KR20100021405A - 악성 질환, 자가-면역 질환 또는 감염질환의 치료 수단의 세트 - Google Patents

악성 질환, 자가-면역 질환 또는 감염질환의 치료 수단의 세트 Download PDF

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크리스토프 데 로메우프
나탈리 푸르니에
나딘 페르난데즈
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Abstract

악성 질환, 자가면역 질환 또는 감염성 질환 치료용 수단 키트로서, 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 이펙터 세포(effector cell), 및 단일클론항체를 포함하며, CD16에 대한 상기 단일클론항체의 Fc 영역의 친화력은 CD16에 대한 다클론성 면역글로불린의 Fc 영역의 친화력보다 더 크다.

Description

악성 질환, 자가-면역 질환 또는 감염질환의 치료 수단의 세트{SET OF MEANS FOR TREATING A MALIGNANT PATHOLOGY, AN AUTOIMMUNE DISEASE OR AN INFECTIOUS DISEASE}
본 발명은 악성 질환, 자가-면역 질환, 또는 감염 질환의 치료에 관한 것으로, 특히 그 표면에서 FcγR 수용기(receptor)를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)에 의한 치료에 관한 것이다.
연구에도 많이 사용되는, 항체는 또한 전통적인 치료에 대안을 제시하는, 진단과 치료에서 선택되는 도구로 이용된다.
혈장 유래(plasmatic origin)의 또는 생물공학으로부터 기인하는, 치료적 사용을 위한 항체가 현재 시장에서 제조 중이거나 또는 임상 발달 단계에서 제조 중이다. 그들의 특성은 그들의 표적에 특이하게 결합할 수 있는, 그리고 면역계의 세포를 효율적으로 보충할 수 있는 치료 도구(therapeutic tools)를 생성하기 위하여 이용된다.
항체의 효율성을 향상시키는 것 및 특히 불변 Fc 영역을 조작하는 것에 대한 연구가 최근 집중되고 있다. 면역계의 이펙터 세포(effector cell)의 동원(mobilisation) 및 보체 단백질의 동원(mobilisation)을 허용하기 때문에, 후자 는 항체의 "이펙터(effector)" 성질의 원인이 된다. 이 능력은, 당단백질(glycoproteins)의 특정 이펙터 세포(effector cell), 즉 수용기 Fc(FcR)의 존재에 의해 가능하다. 일단 항체의 가변 영역에 의해 항체의 불변 영역이 표적 항원에 고정되면, 이 수용기는 항체의 불변 영역에 결합할 수 있다. 이펙터 세포의 FcR에 항체의 Fc 영역이 결합하면 식균 작용 및 ADCC(cellular cytotoxicity dependent on antibodies 또는 Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)와 같은 세포 독성 메커니즘의 활성화가 유발된다. 자가-면역 질환 동안, 공격에 대해 유기체를 보호하는 근본 역할을 하는, 면역계는 외래 물질(extraneous bodies)이 존재하면 염증성 반응을 유발하여 스스로 자신의 분자를 "부가적으로(accidentally)" 공격하는 조직 병변(tissue lesions)을 유발한다. 신체의 다른 조직 또는 다른 기능에 영향을 미치는 다른 자가-면역 질환도 있다. 예를 들면, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 환자들의 경우 두뇌가 영향을 받고, 크론병(Crohn’s disease) 환자의 경우 내장이 표적이 되며, 류머티스성 다발성 관절염(rheumatoid polyarthritis) 환자들의 경우 활액(synovia), 뼈 및 연골이 영향을 받는다.
자가-면역 질환의 발생(development) 동안, 영향받은 하나 이상의 유형의 조직에 진행성 파괴(progressive destruction), 기관의 이상 성장 또는 기관 기능의 변경 등과 같은 몇몇 현상이 일어날 수도 있다. 자가-면역 질환 동안 주로 영향받은 조직 또는 기관은 조혈세포(haematopoietic cell), 혈관(blood vessels), 결합 조직(connective tissues), 내분비선(endocrine glands), 근육, 관절 및 피부이다. 자가-면역 질환은 만성 염증성 질환(chronic inflammatory pathology)과 자주 연관 된다. 가장 빈번한 경우로는 염증성 관절염(inflammatory arthritis)의 2가지의 유형인 류머티스 다발성관절염(rheumatoid polyarthritis) 및 소아 류머티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis)을 들 수 있다. 관절염은 관절의 염증을 지시하는 일반 용어이다.
대부분의 치료는 많은 보조 효력(secondary effects)이 있거나 질병의 진행을 완전히 막지 못한다. 현재 이상적인 치료법 또는 환자의 치료를 돕는 치료법은 없고, 더 효율적이고 상기 모두 치료할 수 있는 신규한 치료법이 요구된다.
B 림프구(B lymphocytes; LB)는 자가-면역 질환의 발달에 원인이 되는 자가 항체(auto-antibodies)를 수시로 생성하는 세포이기 때문에, 이 세포 유형의 특이한 단일클론 항체를 복용하여 자가-면역 질환을 파괴하는 것은, 최근 류머티스 다발성 관절염을 치료하기 위해 승인된 리툭시맵(rituximab)처럼, 환자에 유리할 수도 있다.
또한, 향상된 위생상태, 면역 및 항균성 치료에 상당한 진전이 있음에도, 감염성 질환은 현대 의료 분야에 있어 지속적이고 상당한 문제를 나타낸다. 가장 만연된 질병(widespread disease)인 단순 감기(simple cold)는 가장 무서운 질병 중 하나인 AIDS(후천성 면역 결핍증)와 동일한 카테고리의 감염성 질환이다. 퇴행성 질환(degenerative diseases)과 같은 특정 신경성 질환 종류도 감염과 실제로 연관되었다는 것이 증명되었다.
감염성 질환은 앞으로는 중요한 의료상의 문제로 남아 있다.
감염성 질환 동안, 단일클론항체는 두 가지 보완적(complementary) 역할을 할지도 모른다: 감염의 급성기(acute phase) 동안 분비된 병원체(pathogenic agent) 또는 독소를 중화시키는 역할 및 만성기(chronic phase)로 전이하는 동안 감염원 세포(reservoir cell)를 파괴하는 역할.
병원체(pathogenic agent)가 증식할 수 있는 숙주 세포(host cells)를 파괴하여 자가-면역 질환 또는 암과 같은 심각한 질병을 종종 유발할 수 있는 만성기로 전이되는 것을 막을 수 있다. 최근, 그 필요성에도 불구하고, 만성기의 치료에서 효율적인 항-감염성 치료(anti-infectious treatment)가 없다. 반면에, 교차 저항성(cross-resistance)의 유발에 의해 감염의 급성기 동안 작은 분자(항생 물질, 항기생충(anti-parasitic) 분자, 항바이러스 분자)의 유리한 효력이 점점 더 손상되고 있다. 그러므로 항생제에 다중-저항성을 가지는 박테리아의 등장은 다소 심각한 병원감염(nosocomial infection)에 의해, 모든 입원(hospitalisation)의 6% 내지 7%인, 매년 천오백만 건의 입원 중 약 750,000건에 공중 위생의 문제를 내포한다(http://www.senat.fr/rap/r05- 21/r05-4211.html#toc13). 전체로, 병원 감염으로 매년 9,000명이 사망하며, 반면에 입원한 병원에 단기 동안 치명적 예후(vital prognosis)가 관련되지 않은, 4,200명의 관련 환자(concern patients)가 발생한다(http://www.senat.fr/rap/r05-421/r05-4213.html).
그러므로, 의사와 그들의 환자를 위한 치료 대안을 제공할 수 있는 혁신적인 약을 개발할 필요성이 있다.
종양은 양성(benign) 또는 악성(malignant)의, 제어되지 않은 세포 증식에서 유래하는, 종양 형성 덩어리(neoplasic mass)에 대응한다. 양성 종양은 일반적으로 국소적으로(localised) 남아 있다. 악성 종양은 집합적으로 암이라고 불린다. 용어 "악성(malignant)"은 일반적으로 인접한 구조를 침입 및 파괴하며 먼 곳까지 확산할 수 있고, 결국에는 환자 사망의 원인이 되는 종양을 의미한다(Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122). 종양은 많은 다른 위치에서 발생되어 그 조직 근원의 기능과 다르게 행동할지도 모른다. 현재, 암 치료 방법에는 환자의 종양 세포를 제거하기 위한 수술, 화학치료, 호르몬 치료 및/또는 방사선 치료가 있다(Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, Eds., Chapter 12). 이러한 모든 치료방법은 주요한 결점이 있다. 예를 들면, 다양한 화학 분자를 이용할 수 있음에도, 화학요법은 심한 구토(severe nausea), 수질 무형성(medullar aplasia), 면역 억제 등과 같은 많은 부작용을 유발한다. 일부 부작용은 심각하여 의사가 때때로 치료를 중단해야 하는 경우도 있다. 게다가, 몇몇 화학 분자를 조합하여 투여함에도, 종양 세포의 대부분은 화학요법 약물에 저항성을 가지거나 저항성을 획득한다. 실제로, 현재 프로토콜에서 투여되는 특정 약물에 저항성을 가지는 세포는 유감스럽게도 다른 약물에도 저항성을 가지며, 이는 치료 프로토콜에서 투여된 의약에 의해 사용되는 것과 다른 메커니즘을 통해 작용하는 것도 포함한다. 다제약내성(multidrug resistance)라고 알려진 이 현상은 수시로 표준 화학요법 프로토콜의 치료적 실패의 원인이 된다.
이렇게 수술, 방사선요법, 화학요법 또는 호르몬요법과 같은 전통적인 치료로 치료하기 힘든 암 치료를 위한 혁신적인 항암성 치료법이 요구된다.
유망한 대안은 종양 세포가 종양 항원에 특이한 항체에 의해 특이하게 표적이 되는 면역 요법이다. 예를 들면 하이브리도마 기술(hybridoma technology)을 통해 종양 세포에 의해 발현되는 항원에 특이한 단일클론항체를 개발하는 것과 같은, 면역 반응의 특이성을 이용하려는 중요한 노력이 있었다(Green M.C. et al., 2000 Cancer Treat Rev., 26: 269-286; Weiner L.M., 1999 Semin Oncol. 26 (suppl. 14):43-51).
표적이 된 질환과 상관없이 단일클론항체가 숙주 병원체, 또는 병원체(pathogenic agent)의 유해한 세포를 파괴하는 것은 바람직하다. 이 항체가 환자 면역계의 이펙터 세포(effector cell)와 최선으로 상호 작용하도록 향상시키는 것이 중요하다.
B 림프구(LB)의 악성 증식으로 특징화되는 질병인, 만성 림프성 백혈병 B(Chronic lymphoid leukaemia B; LLC-B)은 가장 빈번한 유형의 백혈병이다. 현재 치료는 질병의 초기 단계를 위한 치료 절제(therapeutic abstinence)에 근본적으로 근거를 둔다. 임상적 또는 혈액학적인 징후학(clinical or haematological symptomatology) 경우, 코르티코이드만으로 또는 항-유사분열 분자(anti-mitotic molecules)를 함께 이용하여 환자를 치료하였다. 대부분의 환자에 있어, 치료에 대한 저항성은 다소 장기 간에 얻어 결국 화학-저항성 세포(chemo-resisting cell)가 등장하여 치료 노력이 실패로 돌아간다. 화학요법은 실질적으로 부작용을 일으키며, 특히 골수독성(myelotoxicity)으로 인해 환자에 심각한 감염, 때때로 치명적인 감염을 일으켜 면역 결핍(immune deficit)을 유발한다. 많은 치료적 접근방법은 가 능한 특이하게 평가된 종양 B 세포를 파괴하는 것에 집중되었다. 종양 (및 정상) LB에 의하여 CD20 분자를 특이하게 발현시키는 것을 통해 인간 항-CD20 단일클론항체를 이용하는 것에 기반을 둔 치료가 발달하였다.
단일 비-방사선 표지된 항-CD20 단일클론항체인, 리툭시맵(rituximab) (Rituxan®, Genentech and Mabthera™, Roche)이 현재 상업적으로 이용가능하다. 단계 Ⅲ-Ⅳ의 소포 림프종(follicular lymphoma) 환자를 치료함에 그리고 미만성 CD20 양성 대형 B 세포 공격성 비호지킨림프종(diffuse CD20 positive large B cells aggressive non-Hodgkin’s lymphoma) 환자를 치료하는 화학요법과 함께 리툭시맵이 사용된다. 단일 약제로 사용될 때 그 효율은 가변적이나 수시로 적당하기 때문에(Teeling et al. 2004, Blood 104(6):1793-800), 대부분 화학 요법과 함께 사용된다.
리툭시맵(rituximab)은 또한 LLC-B 환자에게서 평가되었다. 이 항체는 단일요법으로 사용될 때 낮은 효율성만 나타내지만, 현재 화학요법과 함께 투여된다.
LLC-B 환자에 리툭시맵(rituximab)을 단독 요법으로 사용하는 경우 실패하는 많은 이유를 설명할 수도 있다: 첫째로, 시험관 내의(in vitro) 리툭시맵(rituximab)은 B 세포에 경미한 ADCC 활성을 유발하지만, 정상 LB에 반대이며, NHL에서, LLC-B의 LB는 그 표면에서 약간의 CD20 분자만 발현하여(유세포 분석기(Flow Cytometry)에 의한 양 측정에 의해, 약 5배 낮은 밀도), 세포 표면에 항체의 양 및 관련 세포 독성 기능(특히 ADCC 및 활성 보체)을 제한한다.
CD20 항원에 특이하고 종양 세포의 용해(lysis)를 효과적으로 일으킬 수 있 는 항체를 포함하는 대안적인 치료법에 집중하는 것이 중요하다.
대식 세포, 고유한 면역의 이펙터 세포(effector cell)는, 항-종양 반응에 중요한 역할을 한다. (어떤 병원체도 없는 경우에) 비활성 형태로 자연적으로 존재하며, 그들은 (항체의 Fc 영역을 통해 FcR에 결합하는) 병원체를 분해하거나 면역성 복합물 또는 특히 염증성 현상 동안 생성되는 면역-조절(immuno-modulatory) 분자인, 사이토키닌(cytokines)의 표면에서 발현된 수용기에 결합하는 것과 같은, 다른 루트에 의해 생체 조건 내에서(in vivo ) 또는 생체 조건 밖에서(in vitro) 활성화된다. 활성화는 용해 활성을 유도하고 대식 세포의 항-종양 활성을 증가시킨다(Adams D. and Hamilton T.: Activation of macrophages for tumour cell kill: effector mechanism and regulation. In Heppner & Fulton (Eds), Macrophages and cancer. CRC Press, 1988, p. 27; Fidler I.: Macrophages and metastases. A biological approach to cancer therapy. Cancer Res, 45: 4714, 1985).
게다가, 대식 세포, 또는 단핵세포(monocyte) 또는 그 전구체에서 유래된 다른 세포는 항원 제공 세포이다. 엔도사이토시스(endocytosis), 분해 및 중요 조직적합성 복합물(MHC)의 분자와 관련된 항원 펩티드의 T 림프구로의 제공에 있어 강한 능력 때문에, 특이한 면역 반응을 유도할 수 있다.
리툭시맵(rituximab)의 효율성을 증가할 목적으로, 인터페론 γ(IFN- γ)가 존재할 때 생체 외에서(ex vivo) 활성화된 대식 세포와의 협력을 LLC-B의 일차 세포의 용해를 위한 시험에서 시험관 내에서(in vitro) 평가하였다(Lefebvre ML, Stefan W. Krause, Salcedo M, Nardin A. Ex vivo activated human macrophages kill chronic lymphocytic leukemia cells in the presence of Rituximab: mechanism of antibody-dependent cellular cytotoxicity and impact of human serum. J. Immunother; vol. 29, n°4: 388-397, 2006). 리툭시맵(rituximab) 존재시 인간 혈청의 농도가 증가함에 따라 활성화된 대식 세포에 의한 LLC-B 세포의 용해가 저지된다. 이러한 저지는 대식 세포의 표면에서 발현된 각종 FcR에 리툭시맵(rituximab)-LLC-세포 복합물의 결합과 혈청(serum)에 존재하는 다클론성 면역글로불린(polyclonal immunoglobulins)과의 결합이 경쟁하기 때문이다. 이 저지의 강도는 리툭시맵(rituximab)의 사용 농도와 이펙터 세포(effector cell):표적 세포의 비율(이펙터: 표적 또는 E:T)에 달려 있다.
암, 자가-면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하는 많은 치료 도구가 존재함에도, 여전히 기존 제품보다 더 효율적이고 더 안전하다고 입증된 신규한 면역요법 제품이 실질적으로 요구된다.
본 발명의 1차 목적은 악성 질환, 자가-면역 질환 또는 감염성 질환 치료용 수단의 키트로서, 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현시키는 이펙터 세포(effector cell), 및 단일클론항체를 포함하며, CD16에 대한 상기 단일클론항체의 Fc 영역의 친화력은 CD16에 대한 다클론성 면역글로불린의 Fc 영역의 친화력보다 더 크다.
유리하게, 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)는 단핵세포(monocyte) 또는 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 세포에서 유래하는 단핵세포(monocyte) 또는 단핵세포(monocyte) 전구체이다.
유리하게, 이 세포는 CD16을 발현하는 단핵세포(monocyte), 대식세포, NK 세포(NK), 수지상세포(dendritic cell) 및 전체로서의 말초혈액단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell 또는 PBMC)에서 선택된다.
유리하게, 표면에서 CD16를 발현하는 세포는 CD16를 발현하는 단핵세포(monocyte), 대식 세포 및 수지상세포(dendritic cell)에서 선택된다.
특히, 표면에서 CD16을 발현하는, 세포에서 유래한 단핵세포(monocyte) 또는 단핵세포(monocyte) 전구체는 대식세포이다.
유리하게, CD16에 대한 상기 단일클론항체의 Fc 영역의 높은 친화력 때문에, 단일클론항체는 다클론성 면역글로불린, 특히 혈청에 존재하는 ㄷ다클론성 면역글로불린에 의해 대체되지 않는다.
유리하게, 상기 단일클론항체는 2.106M-1 이상의 친화력을 가지는, 세포에서 유래한 상기 단핵세포(monocyte) 또는 단핵세포(monocyte) 전구체의 CD16에 결합한다.
특히 유리한 방법에서, 단일클론항체는 단일클론항체 조성물의 형태로 생성되며, 상기 조성물에서 각 항체는 Fcγ 당화(glycosylation) 위치(Kabat에 따르면 아스파라긴 297)에 결합되는 N-연결 당 사슬(N-linked sugar chains)을 가지며, 상기 조성물의 모든 항체의 상기 당화(glycosylation) 위치의 모든 N-연결 당 사슬 중에서, 푸코오스(fucose)의 비율은 65% 이하이다.
본 발명의 특정 구체화에서, 단일클론항체는 항원 5C5(신장암(renal carcinomas) 세포에 의해 발현되는 종양 항원), BCR(B Cell Receptor), 항-FVⅢ 인히비터 항체, TCR(T Cell Receptor), CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD45, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD66(a, b, c, d), CD74, CD80, CD86, CD126, CD138, CD154, MUC1(Mucine 1), MUC2(Mucine 2), MUC3(Mucine 3), MUC4(Mucine 4), MUC16(Mucine 16), HM1.24(다발성 골수종에서 과발현된(overexpressed) 형질세포(plasmocyte)에 대한 특이 항원), 테나신(tenascin)(세포외기질(extracellular matrix)의 단백질), GGT(gamma-glutamyltranspeptidase), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), EGFR(Endothelial Growth Factor receptor), CEA(carcinoembryonic antigen), CSAp (colon-specific antigen-p), ILGF(Insulin-Like Growth factor), 태반성장인자(placental growth factor), Her2/neu, 탄산 탈수 효소 Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ), IL-6, 단백질 S100(칼슘에 결합한 단백질의 다중유전자족(multigenic family)), MART-1(흑색종에 관한 종양 분화 항원(tumorous differentiation antigen associated with melanoma)), TRP-1(tyrosinase-related protein 1), TRP-2(tyrosinase-related protein 2), gp100(glycoprotein 100 kDa), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 리서스 D 항원(Rhesus D antigen), (HLA-DR와 같은) 클래스 I 및 Ⅱ의 MHC 분자, 변이된 유전자(mutated genes), 특히 종양유전자(oncogene) 또는 종양-억제유전자(tumour-suppressor genes)에서 발현된 항원, 특정한 잘 정의된 종양에 의해 발현된 종양유전자 바이러스에서 유래된 항원, 뮐러관호르몬(Mullerian hormone)의 유형 Ⅱ 수용기 등과 같은, 일부 종양에서 과발현되고, 일부 정상 조직에서 약간 발현된 유비쿼터스 항원(ubiquitous antigen), 당화(glycosylated) 또는 비-당화(non-glycosylated) 단백질, 인지질(phospholipid), 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 같은 감염된 세포에 의해 자가 발현(self-expressed), 또는 비자가-발현(non self expressed) 또는 막에 노출된 분자 및 병원체(pathogenic agent)에 의해 발현된 또는 분비된 단백질(세균성 독소, 세균성 또는 기생성 벽의 단백질 복합물, HIV 바이러스, HBV, HCV 및 RSV 등의 바이러스 외피 당단백질(viral envelope glycoproteins)과 같은 이디오타이프(idiotype)에서 선택된 항원에 대한 것이다.
바람직하게, 단일클론항체는 CD20에 대한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 항-CD16 항체는 수탁번호 I-3314 하에 2004년 11월 8일에 CNCM에 기탁된, 세포계 R509에 의해 또는 수탁번호 I-3529 하에 2005년 11월 29일에 CNCM에 기탁된, 세포계 R603에 의해 생성된다(CNCM: collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15-France).
유리하게, 본 발명의 수단 키트는 치료에 동시에, 연속적으로 또는 따로 사용된다.
유리하게, 본 발명의 수단 키트에서, 그 표면에서 CD16를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)는 CD16와 항체의 상호 작용에 의해 촉진되는, 상기 항체에 의해 표적이 되는 세포에 세포 독성 활성을 가진다.
유리하게, 본 발명의 수단 키트에서, 단일클론항체는 ADCC 활성에 의해 또는 CD16를 발현하는 이펙터 세포(effector cell) 존재시 상기 항체 표적 세포의 식균작용에 의해 세포 독성(cytotoxicity)을 유도한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 수단 키트 및 약학적으로 허용가능한 부형(excipient)제를 포함하는 약제 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 약을 제조하기 위해 본 발명의 수단 키트의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 악성 질환의 치료를 위한 약을 제조하기 위한 본 발명의 수단 키트의 사용에 관한 것이다.
유리하게, 악성 질환은 고형 종양(solid tumours) 및 악성 혈액질환(haemopathy)에서 선택된다. 유리하게, 고형 종양은 흑색종(melanomas), 암(carcinomas), 육종(sarcomas), 신경교종(gliomas) 및 피부암(skin cancers)에서 선택된다. 유리하게, 암(carcinomas)은 신장(kidney), 유방(breast), 구강(oral cavity), 폐(lungs), 위장관(gastro intestinal tract), 난소(ovaries), 전립선(prostate), 자궁(uterus), 방광(bladder), 췌장(pancreas), 간(liver), 쓸개(gallbladder), 피부(skin) 및 고환(testicles)의 암(carcinomas)으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
유리하게, 악성 혈액질환(haemopathy)은 B형 NHL를 가지는 림프세포증식질환(lymphoproliferative syndrome), B형 NHL를 가지는 골수증식성질환(myeloproliferative syndrome), B형 NHL를 가지는 골수이형성증후군(myelodysplasic syndrome), 급성 또는 만성 B 림프성 백혈병(acute or chronic B lymphoid leukemias), 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma), 모양 세포성 백혈병(tricholeucocyte leukaemia), 급성 및 만성 골수성 백혈병(acute and chronic myeloid leukemias), T 림프종 백혈병(T lymphomas leukemias), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas), 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 다발성골수종(multiple myeloma) 등과 같은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)에서 선택된다.
유리하게, 자가-면역 및/또는 일차 또는 이차 염증성 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 수단 키트 사용에 관한 것으로, 기관 또는 계에 특이하며, 병원성 자가 항체에 관련된 또는 관련되지 않는다.
자가-면역 및/또는 염증성 질환은 기관 이식 거부반응(organ graft rejection) 또는 이식편대숙주반응(graft versus host disease), 류머티스성 다발성관절염(rheumatoid polyarthritis), 파종성홍반성루푸스(disseminated lupus erythematosus), 경피증(sclerodermia), 원시 쇼그렌증후군(primitive Sjogren's syndrome)(또는 구제로 쇼그렌 증후군(Gougerot-Sjogren syndrome)), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 자가-면역 말초신경병증(polyneuropathies), 유형 I 당뇨병, 자가-면역 간염(auto-immune hepatitis), 강직성 척추염( ankylosing spondylarthritis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 통풍성 관절염(gout arthritis), 소아 지방변증(coeliac disease), 크론병(Crohn's disease), 하시모토병(Hashimoto's thyroiditis), 에디슨병(Addison's disease), 자가-면역 간염, 바제도우병(Basedow's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), ANCA(antineutrophil cytoplasmic antibody)에 관련된 전신 혈관염(systemic vasculitis)과 같은 혈관염(vasculitis), 자가-면역 혈구감소증(auto-immune cytopenias), 급성 또는 만성 자가-면역 저혈소판증(thrombopenias), 자가-면역 용혈성 빈혈(Haemolytic anaemias), 신생아의 용혈성 질환(haemolytic disease of the newborn; HDN), 냉응집소병(cold agglutinin disease), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura), 및 후천성 자가-면역 혈우병(acquired auto-immune haemophilia); 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 막외성 신증(extramembraneous nephropathies), 자가-면역 수포성 피부질환(auto-immune bullous skin disorders), 중증 근무력증(refractory myasthenia), 혼합한랭글로불린혈증(mixed cryoglobulinemia), 건선(psoriasis), 청소년 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 염증성 근육염(inflammatory myositis), 피부근염(dermatomyositis) 및 항인지질항체 증후군(antiphospholipid syndrome)을 포함한 소아 전신성 자가면역 질환과 같은, 성인 및 소아의 다른 혈액학적 합병증(haematological complications)에서 선택된다.
본 발명의 다른 목적은 감염성 질환을 치료용 약 제조를 위한 본 발명의 수단 키트의 사용에 관한 것이다.
유리하게, 감염성 질환은 바이러스(인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스(HBV, HCV), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV), 선천성 거대세포바이러스(cytomegalovirus; CMV), 엔테로바이러스(enterovirus), 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C의 인플루엔자(influenza with Influenza virus A, B and C), 호흡기 세포융합바이러스(syncytial respiratory virus; SRV), 또는 HTLV), 박테리아 및/또는 그들의 독소(파상풍(tetanus), 디프테리아(diphtheria), 폐렴구균(pneumococci), 수막염구균(meningococci), 메티실린 내성 형태(methicilin resistant forms)를 포함하는 포도상구균(staphylococci), 클렙시라(Klebsiellas), 시겔라(Shigellas), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테리아(enterobacteria) 또는 병원내 질병(nosocomial diseases)을 포함한 항생제 내성 질환(antibiotic resistant pathologies)), 기생충(말라리아(paludism), 레이쉬마니아증(Leishmaniosis), 트리파노소마증(trypanosomiasis)) 및 치군군야(chikungunya), 조류독감, SARS(severe acute respiratory syndrome virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스 또는 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)와 같은 출혈열(haemorrhagic fevers)에 관한 바이러스과 같은 신종 질병(emerging diseases), 탄저병(Anthrax), 보툴리누스중독증(botulism), 흑사병(Plague), 천연두(smallpox) 및 수두 바이러스(poxvirus), 튜라레미아증(Tularaemia), 출혈열 병원균(haemorrhagic fever agents), 브루셀라증(brucellosis), 포도상구균 B 엔데로톡신(Staphylococcus B Enterotoxins), 디프데리아 독소(diphtheric toxin) 또는 바이러스성 뇌염(viral Encephalitis)과 같은 바이오 테러리즘(bio-terrorism)에 관한 질병에서 선택된다.
수단 키트
용어 "수단 키트"는 그들의 일반적인 표시 때문에 기능 유닛의 형태인 기본 구성요소의 약제 조성물을 지시한다.
특히, 본 발명의 수단 키트는 동시에, 따로 또는 연속적으로 사용되는, 악성 질환, 자가-면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하기 위한, 활성 기질로서, 표면에서 CD16을 발현하는 이펙터 세포(effector cell) 및 단일클론항체를 포함하는 약제 조성물이며, 상기 CD16에 대한 단일클론항체의 Fc 영역의 친화력은 CD16에 대한 다클론성 면역글로불린의 Fc 영역의 친화력보다 더 크다.
단일클론항체 및 그 표면에서 CD16를 발현하는, 이펙터 세포(effector cell)는 함께 수단의 단일 키트의 형상으로 조성물을 형성하며, 시간상 그 구성요소는 동시에, 따로 또는 연속적으로 적용할 수 있다. 본 발명의 수단 키트는 또한 혼합물 형태일 수도 있다.
단일클론항체 및 CD16를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)는 신규한 일반 효과 및 일반적인 징후 때문에 기능성 유닛을 형성한다.
표면에 Fc γRⅢ 수용기( CD16 )를 발현하는 이펙터 세포( effector cell )
"표면에 CD16 수용기를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)"는 이펙터(effector) 활성(특히, ADCC에 의한 세포독성, 식균작용 또는 다른 분야의 항원전달(antigen presentation) 및 체액성 면역반응 성질(humoral response properties))을 가진 모든 세포를 의미하며, 다음의 세포활성은 항체가 결합하여 형성된 면역 복합물과 FcγRⅢ 또는 CD16 막 수용기에 특이한 항원의 결합에 의해 유도된다. 이런 세포는 그 표면에서 CD16을 발현시켜야 한다.
유리하게, 그런 세포는 그 표면에서 CD16를 발현하는 단핵세포(monocyte) 또는 단핵세포(monocyte) 전구체 유래 세포, 단핵세포(monocyte) CD16+, 대식세포, 수지상세포(dendritic cell)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
그러므로, 이 제한은 또한 NK 세포(NK) 및 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell) 세포까지 확대될 수 있다. "NK 세포"는 이전 면역화(immunisation) 없이 자발성 세포 독성이 가능한 거대과립림프구(large granulosar lymphocytes)를 의미한다. "PBMC"는 그 표면에서 CD16을 발현하는, 말초혈액의 단핵세포(mononucleated cells) 세포(단핵세포 및 림프구)를 의미한다.
본 발명의 단일클론항체가 존재할 때 단일클론항체 Fc 영역 및 세포에 의해 발현된 CD16 수용기 사이의 결합에 의해, 그런 세포는 ADCC 활성을 유도할 수 있다.
이펙터 세포(effector cell)는 바람직하게 대식 세포이다.
(표면에서 CD16을 발현하는) CD16+ 단핵세포는 그 막표면에서 CD16를 발현하는 단핵세포(monocyte) 아집단(sub-population)이다. CD16+ 단핵세포는 식세포일 수 있고 ADCC 활성을 유도할 수 있다.
대식 세포는 고유한 면역성의 주요 인자의 하나로서, 후천성면역(adaptive immunity)에 참가한다. 그것은 단핵세포(monocyte)에서 분화된 것이다.
예로, 단핵세포(monocyte)를 대식세포로의 분화를 유도하기 위해, 단핵세포가 농축된 세포질 현탁액을 M-CSF(Monocyte-Colony Stimulating Factor) 또는 GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor)를 포함하는 적당한 배지(RPMI® medium for Roswell Park Memorial Institute)에서 배양하는 단계를 통해 단핵 세포에서 대식 세포를 유래할 수도 있다. 예를 들면, 대식 세포는 6 내지 7일 동안 배양한 후 생성될 수도 있다.
M-CSF(Monocyte-Colony Stimulating Factor) 또는 GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor)를 포함하는 배지에서 단핵세포를 배양하는 단계를 수행하여, 건강한 사람에서 수행한 혈구성분채집술(cytapheresis)에 의해 얻은 혈액세포를 농축한 조성물에서 대식세포를 생성할 수 있다.
선택적으로, 이 배양 단계는 먼저 단핵세포(mononuclear cells)를 분리하는 단계가 선행될 수 있고, 반면 혈구성분채집술(cytapheresis)에 의해 얻은 혈액 유래 조성물에 포함된 적혈구, 과립성 백혈구(granulocytes) 및 혈소판의 일부를 제거하는 단계 및 선행 단계에서 남아있는 혈소판 및 혈액응고방지제(anticoagulant)를 세척하여 제거하는 단계가 선행된다.
상술한 단핵세포의 세포질 현탁액을 농축하는 단계는 밀도구배(density gradient)에서, 특히 1/077g/ml의 밀도를 가지는 Ficoll Paque 유형(Pharmacia) 용액과 같은, 약 1.0 내지 1.3g/ml의 밀도를 가지는 용액에서, 단핵세포를 포함하는 배지를 원심분리(centrifugating)하여 일반적으로 이루어진다.
선택적으로, 대식 세포, 및/또는 수지상세포(dendritic cell), 및/또는 NK 세포를 포함하는 조성물은 인간에서 분리한 혈액 유래 조성물에서 얻을 수 있고, 혈액세포, 특히 혈구성분채집술(cytapheresis)에 의해 얻은 혈액 유래 조성물의 단핵세포나 그 전구체와 같은 백혈구가 농축될 것이며, 다음의 단계를 포함한다:
- 유리하게, 적당한 생리 식염수(physiological solution)로, 특히 약 2~3배 부피로, 상기 혈액 유래 조성물을 희석시키는 단계,
- 원심분리 및 상술한 원심분리에서 유래한 펠렛(pellet)을 세척하고, 적당한 생리 체척액, 특히 (트랜스퍼 포켓 유형(transfer pocket type)의) 포켓에서 펠렛을 회수한 후, 혈액응고방지제 또는 다양한 잔류물을 제거하고, 혈소판을 제거한 조성물을 회수하기 위해 상기 포켓에서 가압하여, 세척액을 다른 포켓 또는 용기(receptacle)로 제거하는 것을 포함하는, 상기 혈액 유래 조성물을 세척하는 단계,
- 필요에 따라, 상기 세척 단계를 1 내지 2회 반복하며,
- 약 6 내지 10일 동안 (특히 6 내지 7일 동안), 적당한 배지에서, 특히 유리하게 소수성 포켓에, 상기 세척 단계에서 얻은 혈액 유래 조성물에 포함된 세포를 배양하는 단계,
이 배양 단계는:
- 초기 조성물에 존재하는 단핵세포 또는 그 전구체, 특히 혈소판, 적혈구, 과립백혈구 및 림프종 외의 구성요소의 전부 또는 일부를 제거하는 단계, 배양단계 이전의 세척 단계 후에 얻어진 혈액 유래 조성물을 상기 구성요소의 전부 또는 일부에 대한 항체와 접촉시키고, 상기 구성요소의 전부 또는 일부는 항체에 고정한 채로 남아 있는 동안 단핵세포 또는 그 전구체를 포함하는 용액을 회수하는 단계가 선행하고 및/또는 상술한 것처럼 항체와 배양 단계 후 얻은 혈액 조성물을 접촉시켜 대식세포 이외의 구성요소의 전부 또는 일부를 제거하고, 상기 구성요소의 전부 또는 일부가 항체에 고정된 채로 남아 있는 동안 대식세포를 포함하는 용액을 회복하는 단계가 뒤따르며,
-및/또는 배양 단계 후에 얻어진 조성물의 다른 구성요소에서, 특히 혈소판, 적혈구 및 림프구에서 분리된 대식세포를 정제, 특히 정화(elutriation)하는 단계가 뒤따른다.
일반적으로, 그 표면에서 CD16를 발현시키는, 대식 세포를 얻는 다른 과정도 또한 본 발명에 적용 가능하다.
게다가, 본 발명의 "대식 세포"는 단핵세포에서 얻어진 모든 세포를 의미하며, 잘 정의된 프로토콜에 따라 분화되어 다음의 막 마커(membrane markers)를 발현하는 세포에서 유래한다; CD14+, CD16+, CD32+, CD64+, CD11b+. 특히, CD16+ 세포의 퍼센트는 적어도 20%이며, 바람직하게 50%, 또는 70%이고 또는 70 내지 100% 사이이다.
단일클론항체
본 발명의 목적에 있어, 표현 "단일클론항체" 또는 "단일클론항체의 조성물"은 세포 클론에서 유래하고, 동일한 단독 특이성을 가진 항체 분자를 제조하는 것을 의미한다.
면역글로불린 분자는 4개의 폴리펩티드로 구성된다: 50kDa의 2개의 동일한 중쇄(H) 및 25kDa의 2개의 동일한 경쇄(L). 경쇄는 VL 및 CL로 불리는, 2개의 도메인인, 가변 영역(V) 및 불변 영역(C)을 포함하며, 공간에서 서로 독립적으로 접힌다. 중쇄는 또한 VH로 표시되는 V 도메인 및 CH1 내지 CH4로 표시되는 3 또는 4개의 C 도메인을 포함한다. 각 도메인은 약 110개의 아미노산을 포함하며, 동등하게 구성된다. 2개의 중쇄는 이황화 결합으로 연결되고 또한 이황화 결합에 의해 각 중쇄는 경쇄에 연결된다.
항원에 대한 항체의 특이성을 결정하는 영역은 가변부에서 유래하고, 반면 불변부는 이펙터 세포(effector cell)의 Fc 수용기 또는 다른 기능성을 유발하는 보체 단백질과 같은 분자와 상호작용한다.
중쇄와 경쇄의 가변 영역에 관하여, 서열(sequence)의 가변성이 동등하게 분배되지 않는 것이 관찰된다. 사실상, 가변 영역은 "프레임워크"(FR)로 알려져 있는 약간 가변하는 영역 및 가변성이 극단적인 영역으로 구성된다: 이들은 "과가변(hypervariable)" 영역, 또는 전체 3개인(CDR1 내지 CDR3), CDR(Complementarity Determining Regions)이다.
유리하게, 본 발명에 따른 항체는 키메라(chimeric) 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게 키메라 항체이다.
"키메라 항체"는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역이 경쇄 및 중쇄의 불변 영역이 속하는 종과 다른 종에 속하는 항체를 의미한다. 그러므로, 본 발명에 따른 항체는 쥐과(murine), 쥐(rat), 토끼, 원숭이, 산양 또는 인간 유래의 가변 영역 및 항체가 생성된 종과 다른 종에 속하는 불변 영역을 가진다. 이 점에서, 포유동물의 모든 계 및 종이 사용될 수 있고, 특히 예를 들면 새뿐만 아니라 인간, 원숭이, 쥐(rat) 및 쥐(mice), 돼지과, 솟과(bovine), 말과(equines), 고양이과(felines), 개과(canine)를 사용할 수 있다. 더 바람직하게, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄 및 각 중쇄의 불변 영역은 인간의 불변 영역이다. 본 발명의 이 바람직한 구체화는 인간의 항체 면역원성(immunogenicity)을 줄이고 그로 인하여 인간에 치료 투여 동안 그 효율성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 불변 영역은 κ 유형이다. 본 발명의 바람직한 구체화에서, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 불변 영역은 유형 κ이다. 어떤 알로타이프(allotype)이든지 본 발명의 실행에 적당하며, 그 예로는 Km(1), Km(1, 2), Km(1, 2, 3) 또는 Km(3)을 들 수 있다.
본 발명의 다른 구체화에서, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 불변 영역은 유형 λ이다.
본 발명의 특정한 측면에서, 특히 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 불변 영역 및 각 중쇄의 불변 영역이 인간 영역일 때, 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 유형 γ이다. 이 변이체에 따르면, 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 유형 γ1, 유형 γ2, 유형 γ3 또는 γ4일 수 있고, 이들 세 가지 유형(유형 γ1, 유형 γ2, 유형 γ3)의 불변 영역은 인간 보체를 연결하는 특징이 있다. 유형 γ의 각 중쇄의 불변 영역을 가지는 항체는 IgG 류에 속한다. 유형 G 면역글로불린(IgG)은 이황화 결합에 의해 연결된, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의해 구성된 이질이합체(heterodimer)이다. 각 사슬은 N-말단 위치에 항체에 대한 항원에 특이한 (경쇄에 있어 재배열된 V-J 유전자 및 중쇄에 있어 V-D-J에 의해 인코딩된) 가변 영역 또는 도메인 및 C-말단 위치에 경쇄의 단일 LC 도메인 또는 중쇄의 3 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된 불변 영역을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 및 불변 도메인 CH1 및 CL의 조합이 Fab부를 형성하며, 이는 각 Fab가 항원 타겟에 결합할 수 있게 하는 매우 유연한 힌지(hinge) 영역에 의해 Fc 영역에 연결되고, 반면 항체의 효과기 성질을 중재하는, Fc 영역은 FcγR 수용체, neonatal Fc 수용체(FcRn) 및 C1q와 같은 효과기 분자에 접근 가능하게 남아 있다. 2개의 구형 도메인(globular domain) Cγ2 및 Cγ3으로 구성된 Fc 영역은, Asn 297에 연결된, 2개의 사슬의 각각에, 양 촉각을 가진(biantennate) N-글리칸(N-glycan)이 존재하는 Cγ2 영역에서 당화(glycosylate)된다.
바람직하게, 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 유형 γ1이고, 그런 항체는 대부분 (인간) 개체에서 ADCC(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) 활성을 일으킨다. 이 점에서, 어떤 알로타이프이든지 본 발명의 실행에 적당하며, 예로서, G1m(3), G1m(1, 2, 17), GIm(1, 17) 또는 G1m (1,3)을 들 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 항체는 당업자에게 공지되어 있는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되며, 특히 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 : 6851-55 (1984)에 기술된 키메라 항체의 제조 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 여기서, DNA 재조합 기술은 인간 면역글로불린의 대응 영역을 인간이 아닌 포유동물에서 기인하는 항체의 중쇄의 불변 영역 및/또는 경쇄의 불변 영역 을 교체하는데 사용된다. 그런 항체 및 그들의 제조 방법은 또한 특허 EP 173 494, Neuberger, M.S. et al., Nature 1985 Mar 21-27; 314(6008): 268-70., EP 125 023에 기술되어 있다. 키메라 항체 생성 방법은 당업자가 광범위하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄는 각 사슬을 위한 벡터를 사용하여 따로따로 발현시킬 수도 있고, 단일 벡터에 통합될 수도 있다.
발현 벡터는 항체의 각 중쇄 또는 각 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 및/또는 항체의 각 중쇄 또는 각 경쇄의 불변 영역을 코딩하는, 바람직하게 사람의, 핵산 서열이 숙주세포에 삽입되고, 도입되며, 유지되는 핵산 서열이다. 발현 벡터는 발현에 필수 불가결한 서열(프로모터(promoter), 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열, 선발 유전자(selection gene))을 보유하기 때문에 숙주 세포에서 이들 외래 핵산 단편을 발현할 수 있다. 그런 벡터는 당업자에게 공지된 것이며, 플라스미드(plasmid), 아데노바이러스(adenovirus), 레트로바이러스(retrovirus) 또는 박테리오파지(bacteriophage)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 게다가, 모든 포유류 세포를 숙주 세포로 이용할 수 있고, 즉, 본 발명에 따른 항체를 발현하는 세포로, 예를 들면 YB2/0, CHO, CHO dhfr- (예를 들면, CHO DX B11, CHO DG 4), CHO-Lec13, SP2/0, NS0, 293-HEK 또는 COS을 들 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 항체를 위한 발현 벡터를 제조하기 위해, 합성 신호 서열 및 적당한 제한효소 위치가 PCR 확대 반응(Polymerase Chain Reaction) 동안 가변 영역에 융합될 수도 있다. 그러고 나서 가변 영역은 항체, 바람직하게 인간 IgG1의 불변 영역과 결합한다. 이렇게 형성된 유전자는 두 별개의 벡터(각 사슬에 대해 하나) 또는 단일 벡터를 이용하여, 프로모터(예를 들면 RSV 프로모터)의 제어하에 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 위치의 업스트림에 복제된다. 벡터는 또한, dhfr 유전자, 네오마이신 내성 유전자와 같은, 당업자에게 알려진 선발 유전자가 제공된다.
본 발명에 따른 키메라 항체는 당업자에게 공지된 방법을 (예를 들면, 인산칼슘을 이용한 공동 침전법(co-precipitation with calcium phosphate), 전기천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection) 등) 이용하여 경쇄의 발현 벡터 및 중쇄의 발현 벡터를 숙주 세포에 공동-트랜스펙션(co-transfection)을 하여 생성될 수 있다.
인간화된 항체는 비인간 항체에서 유래된 CDRs 영역을 포함하는 항체를 의미하며, 항체 분자의 다른 부분은 하나 (이상) 인간 항체에서 유래된다. 그런 항체는 당업자에게 공지된 CDR 접합 방법에 따라 제조된다(US patent 5,225,539, US 6,180,370; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5. (1986); Verhoeyen et al., Bioessays 8(2): 74-8(1988); Riechmann et al., Nature 332: 323-7(1988); Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(24):10029-33(1989); Lewis A.P. and Crowe J.S., Gene 101(2): 297-302(1991); Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res. 19(9): 2471-6(1991); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285(1992); Singer et al., J. Immunol. 150 (7): 2844-57(1993); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623(1993)). 인간화된 항체를 생성하기 위해 접목되는 인간 가변 영역을 선택하는 것은 그 표적에 대한 친화력을 바꾸지 않고 항체 면역원성(immunogenicity)을 감소시키데 있어 중요하다. 인간화된 항체의 생성 방법에서, 쥐과 항체의 가변 영역의 서열을 알려진 인간 가변 영역의 서열 라이브러리와 비교하고 쥐과 서열에 가장 가까운 인간 가변 서열은 인간화된 항체의 FR 영역("프레임워크")로 유지된다[Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24): 10029-33 (1989); Sims et al., J. Immunol., 151 : 2296 (1993)]. 인간 FR 영역을 선택하는 또 다른 방법은 각 FR 영역에 있어, 쥐과 서열과 가장 가까운 인간 FR 서열을 선택하기 위하여 알려진 인간 FR 서열 라이브러리와 각 쥐과 FR 서열 서브 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)의 서열을 비교하는 것이다[US patent 2003/0040606; Singer et al., J. Immunol. 150 (7): 2844-57(1993); Sato K. and al, Mol. Immunol. 31(5): 371-81 (1994); Leung S.O. et al., Mol. Immunol. 32(17-18): 1413-27 (1995)]. 다른 방법은 인간 항체 중쇄 또는 경쇄의 특정 서브-그룹의 공통 서열(consensus sequence)에서 유래한 특정 FR 영역를 사용한다[Sato K. and al, Mol. Immunol. 31(5): 371-81 (1994)]. CDR 접목은 대부분 표적에 대한 인간화된 항체의 양호한 친화력을 보존하기 위해 인간 FR에 집중된 일부 중요 잔기를 약화시켜(muting) 완성된다[Holmes M.A. and Foote J., J. Immunol. 158(5): 2192-201 (1997)].
본 발명에 따른 인간화된 항체는 생체외(in vitro) 진단 방법, 또는 생체 조건(in vivo) 질병 예방 및/또는 치료 치료법에서의 사용이 바람직하다.
본 발명에 따라 이렇게 키메라화된(chimerised) 인간화된 항체는 인체 조직에 잘 내성을 얻고, 적어도 본래 항체만큼 효율적인 이점을 가진다. 특히 유리한 방법에서, 이렇게 키메라화된(chimerised) 인간화된 항체는 대응하는 천연 항체의 2배의 세포 독성을 가진다. 훨씬 유리한 방법에서, 이렇게 키메라화된(chimerised) 인간화된 항체는 대응하는 천연 항체보다 10배, 또는 100배, 더 바람직하게 500배 이상의 세포독성을 가진다.
인간 항체는 인간 항체에서 유래되는 각 영역의 항체를 의미한다. 이 항체는 인간 항체 유전자를 운반하는 형질전환 쥐 또는 인간 세포에서 유래할 수도 있다[Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct; 6(5): 561-6 (1995); Lonberg N. and D. Huszar. Internal Review of Immunology 13: 65-93 (1995); Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 97(2): 722-727 (2000)].
본 발명의 인간화된 또는 인간 키메라 항체는 당업자에게 알려진 재조합형 DNA 기술로서 바람직하게 생성한다. 본 발명의 단일클론항체는 P2/0, YB2/0, IR983F, 인간 골수종 나말와(human myeloma Namalwa), PER, C6, CHO 세포계, 특히 CHO-K-I, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO- Lec13, CHO Pr0-5, CHO dhfr-, Wil-2, 주르카트(Jurkat), 베로(Vero), Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653 등에서 선택된 분리된 세포에 의해 바람직하게 생성할 수도 있다.
본 발명의 단일클론항체는 또한 형질전환 동물로 생성할 수도 있다. 형질전환(Transgenesis)은 외래(exogenic) DNA가 다세포(multicellular) 유기체의 게놈으로 도입되어 자손에 전달되는 분자 유전 기술이다. 발생 초기 단계에서 배의 게놈에 상기 DNA가 안정하게 통합되어 자손에게 전달된다.
예를 들면, 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 형질전환 기술은 수정된 포유동물 난모세포(fertilized mammal ovocyte)에 전핵(pronucleus)으로 또는 특정 수의 경우에 숙주 게놈으로 마이크로인젝팅된 DNA 분자의 일부를 통합하는, 배줄기 세포로 naked DNA를 마이크로-인젝팅하는 것을 포함한다. 형질전환을 위한 다른 기술로서 당업자에게 공지된, 살아있는 세포로 외래(exogenic) DNA를 도입하는 기술이 있고, 특히 전기천공법(electroporation), 인산칼슘염 침전물, lipofectamine®(IN VITROGEN)와 같은 변형 리포좀(modified liposomes) 또는 지질에 의한 트렌스펙션(transfection)이 있다.
본 발명의 단일클론항체는 형질전환 동물의 우유에서 바람직하게 생성된다. 이런 식으로, 관심 단백질을 코딩하는 유전자는 특이적으로 우유에서 발현되는 유전자-조절 요소와 관련된다(예를 들면, WAP 유전자, 유장 산성 단백질의 프로모터). 발현 벡터는 단세포 단계에서 포유류 배로 현미경에 의해 마이크로 인젝팅된다. 배는 암컷으로 옮겨진다.
예를 들면, 임신 기간의 1달 후에, 그들의 게놈으로 형질전환유전자(transgene) (F0)를 통합한 1세대 포유동물이 태어나고 PCR 분석에 의해 귀 생검(ear biopsy)으로 확인한다. 그들은 주조자(founder)로 형질전환 포유동물의 2세대를 낳기 위하여 사용될 것이다. 주조자는 우유에 관심 대상 단백질을 생산하는 효율성을 위채 또한 형질전환 토끼(F1)의 2세대를 생산하기 위해 선택된다.
F1 자손은 귀 생검 후 PCR 분석에 의해 확인된다. 성숙한 F1 암컷을 비형질전환 수컷의 정자로 인공수정한다. 우유를 기계적으로 얻고 재조합형 단백질은 대량 생산 및 정제 전략의 개발을 위해 최선의 라인을 선택하도록 특징화된다(GLP, pre-GMP, GMP).
동시에, FDA 및 유럽 제안의 권고에 따라, F1 형질전환 수컷의 정자를 얻어 액체 질소에 -Master Sperm Bank, MSB- 냉동보관한다. 2세대 자손(F2)을 생성하기 위해, 이 정자는 비형질전환 암컷에 인공수정하기 위해 사용될 것이다. F2 형질전환 수컷의 정자를 얻어 우유에 단일클론항체를 산업적인 양만큼 생산할 수 있는 F3 형질전환 암컷을 생산하기 위해 - Working Sperm Bank, WSB -에 15 내지 20년 이상 저장될 것이다. 이 유형의 기술은 특허 EP 0 527 063 등에 기술된다.
Fc 감마 수용기
또한 유형 Ⅲ Fc 감마 수용기(FcγRⅢ)라고 불리는, CD16은 많은 면역계 세포에 존재하는 수용기이다. CD32(FcγRⅡ)와 CD64(FcγRI)와 함께, CD16은 IgG 항체 중쇄의 불변 (Fc) 단편에 대한 특이한 수용기이다. IgG의 Fc를 통해 면역계 이펙터 세포(effector cell)에 존재하는, CD16, CD32 및 CD64 수용기에 면역 복합물을 결합하는 것은 이펙터 세포(effector cell)를 활성화시키며, 특히 면역 복합물 식균작용을 활성화시킨다.
본 발명의 이펙터 세포(effector cell)는 세포막에서 3 유형의 Fc 수용기를 발현한다: CD64, CD32 및 CD16.
CD16 수용기는 "낮은 친화력 수용기"라고 불리고, PMNs(다혈핵 호중구(polymorphonuclear neutrophils)), 단핵세포의 아집단, 대식 세포, 수지상세포(dendritic cell) 및 NK 세포에서 발현된다. CD16는 식균작용, 입자 또는 면역 복합물의 식작용(opsonisation) 및 ADCC 활성 등과 같은 다수 이펙터 기능에 참가한다.
본 발명의 수단 키트의 단일클론항체는 본 발명의 이펙터 세포(effector cell)에 존재하는 Fc 수용기에 대해, 또한 특히 CD16에 강한 친화력을 나타내는 Fc 영역을 가진다. 본 발명은 본 발명의 단일클론항체의 Fc 영역과 수단 키트의 이펙터 세포(effector cell)의 CD16 사이의 시너지를 기술한다. 이 친화력은 항체와 이펙터 세포(effector cell)를 포함하는 배지에 (말초혈액의 중요한 구성요소인) 인간 다가 혈장 IgG(human polyvalent plasmatic IgG)를 추가해도 단일클론항체와 이펙터 세포(effector cell) 사이의 관계에 의해 생성되는 ADCC 활성에 전혀 또는 거의 영향을 미치지 않는다. 이는 CD16에 대한 단일클론항체의 Fc 영역의 친화력이 생리 조건에 존재하는 인간 IgG보다 크기 때문이다. 결과적으로, 생체 밖에서(in vitro) 관찰된 ADCC 활성은 seric IgG에 의해 관심대상 항체를 대체하지 않고 생체 내에서(in vivo) 감소되지 않는다. 사실상, 혈장과 혈청은 (또한 다가 혈장 IgG 또는 다클론(polyclonal) IgG 또는 seric IgG이라고 불리는) 높은 농도의 다가 면역글로불린을 포함한다. 수단 키트의 단일클론항체는 ADCC 또는 식균작용에 의해 세포 용해를 유도하는 CD16 및 CD64의 Fc 수용기를 통해 이펙터 세포(effector cell)의 활성화를 유도한다. 다가 혈장 IgG가 CD64를 통해 이펙터 세포(effector cell)의 세포의 용해 메커니즘을 저지한다는 일반적으로 승인되어 있고, 후자는 다가 IgG의 존재시 포화된다.
단일클론항체의 수단 키트에서 혈장 단편 분리 IgG보다 CD16에 대한 친화력이 큰 Fc 영역과 결합하면 생체 외에서(in vitro) 혈장 IgG의 첨가에 의해 저지되지 않는 ADCC 활성을 유도하고, 그로 인해 생체 내에서(in vivo) 치료 활성을 보전할 수 있게 된다. 이 생체 내에서의(in vivo ) 치료 활성은 종양 세포의 세포용해, 병원체(pathogenic agent)에 감염된 세포의 세포용해 또는 자가 항체를 생산하는 세포의 세포용해에 대응한다.
그러므로, 유리하게, 단일클론항체는 인간 혈장 IgG가 추가된 경우 다가 IgG에 의해 대체되지 않는다.
CD16에 대한 항체 Fc 영역의 강한 친화력 때문에, 단일클론항체는 이펙터 세포(effector cell)에 결합하고, 이 결합은 혈청의 농도가 진한 경우조차도, 인간 다가 혈장 IgG에 의해 대체되지 않는다.
결과적으로, 본 발명의 수단 키트는 단일클론항체 농도가 낮은 경우조차 표적 세포의 최적의 세포용해를 가능하게 한다.
유리하게, 수단 키트의 단일클론항체의 농도는 전통적으로 악성 질환, 자가-면역 또는 감염성 질환의 치료를 위한 단독 요법에서 사용된, 동일한 특이성을 가진 항체의 농도 보다는 더 낮다.
본 발명의 특정한 구체화에서, 본 발명의 단일클론항체의 Fc 영역은 적어도 2.106M-1의 CD16와 일정한 결합을 가진다.
유리하게, 본 발명의 항체의 일정한 결합은 Maenaka 등에 의한 문서(Katsumi Maena, P. Anton van der Merwe, David I. Stuart, E. Yvonne Jones, and Peter Sondermann; The Human Low Affinity Fcy receptors IIa, Iib, and III bind IgG with Fast Kinetics and Distinct Thermodynamic Properties. J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 48, 44898-44904, November 30, 2001)에서 기술된 방법에 따라 측정된다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 수단 키트의 단일클론항체 농도는 바람직하게 세포의 1mg/200백만 이하이다.
수단 키트라고 불린, 본 발명의 사용은 질환시 또는 주입 후에 고려된다. 효과기/표적 비율은 높을 필요가 없고, 10 이하, 또는 1 또는 0.1 이하이다.
본 발명의 특정한 양상에서, 단일클론항체는 적어도 2.106M-1의 친화력을 가진 이펙터 세포(effector cell)의 CD16에 결합한다.
예를 들면, 본 발명의 단일클론항체는 특허 WO 01/77181에서 기술된 과정에 의하여 제조될지도 모른다. CD16을 발현시키는 이펙터 세포(effector cell)를 활성화할 수 있는 단일클론항체를 제조하는 단계는 다음의 단계를 포함한다:
a) 하이브리도마, 특히 헤테로하이브리도마에서 선택된 세포계 및 상기 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터에 의해 트랜스펙션된 동물 또는 인간 세포계에서 기인하는 다양한 클론에서 얻은 단일클론항체를 정제하는 단계;
b) 단계 a)에서 얻은 각 형체에 다음을 포함하는 개별 반응 혼합물을 추가하는 단계:
i. 상기 항체의 표적 세포,
ⅱ. FcyRⅢ 발현 세포를 포함하는 이펙터 세포(effector cell),
ⅲ. 다가 IgG,
c) 표적세포의 세포용해 퍼센트를 결정하고, 표적 세포의 세포용해를 유발하는 이펙터 세포(effector cell)를 활성화시키는 단일클론항체를 선택하는 단계.
각 항원 특이성을 위해, 본 발명의 단일클론항체는 전부 동일한 세포질 클론에서 기인하기 때문에 일차 구조의 수준이 동일한, 단일클론항체를 포함하는 조성물이다. 그러나, 단일클론항체 조성물의 모든 항체는 동일한 글리칸의(glycannic) 단면도를 나타내지 않는다. 인간 및 동물 항체는 각 중쇄의 CH2 도메인에 N-결합 올리고당을 가진다. G 면역글로불린에 대한 이 올리고당의 결합 위치는 아스파라긴 297(Kabat에 따라 Asn297)이다. 이 아스파라긴 잔기는 또한 "Fcγ 당화(glycosylation)"라고 불린다.
Asn 297에 결합된 올리고당 사슬의 말단을 "리덕터(reductor) 말단"으로, 반대 말단을 "비-리덕터(non-reductor) 말단"이라 한다.
IgG 항체의 Fc 영역에, 2개의 Fcγ 당화(glycosylation) 위치가 있다; 그러므로 2개의 올리고당 사슬은 각 항체 분자에 결합된다.
그러므로, 단일클론항체 조성물에서, 올리고당 사슬은 생산 세포계에 의해 전달되는 당화(glycosylation)에 따라, 다양한 구조를 가진다. 그러나, 이 사슬은 공통의 기본 구조를 가진다:
Figure 112009064770872-PCT00001
모든 단일클론항체에 공통인, 이 기본 구조는, 다음의 당을 더 포함할 수도 있다: N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)(GlcNAc), 푸코오스(fuc) 및 갈락토오스(gal). N-올리고당의 주요 당화(glycosylated) 형태는 다음과 같다:
Figure 112009064770872-PCT00002
각 올리고당 사슬이 하나 이상의 이런 당을 포함하기 때문에, 그리고 상기의 G0, G0F, G1 또는 G1F 형태로 존재하기 때문에, 단일클론항체 조성물에 한 항체 조성물과 다른 항체 조성물을 다르게 하는 이런 각각의 당에서 단일클론항체 조성물로 전달되는 올리고당의 많은 조합이 있다. 그러므로, 동일한 세포계에서 기인하는 클론도 글리칸 조성물이 다양한 항체 조성물을 생성할 수 있다.
그러므로 푸코오스(fucose) 비율이 65% 이하인 단일클론항체 조성물이 CD16에 대하여 강한 친화력을 가진다는 것을 본 출원인이 밝혔다. 특히, 이런 유형의 단일클론항체 조성물은 CD16에 대한 다가 IgG보다 더 높은 CD16에 대한 친화력을 가진다. 게다가, 조성물의 단일클론항체는 seric Ig로 대체되지 않는다.
그런 단일클론항체 조성물의 제조방법이 예를 들면 특허 WO 01/77181에서 개시되어 있다. 본 발명의 유리한 구체화에서, 단일클론항체 조성물은 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오즈를 첨가하도록 하는 낮은 효소 활성을 가지는 세포에 의해 생성된다.
본 발명의 다른 구체화에서, 그런 비율의 푸코오스(fucose)를 함유하는 단일클론항체 조성물을 얻기 위하여 단일클론항체 조성물에 fucosidase 등과 같은 효소를 작용하게 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 단일클론항체 조성물은 YB2/0(ATCC CRL-1662)에서 생성된다.
이점으로서, 본 발명의 수단 키트의 단일클론항체는 항원 5C5(신장암 세포에 의해 발현되는 종양 항원), BCR(B Cell Receptor), 항-FVⅢ 인히비터 항체, TCR(T Cell Receptor), CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD45, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD66(a, b, c, d), CD74, CD80, CD86, CD126, CD138, CD154, MUC1(Mucine 1), MUC2(Mucine 2), MUC3(Mucine 3), MUC4(Mucine 4), MUC16(Mucine 16), HM1.24(다발성 골수종에서 과발현된 형질세포에 대한 특이 항원), 테나신(tenascin)(세포외기질의 단백질), GGT(gamma-glutamyltranspeptidase), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), EGFR(Endothelial Growth Factor receptor), CEA(carcinoembryonic antigen), CSAp (colon-specific antigen-p), ILGF(Insulin-Like Growth factor), 태반성장인자(placental growth factor), Her2/neu, 탄산 탈수 효소 Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ), IL-6, 단백질 S100(칼슘에 결합한 단백질의 다중유전자족), MART-1(흑색종에 관한 종양 분화 항원), TRP-1(tyrosinase-related protein 1), TRP-2(tyrosinase-related protein 2), gp100(glycoprotein 100 kDa), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 리서스 D 항원(Rhesus D antigen), (HLA-DR와 같은) 클래스 I 및 Ⅱ의 MHC 분자, 변이된 유전자, 특히 종양유전자(oncogene) 또는 종양-억제유전자에서 발현된 항원, 특정한 잘 정의된 종양에 의해 발현된 종양유전자 바이러스에서 유래된 항원, 뮐러관호르몬(Mullerian hormone)의 유형 Ⅱ 수용기 등과 같은, 일부 종양에서 과발현되고, 일부 정상 조직에서 약간 발현된 유비쿼터스 항원(ubiquitous antigen), 당화 또는 비-당화 단백질, 인지질, 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 같은 감염된 세포에 의해 자가 발현(self-expressed), 또는 비자가-발현(non self expressed) 또는 막에 노출된 분자 및 병원체(pathogenic agent)에 의해 발현된 또는 분비된 단백질(세균성 독소, 세균성 또는 기생성 벽의 단백질 복합물, HIV 바이러스, HBV, HCV 및 RSV 등의 바이러스 외피 당단백질(viral envelope glycoproteins)과 같은 이디오타이프(idiotype)에서 선택된 항원에 대한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 바람직하게 CD20 항원에 대한 것이다.
CD20 항원은 성숙한 B 림프구의 표면에 존재하는 35~37kDa의 분자량을 가지는 소수성 막 횡단 단백질이다(Valentine et al. 1987, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 84(22): 8085-9; Valentine et al. 1989, J.Biol. Chem. 264(19): 11282-11287). 그것은 형질세포(plasmocyte)에서 초기 pre-B 단계에서 이 발현이 사라지는 단계인 분화시까지 B 림프구의 발생 동안 발현된다. CD20 항원은 정상적인 B 림프구와 악성 B 세포 둘 다에 존재한다. 특히, CD20 항원은 B 발현형(phnotype) 림프종의 대부분(림프종의 80%)에 발현된다: 예를 들면 그것은 림프구 B 비호지킨(non-Hodgkin) 림프종(NHL)의 90% 이상, B형 만성 림프성 백혈병(LLC-B)의 95% 이상에서 발현된다. CD20 항원은 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell) 또는 형질세포(plasmocyte)에서는 발현되지 않는다.
CD20이 칼슘 채널로 작용하고 B 림프구 분화의 첫 번째 단계(Golay et al. 1985, J Immunol.; 135(6): 3795-801) 및 B 림프구 증식(Tedder et al. 1986, Eur J Immunol. 1986 Aug; 16(8): 881-7)의 조절에 개입할 수 있지만, CD20의 기능은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 항-CD20 항체의 조성물은 YB2/0에 의해 생성되고, 65% 이하의 푸코오스(fucose) 비율을 가진다.
본 발명의 특정한 구체화에서, 그런 항체 및 그 생산 과정은 특허 WO2006/ 064121에 기술된다.
유리하게, 그런 항체 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호(SEQ IN NO) 1에 개시된 서열이다.
유리하게, 그런 항체 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호(SEQ IN NO) 2 또는 3에 개시된 서열이다.
간단하게, 이 항체는 상술한 경쇄 및 중쇄를 발현시키는 벡터에 의한 YB2/0 세포 트렌스펙션(transfection)을 통해 특허출원 WO2006/064121의 개시에 따라 얻어질 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 단일클론 항-CD20 항체의 조성물은 65% 이하의 푸코오스(fucose) 비율을 가지며, 바람직하게는 20 내지 40%의 푸코오스 비율을 포함하며, 또는 0.6 이하의 푸코오스/갈락토오스 비율을 가진다.
본 발명의 바람직한 구체화에서, 수단 키트의 단일클론항체는 수탁번호 CNCM I-3314의 하에 CNCM에 기탁된, R509 클론에 의해 생성된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체화에서, 수단 키트의 단일클론항체는 수탁번호 CNCM I-3529의 하에 CNCM에 기탁된, R603 클론에 의해 생성된다.
인간 혈청이 존재하는 경우를 포함하여, LLC-B 환자의 악성 세포가 생체외에서(ex vivo), 심지어 E:T의 비율이 10 이하, 또는 5 이하 또는 2 이하의 낮은 농도에서 세포용해가 되기 때문에, 본 출원인은 본 발명의 수단 키트가 LLC-B를 치료하는데 효과적임을 밝혔다.
다가 IgG로 대체되지 않을 정도로 충분히 강한, 이펙터 세포(effector cell)와 항체의 Fc 영역 사이의 물리적 상호작용(결합) 때문에, 본 발명의 수단 키트는 항체의 가변 영역에 의해 인식된 표적세포의 최적의 용해를 허용한다.
유리하게, LLC-B 치료를 위한 본 발명의 수단 키트에 포함된 단일클론항체의 농도는 375 mg/㎡ 이하이다.
낮은 독성, 특이성 및 감소한 복용량에 관한 이점 때문에, 항-CD20 항체를 포함하는 수단 키트는 다음의 질병을 치료하는데 투여될 수 있다: B형 NHL(type B NHL), 급성 또는 만성 B 림프성 백혈병(acute or chronic B lymphoid leukemias) 등과 같은 CD20 양성 B 림프종의 림프세포증식질환(lymphoproliferative syndrome), 기관 이식 거부반응(organ graft rejection) 또는 이식편대숙주반응(graft versus host disease), 류머티스성 다발성관절염(rheumatoid polyarthritis), 파종성홍반성루푸스(disseminated lupus erythematosus), 경피증(sclerodermia), 원시 쇼그렌증후군(primitive Sjogren's syndrome)(또는 구제로 쇼그렌 증후군(Gougerot-Sjogren syndrome)), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 자가-면역 말초신경병증(polyneuropathies), 유형 I 당뇨병, 자가-면역 간염(auto-immune hepatitis), 강직성 척추염(ankylosing spondylarthritis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 통풍성 관절염(gout arthritis), 소아 지방변증(coeliac disease), 크론병(Crohn's disease), 하시모토병(Hashimoto's thyroiditis), 에디슨병(Addison's disease), 자가-면역 간염, 바제도우병(Basedow's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), ANCA(antineutrophil cytoplasmic antibody)에 관련된 전신 혈관염(systemic vasculitis)과 같은 혈관염(vasculitis), 자가-면역 혈구감소증(auto-immune cytopenias), 급성 또는 만성 자가-면역 저혈소판증(thrombopenias), 자가-면역 용혈성 빈혈(Haemolytic anaemias), 신생아의 용혈성 질환(haemolytic disease of the newborn; HDN), 냉응집소병(cold agglutinin disease), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura), 및 후천성 자가-면역 혈우병(acquired auto-immune haemophilia); 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 막외성 신증(extramembraneous nephropathies), 자가-면역 수포성 피부질환(auto-immune bullous skin disorders), 중증 근무력증(refractory myasthenia), 혼합한랭글로불린혈증(mixed cryoglobulinemia), 건선(psoriasis), 청소년 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 염증성 근육염(inflammatory myositis), 피부근염(dermatomyositis) 및 항인지질항체 증후군(antiphospholipid syndrome)을 포함한 소아 전신성 자가면역 질환과 같은, 자가-면역 및/또는 염증성 질병.
유리하게, 본 발명의 수단 키트는 주사 가능한 용액이다. 이 주사 가능한 용액은 유리하게 국부적으로 또는 전신에 주사 가능한 용액의 형태이다. 특정한 구체화에서, 환자에게 6번 투여된다. 한 번은 일주일 동안 매일 또는 이틀에 한 번씩, 그러고 나서 한 달 또는 두 달 동안 매주 한 번씩 투여하며 한 달에 세 번 투여며, 치료는 여러 번 갱신할 수 있다.
다른 구체화에서, 이펙터 세포(effector cell)는 주사를 맞을 때마다 104 내지 109의 이펙터 세포(effector cell)가 함유된 복용량으로 투여된다.
다른 구체화에서, 본 발명의 항체는 주사 당 1 내지 500mg의 항체를 함유한 복용량으로 투여된다.
본 발명의 다른 특정한 구체화에서, 이펙터 세포(effector cell)는 10번까지 반복 투여될 수 있고, 각 투여 사이의 시간 간격은 2일 및 12개월 사이이다. 본 발명의 다른 특정한 구체화에서, 단일클론항체는 10번까지 반복 투여될 수 있고, 각 투여 사이의 시간 간격은 2일 및 12개월 사이이다. 본 발명의 다른 구체화에서, 단일클론항체 및 이펙터 세포(effector cell)는 동시에 투여된다.
본 발명의 다른 구체화에서, 이펙터 세포(effector cell)의 전에 단일클론항체를 투여하여, 단일클론항체 및 이펙터 세포(effector cell)는 연속적으로 투여된다.
본 발명의 다른 구체화에서, 단일클론항체 및 이펙터 세포(effector cell)는 이펙터 세포(effector cell) 후에 단일클론항체를 투여하여 연속적으로 투여된다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 수단 키트를 함유하는 약제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 악성 질환, 자가-면역 및 감염성 질환을 치료하는 약제를 제조하기 위해 본 발명의 수단 키트의 사용에 관한 것이다.
이 약제 또는 약제 조성물은 유리하게 부형제 및/또는 약제로 허용가능한 부형제를 포함한다.
부형제는 약제 사용법과 호환되고 당업자에 알려진, 현탁액, 젤, 분말 등뿐만 아니라 식염수, 생리 식염수, 등장액, 버퍼 용액 등등과 같은 용액일 수도 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 하나 이상의 작용제(agnet) 또는 분산제(dispersants), 가용화제(solubilisers), 안정제, 계면활성제, 부식방지제 등등에서 선택된 부형제를 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 다른 작용제 또는 유효 성분을 포함할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약 제조를 위한 본 발명의 수단 키트의 사용이다.
본 발명의 또 다른 목적은 악성 질환 치료용 약 제조를 위한 본 발명의 수단 키트의 사용이다.
유리하게, 이 악성 질환는 고형 종양(solid tumours) 및 악성 혈액질환(haemopathy)에서 선택된다. 유리하게, 고형 종양은 흑색종(melanomas), 암(carcinomas), 육종(sarcomas), 신경교종(gliomas) 및 피부암(skin cancers)에서 선택된다. 유리하게, 암(carcinomas)은 신장(kidney), 유방(breast), 구강(oral cavity), 폐(lungs), 위장관(gastro intestinal tract), 난소(ovaries), 전립선(prostate), 자궁(uterus), 방광(bladder), 췌장(pancreas), 간(liver), 쓸개(gallbladder), 피부(skin) 및 고환(testicles)의 암(carcinomas)으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
악성 혈액질환(haemopathy)은 림프세포증식질환(lymphoproliferative syndrome), 골수증식성질환(myeloproliferative syndrome), 골수이형성증후군(myelodysplasic syndrome) 및 B형 NHL(type B NHL), 급성 또는 만성 B 림프성 백혈병(acute or chronic B lymphoid leukemias), 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma), 모양(毛樣) 세포성 백혈병(tricholeucocyte leukaemia), 급성 및 만성 골수성 백혈병(acute and chronic myeloid leukemias), T 림프종 백혈병(T lymphomas leukemias), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas), 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 다발성골수종(multiple myeloma) 등과 같은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)에서 선택되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
유리하게, 자가-면역 및/또는 일차 또는 이차 염증성 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 수단 키트 사용에 관한 것으로, 기관 또는 계에 특이하며, 병원성 자가 항체에 관련된 또는 관련되지 않는고, 상기 질병은 기관 이식 거부반응(organ graft rejection) 또는 이식편대숙주반응(graft versus host disease), 류머티스성 다발성관절염(rheumatoid polyarthritis), 파종성홍반성루푸스(disseminated lupus erythematosus), 경피증(sclerodermia), 원시 쇼그렌증후군(primitive Sjogren's syndrome)(또는 구제로 쇼그렌 증후군(Gougerot-Sjogren syndrome)), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 자가-면역 말초신경병증(polyneuropathies), 유형 I 당뇨병, 자가-면역 간염(auto-immune hepatitis), 강직성 척추염( ankylosing spondylarthritis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 통풍성 관절염(gout arthritis), 소아 지방변증(coeliac disease), 크론병(Crohn's disease), 하시모토병(Hashimoto's thyroiditis), 에디슨병(Addison's disease), 자가-면역 간염, 바제도우병(Basedow's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), ANCA(antineutrophil cytoplasmic antibody)에 관련된 전신 혈관염(systemic vasculitis)과 같은 혈관염(vasculitis), 자가-면역 혈구감소증(auto-immune cytopenias), 급성 또는 만성 자가-면역 저혈소판증(thrombopenias), 자가-면역 용혈성 빈혈(Haemolytic anaemias), 신생아의 용혈성 질환(haemolytic disease of the newborn; HDN), 냉응집소병(cold agglutinin disease), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura), 및 후천성 자가-면역 혈우병(acquired auto-immune haemophilia); 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 막외성 신증(extramembraneous nephropathies), 자가-면역 수포성 피부질환(auto-immune bullous skin disorders), 중증 근무력증(refractory myasthenia), 혼합한랭글로불린혈증(mixed cryoglobulinemia), 건선(psoriasis), 청소년 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 염증성 근육염(inflammatory myositis), 피부근염(dermatomyositis) 및 항인지질항체 증후군(antiphospholipid syndrome)을 포함한 소아 전신성 자가면역 질환과 같은, 성인 및 소아의 다른 혈액학적 합병증(haematological complications)에서 선택되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 목적은 감염성 질환을 치료용 약 제조를 위한 본 발명의 수단 키트의 사용에 관한 것이다.
유리하게, 감염성 질환은 바이러스(인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스(HBV, HCV), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV), 선천성 거대세포바이러스(cytomegalovirus; CMV), 엔테로바이러스(enterovirus), 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C의 인플루엔자(influenza with Influenza virus A, B and C), 호흡기 세포융합바이러스(syncytial respiratory virus; SRV), 또는 HTLV), 박테리아 및/또는 그들의 독소(파상풍(tetanus), 디프테리아(diphtheria), 폐렴구균(pneumococci), 수막염구균(meningococci), 메티실린 내성 형태(methicilin resistant forms)를 포함하는 포도상구균(staphylococci), 클렙시라(Klebsiellas), 시겔라(Shigellas), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테리아(enterobacteria) 또는 병원내 질병(nosocomial diseases)을 포함한 항생제 내성 질환(antibiotic resistant pathologies)), 기생충 (말라리아(paludism), 레이쉬마니아증(Leishmaniosis), 트리파노소마증(trypanosomiasis)) 및 치군군야(chikungunya), 조류독감, SARS(severe acute respiratory syndrome virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스 또는 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)와 같은 출혈열(haemorrhagic fevers)에 관한 바이러스, 및 탄저병(Anthrax), 보툴리누스중독증(botulism), 흑사병(Plague), 천연두(smallpox) 및 수두 바이러스(poxvirus), 튜라레미아증(Tularaemia), 출혈열 병원균(haemorrhagic fever agents), 브루셀라증(brucellosis), 포도상구균 B 엔데로톡신(Staphylococcus B Enterotoxins), 디프데리아 독소(diphtheric toxin) 또는 바이러스성 뇌염(viral Encephalitis)과 같은 바이오 테러리즘(bio-terrorism)에 관한 것에서 유도된 것에 선택된다.
도 1: 경쟁 테스트를 통해 항 D-R297 EMABling 항체와 대식 세포의 CD16 (FcgRⅢ 수용기)에 AD1 항체의 결합 연구.
도 2: 다클론성 면역글로불린(IVIg)이 다양한 농도로 존재할 때 EMABling R297 항체와 AD1 항체의 ADCC 활성이 유도된 대식세포.
도 3: 면역글로불린(IVIg)이 다양한 농도로 존재할 때 EMABling R297 항체와 AD1 항체 및 6.25㎍/㎖ 농도에서 항-CD16 3G8 항체의 ADCC 활성이 유도된 대식 세포.
도 4: 면역글로불린(IVIg)이 다양한 농도로 존재할 때 EMABling R297 항체 및 AD1 항체에 의해 유도되는 CD16+ 대식 세포에 의한 Rh+ 적혈구(erytrhocytes)의 식균작용.
실시예 1: 대식 세포로 단핵세포(monocyte)의 분화
단핵세포(monocyte)는 Ficol와 Percol 밀도 구배에서 분획하여 말초혈액에서 분리되며, 10% SVF를 포함하는 배지에서 배양하고 M-CSF(Monocyte Colony Stimulating Factors) (50ng/ml)을 첨가한다. 7일 후, 얻은 대식세포의 발현형은 CD14+, CD16+, CD32+, CD64+, CD11b+, CD1a-, CD80-, CD83-이다.
그러므로, M-CSF 분화는 대식 세포의 표면에서 CD16의 발현을 허용한다.
실시예 2: 대식세포에 의해 발현된 CD16를 가진 항-D 항체의 상호 작용
(또한 "EMABling R297"이라고 불리는) 항-D R297 항체의 결합을 AD1 항체와의 결합과 비교한다. 항-D R297 항체는 문서 WO 01/77181에서 기술되어 있고, 이 문서에서 기술된 과정에 따라 생성한다. 이 항체는 YB2/0 세포(ATCC CRL-1662)에서 생성된다.
대식 세포 CD16에서 R297 항체의 결합은 (헤테로골수종(heteromyeloma)에 의해 발현된, 문서 WO 01/77181에서 기술되는) AD1 항체의 결합과 비교된다.
항-CD16 항체(생산자 클론 3G8)의 displacement assay을 통해 특이성과 상관없이, 대식세포의 CD16 수용기에 결합하는 단일클론항체를 측정할 수 있다.
정제된 대식 세포는 항-D 항체(R297 또는 AD1)의 다양한 농도의 농도(0 내지 83 μg/ml)로, 그리고 정해진 농도로 형광 색소에 결합한 항-CD16 3G8 항체(3G8 PE)로 배양된다.
세척 후에, 대식 세포의 CD16 수용기에의 항체 3G8-PE의 결합을 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 측정한다. CD16에 스스로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체는 3G8 항체의 결합과 경쟁하여, 그 결과, MFI(Mean Fluorescence Intensity)가 감소한다. 결과를 평가된 항체의 양에 대한 함수로서, 형광 평균(MFI)으로 표현한다.
도 1은 AD1 항체와 비교하여 R297 항체가 대식 세포 CD16에 아주 강하게 결합함을 보여준다.
그래프의 평탄역(plateau)에서, EMABling 항체는 AD1 항체보다 적어도 6배 큰 displacement를 유도한다.
실시예 3: 대식 세포에 의해 발현된 CD16와 항-CD20 EMAB6 및 EMAB603 항체의 상호 작용
(수탁번호 I-3529의 하에 CNCM에 기탁된, R603 클론에 의해 생성된) 항-CD20 EMAB603 항체 및 (수탁번호 I-3314의 하에 CNCM에 기탁된 R509 클론이 생성하는) EMAB6가 대식 세포에 결합하는 것을 리툭산(Rituxan)과의 결합과 비교한다. 항-CD20 EMAB6와 EMAB603 항체는 특허 WO2006/064121, 특히 26~33에, 기술된 과정에 따라 생성된다. 또한, 이 항체를 생성하는 클론은 수탁번호 CNCM I-3314와 CNCM I- 3529의 하에서 CNCM에서 이용가능하다.
항-CD16 항체(생산자 클론 3G8)의 displacement assay는 그들의 특이성에 관계없이 CD16 수용기에 결합하는 단일클론항체를 측정한다.
대식 세포는 항-CD20 항체(EMAB6, EMAB603 또는 리툭시맵(rituximab))의 다양한 농도(0 내지 83μg/ml)로, 또한 정해진 농도의 형광 색소에 결합한 항 CD16 3G8항체(3G8-PE)로 배양된다.
세척 후, 대식 세포의 CD16 수용기에의 3G8 PE 항체의 결합을 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 측정한다. CD16에 스스로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체는 3G8 항체의 결합과 경쟁하고, 그 결과, MFI(Mean Fluorescence Intensity)가 감소한다. 결과를 평가된 항체의 양에 대한 함수로서, 형광 평균(MFI)으로 표현한다.
Imax 값(3G8 결합의 최대 저지) 및 IC50 값(Imax의 50%에 해당하는 3G8 결합 저지를 유도하기 위해 요구되는 항-CD20 항체 농도)을 PRISM 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 산출한다.
결과: 대식 세포 CD16에의 EMABling R603 및 EMAB6 항체의 상호 작용은 Rituxan로 얻어진 상호작용보다 더 크다.
그러므로, 이 분석실험이 항원 표적이 없이 실행되기 때문에, 본 발명의 항-CD20 항체는 대식 세포 CD16에 강하게 결합하는 능력을 가진다.
실시예 4: 항-D/적혈구(erytrhocytes) Rh+/대식세포(macrophages) ADCC 활 성. 다가 IVIg의 역할(Tegeline®).
항-D 항체의 세포 독성을 ADCC 기술로 연구한다. 항-D 항체, (M-CSF의 단핵세포(monocyte)에서 분화된) 대식 세포 및 (약 2/1의 이펙터/표적 비율의) 레소스(Rhesus) D+ 적혈구를 다가 면역글로불린(IVIg)(Tegeline®)의 다양한 농도 하에서 37℃, 16시간 동안 배양한다. 그러고 나서, 항체에 의해 유도된 세포 독성을 세포용해된 적혈구에서 분리된 헤모글로빈 상층액(supernatants)에서 정량하여 분광기(colorimetry)로 측정한다. 특이한 세포용해의 결과가 세포용해 퍼센트로 표현된다.
도 2의 결과는 IVIg이 없을 경우 ADCC에 의하여 유일하게 세포용해를 유도하는 AD1 항체와 반대로, 대식 세포 존재시, EMABling R297 항체는 상당한 농도의 IVIg가 존재할 때 강한 잔여 ADCC 활성을 가짐을 나타낸다.
그러므로, 다가 면역글로불린이 없을 경우, 2 항-D 항체, EMABling R297 및 AD1는 약 29%의 ADCC 활성을 가진다. 반대로, 다가 면역글로불린이 5mg/ml의 농도로 존재하면, EMABling 항체가 적어도 20배 더 활성을 나타낸다(23% 세포용해 대 AD1에 1%). 더 진한 농도(25mg/ml)의 다가 면역글로불린에서, EMABling과 AD1의 각 세포용해의 퍼센트는 16% 및 1%이다.
실시예 5: 항-D/적혈구 Rh+/대식세포 ADCC 활성. 다가 IVIg(Tegeline®)의 역할.
실시예 4에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 따라, Raji 세포와 (M-CSF에서 단핵세포(monocyte)에서 분화된) 대식세포의 존재시 항-CD20의 ADCC 활성을 조사하였다. (R603 클론 또는 리툭산(Rituxan)에 의해 생성된) 항-CD20 항체는 대식세포 및 Raji 세포 존재시 다가 IVIg(Tegeline®)의 다양한 농도 하에서 배양한다. 37℃, 16 시간의 배양 후, Raji 세포에서 분리된 세포내 LDH(lactate deshydrogenase)의 양을 상층액(supernatants)에서 정량하면서 항체에 의해 유도된 ADCC 활성을 분광기로 측정한다. 특이한 세포용해의 결과를 세포용해 퍼센트로 표현한다.
결과에 의하면, 항-CD20 R603 항체는 대식세포 발현 CD16와 Tegeline®의 존재시 리툭산(Rituxan)에 의해 유도된 것보다 적어도 2배 큰 ADCC 활성을 가진다. 이 ADCC 활성은 항-CD16 3G8의 인히비터 효력에 의해 보여준 것처럼 대식세포에 의해 발현된 CD16에 달려있다.
실시예 6: 항-D/적혈구 Rh+/대식세포 ADCC 활성. IVIg 존재시 CD16 강조.
항-CD16 항체, 3G8를 추가하면, 시험된 IVIg의 가장 진한 농도가 존재할 때 EMABling 항체에 의해 ADCC 활성이 저해되며, 이는 대식 세포에서 발현된 CD16에 유도된 세포용해가 좌우됨을 의미한다.
실시예 7: IVIg 존재시 EMABling R297 항체에 의해 유도되는 CD16+ 대식 세포에 의한 Rh+ 적혈구의 식균작용.
CD16+ 대식 세포에 의하여 RH + 적혈구의 식균작용을 유도하는 항-D R297 항 체의 능력을 유세포 분석기(flow cytometry)로 조사한다. 항-D 항체, PKH67로 표지시킨 대식세포 (분화된 단핵세포(monocyte) M-CSF) 및 PKH26으로 표지된 Rh D+ 적혈구 (5/1의 이펙터/표적 비율)을 다가 IVIg(Tegeline®)의 다양한 농도 하에서 4℃와 37℃에서 3시간 동안 배양한다.
결과는 이중으로 표지된, 즉 적어도 하나의 적혈구에 식균 작용이 실시된, PKH67/PKH26의 백분율에 대응한다.
결과: 4℃에서, 각각 특정한 형광 색소로 표지된 대식 세포 및 적혈구는 분광기에서 다른 창(window)을 나타낸다. 식균작용 퍼센트는 매우 낮고, IVIg이 없을 경우 약 4%이며, IVIg가 존재할 때 1 내지 2%이다. 4℃에서의 이 값은 37℃에서의 식균작용 퍼센트를 공식화하기 위하여 추론된다.
37℃에서, 이중으로 표지된 PKH67/PKH26의 퍼센트는 IVIg가 없을 경우 두 ㅂ분석된 항체, R297 EMABling와 AD1에 있어서 증가한다. IVIg의 존재시, AD1 항체와 달리, EMABling 항체만 Rh+ 적혈구에 식균 작용을 할 능력이 있다. 그러므로, 0, 1 또는 2mg/ml의 IVIg가 있을 때, 식균작용의 퍼센트가 15 내지 20% 남아 있고, 이는 IVIg의 첨가로 인해 EMABling 항체에 의해 유도된 식균 작용이 저해되지 않음을 보여준다.
1mg/ml의 농도에서, EMABling 항체는 AD1 항체보다 적어도 5배 더 크다. 2mg/ml 이상의 농도에서, 식균작용 퍼센트는 EMABling 항체에서 16.9%이지만, AD1 항체에서는 0이다.
실시예 8: IVIg 존재시 R603 항체에 의해 유도되는 CD16+ 대식 세포에 의한 Rh+ 적혈구의 식균작용.
IVIg 존재시 R603 항체에 의해 유도된 CD16 대식 세포가 존재할 때 CD20 Raji 세포의 식균작용을 연구한다.
CD16+ 대식 세포에 의하여 Raji 세포의 식균작용을 유도하는 항-CD20 항체의 능력을 유세포 분석기(flow cytometry)로 조사한다. 항-CD20 항체, PKH67로 표지된 대식 세포(분화된 단핵세포 M-CSF) 및 PKH67로 표지된 Raji 세포(5/1의 이펙터/표적 비율)를 다가 IVIg(Tegeline®)의 다양한 농도하에서 4℃와 37℃에서 3시간 동안 배양한다.
결과는 이중으로 표지된, 즉 적어도 하나의 Raji 세포에 식균 작용이 실시된, PKH67/PKH26의 백분율에 대응한다.
결과: 4℃에서, 각각 특정한 형광 색소로 표지된, 대식세포 및 Raji 세포는 분광기에서 다른 창에 나타난다. 식균작용의 퍼센트는 매우 낮고, IVIg의 부재 및 존재시 5% 이하이다. 4℃에서의 이 값을 체계적으로 37℃에서의 식균작용 퍼센트를 공식화하기 위하여 추론한다.
37℃에서, 시험된 2 항체, 항-CD20 R603 및 리툭산(Rituxan)에 있어서 IVIg이 없을 경우에 이중으로 표지된 PKH67/PKH26의 퍼센트가 증가한다.
IVIg 존재시, 리툭산(Rituxan) 항체와 비교하면, EMABling 항체는 Raji 세포에의 식균 작용(phagocyting)에 있어, 약 2배, 4배 또는 10배 더 큰 용량을 가진다. 그러므로, 0, 1 또는 2mg/ml의 IVIg가 있을 때, 식균작용의 퍼센트가 리툭 산(Rituxan)에 의해 유도된 것보다 크며, 이는 IVIg 존재시 EMABling 항체는 CD16+ 대식 세포 존재시 식균작용을 유도함을 보여준다.
<110> LFB BIOTECHNOLGIES <120> SET OF MEANS FOR TREATING A MALIGNANT PATHOLOGY, AN AUTOIMMUNE DISEASE OR AN INFECTIOUS DISEASE <150> FR0703013 <151> 2007-04-25 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (24)

  1. 악성 질환, 자가면역 질환 또는 감염성 질환 치료용 수단 키트로서,
    표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 이펙터 세포(effector cell), 및 단일클론항체를 포함하며,
    CD16에 대한 상기 단일클론항체의 Fc 영역의 친화력은 CD16에 대한 다클론성 면역글로불린의 Fc 영역의 친화력보다 더 큰, 수단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)는 단핵세포 또는 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 세포에서 유래하는 단핵세포 또는 단핵세포 전구체인, 수단 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 세포에서 유래하는 단핵세포 또는 단핵세포 전구체는 CD16을 발현하는 단핵세포, 대식세포, NK 세포, 수지상세포 및 말초세포 단핵세포(PBMC)에서 선택되는, 수단 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 표면에서 FcγRⅢ 수용기(CD16)를 발현하는 세포에서 유래하는 단핵세 포 또는 단핵세포 전구체는 대식세포인, 수단 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD16에 대한 상기 단일클론항체의 Fc 영역의 상기 친화력 때문에, 상기 단일클론항체는 다클론성 면역글로불린, 특히 인간 혈청에 존재하는 다클론성 면역글로불린으로 대체되지 않는, 수단 키트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 2.106M-1 이상의 친화력을 가지는 세포에서 유래된 상기 단핵세포 또는 단핵세포의 전구에의 CD16에 결합하는, 수단 키트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 단일클론항체 조성물의 형태로 생성되며,
    각 항체는 Fcγ 당화(glycosylation) 위치(Kabat에 따르면 아스파라긴 297)에 결합되는 N-연결 당 사슬(N-linked sugar chains)을 가지며,
    상기 조성물의 모든 항체의 상기 당화(glycosylation) 위치의 모든 N-연결 당 사슬 중에서, 푸코오스(fucose)의 비율은 65% 이하인, 수단 키트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 항원 5C5(신장암 세포에 의해 발현되는 종양 항원), BCR(B Cell Receptor), 항-FVⅢ 인히비터 항체, TCR(T Cell Receptor), CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD45, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD66(a, b, c, d), CD74, CD80, CD86, CD126, CD138, CD154, MUC1(Mucine 1), MUC2(Mucine 2), MUC3(Mucine 3), MUC4(Mucine 4), MUC16(Mucine 16), HM1.24(다발성 골수종에서 과발현된 형질세포(plasmocyte)에 대한 특이 항원), 테나신(tenascin)(세포외기질의 단백질), GGT(gamma-glutamyltranspeptidase), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), EGFR(Endothelial Growth Factor receptor), CEA(carcinoembryonic antigen), CSAp (colon-specific antigen-p), ILGF(Insulin-Like Growth factor), 태반성장인자(placental growth factor), Her2/neu, 탄산 탈수 효소 Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ), IL-6, 단백질 S100(칼슘에 결합한 단백질의 다중유전자족), MART-1(흑색종에 관한 종양 분화 항원), TRP-1(tyrosinase-related protein 1), TRP-2(tyrosinase-related protein 2), gp100(glycoprotein 100 kDa), 아밀로이드 단백질(amyloid protein), 리서스 D 항원(Rhesus D antigen), (HLA-DR와 같은) 클래스 I 및 Ⅱ의 MHC 분자, 변이된 유전자(mutated genes), 특히 종양유전자(oncogene) 또는 종양-억제유전자(tumour-suppressor genes)에서 발현된 항원, 특정한 잘 정의된 종양에 의해 발현된 종양유전자 바이러스에서 유래된 항원, 뮐러관호르몬(Mullerian hormone)의 유형 Ⅱ 수용기 등과 같은, 일부 종양에서 과발현되고, 일부 정상 조직에서 약간 발현된 유비쿼터스 항원(ubiquitous antigen), 당화 또는 비-당화 단백 질, 인지질(phospholipid), 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 같은 감염된 세포에 의해 자가 발현 또는 비자가-발현(non self expressed) 또는 막에 노출된 분자 및 병원체에 의해 발현된 또는 분비된 단백질(세균성 독소, 세균성 또는 기생성 벽의 단백질 복합물, HIV 바이러스, HBV, HCV 및 RSV 등의 바이러스 외피 당단백질과 같은 이디오타이프(idiotype)에서 선택된 항원에 대한, 수단 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 CD20 항원에 대한, 수단 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항-CD16 항체는 수탁번호 I-3314 하에 CNCM에 기탁된, 세포계 R509에 의해 또는 수탁번호 I-3529 하에 CNCM에 기탁된, 세포계 R603에 의해 생성되는, 수단 키트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료에 동시에, 연속적으로 또는 따로 사용되는, 수단 키트.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표면에서 CD16를 발현하는 이펙터 세포(effector cell)는 CD16와 항체의 상호 작용에 의해 촉진되는, 상기 항체에 의해 표적이 되는 세포에 대한 세포 독성을 가지는, 수단 키트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 ADCC 활성에 의해 또는 상기 CD16를 발현하는 이펙터 세포(effector cell) 존재시 상기 항체의 상기 표적 세포의 식균작용에 의해 세포 독성을 유도하는, 수단 키트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 수단 키트 및 약학적으로 허용가능한 부형(excipient)제를 포함하는 약학 조성물.
  15. 약제 제조를 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 수단 키트의 사용.
  16. 악성 질환의 치료용 약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 수단 키트의 사용.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 악성 질환은 고형 종양(solid tumours) 및 악성 혈액질환(haemopathy)에서 선택되는, 수단 키트의 사용.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 고형 종양은 흑색종(melanomas), 암(carcinomas), 육종(sarcomas), 신경교종(gliomas) 및 피부암(skin cancers)에서 선택되는, 수단 키트의 사용.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암(carcinomas)은 신장암, 유방암, 구강암, 폐암, 위장관(gastro intestinal tract) 암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 방광암, 췌장암, 간암, 쓸개암, 피부암 및 고환암으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 수단 키트의 사용.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 악성 혈액질환(haemopathy)은 B형 NHL를 가지는 림프세포증식질환(lymphoproliferative syndrome), B형 NHL를 가지는 골수증식성질환(myeloproliferative syndrome), B형 NHL를 가지는 골수이형성증후군(myelodysplasic syndrome), 급성 또는 만성 B 림프성 백혈병(acute or chronic B lymphoid leukemias), 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma), 모양 세포성 백혈병(tricholeucocyte leukaemia), 급성 및 만성 골수성 백혈병(acute and chronic myeloid leukemias), T 림프종 백혈병(T lymphomas leukemias), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphomas), 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 다발성골수종(multiple myeloma)에서 선택되는, 수단 키트의 사용.
  21. 자가-면역 및/또는 일차 또는 이차 염증성 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 수단 키트의 사용으로서,
    기관 또는 계에 특이하며, 병원성 자가 항체에 관련된 또는 관련되지 않는, 수단 키트의 사용.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 자가-면역 및/또는 염증성 질환은 기관 이식 거부반응(organ graft rejection) 또는 이식편대숙주반응(graft versus host disease), 류머티스성 다발성관절염(rheumatoid polyarthritis), 파종성홍반성루푸스(disseminated lupus erythematosus), 경피증(sclerodermia), 원시 쇼그렌증후군(primitive Sjogren's syndrome)(또는 구제로 쇼그렌 증후군(Gougerot-Sjogren syndrome)), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 자가-면역 말초신경병증(polyneuropathies), 유형 I 당뇨병, 자가-면역 간염(auto-immune hepatitis), 강직성 척추염( ankylosing spondylarthritis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 통풍성 관절염(gout arthritis), 소아 지방변증(coeliac disease), 크론병(Crohn's disease), 하시모토병(Hashimoto's thyroiditis), 에디슨병(Addison's disease), 자가-면역 간염, 바제도우병(Basedow's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), ANCA(antineutrophil cytoplasmic antibody)에 관련된 전신 혈관염(systemic vasculitis)과 같은 혈관염(vasculitis), 자가-면역 혈구감소증(auto-immune cytopenias), 급성 또는 만성 자가-면역 저혈소판증(thrombopenias), 자가-면역 용혈성 빈혈(Haemolytic anaemias), 신생아의 용혈성 질환(haemolytic disease of the newborn; HDN), 냉응집소병(cold agglutinin disease), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura), 및 후천성 자가-면역 혈우병(acquired auto-immune haemophilia); 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 막외성 신증(extramembraneous nephropathies), 자가-면역 수포성 피부질환(auto-immune bullous skin disorders), 중증 근무력증(refractory myasthenia), 혼합한랭글로불린혈증(mixed cryoglobulinemia), 건선(psoriasis), 청소년 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 염증성 근육염(inflammatory myositis), 피부근염(dermatomyositis) 및 항인지질항체 증후군(antiphospholipid syndrome)을 포함한 소아 전신성 자가면역 질환에서 선택되는, 수단 키트의 사용.
  23. 감염성 질환을 치료용 약 제조를 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 수단 키트의 사용.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 감염성 질환은 바이러스(인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스(HBV, HCV), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV), 선천성 거대세포바이러스(cytomegalovirus; CMV), 엔테로바이러스(enterovirus), 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C의 인플루엔자(influenza with Influenza virus A, B and C), 호흡기 세포융합바이러스(syncytial respiratory virus; SRV), 또는 HTLV), 박테리아 및/또는 그들의 독소(파상풍(tetanus), 디프테리아(diphtheria), 폐렴구균(pneumococci), 수막염구균(meningococci), 메티실린 내성 형태(methicilin resistant forms)를 포함하는 포도상구균(staphylococci), 클렙시라(Klebsiellas), 시겔라(Shigellas), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테리아(enterobacteria) 또는 병원내 질병(nosocomial diseases)을 포함한 항생제 내성 질환(antibiotic resistant pathologies)), 기생충(말라리아(paludism), 레이쉬마니아증(Leishmaniosis), 트리파노소마증(trypanosomiasis)) 및 치군군야(chikungunya), 조류독감, SARS(severe acute respiratory syndrome virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스 또는 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)와 같은 출혈열(haemorrhagic fevers)에 관한 바이러스과 같은 신종 질병(emerging diseases), 탄저병(Anthrax), 보툴리누스중독증(botulism), 흑사병(Plague), 천연두(smallpox) 및 수두 바이러스(poxvirus), 튜라레미아증(Tularaemia), 출혈열 병원균(haemorrhagic fever agents), 브루셀라증(brucellosis), 포도상구균 B 엔데로톡신(Staphylococcus B Enterotoxins), 디프데리아 독소(diphtheric toxin) 또는 바이러스성 뇌염(viral Encephalitis)과 같은 바이오 테러리즘(bio-terrorism)에 관한 질병에서 선택되는 수단 키트의 사용.
KR1020097022136A 2007-04-25 2008-04-25 악성 질환, 자가-면역 질환 또는 감염질환의 치료 수단의 세트 KR20100021405A (ko)

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