EP3555136A1 - Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-amhrii - Google Patents

Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-amhrii

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Publication number
EP3555136A1
EP3555136A1 EP17836011.1A EP17836011A EP3555136A1 EP 3555136 A1 EP3555136 A1 EP 3555136A1 EP 17836011 A EP17836011 A EP 17836011A EP 3555136 A1 EP3555136 A1 EP 3555136A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
acid sequence
pharmaceutical composition
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17836011.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Abdessatar Sami Chtourou
Nathalie Fournier
Christophe De Romeuf
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LFB SA
Original Assignee
LFB SA
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Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Publication of EP3555136A1 publication Critical patent/EP3555136A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to a new combination of antibodies, in particular for the prevention or treatment of urogenital cancers, preferably ovarian cancer.
  • Ovarian cancer is the leading cause of gynecological cancers, and is the fifth leading cause of cancer death in women, whose three histological origins are as follows:
  • FIGO classification International Federation of Gynecology and Obstetrics
  • FIGO classification International Federation of Gynecology and Obstetrics
  • Stage I Tumor limited to the ovaries (5-year survival rate: 90-70%)
  • Stage II Tumor in one or both ovaries with pelvic extension (5-year survival rate: 70-40%)
  • Stage III Tumor in one or both ovaries with extra-pelvic extension (5-year survival rate: 20%), and
  • Stage IV Remote metastases excluding peritoneal metastases (5-year survival rate: ⁇ 10%).
  • the main current strategies used for the treatment of ovarian cancer are surgery and chemotherapy, particularly at the front line, such as carboplatin and paclitaxel.
  • Monoclonal antibodies have also recently been developed such as cetuximab, which is directed against the epidermal growth factor receptor.
  • the combination of an anti-CD303 antibody and an anti-AMHRIl antibody is particularly effective against ovarian tumors.
  • the combination of these two antibodies may have a synergistic effect on the site of the tumor.
  • the present invention thus relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle:
  • the present invention also relates to products containing:
  • the invention further relates to
  • At least one anti-AMHRIl antibody for its use for the prevention or treatment of urogenital cancers in combination with at least one anti-CD303 antibody;
  • At least one anti-CD303 antibody for use in the prevention or treatment of urogenital cancers in combination with at least one anti-AMHRII antibody.
  • the invention also relates to a method of treating urogenital cancers, which comprises administering to a patient at least one anti-AMHRI1 antibody and at least one anti-CD303 antibody.
  • antibody refers both to an immunoglobulin, fragments and derivatives of this immunoglobulin.
  • Immunoglobulins are well known to those skilled in the art and consist of an assembly of two dimers each consisting of a heavy chain and a light chain. The multimeric complex is assembled by the binding of a light chain and a heavy chain by a disulfide bridge between two cysteines, the two heavy chains being themselves also linked together by two disulfide bridges.
  • Each of the heavy chains and light chains consists of a constant region and a variable region. More precisely, each light chain consists of a variable region (V L ) and a constant region (C L ). Each heavy chain consists of a variable region (V H) and a constant region consisting of three constant domains C H i, C H2 and C H3 . The domains C H2 and C H3 make up the domain Fc.
  • the variable regions of the light chain and of the heavy chain consist of three domains determining the recognition of the antigen (CDR regions, ie Complementary Determining Regions) surrounded by four framework domains (FR or Framework regions).
  • Anti-CD303 (a) and anti-AMHRI1 (b) antibodies can be monoclonal or polyclonal. Preferably, they are monoclonal antibodies.
  • the antibodies can be of several isotypes, depending on the nature of their constant region: the constant regions ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ correspond respectively to immunoglobulins IgG, IgA, IgM, IgE and IgD.
  • the anti-CD303 a) and anti-AMHRIl b) antibodies are of IgG isotype. Indeed, this isotype shows an ability to efficiently induce an ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) activity in the largest number of (human) individuals.
  • ADCC Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity
  • the constant regions ⁇ comprise several subtypes: ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the human complement, and ⁇ 4, thus creating the lgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 sub-isotypes.
  • the anti-CD303 a) and anti-AMHRIl b) antibodies are of the IgG1 or IgG2 isotype, preferably IgG1.
  • the anti-CD303 a) and anti-AMHRIl b) antibodies are selected from murine antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and human antibodies.
  • the anti-CD303 antibody a) is a chimeric antibody, and more preferably a chimeric antibody selected from a murine / human chimeric antibody or a human / macaque chimeric antibody.
  • the anti-CD303 antibody a) is a humanized antibody, in particular a chimeric antibody whose constant region of the heavy and light chains is of human origin.
  • chimeric antibody refers to an isolated antibody, in which the sequence of each light chain and / or heavy chain that constitutes it comprises or consists of a hybrid sequence derived from at least two distinct animals.
  • a chimeric antibody contains a wild-type light chain variable region and wild-type heavy chain variable region fused to the human light chain and heavy chain constant regions, respectively.
  • a chimeric antibody can be prepared using genetic recombination techniques well known to those skilled in the art.
  • humanized antibody refers to an antibody derived from an animal other than humans in which heavy chain and light chain sequences other than CDRs have been replaced by corresponding sequences of one or more antibodies. human origin. The antibody is therefore mainly composed of human sequences, but its specificity for the antigen conferred by the CDRs comes from another species. In addition, some of the skeletal segment residues (referred to as FR) can be modified to maintain binding affinity (Jones et al., 1986, Verhoeyen et al., 1988, Riechmann et al., 1988).
  • the humanized antibodies according to the invention may be prepared by techniques known to those skilled in the art such as “CDR grafting”, “resurfacing”, Superhumanization, "Human string content”, “FR libraries” technologies. "Guided selection”, “FR shuffling” and “Humaneering”, as summarized in the review of Almagro et al-2008.
  • the anti-CD303 antibody and / or the anti-AMHRIl antibody according to the invention may also be present in the form of an anti-CD303 antibody fragment and / or a fragment of anti-AMHRIl antibodies, respectively.
  • fragment refers in particular to Fab, F (ab) '2 or
  • Fab refers to an antibody fragment of molecular weight of about 50,000 Da and having antigen binding activity.
  • the Fab fragment consists of the entire light chain (VL + CL) and part of the heavy chain (VH + CH1). It can be obtained in particular by treating IgG with a protease, papain.
  • F (ab ') 2 refers to a fragment of about 100,000 Da and having antigen binding activity. It corresponds to the association by a bridge disulfide (hinge region) of two Fab fragments described above. It can be obtained by treating IgG with a protease, pepsin.
  • Fd corresponds to the portion of the heavy chain that is included in the Fab fragment.
  • the fragment Fd is thus formed of the VH and CH1 domains.
  • the anti-CD303 antibody and / or the anti-AMHRIl antibody according to the invention may also be present in the form of an anti-CD303 antibody derivative a) and / or a anti-AMHRIl antibody derivative b), respectively.
  • derivative refers in particular to scFv derivatives, and to scFv multimers, such as diabody, triabody or tetrabody.
  • ScFv single chain Fv
  • VH VL polypeptide synthesized using the genes encoding the VL and VH domains and a linker sequence.
  • ScFv includes CDRs maintained in an appropriate conformation, for example using genetic recombination techniques.
  • ScFv can also serve as basic modules for the development of multimeric structures (dimeric: "diabody”, trimeric: “triabody”, tetrameric: “tetrabody”).
  • diabody refers to a scFv dimer. This fragment dimer has the property of maintaining the double valence that the parent antibody possesses. Diabody is bivalent, mono or bispecific depending on whether it fixes two identical or different antigens.
  • triabody refers to the trivalent association of scFv. A triabody can thus fix three identical or different antigens.
  • tetrabody refers to the tetravalent association of scFv.
  • a tetrabody can fix four identical or different antigens.
  • urogenital cancers refers to cancers of the urogenital tract in the male or female organs. These include prostate cancer, testicular cancer, penile cancer, endometrial cancer, vulvar and vaginal cancer, uterine cancer, cervix cancer the uterus, ovarian cancer, kidney cancer, bladder cancer. Preferably, the urogenital cancer is ovarian cancer.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle, at least one anti-CD303 antibody, and at least one anti-AMHRI1 antibody fragment or derivative.
  • the present invention also relates to products containing at least one anti-CD303 antibody, and at least one anti-AMHRI1 antibody fragment or derivative, as combination products for simultaneous, separate or time-course use for its use in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle, at least one anti-CD303 antibody fragment, and at least one anti-AMHRIl antibody or one of its fragments or one of its derivatives.
  • the present invention also relates to products containing at least one anti-CD303 antibody fragment, and at least one anti-AMHRIl antibody or one of its fragments or a derivative thereof, as combination products for a simultaneous use, separate or spread over time, for its use in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle, at least one anti-CD303 antibody derivative, and at least one anti-AMHRIl antibody or one of its fragments or one of its derivatives.
  • the present invention also relates to products containing at least one anti-CD303 antibody derivative, and at least one anti-AMHRIl antibody or one of its fragments or a derivative thereof, as combination products for one or more simultaneous use, separate or spread over time, for its use in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle, at least one anti-AMHRI1 antibody, and at least one anti-CD303 antibody fragment or derivative.
  • the present invention also relates to products containing at least one anti-AMHRI 1 antibody, and at least one anti-CD303 antibody fragment or derivative, as combination products for simultaneous, separate or spread use over time, for its use in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle, at least one anti-AMHRI1 antibody fragment, and at least one anti-CD303 antibody or one of its fragments or one of its derivatives.
  • the present invention also relates to products containing at least one anti-AMHRIl antibody fragment, and at least one anti-CD303 antibody or one of its fragments or one of its derivatives, as combination products for simultaneous, separate or spread use over time for its use in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle, at least one anti-AMHRI1 antibody derivative, and at least one anti-CD303 antibody or one of its fragments or one of its derivatives.
  • the present invention also relates to products containing at least one anti-AMHRI1 antibody derivative, and at least one anti-CD303 antibody or a fragment thereof or a derivative thereof, as combination products for one or more simultaneous use, separate or spread over time, for its use in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the present invention thus relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable vehicle:
  • pharmaceutically acceptable carrier is meant a non-toxic medium compatible with a biological system such as a cell, a cell culture, a tissue or an organism.
  • the invention also relates to a product containing the above two active agents a) and b), said active ingredients being combined for simultaneous, separate or time-based use, and in the prevention or treatment of urogenital cancers.
  • the anti-CD303 antibody is an antibody directed against the CD303 protein.
  • This protein also named BDCA-2, is specifically expressed on the surface of plasmacytoid dendritic cells, and is a type II protein belonging to type C lectins.
  • the human CD303 antigen is the C member of the 4 th type C lectin family (CLEC4 or "C-type lectin domain family 4, member C"). It is a 213 amino acid type II transmembrane glycoprotein (accessible in Uniprot: Q8WTT0), comprising a short cytoplasmic domain without obvious signaling (amino acids 1 -21), transmembrane region (amino acids 22-44), and extracellular domain (amino acids 45-213).
  • Plasmacytoid dendritic cells correspond to a subpopulation of dendritic cells, also called DC2.
  • Plasmacytoid dendritic cells are characterized by the Lin- (CD3-, CD19-, CD20-, CD14-, CD56-), HLA-DR +, CD1-1C-, CD123 + and CD45RA + markers. These cells have also been phenotypically characterized: they express the markers CD4, CD303 and BDCA-4. They are present in the lymphoid organs and are also circulating in the blood. They have the ability to secrete type I IFN in the presence of a viral infection.
  • tumor cells can promote the growth of tumor cells and their survival, in particular inducing an immunosuppressive environment in the tumor environment, for example by inducing the differentiation of regulatory T cells (Treg).
  • Treg regulatory T cells
  • immunosuppressive properties refers to the properties of dendritic cells to develop and maintain immunosuppression in the tumor environment.
  • tolerogenic properties means that plasmacytoid dendritic cells will not induce an immune response.
  • anti-CD303 antibodies according to the invention by virtue of their cytotoxic action, advantageously makes it possible to eliminate tumor-infiltrating plasmacytoid dendritic cells.
  • the immunosuppressive and / or tolerogenic properties with respect to the tumor are thus diminished, advantageously suppressed, which improves the antitumor immunity in situ.
  • the anti-CD303 antibody according to the invention is a monoclonal antibody directed against the ectodomain of the human CD303 antigen (SEQ ID NO: 86).
  • the anti-CD303 antibody according to the invention comprises heavy chains comprising three CDR-H (heavy chain CDR according to the IMGT nomenclature) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% of identity with the following sequences, and light chains comprising three CDR-Ls (light chain CDRs according to the IMGT nomenclature) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% identity with the following sequences:
  • CDR1 -H-family 1 SEQ ID NO: 1, CDR2-H-family 1: SEQ ID NO: 2, CDR3-H-family 1: SEQ ID NO: 3, CDR1-L-family 1: SEQ ID NO: 4, CDR2-L-family 1: SEQ ID NO: 5, CDR3-L-family 1: SEQ ID NO: 6; or ii) CDR1 -H-family 2: SEQ ID NO: 7, CDR2-H-family 2: SEQ ID NO: 8,
  • CDR3-H-family 2 SEQ ID NO: 9
  • CDR1-L-family 2 SEQ ID NO: 10
  • CDR2-L-family 2 SEQ ID NO: 1
  • CDR3-L-family 2 SEQ ID NO 12.
  • the expression "at least 80% identity” means an identity of 80%, 81%, 82%,
  • the percentages of identity to which reference is made in the context of the present invention are determined on the basis of an overall alignment of the sequences to be compared, that is to say on an alignment of the sequences taken in their entirety over any the length using any algorithm well known to those skilled in the art such as the Needleman and Wunsch-1970 algorithm.
  • This sequence comparison can be performed using any software well known to those skilled in the art, for example the needle software using the parameter "Gap open” equal to 10.0, the parameter "Gap extend” equal to 0.5 and a "Blosum 62" matrix.
  • the needle software is for example available on the ebi.ac.uk world wide website under the name "Align”.
  • the CDR or variable region of an antibody has an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93% , at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of identity with a reference sequence, it may have insertions, deletions or substitutions by compared to the reference sequence.
  • substitution is preferably carried out by an "equivalent" amino acid, that is to say any amino acid whose structure is close to that of the original amino acid and is therefore unlikely to alter the biological activities of the antibody, or an amino acid whose structure differs but whose intrinsic properties are known to be equivalent to those of the original amino acid and not altering by the biological activities of the 'antibody.
  • Table 1 summarizes the amino acid sequences of the CDR-IMGTs of the two families of anti-CD303 antibodies that can be used according to the invention:
  • the anti-CD303 antibody according to the invention comprises three CDR-H (heavy chain CDR according to the IMGT nomenclature) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% identity with the sequences. following, and three CDR-L (light chain CDR according to the IMGT nomenclature) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% identity with the following sequences:
  • CDR1 -H-122A2 SEQ ID NO: 13, CDR2-H-122A2: SEQ ID NO: 14, CDR3-H-122A2: SEQ ID NO: 15, CDR1 -L-122A2: SEQ ID NO: 16, CDR2-L-122A2: SEQ ID NO: 17, CDR3-L-122A2: SEQ ID NO: 18; ii) CDR1 -H-102E9: SEQ ID NO: 19, CDR2-H-102E9: SEQ ID NO: 20, CDR3-H-102E9: SEQ ID NO: 21, CDR1 -L-102E9: SEQ ID NO: 22, CDR2-L-102E9: SEQ ID NO: 23, CDR3-L-102E9: SEQ ID NO: 24; iii) CDR1 -H-104Cl2: SEQ ID NO: 25, CDR2-H-104Cl2: SEQ ID NO: 26, CDR3-H-104Cl2: SEQ ID NO: SEQ
  • the anti-CD303 antibody according to the invention has heavy and light chains whose variable regions have the following amino acid sequences or sequences having at least 80% identity with the following sequences:
  • 122A2 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 43, light chain: SEQ ID NO: 48,
  • 102E9 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 44, light chain: SEQ ID NO: 49, iii) Antibody 104C12: heavy chain: SEQ ID NO: 45, light chain: SEQ ID NO: 50,
  • Antibody 1 14D1 1 heavy chain: SEQ ID NO: 46, light chain: SEQ ID NO: 51, or
  • Antibody 104E10 heavy chain: SEQ ID NO: 47, light chain: SEQ ID NO: 52.
  • Table 2 summarizes the amino acid sequences of the CDRs and variable regions of the heavy and light chains of the anti-CD303 antibodies according to the invention:
  • VL-122A2 DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDQ
  • VL-1 14D1 1 TSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAE
  • VL-104E10 GTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEA
  • the anti-CD303 antibody according to the invention has a human constant region, preferably a human constant region of IgG1 isotype.
  • Table 3 Preferred human heavy and light chain constant region sequences SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54.
  • the anti-CD303 antibody according to the invention advantageously comprises the heavy and light chains described in Table 4 below.
  • the anti-AMHRII antibody is an antibody directed against the anti-Mullerian type II receptor.
  • Human anti-Mullerian hormone is a glycoprotein of 560 amino acids, member of the TGF- ⁇ family. It is a hormone emitted by the Sertoli cells of the fetal testicle, which causes the degeneration of the Muller's canal. It is expressed in adults in Sertoli and Leydig cells (testis) and granulosa cells (ovary). It plays a role in the activity of the adult ovary regulating folliculogenesis. The sequence of human est is accessible in Uniprot under the reference P03971.
  • the receptor for anti-Mullerian hormone type II is a peptide of
  • the anti-AMHRIl antibody according to the invention is derived from murine monoclonal antibody 12G4, described in particular in application WO2008 / 053330.
  • the anti-AMHRI1 antibody according to the invention is a humanized and mutated antibody, or fragments or derivatives thereof, having an affinity at least equal to that of the corresponding non-mutated chimeric antibody and a specificity of to the AMHRII receptor and not triggering an immune reaction.
  • the present invention relates to a humanized monoclonal antibody 12G4 mutated as defined above, having a light chain and a heavy chain chosen from the following:
  • the anti-AMHRIl antibody according to the invention has: a) a light chain comprising or consisting of a variable region whose amino acid sequence is represented by:
  • SEQ ID NO: 68 and a constant region whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 69, b) a heavy chain comprising or consisting of a variable region whose amino acid sequence is represented by:
  • the anti-AMHRI1 antibody according to the invention has: a) a light chain consisting of the amino acid sequence represented by:
  • antibody 3C_23K or, a) a light chain consisting of the amino acid sequence represented by:
  • antibody 4C_35 or, a) a light chain consisting of the amino acid sequence represented by:
  • the anti-AMHRIl antibody according to the invention comprises three CDR-H (heavy chain CDR according to the IMGT nomenclature) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% identity with the following sequences, and three CDR-Ls (light chain CDR according to the IMGT nomenclature) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% identity with the following sequences:
  • CDR1 -H3C_23 GYTFTSHY (SEQ ID NO: 87), CDR2-H3C_23: IYPGDDST (SEQ ID NO: 88), CDR3-H3C_23: TRGDRFAY (SEQ ID NO: 89), CDR1 -L3C_23: SSVRY ( SEQ ID NO: 90), CDR2-L 3C_23: PTS and CDR3-L 3C_23: LQWSSYPWT (SEQ ID NO: 91). These 6 CDRs are those present in the 3C_23 antibody and in the 3C_23K antibody.
  • the anti-AMHRIl antibody according to the invention comprises:
  • the anti-CD303 and anti-AMHRIl antibodies according to the invention may, each independently, be produced in a host cell, a transgenic non-human animal or a transgenic plant comprising at least one nucleic acid encoding such an antibody, its fragments or derivatives, or a vector containing such a nucleic acid.
  • the anti-CD303 antibody and / or the anti-AMHRI1 antibody according to the invention are produced by transgenesis, in particular in a transgenic non-human animal or a transgenic plant.
  • the host cell may be of prokaryotic or eukaryotic origin, and may especially be chosen from bacterial cells, insect cells, plants, yeast or mammals.
  • the antibody according to the invention can then be produced by culturing the host cell under appropriate conditions.
  • a host cell according to the invention can in particular be obtained by transformation of a cell line by the expression vector (s) of the heavy and light chains of an antibody according to the invention, and separation of the different cellular clones. obtained.
  • the transformed cell line is preferably of eukaryotic origin, and may in particular be chosen from insect, plant, yeast or mammalian cells.
  • Cell lines suitable for the production of antibodies include the lines selected from: SP2 / 0; YB2 / 0; IR983F; human myeloma Namalwa; PERC6; the CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-Led O, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, or CHO line deleted for the two alleles coding for the FUT8 gene and / or the GMD gene; Wil-2; Jurkat; Vero; Molt -4; COS-7; 293-HEK; BHK; K6H6; NSO; SP2 / 0-Ag 14, P3X63Ag8.653, cell line of embryonic duck EB66® (Valneva); rat hepatoma lines H4-II-E (DSM ACC3129), and H4-ll-Es (DSM ACC3130) (see WO2012 / 041768), NM-H9D8
  • a non-human transgenic animal according to the invention can be obtained by direct injection of the gene (s) of interest into a fertilized egg (Gordon et al. 1980).
  • a transgenic non-human animal can also be obtained by introducing the gene (s) of interest into an embryonic stem cell and preparing the animal by a chimera aggregation method or a chimeric injection method (see Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)).
  • a transgenic non-human animal can also be obtained by a cloning technique in which a nucleus in which the gene (s) of interest has been introduced is transplanted into an enucleated egg (Ryan et al., 1997; and al-1998, WO00 / 26357).
  • a transgenic non-human animal producing an antibody of interest can be prepared by the above methods. The antibody can then be accumulated in the transgenic animal and purified, in particular from the milk or eggs of the animal.
  • Non-human transgenic animals of interest include the mouse, rabbit, rat, goat, cattle (especially cow), and poultry (including chicken).
  • a transgenic plant according to the invention may be chosen from any plant that allows the production of antibodies. Many antibodies have already been produced in transgenic plants and the technologies necessary to obtain a transgenic plant expressing an antibody of interest and to the recovery of the antibody are well known to those skilled in the art (see Stoger and al-2002, Fisher et al-2003, Ma et al. 2003, Schillberg et al. 2005). It is also possible to influence the glycosylation obtained in plants to obtain glycosylation close to that of natural human antibodies (without xylose), but with, in addition, low fucosylation, for example with the aid of small interfering RNAs (Forthal et al. al, 2010).
  • the anti-CD303 antibody and the anti-AMHRIl antibody are present, according to the invention, either in a pharmaceutical composition or as combination products. They can therefore be combined with pharmaceutically acceptable excipients, and optionally extended release matrices, such as biodegradable polymers.
  • the pharmaceutical composition or the combination product may be administered orally, sublingually, subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intraarterially, intrathecally, intraocularly, intracerebrally, transdermally, pulmonally, locally or rectally.
  • the antibodies can then be administered in unit dosage form, in admixture with conventional pharmaceutical carriers.
  • Unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual and oral forms of administration, aerosols, subcutaneous implants, transdermal, topical, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intrathecal, intranasal administration forms and rectal administration forms.
  • the pharmaceutical composition or the combination product contains a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected. It may be in particular isotonic formulas, sterile, saline solutions, or freeze-dried compositions, which, during the addition of sterilized water or physiological saline as appropriate, allow the constitution of injectable solutions.
  • compositions suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions, oily formulations, and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions.
  • the form must be sterile and must be fluid to the extent that it must be injected by syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi.
  • the dispersions according to the invention can be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols or mixtures thereof, or in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a solvent or dispersion medium.
  • the proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a surfactant.
  • Prevention of the action of microorganisms can be caused by various antibacterial and antifungal agents. In many cases, it will be better to include isotonic agents.
  • Prolonged absorption of the injectable compositions can be caused by the use in the compositions of agents delaying absorption.
  • Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active ingredients in the required amount in the appropriate solvent with several of the other ingredients listed above, if appropriate, followed by sterilization by filtration.
  • the dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle that contains the basic dispersion medium and the other required ingredients from those enumerated above.
  • the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization.
  • the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount.
  • the formulations are easily administered in a variety of dosage forms, such as the injectable solutions described above, but drug release capsules and the like can also be used.
  • aqueous solutions For parenteral administration in an aqueous solution for example, the solution should be suitably buffered and the liquid diluent rendered isotonic with sufficient saline or glucose.
  • aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration.
  • sterile aqueous media that can be used are known to those skilled in the art.
  • the level of therapeutically effective dose specific for a particular patient will depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disease, the activity of the specific compound employed, the specific composition used, the age, the body weight, general health, sex and diet of the patient, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion of the specific compound used, the duration of treatment, or the drugs used in parallel.
  • the pDCs are responsible for the differentiation of T regulators (Moseman EA, 2004, Martin-Gayo E, 2010) inter alia by the ICOS / ICOSL interaction, (Ito, T., 2007, Faget, J. 2012, Faget, J 2013).
  • the T thus differentiated regulators exert mechanisms of immunosuppression on the functions of the other cells of the immune system, in particular the NK cells, via cell / cell contact but also via the secretion of immunomodulatory cytokines such as IL-10, IL-35 and TGF- ⁇ (Liu, C 2016).
  • the protective effect of anti-CD303 antibodies targeting pDCs can be demonstrated by the correlative study of the decrease or elimination of cytokines IL-10 and TGF- ⁇ in the tumor environment and its impact on the effector functions of an anti-cancer agent administered, specific for the tumor (anti-AMHRIl antibody).
  • the anti-CD303 antibodies depleting the pDCs lead to a limitation of the immunosuppressive effects of regulatory T and thus a limitation of their secretion of IL-10 and TGF- ⁇ .
  • This limitation of secretion of IL-10 and TGF- ⁇ is correlated with a better ADCC of the NK cells, validating the indirect stimulatory effect of the anti-CD303 antibodies on the anti-cancer action of the anti-AMHRIl antibodies.
  • NK-CD16 CD16-transfected NK effector cells
  • NK-CD16 cells were cultured in culture medium without IL-2, in the absence or in the presence of IL-10 (5, 50 or 120 ng / ml) and TGF- ⁇ (5 , 50 or 120 ng / ml).
  • IL-10 5, 50 or 120 ng / ml
  • TGF- ⁇ 5 , 50 or 120 ng / ml.
  • COV434 cells 35000 cells / well) expressing AMHRII are incubated in a flat-bottomed 96-well plate with NK-CD16 cells, with an E / C ratio (Effector - NK / Target - COV434) equal to 5 / 1 and 5000 ng / ml anti-AMHRIl antibody.
  • the negative control corresponds to the same protocol in which the anti-AMHRI1 is replaced by an anti-FVI II chimeric antibody produced in YB2 / 0.
  • the lysis of the target cells induced by the anti-AMHRIl antibodies is measured chromogenic by quantifying the intracellular enzyme lactate dehydrogenase (LDH) released into the supernatant by lysed target cells (Roche Diagnostics - Cytotoxicity Detection Kit LDH).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • % lysis [(ER - SR) / (100 - SR)] - [(NC - SR) / (100 - SR)]
  • ER and SR respectively represent the experimental (ER) and spontaneous (SR) release of LDH
  • NC represents the natural cytotoxicity of NK cells.
  • the results (% lysis) are expressed as a percentage, 100% being the value taken as a reference, obtained with NK-CD16 cells in the presence of anti-AMHRIl antibodies and in the absence of IL-10 and TGF- ⁇ (ie anti-AMHRIl antibody alone).
  • the monocytes are differentiated into CD16 + macrophages (M2 like) for 2 days in RPMI 1640 + 10% FCS + M-CSF 50 ng / ml for 48 hours.
  • SKBR3 and macrophage cells are labeled with PKH-67 (green fluorescence) and PKH-26 (red fluorescence), respectively.
  • the SKBR3 cells are opsonized with 10 ⁇ g / ml of the AMHRII antibody or with an irrelevant antibody and then incubated with the macrophages (1 .105 of each cell / well) in the absence or in the presence of different concentrations of IL-10 (5). and 50 ng / ml) alone, TGF- ⁇ (5 and 50 ng / ml) alone and IL-10 + TGF- ⁇ (5 and 50 ng / ml).
  • the cells After 3h incubation at 37 ° C, the cells are placed on a counting cell (Mallassez) and observed with a fluorescence microscope.
  • a counting cell Malassez
  • the percentage of phagocytosis is evaluated by counting the number of macrophages (at least 100 macrophages) containing COV434 cells.
  • PBMC Mononucleated cells
  • beads coated with anti-CD3 / anti-CD28 to stimulate proliferation T are added in a ratio Treg / beads of 4/1 to verify the activation of Treg.
  • Treg cells (CD4 + , CD25 + ) are purified from PBMC by a two-step process: depletion of CD4 negative cells (CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 positive cells) , TCRy / ⁇ , and CD235a) then positive selection of CD25 + cells.
  • Purified pDC or pDC lines are added in a Treg / pDC ratio of 100, 10 and 1.
  • Different amounts of the anti-CD303 antibody (from 1 ng to 10 ⁇ g / ml) are added to the Treg / pDC mixture in the presence of IL-2 (500 U / ml).
  • the number of Tregs and their phenotype is monitored over time (1 to 4 days).
  • beads coated with anti-CD3 / anti-CD28 to stimulate proliferation T are added in a ratio Treg / beads of 4/1 to verify the activation of Treg.
  • a negative control in the absence of pDC is established, in order to check the impact (expected neutral) of the anti-CD303 directly on the Tregs.
  • Example 3 Depletion of human pDCs via an anti-CD303 antibody in vivo in the treatment of ovarian cancer
  • HTM humanized mouse model mouse model
  • This model advantageously brings together several elements that are relevant for the reproducibility of the in vivo conditions: presence of human pDCs which alone express on their surface the target CD303, presence of infiltration of human Treg cells, presence of human tumor cells expressing on their surface AMHRII , molecule targeted by an anti-AMHRIl and an immunocompetent murine host (NK effector cells for ADCC activity).
  • the model described previously in the article Wege et al (Int J Cancer 201 1: 129, 2194-2206) combines all these characteristics.
  • BRGSF TM or BRGSF TM -A2 mice BALB / c, Rag2tm1 Fwa, IL-2Ryctm1 Cgn, SIRPocNOD, Flk2tm1 lrl, Tg (HLA-A / H2-D / B2M) 1 Bpe
  • BRGSF TM or BRGSF TM -A2 mice may be generated according to the procedure described by Legrand N, Huntington ND, Nagasawa M et al.
  • HLA-A2.1 -restricted education and cytolytic activity of CD8 (+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 single-stranded transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med 185: 2043-2051).
  • mice from the BRGSF-A2 immunodeficient mouse line (BALB / c Rag2 tm1 Fwa IL-2Ry c tm1 C9n SIRPoc NOD Flk2 tm1 lrl Tg (HLA-A / H2-D / B2M) 1 Bpe are irradiated (3 Gy) during their first 192 hours of life and 24 hours later they are transplanted by intrahepatic injection with 1.5x10 5 human CD34 + cells isolated from umbilical cord blood (RBC).
  • BRC umbilical cord blood
  • COV434-AMHRII-Luc tumor cells are cells of human origin resulting from ovarian carcinoma expressing on their surface the AMHRII receptor, the target of the anti-AMHRII antibody
  • the COV.434 cells were, before their administration, modified by lentiviral transduction in order to make them luminescent thanks to the constitutive expression of luciferase This modification allows a c Transverse control during the time of tumor uptake through the analysis of bioluminescence while not sacrificing animals and thus adjust the window of the beginning of treatment.
  • mice are tested for their degree of humanization by analysis of the composition of cells present in their blood (human and murine) by flow cytometry and then divided into five groups.
  • different see table below: a control group without injection of COV434 cells treated with an isotype antibody (ie an anti-Factor VIII antibody) (this group serves as a negative control to the taking of tumors) (group 1), an injection control group of COV434 cells treated with an isotype antibody (ie an anti-Factor VIII antibody) (group 2), a group treated with anti-transgenic anti-AMHRI1 (AATG) group 3), a group treated with the anti-CD303 antibody (group 4) and a group treated with the combination of anti-CD303 and AATG antibody treatments (group 5).
  • the doses used and the treatment frequencies are indicated in the table below:
  • the treatment begins 14 weeks after humanization (ie injection of human CD34 + cells isolated from umbilical cord blood (CB) in the presence or absence of 3x10 6 COV434-AMHRII-Luc tumor cells) and lasts 19 weeks.
  • the treatment consists of the injection of the products tested intravenously at a dose of 30 mg / kg of body weight in the case of the anti-CD303 antibody every 3 days and once a week at 10 mg / kg of weight. in the case of the AATG antibody.
  • the body weight of the mice is determined 3 days before the start of treatment to adjust the dose individually.
  • the impact of the treatment on the human pDC subpopulation as well as the other populations of lymphoid cells (B lymphocytes, T lymphocytes, etc.) present in the blood and the spleen was determined by flow cytometry at different times: , j3 and j7.
  • the results show that treatment with anti-CD303 antibody at a dose of 30 mg / kg in humanized BRGSF-HIS mice induces depletion of human pDCs for at least 7 days in the blood and spleen. In blood, depletion activity of human pDCs was rapid (> 80% on day 1) and later in the spleen.
  • the adapted HTM murine model can be advantageously used to evaluate the indirect effect of the administration of an anti-CD303 antibody on the effect of the ovarian anti-tumor agent, the anti-AMHRIl antibody, in conditions reproducing a physiological situation in vivo, by comparing in particular the results obtained with the different groups tested.
  • This model is thus useful for evaluating the benefit, advantageously the synergistic effect, of administering an anti-CD303 antibody in combination with the administration of an anti-AMHRI1 antibody in an ovarian tumor.

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Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable : a. au moins un anticorps anti-CD303; et b. au moins un anticorps anti-AMHRII. La présente invention est également relative à l'association des deux anticorps a) et b) susmentionnés comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.

Description

Combinaison d'anticorps anti-CD303 et anti-AMHRIl
La présente invention a pour objet une nouvelle combinaison d'anticorps, notamment pour la prévention ou le traitement de cancers urogénitaux, de préférence le cancer de l'ovaire.
Le cancer de l'ovaire est la cause principale des cancers gynécologiques, et constitue la cinquième cause de mortalité par cancer chez la femme, dont les trois origines histologiques sont les suivantes :
- l'épithélium de surface (tumeur épithéliale avec différents sous-types) qui représente 85-90 % des cancers ovariens,
- les cordons sexuels / stroma (tumeur de la granulosa (3% des cancers ovariens totaux)), qui représentent environ 10 % des tumeurs ovariennes, et
- les cellules germinales qui représentent 5 % des cancers ovariens.
Il est généralement asymptomatique pendant les premiers stades, ce qui lui vaut le surnom de « silent killer » (La Marca A., Volpe A. The Anti-Mullerian hormone and ovarian cancer. Human Reproduction Update, Vol.13, No.3 pp. 265-273, 2007).
D'après la classification FIGO (Fédération internationale de Gynécologie et d'Obstétrique), il existe 4 stades pour lesquels le taux de survie diminue fortement dès le stade 2:
Stade I: Tumeur limitée aux ovaires (taux de survie à 5 ans: 90-70%),
Stade II: Tumeur dans un ou deux ovaires avec extension pelvienne (taux de survie à 5 ans : 70-40%),
Stade III: Tumeur dans un ou deux ovaires avec extension extra pelvienne (taux de survie à 5 ans : 20%), et
Stade IV: Métastases à distance à l'exclusion des métastases péritonéales (taux de survie à 5 ans : <10%).
Les principales stratégies actuelles utilisées pour le traitement du cancer ovarien sont la chirurgie et la chimiothérapie, en particulier en première ligne, tel qu'un mélange carboplatine et paclitaxel.
Des anticorps monoclonaux ont également été récemment développés tel que le cetuximab, qui est dirigé contre le récepteur du facteur de croissance épidermique
(EGFR, Ozols R. F. et al., Focus on epithelial ovarian cancer, Cancer Cell. 2004, Jan ;
5(1 ) : 19-24). D'autres immunothérapies sont actuellement à l'étude, telles que celles avec l'abagovomab dirigé contre le CA-125, le bevacizumab dirigé contre le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF-A), le farletuzumab, dirigé contre le récepteur alpha folique (FRA), ou des anticorps humanisés mutés anti-AMHRIl (WO201 1 /141653). Des thérapies ciblées, par exemple avec olaparib, sont également testées.
Il existe cependant toujours un besoin pour optimiser la thérapie du cancer de l'ovaire, notamment lorsque le cancer présente une invasion de cellules effectrices susceptibles d'induire une tolérance du cancer par le système immunitaire, tout en identifiant une thérapie qui soit mieux tolérée, et qui présente moins d'effets secondaires.
Les inventeurs ont maintenant découvert que, de façon surprenante, l'association d'un anticorps anti-CD303 et d'un anticorps anti-AMHRIl, est particulièrement efficace contre les tumeurs ovariennes. Notamment, la combinaison de ces deux anticorps peut présenter un effet synergique sur le site de la tumeur.
La présente invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable :
a. au moins un anticorps anti-CD303; et
b. au moins un anticorps anti-AMHRIl.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant :
a. au moins un anticorps anti-CD303; et
b. au moins un anticorps anti-AMHRIl,
comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
L'invention concerne encore :
- au moins un anticorps anti-AMHRIl pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de cancers urogénitaux en combinaison avec au moins un anticorps anti- CD303; et
au moins un anticorps anti-CD303 pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de cancers urogénitaux en combinaison avec au moins un anticorps anti- AMHRII.
L'invention concerne également une méthode de traitement de cancers urogénitaux, qui comprend l'administration à un patient d'au moins un anticorps anti- AMHRIl et d'au moins un anticorps anti-CD303. Selon la présente invention, le terme « anticorps » fait référence aussi bien à une immunoglobuline, qu'aux fragments et dérivés de cette immunoglobuline. Les immunoglobulines sont bien connues de l'homme du métier et sont constituées d'un assemblage de deux dimères constitués chacun d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère. Le complexe multimérique est assemblé par la liaison d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant elles-mêmes également reliées entre elles par deux ponts disulfures.
Chacune des chaînes lourdes et des chaînes légères est constituée d'une région constante et d'une région variable. Plus précisément, chaque chaîne légère est constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). Chaque chaîne lourde est constituée d'une région variable (VH) et d'une région constante constituée de trois domaines constants CHi , CH2 et CH3. Les domaines CH2 et CH3 composent le domaine Fc. Les régions variables de la chaîne légère et de la chaîne lourde sont constituées de trois domaines déterminant la reconnaissance de l'antigène (régions CDR, i.e. Complementary Determining Régions) entourées de quatre domaines charpentes (régions FR ou Framework).
Les anticorps anti-CD303 a) et anti-AMHRIl b) peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. De préférence, ce sont des anticorps monoclonaux.
Les anticorps peuvent être de plusieurs isotypes, en fonction de la nature de leur région constante : les régions constantes γ, α, μ, ε et δ correspondent respectivement aux immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. Avantageusement, les anticorps anti-CD303 a) et anti-AMHRIl b) sont d'isotype IgG. En effet, cet isotype montre une capacité à induire efficacement une activité ADCC (« Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity », soit Cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps) chez le plus grand nombre d'individus (humains). Les régions constantes γ comprennent plusieurs sous-types : γ1 , γ2, γ3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, et γ4, créant ainsi les sous-isotypes lgG1 , lgG2, lgG3, et lgG4. Avantageusement, les anticorps anti-CD303 a) et anti-AMHRIl b) sont d'isotype lgG1 ou lgG2, de préférence lgG1 .
Dans un aspect particulier de l'invention, les anticorps anti-CD303 a) et anti- AMHRIl b) sont choisis parmi les anticorps murins, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps humains.
De préférence, l'anticorps anti-CD303 a) est un anticorps chimérique, et plus préférentiellement un anticorps chimérique choisi parmi un anticorps chimérique murin/humain ou un anticorps chimérique humain/macaque. Alternativement, de préférence, l'anticorps anti-CD303 a) est un anticorps humanisé, en particulier un anticorps chimérique dont la région constante des chaînes lourdes et légères est d'origine humaine.
Le terme « anticorps chimérique » fait référence à un anticorps isolé, dans lequel la séquence de chaque chaîne légère et/ou de chaque chaîne lourde qui le constitue comprend ou consiste en une séquence hybride issue d'au moins deux animaux distincts. Notamment, un anticorps chimérique contient une région variable de chaîne légère et une région variable de chaîne lourde sauvages murines, fusionnées avec les régions constantes humaines de chaîne légère et de chaîne lourde respectivement. Un anticorps chimérique peut être préparé en utilisant les techniques de recombinaison génétique bien connues de l'homme du métier.
Le terme « anticorps humanisé » fait référence à un anticorps issu d'un animal autre que l'homme dans lequel les séquences des chaînes lourdes et des chaînes légères autres que les CDR ont été remplacées par des séquences correspondantes d'un ou plusieurs anticorps d'origine humaine. L'anticorps est donc majoritairement constitué de séquences humaines, mais sa spécificité pour l'antigène conférée par les CDRs est issue d'une autre espèce. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al- 1986 ; Verhoeyen et al- 1988 ; Riechmann et al-1988). Les anticorps humanisés selon l'invention peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art telles les technologies de « CDR grafting », de « resurfacing », de SuperHumanisation, de « Human string content », de « FR libraries », de « Guided sélection », de « FR shuffling » et de « Humaneering », comme résumé dans la revue de Almagro et al-2008. Comme indiqué ci-dessus, l'anticorps anti-CD303 et/ou l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention peut également être présents sous la forme d'un fragment d'anticorps anti-CD303 et/ou d'un fragment d'anticorps anti-AMHRIl, respectivement.
Le terme « fragment » fait en particulier référence aux fragments Fab, F(ab)'2 ou
Fd.
Le terme « Fab » fait référence à un fragment d'anticorps de masse moléculaire d'environ 50.000 Da et possédant une activité de liaison à l'antigène. Le fragment Fab est formé de la chaîne légère en entier (VL+CL) et d'une partie de la chaîne lourde (VH+CH1 ). Il peut être obtenu notamment par traitement des IgG par une protéase, la papaïne.
Le terme « F(ab')2 » fait référence à un fragment d'environ 100.000 Da et possédant une activité de liaison à l'antigène. Il correspond à l'association par un pont disulfure (région charnière) de deux fragments Fab décrits ci-dessus. Il peut être obtenu par le traitement des IgG par une protéase, la pepsine.
Le terme « Fd » correspond à la partie de la chaîne lourde qui est incluse dans le fragment Fab. Le fragment Fd est ainsi formé des domaines VH et CH1 .
Comme indiqué ci-dessus, l'anticorps anti-CD303 et/ou l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention peut également être présent sous la forme d'un dérivé d'anticorps anti- CD303 a) et/ou d'un dérivé d'anticorps anti-AMHRIl b), respectivement.
Le terme « dérivé » fait en particulier référence aux dérivés scFv, et aux multimères de scFv, comme le diabody, triabody ou tetrabody.
Le terme « scFv » (single chain Fv) est un polypeptide VH:VL synthétisé en utilisant les gènes codant pour les domaines VL et VH et une séquence linker. Un scFv inclut les CDR maintenus dans une conformation appropriée, par exemple en utilisant des techniques de recombinaison génétique.
Les scFv peuvent également servir de modules de base pour le développement de structures multimériques (dimérique : « diabody », trimérique : « triabody », tétramérique : « tetrabody »).
Le terme « diabody » fait référence à un dimère de scFv. Ce dimère de fragment a la propriété de maintenir la double valence que l'anticorps parent possède. Le diabody est bivalent, mono ou bispécifique selon qu'il fixe deux antigènes identiques ou différents.
Le terme « triabody » fait référence à l'association trivalente de scFv. Un triabody peut ainsi fixer trois antigènes identiques ou différents.
Le terme « tétrabody » fait référence à l'association tétravalente de scFv. Un tétrabody peut fixer quatre antigènes identiques ou différents.
Le terme « cancers urogénitaux » fait référence aux cancers de l'appareil uro- génital dans les organes masculins ou féminins. Il s'agit par exemple du cancer de la prostate, du cancer du testicule, du cancer du pénis, du cancer de l'endomètre, du cancer de la vulve et du vagin, du cancer de l'utérus, du cancer du col de l'utérus, du cancer de l'ovaire, du cancer du rein, du cancer de la vessie. De préférence, le cancer urogénital est le cancer de l'ovaire.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un anticorps anti-CD303, et au moins un fragment ou un dérivé d'anticorps anti-AMHRIl. La présente invention se rapporte également à des produits contenant au moins un anticorps anti-CD303, et au moins un fragment ou un dérivé d'anticorps anti-AMHRIl, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un fragment d'anticorps anti-CD303, et au moins un anticorps anti-AMHRIl ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant au moins un fragment d'anticorps anti-CD303, et au moins un anticorps anti-AMHRIl ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un dérivé d'anticorps anti-CD303, et au moins un anticorps anti-AMHRIl ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant au moins un dérivé d'anticorps anti-CD303, et au moins un anticorps anti-AMHRIl ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un anticorps anti-AMHRIl, et au moins un fragment ou un dérivé d'anticorps anti-CD303.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant au moins un anticorps anti-AMHRI l, et au moins un fragment ou un dérivé d'anticorps anti-CD303, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un fragment d'anticorps anti-AMHRIl, et au moins un anticorps anti-CD303 ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant au moins un fragment d'anticorps anti-AMHRIl, et au moins un anticorps anti-CD303 ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins un dérivé d'anticorps anti-AMHRIl, et au moins un anticorps anti-CD303 ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant au moins un dérivé d'anticorps anti-AMHRIl, et au moins un anticorps anti-CD303 ou l'un de ses fragments ou l'un de ses dérivés, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
La présente invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable :
a. au moins un anticorps anti-CD303; et
b. au moins un anticorps anti-AMHRIl.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend un milieu non toxique compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme.
L'invention se rapporte également à un produit contenant les deux agents actifs a) et b) susmentionnés, lesdits actifs étant combinés pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, et dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
Anticorps anti-CD303
L'anticorps anti-CD303 est un anticorps dirigé contre la protéine CD303. Cette protéine, également nommée BDCA-2, est exprimée de manière spécifique à la surface des cellules dendritiques plasmacytoïdes, et est une protéine de type II appartenant aux lectines de type C.
L'antigène CD303 humain (ou protéine CD303) est le membre C de la 4ème famille de domaine lectine de type C (CLEC4 ou « C-type lectin domain family 4, member C »). Il s'agit d'une glycoprotéine transmembranaire de type II de 213 acides aminés (accessible dans Uniprot : Q8WTT0), comprenant un court domaine cytoplasmique sans motif de signalisation évident (acides aminés 1 -21 ), une région transmembranaire (acides aminés 22-44), et un domaine extracellulaire (acides aminés 45-213).
Les cellules dendritiques plasmacytoïdes correspondent à une sous-population de cellules dendritiques, aussi appelée DC2. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont caractérisées par les marqueurs Lin- (CD3-, CD19-, CD20-, CD14-, CD56-), HLA-DR+, CD1 1 c-, CD123+ et CD45RA+. Ces cellules ont aussi été caractérisées phénotypiquement : elles expriment les marqueurs CD4, CD303 et BDCA-4. Elles sont présentes dans les organes lymphoïdes et sont également en circulation dans le sang. Elles ont la capacité de sécréter de l'IFN de type I en présence d'une infection virale. Elles peuvent favoriser la croissance des cellules tumorales et leur survie, en induisant notamment un environnement immunosuppressif dans l'environnement de la tumeur, par exemple en induisant la différenciation de lymphocytes T régulateurs (Treg). Ainsi, ces cellules présentent des propriétés immunosuppressives et/ou tolérogènes vis-à-vis de la tumeur. L'expression « propriétés immunosuppressives » se réfère aux propriétés des cellules dendritiques de développer et maintenir l'immunosuppression dans l'environnement de la tumeur. L'expression « propriétés tolérogènes » signifie que les cellules dendritiques plasmacytoïdes ne vont pas induire de réponse immunitaire.
L'utilisation d'anticorps anti-CD303 selon l'invention, par leur action cytotoxique, permet avantageusement de supprimer les cellules dendritiques plasmacytoïdes infiltrant la tumeur. Les propriétés immunosuppressives et/ou tolérogènes vis-à-vis de la tumeur sont ainsi diminuées, avantageusement supprimées, ce qui améliore l'immunité antitumorale in situ. De préférence, l'anticorps anti-CD303 selon l'invention est un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain (SEQ ID NO :86).
Avantageusement, l'anticorps anti-CD303 selon l'invention comprend des chaînes lourdes comprenant trois CDR-H (CDR de chaîne lourde selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes, et des chaînes légères comprenant trois CDR-L (CDR de chaîne légère selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :
i) CDR1 -H-famille 1 : SEQ ID NO : 1 , CDR2-H-famille 1 : SEQ ID NO : 2, CDR3-H-famille 1 : SEQ ID NO : 3, CDR1 -L-famille 1 : SEQ ID NO : 4, CDR2-L-famille 1 : SEQ ID NO : 5, CDR3-L-famille 1 : SEQ ID NO : 6; ou ii) CDR1 -H-famille 2 : SEQ ID NO : 7, CDR2-H-famille 2: SEQ ID NO : 8,
CDR3-H-famille 2: SEQ ID NO : 9, CDR1 -L-famille 2: SEQ ID NO : 10, CDR2-L-famille 2: SEQ ID NO : 1 1 , CDR3-L-famille 2: SEQ ID NO : 12. L'expression « au moins 80% d'identité » signifie une identité de 80%, 81 %, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%. Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence dans le cadre de la présente invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute la longueur en utilisant tout algorithme bien connu de l'homme du métier tel que l'algorithme de Needleman et Wunsch-1970. Cette comparaison de séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, par exemple le logiciel needle en utilisant le paramètre « Gap open » égal à 10.0, le paramètre « Gap extend » égal à 0.5 et une matrice « Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide sous la dénomination « Align ».
Lorsque le CDR ou la région variable d'un anticorps possède une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% d'identité avec une séquence de référence, elle peut présenter des insertions, délétions ou substitutions par rapport à la séquence de référence. Lorsqu'il s'agit de substitutions, la substitution est de préférence réalisée par un acide aminé « équivalent », c'est-à-dire tout acide aminé dont la structure est proche de celle de l'acide aminé d'origine et est donc peu probable de modifier les activités biologiques de l'anticorps, ou un acide aminé dont la structure diffère mais dont les propriétés intrinsèques sont connues pour être équivalentes à celles de l'acide aminé d'origine et ne modifiant par les activités biologiques de l'anticorps.
Le Tableau 1 ci-dessous résume les séquences d'acides aminés des CDR-IMGT des deux familles d'anticorps anti-CD303 pouvant être utilisées selon l'invention :
Famille 1 Famille 2
CDR1 -H GYTFTDYS (SEQ ID NO :1 ) GYTFTDXS (SEQ ID NO :7)
CDR2-H ISXYYGDX (SEQ ID NO :2) INTETGXP (SEQ ID NO :8)
ARNXXXYXXXY (SEQ ID XRNGYYVGYYAXDY (SEQ ID
CDR3-H
NO :3) NO :9) CDR1 -L QDIXNY (SEQ ID NO :4) SSVXY (SEQ ID NO :10)
CDR2-L YTS (SEQ ID NO :5) STS (SEQ ID NO :1 1 )
CDR3-L QQGXTLPWT (SEQ ID NO :6) QQRRSYPXT (SEQ ID NO :12)
Tableau 1 . Séquences d'acides aminés des CDR des deux familles d'anticorps anti-CD303 pouvant être utilisées selon l'invention selon la nomenclature IMGT. Dans chaque séquence, X peut représenter n'importe quel acide aminé.
Avantageusement, l'anticorps anti-CD303 selon l'invention comprend trois CDR-H (CDR de chaîne lourde selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes, et trois CDR-L (CDR de chaîne légère selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :
i) CDR1 -H-122A2 : SEQ ID NO : 13, CDR2-H-122A2: SEQ ID NO : 14, CDR3-H-122A2: SEQ ID NO : 15, CDR1 -L-122A2: SEQ ID NO : 16, CDR2- L-122A2: SEQ ID NO : 17, CDR3-L-122A2: SEQ ID NO : 18; ii) CDR1 -H-102E9 : SEQ ID NO : 19, CDR2-H-102E9: SEQ ID NO : 20, CDR3-H-102E9: SEQ ID NO : 21 , CDR1 -L-102E9: SEQ ID NO : 22, CDR2- L-102E9: SEQ ID NO : 23, CDR3-L-102E9: SEQ ID NO : 24; iii) CDR1 -H-104C12 : SEQ ID NO : 25, CDR2-H-104C12: SEQ ID NO : 26, CDR3-H-104C12: SEQ ID NO : 27, CDR1 -L-104C12: SEQ ID NO : 28, CDR2-L-104C12: SEQ ID NO : 29, CDR3-L-104C12: SEQ ID NO : 30; iv) CDR1 -H-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 31 , CDR2-H-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 32, CDR3-H-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 33, CDR1 -L-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 34, CDR2-L-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 35, CDR3-L-1 14D1 1 : SEQ ID NO : 36; ou v) CDR1 -H-104E10: SEQ ID NO: 37, CDR2-H-104E10: SEQ ID NO: 38, CDR3-H-104E10: SEQ ID NO: 39, CDR1 -L-104E10: SEQ ID NO: 40, CDR2-L-104E10: SEQ ID NO: 41 , CDR3-L-104E10: SEQ ID NO : 42.
Avantageusement, l'anticorps anti-CD303 selon l'invention possède des chaînes lourdes et légères dont les régions variables ont les séquences d'acides aminés suivantes ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :
i) Anticorps 122A2: chaîne lourde : SEQ ID NO : 43, chaîne légère : SEQ ID NO : 48,
ii) Anticorps 102E9: chaîne lourde : SEQ ID NO : 44, chaîne légère : SEQ ID NO : 49, iii) Anticorps 104C12: chaîne lourde : SEQ ID NO : 45, chaîne légère : SEQ ID NO : 50,
iv) Anticorps 1 14D1 1 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 46, chaîne légère : SEQ ID NO : 51 , ou
v) Anticorps 104E10: chaîne lourde : SEQ ID NO : 47, chaîne légère : SEQ ID NO : 52.
Le Tableau 2 ci-dessous résume les séquences d'acides aminés des CDRs et des régions variables des chaînes lourdes et légères des anticorps anti-CD303 selon l'invention :
Anticorps 122A2
Chaîne lourde
CDR1 -H-IMGT-122A2 GYTFTDYS (SEQ ID NO : 13)
CDR2-H-IMGT-122A2 ISTYYGDS (SEQ ID NO : 14)
CDR3-H-IMGT-122A2 ARNGNFYVMDY (SEQ ID NO : 15)
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYSMHWVK QSHAKSLEWIGVISTYYGDSNYNQKFKGKATMTVDKSST
VH-122A2
TAYMELARLTSEDSAIYYCARNGNFYVMDYWGQGTSVTV SS (SEQ ID NO : 43)
Chaîne légère
CDR1 -L-IMGT-122A2 QDISNY (SEQ ID NO : 16)
CDR2-L-IMGT-122A2 YTS (SEQ ID NO : 17)
CDR3-L-IMGT-122A2 QQGNTLPWT (SEQ ID NO : 18)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKP
VL-122A2 DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDQ
EDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 48)
Anticorps 102E9
Chaîne lourde
CDR1 -H-IMGT-102E9 GYTFTDYS (SEQ ID NO : 19)
CDR2-H-IMGT-102E9 INTETGEP (SEQ ID NO : 20)
CDR3-H-IMGT-102E9 TRNGYYVGYYAMDY (SEQ ID NO : 21 )
QIHLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQ APGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLESSAST
VH-102E9
AFLQINNLKNEDTSTYFCTRNGYYVGYYAMDYWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO : 44) Chaîne légère
CDR1 -L-IMGT-102E9 SSVIY (SEQ ID NO : 22)
CDR2-L-IMGT-102E9 STS (SEQ ID NO : 23)
CDR3-L-IMGT-102E9 QQRRSYPFT (SEQ ID NO : 24)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVIYIHWFQQKPGT
VL-102E9 SPKLWIYSTSYLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAED
AATYYCQQRRSYPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 49)
Anticorps 104C12
Chaîne lourde
CDR1 -H-IMGT-104C12 GYTFTDYS (SEQ ID NO : 25)
CDR2-H-IMGT-104C12 ISPYYGDT (SEQ ID NO : 26)
CDR3-H-IMGT-104C12 ARNDDYYRFAY (SEQ ID NO : 27)
QVQLQQSGAELVGPGVSVKISCKGSGYTFTDYSMHWVK QSHAKSLEWIGVISPYYGDTNYNQKFKGKATMTVDKSSS
VH-104C12
TAYMELASLTSEDSAIYFCARNDDYYRFAYWGQGTLVTV SA (SEQ ID NO : 45)
Chaîne légère
CDR1 -L-IMGT-104C12 QDINNY (SEQ ID NO : 28)
CDR2-L-IMGT-104C12 YTS (SEQ ID NO : 29)
CDR3-L-IMGT-104C12 QQGKTLPWT (SEQ ID NO : 30)
DLQMTQTPSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLSWYQEK PDGTFKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTVRNLE
VL-104C12
QEDIGTYFCQQGKTLPWTFGGGTKLEIR (SEQ ID NO : 50)
Anticorps 114D11
Chaîne lourde
CDR1 -H-IMGT-1 14D1 1 GYTFTDSS (SEQ ID NO : 31 )
CDR2-H-IMGT-1 14D1 1 INTETGGP (SEQ ID NO : 32)
CDR3-H-IMGT-1 14D1 1 ARNGYYVGYYALDY (SEQ ID NO : 33)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDSSMHWVQQ APNKGLKWMGWINTETGGPTYADDFKGRFAFSLETSART
VH-1 14D1 1
AYLQ I N N LKN E DTATYFCARNG YYVG YYALDYWGQGTS V TVSS (SEQ ID NO : 46)
Chaîne légère
CDR1 -L-IMGT-1 14D1 1 SSVFY (SEQ ID NO : 34) CDR2-L-IMGT-1 14D1 1 STS (SEQ ID NO : 35)
CDR3-L-IMGT-1 14D1 1 QQRRSYPYT (SEQ ID NO : 36)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVFYMHWFQQKPG
VL-1 14D1 1 TSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAE
DAATYYCQQRRSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 51 )
Anticorps 104E10
Chaîne lourde
CDR1 -H-IMGT-104E10 GYTFTDYS (SEQ ID NO : 37)
CDR2-H-IMGT-104E10 INTETGEP (SEQ ID NO : 38)
CDR3-H-IMGT-104E10 ARNGYYVGYYAMDY (SEQ ID NO : 39)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQ APGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSATT
VH-104E10
AYLQINNFKNE DTAT YFC AR NG YYVG YYAM D YWGQGTS VTVSS (SEQ ID NO : 47)
Chaîne légère
CDR1 -L-IMGT-104E10 SSVIY (SEQ ID NO : 40)
CDR2-L-IMGT-104E10 STS (SEQ ID NO : 41 )
CDR3-L-IMGT-104E10 QQRRSYPYT (SEQ ID NO : 42)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVIYMHWFQQKP
VL-104E10 GTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEA
EDAATYYCQQRRSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO : 52)
Tableau 2. Séquences d'acides aminés des CDR1 , CDR2, et CDR3 des chaînes lourdes et légères selon la nomenclature IMGT, et des fragments VH et VL des anticorps anti-CD303 selon l'invention. De préférence, l'anticorps anti-CD303 selon l'invention présente une région constante humaine, préférentiellement une région constante humaine d'isotype lgG1 .
Les séquences préférées de région constante des chaînes lourde ou légère humaines, SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54, d'isotype lgG1 , sont présentées dans le Tableau 3 ci-dessous.
Région ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL constante de TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK chaîne lourde VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP humaine EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV préférée (lgG1 ) VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO :53)
Région
constante de RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA chaîne légère LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ humaine GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO :54)
préférée (lgG1 )
Tableau 3 \. Séquences préférées de région constante de chaînes lourde et légère humaines SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54.
Ainsi, l'anticorps anti-CD303 selon l'invention comprend avantageusement les chaînes lourde et légère décrites dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4. Séquences d'acides aminés des chaînes lourdes et légères des anticorps anti-CD303 selon l'invention.
Anticorps anti-AMHRIl L'anticorps anti-AMHRII est un anticorps dirigé contre le récepteur de l'hormone anti-mullérienne de type II.
L'hormone anti-mullérienne humaine (AMH) est une glycoprotéine de 560 acides aminés, membre de la famille des TGF-β. C'est une hormone émise par les cellules de Sertoli du testicule fœtal, qui provoque la dégénérescence du canal de Muller. Elle est exprimée chez l'adulte dans les cellules de Sertoli et de Leydig (testicule) et les cellules de la granulosa (ovaire). Elle joue un rôle dans l'activité de l'ovaire adulte de régulation de la folliculogenèse. La séquence de ΓΑΜΗ humaine est accessible dans Uniprot sous la référence P03971 .
Le récepteur de l'hormone anti-mullérienne de type II (AMHR-II) est un peptide de
573 acides aminés et possède une activité sérine-thréonine kinase. Il est impliqué dans la régression du canal de Muller associé au développement du système de reproduction de l'homme. Il s'atrophie chez l'homme où il ne forme que l'utricule prostatique et l'hydatide sessile, mais persiste chez la femme où il est à l'origine des trompes, de l'utérus et de la plus grande partie du vagin. Ce récepteur est fréquemment exprimé sur les cellules épithéliales tumorales d'ovaire humaines et les tumeurs de la granulosa. La séquence de l'AMHRIl humaine est accessible dans Uniprot sous la référence Q16671 .
De préférence, l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention dérive de l'anticorps monoclonal murin 12G4, décrit notamment dans la demande WO2008/053330.
De préférence, l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention est un anticorps humanisé et muté, ou des fragments ou dérivés de celui-ci, possédant une affinité au moins égale à celle de l'anticorps chimérique correspondant non muté et une spécificité vis-à-vis du récepteur AMHRII et ne déclenchant pas de réaction immune.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un anticorps monoclonal humanisé 12G4 muté tel que défini ci-dessus, possédant une chaîne légère et une chaîne lourde choisies parmi les suivantes:
De préférence, l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention présente : a) une chaîne légère comprenant ou constituée d'une région variable dont la séquence en acides aminés est représentée par:
- SEQ ID NO:65, ou
- SEQ ID NO:66, ou
- SEQ ID NO:67, ou
- SEQ ID NO:68, et d'une région constante dont la séquence en acides aminés est représentée par SEQ ID NO:69, b) une chaîne lourde comprenant ou constituée d'une région variable dont la séquence en acides aminés est représentée par:
- SEQ ID NO:70,
- SEQ ID NO:71 ,
- SEQ ID NO:72,
- SEQ ID NO:73,
- SEQ ID NO:74,
et d'une région constante dont la séquence en acides aminés est représentée par SEQ ID NO: 75.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention présente : a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 76, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 77,
(anticorps 3C_23)
ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 78, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 79,
(anticorps 6B_78)
ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par: - SEQ ID NO: 80, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 81 ,
(anticorps 3C_23K) ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO:82, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 83,
(anticorps 4C_35) ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 84, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par:
- SEQ ID NO: 85,
(anticorps 5B 42).
De préférence, l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention comprend trois CDR-H (CDR de chaîne lourde selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes, et trois CDR-L (CDR de chaîne légère selon la nomenclature IMGT) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :
- CDR1 -H 3C_23 : GYTFTSHY (SEQ ID NO :87), CDR2-H 3C_23: IYPGDDST (SEQ ID NO:88), CDR3-H 3C_23: TRGDRFAY (SEQ ID NO:89), CDR1 -L 3C_23: SSVRY (SEQ ID NO:90), CDR2-L 3C_23: PTS et CDR3-L 3C_23: LQWSSYPWT (SEQ ID NO:91 ). Ces 6 CDRs sont ceux présents dans l'anticorps 3C_23 et dans l'anticorps 3C_23K.
De préférence, l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention comprend :
a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 76, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 77, (anticorps 3C_23)
ou,
a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 80, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 81 , (anticorps 3C_23K).
Les anticorps anti-CD303 et anti-AMHRIl selon l'invention peuvent, chacun indépendamment, être produits dans une cellule hôte, un animal non-humain transgénique ou une plante transgénique comprenant au moins un acide nucléique codant pour un tel anticorps, ses fragments ou dérivés, ou un vecteur contenant un tel acide nucléique.
De préférence, l'anticorps anti-CD303 et/ou l'anticorps anti-AMHRIl selon l'invention sont produits par transgénèse, notamment dans un animal non-humain transgénique ou une plante transgénique.
La cellule hôte peut être d'origine procaryote ou eucaryote, et peut notamment être choisie parmi les cellules bactériennes, les cellules d'insecte, de plantes, de levure ou de mammifères. L'anticorps selon l'invention peut alors être produit en cultivant la cellule hôte dans des conditions appropriées. Une cellule hôte selon l'invention peut notamment être obtenue par transformation d'une lignée cellulaire par le(s) vecteur(s) d'expression des chaînes lourde et légère d'un anticorps selon l'invention, et séparation des différents clones cellulaires obtenus. La lignée cellulaire transformée est de préférence d'origine eucaryote, et peut notamment être choisie parmi les cellules d'insecte, de plantes, de levure ou de mammifères. Des lignées cellulaires appropriées pour la production d'anticorps incluent notamment les lignées choisies parmi : SP2/0 ; YB2/0 ; IR983F ; le myélome humain Namalwa ; PERC6 ; les lignées CHO, notamment CHO-K-1 , CHO- Led O, CHO-Lec1 , CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ou lignée CHO délétée pour les deux allèles codant pour le gène FUT8 et/ou le gène GMD ; Wil-2; Jurkat; Vero; Molt -4; COS-7; 293-HEK; BHK; K6H6; NSO; SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, lignée de cellule de canard embryonnaire EB66® (Valneva) ; les lignées d'hépatome de rat H4-II-E (DSM ACC3129), et H4-ll-Es (DSM ACC3130) (voir WO2012/041768), NM-H9D8 (DSM ACC2806), NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807), et NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856) (voir WO2008/028686).
Un animal non-humain transgénique selon l'invention peut être obtenu par injection directe du ou des gène(s) d'intérêt dans un œuf fertilisé (Gordon et al-1980). Un animal non-humain transgénique peut également être obtenu par introduction du ou des gène(s) d'intérêt dans une cellule souche embryonnaire et préparation de l'animal par une méthode d'agrégation de chimère ou une méthode d'injection de chimère (voir Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). Un animal non-humain transgénique peut également être obtenu par une technique de clonage dans laquelle un noyau, dans lequel le ou les gène(s) d'intérêt a été introduit, est transplanté dans un œuf énucléé (Ryan et al-1997; Cibelli et al-1998, WO00/26357). Un animal non humain transgénique produisant un anticorps d'intérêt peut être préparé par les méthodes ci-dessus. L'anticorps peut alors être accumulé dans l'animal transgénique et purifié, notamment à partir du lait ou des œufs de l'animal. Pour la production d'anticorps dans le lait d'animaux non humains transgéniques, des procédés de préparation sont notamment décrits dans WO90/04036, W095/17085, WO01/26455, WO2004/050847, WO2005/033281 , WO2007/048077. Des procédés de purification de protéines d'intérêt à partir du lait sont également connus (voir WO01/26455, WO2007/106078). Les animaux non humains transgéniques d'intérêt incluent notamment la souris, le lapin, le rat, la chèvre, les bovins (notamment la vache), et les volailles (notamment le poulet).
Une plante transgénique selon l'invention peut être choisie parmi toute plante permettant la production d'anticorps. De nombreux anticorps ont déjà été produits dans des plantes transgéniques et les technologies nécessaires à l'obtention d'une plante transgénique exprimant un anticorps d'intérêt et à la récupération de l'anticorps sont bien connues de l'homme du métier (voir Stoger et al-2002, Fisher et al-2003, Ma et al-2003, Schillberg et al-2005). Il est également possible d'influencer la glycosylation obtenue dans les plantes pour obtenir une glycosylation proche de celle des anticorps humains naturels (sans xylose), mais avec en outre une faible fucosylation, par exemple à l'aide de petits ARNs interférents (Forthal et al-2010).
L'anticorps anti-CD303 et l'anticorps anti-AMHRIl sont présents, selon l'invention, soit dans une composition pharmaceutique, soit comme produits de combinaison. Ils peuvent donc être combinés avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables. La composition pharmaceutique ou le produit de combinaison peut être administré par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intra-oculaire, intra-cérébrale, transdermique, pulmonaire, locale ou rectale. Les anticorps peuvent alors être administrés sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants sous-cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale.
De préférence, la composition pharmaceutique ou le produit de combinaison contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines, ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables.
Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et les champignons.
Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes.
Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption.
Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art.
Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle.
L'invention est maintenant illustrée avec les exemples suivants.
EXEMPLES :
Exemple 1 : Impact de l'élimination des pDC sur les activités ADCC et phagocytose d'anticorps anti-AMHRIl
1 .1 - Principe de l'étude Les pDC sont responsables de la différenciation des T régulateurs (Moseman EA, 2004 ; Martin-Gayo E, 2010) entre autre par l'interaction ICOS/ICOSL, (Ito, T., 2007 ; Faget, J. 2012 ; Faget, J. 2013). Les T régulateurs ainsi différenciés exercent des mécanismes d'immunosuppression sur les fonctions des autres cellules du système immunitaire, notamment les cellules NK, via le contact cellule/cellule mais également via la sécrétion de cytokines immuno-modulatrice comme IL-10, IL-35 et TGF-β (Liu, C 2016).
Par effet cascade, il est ainsi possible d'étudier l'impact de l'élimination des pDC sur l'activité d'un agent anti-cancéreux spécifique d'une tumeur impliquant une activation des pDC in situ. Notamment, l'effet protecteur des anticorps anti-CD303 ciblant les pDC peut être démontré par l'étude corrélative de la diminution ou élimination des cytokines IL-10 et TGF-β dans l'environnement tumoral et son impact sur les fonctions effectrices d'un agent anti-cancéreux administré, spécifique de la tumeur (anticorps anti-AMHRIl). En effet, selon ce modèle, les anticorps anti-CD303 déplétant les pDC entraînent une limitation des effets immunosuppresseurs des T régulateurs et ainsi une limitation de leur sécrétion d'IL- 10 et TGF-β. Cette limitation de sécrétion d'IL-10 et TGF-β est corrélée à une meilleure ADCC des cellules NK, validant l'effet stimulateur indirect des anticorps anti-CD303 sur l'action anti-cancéreuse des anticorps anti-AMHRIl.
1 .2- Effet de l'IL-10 et TGF-β sur l'activité ADCC de l'anti-AMHRIl
Afin de tester l'ADCC de l'anti-AMHRIl dans un contexte tumoral impliquant une activation des pDC d'une part ou en éliminant les pDC d'autre part, le protocole suivant est mis en place :
Des cellules effectrices NK transfectées avec CD16 (« NK-CD16 ») ont été cultivées à 3x105 cellules/ml dans un milieu de culture contenant de l'IL-2.
A J-1 , les cellules NK-CD16 ont été cultivées dans un milieu de culture sans IL-2, en absence ou en présence d'IL-10 (5, 50 ou 120 ng/ml) et de TGF-β (5, 50 ou 120 ng/ml). A J0, des cellules COV434 (35000 cellules/puits) exprimant AMHRII sont incubées dans une plaque 96 puits à fond plat avec les cellules NK-CD16, avec un ratio E/C (Effecteur - NK / Cible - COV434) égal à 5/1 et 5000 ng/ml d'anticorps anti-AMHRIl.
Après 16 heures d'incubation à 37°C, le surnageant est collecté.
Le contrôle négatif correspond au même protocole dans lequel l'anti-AMHRIl est remplacé par un anticorps chimérique anti anticorps anti-FVI II produit en YB2/0.
La lyse des cellules cibles induite par les anticorps anti-AMHRIl est mesurée de façon chromogénique en quantifiant l'enzyme intracellulaire lactate déshydrogénase (LDH) relarguée dans le surnageant par les cellules cibles lysées (Roche Diagnostics - Cytotoxicity Détection Kit LDH). Le pourcentage de lyse est calculé selon la formule suivante :
% lyse = [(ER - SR) / (100 - SR)] - [(NC - SR) / (100 - SR)]
Où ER et SR représentent respectivement les relargages expérimental (ER) et spontané (SR) de LDH, et NC représente la cytotoxicité naturelle des cellules NK.
Les résultats (% lyse) sont exprimés en pourcentage, 100% étant la valeur prise comme référence, obtenue avec les cellules NK-CD16 en présence d'anticorps anti-AMHRIl et en absence d'IL-10 et de TGF-β (i.e. anticorps anti-AMHRIl seul).
Conclusion : Par effet cascade, la comparaison du pourcentage de lyse observable en l'absence de cytokines l'IL-10 et/ou TGF-β avec le pourcentage de lyse observable en présence de ces mêmes cytokines, permet d'évaluer l'impact de la déplétion des pDC présents sur le site tumoral. Il peut ainsi être démontré que les anticorps anti-CD303 permettent de potentialiser indirectement l'effet des anticorps anti-cancéreux anti-AMHRIl.
1 .3- Effet de l'IL-10 et TGF-β sur la phagocytose induite par l'anti-AMHRIl
Les monocytes sont différenciés en macrophages CD16+ (M2 like) pendant 2 jours en RPMI 1640 + 10 % SVF + M-CSF 50 ng/ml pendant 48h.
Les cellules SKBR3 et macrophages sont marqués avec PKH-67 (fluorescence verte) et PKH-26 (fluorescence rouge), respectivement.
Les cellules SKBR3 sont opsonisées avec 10 μg/ml de l'anticorps AMHRII ou avec un anticorps irrelevant puis incubées avec les macrophages (1 .105 de chaque cellules/puits) en absence ou en présence de différentes concentrations d'IL-10 (5 et 50 ng/ml) seule, de TGF-β (5 et 50 ng/ml) seul et d'IL-10 + TGF-β (5 et 50 ng/ml).
Après 3h d'incubation à 37°C, les cellules sont placées sur une cellule de comptage (Mallassez) et observées avec un microscope à fluorescence.
Le pourcentage de phagocytose est évalué en comptant le nombre de macrophages (au moins 100 macrophages) contenant des cellules COV434.
Conclusion : Par effet cascade, la comparaison du pourcentage de phagocytose observable en l'absence de cytokines l'IL-10 et/ou TGF-β avec le pourcentage de lyse observable en présence de ces mêmes cytokines, permet d'évaluer l'impact de la déplétion des pDC présents sur le site tumoral. Il peut ainsi être démontré que les anticorps anti-CD303 permettent de potentialiser indirectement l'effet des anticorps anticancéreux anti-AMHRII.
Exemple 2 : Effet d'un anticorps anti-CD303 sur l'activation des cellules T régulatrices (Treg)
2.1 - Rôle de l'anti-CD303 sur le phénotype et l'expansion des Treg en PBMC
Les cellules mononucléées (PBMC) sont isolées à partir d'un tube de sang prélevé sur anti-coagulant. Les cellules Treg sont identifiées et phénotypiquement caractérisées par cytométrie en flux sur la base de 3 marqueurs : CD4, CD25 et Fox-P3.
Différentes quantités de l'anticorps anti-CD303 (de 1 ng à 10 μg/ml) sont ajoutées aux PBMC en présence d'IL-2 (500 U/ml). Le nombre de Treg et leur phénotype est suivi au cours du temps (1 à 4 jours).
Dans les mêmes conditions, des billes coatées avec anti-CD3 / anti-CD28 pour stimuler la prolifération T sont ajoutées dans un ratio Treg / billes de 4 / 1 pour vérifier l'activation des Treg.
Conclusion : Il peut ainsi être démontré que les anticorps anti-CD303, en l'absence de pDC, n'ont pas d'impact sur l'expansion et le phénotype immunosuppresseur des T régulateurs.
2.2- Rôle de l'anti-CD303 sur le phénotype et l'expansion de Treg purifiés en présence de pDC
Les cellules Treg (CD4+, CD25+) sont purifiées à partir de PBMC grâce à un procédé en 2 étapes : déplétion des cellules CD4 négatives (cellules positives pour les marqueurs CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCRy/δ, et CD235a) puis sélection positive des cellules CD25+.
Des pDC purifiées ou des lignées pDC (e.g. obtenues selon le procédé décrit dans Maeva CAL-1 ) sont ajoutées dans un ratio Treg / pDC de 100, 10 et 1 . Différentes quantités de l'anticorps anti-CD303 (de 1 ng à 10 μg/ml) sont ajoutées au mélange Treg / pDC en présence d'IL-2 (500 U/ml). Le nombre de Treg et leur phénotype est suivi au cours du temps (1 à 4 jours).
Dans les mêmes conditions, des billes coatées avec anti-CD3 / anti-CD28 pour stimuler la prolifération T sont ajoutées dans un ratio Treg / billes de 4 /1 pour vérifier l'activation des Treg. Un témoin négatif en absence de pDC est établi, de façon à vérifier l'impact (attendu neutre) de l'anti-CD303 directement sur les Treg.
Conclusion : L'observation sur plusieurs jours de l'expansion et de la différenciation des Treg purifiés en présence de pDC, après administration d'anticorps anti-CD303 peut permettre de montrer que l'administration d'anti-CD303 est efficace pour diminuer ou supprimer les propriétés immunosuppressives des pDC.
Exemple 3 : Déplétion des pDCs humaines via un anticorps anti-CD303 in vivo dans le traitement du cancer de l'ovaire
3.1 - Génération d'un modèle d'étude reproductif d'une situation pathologique chez l'homme
Afin d'étudier l'effet d'un anticorps anti-CD303 dans le traitement du cancer de l'ovaire, un modèle de souris humanisée 'humanized tumor mouse model' (HTM) peut être utilisé. Il est caractérisé par le développement d'un système immunitaire mature humain et la croissance de cellules de cancers de l'ovaire humaines qui ont été au préalable co- transplantées avec les cellules souches hématopoïétiques humaines.
Ce modèle permet avantageusement de réunir plusieurs éléments pertinents pour la reproductibilité des conditions in vivo : présence de pDCs humaines qui seules expriment à leur surface la cible CD303, présence d'infiltration de cellules Treg humaines, présence de cellules tumorales humaines exprimant à leur surface AMHRII, molécule ciblée par un anti-AMHRIl et un hôte murin immunocompétent (cellules effectrices de type NK pour l'activité ADCC). Le modèle décrit précédemment dans l'article Wege et al (Int. J. Cancer 201 1 : 129, 2194-2206) réunit toutes ces caractéristiques.
Ce modèle a été adapté pour le rendre compatible avec les souris BRGSF™ ou BRGSF™-A2 (BALB/c, Rag2tm1 Fwa, IL-2Ryctm1 Cgn, SIRPocNOD, Flk2tm1 lrl, Tg(HLA- A/H2-D/B2M)1 Bpe) caractérisées par l'absence de cellules murines T, B, et NK, et exprimant uniquement le HLA de classe 1 humain HLA-A2.1 . Lesdites souris BRGSF™ ou BRGSF™-A2 peuvent être générées selon la procédure décrite par Legrand N, Huntington ND, Nagasawa M et al. (Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 201 1 ;108:13224-13229). Elles acquièrent le génotype(HLA-A/H2-D/B2M)1 Bpe par transgenèse. (Pascolo, S., N. Bervas, J.M. Ure, A.G. Smith, F. A. Lemonnier, and B. Perarnau. 1997. HLA-A2.1 -restricted éducation and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med 185:2043-2051 ).
3.2 - Méthode pouvant être utilisée pour tester l'activité de l'anticorps anti-CD303
Brièvement, les souris nouveau-nées issues de la lignée de souris immunodéficientes BRGSF-A2 (BALB/c Rag2tm1 Fwa IL-2Ryc tm1 C9n SIRPocNOD Flk2tm1 lrl Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1 Bpe sont irradiées (3 Gy) au cours de leurs 192 premières heures de vie. Vingt-quatre heures plus tard, elles sont transplantées par injection intra-hépatique avec 1 ,5x105 cellules CD34+ humaines isolées à partir de sang de cordon ombilical (CB) en présence, ou non, de cellules tumorales 3x106 COV434-AMHRII-Luc (exprimant la luciférase pour un suivi en bioluminescence). Les cellules COV434 sont des cellules d'origine humaine issues d'un carcinome ovarien exprimant à leur surface le récepteur AMHRII, la cible de l'anticorps anti-AMHRII. Dans le cadre de ce modèle particulier, les cellules COV.434 ont été, avant leur administration, modifiées par transduction lentivirale dans le but de les rendre luminescentes grâce à l'expression constitutive de la luciférase. Cette modification permet un contrôle transversal au cours du temps de la prise des tumeurs grâce à l'analyse de la bioluminescence tout en ne sacrifiant pas des animaux et ainsi ajuster au mieux la fenêtre de début de traitement. Onze à douze semaines après la co- administration des cellules humaines, les souris sont testées pour leur degré d'humanisation par analyse de la composition de cellules présentes dans leur sang (humaines et murines) par cytométrie en flux puis réparties au sein de cinq groupes différents (cf. tableau ci-dessous) : un groupe contrôle sans injection de cellules COV434 traité avec un anticorps isotype (i.e. un anticorps anti-anticorps anti-Facteur VIII) (ce groupe sert de contrôle négatif à la prise de tumeurs) (groupe 1 ), un groupe contrôle avec injection de cellules COV434 traité avec un anticorps isotype (i.e. un anticorps antianticorps anti-Facteur VIII) (groupe 2), un groupe traité avec l'anti-AMHRIl transgénique (AATG) groupe 3), un groupe traité avec l'anticorps anti-CD303 (groupe 4) et un groupe traité avec la combinaison de traitements anticorps anti-CD303 et AATG (groupe 5). Les doses utilisées ainsi que les fréquences de traitement sont indiquées dans le tableau ci-dessous :
Groupes COV434- Produit(s) testé(s) Nombre
AM H RM-Luc
1 non Isotype (anticorps anti n=10 anticorps anti Facteur VIII)
2 oui Isotype (anticorps anti n=10 anticorps anti Facteur VIII)
3 oui AATG n=10 4 oui Anti-CD303 n=10
5 oui AATG n=10
+ anti-CD303
Le traitement débute 14 semaines après l'humanisation (i.e. injection des cellules CD34+ humaines isolées à partir de sang de cordon ombilical (CB) en présence, ou non, de cellules tumorales 3x106 COV434-AMHRII-Luc) et dure 19 semaines.
Le traitement consiste en l'injection des produits testés par voie intraveineuse à une dose de 30 mg/kg de poids corporel dans le cas de l'anticorps anti-CD303 tous les 3 jours et une fois par semaine à 10 mg/kg de poids corporel dans le cas de l'anticorps AATG. Le poids corporel des souris est déterminé 3 jours avant le début du traitement pour ajuster la dose individuellement.
Des prélèvements fréquents de sang sont réalisés pour tester l'efficacité de déplétion de pDCs humaines par cytométrie en flux. De plus, une analyse réalisée dès le début du traitement puis toutes les deux semaines par bioluminescence est réalisée pour comparer l'efficacité des différents produits testés. Enfin, une analyse des tumeurs de trois animaux par groupe à la semaine 18 après l'humanisation est réalisée par cytométrie en flux pour vérifier la présence ou l'absence des pDCs humaines infiltrantes dans les tumeurs.
Résultats :
- L'impact du traitement sur la sous-population pDC humaine ainsi que les autres populations de cellules lymphoïdes (lymphocytes B, lymphocytes T ...) présentes dans le sang et la rate a été déterminé par cytométrie en flux à différents temps: j1 , j3 et j7. Les résultats permettent de montrer que le traitement par l'anticorps anti-CD303 à une dose de 30 mg/kg chez des souris BRGSF-HIS humanisées induit la déplétion des pDC humaines pendant au moins 7 jours dans le sang et la rate. Dans le sang, l'activité de déplétion des pDC humaines était rapide (> 80% le jour 1 ) et plus tardive dans la rate. Dans le sang et la rate, la déplétion des pDC humaines était toujours efficace (> 90%) le jour 7, c'est-à-dire 3 jours après la dernière injection de l'anticorps monoclonal anti- CD303. Il est à noter que l'activité de déplétion de l'anticorps anti-CD303 était très spécifique puisqu'elle n'affecte pas significativement les autres sous-populations de cellules hématopoïétiques humaines dans les organes testés.
- De plus, il est à noter que ce modèle s'avère être un modèle particulièrement adapté à l'étude de l'invention puisque la recherche de pDC dans les tumeurs de souris sacrifiées permet de montrer la présence de pDC infiltrant ces tumeurs. Conclusion :
Le modèle murin HTM adapté peut être avantageusement utilisé pour évaluer l'effet indirect de l'administration d'un anticorps anti-CD303 sur l'effet de l'agent anti-tumeur d'ovaire, l'anticorps anti-AMHRIl, dans des conditions reproduisant une situation physiologique in vivo, en comparant notamment les résultats obtenus avec les différents groupes testés.
Ce modèle est ainsi utile pour pouvoir évaluer le bénéfice, avantageusement l'effet synergique, d'administrer un anticorps anti-CD303 en combinaison à l'administration d'un anticorps anti-AMHRIl dans une tumeur de l'ovaire.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable :
a. au moins un anticorps anti-CD303; et
b. au moins un anticorps anti-AMHRII.
2. Produits contenant :
a. au moins un anticorps anti-CD303; et
b. au moins un anticorps anti-AMHRII,
comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers urogénitaux.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou produits selon la revendication 2, dans lesquels les anticorps a) et b) sont choisis parmi les anticorps murins, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps humains.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 3, ou produits selon la revendication 2 ou 3, dans lesquels l'anticorps anti-CD303 est un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de l'antigène CD303 humain.
5. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 , 3 ou 4, ou produits selon l'une des revendications 2 à 4, dans lequel l'anticorps anti-CD303 comprend les CDRs suivants :
ou bien
CDR1 -H-IMGT-102E9 GYTFTDYS (SEQ ID NO :19)
CDR2-H-IMGT-102E9 INTETGEP (SEQ ID NO : 20) CDR3-H-IMGT-102E9 TRNGYYVGYYAMDY (SEQ ID NO : 21 )
CDR1 -L-IMGT-102E9 SSVIY (SEQ ID NO : 22)
CDR2-L-IMGT-102E9 STS (SEQ ID NO : 23)
CDR3-L-IMGT-102E9 QQRRSYPFT (SEQ ID NO : 24) ou bien
ou bien
ou bien
Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 3 à 5, ou produits selon l'une des revendications 2 à 5, dans lequel l'anticorps anti-AMRHII comprend: a) une chaîne légère comprenant ou constituée d'une région variable dont la séquence en acides aminés est représentée par:
- SEQ ID NO:65 , ou
- SEQ ID NO:66, ou - SEQ ID NO:67, ou
- SEQ ID NO:68,
et d'une région constante dont la séquence en acides aminés est représentée par SEQ ID NO:69, b) une chaîne lourde comprenant ou constituée d'une région variable dont la séquence en acides aminés est représentée par:
- SEQ ID NO:70,
- SEQ ID NO:71 ,
- SEQ ID NO:72,
- SEQ ID NO:73,
- SEQ ID NO:74,
et d'une région constante dont la séquence en acides aminés est représentée par SEQ ID NO: 75.
7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 3 à 5, ou produits selon l'une des revendications 2 à 5, dans lequel l'anticorps anti-AMRHII comprend: a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 76, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 77, ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 78, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 79, ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 80, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 81 , ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO:82, et b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 83, ou, a) une chaîne légère constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 84, et
b) une chaîne lourde constituée de la séquence en acides aminés représentée par SEQ ID NO: 85.
Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 3 à 5, ou produits selon l'une des revendications 2 à 5, dans lequel l'anticorps anti-AMRHII comprend trois CDR de chaîne lourde ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes, et trois CDR de chaîne légère ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80% d'identité avec les séquences suivantes :
- CDR1 -H 3C_23 : GYTFTSHY (SEQ ID NO :87),
- CDR2-H 3C_23: IYPGDDST (SEQ ID NO:88),
- CDR3-H 3C_23: TRGDRFAY (SEQ ID NO:89),
- CDR1 -L 3C_23: SSVRY (SEQ ID NO:90),
- CDR2-L 3C_23: PTS et
- CDR3-L 3C_23: LQWSSYPWT (SEQ ID NO:91 ).
Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 3 à 8, ou produits selon l'une des revendications 2 à 8, dans lequel l'anticorps anti-CD303 et/ou l'anticorps anti-AMHRIl est choisi parmi les Fab, F(ab)'2, Fd, scFv et les multimères de scFv.
10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 3 à 9, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de cancers urogénitaux.
1 1 . Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 10, ou produits selon la revendication 2, dans lequel le cancer urogénital est le cancer de l'ovaire.
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