TW200902038A - Kits of parts for treating a malignant pathology, an auto-immune disease or an infectious disease - Google Patents

Description

200902038 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 -般而言’本發明係有關於治療惡性病症、自體免疫 疾病、或感染性疾病，且特別是透過於其表面表王見 受體的效應細胞。 【先前技術】 越來越多的研究顯示抗體亦為診斷及治療之可選擇工 具’其代表傳統療法之替代選擇。 用於治療用途之血漿來源或源自生物技術之抗體的數 種製劑現已在於市場上或於開發階段。開發其性質以製造 ’α療工具，舱知_異性地結合其目標，且有效地吸收免疫系 統的細胞。 近來研究著重於改良抗體的有效性，且特別是其怪定 Fc區域的操作。此即後者之負責抗體之「作用」性質，乃 係由於其允許免疫系統的效應細胞的活動。此項能力係藉 由糖蛋白，亦即受體Fc(FcR)存在於某些效應細胞而使其 為可能。當抗體藉由其可變區域固定於目標抗原時，該等 文體能結合抗體之恆定區域。藉由效應細胞實施之抗體F〇 區域於FcR的結合’引起細胞毒性機制的後續活化，例如 吞噬作用（phagocytosis)及ADCC(依賴於抗體之細胞獨性 或依賴抗體之細胞調節的細胞毒性）。於自體免疫疾病中， 本質角色為保護胞器免於凝集的免疫系統，外來物不存在 而引起炎性回應且因此其本身藉由意外地攻擊其本身的分 6023-9628-PF/Kai 5 200902038 子引起組織損傷。有不同的自體免疫病源影響身體的不同 組織或不同功能。例如，於該等羅患多發性硬化症之击者 的=到影響，克隆氏症患者的腸為目標，以及患有;;濕 性夕杳性硬化症之患者的滑液、骨及軟骨受到影響。 於自體免疫疾病的發展中’可發生數種現象，例如— 種或多種形態組織的進行性破壞、器官的異常生長或受與 響器官功能的改變。於自體免疫疾病中最常受到影響的挺 織或益官為血細胞生成細胞(⑻咖―以】c d ! s)、血 官、結締組織、内分泌腺體、肌肉、關節及皮膚。自體免 ft病—相關於慢性炎性病理°最常見之病例為風濕性 夕电性關郎炎及幼年型風濕性關節炎兩種所代表 節炎。關節炎為關節之炎症的—般通稱。 终多的療法具有嚴重的副作用或無法完全防止疾病的 :展；目前未有理想的療法且沒有-種療法有助於治= 對於更有效且優於所有治療法之新穎療法的顯 達到頂點。 而衣 由於Β淋巴球⑽為該等細胞產生之自體抗體 造成自體免疫疾病的發展，藉由此細胞類型 體的投予對其等之破壞’對患者可為唯-有利處，如= 近獲准用於治療風濕性多發性關節炎之利妥昔 (ri tuximab)所示者。 几 再者雖然已改良衛生條件、免疫及抗微生物療法， “染性疾病仍代表現代醫學之持續性及顯著的問題。最雇 放布的疾病、最簡僻冷門的為與最可怕的疾病之a⑽（後 6 6〇23-9628-PF;Kai 200902038 天免疫不全症候群)相同類別的感染性疾病。已證實有此神 經性：患分類:例如神經退化性疾病，事實上與感染相： 來，感染性疾病仍為主要的醫學問題。 ;感木！生疾病中’單株抗體可扮演兩個互補的角色. 病原媒介或於急性感染中所分泌毒素的中峨，以及於 轉型為慢性狀態過程中儲存細胞的破壞角色。 、能使病原媒介低干擾複製的宿主細胞的破壞，可防止 ㈣為慢性狀態’終結常見的例如自體免疫疾病或癌症之 嚴重病理的發展。如今’雖然確實的需要存在，但慢性狀 態的治療中幾乎無有效的抗感染療法。另一方面，感毕的 急性狀態中的小分子（抗生素、抗寄生蟲劑、抗病毒）的有 利效果:隨著交叉阻抗性stance)發展的讓步 而逐漸增加。因此’對抗生素多重阻抗性細菌的出現，造 成所有住院者之6%至7%因或多或少的嚴重院内感染而增 加難度的公共衛生的問題，或者每年15〇〇萬住院者中Μ 萬的病例（httP://www.senat.fr/rap/r〇5_21/r〇5_42ii. html#t〇C13)。總言之，院内感染將因而造成每年g_個 死亡病例其中的4200個受關注患者之生命攸關的預後未 佔據其入院之短時期（http://wwwsenatfr/rap/ r05 421/r05-421 3. html )。因此，顯然需要開發對醫生及 其患者提供療法選擇性的新穎藥物。 對應由細胞之未受調控的增生所致之贅生質量 (neoplasticmass)的腫瘤可為良性或惡性。—般而言，良 性腫瘤保留於定位。惡性腫瘤總稱為癌。詞語「惡性」— 6023-9628-PF;Kai 7 200902038 般意指腫瘤能侵犯及破壞鄰近結構且擴散至遠端位置，長 時間下造成患者死亡（Robbins ’and Angell，1976, Basic

Pathology, 2d Ed., W. β. Saunders Co., Philadelphia, p p. 6 8 -12 2 )。癌可因其組織源的功能而發生於多種不同位 置且表現不同。目前，用於治療癌之手段為手術、化學療 法、荷爾蒙治療及/或放射線治療以去除存在於患者的腫瘤 細胞（Stockdale，1 998，"Principies〇fCancerPatient

Management", i n Sc i ent i f 2 c Amer i can : Medicme, v〇l. 3’ RubensteinandFederman，Eds·’ Chapter 12)。所有 該等療法皆有重大的缺點。例如，雖然有大量的各種化學 分子可供選擇’化學療法仍引起嚴重的副作用，例如嚴重 的噪心、骨髓發育不全、免疫壓抑等。有些該等效果的嚴 重度迫使醫生於某些時候十斷治療。此外，雖然組合數種 化子刀子投樂’但腫瘤細胞的大多數對化學治療劑為阻抗 或發展抗性。事實上，蚪B 乂 #、丄^ 對目别療法中所投藥的特定藥劑為

阻抗的細胞’不幸地亦對其他藥物阻抗，包括該等經由I 目療法中所用於投藥的藥劑為不同機制而作用者。已： 稱為多藥物阻抗性的此現象， 敗的源由。 …準化學療法之治療失 因此對於新穎抗癌治療有 + ^ ^ ώ 不而要，特別是用於對例 如手術、放射線治療、化學療法 的癌治療。 ^何爾象治療為沉疴難治 確效的替代方法為免疫療法 腫瘤抗原特里沾W 、 之腫瘤細胞糟由對 机原知異的抗體而特異地為 ^ 主要的努力已完成 6023-9628-PF;Kai 8 200902038 解明免疫回應的特異性，例如融合瘤技術已開發對腫瘤細 胞所表現的抗原為特異的單株抗體（Green M.C.以3人， 2000 Cancer Treat Rev., 26： 269-286; Weiner L.Μ., 1999

Semin 〇nc〇i. 26 (suppl.⑷:43—51)。 宿主之有害細胞或病原媒介的破壞回應於所欲之單株 抗體的樂效機制而不考慮目標病理。因此改良該等抗體為 重要的，使其與患者免疫系統效應細胞的交互作用最適化。 慢性淋巴白血病B(LLC-B)，為β淋巴球的惡性增生為 特徵的疾病，為白血病之最常見形式。目前的療法主要係 基於忒疾病早期階段的治療戒除。於臨床或血液病症學的 情況中，傳統地患者藉由皮質類固醇（c〇rtic〇ids)單獨或 與抗有絲分裂分子組合而治療。對多數患者而言，對治療 的阻杬性或多或少建立在長時期且通常以具有化學阻抗細 胞的出現的治療竭力的失敗而結束。化學療法造成實質上 的副作用，特別是骨髓毒性而產生免疫缺乏以致於造成患 者的嚴重感染，導致死亡。許多治療方向著重於如已評估 的盡可能特異性地破壞腫瘤B細胞。藉由腫瘤（及正常）LB 的CD20分子的特異表現已允許基於使用人類抗-CD2〇單株 抗體的療法的開發。 單一非放射性標示的抗-CD20單株抗體，利妥昔單抗 (Rituxan®, Genentech and Mabth6raTM，Roche)，目前為 市售可得。其適用於治療受111-IV期之濾泡淋巴所苦之患 者，以及與化學療法組合用於治療出現擴散CD2〇陽性大B 細胞凝集之非-何杰金氏淋巴（NHL)的患者。由於使用作為 6023-9628-PF;Kai 9 200902038 -單一藥劑時其藥效仍為多變化且通常為有所節制的 (Teelmg 以 5人 2004，Blood 1 04( 6):1 793一8〇〇) ’ 其最 常與化學療法組合使用。 利妥昔單抗（Rituximab)業已於具有LLC_B的患者中 評估。當使用於單療法時’此抗體僅呈現些微藥效，目前 與化學療法組合投藥。 許多理由可解釋於LLC-B的患者中藉由利妥昔單抗之 單一療法的失敗·首先’利妥昔單抗於活體外在B細胞引 起些微的ADCC活性，以及相對於正常lb而於中，LLC-B 的LB於其表面僅表現少數CD20分子（密度約少5倍，藉由 流體細胞儀定量測量），因而限制抗體於細胞表面的量且從 而相關於細胞毒性功用（特別是ADCC與活性補充）。 因此主重要性著重於替代療法’其包括對CD2 0抗原為 特異的抗體且能有效地引起腫瘤細胞分解，包括些微表現 抗原者。 巨01細胞’為本質地免疫效應細胞’於抗腫流反應中 扮演重要角色。自然地呈現為不活化形式（無任何病理 時），其可藉由不同途徑於活體内或活體外活化，例如病源 的攝入或結合至表現於免疫複合物表面的受體（經由抗體 之Fc區域結合至FcR)或結合至細胞激素，特別是於炎性 現象中所產生的免疫調節分子（imniune-modulatory mo 1 ecu 1 es)。活化誘發分解且因而於巨噬細胞增加抗腫瘤 活性（Adams D. and Hami 1 ton T. : Activation of macrophages for tumour cell kill: effector mechanism 6023-9628-PF/Kai 10 200902038 • and regulation. In Heppner & Fulton (Eds), Macrophages and cancer. CRC Press, 1988, p. 27; Fidler I. : Macrophages and metastases. A biological approach to cancer therapy. Cancer Res, 45: 4714, 1985)。 此外，巨噬細胞，或衍生自單核球或其前驅體之其他 細胞，為抗原呈現細胞。由於其具有對主要組織相容性複 合物（Μ H C)之分子相關的抗原性肽的τ淋巴球的胞内吞嗟 (endocytosis)、分解及呈現的強能力，因此其可誘發特異 的免疫反應。 為了增加利妥昔單抗的藥效，利妥昔單抗與於非活體 内經活化之巨噬細胞的相關係於干擾素—τ (丨NF_ r )存在 下於活體外之L L C - B原生細胞的分解測試中評估 (Lefebvre ML, Stefan W. Krause, Salcedo M, Nardin A. Ex vivo activated human macrophages kill chronic lymphocytic leukemia cells in the presence of

Rituximab: mechanism of antibody-dependent cellular cytotoxicity and impact of human serum. J. Immunother· vol. 29, n 4: 388-397，2006)。結果顯示於利妥昔單抗 存在下，藉由經活化之巨噬細胞之llc-β細胞的強力分 解’透過人類血漿;;辰度的增加而受到強力的抑制。此抑制 關連於藉由多株免疫球蛋白的競爭，該免疫球蛋白存在於 血漿相比於利妥昔單抗-LLC-細胞複合物表現於巨嗟細胞 表面之各種FcR的結合。抑制強度取決於利妥昔單抗與效 .應細胞的使用濃度：目標細胞比例（效應細胞：目標或E : 6023-9628—PF;Kai 11 200902038 τ) ° 自體免疫疾病 法產物，較現 雖然已存在數種治療手段用以治療癌、 或感染性疾病，實f上仍需要新穎的免疫療 存產物確證有更加藥效及更高安全性。 【發明内容】 本發明之主要目的為一種用於治療惡性病症、自體 疫疾病、或感染性疾病之套組’包括於其表面表現…仙 文體（CD16)的效應細胞（effeGtQr Geu);以及單株抗體， 邊早株抗體的&區域對㈤6的親和性大於多株免疫球蛋 白的Fc區域對CD 1 6的親和性。 較佳地’該於其表面表現FcrRni受體咖6)的效應 細胞^於其表面表錄rRm受體咖)的單核球或： 生自單核球或單核球前驅體衍生之細胞。 較佳地，該於其表面表現CD16的單核球或單核球前驅 體衍生之細胞係選自表現CD16單核球、巨嗟細胞、自秋殺 手細胞(NK)、樹突細胞及所有周邊血液單核細胞(或陶。 /較佳地，該於其表面表現CD16之細胞係1自^_ 早核球、巨噬細胞及樹突細胞。 更佳地’该早核球或單核球前驅體衍生之細胞，其於 表面表現CD1 6者為巨噬細胞。 較佳地’該單株抗體由於其&區域對CD16的親和性 而不為多株免疫球蛋白（特別是存在於人類血清中者）所取 6023-9628-PF;Kai 12 200902038 . 較佳地，該單株抗體結合該單核球或單核球衍生之細 胞的CD16具有大於2. ΙΟ% — 1的親和性。 於特別有利的態樣中，該單株抗體係製造為單株抗體 組合物的形式，其中該抗體具有連結於Fcy醣基化位置 (glycosylation Site)(天冬醯胺 297，根據 Kabat^々 N_ 連結糖鏈，且其中該組合物之所有抗體之連結於FCT醣基 化位置的所有N-連結糖鏈中，海藻糖的比率小於65% ^ 本發明之特別具體例甲，該單株抗體係直接對抗選自 下述之抗原：5C5抗原（由腎細胞瘤的細胞所表現之腫瘤抗 原）、BCR(B細胞受體）、例如作為抗_FVIn抑制劑抗體之 遺傳性型（idiotype) ' TCR(T 細胞受體）、CD2、CD3、C])4、 CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD2：l、CD22、CD23、CD25、 CD45、CD30、CD3 3、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、 CD54、CD66U、b、c、d)、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、 CD154、MUC1(黏液蛋白diucm黏液蛋白2)、MUC3(黏液 蛋白3)、MUC4(黏液蛋白4)、MUC16(黏液蛋白ι6)、 HM1 · 24(過度表現於多發性骨髓瘤之漿細胞的特異抗原）、 tenasciiU細胞基質外的蛋白質）、GGT(伽瑪_麵胺酸轉移酵 素）、VEGF(血管細胞生長因子）、EGFR(上皮細胞生長因 子）、CEA(癌胚胎抗原）、cSAp(大腸特異性抗原_p)、ILGF(類 胰島素生長因子）、胎盤生長因子、Her2/neu、碳酸酐酶 (carbonic anhydrase)IX、IL-6、S100 蛋白質（結合鈣之 蛋白質的多基因家族（mu ltigenic family))、MART-1 (相關 於黑色素細胞瘤之腫瘤分化抗原）、TRP — i (酪胺酸酶相關之 6023-9628-PF;Kai 13 200902038 蛋白質l)、TRP_2(酪胺酸酶相關之蛋白 白麵一粉樣蛋白質一 D抗原、=: 之MHC分子的群！及Π)、來自經突變基因（特別是致癌基 因或腫瘤抑制基因）的表現所產生的抗原、由某已知腫瘤表 現的致癌性病毒所衍生的抗原、過度表現於某些腫瘤且輕 微表現於正常組織的泛見抗原例如苗勒激素（仙丨丨叮丨抓 hormone)的II型受體、醣基化或未醣基化之蛋白質、磷 脂、藉由經感染的細胞使其本身或非其本身表現或暴露於 細胞膜之分子例如磷脂絲胺酸（ph〇spha1;idy 及藉 由病原媒介（細菌毒素、細菌壁或寄生蟲壁之蛋白質複合 物、病毒外套糖蛋白（例如HIV病毒、HBV、Hcv及RSv)所 表現或分泌之蛋白質。 較佳地’該單株抗體為直接抗CD2〇。 本發明之較佳具體例中，該抗_CD2〇抗體係由寄存於 CNCM之寄存編號為1-3314的細胞株R509所產生，或由寄 存於CNCM之寄存編號為卜3529的細胞株R6〇3所產生者 (CNCM · Collection Nationale du Culture de

Microorganisms, I ns t i tu te Pas tear, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15—France)。 較佳地，本發明之套組係同時的、依序地或分別地使 用於治療。 較佳地，本發明之套組中，該於其表面表現cD16之效 應細胞於該抗體（較佳為與具CD16的抗體有交互作用）之 目標細胞具有細胞毒性活性。 6023-9628-PF;Kai 14 200902038 季父佳地’本發明之套組中 平体彳几體於表現CD1 6的 效應細胞存在下，藉由該括f ^ 曰时❻抗體之目軚細胞的ADCC活性或吞 噬作用（phagocytosis)而誘發細胞毒性。 本發明之另-目的為—種醫藥組合物，含有本發明之 套組，以及藥學上可接受的賦形劑。 本發明之另-目的關於本發明之套組之用途，係用於 製造藥物。 本發明之另一目的關於本發明之套組之用途，係用於 製造用以治療惡性病症之藥物。 較佳地，該惡性病症係選自實體腫瘤及惡性血液病 變。有利地，該實體腫瘤係選自黑色素細胞瘤、癌、肉瘤' 神經膠質瘤及皮膚癌。有利地，該癌係選自腎、乳房、口 腔、肺、胃腸道、卵巢、前列腺、子宮、膀胱、肝、膽囊、 皮膚及睪丸之癌所成組群。 較佳地，該惡性血液病變係選自淋巴增生 (lymphoproli ferative) 、骨 髓增生 (myeloproliferative)、具B型NHL之骨髓造血不良症候 群（myelodysplasic syndromes)及急性骨髓白血病（acute myeloid leukemias)、急性或慢性B淋巴白血病（acute or chronic B lymphoid leukemias)、伯基特氏淋巴瘤 (Burkitt’ s lymphoma)、 多 毛細胞 白血病 (tricholeucocyte leukaemia)、急性及慢性淋巴球性白血 病（acute and chronic myeloid 1 eukemias)、T 淋巴瘤及 白血病、何杰金氏淋巴瘤（Hodgkin’ s 1 ymphomas)、華登 6023-9628-PF;Kai 15 200902038 •氏巨球蛋白血症（Waldenstrom，s macrog〗obuHnemia)及 多發性骨趨瘤（mu 11 ip 1 e -mye 1 omas)。 本發明之另一目的關於本發明之套組之用途，係用於 製造藥物以治療自體免疫疾病及/或原發性或繼發性炎性 疾病’該等疾病對器官或全身性為特異的且不相關於病原 性自體抗體。 較佳地’該等疾病選自器官移植排斥、移植物對抗宿 主疾病、類風濕性多發性關節炎（rheumat〇id polyarthritis)、全身性紅斑性狼瘡之眼底病變 (disseminated lupus erythematosus)、硬皮症 (sclerodermia)、原發性修格連氏症（primitive Sjogren' s syndrome(或葛特—修格連氏 症）（Gougerot-Sj0gren syndrome)、自體免疫多發性神經 病變（auto-immune polyneuropathies)例如多發性硬化 症、第I型糖尿病、自體免疫肝炎、僵直性脊椎關節炎 (ankylosing spondylarthritis)、萊特氏症（Reiter，s syndrome)、痛風性關節炎（g〇ut arthrj s)、腹腔性疾病 (coeliac disease)、克隆氏症（Crohn’ s disease)、橋本 氏曱狀腺炎（Hashimoto, s thyroiditis)'艾迪森氏症 (Addison’ s disease)、自體免疫肝炎（aut〇_immune hepatitis)、巴塞多氏症（Based〇w’ s disease)、潰瘍性 大腸炎、血管炎例如相關於ANCA(抗中性細胞質抗體）之全 身性血皆炎、自體免疫血球減少症以及於成人與兒童之其 他血液併發症，例如急性或慢性自體免疫血小板減少症 6023-9628-PF;Kai 16 200902038 • (acute or chronic auto-immune thrombopenias)、自體 免疫洛.血性&(auto_imniune haemolytic anaemias).、新 生兒的溶血性疾病（H D N)、冷凝急素病（c 〇 i d a g g 1 u t i n i n di sease )、血栓性血小板減少性紫斑症（thr〇mb〇Cy topen i c thrombotic purpura)及後天自體免疫血友病（aCqUired auto-immune haemophilia)，古巴斯德症（Goodpasture ’ s syndrome)、外膜性腎炎（extra-membraneous nephropathies)、自體免疫水泡皮膚症（aut〇—immune bullous skin disorders)、難治性肌無力（refract〇ry myasthenia)、混合性冷球蛋白血症（mixed cryog 1 obul inemias)、乾癬（psoriasis)、幼年型慢性關節 炎（juvenile chronic arthritis)、炎性肌炎、皮肌炎 (dermatomyositis)以及包括抗磷脂症候群之兒童全身性 自體免疫疾病（antiphosphol ipids syndrome)。 本發明之另一目的關於本發明之套組之用途，係用於 製造用以治療感染性疾病的藥物。 車父佳地，該感染性疾病選由下述所誘發者：病毒（人類 免疫不全病毒或HIV)、肝炎病毒（HBV、Ηα)、艾-巴病毒 (Epstein-Barr virus)或 EBV 、巨細胞病毒 (cytomegalovirus)或 CMV、腸病毒（enter〇virus)、具流 感病毒A、B及C之流感 '融合呼吸道病毒（syncytial respiratory virus)或SRV、或HTLV);細菌及/或其毒素（破 傷風桿菌（tetanus)、白喉桿菌（diphtheria)、肺炎雙球菌 (pneumococci)、腦膜炎雙球菌mening〇c〇cci)、葡萄球菌 6023-9628-PF;Kai 17 200902038 Λ . 包括曱氧西林（methici 1 in)阻抗形式、克雷白桿菌 (Klebsiellas)、志賀氏桿菌（Shigellas)、綠膿桿菌 (pseudomonas aeruginosa)、腸桿菌（enterobacteria)或 抗生素阻.抗病原包括院内感染_性疾病（nosocomial diseases));寄生蟲（癔疾（pa’ludism)、.利，甚曼病 (leishmaniosis)、錐蟲病（trypanosomiasis))以及新興的 疾病’例如曲弓熱（Chikungunya)、禽流感（bird f lu)、嚴 重急性呼吸道病毒症候群（severe acute respiratory virus syndrome)或SARS ;造成出血熱的病毒，例如伊波 拉（Ebola)病毒、登革熱（DengUe fever)病毒或西奈病毒 (west Nile virus);以及相關於生物恐怖者，例如炭疽熱 (Anthrax)、肉毒桿菌中毒（Botulism)、鼠疫（piague)、天 7匕（smallpox)及痘病毒（p0xvirus) 、土拉偷斯病 (Tularaemia)、出血熱媒介、布氏桿菌（bruceU〇sis)、葡 萄球菌之B腸毒素（b En1;erotoxins)、白喉毒素 (diphtheric toxin)或病毒性腦炎（viral Encephalitis)。 【實施方式】 套組 本發明所述之「套組」意指藥物組合物之由於其通用 適應症而形成功能單位之單元組成。 更具體而言，本發明之套組為藥物組合物，含有作為 活性逐之於其表面表現CD16之效應細胞，以及單株抗體， 該單株抗體的Fe區域對⑶16的親和性大於多株免疫球蛋 6023-9628-PF;Kai 18 200902038 - 白的Fc區域對CDl 6的親和性，用以同時的、分別地或依 序地使用於治療惡性病症、自體免疫疾病或感染性疾病。 單株抗體及效應細胞（於其表面表現CD16),共同形成 單元套組形式的組合物，其組成可同時的、分別地或間隔 的歷時應用。本發明之套組亦可為混合物形式。 單株抗體及效應細胞（於其表面表現CD16)形成功能單 兀，此乃因新穎的通用效果且因而所致之通用適應症。 於其表面表現FcrRIII受體（CD16)的效應細胞 本發明所述之「於其表面表現CD1 6受體的效應細 胞」，思指藉由抗體與其對Fc r r I π或CD丨6膜受體為特 異的抗原聯結所型之免疫複合物之結合所誘發之細胞活化 後，能為作用活性（特別是藉由ADCC之細胞毒性活性、吞 噬作用（phagocytosis) ’或於另一領域之抗原呈現及荷爾 蒙回應性質）之任何細胞。該等細胞必須於其表面表現cdi6 較佳地，該細胞可為於其表面表現CD16之衍生自單核 球之細胞或單核球前驅體衍生之細胞、CD16 +單核球、巨噬 細胞、樹突細胞，但不限於此。 因此，此清單可延伸至自然殺手細胞（NK)及pBMC(周 邊血液單核細胞）。「I細胞」意指無預先的免疫而能有 自發性細胞毒性活性的大顆粒狀淋巴球。「PBMC」意指周 邊血液（單核球及淋巴球）之任何單核細胞。 該等細胞因而於本發明之單株抗體的存在下能誘發 ADCC活性，此乃因單株抗體Fc區域及細胞所表現之cD i 6 受體之間的結合。 6023-9628-PF;Kai 19 200902038 . 效應細胞較佳為巨噬細胞。 CD1 6 +單核球（亦即於其表面表現CD1 6)為於其細胞膜 表面表現CD16之單核球亞群。CD16 +單核球能有吞噬作用 及_誘發ADCC活性。 巨°益細胞為.本.質免疫的主要角色之一且參與適應性免 疫（adaptive immunity)。其來自單核球之分化 (differentiation)。 在一實施例中’巨噬細胞可衍生自細胞懸浮液，其強 力富含單核球包括於合適培養基（RpMr fQ;r

Roswell Park Memorial Institute)含有 M-CSF(Monocyte-

Colony Stimulating Factor)或 GM-CSF(Granu1ocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor)以誘發單核球分 化為巨噬細胞之培養步驟。巨噬細胞可於例如6至7日的 培養中產生。 亦可3b由畐含血球細胞之組合物產生巨嗟細胞，該血 球細胞藉由於健康個體實施細胞分離術，以及進行於含有 M-CSF(單核球聚落刺激因子（M〇n〇cyte CQlQny Stimulating Factor))或GM-CSF(顆粒球巨噬細胞具落刺 激因子（Granulocytes Macrophages Colony stimulating

Fact or))之培養基中培養單核球的步驟而獲得。 視需要地，此培養步驟可有利地首先進行單核細胞的 分離步驟，以及另一方面，由細胞分離術所獲得之血液衍 生組合物中所含有之紅血球細胞、顆粒球及部分血小板， 藉由清洗殘留於前步驟之部分血小板及抗凝集素之清除步 6023-9628-PF;Kai 20 200902038 上逑細胞懸浮液於單核球之富含步驟係藉由將含有單 核球之培養基於密度梯度離心而達成，特別是具有密度約 1. 〇至約3g/mi之溶液，例如具有密度丨_ 〇77g/mi之 Flc〇ll PaqUe 型（pharmacia)溶液。

視需要地，含有巨噬細胞、及/或樹突細胞、及/或NK 細胞之組合物可由人類來源且富含血球之血液衍生組合物 獲侍，且更具體地，富含例如單核球或其前驅體之白血球， 特別是藉由細胞分離術所獲得之血液衍生組合物，該處理 包括下述步驟： .較佳地，藉由合適的生理溶液，稀釋該血液衍生組 合物’特別是其容積的2至3倍， .清洗該血液衍生組合物，較佳地藉由離心以及上述 離心所得之小粒的清洗，时小粒後，於合適的生理清洗 溶液中，特別是於（移轉袋型的）袋中，例如藉由對該袋施 加壓力，然後使清洗溶液排出 „ A x 力衣或另—接收器，以 回收除去任何可能的抗凝集素 物，且血小板少， 饤不良殘質的組合 况步驟，具體為丨至2次之保 .培養上述清洗步驟後所得之血 有之細胞，藉由置於適當培養基中，特^組合物中所 性袋中，培養約6至1G日（特別是約6至^地視於疏 此培養步驟為： ） .預先藉由非單核球或其前 】驅體(期待期等存在於起 6023-9628-PF;Kai 21 200902038 7物中）之組成（特別是血小板、紅血球、顆粒球及淋巴 球)的全部或部分的清除步驟’藉由將清洗步驟之後培養步 驟之前所獲得之血液衍生組合物，與直接對抗上述全部或 部分組成之抗體接觸，i回收含有單核球或其前驅體之溶 液而上述全部.或部分組成仍固定於抗體，及/或後續藉由盘 例如本文中所述抗體培養後所獲得之血液衍生組合物接觸 而清除非旦噬細胞之全部或部分組成之步驟，以及回收含 有巨噬細胞之溶液而上述之全部或部分組成仍固定於抗 體， .及/或後續藉由純化步驟，特別是藉由淘析法 (el utri at i on)，而巨噬細胞與培養步驟後所獲得之組合物 的其他組成物理性的分離，特別是與血小板、紅血球及淋 巴球的分離。 一般而言，用於獲得巨噬細胞之任何其他處理，使⑶i 6 於其表面表現者’亦可應用於本發明。 此外’於本發明中所述之「巨噬細胞」意指由單核球 所獲得之任何細胞且其根據已知方法分化，因而使細胞表 現下述膜標記：CD14+、CD16+、CD32+、CD64+、CDllb+。 特別是CD 1 6 +細胞的百分比為至少2 0%，較佳為5 0%，或 70%，或含有為70及100%之間。 單株抗體 為了本發明之目的，本發明所述之「單株抗體」或「單 株抗體之組合物」意指源自細胞聚落且具有相同單一特異 性之抗體分子的製劑。 6023-9628-PF;Kai 22 200902038 免疫球蛋白分子由4的多月太組成：各⑽咖之2個相 同重鏈（H , Heavy)及各25kDa之2個；^ π 4

< ζ個相同輕鏈（L 輕鏈由2個域（domain)組成，可變域v及恆 於空間中各自後折，稱為VL及CL。 S ，彼此 Μ以及稱作㈤至CH4的3個或4^^^作_ -人4徊L域。各域包括約 110個胺基酸且為結構相容的。2 ' u更鏈猎由雙硫橋連結且 各重鏈亦藉由雙硫橋連結至輕鏈。 決定抗體對抗原的特異性的區域係藉由可變部分攜 :，而恆定部分可與效應細胞之Fc受體或與例如補體蛋： 質之分子交互作用而引起不同功能性質。 關於重鏈與輕鏈之可變區域’已觀察到序列之可變化 性不平均分布。實行上’可變區域下述兩區域所組成：已 知為「框架」（FR)之僅猶微可變的區域，編號4(阳至 FR4)，以及可變化性為極度之區域，其為高可變化 (hyPervariable)區域，或CDR(互補決定區域），總數 3(CDR1 至 CDR3)。 " 較佳地，本發明之抗體為嵌合抗體、擬人化抗體或人 類抗體。 本發明之抗體較佳為嵌合的。 。、本發明所述之「嵌合抗體」，意指輕鏈與重鏈的可變 區域所屬之種，與輕鏈及重鏈的恆定區域所屬之種不同。 因此，本發明之抗體亦具有鼠、大鼠、兔、猴、山羊或人 類來源的可變區域，以及與產生抗體之種為屬於不同種之 怪定區域。於此態樣中可使用哺乳類之所有屬及種，且特 6023-9628-PE1；Kai 23 200902038 為人類 猴、大鼠及小鼠、豬、 例如烏。甚至更較#从 馬1田、犬，以及 之怪定區域為人類：定區：發明之抗體之各輕鏈及各重鍵 的免疫性於人類^夂 本發明之較佳具體例使抗體 藥中的藥效。、牛低，且因而改良抗體於人類治療性投 本發明之較#且 定區域為i型 例中，本發明之抗體之各輕鏈的恆 明，例如二Γ(::型(a11。… 本發明之另-二ΓΓ、，2’ 3)或_。 區域為λ _型。 ^明抗體之個輕鏈的怪定 各重月之特疋痛樣中’特別是本發明抗體之各輕键及 重鏈之怪定區域為人類來源時，抗 根據此變化，抗體之各重鍵的恆定區域可為二= 垔或λ 3~型，該恆定區域之三種型且有gj定人i§ ¥ _ 有固疋人類補體的特 属/至是“―型。具有1型恆定區域之重鏈的 心屬於IgG分類。G_型免疫球蛋白（IgG)為由2個重鍵及 2士個㈣Μ成的二異體（heterc)dlmer)，兩者藉由雙硫橋連 ▲各鏈於N終端位置由對抗體直接對抗之抗原為特異的 可變區域或域（輕鏈由v_j重組基因編碼而重鏈m—了重 =基因編碼）所組成，以及,口區域< 終端位置由由單 一 CL域之輕鏈或3個域（CH1的、CH2及ch㈧的重鏈所組 成。重鏈及輕鏈之可變域及]1與CL域的組合形成片 段，其藉由非常可撓之絞鏈域連結至Fc區域，以使各以匕 固定至其抗原目標，而調控抗體作用子性質的Fc區域仍容 6023-9628-PF；Kai 24 200902038 易接近例如FcrR及Clq受體之作用子分子。由2個球型 域Cr2及c”所組成之Fc區域’係於該各2鏈以雙觸 (blantenna)N—聚醣存在下於Cr2域程度經醣基化，連結 至天門冬醯胺酸2 9 7。 抗體之各重鏈之怪定區域較佳為…型，例如顯示於 大數目（人類）個體能誘發ADCC活性（抗體—依賴性細胞毒 性）之抗體。此態樣中，任何同種異型皆適合完成本發明， 例如 Glm(3)、Glm(l，2，Π)、Glm(l，17)或 Glm(1，3)。 本發明之嵌合抗體可使用已知於此項技術領域之標準 重組DNA技術構築，以及更具體地使用揭示於例如

Morrison 5/. , pr〇c. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 81： 6 8 5 1 5 5 ( 1 9 8 4)之欲合抗體之構築技術，其中ρ n a重組技 術使用人類免疫球蛋白之回應區域取代源自非人類哺乳類 之抗體的重鏈恆定區域及/或輕鏈的恆定區域。該抗體及其 製備方法已揭示於例如專利EP 173 494、文獻Neuberger， M-S. et al., Nature 1 985 Mar 21-27; 314(6008): 268-70.，以及專利文獻EP 125 〇23。用於產生嵌合抗體 之方法廣為此項技術領域中具有通常知識者所使用。例 如’抗體之重鏈及輕鏈可使用各鏈之載體分別表現，或其 等可集合於單一載體。 表現載體為核酸分子其中已插入編碼抗體之各重鏈或 輕鍵之可變區域，及/或較佳為人類之編碼抗體之各重鏈或 輕鏈之怪定區域之核酸序列’以將其導入及維持於宿主細 胞中。由於其具有對此表現為不可或缺的序列（啟動子、多 25 6023-9628-PF;Kai 200902038 « 腺苷化序列），其可允許外來核酸片段於宿主細胞的表現。 載體可例如為質體、腺病毒、反轉錄病毒或噬菌體，以及 宿主細胞可為任何哺乳類細胞，例如 SP2/0、YB2/0、 IR983F、Namalwa人類骨髓瘤、PERC6、CH0細胞株，特別 是 CH0-K-1、CHO-LeclO、CH〇-Lecl、CH0-Lecl3、CH0 Pro-5、 CHO dhfr-、Wi l-2、Jurka1:、Vero、Molt-4、COS-7、2 93-HEK、 BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14 及 P3X63Ag8_ 653。 用於構築本發明之嵌合抗體用之表現載體，合成信號 序列及合適的限制酶位置於PCR擴增反應（聚合酶鏈鎖反 應）中可融合至可變區域。然後可變區域與抗體（較佳為人 類IgGl)之恆定區域組合。因此所構築之基因經選殖於啟 動子（例如RSV啟動子）的調鞺且於多腺苷化位置的上游， 使用兩個分別的載體（各用於一鏈）或單一載體。載體亦提 供此項技術領域已知之選擇基因，例如新黴素阻抗性之 dhfr基因。 本發明之嵌合抗體亦可經由此項技術領域中具有通常 知識者習知之方法（例如與磷酸鈣共沉澱、電穿透法、微注 射等），藉由共轉染或單獨轉染重鏈表現載體之輕鏈表現载 體或單一載體至宿主細胞而製造。 擬人化抗體，意指抗體含有衍生自非人類抗體之⑶k 區域，抗體分子之其他部分衍生自一種（或多種）人類抗 體。該抗體可根據CDR接枝方法（CDR_grafting)，已為二 項技術領域中具有通常知識者習知之方法（美國專利第 5, 225, 53 號、美國專利第 6, 18〇, 37〇 號；J〇nes ^ ^ 6023-9628-PF;Kai 26 200902038

Nature 321 ( 6069 ): 522-5. ( 1 986); Verhoeyen et al.·,

Bioessays 8(2): 74-8 (1988)； Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(24):10029-33 (1989); Lewis A.P. and Crowe J.S., Gene 101(2)： 297-302 (1991); Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res. 19(9): 2471-6 (1991); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992) ; Singer et al. , J. Immunol. 150 (7)： 2844-57 (1993) ; Presta eis/.’ J. Immun〇l·， 151: 2623 (1993)) 而製備。預接枝用以製造擬人化抗體之各種人類域之選 擇’對於降低抗體免疫原性（immunogenicity)而不影響該 抗體對其目標之親和性為重要者。用於擬人化抗體的製造 方法中’鼠抗體之可變域的序列與以之可變人類區域的序 列庫相比較且最接近鼠序列的可變人類序列保留作為擬人 化抗體之 FR 區域（框架）[Riechmann Nature 332_ 323-7(1988); Queen C. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24)： 1 0029-33 ( 1 989 ); Sims etaJ., J. Imniunol.,

1 51 : 229 6 (1 993)]。人類FR區域的另一選擇方法將FR序 列次區域（FR1、FR2、FR3及FR4)的序列與已知人類FR序 列庫作比較，而對各FR區域選擇最接近鼠序列之人類FR 序列[美國專利第2003/0040606號；Singer d j Immunol. 1 50 ( 7): 2844-57 ( 1 993); Sato K. and al, Mol. Immunol. 31 (5): 371-81 ( 1 994); Leung S. 0. etal., M〇l. I_unol· 32 ( 1 7-1 8 ): 1 41 3-27 ( 1 995)]。另一方法使用特 6023-9628-PF;Ka 27 200902038 η . 殊FR區域，其係衍生自擬人化抗體重鏈或輕鏈之特定次群 之共有序列（consensus sequence)[Sato K. and a/，Mol.

Immunol. 3 1 ( 5 ): 371 -8 1 ( 1 994)] °CDR 接枝完成於多數 案例係藉由使定位於人類FRs之某些重要殘基閉鎖，以保 留擬人化抗體對其目標之良好親和性[H〇imes Μί A. and

Foote J·，J_ I—unol. 1 58( 5): 21 92-20 1 ( 1 997)]。 本發明之擬人化抗體較佳為其於活體外診斷方法之用 途，或活體内預防及/治療方法。 本發明之嵌合或擬人化抗體具有為人類器官耐受較佳 之有利處，以及至少有與原始抗體同樣藥效。於特別有利 的方法’本發明之嵌合或擬人化抗體為回應原生抗體之兩 倍細胞毒性。於更有利的方法，本發明之嵌合或擬人化抗 體較回應原生抗體為10倍、或甚至是1 〇 〇倍或較佳地超過 5 0 0倍的細胞毒性。 擬人化抗體’意指抗體之各區域係衍生自人類抗體。 該等抗體可衍生自帶有人類抗體基因之轉殖基因鼠或衍生 自人類細胞[Jakobovits ei a/.，Curr Opin Biotechno 1 〇ct； 6(5): 561-6 (1995)； Lonberg N. and D. Huszar Internal Review of Immunology 13: 65-93 (1995).

Tomizuka K. etal., pr〇c. Natl. Acad, Sci. USA 97(2)· 722-727 (2000)]。 本發明之擬人化或人類嵌合抗體較佳藉由此項技術領 域中具有通常知識者習知之重組DNA技術而製造。本發明 之單株抗體較佳可藉由經單離細胞製造，例如選自Sp2/〇、 6023-9628-PF;Kai 28 200902038 « • YB2/0 、 IR983F 、 Namalwa human myeloma 、 PERC6 、 CH0 細 胞株’特別是 CH0-K-1、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CH0-Lecl3、 CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、. Jurkat、Vero、Molt-4、 COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14 以及 P3X6 3Ag8. 6 53，但不限制於此。 本發明之單株抗體亦可藉由轉殖基因動物的方法製 造。轉殖基因係藉由將外源DNA導入至多細胞生物之基因 體且傳遞至其繼代之分子遺傳技術。此傳遞至繼代確立於 發月的早期階段，該DNA安定的融入胚胎之基因體。 例如’使用於本發明範疇之轉殖基因技術之一，由微 注射裸DNA至受精哺乳卵細胞之核前體（pr〇nuc；leus)中或 胚胎幹細胞中，於一定數目的案例中，其將導致為注射dna 为子之部分融入宿主基因體。其他技術亦可使用於轉殖基 因，且特別是用於導入外源（ex〇genic)DNA至活細胞之技 術，其為此項技術領域中具有通常知識者習知之方法，特 別是電穿孔法、藉由磷酸鈣沉澱之轉染、改質微脂體或脂 肪例如 lip〇fectamine®(INVITROGEN)。 本發明之單株抗體較佳藉由轉殖基因動物而製造於該 動物之乳中於此方法中，編碼有興趣蛋白質之基因與基 因-調控單元表現於乳中（例如嫌基因、乳清酸性蛋白之 欠動子）。所彳于之表現載體於單細胞階段於顯微鏡下，微注 射至哺礼動物胚胎。然後移轉胚胎至接受雌性動物。 例如，於妊娠一個月後，經融入轉殖基因（F0)至其基 因體的第一哺乳類產出且藉由耳朵切片樣品PCR分析^ 6023-9628-PF;Kai 29 200902038 , 定。其將作為產出轉殖基因哺乳類第二代之創立者。選擇 創立者於其乳中製造有興趣之蛋白質的效果且用於產生轉 殖基因兔之第二代（F1)。. F1繼代係借由耳朵切片接著進行pcR分析而鑑定。然 後性狀成熟之F1雌性動物以來自非轉殖基因雄性動物之 精子受精。乳係機械地收集且重組蛋白質係經特徵化，以 選擇用於大規模製造以及用於發展純化方法之最佳路線 (GLP 、 pre-GMP 、 GMP)。 同時根據FDA的建礅及歐洲要求，f 1轉殖基因雄性 動物之精子-Master Sperm Bank, MSB-收集且凍結保存於 液態氮。此精子將使用於人工授精非轉殖基因雌性動物以 產生第二繼代（F2)。F2轉殖基因雄性動物之精子—w〇rking SpennBank，WSB-收集且於15至2〇年間將用於產生π轉 殖基因雌性動物，其將於其乳中製造工業量的單株抗體。 此形式之技術例如揭示於專利Ep 〇 527 〇63。 F c伽瑪受體 k. CD16,亦稱為III型Fc伽瑪受體（Fcr RIII)，為存在 於神經免疫系統細胞之受體。與CD32(Fct* RII)以及 CD64(FcrRI)共同，CD16為恆定（Fc)片段IgG抗體重鏈之 特異受體。免疫複合物經由IgG之Fc對該等存在於免疫系 統效應細胞之CD1 6、CD32及CD64受體的結合，活化後者 且特別是免疫複合物吞噬作用。 本發明之效應細胞於其細胞膜表現3型Fc受體： CD64 、 CD32 及 CD16 。 6023-9628-PF;Kai 200902038 CD16文體傳統上稱為「低—親和性受體」，且持續表 現於PMNs(多型性中性球）、單核球之次族群、巨噬細胞、 樹突細胞及自然殺手細胞（NK細胞）。CD1 6參予多重作用子 功能，例如吞噬作用、免疫複合物顆粒之調理素作用 (opsonisation)、以及 ADCC 活性。 本發明套組之單株抗體具有對存在於本發明效應細胞 之Fc受體顯示強親和性之Fc區域，且特別是對⑶“顯示 強親和性。本發明揭示本發明單株抗體之Fc區域與套組之 此親和性使 效應細胞的CD1 6之間的協同作用（synergy) 人類多價血漿IgG(周邊血液之重要組成)於含有抗體與效 應細胞之培養基的添加，對於單豬抗體與效應細胞之間的 組合所產生的ADCC活性不具有或僅有小影響。此係由於單 株抗體之Fc區域對CD16的親和性大於存在於生理條件之 人類IgG的親和性。其結果，無藉由血清IgG之有興趣抗 體置換後，於活體外觀察到的ADCC活性於活體内不減低。

實際上，血漿與血清含有強濃度的多價免疫球蛋白（亦稱為 多價血漿IgG或多株IgG或血清IgG)。套組之單株抗體透 過CD16及CD64的Fc受體誘發效應細胞的活化，而導致藉 由或吞嗟作用之細胞分解。目前通“Μ

IgG透過CD64抑制效應細胞的分解機制，後者於多償 的存在下為經飽和的。 、 ^申請人已顯示套組中對CI)16具有較血漿劃分之經單 離IgG為較大的親和性單株抗體的&區域，誘發心π活 性且不為活體外添加血I igG而受到抑制，因此易於活體 6023-9628-pp;Kai 31 200902038 . 内保留治療活性。此活體内治療活性反應於分解腫瘤細 胞、受病原媒介感染的細胞或產生自體抗體的細胞。 因此’較佳地，於添加人類血漿IgG的情況中.，單株 抗體不為多價I g G所取代。 由於抗體Fc區域對CD 1 6的強親和性’單株抗體結合 至效應細胞，且此結合不為人類多價血漿丨gG所置換，即 便於強血清濃度中亦然。 其結果’即便為低濃度的單株抗體，本發明之套组能 最佳化目標細胞之分解。 較佳地’套組之單株抗體的濃度低於具有相同特異 性、傳統上使用於治療惡性病症、自體免疫疾病或感染性 疾病的單一療法之抗體的濃度。 本發明之特別具體例中，本發明單株抗體之Fc區域具 有與CD16至少2. 1(Γ6Μ-1的組合常數。 較佳地，本發明抗體之組合常數係根據揭示於文獻 : Maenaka 等人（Katsumi Maena，P. Anton van der Merwe,

David I. Stuart, E. Yvonne Jones, and Peter Sondermann; The Human Low Affinity Fey receptors Ila, lib, and III bind IgG with Fast Kinetics and Distinct Thermodynamic Properties. J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 48, 44898-44904，November 30，20 0 1 )之方法而測 量。 本發明之較佳具體例中，套組中之單株抗體濃度較佳 低於1 mg/200百萬個細胞。 6023-9628-PF;Kai 32 200902038 係考慮於病症或注射 本發明之用途，後文稱為套組， 後。作用子/目標之比例不必高，亦即低於工〇，或甚至為 或 〇 · 1 〇 本發明之特別態樣中，效應細胞CD16之單株抗體結合 具有至少2· 1 06M-1的親和性。 "" 例如，本發明之單株抗體可藉由揭示於專利文獻肋 01/77181的方法製造。此方法製造單株抗體能活化⑶ 表現效應細胞’該方法包括下述步驟： a) 純化單株抗體，該單株抗體由融合瘤（特別是種間融 合瘤（heterohybridoma)以及經轉染有包括編碼該基因之 載體的動物或人類細胞株選出的細胞株為來源之各種聚落 所獲得者； b) 步驟a所獲得之各抗體添加於不同反應混合物中， 包括： i ·該抗體之目標細胞，

i i ·包括FcyR 111表現細胞之效應細胞 i i i ·多價 I g G， c)測定目標細胞之分解百分比且選擇活化效應細胞引 起目標細胞顯著分解之單株抗體（ADCC活性取決於 FcyRIII)。 對於各抗原特異性，本發明之單株抗體實際上於含有 單株抗體之組合物中，由於皆源自相同細胞聚落故其於— 級結構層次皆相同。然而’單株抗體組合物之所有抗體不 擁有相同的聚醣分布情況。人類及動物抗體於其各重鏈之 6023-9628-PF;Kai 33 200902038 CH2域具有N-鍵結寡糖。對於G免疫球蛋白，募糖的鍵結 位置為天冬醯胺酸297(Asn297根據Kabat)。此天冬醯胺 酸殘基亦稱為「F c r醣基化」。 鍵結至Asn297之寡糖鏈的末端稱為「環原端」 (redactor extremity)，而相反末端稱為「非環原端」。

IgG抗體之Fc區域中，有兩個Fc<r醣基化位置；因 此兩個寡糖鏈鍵結至各抗體分子。 因此，於單株抗體組合物中，募糖鏈具有多種結構， 取決於由製造細胞株所授予之醣基化。然而該等鏈具有通 用之基礎結構： —結合至Asn297 GlcNAc ·:甘露糖

通用於所有單株抗體之此基礎結構，可進一步包括下 述糖類：N-乙酿基葡糖胺（GlcNAc)、海藻糖（心）及半乳糖 (gal)。N-寡糖之主要醣基化形式係如下所示··

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IcNAc⑩：甘露糖:半乳糖卜：海藻糖 由於各寡糖鏈可包括一種或多種該等糖類，且因此 八本身為本文上述之G〇、G〇F、G1或GW形式，於 6023-9628-pF；Kai 34 200902038 株抗體組合物中有多類募 物於可為-抗體組合物與另一二授:f株抗體組合 例。因此源自相同細胞株聚;5之D玄等糖類之比 化之抗體組合物。 ^產生聚糖組合物為可變 因此，申請人意外地已顯示复 m , A , ，、中海澡糖的比率低於65% 的早株抗體組合物對於CD16 強親和性。更具體地，此 形心之早株抗體組合物具有 ^ ^ ^ τ 0 對CD16的親和性為高 於夕h IgG對CD16的親和性。此外^人λ .^ ^ τ 兄$迮此外，組合物之單株抗體不 马血清I g所置換。 用於製備该等早株抗體之方法係揭示於例如專利申古青 案W0 〇1/77181。本發明 月之有利的具體例中，單株抗體組 合物係藉由具有低酵素活性以使海藻糖加成至還原端之N— ^酿基葡糖胺的細胞而製造，該酵素較佳為海藻糖基轉移 S#(fucosyltransferase)。 本發明之另一具體例中’於單株抗體組合物可能作用 有酵素’例如海藻糖酶’以獲得包括該比率海藻糖之單株 抗體組合物。 本發明之較佳具體例中，單株抗體組合物係於 YB2/0(ATCC CRL- 1 662)製造。 藉由有利的方式，本發明套組之單株抗體係直接對抗 5C5杬原（由腎細胞瘤的細胞所表現之腫瘤抗原）、BCR(B細 胞丈體）、例如作為抗—FVI11抑制劑抗體之遺傳性型 (ldiotype)、TCR(T 細胞受體）、CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、 CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD45、CD30、 6023-9628-PF;Kai 35 200902038 CD33、CD3 7、CD3 8、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66(a、 b、c、d)、CD74、CD8〇、CD86、CD126、CD138、CD154、MUC1(黏 液蛋白1)、MUC2(黏液蛋白2)、MUC3(黏液蛋白3)、MUC4(黏 液蛋白4)、MUC16(黏液蛋白16)、ημ1·24(過度表現於多發 性骨:¾•瘤之槳細胞的特異抗原）、t e n a s c i η (細胞基質外的、 蛋白質）、GGT(伽瑪-麵胺酸轉移酵素）、VEGF(血管細胞生 長因子）、EGFR(上皮細胞生長因子）、CEA(癌胚胎抗原）、 CSAp(大腸特異性抗原-P)、iLGF(類胰島素生長因子）、胎 盤生長因子、Her2/neu 、碳酸酐酶（carb〇nic anhydraseMX、IL-6、S100蛋白質（結合鈣之蛋白質的多 基因家族（multigenic family))、MART-1 (相關於黑色素細 胞瘤之腫瘤分化抗原）、TRP-1 (酪胺酸酶相關之蛋白質i)、 TRP-2(酿胺酸酶相關之蛋白質2)、gpl〇〇(糖蛋白 lOOkDa)、澱粉樣蛋白質、rhesus d抗原、例如HLA —DR之 MHC分子的群I及II)、來自經突變基因（特別是致癌基因 或腫瘤抑制基因）的表現所產生的抗原、由某腫瘤表現的致 癌性病毒所衍生的抗原、過度表現於某些腫瘤且輕微表現 於正常組織的泛見抗原例如苗勒激素（Μϋ1丨叶丨时 的Π型受體、醣基化或未醣基化之蛋白質、磷脂、藉由經 感染的細胞使其本身或非其本身表現或暴露於細胞^之分 子例如磷脂絲胺酸（Ph〇SPhatidylserine)及藉由病原媒介 (細菌毒素、細菌壁或寄生蟲壁之蛋白質複合物、病毒外套 糖蛋白（例如HIV病毒、HBV、HCV及RSV)所表現或分泌之 蛋白質，但不限制於此》 6023-9628-PF;Kai 36 200902038 - 本發明之抗體較佳為直接對抗CD2 0。 CD20抗原為具有分子量35至37kDa之疏水性穿膜蛋 白質’期存在於成熟B淋巴球的表面（Valentine以a/. 1 987, Proc Natl Acad Sci U. S. A. 84(22)： 8085-9；

Valentine et al. 1 989, J.Biol. Chem. 264( 1 9 ): 1 1 282-1 1 287)。其表現於b淋巴球由早期pre — B階段直到 於漿細胞中分化（為此表現消失的階段）的發展中。CD2〇抗 原存在於正長B淋巴球及惡性b淋巴球細胞兩者。更具體 地’ CD20抗原表現於多數的b表現型淋巴瘤（淋巴瘤之 8〇%).其係表現於例如超過9〇%的淋巴球b非何杰金氏淋 巴瘤（NHL)，且不超過95%的B型慢性淋巴白血病（LLC-B)。 CD20抗原不表現於造血幹細胞或漿細胞。 CD20的功能仍未完全釐清，然而其可作為齊離子通道 且介入B淋巴球之分化（Golay a/. 1985，】1_仙〇1.;

1 35(6): 3795-80 1 )及增生（Tedder* ez" s/. 1 986, Eur J

Immunol. 1 986 Aug; 16(8): 88卜7)之主要步驟的調控。 本發明之較佳具體例中，抗—CD2〇抗體之組合物係藉 由YB2/0製造且具有海藻糖比率低於65%。 本發明之特定具體例中，例如抗體及其製造方法，係 揭示於專利申請案W02006/0641 21。 有利地’該抗體之重鏈的胺基酸序列為序列編號丨所 示之序列。 有利地，該抗體之輕鏈的胺基酸序列為序列編號2或 . 3所示之序列。 6023-9628-PF;Kai 37 200902038 簡e之’根據專利申請案w〇2〇〇6/〇64121的教示，藉 由使能表現本文所述輕鏈及重鏈的載體轉染γΒ2/〇的方 法，可獲得抗體。 本發明之較佳具體例中’單株抗_CD2〇抗體之組合物 具有海蕩糖比率低於65%，且包括較佳界於2〇及桃之間， 或海藻糖/半乳糖的比率低於〇 6。 本發明之較佳具體例中’套組之單株抗體係甴寄存於 CNCM之寄存編號為CNCM卜3314之R5〇9聚落所製造。 本發明之另一較佳具體例中，套組之單株抗體係由寄 存於CNCM之寄存編號為CNCM卜3529之R6〇3聚落所製造。 申请人已顯示本發明之套組有效於治療LLC — B，此乃 係由於來自患有LLC-B之患者的惡性細胞於低抗體濃度 下，包括人.類血清的存在下，於活體外分解，甚至是比 率低於或專於10’甚至是5或2的e: T。 本發明之套組因而允許藉由抗體之可變區域所辨認之 目標的最適化分解，此係由於效應細胞與抗體Fc區域之間 的物理性交互作用（結合），其為充份強力而不為多價 所取代。 有利地，含於本發明套組用於治療LLC_B之單株抗體 的濃度低於375mg/m2。 由於其關於低毒性、特異性及降低劑量之有利處，包 括抗-CD20抗體之套組可投藥用抑制療下述病症·惡性病 症具有CD20陽性b淋巴球之淋巴增生症候群而具有例如b 型NHL或急性或慢性淋巴.B白血病、自體免疫及/或炎性疾 6023-9628-PF;Kai 38 200902038 . 病例如器官移植排斥、移植物對抗宿主疾病、類風濕性多 發性關節炎（rheumatoid polyarthritis)、全身性紅斑性 狼瘡之眼底病變（disseminated lupus erythematosus)、 硬皮症（sclerodermia)、原發性修格連氏症（primitive Sj0gren’ s syndrome(或葛特-修格連氏症）（G〇uger〇1; — Sj0gren syndrome)、自體免疫多發性神經病變 (auto-immune P〇 iyneuropathi es)和J 士口 多發十生硬 <匕症、第 I型糖尿病、自體免疫肝炎、僵直性脊椎關節炎（ankylosing spondylarthritis)、萊特氏症（Reiter’ s syndrome)、痛 風性關節炎（gout arthritis)、腹腔性疾病（coeiiac disease)、克隆氏症（Crohn，s disease)、橋本氏甲狀腺 炎（Hashimoto’ s thyroiditis)、艾迪森氏症（Addison，s disease)、自體免疫肝炎（auto-immune hepatitis)、巴塞 多氏症（Basedow’ s disease)、潰瘍性大腸炎、血管炎例 如相關於ANCA(抗中性細胞質抗體）之全身性血管炎、自體 免疫血球減少症以及於成人與兒童之其他金液併發症，例 如急性或慢性自體免疫血小板減少症（acute or chronic auto-immune thrombopenias)、自體免疫溶血性貧血 (auto-immune haemolytic anaemias)、新生兒的溶血性疾 病（HDN)、冷凝急素病（cold agglutinin disease)、血栓 性血小板減少性紫斑症（thrombocytopenic thrombotic purpura)及後天自體免疫血友病（acquired auto-immune haeraophi 1 ia);古巴斯德症（Goodpasture’ s syndrome) ' 外膜性腎炎（extra-membraneous 6023-9628-PF;Kai 39 200902038 遐光疫水泡皮膚症（aut〇—immune nephropathies bullous skin disorders)、難治性肌無力（refract〇ry myasthenia)、混合性冷球蛋白血症（mixed cryoglobulinemias)、乾癬（psoriasis)、幼年型慢性關節 炎（juvenile chronic arthritis)、炎性肌炎、皮肌炎 (dermatomyositis)以及包括抗磷脂症候群 (antiphospholipids syndrome)之兒童全身性自體免疫疾 病，但不限制於此。 較佳地，本發明之套組為可注射溶液。可注射溶液有 利地為局部或全身性可注射溶液。於特定具體例中，對患 者元成6次投藥。每日或每兩日或一週完成一個投藥，然 後一個月或兩個月每週一個，每月三次一個投藥，治療可 更新數次。 於補充具體例中’效應細胞係投藥於劑量包括每次注 射界於1〇4及109個效應細胞。 於另一補充具體例中，本發明之抗體係投藥於劑量包 括每次注射界於1及5 00rng的抗體。 本發明之另一特定具體例中，效應細胞為重複投藥多 達1 〇次’各投藥之時間間隔包括界於2日及1 2個月之間。 本發明之另一特定具體例中，單株抗體係重複投藥多達10 ""人’各投藥之時間間隔包括界於2日及1 2個月之間。本發 明之另一具體例中’單株抗體及效應細胞係同時投藥。 本發明之另—具體例中，單株抗體及效應細胞為依序 才又藥單株彳几體投藥於效應細胞之前。 6023-9628-PF；Kai 40 200902038 本&月之另具體例中，單株抗體及效應細胞為依序 投藥，單株抗體投藥於效應細胞之後。 本發明之另一’日仏 的為包括本發明之套組的醫藥組合 物 另目的係關於本發明套組之用途，係用以

製造治療惡性、自體#、志斗4 U 肢光疫或感染性病症之藥物。 此藥物或醫藥組合铷古 ^ 物有利地包括賦形劑及/或藥學上 可接受的載劑。 賦形劑可為任何溶、波 .g„ ^ 液’與4樂用途相容且為此項技術 領域中具有通常知識者習知者，例如生理鹽水、生理的、 粉末等。 安定劑、 再者，本 等張的、緩衝溶液等，以及任何懸浮物、凝膠 本發明之組合物亦可含有 负k目刀政劑、溶解劑 界面活性劑、防腐劑等— 裡及夕種樂劑或載劑 發明之組合物亦可#扭甘Μ — +, J包括其他樂劑或活性成分。 本叙明之另一目地為本發明备知七 A月套組之用途，用於製造藥 物。 本發明之另一目地為 奴乃貧組之用途，用於制 療惡性病症之藥物。 、t k Π 有利地，此惡性病症係選自 變。實體腫瘤係選自黑色素細胞瘤、二惡性血液病 瘤及皮膚癌。癌係選自腎、穿 乂胗貝 巢、前列腺、子宮、膀胱、肝、膽逼、即 成組群。 Μ及睪丸之癌所 惡.性血液病變传 文係璉自淋巴增生 6023-9628-PF;Kai ., 200902038 (lymphoproli ferative) 、 骨 體增生 (myeloprol i f erative)、具B型NHL之骨髓造血不良症候 群（myelodysplasic syndromes)及急性骨髓白血病（acute myeloid leukemias)、急性或慢性B淋巴白血病(acute or chronic B lymphoid leukemias)、伯基特氏淋巴瘤 (Burkitt，s lymphoma)、 多毛細胞白血病 (tricholeucocyte leukaemia)、急性及慢性淋巴球性白血 病（acute and chronic myeloid leukemias)、T 淋巴瘤及 白血病、何杰金氏淋巴瘤（H〇dgkin，s lymph〇mas)、華登 氏巨球蛋白血症（Waldenstr0m’ s macroglobulinemia)及 多發性骨髓瘤（mu 11 ip 1 e mye 1 omas)，不限制於此清單。 本發明之另一目地係本發明套組之用途，用於製造欲 用於治療自體免疫及/或炎性原發性或繼發性炎性疾病，該 等疾病對器官或全身性為特異的且不相關於病原性自體抗 體’選自器官移植排斥、移植物對抗宿主疾病、類風濕性 多發性關節炎（rheumatoid polyarthritis)、全身性紅斑 性狼瘡之眼底病變（disseminated lupus erythematosus)、硬皮症（scierocjermia)、原發性修格連 氏症（primitive Sjogren’ s syndrome(或葛特-修格連氏 症）（Gougerot-Sj6gren syndrome)、自體免疫多發性神經 病、菱（auto-immune p〇lyneur〇pathies)例如多發性硬化 症、第1型糖尿病、自體免疫肝炎、僵直性脊椎關節炎 (ankylosing spondylarthritis)、萊特氏症（Reiter’ s syndrome)、痛風性關節炎（g〇ut arthri t丨3)、腹腔性疾病 6023-9628-PF;Kai 42 200902038 t- . (coel iac disease)、克隆氏症（Crohn，s disease)、橋本 氏曱狀腺炎（Hashimoto’ s thyroiditis)、艾迪森氏症 (Addison’ s disease)、自體免疫肝炎（aut〇-i_une hepatitis)、巴塞多氏症（Base'dow’ s disease)、潰瘍性 大腸炎、血管炎例如相關於ANCA (抗中性細胞質抗體）之全 身性血管炎、自體免疫血球減少症以及於成人與兒童之其 他血液併發症’例如急性或慢性自體免疫血小板減少症 (acute or chronic auto-immune thrombopenias)、自體 免疫溶血性貧血（auto-immune haemolytic anaemias)、新 生兒的浴血性疾病（HDN)、冷凝急素病（cold agglutinin disease)、血栓性血小板減少性紫斑症（thromb〇Cytopenic thrombotic purpura)及後天自體免疫血友病（acquired auto iiiiiniine haemophilia),古巴斯德症（Goodpasture，s syndrome)、外膜性腎炎（extra-membraneous nephropathies)、自體免疫水泡皮膚症（au1;〇_immune : bullous skin disorders)、難治性肌無力（refract〇ry myasthenia) >混合性冷球蛋白血症（mixed cryoglobul inemias)、乾癬（psoriasis)、幼年型慢性關節 炎（juveni le chronic arthritis)、炎性肌炎、皮肌炎 (derinatoinyositis)以及包括抗鱗脂症候群 (antiphosphol ipids syndrome)之兒童全身性自體免疫疾 病不限制於此清單。 本發明之另一目地為本發明套組之用途，用於製造治 療.感染性疾病之藥物。 6023-9628-PF;Kai 43 200902038 下述所誘發者：病毒

傷風桿菌（tetanus)、白喉桿菌（diphtheria)、肺炎雙球菌 (pneumococci)、腦膜炎雙球菌mening〇c〇cci)、葡萄球菌 有利地’此感染性疾病係選自由 (人類免疫不全病毒或ΗIV )、肝炎病 病毒（Epstein-Barr virus)或 e 包括曱 包括曱氧西林（methicilin)阻抗形式、克雷 (Klebsiellas)、志贺氏桿菌（Shigellas)、綠 白桿菌 綠腺桿菌 (pseudomonas aeruginosa)、腸桿菌（enter〇bacteria)或 抗生素阻抗病原包括院内感染性疾病（n〇s〇c〇mial diseases))，寄生蟲（瘧疾（paiudism)、利甚曼病 (leishmaniosis)、錐蟲病（trypanosomiasis))以及新興的 疾病’例如曲弓熱（Chikungunya)、禽流感（bird flu)、嚴 重急性呼吸道病毒症候群（sevei*e acute respiratory virus syndrome)或SARS ;造成出血熱的病毒，例如伊波 拉（Ebola)病毒、登革熱（Dengue fever)病毒或西奈病毒 (west Nile virus);以及相關於生物恐怖者，例如炭疽熱 (Anthrax)、肉毒桿菌中毒（Botulism)、鼠疫（Plague)、天 花（smallpox)及癌病毒（p〇xVirus) 、土拉倫斯病 (Tularaemia)、出血熱媒介、布氏桿菌（brucellosis)、葡 萄球菌之 B腸毒素（B Enterotoxins)、白喉毒素 (diphtheric toxin)或 病.毒 性 腦 炎（viral 6023-9628—PF;Kai 44 200902038 • Encephalitis)，不限制於此清單。 本發明之其他態樣及有利處將於下述實施例中加以詳 述’但該箏實施例必須視為示例且不限制本發明之範疇。 實施例 實施例1 :巨噬細胞中單核球之分化 單核球藉由於F i co 1 and Perco 1密度梯度劃分而.由周 邊血液單離’然後培養於含有l〇%SVF之RPMi培養基中且 添加M-CSF(單核球聚落刺激因子）（50ng/ml)。7日後，獲 得之巨噬細胞為 CD14+、CD16+、CD32+、CD64+、CD1 lb+、 CDla-、CD80-、CD83-表現型。 因此，M-CSF分化使CD1 6表現於巨噬細胞表面。 實施例2 :抗-D抗體與巨噬細胞所表現之cd 1 6的交互作用 抗-D R297抗體（亦稱為「EMAB1 ing R297」）之結合與 AD1抗體之結合相比較。抗_D R297抗體揭示於專利文獻 W0 01 / 77181，且根據此文獻所揭示之方法製造。此抗體於 YB2/0 細胞（ATCC CRL-1662)製造。 比較R297抗體與AD1抗體（揭示於專利文獻W0 0 1 / 77181 ’由種間骨髓瘤表現）於巨嗟細胞cj) 1 6之結合。 抗-CD16抗體（製造聚落3G8)之置換分析 (displacement assay)允許測量單株抗體於該等巨噬細胞 之CD 1 6受體之結合，不考慮其特異性。 經純化之巨嗟細胞與多種濃度（〇至83 # g/m 1)的抗-D 抗體培養且於經測定濃度下與抗-CD1 6 3G8抗體偶合至螢 光色素（3G8-PE)。 45 6023-9628-PF;Kai 200902038 ， 清洗後’抗體3G8-PE於巨噬細胞之CD16受體之結合 使用流體細胞儀評估。能結合其本身於CD1 6的抗體參與 3 G 8抗體之結合競爭’以及結果誘發肝I (平均螢光強度） 減低。結果以螢光平均（MFI )表示，作為欲評估之抗體量的 函數。.. 第1圖顯示當相較於AD1抗體時，R297抗體非常強力 地結合於巨噬細胞CD 1 6。 於平穩時期’ EMAB1 ing抗體誘發置換，其至少6倍大 於AD1抗體。 實施例3 :抗-CD2〇 EMAB6及EMAB603抗體與巨噬細胞所表 現之CD1 6的交互作用 抗-CD20 EMAB603抗體（由R603聚落所製造，寄存於 0?^乂，編號為1 — 3529)以及丑1^36(由{?509聚落所製造，寄 存於CNCM ’編號為1-3314)於巨噬細胞CD16之結合與利妥 昔單抗（Rituxan)之結合相比較。抗-CD20 EMAB6及EMAB603 抗體係根據揭示於專利申請案W0 20 0 6/0 641 21之方法而製 造，特別是第26至33頁。再者，製造該等抗體之聚落可 由CNCM獲得，其存取編號分別為CNCM I-3314及CNCM 1-3529 。 抗-CD16抗體（製造聚落3G8)之置換分析 (displacement assay)測量單株抗體於CD16受體之結合， 不考慮其特異性。 巨噬細胞與多種濃度（〇至83/z g/mi)的抗 -CD20(EMAB6、EMAB603或利妥昔單抗）抗體培養且於經測 6023-9628-PF;Kai 200902038 • 定濃度下與抗-CD16 3G8抗體耦合至螢光色素（3G8-PE)。 清洗後，抗體3G8-PE於巨噬細胞之CD1 6受體之結合 使用流:體細胞儀評估。能結合其本身於CD 1 6的抗體參與 3G8抗體之結合競爭，以及結果誘發MFI (平均螢光強度） 減低。結果以螢光平均（肝丨）表示，作為欲評估之抗體量的 函數。

Imax值（3G8結合之最大抑制）及IC5〇值（誘發ι·χ5〇% , 之3G8結合抑制所需之抗_CD2〇抗體濃度）使用pRISM統計 分析軟體計算。 結果：EMAB6及EMAB603抗體於巨噬細胞CD16之交互 作用遠大於與利妥昔單抗所獲得之交互作用。 因此’既然此分析係於無抗原目標下實施，本發明之 抗-CD20抗體具有強力地結合於巨噬細胞CD16的能力。 貫施例4 :抗-D/紅血球Rh + /巨噬細胞ADCC活性、IVIg多 價物（Tegeline®)之角色 I 抗—D抗體之細胞毒性能力係藉由ADCC技術加以研 究。抗-D抗體、巨噬細胞（於M_CSF中分化之單核球）及 Rhesus D+紅血球（效應細胞/目標比例約2/1)，於多種濃 度之夕4貝免疫球蛋白（IVIg) (Tegel ing(g))的存在下，於Μ C坧養1 6小日守。然後藉由色度計測量由抗體所誘發之細胞 毒性活性，以定量上清液中由分解的紅血球所釋放之血紅 素。特異分解的結果表現為分解百分比。 第2圖的結果顯示於巨噬細胞的存在下，emabi丨叫 R297抗體於顯著澧庶的TVTrvy·* — -τ*/ η丄 辰度的iVIS存在下仍具有強力的AD.CC活 6023-9628-PF;Kai 47 200902038 ， 性’相對之AD 1抗體僅於無i v I g存在下藉由ADCC誘發分 解。 因此，無多價免疫球蛋白的存在下，兩個抗_D抗體， EMABlingR297及AD1具有大約29%的ADCC活性。相對地’ 於5mg/ml濃度的多價免疫球蛋白時，EMABHng抗體顯現 至少多20倍的活性（23%分解相對於1%AD1)。於更強濃度 的多價免疫球蛋白時USmg/ml)，維持此有利處，對於 EMAB1 ing及AD1抗體預期之分解百分比為及。 貫施例5 .抗-D/紅血球Rh+/巨嗟細胞adcC活性、I VIg多 價物（Tegeline®)之角色 根據實施例4所揭示之相同方法’亦於Ra〗i細胞及巨 嗟細胞（於M-CSF中分化之單核球）的存在下，研究抗—⑶別 之ADCC活性。抗-CD20抗體（由R603聚落或RHuxan所製 造）於巨噬細胞、Raji細胞及多種濃度的多價 1乂4(1'叫6 1丨叫©)的存在下進行培養。於37。(：：培養16小時 後，由抗體所誘發之ADCC活性藉由色度計測量以定量上清 液中由Ra j i細胞所釋放之細胞内LDE(乳酸脫氫酶）的量。 特異分解的結果表現為分解百分比。 結果顯示’於表現CD16之巨噬細胞及Tegeune®的存 在下，抗-CD20 R603抗體具有至少2倍大於由Rituxan所 誘發之ADCC活性。此ADCC活性取決於巨嗟細胞所表現之 CD16 ’例如由抗-CD16 3G8之抑制效果所示。 實施例6 :抗-D/紅血球Rh + /巨噬細胞ADCC活性。CD1 6顯 著於IVI g的存在 6023-9628-PF;Kai 48 200902038 . 抗-CD16抗體，3G8的添加，於最強的IVIg測試濃度 的存在下，抑制由EMABling抗體所誘發ADCC，顯示誘發 ' 的分解取決於表現於巨噬細胞之CD16(第3圖）。 實施例7 : IVIg存在下EMAB1 ing R297抗體所誘發之CD16 + 巨噬細胞之Rhesus +紅血球的吞噬作用 抗-D R297抗體藉由CD16+巨嗟細胞誘發Rhesus +紅血 球之吞噬作用的能力’係藉由流體細胞儀研究。抗一D抗體、 以PKH67(於M-CSF中分化之單核球）標記之巨噬細胞以及 以PKH26標記之Rhesus +紅血球（效應細胞/目標之比例為 5/1) ’於多種濃度之多價ivig(Tegeline®)的存在下於4 C及37°C培養3小時。 結果回應於PKH67/PKH26雙標記之百分比，亦即具有 經吞噬之至少一紅血球。 結果：於4。(： ’巨噬細胞及紅血球於細胞儀出現於不 同視窗，各以特異的螢光色素標記。吞噬作用百分比非常 ' 低’無IVIg時約4%，而於IVIG存在下為1至2%。於代 之該等值為有系統地演繹以公式化於37°c之吞噬作用百分 比。 於37°C，對於兩個分析的R297 EMABling及AD1抗體’ 於無IVIG時，PKH67/PKH26雙標記之百分增加。於IVIG 存在下，相對於AD1抗體，僅EMABling抗體具有呑噬Rh + 紅血球的能力。因此，應為有0、i或2mg/na的Ivig，吞 噬作用的百分比仍界於15及20%之間，顯示IVIg的添加 不抑制由EMAB1 i ng抗體所誘發蚕噬作用。 6023-9628~PF；Kai 49 200902038

於濃度lmg/ml時，EMABl ing抗體為至少5倍大於ADI « 抗體。於濃度高於 2mg/ml時，吞噬作用百分比使用 EMABling抗體為16. 9%而使用AD1抗體則為不顯著（值〇)。 實施例8 : IVIg存在下R603抗體所誘發之CD16+巨噬細胞 之Rhesus+紅血球的吞嗤作用 亦研究於IVIg存在下之R603抗體所誘發之CD16巨噬 細胞存在下之CD2 0 Ra j'i細胞的吞0筮作用。 抗-〇〇20抗體藉由〇〇16 +巨噬細胞誘發1?叫1細胞之吞 嗤作用的能力’係藉由流體細胞儀研究。抗—CD2〇抗體、 以PKH67(經分化之單核球m-CSF)標記之巨噬細胞以及以 PKH26標記之Ra j i細胞（效應細胞/目標之比例為5/卜丨〇/工 及20/1)’於多種濃度之多價IVig(Tegeiine@)的存在下於 4 C及3 7 C培養3小時。 結果回應於PKH67/PKH26雙標記之百分比，具有經吞 嗟之至少一 Ra j i細胞。 結果 ： 於4 C，巨噬細胞及Raj丨細胞於細胞儀出現於不同視 窗，各以特異的螢光色素標記。吞噬作用的百分比非常低， 無ing及iVIg存在下百分比低於5%，而於niG存在下 為1至2/於4 C之該等值為有系統地演繹以公式化於37 °C之吞噬作用百分比。 於37°C，對於兩個分析的抗—CD2〇R6〇3& ⑽⑽抗 體，無IVIG時，ΡΚΗ67/ρκΗ26雙標記之百分比增加。 於IVIG存在下，當相較於RHuxan抗體時，對於吞噬 6〇23-9628-PF;Kai 200902038

Ra j i細胞’ EMAB1 i ng抗體具有較大能力約2倍、4倍甚至 10倍。因此’應為有0、1或2mg/ml的ivig，吞嗟作用的 百分比通常仍較大於由Rituxan所誘發者，顯示iVIg的存 在下，EMAB 1 i ng抗體於CD1 6 +巨嗜細胞的存在下誘發吞嗟 作用。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示抗-D R297 EMAB1 ing抗體及AD1抗體透過 競爭測試對巨噬細胞之CD16(Fc r R受體）的結合。 第2圖顯示在多種濃度之多株免疫球蛋白（ivig)的存 在下，巨噬細胞誘發之EMAB1 ing R297抗體及AD1抗體之 ADCC活性。 弟3圖顯示多種濃度之免疫球蛋白（ivig)及濃度 6. 25 // g/ml之抗-CD16 3G8抗體的存在下，巨噬細胞誘發 之EMABling R297抗體及AD1抗體之ADCC活性。 第4圖顯示多種濃度之免疫球蛋白（ivig)的存在下， Rh+紅血球透過由EMAB1 ing R29 7抗體及AD1抗體所誘發之 巨噬細胞之吞噬作用。 【主要元件符號說明】 無0 6023-9628-PF；Kai 51

Claims (1)

1. 200902038 十、申請專利範圍： 1 · 一種用於治療惡性病症、自體免疫疾病、或感染性 疾病之套組，包括一於其表面表現Fc 7" RI11受體（CD16) 的效應細胞（ef f ector ce 11);以及一單株抗體，該單株抗 體的Fc區域對CD 1 6的親和性大於多株免疫球蛋白的fc區 域對CD16的親和性。 2. 如申請專利範圍第1項所述之套組，其中該於其表 面表現FctRIII受體（CD16)的效應細胞為一於其表面表 現Fc γ RI Π受體（CD 1 6 )的單核球、或單核球或單核球前驅 體所衍生之細胞。 3. 如申請專利範圍第1或2項所述之套組，其中該於 其表面表現CD1 6的單核球或單核球前驅體衍生之細胞係 擇自於表現C D1 6之單核球、巨嗟細胞、自然殺手細胞、樹 犬細胞及所有周邊血液單核細胞（pBMC)。 4. 如申請專利範圍第3項所述之套組，其中該於其表 面表現CD1 6之單核球或單核球前驅體衍生細胞為一巨噬 細胞。 ^如申請專利範圍第1至4項中任-項所述之套組， ;4單株抗體Fc區域對CD16的親和性，使該單株抗體 存在於人類血清中不會被多株免疫球蛋白所取代。 申請專利範圍第i至5項中任一項所述之套組， Λ單株抗體結合該單核球或單核球衍生細胞CD1 6之 親和性大於2. 1 06Μ —丨。 .7.如申請專利範圍第1至6項中任-項所述之套組， 1 200902038 其中該單株抗體係製造為單株抗體組合物的形式，其中該 抗體畀有連結於醣基化位置（glycosylation si te)(天冬醯胺297)的N-連結糖鏈’且其中該組合物中所 有抗體之連結於F c τ醣基化位置的所有N -連結糖鏈中， 海藻糖的比率小於65%。 8 ·如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之套組， 其中該單株抗體係直接對抗擇自下列之抗原：5C5抗原（由 腎細胞瘤的細胞所表現之腫瘤抗原）、BCR(B細胞受體）、 作為抗-FVIII抑制劑抗體之遺傳性型（idi〇type)、TCR(T 細胞受體）、CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、 CD2卜 CD22、CD2 3、CD2 5、CD45、CD3 0、CD33、CD37、CD38、 CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD6 6(a、b、c、d)、CD74、 CD80、CD86、CD126、CD138、CD154、MUC1(黏液蛋白 l)、 MUC2(黏液蛋白2)、MUC3(黏液蛋白3)、MUC4(黏液蛋白4)、 MUC16(黏液蛋白16)、ΗΜ1·24(過度表現於多發性骨髓瘤之 漿細胞的特異抗原）、tenascin(細胞基質外的蛋白質）、 GGT(伽瑪-麩胺酸轉移酵素）、VEGF(血管細胞生長因子）、 EGFR(上皮細胞生長因子）、CEA(癌胚胎抗原）、CSAp(大腸 特異性抗原-p)、ILGF(類胰島素生長因子）、胎盤生長因 子、Her2/neu、碳酸酐酶Ix、IL_6、sl〇〇蛋白質c结合鈣 之蛋白質的多基因家族）、MART—丨（相關於黑色素細胞瘤之 腫瘤分化抗原）、TRP-1 (酪胺酸酶相關之蛋白質丨）、 TRP-2(酪胺酸酶相關之蛋白質2)、gpl〇〇(糖蛋白 lOOkDa)、澱粉樣蛋白質、rhesus D抗原、HLA_DR之迎c 200902038 a *分子的群1及11、來自經突變基因（特別是致癌基因或腫 瘤抑制基因）表現所產生的抗原、由某已知腫瘤表現的致癌 性病毒所衍生的抗原、過度表現於某些腫瘤且輕微表現於 正常組織的泛見抗原，苗勒激素（MiiUerian h〇rm〇ne)的 π型受體、醣基化或未醣基化之蛋白質、磷脂質、藉由經 感染的細胞使其本身或非其本身表現或暴露於細胞膜之分 子，磷脂絲胺酸（phosphatidyl serine)及藉由病原媒介（細 菌毒素、細菌壁或寄生蟲壁）之蛋白質複合物、病毒外套糖 蛋白（HIV病毒、HBV、HCV及RSV)所表現或分泌之蛋白質。 9·如申請專利範圍第8項所述之套組，其中該單株抗 體為直接抗CD20。 10·如申請專利範圍第9項所述之套組，其中該抗 -CD20抗體係由寄存於CNCM之寄存編號為3314的細胞 株R509所產生，或由寄存於CNCM之寄存編號為卜3529的 細胞株R 6 0 3所產生者。 11 ·如申請專利範圍第1至1 〇項中任一項所述之套 組’其係同時的、依序地或分別地使用於治療。 12.如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之套 組’其中s亥於其表面表現cd 16之效應細胞於該抗體之目標 細胞具有細胞毒性活性，該目標細胞與具CD 16的抗體有交 互作用。 1 3.如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之套 組’其中該單株抗體於表現CD1 6的效應細胞存在下，藉由 s玄抗體之目標細胞的adcc活性或吞嗤作用誘發細胞毒性。 200902038 14. 一種醫藥细.·· _任一項之套組，以及藥學上 15. —種申請專利範圍第

   至13項 利範圍第1至 組之用途，係用於製造藥物。 16. —種申請專利範圍第j 又叼與形劑。 13項中任一項所述之套 至13 項中任一項之套組之 用途，係用於製造用以治療惡性病症之藥物。 Π.如申請專利範圍第16項之套纽之用途，係用於治 療擇自實體腫瘤及惡性血液病變之惡性病症。 18_如申請專利範圍第17項之套組之用途，其中該實 體腫瘤係擇自於黑色素細胞瘤、癌、 肉瘤、神經膠質瘤及 皮膚癌。 19.如申請專利範圍第18項之套組之用途，其中該癌 係擇自下列所組成之組群：腎癌、乳房癌、口腔癌、肺癌、 胃腸道癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、膀胱癌、肝癌、 膽囊癌、皮膚癌及睪丸癌。 2 0 ·如申請專利範圍第1 7項之套組之用途，其中該惡 性血液病變係擇自於淋巴增生（lymph〇pr〇liferatiVe)、骨 髓增生（myeloproliferative)、具B型NHL之骨髓造血不 良症候群（myelodysplasic syndromes)及急性骨髓白血病 (acute myeloid leukemias)、急性或慢性B淋巴白血病 (acute or chronic B lymphoid leukemias) ' 伯基特氏淋 巴瘤（Burkitt’ s lymphoma)、多毛細胞白血病 (tricholeucocyte leukaemia)、急性及慢性淋巴球性白血 病（acute and chronic myeloid leukemias)、T 淋巴瘤及 200902038 白血病、何杰金氏淋巴瘤（Hodgkin，s lymphomas)、華登 氏巨球蛋白血症（Waldens"tr0ffl，s macroglobulinemia)及 多發性骨髓瘤（multiple myel〇mas)。 21_ —種申請專利範圍第1至13項中任一項之套組之 用述，係用於製造藥物以治療自體免疫疾病及/或原發性或 繼發性炎性疾病’該等疾病對器官或全身性為特異的且不 相關於病原性自體抗體。 22_如申請專利範圍第21項之套組之用途，係用於治 療自體免疫疾病及/或原發性或繼發性炎性疾病，該等疾病 對盗官或全身性為特異的且不相關於病原性自體抗體，該 等疾病擇自於器官移植排斥、移植物對抗宿主疾病、類風 濕性多發性關郎炎（rheuniat〇丨d p〇 1 yarthr i t i s)、全身性 紅斑性狼瘡之眼底病變（disseminated lupus erythematosus)、硬皮症（scierodermia)、原發性修格連 氏症（primitive Sj0gren，s syndrome(或葛特-修格連氏 症）（Gougerot-Sj0gren syndrome)、自體免疫多發性神經 病變（auto-immune po 1 yneuropathi es)，多發性硬化症、 第I型糖尿病、自體免疫肝炎、僵直性脊椎關節炎 (ankylosing spondylarthritis)、萊特氏症（Reiter’ s syndrome)、痛風性關節炎（g0ut arthritis)、腹腔性疾病 (coeliac disease)、克隆氏症（Crohn’ s disease)、橋本 氏曱狀腺炎（Hashimoto’ s thyroiditis)、艾迪森氏症 (Addison， s disease)、自體免疫肝炎（aut0_immune hepatitis)、巴塞多氏症（Basedow，s disease)、潰瘍性 200902038 • 大腸炎、血管炎、相關於ANCA(抗中性細胞質抗體）之全身 性血管炎、自體免疫血球減少症以及於成人與兒童之其他 血液併發症，急性或慢性自體免疫血小板減少症（a c u t e 〇 r chronic auto-immune thrombopenias) ' 自體免疫溶血性 貧血（auto-immune haemolytic anaemias)、新生兒的溶血 性疾病（HDN)、冷凝急素病（co Id agglutinin disease)、 血栓性血小板減少性紫斑症（thrombocytopenic thrombotic purpura)及後天自體免疫血友病（acquired / auto-immune haemophi 1 ia);古巴斯德症（Goodpasture，s syndrome)、外膜性腎 炎（extra-membraneous nephropathies)、自體免疫水泡皮膚症（auto-immune bullous skin disorders)、難治性肌無力（refract〇ry myasthenia)、 混合性冷球蛋白血症 （mixed cry1 〇bul inemias)、乾癬（psoriasis)、幼年型慢性關節 炎（juveni le chronic arthritis)、炎性肌炎、皮肌炎 《 （dermatomyositis)以及包括抗磷脂症候群之兒童全身性 自體免疫疾病（antiphospholipids syndrome)。 2 3. —種申请專利範圍第1至13項中任一項之套組之 用返’係用於製造用以治療感染性疾病的藥物。 2 4 ·如申請專利範圍第2 3項之套組之用途，係用於治 療感染性疾病’該感染性疾病係擇自於下述所誘發：病毒 (人類免疫不全病毒或HIV)、肝炎病毒、艾—巴 病毒（Epstein-Barr virus)或EBV、巨細胞病毒 (cytomegalovirus)或 CMV、腸病毒（enter〇virus)、具流 200902038 A 4 感病毋A、B及C之流感、融合呼吸道病毒（syncytial respiratory virus)或SRV、或HTLV);細菌及/或其毒素（破 傷風桿菌（tetanus)、白喉桿菌（diphtheria)、肺炎雙球菌 (pneumococci)、腦膜炎雙球菌meningococci)、葡萄球菌， 包括甲氧西林（methicil in)、克當白桿菌（Klebsiellas)、 志貞氏桿菌（Shigellas)、綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa)、腸桿菌（enterobacteria)或抗生素阻抗病 原’包括院内感染性疾病（nosocomial di seases));寄生 蟲（癔疾（paludi sm)、利甚曼病（1 ei shmanios i s)、錐蟲病 (trypanosomiasis))以及新興的疾病，包括曲弓熱 (Chikungunya)、禽流感（bird fiu)、’嚴重急性呼吸道病毒 症候群（severe acute respiratory virus syndrome)或 SARS ;造成出血熱的病毒，包括伊波拉（Eb〇la)病毒、登革 熱（Dengue fever)病毒或西奈病毒（west Nile virus);以 及相關於生物恐怖者’包括炭疽熱（Anthrax)、肉毒桿菌中 毋（Botu 1 i sm)、乳疫（p 1 agUe)、天花（smauρ〇χ)及痘病毒 (poxvirus)、土拉倫斯病（Tuiaraemia)、出企熱媒介、布 氏桿菌（brucellosis)、葡萄球菌之b腸毒素、白喉毒素 (diphtheric toxin)或病毒性腦炎（viral EncephaHtis)。