire R509 déposée à la CNCM le 8 Novembre 2004 sous le numéro d'accession 1-3314, ou par la lignée cellulaire R603, déposée à la CNCM le 29 Novembre 2005 sous le numéro d'accession I- 3529 (CNCM: Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 - France) . Avantageusement, l'ensemble de moyens de l'invention est destiné à une utilisation en thérapie de manière simultanée, séquentielle ou séparée.
Avantageusement, dans l'ensemble de moyens de l'invention, la cellule effectrice exprimant le CD16 à sa surface a une activité cytotoxique sur la cellule cible dudit anticorps favorisée par l'interaction de l'anticorps avec le CDl6.
Avantageusement, dans l'ensemble de moyens de l'invention, l'anticorps monoclonal induit une cytotoxicité par activité ADCC ou par phagocytose de ladite cellule cible de l'anticorps en présence d'une cellule effectrice exprimant le CD16.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique contenant l'ensemble de moyens selon l'invention, et des excipients pharmaceutiquement acceptables.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie maligne .
Avantageusement, la pathologie maligne est choisie parmi les tumeurs solides et les hémopathies malignes. Avantageusement, les tumeurs solides sont sélectionnées parmi les mélanomes, les carcinomes, les sarcomes, les gliomes et les cancers cutanés. Avantageusement, les carcinomes sont sélectionnés dans le groupe constitué par les carcinomes du rein, du sein, de la cavité orale, des poumons, du tractus gastro-intestinal, des ovaires, de la prostate, de l'utérus, de la vessie, du pancréas, du foie, de la vésicule biliaire, de la peau et des testicules. Avantageusement, les hémopathies malignes sont sélectionnées parmi les syndromes lymphoprolifératifs, myéloprolifératifs, myélodysplasiques et les leucémies myéloîdes aiguës avec, par exemple, les lymphomes non- hodgkiniens de type B, les leucémies B lymphoïdes aiguës ou chroniques, le lymphome de Burkitt, la leucémie à tricholeucocytes, les leucémies myéloîdes aiguës et chroniques, les lymphomes et les leucémies T, lymphomes
Hodgkiniens, la macroglobulinémie de Waldenstrôm et les myélomes multiples.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie auto- immune et/ou inflammatoire primitive ou secondaire, spécifique d'organes ou systémiques et associée ou non à des autoanticorps pathogènes.
Avantageusement, la maladie auto-immune et/ou inflammatoire est choisie parmi le rejet de greffe d'organes, la maladie du greffon contre l'hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, la sclérodermie, le syndrome de Sjôgren primitif (ou Syndrome de Gougerot-Sjôgren) , les polyneuropathies auto-immunes comme la- sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto-immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l'arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite d'Hashimoto, la maladie d'Addison, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow, la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associés aux ANCA (anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles) , les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l'adulte et de l'enfant, telles que les thrombopénies auto- immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto- immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN) , la maladie des agglutinines froides, le purpura thrombotique thrombocytopénique et l'hémophilie acquise auto-immune; le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées huileuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l'arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les affections systémiques auto-immunes de l'enfant incluant le syndrome des antiphospholipides .
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie infectieuse .
Avantageusement, la maladie infectieuse est choisie parmi celles induites par les virus (virus de 1 ' immunodéficience humaine ou VIH, virus de l'hépatite B ou C (HBV, HCV), virus Epstein-Barr ou EBV, cytomégalovirus ou CMV, les entérovirus, la grippe avec les virus Influenza A, B et C, le virus respiratoire syncytial ou VRS, Human T cell Lymphotropic Virus ou HTLV), les bactéries et/ou leurs toxines (tétanos, diphtérie, pneumocoques, méningocoques , staphylocoques y compris les formes méthiciline résistantes, les Klebsielles, les Shigelles, les pseudomonas aeruginosa, les entérobactéries ou les pathologies résistantes aux antibiotiques dont les maladies nosocomiales) , les parasites (paludisme, leishmanioses, trypanosomiases) ainsi que les maladies émergentes par exemple le Chikungunya, la grippe aviaire, le virus du syndrome respiratoire aigu sévère ou SRAS, les virus responsables de fièvres hémorragiques comme Ebola ou Dengue ou le virus du Nil occidental, et celles reliées au bio- terrorisme comme le Charbon, le Botulisme, la Peste, la Variole et poxvirus, la Tularémie, les Agents des fièvres hémorragiques, la Brucellose, les Entérotoxines B du Staphylocoque, la Toxine diphtérique ou les Encéphalites virales . DESCRIPTION DETAILLEE
Ensemble de moyens
Le terme « ensemble de moyens » désigne une association médicamenteuse dont les constituants élémentaires forment une unité fonctionnelle du fait de leur indication commune. Ici, le terme ensemble de moyens représente en fait un « kit of parts ».
Plus spécifiquement, l'ensemble de moyen de l'invention est une association médicamenteuse contenant, comme substance active, une cellule effectrice qui exprime le CD16 à sa surface et un anticorps monoclonal dans lequel l'affinité de la région Fc de cet anticorps monoclonal pour le CD16 est plus grande que l'affinité de la région Fc des immunoglobulines polyclonales pour le CD16, pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle, dans le traitement de pathologies malignes, de maladies auto-immunes, ou de maladies infectieuses .
L'anticorps monoclonal et la cellule effectrice, qui exprime le CD16 à sa surface, forment ensemble une composition sous forme « d'ensemble de moyens » unitaire, dont les constituants sont disponibles pour une application simultanée, ou séparée, ou étalée dans le temps. L'ensemble de moyens de l'invention peut également se présenter sous forme de mélange.
L'anticorps monoclonal et la cellule effectrice qui exprime le CD16 forment une unité fonctionnelle du fait d'un nouvel effet commun et donc d'une indication commune.
Cellule effectrice qui exprime le récepteur FcγRIII (CDlβ) à sa surface On entend par "cellule effectrice qui exprime le récepteur
CD16 à sa surface" toute cellule capable d'activité effectrice
(en particulier une activité cytotoxique par ADCC, phagocytose, ou dans un autre domaine des propriétés de présentation antigénique et de réponse humorale) suite à l'activation cellulaire induite par la liaison au récepteur membranaire FcγRIII ou CD16 d'un complexe immun formé par l'association d'un anticorps avec l'antigène dont il est spécifique. Ces cellules expriment nécessairement le CD16 à leur surface.
Avantageusement, une telle cellule peut être une cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte qui exprime le CDl6 à sa surface, un monocyte CDl6+ , un macrophage, une cellule dendritique, cette liste n'étant pas limitative.
Ainsi, cette liste peut également s'étendre aux cellules Natural Killer (NK) et aux PBMC (Peripheral Blood Mononuclear CeIl) . On entend par « cellules NK » de grands lymphocytes granuleux capables d'une activité cytotoxique spontanée sans immunisation antérieure. On entend par « PBMC » toute cellule mononucléée du sang périphérique (monocytes et lymphocytes) , et qui exprime le CD16 à sa surface.
De telles cellules sont ainsi capables d'induire une activité ADCC en présence des anticorps monoclonaux de l'invention, en raison de la liaison entre la région Fc des anticorps monoclonaux et le récepteur CD16 exprimé par la cellule . Préférentiellement , la cellule effectrice est un macrophage .
Le monocyte CD16+ (c'est-à-dire exprimant le CD16 à sa surface) est une sous population de monocyte exprimant le CD16 à la surface de sa membrane. Les monocytes CD16+ sont capables de phagocyter et d'induire une activité ADCC.
Le macrophage est l'un des acteurs principaux de l'immunité innée et participe à l'immunité adaptative. Il est issu de la différenciation des monocytes.
A titre d'exemple, des macrophages peuvent être dérivés à partir d'une suspension cellulaire fortement enrichie en monocytes comprenant une étape de culture dans un milieu de culture approprié (milieu RPMI pour Roswell Park Mémorial Institute) contenant du M-CSF (Monocyte-Colony Stimulating Factor) ou du GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) pour induire la différentiation des monocytes en macrophages. Ces derniers peuvent être générés, par exemple, en six- sept jours de culture.
Il est également possible d'obtenir des macrophages à partir d'une composition enrichie en cellules sanguines obtenue par cytaphérèse réalisée sur un individu sain, et en effectuant une étape de culture de monocytes dans un milieu de culture contenant du M-CSF (Monocyte Colony Stimulating
Factor) ou du GM-CSF (Granulocytes Macrophages Colony Stimulating Factor) .
Optionnellement , cette étape de culture peut avantageusement être précédée par une étape de séparation, d'une part, des cellules mononucléaires, et, d'autre part, des globules rouges, granulocytes et d'une partie des plaquettes contenus dans la composition dérivée du sang obtenue par cytaphérèse, et par une étape d'élimination, par lavage, d'une partie des plaquettes sanguines et des anticoagulants restant après l'étape précédente.
L'étape d'enrichissement de la suspension cellulaire en monocytes susmentionnée est généralement réalisée par centrifugation du milieu contenant les monocytes sur un gradient de densité, notamment sur une solution ayant une densité d'environ 1,0 à environ 1,3 g/ml, telle qu'une solution du type Ficoll Paque (Pharmacia) ayant une densité de 1, 077 g/ml .
Optionnellement, une composition contenant des macrophages, et/ou des cellules dendritiques, et/ou des cellules NK peut être obtenue en partant d'une composition dérivée du sang d'origine humaine, et enrichie en cellules sanguines, et, plus particulièrement, en globules blancs tels que les monocytes, ou en précurseurs de ces derniers, notamment d'une composition dérivée du sang telle qu'obtenue par cytaphérèse, ledit procédé comprend les étapes suivantes:
• Avantageusement, une dilution de ladite composition dérivée du sang, notamment dans environ 2 à 3 fois le volume de cette dernière, à l'aide d'une solution physiologique appropriée, • une étape de lavage de ladite composition dérivée du sang, avantageusement par centrifugation simple et lavage du culot issu de la centrifugation susmentionnée, après récupération du culot dans une solution physiologique de lavage appropriée, notamment dans une poche (du type poche de transfert) , en effectuant par exemple une pression sur ladite poche, la solution de lavage étant alors éliminée vers une autre poche ou autre récipient, pour récupérer une composition dépourvue d'éventuels anticoagulants et de résidus divers et appauvrie en plaquettes,
• le cas échéant répétition de l'opération de lavage susmentionnée, notamment entre 1 et 2 fois,
• une étape de culture des cellules contenues dans la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage susmentionnée, en plaçant celle-ci dans un milieu de culture approprié, notamment dans une poche avantageusement hydrophobe, pendant environ 6 à environ 10 jours (notamment d'environ 6 à 7 jours) , cette étape de culture étant:
• précédée par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les monocytes, ou leurs précurseurs, susceptibles d'être présents dans la composition de départ, notamment des plaquettes, des globules rouges, des granulocytes et des lymphocytes, par mise en contact de la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de lavage précédant l'étape de culture, avec des anticorps dirigés contre tout ou partie des constituants susmentionnés, et récupération de la solution contenant les monocytes, ou leurs précurseurs, tout ou partie des constituants susmentionnés restant fixés aux anticorps, et/ou suivie par une étape d'élimination de tout ou partie des constituants autres que les macrophages par mise en contact de la composition dérivée du sang obtenue après l'étape de culture avec les anticorps tels que décrits ci-dessus, et récupération de la solution contenant les macrophages, tout ou partie des constituants susmentionnés restant fixés aux anticorps,
• et/ou suivie par une étape de purification, notamment par élutriation, dans laquelle les macrophages sont séparés des autres constituants de la composition obtenue après l'étape de culture, notamment des plaquettes, des globules rouges et des lymphocytes, par voie physique.
D'une façon plus générale, tout autre procédé d'obtention de macrophages, conduisant à l'expression du CD16 à leur surface est également applicable à l'invention.
De plus, on doit entendre par « macrophage » au sens de la présente invention toute cellule obtenue à partir de monocytes et différenciés selon un protocole bien déterminé, conduisant à des cellules exprimant les marqueurs membranaires suivants: CD14+, CD16+, CD32+, CD64+, CDlIb+. En particulier, le pourcentage de cellules CD16+ est d'au moins 20%, préférentiellement 50%, ou 70% ou compris entre 70 et 100%.
Anticorps monoclonaux
Aux fins de l'invention, les expressions « anticorps monoclonal » ou « composition d'anticorps monoclonal » se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps issue d'un clone cellulaire et possédant une spécificité identique et unique.
Une molécule d' immunoglobuline est composée de 4 polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy) identiques de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light) identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère est composée de 2 domaines, un domaine variable V et un domaine constant C, repliés indépendamment l'un de l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH et 3 ou 4 domaines C noté de CHl à CH4. Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure également.
La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, alors que les parties constantes peuvent interagir avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des molécules comme les protéines du complément pour induire différentes propriétés fonctionnelles .
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et légères, on constate que la variabilité de séquence n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les régions variables sont constituées d'une part de régions très peu variables nommées « charpente » ou « framework » (FR) au nombre de 4 (FR
1 à FR4 ) et d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité est extrême: il s'agit des régions
« hypervariables », ou CDR (pour régions de détermination de complémentarité ou Complementarity Determining Régions) , au nombre de 3 (CDRl à CDR3) .
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle, l'anticorps selon l'invention est chimérique.
On entend par « anticorps chimérique » un anticorps dont les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente des régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention possède en outre des régions variables murines, ou de rat, ou de lapin, ou de singe, ou de chèvre, ou humaine et des régions constantes appartenant à une espèce différente de l'espèce où a été produit l'anticorps. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier/ 1 ' homme , le singe, les muridés, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. De manière encore préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l ' immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type a. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(I), Km(I, 2), Km(I, 2, 3) ou Km (3) .
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type λ.
Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type γl , de type γ2 , de type γ3 , ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type γ4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG) , sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHl, CH2 et CH3 ) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CHi et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcγR et le CIq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires Cy2 et Cγ3j est glycosylée au niveau du domaine Cy2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à 1 ' asparagine 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γl , car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) chez le plus grand nombre d'individus (humains) . A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Glm(3), GIm (1, 2, 17), GIm(I, 17) ou GIm(I, 3).
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l 'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps chimériques décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A., 81: 6851-55 (1984), où la technologie de l 'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. De tels anticorps et leur mode de préparation ont également été décrits dans la publication brevet EP 173 494, dans le document Neuberger, M. S. et al., Nature 1985 Mar 21-27; 314 (6008) :268-70., ainsi que dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour générer des anticorps chimériques sont largement disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les chaînes lourdes et légères de l'anticorps peuvent être exprimées séparément en utilisant un vecteur pour chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul vecteur.
Un vecteur d'expression est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et/ou la séquence d'acide nucléique, de préférence humaine, codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation) à cette expression. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lee1, CH0-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr- , Wil-2, Jurkat, Vero, MoIt -4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Pour la construction de vecteurs d'expression des anticorps chimériques selon l'invention, des séquences signal synthétiques et des sites de restriction appropriés peuvent être fusionnés aux régions variables au cours des réactions d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction). Les régions variables sont ensuite combinées avec les régions constantes d'un anticorps, de manière préférentielle une IgGl humaine. Les gènes ainsi construits sont clones sous le contrôle d'un promoteur (par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site de polyadénylation, en utilisant soit deux vecteurs séparés (un pour chaque chaîne) soit un vecteur unique. Le ou les vecteurs sont également munis de gènes de sélection connus de l'homme du métier, tels que par exemple le gène dhfr, le gène de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être produits par co-transfection ou transfection simple dans une cellule hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du vecteur d'expression de la chaîne lourde ou du vecteur unique en utilisant une méthode bien connue de l'homme du métier (par exemple la co-précipitation au phosphate de calcium, 1 ' électroporation, la micro-injection, etc.).
Par anticorps humanisé, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de CDR (« CDR-grafting ») bien connues de l'homme du métier (brevet US 5,225,539, US 6,180,370; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5. (1986); Verhoeyen et al., Bioessays
8(2): 74-8 (1988); Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988);
Queen C. et al., Proc . Natl. Acad. Sci . U S A 86 (24) : 10029-33
(1989); Lewis A. P. and Crowe J. S., Gène 101 (2) :297-302 (1991);
Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res . 19(9):2471-6 (1991); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 (1992); Singer et al., J. Immunol . 150 (7): 2844-57 (1993); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). Le choix des domaines variables humains à greffer pour la production d'anticorps humanisés est important afin de réduire 1 ' immunogénicité de l'anticorps sans altérer son affinité pour sa cible. Dans une méthode de production d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine variable d'un anticorps murin est comparée à une banque de séquences de régions variables humaines connues et la séquence variable humaine la plus proche de la séquence raurine est retenue comme région FR (« framework ») de l'anticorps humanisé [Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24) :10029-33 (1989); Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993)] . Une autre méthode de sélection des régions FR humaines est la comparaison de la séquence de chaque sous- région de la séquence FR murine (FRl, FR2 , FR3 et FR4 ) avec une banque de séquences FR humaines connues, afin de choisir, pour chaque région FR, la séquence FR humaine la plus proche de la séquence murine [publication brevet US 2003/0040606; Singer et al., J. Immunol. 150 (7): 2844-57 (1993); Sato K. et al, Mol. Immunol. 31(5):371-81 (1994); Leung S. O. et al . , Mol. Immunol. 32 ( 17-18) : 1413 -27 (1995)]. Une autre méthode utilise une région FR particulière dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde ou légère [Sato K. et al, Mol. Iraraunol . 31(5):371-81 (1994)]. La greffe de CDR est complétée dans la majorité des cas par la mutation de certains résidus clés localisés dans les FR humains afin de conserver une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa cible [Holmes M.A. and Foote J., J. Immunol . 158 (5) : 2192-201 (1997)].
Les anticorps humanisés selon 1 ' invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par l'organisme humain, et au moins aussi efficace que l'anticorps d'origine.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé est 2 fois plus cytotoxique que l'anticorps natif correspondant. De manière encore plus avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé est 10 fois, ou encore 100 fois ou de manière préférée plus de 500 fois plus cytotoxique que l'anticorps natif correspondant.
Par anticorps humain, on entend désigner un anticorps dont chaque région est dérivée d'un anticorps humain. Ces anticorps peuvent être dérivés de souris transgéniques portant des gènes d'anticorps humains, ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol . Oct ; 6 (5) : 561-6 (1995); Lonberg N. and D. Huszar. Internai Review of Immunology 13 :65-93 (1995); Tomizuka K. et al., Proc . Natl . Acad, Sci . USA 97(2): 722-727
(2000) ] .
De manière préférée, les anticorps chimériques, humanisés ou humains de l'invention sont produits au moyen des techniques de l'ADN recombinant connues de l'homme du métier.
De manière préférée, les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être produits par une cellule isolée, par exemple choisie parmi SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO- Lecl, CH0-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr- , Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653, cette liste n'étant pas limitative.
Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent également être produits au moyen d'un animal transgénique. La transgénèse est une technique de génétique moléculaire par laquelle de I1ADN exogène est introduit dans le génome d'un organisme multicellulaire et est transmis à la descendance de ce dernier. Cette transmission à la descendance impose l'intégration stable dudit ADN dans le génome de l'embryon et ceci à un stade précoce de développement . Par exemple, une des techniques de transgénèse susceptible d'être utilisée dans le cadre de l'invention consiste en la micro-injection d'ADN nu dans le pronucléus d'un ovocyte de mammifère fécondé ou dans des cellules souches embryonnaires dites, laquelle conduit, dans un certain nombre de cas, à l'intégration d'une partie des molécules d'ADN microinjectées dans le génome de l'hôte. D'autres techniques sont utilisables pour la transgénèse, et notamment les techniques d'introduction d'ADN exogène dans une cellule vivante qui sont bien connues de l'homme du métier, notamment 1 ' électroporation, la transfection à l'aide de précipités de phosphate de calcium, de liposomes ou de lipides modifiés tels que la lipofectamine® (IN VITROGEN) .
D'une manière préférentielle, l'anticorps monoclonal de l'invention est produit par l'animal transgénique dans son lait. A ce titre, le gène codant pour la protéine d'intérêt est associé à des éléments régulateurs de gènes exprimés spécifiquement dans le lait (par exemple le promoteur du gène WAP, whey acidic protein) . Le vecteur d'expression ainsi obtenu est micro- injecté sous microscope dans des embryons de mammifère au stade unicellulaires . Les embryons sont ensuite transférés dans des femelles receveuses. Par exemple, après un mois de gestation, les premiers mammifères ayant intégré le transgène (FO) dans leur génome naissent et sont identifiés par analyse PCR de biopsie d'oreille. Ils serviront de fondateurs pour donner naissance à la deuxième génération de mammifères transgéniques. Les fondateurs sont sélectionnés pour leur efficacité à produire la protéine d'intérêt dans leur lait et pour générer la seconde génération de lapins transgéniques (Fl) .
La descendance Fl est identifiée par biopsie de l'oreille suivie d'analyse par PCR. Les femelles Fl matures sexuellement sont alors inséminées avec du sperme de mâle non transgénique. Le lait est récolté mécaniquement et la protéine recombinante est caractérisée afin de sélectionner la meilleure lignée pour la production à grande échelle et pour développer la stratégie de purification (GLP, pré-GMP, GMP) .
En parallèle, le sperme de mâles transgéniques Fl - Master Sperm Bank, MSB - est récolté et cryo-conservé dans de l'azote liquide, suivant les recommandations de la FDA et des instances européennes. Ce sperme sera utilisé pour inséminer artificiellement des femelles non-transgéniques pour générer la seconde descendance (F2) . Le sperme de mâles transgéniques F2 - Working SpermBank, WSB - est récolté et servira, pendant 15-20 ans, à la génération de femelles transgéniques F3 qui produiront les quantités industrielles de l'anticorps monoclonal dans leur lait. Une telle technique est décrite par exemple dans le brevet EP 0 527 063.
Fc gamma récepteurs
Le CD16, appelé également Fc gamma récepteur de type III (FcγRIII) , est un récepteur présent sur de nombreuses cellules du système immunitaire. Avec les CD32 (FcγRII) et CD64 (FcγRI), le CD16 est un récepteur spécifique des fragments constants (Fc) des chaînes lourdes des anticorps IgG. La liaison d'un complexe immun, via le Fc des IgG, à ces récepteurs CDl6, CD32 et CD64 présent sur les cellules effectrices du système immunitaire déclenche l'activation de ces dernières et notamment la phagocytose du complexe immun. Les cellules effectrices de l'invention expriment sur leur membrane cellulaire 3 types de récepteurs Fc: CD64 , CD32 et CDl6. Le récepteur CD16 est appelé traditionnellement "récepteur de faible affinité" , et est exprimé de manière constitutionnelle sur les PMNs (polymorphonuclear neutrophils) , une sous-population de monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules Natural Killer (cellules NK) . Le CD16 participe à de multiples fonctions effectrices, par exemple la phagocytose, l ' opsonisation de particules ou de complexes immuns , et l'activité ADCC.
L'anticorps monoclonal de l'ensemble de moyens de l'invention possède une région Fc présentant une forte affinité pour les récepteurs Fc présents sur les cellules effectrices de l'invention, et en particulier pour le CD16. L' invention décrit la synergie entre la région Fc des anticorps monoclonaux de l'invention et le CD16 des cellules effectrices de l'ensemble de moyens. Cette affinité est telle que l'addition d' IgG plasmatiques polyvalentes humaine (constituant important du sang périphérique) dans le milieu contenant des anticorps et des cellules effectrices n'a pas ou peu d'influence sur l'activité ADCC générée par l'association entre l'anticorps monoclonal et les cellules effectrices . Ceci est dû au fait que l'affinité de la région Fc de l'anticorps monoclonal pour le CD16 est supérieure à celle des IgG humaines présentes dans des conditions physiologiques. En conséquence, l'activité ADCC observée in vitro ne sera pas diminuée in vivo suite à l'absence de déplacement de l'anticorps d'intérêt par les IgG sériques . En effet, le plasma et le sérum contiennent de fortes concentrations d' immunoglobulines polyvalentes (également appelées IgG plasmatiques polyvalentes ou IgG polyclonales ou IgG sériques) . L'anticorps monoclonal de l'ensemble de moyens induit l'activation des cellules effectrices via les récepteurs Fc dont le CD16 et le CD64 conduisant à la lyse cellulaire par ADCC ou phagocytose. Il est maintenant communément admis que les IgG plasmatiques polyvalentes inhibent le mécanisme de lyse des cellules effectrices via le CD64, ce dernier étant saturé en présence d' IgG polyvalentes.
Le Demandeur a montré que, de manière surprenante, l'association dans un ensemble de moyens d'un anticorps monoclonal dont la région Fc présente une affinité pour le CD16 supérieure à celle des IgG isolées à partir de fractions plasmatiques, induit une activité ADCC qui n'est pas inhibée par l'addition IgG plasmatiques in vitro, ce qui permet donc d'envisager une conservation de l'activité thérapeutique in vivo. Cette activité thérapeutique in vivo correspond à la lyse des cellules tumorales, des cellules infectées par des agents pathogènes ou des cellules productrices d'auto- anticorps .
Ainsi, de manière avantageuse, l'anticorps monoclonal n'est pas déplacé par les IgG polyvalentes dans le cas de l'addition d' IgG plasmatiques humaines. En raison de la forte affinité de la région Fc de l'anticorps pour le CD16, l'anticorps monoclonal lie les cellules effectrices, et cette liaison n'est pas déplacée par les IgG plasmatiques polyvalentes humaines, même à de fortes concentrations en sérum. En conséquence, l'ensemble de moyens de l'invention permet une lyse optimale des cellules cibles même à de faibles concentrations de l'anticorps monoclonal.
Avantageusement, la concentration de l'anticorps monoclonal de l'ensemble de moyens est inférieure à la concentration d'un anticorps de même spécificité, utilisé traditionnellement en monothérapie, pour le traitement de pathologies malignes, de maladies auto-immunes ou infectieuses.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la région Fc de l'anticorps monoclonal de l'invention possède une constante d'association au CD16 d'au moins 2.106 M"1.
Avantageusement, la constante d'association de l'anticorps de l'invention est mesurée selon la méthode décrite dans le document Maenaka et al. (Katsumi Maeneka, P. Anton van der Merwe, David I. Stuart, E. Yvonne Jones, and Peter Sondermann; The Human Low Affinity Fc7 receptors lia, Hb and III Bind IgG with Fast Kinetics and Distinct Thermodynamic Properties. J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 48, 44898-44904, November 30, 2001) .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la concentration en anticorps monoclonal dans l'ensemble de moyens est préférentiellement inférieure à 1 mg/200 millions de cellules.
L'utilisation de l'invention, ci dessus nommée ensemble de moyens, est envisagée dans des pathologies ou après injection le rapport effecteur/cible n'est pas nécessairement élevé, c'est à dire inférieur à 10, voire 1 ou 0.1. Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps monoclonal lie le CD16 de la cellule effectrice avec une affinité d'au moins 2.106 M"1.
Par exemple, l'anticorps monoclonal de l'invention peut être préparé au moyen du procédé décrit dans la demande de brevet WO 01/77181. Ce procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable d'activer les cellules effectrices exprimant le CD16, comprend les étapes suivantes: a) purification d'anticorps monoclonaux obtenus à partir de différents clones provenant de lignées cellulaires sélectionnées parmi les hybridomes, notamment les hétérohybridomes et les lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps; b) addition de chaque anticorps obtenu à l'étape a) dans un mélange réactionnel distinct comprenant : i. les cellules cibles desdits anticorps, ii. des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le FcyRIII, iii. des IgG polyvalentes, c) détermination du pourcentage de lyse des cellules cibles et sélection des anticorps monoclonaux qui activent les cellules effectrices provoquant une lyse significative des cellules cibles (activité ADCC dépendante du FcyRIII).
Pour chaque spécificité antigénique, l'anticorps monoclonal de l'invention est en réalité une composition contenant des anticorps monoclonaux, tous identiques au niveau de leur structure primaire car étant tous originaires d'un même clone cellulaire. Toutefois, tous les anticorps d'une composition d'anticorps monoclonaux ne présentent pas le même profil glycannique . Les anticorps humains et animaux possèdent un oligosaccharide lié en N sur le domaine CH2 de chacune de leur chaîne lourde. Le site de liaison de cet oligosaccharide est, pour les immunoglobulines G, l ' asparagine 297 (Asn 297 selon
Kabat) . Ce résidu asparagine est également appelé « site de glycosylation Fcγ » .
L'extrémité de la chaîne oligosaccharidique liée à l'Asn 297 est appelée « extrémité réductrice », tandis que l'extrémité opposée est appelée « extrémité non-réductrice ».
Dans la région Fc des anticorps de type IgG, il y a deux sites de glycosylation Fcγ; ainsi deux chaînes oligosaccharidiques sont liées à chaque molécule d'anticorps.
Ainsi, dans une composition d'anticorps monoclonaux, les chaînes oligosaccharidiques ont des structures variées, dépendantes de la glycosylation conférée par la lignée cellulaire productrice. Toutefois, ces chaînes ont une structure de base commune :
WÈ<r liaison à Asn297
[|§ : GIcNAc © : Mannose
Cette structure de base, commune à tous les anticorps monoclonaux, peut comprendre en plus les sucres suivants: N- acétylglucosamine (GIcNAc), le fucose (fuc) et le galactose (gai) . Les principales formes glycosylées de N- oligosaccharides sont montrées ci-dessous :
GO GOF Gl GIF
|J:GlcNAc @:Mannose φ :Galactose ^* : Fucose Chaque chaîne oligosaccharidique pouvant inclure un ou plusieurs de ces sucres, et donc se présenter selon la forme GO, GOF, Gl ou GIF illustrées ci-dessus, il existe dans une composition d'anticorps monoclonaux une multitude de combinaisons d' oligosaccharides conférant à la composition d'anticorps monoclonaux un ratio en chacun de ces sucres qui peut être différent d'une composition d'anticorps à l'autre. Ainsi, des clones provenant d'une même lignée cellulaire peuvent produire des compositions d'anticorps dont les compositions glycanniques varient.
Ainsi, il a été montré de manière surprenante par le Demandeur que les compositions d'anticorps monoclonaux dans lesquelles le taux de fucose est inférieur à 65% ont une forte affinité pour le CD16. Plus particulièrement, ce type de composition d'anticorps monoclonaux possède une affinité de leur région pour le CD16 qui est plus élevée que celle des IgG polyvalentes pour le CD16. De plus, les anticorps monoclonaux de la composition ne sont pas déplacés par les Ig sériques .
Une méthode de préparation de telles compositions d'anticorps monoclonaux est donnée par exemple dans la demande de brevet WO 01/77181. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition d'anticorps monoclonaux est produite par une cellule possédant une faible activité enzymatique permettant l'addition du fucose au N- acétylglucosamine de l'extrémité réductrice, une telle enzyme étant de préférence la fucosyltransférase . Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est possible de faire agir sur la composition d'anticorps monoclonaux une enzyme, par exemple la fucosidase, de manière à obtenir une composition d'anticorps monoclonaux comportant un tel taux de fucose .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition d'anticorps monoclonaux est produite dans YB2/0 (ATCC CRL- 1662) .
De manière avantageuse, l'anticorps monoclonal de l'ensemble de moyens de l'invention est dirigé contre l'antigène 5C5 (antigène tumoral exprimé par les cellules des carcinomes rénaux) , le BCR (B CeIl Receptor) , un idiotype comme celui des anticorps inhibiteurs anti-FVIII, le TCR (T CeIl Receptor), CD2 , CD3 , CD4 , CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD45, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54 , CD66 (a,b,c, d) , CD74 , CD80, CD86, CD126, CD138, CD154, , MUCl (Mucine 1), MUC2 (Mucine 2), MUC3 (Mucine 3), MUC4 (Mucine 4), MUC16 (Mucine 16), HMl.24 (antigène spécifique des plasmocytes sur-exprimé dans les myélomes multiples) , tenascin (protéine de la matrice extracellulaire) , GGT (gamma-glutamyltranspeptidase) , VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) , EGFR (Endothelial Growth Factor receptor) , CEA (carcinoembryonic antigen) , CSAp (colon- specific antigen-p) , ILGF (Insulin-Like Growth factor) , placental growth factor, Her2/neu, anhydrase carbonique IX, IL-6, les protéines S100 (famille multigénique de protéines se liant au calcium) , MART-I (antigène tumoral de différentiation associé au mélanome) , TRP-I (tyrosinase related protein 1) , TRP-2 (tyrosinase related protein 2), gplOO (glycoprotéine 100 kDa) , les protéines amyloïdes, l'antigène rhésus D, les molécules du CMH de classe I et II comme HLA-DR) , un antigène résultant de l'expression de gènes mutés notamment des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur, un antigène dérivé de virus oncogènes exprimés par certaines tumeurs, un antigène ubiquitaire surexprimé dans certaines tumeurs et faiblement exprimés dans certains tissus normaux comme par exemple le récepteur de type II de l'hormone Mϋllérienne, une protéine glycosylée ou pas, un phospholipide, une molécule du soi ou du non soi exprimée ou exposée à la membrane par les cellules infectées comme la phosphatidylsérine, et une protéine exprimée ou sécrétée par un agent pathogène (toxine bactérienne, protéines complexes de la paroi bactérienne ou parasitaire, glycoprotéines d'enveloppe virale, par exemple de virus HIV, HBV, HCV, RSV, etc.), cette liste n'étant pas limitative.
De manière préférentielle, l'anticorps de l'invention est dirigé contre le CD20.
L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. 1987, Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9 ; Valentine et al. 1989, J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287) . Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte, stade où cette expression disparaît. L'antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 90% des lymphomes non- Hodgkiniens (NHL) de lymphocytes B, et sur plus de 95% des Leucémies Lymphoïdes Chroniques de type B (LLC-B) . L'antigène CD20 n'est pas exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques ni sur les plasmocytes.
La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des premières étapes de la différenciation
(Golay et al. 1985, J Immunol . ; 135 (6) : 3795-801) et de la prolifération (Tedder et al. 1986, Eur J Immunol. 1986 Aug;
16(8):881-7j des lymphocytes B. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition d'anticorps anti-CD20 est produite par YB2/0 et possède un taux de fucose inférieur à 65%.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, un tel anticorps, et son procédé de production, sont décrits dans la demande de brevet WO 2006/064121. Avantageusement, la chaîne lourde d'un tel anticorps a pour séquence en acides aminés la séquence SEQ ID NO: 1.
Avantageusement, la chaîne légère d'un tel anticorps a pour séquence en acides aminés la séquence SEQ ID NO: 2 ou 3. Brièvement, cet anticorps peut être obtenu, conformément à l'enseignement de la demande de brevet WO2006/064121, au moyen de la transfection de la cellule YB2/0 par des vecteurs permettant l'expression de la chaîne légère et de la chaîne lourde décrite ci -dessus. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition d'anticorps monoclonal anti-CD20 possède un taux de fucose inférieur à 65%, et de préférence compris entre 20 et 40%, ou un ratio fucose/galactose inférieur à 0,6.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'anticorps monoclonal de l'ensemble de moyens est produit par le clone R509, déposé à la CNCM sous le numéro d'accession CNCM 1-3314.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'anticorps monoclonal de l'ensemble de moyens est produit par le clone R603, déposé à la CNCM sous le numéro d'accession CNCM 1-3529..
Le Demandeur a montré que l'ensemble de moyens de l'invention est efficace pour le traitement de la LLC-B, car des cellules malignes de patients atteints de LLC-B ont été lysées ex vivo, et ceci même à un ratio inférieur ou égal à 10, voire à 5 ou même 2 E :T, à de faibles concentrations en anticorps, y compris en présence de sérum humain.
L'ensemble de moyens de l'invention permet ainsi la lyse optimale de la cible reconnue par les régions variables de l'anticorps, et ceci en raison des interactions (liaison) physique entre les cellules effectrices et la région Fc des anticorps, qui est suffisamment forte pour ne pas être déplacée par les IgG polyvalentes.
Avantageusement, la concentration en anticorps monoclonal contenue dans l'ensemble de moyens de l'invention pour le traitement de la LLC-B est inférieure à 375 mg/m2. En raison de ses avantages en terme de faible toxicité, de spécificité et de dose réduite, l'ensemble de moyens comprenant l'anticorps anti-CD20 peut être administré pour le traitement des pathologies suivantes: pathologies malignes avec un syndrome lymphoprolifératif des lymphocytes B CD20 positifs avec par exemple les lymphomes non-hodgkiniens de type B ou les leucémies B lymphoïdes aiguës ou chroniques, des maladies auto-immunes et/ou inflammatoires comme le rejet de greffe d'organes, la maladie du greffon contre l'hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, la sclérodermie, le syndrome de Sjôgren primitif (ou Syndrome de Gougerot-Sjôgren) , les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto- immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l'arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite d'Hashimoto, la maladie d'Addison, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow, la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associés aux ANCA (anticorps anti -cytoplasme des neutrophiles) , les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l'adulte et de l'enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN) , la maladie des agglutinines froides, le purpura thrombotique thrombocytopénique, l'hémophilie acquise auto-immune ; le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées bulleuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l'arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites ou les affections systémiques auto-immunes de l'enfant incluant le syndrome des antiphospholipides, cette liste n'étant pas limitative .
Avantageusement, l'ensemble de moyens de l'invention est une solution injectable. Avantageusement, cette solution injectable se trouve sous la forme d'une solution injectable localement ou par voie systémique. Dans un mode de réalisation particulier, 6 administrations sont réalisées au patient . On effectue une administration par jour ou tous les deux jours pendant une semaine puis une fois par semaine pendant un mois ou deux, une administration trois fois/mois, cure pouvant être renouvelée plusieurs fois.
Dans un mode de réalisation complémentaire, les cellules effectrices sont administrées à une dose comprise entre 104 et 109 cellules effectrices par injection.
Dans un autre mode de réalisation complémentaire, les anticorps de l'invention sont administrés à une dose comprise entre 1 et 500 mg d'anticorps par injection.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules effectrices sont administrées de manière répétée jusqu'à 10 fois, l'intervalle de temps entre chaque administration étant compris entre 2 jours et 12 mois. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'anticorps monoclonal est administré de manières répétées jusqu'à 10 fois, l'intervalle de temps entre chaque administration étant compris entre 2 jours et 12 mois. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps monoclonal et les cellules effectrices sont administrés de manière simultanée.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps monoclonal et les cellules effectrices sont administrés de manière séquentielle, l'anticorps monoclonal étant administré avant les cellules effectrices.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps monoclonal et les cellules effectrices sont administrés de manière séquentielle, l'anticorps monoclonal étant administré après les cellules effectrices.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant l'ensemble de moyens de l'invention.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies malignes, auto-immunes et infectieuses. Ce médicament ou composition pharmaceutique comprend avantageusement un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée, etc., ainsi que toute suspension, gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, tensioactifs, conservateurs, etc. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament .
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie maligne.
Avantageusement, cette pathologie maligne est choisie parmi les tumeurs solides et les hémopathies malignes. Les tumeurs solides sont sélectionnées parmi les mélanomes, les carcinomes, les sarcomes, les gliomes et les cancers cutanés. Les carcinomes sont sélectionnés dans le groupe constitué par les carcinomes du rein, du sein, de la cavité orale, des poumons, du tractus gastro- intestinal , des ovaires, de la prostate, de l'utérus, de la vessie, du pancréas, du foie, de la vésicule biliaire, de la peau et des testicules.
Les hémopathies malignes sont sélectionnées parmi les syndromes lymphoprolifératifs , myéloprolifératifs , myélodysplasiques et les leucémies myéloïdes aiguës avec par exemple les lymphomes non-hodgkiniens de type B, les leucémies B lymphoïdes aiguës ou chroniques, le lymphome de Burkitt, la leucémie à tricholeucocytes, les leucémies myéloïdes aiguës et chroniques, les lymphomes et les leucémies T, lymphomes Hodgkiniens, la macroglobulinémie de Waldenstrôm et les myélomes multiples, cette liste n'étant pas limitative.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie auto-immune et/ou inflammatoire primitive ou secondaire, spécifique d'organes ou systémiques et associée ou non à des autoanticorps pathogènes, choisie parmi le rejet de greffe d'organes, la maladie du greffon contre l'hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, la sclérodermie, le syndrome de Sjôgren primitif (ou Syndrome de Gougerot-Sjôgren) , les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto- immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l'arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite d'Hashimoto, la maladie d'Addison, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow, la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associés aux ANCA (anticorps anti -cytoplasme des neutrophiles) , les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l'adulte et de l'enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN) , la maladie des agglutinines froides, le purpura thrombotique thrombocytopénique, l'hémophilie acquise auto-immune; le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses , les affections cutanées bulleuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l'arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les affections systémiques auto-immunes de l'enfant incluant le syndrome des antiphospholipides , cette liste n'étant pas limitative . Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'ensemble de moyens de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie infectieuse.
Avantageusement, cette maladie infectieuse est choisie parmi celles induites par les virus (virus de
1 • immunodéficience humaine ou VIH, virus de l'hépatite B ou C
(HBV, HCV) , virus Epstein-Barr ou EBV, cytomégalovirus ou CMV, les entérovirus, la grippe avec les virus Influenza A, B et C, le virus respiratoire syncytial ou VRS, Human T cell Lymphotropic Virus ou HTLV) , les bactéries et/ou leurs toxines
(tétanos, diphtérie, pneumocoques, méningocoques, staphylocoques y compris les formes méthiciline résistantes, les Klebsielles, les Shigelles, les pseudomonas aeruginosa, les entérobactéries ou les pathologies résistantes aux antibiotiques dont les maladies nosocomiales) , les parasites
(paludisme, leishmanioses, trypanosomiases) ainsi que les maladies émergentes par exemple le Chikungunya, la grippe aviaire, le virus du syndrome respiratoire aigu sévère ou
SRAS, le virus responsables de fièvres hémorragiques comme Ebola ou Dengue ou le virus du Nil occidental, et celles reliées au bio-terrorisme comme le Charbon, le Botulisme, la
Peste, la Variole et poxvirus, la Tularémie, les Agents des fièvres hémorragiques, la Brucellose, les Entérotoxines B du
Staphylocoque, la Toxine diphtérique ou les Encéphalites virales, cette liste n'étant pas limitative.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l ' invention.
Figures
Figure 1: Etude de la fixation des anticorps EMABling anti-D R297 et de l'anticorps ADl au CD16 des macrophages (récepteur FcγRIII) par un test de compétition. Figure 2: Activité ADCC des anticorps EMABling R297 et de l'anticorps ADl induite par les macrophages en présence de différentes concentrations d' immunoglobulines polyclonale (IVIg) .
Figure 3: Activité ADCC des anticorps EMABling R297 et de l'anticorps ADl induite par les macrophages en présence de différentes concentrations d' immunoglobulines (IVIg) et de l'anticorps anti-CD16 3G8 à la concentration de 6,25 μg/ml .
Figure 4: Phagocytose des hématies Rh+ par les macrophages CD16+ induite par les anticorps EMABling R297 et de l'anticorps ADl en présence de différentes concentrations d' immunoglobulines (IVIg).
Exemples
Exemple 1: Différenciation des monocytes en macrophages
Les monocytes sont isolées à partir de sang périphérique par fractionnement sur gradient de densité Ficol et Percol puis mis en culture dans un milieu RPMI contenant 10% SVF et additionné de M-CSF (Monocyte Colony Stimulating Factors) (50 ng/ml) . Après 7 jours, les macrophages obtenus sont de phénotype CD14+, CD16+, CD32+, CD64+, CDlIb+, CDIa-, CD80-, CD83- . Ainsi, la différenciation en M-CSF permet l'expression du CD16 à la surface des macrophages.
Exemple 2; Interaction des anticorps anti-D avec le CD16 exprimé par les macrophages La fixation de l'anticorps anti-D R297 (appelé également « EMABling R297 ») est comparée à celle de l'anticorps ADl. L'anticorps anti-D R297 est décrit dans le document WO 01/77181, et est produit conformément au procédé décrit dans ce document. Cet anticorps est produit dans la cellule YB2/0 (ATCC CRL-1662) . La fixation de l'anticorps R297 sur le CD16 des macrophages est comparée à celle de l'anticorps ADl (décrit dans le document WO 01/77181, exprimé par un hétéromyélome) .
Le test de déplacement de l'anticorps anti-CD16 (clone producteur 3G8) permet de mesurer la fixation des anticorps monoclonaux sur le récepteur CD16 des macrophages, quelle que soit leur spécificité.
Les macrophages purifiés sont incubés avec des concentrations variables (0 à 83 μg/ml) d'anticorps anti-D (R297 ou ADl) et l'anticorps anti-CD16 3G8 couplé à un fluorochrome (3G8-PE) à concentration fixe.
Après lavage, la fixation de l'anticorps 3G8-PE sur le récepteur CD16 des macrophages est évaluée par cytométrie en flux. Les anticorps ayant la capacité de se fixer sur le CD16, entrent en compétition avec la fixation de l'anticorps 3G8 et, par conséquent, induisent une diminution de la MFI (Mean Fluorescence Intensity ou moyenne de l'intensité de fluorescence) . Les résultats sont exprimés en moyennes de fluorescence (MFI) , en fonction de la quantité des anticorps à évaluer.
La figure 1 montre que l'anticorps R297 se fixe très fortement sur le CDl6 des macrophages par rapport à l'anticorps ADl.
Au plateau l'anticorps EMABling induit un déplacement au moins 6 fois plus important que l'anticorps ADl.
Exemple 3; Interaction des anticorps anti-CD20 EMAB6 et EMAB603 avec le CDl6 exprimé par les macrophages
La fixation des anticorps anti-CD20 EMAB603 (produit par le clone R603, déposé à la CNCM sous le numéro 1-3529) et EMAB6
(produit par le clone R509, déposé à la CNCM sous le numéro I-
3314) sur le CD16 des macrophages est comparée à celle de Rituxan. Les anticorps anti-CD20 EMAB6 et EMAB603 sont produits conformément au procédé décrit dans la demande de brevet WO2006/064121 , en particulier pages 26-33. Par ailleurs, les clones produisant ces anticorps sont disponibles à la CNCM sous les numéro d'accession CNCM 1-3314 et CNCM I- 3529 respectivement.
Le test de déplacement de l'anticorps anti-CD16 (clone producteur 3G8) permet de mesurer la fixation des anticorps monoclonaux sur le récepteur CD16, quelle que soit leur spécificité .
Les macrophages sont incubés avec des concentrations variables (0 à 83 μg/ml) d'anticorps anti-CD20 (EMAB6, EMAB603 ou rituximab) et l'anticorps anti-CD16 3G8 couplé à un fluorochrome (3G8-PE) à concentration fixe.
Après lavage, la fixation de l'anticorps 3G8-PE sur le récepteur CD16 des macrophages est évaluée par cytométrie en flux. Les anticorps ayant la capacité de se fixer sur le CD16, entrent en compétition avec la fixation de l'anticorps 3G8 et, par conséquent, induisent une diminution de la MFI (Mean Fluorescence Intensity ou moyenne de 1 ' intensité de fluorescence) . Les résultats sont exprimés en moyennes de fluorescence (MFI),- en fonction de la quantité des anticorps à évaluer .
Les valeurs Imax (inhibition maximale de la fixation de 3G8) et IC50 (concentration d'anticorps anti-CD20 requise pour induire une inhibition de fixation de 3G8 de 50% de Imax) sont calculées à l'aide du logiciel d'analyses statistiques PRISM.
Résultat :
L'interaction des anticorps EMABling R603 et EMAB6 sur le CD16 des macrophages est très supérieure à celle obtenue avec Rituxan.
Ainsi, ce test étant établi en absence de cible antigénique, les anticorps anti-CD20 de l'invention ont la capacité de se fixer fortement sur le CD16 des macrophages.
Exemple 4; Activité ADCC anti-D/hématies Rh+/macrophages . Rôle des IVIg polyvalentes (Tégéline ) . La capacité cytotoxique des anticorps anti-D est étudiée par la technique ADCC. Les anticorps anti-D, les macrophages
(monocytes différenciés en M-CSF) et des hématies Rhésus D+
(rapport effecteur/cible d'environ 2/1) sont incubés 16h à 37°C en présence de différentes concentrations d' immunoglobulines (IVIg) polyvalentes (Tégéline ). L'activité cytotoxique induite par les anticorps est ensuite mesurée par colorimétrie en quantifiant dans les surnageants l'hémoglobine libérée par les hématies lysées. Les résultats de lyse spécifique sont exprimés en pourcentage de lyse.
Les résultats de la figure 2 indiquent qu'en présence de macrophages, l'anticorps EMABling R297 a une forte activité
ADCC qui subsiste en présence de concentrations importantes d' IVIg, contrairement à l'anticorps ADl qui induit une lyse par ADCC uniquement en absence d'IVIg.
Ainsi, en l'absence d' immunoglobulines polyvalentes, les deux anticorps anti-D, EMABling R297 et ADl ont une activité ADCC de l'ordre de 29%. Par contre à la concentration de 5 mg/ml d' immunoglobulines polyvalentes, l'anticorps EMABling apparaît au moins 20 fois plus actif (23% de lyse pour 1% avec ADl) . Cet avantage subsiste à de plus fortes concentrations d' immunoglobulines polyvalentes (25 mg/ml), les pourcentages de lyse respectifs pour l'anticorps EMABling et ADl étant de 16 et 1%.
Exemple 5; Activité ADCC anti-D/hβmaties Rh+/macrophages . Rôle des IVIg polyvalentes (Tégéline ) . Selon le même protocole que décrit dans l'exemple 4, l'activité ADCC des anti-CD20 en présence de cellules Raji et de macrophages (monocytes différenciés en M-CSF) a également été étudiée. Les anticorps anti-CD20 (produit par le clone R603 ou Rituxan) sont incubées en présence de macrophages, de cellules Raji et de différentes concentrations d'IVIg polyvalentes (Tégéline®). Après 16h d'incubation à 37°C, l'activité ADCC induite par les anticorps est mesurée par colorimétrie en quantifiant dans les surnageants la quantité de LDH (lactate deshydrogénase) intracellulaire libérée par les cellules Raji. Les résultats de lyse spécifique sont exprimés en pourcentage de lyse .
Les résultats indiquent que l'anticorps anti-CD20 R603 a une activité ADCC au minimum 2 fois supérieure à celle induite par Rituxan en présence de macrophages exprimant le CD16 et de Tégéline®. Cette activité ADCC est dépendante du CD16 exprimé par les macrophages comme démontré par l'effet inhibiteur de l'anti-CD16 3G8.
Exemple 6: Activité ADCC anti-D/hématiβs Rh+/macrophages . Mise en évidence du CD16 en présence d/ IVIg L'addition d'anticorps anti-CD16, 3G8, inhibe l'ADCC induite par l'anticorps EMABling en présence de la plus forte concentration d'IVIg testée, indiquant que la lyse induite est dépendante du CD16 exprimé sur les macrophages (figure 3) .
Exemple 7 ; Phagocytose des hématies Rhésus + par les macrophages CD16+ induite par l'anticorps EMABling R297 en présence d'IVIg.
La capacité des anticorps anti-D R297 à induire une phagocytose des hématies Rhésus + par des macrophages CD16+ est étudiée par cytométrie en flux. Les anticorps anti-D, les macrophages marqués au PKH67 (monocytes différenciés M-CSF et des hématies Rhésus D+ (rapport effecteur/cible de 5/1) marquées au PKH26 sont incubées 3h à 4°C et 37°C en présence de différentes concentrations d'IVIg polyvalentes (Tégéline ) . Les résultats correspondent au pourcentage de macrophages doublement marqués PKH67/PKH26, c'est à dire ayant phagocyté au moins une hématie.
Résultats : A 40C, les macrophages et hématies apparaissent dans des fenêtres différentes en cytométrie, chacune étant marquée par un fluorochrome spécifique. Le pourcentage de phagocytose est très faible, de l'ordre de 4% en absence d'IVIg, et de 1 à 2% en présence d'IVIg. Ces valeurs à 4°C sont systématiquement déduites pour exprimer le pourcentage de phagocytose à 37°C.
A 370C, le pourcentage de macrophages doublement marqués PKH67/PKH26 augmente en absence d'IVIg pour les deux anticorps testés, R297 EMABling et ADl. En présence d'IVIg, seul l'anticorps EMABling a la capacité de phagocyter les hématies
Rh+ contrairement à l'anticorps ADl. Ainsi, que ce soit à 0, 1 ou 2 mg/ml d'IVIg, le pourcentage de phagocytose reste compris entre 15 et 20%, montrant que l'ajout d'IVIg n'inhibe pas la phagocytose induite par l'anticorps EMABling.
A la concentration de 1 mg/ml, l'anticorps EMABling est au moins 5 fois supérieur à l'anticorps ADl. A la concentration supérieure de 2 mg/ml, le pourcentage de phagocytose est de 16.9% avec l'anticorps EMABling et non significatif (valeur 0) avec l'anticorps ADl.
Exemple 8 ; Phagocytose des hématies Rhésus + par les macrophages CD16+ induite par l'anticorps R603 en présence d'IVIg.
La phagocytose des cellules Raji CD20 en présence de macrophages CDl6, induite par l'anticorps R603 en présence d'IVIg a également été étudiée.
La capacité des anticorps anti-CD20 à induire une phagocytose des cellules Raji par des macrophages CD16+ est étudiée par cytométrie en flux. Les anticorps anti-CD20, les macrophages marqués au PKH67 (monocytes différenciés M-CSF) et les cellules Raji (rapport effecteur/cible de 5/1, 10/1 et
20/1) marquées au PKH26 sont incubées 3h à 40C et 37°C en présence de différentes concentrations d' IVIg polyvalentes
(Tégéline®) .
Les résultats correspondent au pourcentage de macrophages doublement marqués PKH67/PKH26, c'est à dire ayant phagocyté au moins une cellule Raji. Résultats : A 40C, les macrophages et cellules Raj i apparaissent dans des fenêtres différentes en cytométrie, chacune étant marquée par un fluorochrome spécifique. Le pourcentage de phagocytose est très faible, inférieur à 5% en absence et en présence d'IVIg. Ces valeurs à 4°C sont systématiquement déduites pour exprimer le pourcentage de phagocytose à 37°C.
A 370C, le pourcentage de macrophages doublement marqués
PKH67/PKH26 augmente en absence d'IVIg pour les deux anticorps testés, R603 anti-CD20 et Rituxan. En présence d'IVIg, l'anticorps EMABling a une capacité supérieure, de l'ordre de
2 fois, 4 fois, voire 10 fois de phagocyter les cellules Raj i par rapport à l'anticorps Rituxan. Ainsi, que ce soit à 0; 1 ou 2 mg/ml d'IVIg, le pourcentage de phagocytose reste toujours supérieur a celui induit par Rituxan, montrant qu'en présence d'IVIg, l'anticorps EMABling induit une phagocytose en présence de macrophages CD16+.

Claims

REVENDICATIONS
1. Ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto-immune ou d'une maladie infectieuse, comprenant une cellule effectrice qui exprime le récepteur FcγRIII (CD16) à sa surface, et un anticorps monoclonal, dans lequel l'affinité de la région Fc dudit anticorps monoclonal pour le CD16 est supérieure à l'affinité de la région Fc des immunoglobulines polyclonales pour le CD16.
2. Ensemble de moyens selon la revendication 1, dans lequel ladite cellule effectrice qui exprime le récepteur FcγRIII (CD16) à sa surface est un monocyte ou une cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte qui exprime le récepteur FcγRIII (CD16) à sa surface.
3. Ensemble de moyens selon la revendication 1 ou 2 , dans lequel ladite cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte qui exprime le CD16 à sa surface est choisie parmi les monocytes exprimant le CD16, les macrophages, les cellules Natural Killer (NK) , les cellules dendritiques et l'ensemble des cellules mononucléées du sang périphérique (Peripheral Blood Mononuclear CeIl ou PBMC) .
4. Ensemble de moyens selon la revendication 3, dans lequel ladite cellule, dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte, qui exprime le CD16 à sa surface est un macrophage.
5. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit anticorps monoclonal n'est pas déplacé par les immunoglobulines polyclonales, particulièrement celles présentes dans le sérum humain, ceci en raison de ladite affinité de la région Fc dudit anticorps monoclonal pour le CDl6.
6. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit anticorps monoclonal lie le CD16 de ladite cellule dérivée de monocyte ou d'un précurseur de monocyte avec une affinité supérieure à 2.106 M"1.
7. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit anticorps monoclonal est produit sous forme d'une composition d'anticorps monoclonaux, dans laquelle chaque anticorps possède des chaînes de sucre liées en N au site de glycosylation Fcγ (asparagine 297, selon Kabat) , et dans laquelle parmi toutes les chaînes de sucre liées en N audit site de glycosylation de tous les anticorps de ladite composition, le taux de fucose est inférieur à 65%.
8. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des 'revendications précédentes, dans lequel ledit anticorps monoclonal est dirigé contre un antigène sélectionné parmi l'antigène 5C5 (antigène tumoral exprimé par les cellules des carcinomes rénaux) , le BCR (B CeIl Receptor) , un idiotype comme celui des anticorps inhibiteurs anti-FVIII, le TCR (T CeIl Receptor), CD2 , CD3 , CD4 , CD8 , CD14, CD15, CDl 9, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD45, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52 , CD54, CD66 (a,b,c, d) , CD74 , CD80, CD86, CD126, CD138, CD154, MUCl (Mucine 1), MUC2 (Mucine 2) , MUC3 (Mucine 3) , MUC4 (Mucine 4) , MUC16 (Mucine 16) , HMl.24 (antigène spécifique des plasmocytes sur- exprimé dans les myélomes multiples) , tenascin (protéine de la matrice extra-cellulaire) , GGT (gamma- glutamyltranspeptidase) , VEGF (Vascular Endothelial Growth
Factor) , EGFR (Endothelial Growth Factor receptor) , CEA
(carcinoembryonic antigen) , CSAp (colon-specific antigen- p) , ILGF (Insulin-Like Growth factor), placental growth factor, Her2/neu, anhydrase carbonique IX, IL-6, les protéines S100 (famille multigénique de protéines se liant au calcium) , MART-I (antigène tumoral de différentiation associé au mélanome) , TRP-I (tyrosinase related protein 1) , TRP-2 (tyrosinase related protein 2) , gplOO (glycoprotéine 100 kDa) , les protéines amyloïdes, l'antigène rhésus D, les molécules du CMH de classe I et II comme HLA-DR) , un antigène résultant de l'expression de gènes mutés notamment des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur, un antigène dérivé de virus oncogènes exprimés par certaines tumeurs bien définies, un antigène ubiquitaire surexprimé dans certaines tumeurs et faiblement exprimés dans certains tissus normaux comme par exemple le récepteur de type II de l'hormone Mύllérienne, une protéine glycosylée ou pas, un phospholipide, une molécule du soi ou du non soi exprimée ou exposée à la membrane par les cellules infectées comme la phosphatidylsérine , et une protéine exprimée ou sécrétée par un agent pathogène (toxine bactérienne, les protéines complexes de la paroi bactérienne ou parasitaire, les glycoprotéines d'enveloppe virale, par exemple de virus HIV, HBV, HCV et RSV) .
9. Ensemble de moyens selon la revendication 8, dans lequel ledit anticorps monoclonal est dirigé contre le CD20.
10. Ensemble de moyens selon la revendication 9, dans lequel ledit anticorps anti-CD20 est produit par la lignée cellulaire R509 déposée à la CNCM sous le numéro d'accession 1-3314, ou par la lignée cellulaire R603, déposée à la CNCM sous le numéro d'accession 1-3529.
11. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation en thérapie de manière simultanée, séquentielle ou séparée.
12. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite cellule effectrice exprimant le CD16 à sa surface a une activité cytotoxique sur la cellule cible dudit anticorps favorisée par l'interaction de l'anticorps avec le CD16.
13. Ensemble de moyens selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit anticorps monoclonal induit une cytotoxicité par activité ADCC ou par phagocytose de ladite cellule cible de l'anticorps en présence d'une cellule effectrice exprimant le CD16.
14. Composition pharmaceutique contenant un ensemble de moyens tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, et des excipients pharmaceutiquement acceptables.
15. Utilisation d'un ensemble de moyens tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour la fabrication d'un médicament.
16. Utilisation d'un ensemble de moyens tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie maligne.
17. Utilisation d'un ensemble de moyens selon la revendication
16, pour le traitement d'une pathologie maligne choisie parmi les tumeurs solides et les hémopathies malignes.
18. Utilisation d'un ensemble de moyens selon la revendication
17, dans laquelle les tumeurs solides sont sélectionnées parmi les mélanomes, les carcinomes, les sarcomes, les gliomes et les cancers cutanés.
19. Utilisation d'un ensemble de moyens selon la revendication
18, dans laquelle les carcinomes sont sélectionnés dans le groupe constitué par les carcinomes du rein, du sein, de la cavité orale, des poumons, du tractus gastro-intestinal, des ovaires, de la prostate, de l'utérus, de la vessie, du pancréas, du foie, de la vésicule biliaire, de la peau et des testicules.
20. Utilisation d'un ensemble de moyens selon la revendication 17, dans laquelle les hémopathies malignes sont sélectionnées parmi les syndromes lymphoprolifératifs, myéloprolifératifs, myélodysplasiques et les leucémies myéloides aiguës avec les lymphomes non-hodgkiniens de type
B, les leucémies B lymphoïdes aiguës ou chroniques, le lymphome de Burkitt, la leucémie à tricholeucocytes, les leucémies myéloïdes aiguës et chroniques, les lymphomes et les leucémies T, lymphomes Hodgkiniens, la macroglobulinémie de Waldenstrôm et les myélomes multiples.
21. Utilisation d'un ensemble de moyens tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie auto-immune et/ou inflammatoire primitive ou secondaire, spécifique d'organes ou systémiques et associée ou non à des auto-anticorps pathogènes.
22. Utilisation d'un ensemble de moyens selon la revendication 21, pour le traitement d'une maladie auto-immune et/ou inflammatoire primitive ou secondaire, spécifique d'organes ou systémiques et associée ou non à des auto-anticorps pathogènes, choisie parmi le rejet de greffe d'organes, la maladie du greffon contre l'hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, la sclérodermie, le syndrome de Sjôgren primitif (ou Syndrome de Gougerot -Sjôgren) , les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto-immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l'arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite d'Hashimoto, la maladie d'Addison, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow, la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associés aux ANCA (anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles) , les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l'adulte et de l'enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN), la maladie des agglutinines froides, le purpura throtnbotique thrombocytopénique et l'hémophilie acquise auto-immune,- le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées huileuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l'arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les affections systémiques auto-immunes de l'enfant incluant le syndrome des antiphospholipides .
23. Utilisation d'un ensemble de moyens tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie infectieuse.
24. Utilisation d'un ensemble de moyens selon la revendication 23, pour le traitement d'une maladie infectieuse choisie parmi celles induites par les virus (virus de 1 ' immunodéficience humaine ou VIH, virus de l'hépatite B ou C (HBV, HCV) , virus Epstein-Barr ou EBV, cytomégalovirus ou CMV, les entérovirus, la grippe avec les virus Influenza A, B et C, le virus respiratoire syncytial ou VRS, Human T cell Lymphotropic Virus ou HTLV) , les bactéries et/ou leurs toxines (tétanos, diphtérie, pneumocoques, méningocoques , staphylocoques y compris les formes méthiciline résistantes, les Klebsielles, les Shigelles, les pseudomonas aeruginosa, les entérobactéries ou les pathologies résistantes aux antibiotiques dont les maladies nosocomiales) , les parasites (paludisme, leishmanioses , trypanosomiases) ainsi que les maladies émergentes par exemple le Chikungunya, la grippe aviaire, le virus du syndrome respiratoire aigu sévère ou SRAS, les virus responsables de fièvres hémorragiques comme Ebola ou Dengue ou le virus du Nil occidental, et celles reliées au bioterrorisme comme le Charbon, le Botulisme, la Peste, la Variole et poxvirus, la Tularémie, les Agents des fièvres hémorragiques, la Brucellose, les Entérotoxines B du Staphylocoque, la Toxine diphtérique ou les Encéphalites virales .
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