EP2109676A1 - Veränderte ppase-expression in zuckerrübe - Google Patents

Veränderte ppase-expression in zuckerrübe

Info

Publication number
EP2109676A1
EP2109676A1 EP04711306A EP04711306A EP2109676A1 EP 2109676 A1 EP2109676 A1 EP 2109676A1 EP 04711306 A EP04711306 A EP 04711306A EP 04711306 A EP04711306 A EP 04711306A EP 2109676 A1 EP2109676 A1 EP 2109676A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
promoter
seq
nucleic acid
ppase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04711306A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Steffen Greiner
Karsten Harms
Markwart Kunz
Mohammad Munir
Thomas Rausch
Markus Schirmer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suedzucker AG
Original Assignee
Suedzucker AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suedzucker AG filed Critical Suedzucker AG
Publication of EP2109676A1 publication Critical patent/EP2109676A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to methods and means for producing an improved sugar beet, in particular a sugar beet, which has an increased sucrose content in its storage organ, a reduced sucrose breakdown during storage and an increased growth of the beet.
  • the invention relates to the use of at least two gene constructs for generating such a plant and the nucleotide sequences used.
  • sucrose degradation is primarily mediated by enzymatic hydrolysis through a wound-induced invertase, which is primarily located in the vacuoles of the beet cells.
  • Vacuum and / or cell wall-bound invertase isoforms are also induced in de novo wounds of beet tissue (Rosenkranz, H. et al., " . Exp. Bod. 52 (2001), 2381-2385).
  • This process can be achieved by expression an invertase inhibitor (WO 98/04722) or by expressing an antisense or a dsRNA construct for the vacuolar invertase (WO 02/50109).
  • the second and PPi-dependent degradation pathway is even preferentially followed in the plant cell under anaerobic conditions which occur during storage of the beet bodies, since ATP reserves which would be used up in the first degradation pathway of sucrose are thereby obtained.
  • previously known measures for reducing sucrose loss mainly concern the inhibition of the first degradation route (for example invertase inhibition), which - Except in wounded areas -
  • invertase inhibition for example invertase inhibition
  • Other known measures consist in the general reduction of enzymatic activity by storage at low temperatures, for example below 12 ° C., with high air humidity at the same time.
  • This object is achieved according to the invention by providing a process for the production of a transgenic plant, in particular a beet plant, preferably sugar beet (Beta vulgaris), with an increased sucrose content and preferably reduced sucrose degradation during storage.
  • a transgenic plant which can be obtained by this process and has an increased sucrose content and in particular a reduced sucrose breakdown during storage.
  • the object is also achieved according to the invention by providing at least one nucleic acid molecule coding for a protein with the biological activity of a soluble pyrophosphatase from Beta vulgaris, in particular a cytosolic pyrophosphatase (C-PPase), preferably the same pyrophosphatase, which is obtained by Inserting at least one nuclear localization sequence (NLS) is changed in its compartmentalization, and by providing at least one nucleic acid olecule which encodes a promoter of a vacuolar pyrophosphatase (V-PPase) from Beta vulgaris.
  • the method according to the invention for producing a transgenic beet plant with an increased sucrose content comprises
  • V-PPase vacuolar pyrophosphatase
  • C-PPase cytosolic or nuclear-localized soluble pyrophosphatase
  • a transgenic regenerated beet plant with an increased sucrose content in the beet is obtained, which has an increased sucrose content in the beet, preferably a reduced sucrose breakdown during storage, and / or preferably a beet body which is increased by increased meristem activity.
  • vacuolar sucrose in the cytosol is primarily due to the increased activity of the ⁇ pH-dependent sucrose transport from sucrose via the tonoplast membrane to the vacuole.
  • the pH gradient required for sucrose transport is largely due to the activity of the membrane-bound V PPase dependent. This shows high activity (K M ⁇ 10 ⁇ mol / 1) even at a low concentration of the substrate pyrophosphate, while the affinity of soluble PPases is significantly lower (K M > 100 ⁇ mol / 1).
  • Plant cell especially a transgenic plant, can be obtained with increased sucrose accumulation.
  • the expression mediated according to the invention reduces the pyrophosphate content in the plant cell.
  • Particularly preferred according to the invention is the measured expression, in particular overexpression, of transgenic cytosolic or nuclear localized together, preferably simultaneously, with the expression mediated according to the invention, in particular overexpression, of transgenic vacuolar pyrophosphatase.
  • the increased pyrophosphate breakdown in the cytosol and cell nucleus also promotes various synthetic activities in the meristems of the plant, which in turn has a growth-increasing effect, so that enlarged beet bodies. be preserved.
  • the sucrose content in the vacuole is advantageously increased by the increased activity of the V-PPase, the sucrose breakdown in the cytosol is significantly reduced and the activity of the meristems, in particular localized on the periphery of the growing beet body, is increased.
  • a transgenic plant obtainable in this way has an increased growth and, in particular, an increased sucrose content, in particular already at the time of harvest.
  • the storage-related breakdown of sucrose in the plant is reduced and the transgenic plant thus obtainable is more stable in storage.
  • an “increased sucrose content” is understood to mean a content of sucrose mainly in the storage tissue of plants, in particular beets, which is normally at least 5%, in particular min. at least 10%, preferably at least 20%, particularly preferably at least 30% above the average sucrose content in corresponding tissues of comparable known beets.
  • the average Sac charosegehalt in the storage tissue of the sugar beet obtainable according to more than 18% by weight, in particular more than 21% by weight.
  • an “increased” or “increased meristem activity” or “improved meristem growth” usually means an increase in the beet growth (based on the fresh weight) by at least 5%, preferably at least 10%, particularly preferably understood to be at least 19% compared to the average growth of comparable known beets.
  • a “transgene” is understood to mean a gene which can be transfected, ie transformed, in the form of DNA or RNA, preferably cDNA, into a eukaryotic cell, as a result of which foreign genetic information in particular is introduced into the transfected eukaryotic cell At least one is under the operational control of at least one regulatory element under a "gene”. Understanding, in particular, protein-coding nucleotide sequence, that is to say one or more information-carrying sections of DNA molecules.
  • transgenes are transiently present as nucleic acid molecule (s) or are integrated into the genome of the transfected cell, which naturally do not occur in this cell, or they are integrated at a location in the genome of this cell where they do not occur naturally, that is to say transgenes are located in a different genomic environment or are present in a copy number other than the natural number or are under the control of another promoter.
  • s nucleic acid molecule
  • the first transgene which codes for a V-PPase, in particular from Beta vulgaris, preferably comprises at least one nucleic acid molecule, the sequence of this nucleic acid molecule being selected from the group consisting of
  • a modified nucleotide sequence a modified nucleic acid molecule of the modified nucleotide sequence having the nuclein acid molecule hybridized with the nucleotide sequence according to a) or b) and thereby has a sequence identity of more than 80%, preferably more than 90%, 95% or 99%.
  • the second transgene which codes for a C-PPase, in particular from Beta vulgaris, preferably comprises at least one nucleic acid molecule, the sequence of this nucleic acid molecule being selected from the group consisting of
  • acid molecule hybridized with the nucleotide sequence according to a) or b) and thereby has a sequence identity of more than 80%, preferably more than 90%, 95% or 99%.
  • the nucleotide sequence of the aforementioned C-PPase nucleic acid molecule which is preferred according to the invention also comprises at least one nucleus localization sequence.
  • the at least one first transgene is arranged on a vector.
  • the at least one second transgene can preferably also be arranged on a vector. Both first and second transgenes are particularly preferably arranged on a vector, in particular the same vector.
  • the vector is present in isolated and purified form.
  • the second transgene is arranged on the vector in the 5 'to 3' direction before the first transgene.
  • at least one first transgene is arranged on at least one first vector and at least one second transgene is arranged on at least one second vector different from the first vector.
  • the first and second transgenes are transfected simultaneously into at least one plant cell, in particular beet cell, that is to say transformed.
  • the transformation is preferred through ballistic in- jection, that is, by means of biolistic transformation, carried out in a manner known per se.
  • the transformation takes place by electrotransformation, preferably by means of electroporation, in a manner known per se.
  • the transformation is carried out in a known manner by means of Agrobacteria, preferably using in particular Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes, as transformation agents.
  • the transformation is carried out using viruses in a manner known per se.
  • vectors are understood to mean, in particular, liposomes, cosmids, viruses, baeteriophages, shuttle vectors and other vectors customary in genetic engineering. These are preferably understood to mean plasmids. In a particularly preferred variant, this is pBinAR -Vector (Höfgen and Willmitzer, 1990) These vectors preferably have at least one further functional unit which in particular effects or contributes to stabilization and / or replication of the vector in the host organism.
  • vectors are used in which at least one nucleic acid molecule according to the invention is under the functional control of at least one regulatory element.
  • regulatory element means such elements those that ensure the transcription and / or translation of nucleic acid molecules in prokaryotic and / or eukaryotic host cells, so that a polypeptide or protein is expressed.
  • Regulatory elements can be promoters, enhancers, silencers and / or transcription termination signals.
  • Regulatory elements which are functionally linked to a nucleotide sequence according to the invention can be nucleotide sequences which come from organisms or genes other than the protein-coding nucleotide sequence itself.
  • the inventor has according to the invention, the vector used with preference at least one further regulatory element, in particular at least one intrans enhancer.
  • the vectors used are preferably equipped to overexpress the first or second transgene or both transgenes. This is achieved in particular in that the at least one first and / or the at least one second transgene on the vector is operably linked to at least one promoter.
  • the promoter is also preferably a storage-specific promoter.
  • the pro motor on the aforementioned vector a combination of the properties of the aforementioned promoters.
  • the at least one promoter is a promoter from a beet plant, in particular from Beta vulgaris. This is preferably a promoter of the vacuolar pyrophosphatase (V-PPase promoter).
  • the at least one promoter is a promoter from Arabidopsis thaliana or a promoter from the cauliflower mosaic virus (CaMV), in particular the CaMV35S promoter.
  • the at least one promoter is a sucrose synthase promoter.
  • vacuolar pyrophosphatase preferred according to the invention preferably under the control of at least one CaMV35S promoter, leads to a significantly improved energization of the vacuole, that is to say to an increased pH gradient, which mainly leads to the increased accumulation of storage materials, in particular sucrose in the vacuole leads;
  • a significantly improved energization of the vacuole that is to say to an increased pH gradient, which mainly leads to the increased accumulation of storage materials, in particular sucrose in the vacuole leads;
  • the acidification of the vacuole caused by the preferred overexpression according to the invention increases the active saccharose transport into the lumen of the vacuole.
  • C-PPase preferred according to the invention ensures that the breakdown of cytosolic or nuclear pyrophosphate (PP ⁇ ) is significantly increased compared to a non-transformed beet cell.
  • -dependent sucrose breakdown or by activating various synthetic activities (see above) to an increased meristema activity together with the increased accumulation of storage substances, in particular sucrose, in the vacuole due to the overexpression of the V-PPase, an increase in the transgenic beet obtainable according to the invention preferably occurs before harvesting, ie when the plant grows sucrose content.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid molecule which encodes a protein with the biological activity of a soluble pyrophosphatase, in particular from Beta vulgaris, in particular a cytosolic pyrophosphatase (C- _PPase) - preferably according to the universal genetic standard code known per se, where the sequence of this nucleic acid molecule is selected from the group consisting of
  • a modified nucleotide sequence wherein a modified nucleic acid molecule of the modified nucleotide sequence hybridizes with the nucleic acid molecule with the nucleotide sequence according to a) or b) and thereby a sequence identity of more than 80%, preferably more than 90%, 95% or 99%, having.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid molecule which encodes a protein with the biological activity of a vacuolar pyrophosphatase, in particular from Beta vulgaris - preferably according to the universal genetic standard code known per se - the sequence of this nucleic acid molecule being selected from the group consisting of
  • nucleotide sequence which encodes the amino acid sequence which is shown in sequence ID No. 5, and its complementary nucleotide sequence
  • a modified nucleotide sequence a modified nucleic acid molecule of the modified nucleotide sequence with the nucleic acid molecule with the nucleotide sequence according to a) or b) hybridizes and has a sequence identity of more than 80%, preferably more than 90%, 95% or 99%.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid molecule which codes for a promoter of the vacuolar pyrophosphatase (V-PPase) in particular from Beta vulgaris - preferably according to the universal genetic standard code known per se - the sequence of the nucleic acid molecule being selected from the group consisting of out
  • the Nuelein Acidmolekül is preferably a DNA molecule, 'for example, cDNA or genomic DNA, or an RNA molecule, for example mRNA.
  • the nucleic acid molecule preferably comes from the sugar beet Beta vulgaris.
  • the nuclein is preferably acid molecule in isolated and purified form.
  • the invention thus also includes modified nucleic acid molecules with a modified nucleotide sequence, which are obtainable, for example, by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or some bases of a nucleic acid molecule according to the invention, in particular within the coding sequence of a nucleic acid is called nucleic acid molecules, which can be referred to as mutants, derivatives or functional equivalents of a nucleic acid molecule according to the invention.
  • Such manipulations of the sequences are carried out, for example, in order to specifically change the amino acid sequence encoded by a nucleic acid.
  • modified nucleic acids preferred according to the invention encode modified enzymes, in particular modified vacuolar and / or cytosolic pyrophosphates and / or in particular with modified enzymatic activity, and are used in particular for the transformation of plants used for agriculture, mainly to produce transgenic plants.
  • modified enzymes in particular modified vacuolar and / or cytosolic pyrophosphates and / or in particular with modified enzymatic activity
  • nucleic acid molecules according to the invention are inserted into plasmids and using standard methods of microbiology or Molecular biology is subjected to mutagenesis or a sequence change by recombination in a manner known per se.
  • sequence changes can also be achieved by adding natural or synthetic nucleic acid sequences.
  • synthetic nucleic acid sequences are adapters or linkers, which i.a. also be used to link nucleic acid fragments to these fragments.
  • the present invention also relates to naturally occurring sequence variants of the nucleic acid molecules according to the invention or used according to the invention.
  • formulations used in connection with the present invention analogous to the formulation “modified nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleic acid molecule” mean that a nucleic acid molecule hybridizes with another, different nucleic acid molecule in a manner known per se under moderately stringent conditions.
  • hybridization with a radioactive gene probe in a hybridization solution for example: 25% formamide, 5 x SSPE, 0.1% SDS, 5 x Denhardt's solution, 50 mg / ml herring sperm DNA, based on the composition of the individual components
  • a hybridization solution for example: 25% formamide, 5 x SSPE, 0.1% SDS, 5 x Denhardt's solution, 50 mg / ml herring sperm DNA, based on the composition of the individual components
  • the unspecifically bound probe is then removed, for example by washing the filter several times in 2 x SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.
  • these hybridizing nucleic acid molecules preferred according to the invention have at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and particularly • preferably at least 99% homology, that is to say sequential identity at the nucleic acid level.
  • nucleotide sequences of the nucleic acid molecules to be compared are preferably compared over their entire sequence length.
  • the present invention also relates to a vector which is preferably used in the method according to the invention and which contains at least one of the sequences of the aforementioned nucleic acid molecules according to the invention.
  • this vector is preferably a viral vector.
  • this vector is preferably a plasmid, in a particularly preferred variant the pBinAR vector.
  • the vectors are preferably also recorded in which the at least one nucleic acid molecule according to the invention contained therein is operatively linked to at least one regulatory element which inhibits the transcription and synthesis of translatable nucleic acid molecules Pro and / or eukaryotic cells guaranteed.
  • regulatory elements are preferably promoters, enhancers, operators and / or transcription termination signals.
  • the aforementioned vectors according to the invention preferably additionally contain antibiotic resistance genes, herbicide resistance genes and / or other customary selection markers.
  • Another object of the present invention is a host cell which is transformed with at least one of the aforementioned vectors according to the invention, this host cell preferably a bacterial cell, a plant cell or an animal cell.
  • the present invention therefore also relates to a transgenic and preferably fertile plant which is obtained by the process according to the invention, where at least one of the cells of this plant is transformed and this plant is preferably increased by an increased sucrose content and / or an increased growth as a result Meristema activity are marked.
  • the invention also includes the progeny and further breeding obtained from the transformed plants according to the invention.
  • the present invention also relates to transgenic plant cells which have been transformed, ie transfected, with one or more nucleic acid molecule (s) according to the invention or used according to the invention, and transgenic plant cells len derived from such transformed cells.
  • Such cells contain one or more nucleic acid molecule (s) used or according to the invention, this (s) preferably being linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells.
  • Such cells can be distinguished from naturally occurring plant cells in particular in that they contain at least one nucleic acid molecule according to the invention or used according to the invention which does not naturally occur in these cells and / or in that such a molecule integrates at one location in the genome of the cell is present on which it does not occur naturally, that is to say in a different genomic environment or in a copy number other than the natural number and / or is under the control of at least one other promoter.
  • the transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using techniques known to those skilled in the art.
  • the plants obtainable by regeneration of the transgenic plant cells according to the invention are also the subject of the present invention.
  • the invention also relates to plants which contain at least one, but preferably a multiplicity, of cells which contain the vector systems according to the invention or the vector systems used according to the invention, but also derivatives or parts thereof, and which, due to the inclusion of these vector systems, derivatives or parts thereof, form a synthesis are capable of polypeptides (proteins) which cause a modified pyrophosphatase activity.
  • the invention thus makes it possible to provide plants of the most diverse types, genera, families, orders and classes, which in particular have the abovementioned characteristics.
  • the transgenic plants according to the invention are in principle monocotyledon or dicotyledonous plants such as Graminae, Pinidae, Magnoliidae, Ranunculidae, Caryophyllidae, Rosidae, Asteridae, Aridaee, Liliidae, Arecidae, Commelinidae and Gymnospermae but also algae, mosses , Ferns or calli, plant cell cultures etc., as well as parts, organs, tissues, harvesting or propagation materials' thereof.
  • they are preferably useful plants, in particular sucrose-synthesizing and / or storing plants such as the sugar beet.
  • Another object of the present invention is harvested material and propagation material of the aforementioned transgenic plants according to the invention, for example flowers, fruits, seeds, bulbs, roots, leaves, rhizomes, seedlings, cuttings, etc.
  • the present invention also relates to the use of at least one of the aforementioned nucleic acid molecules according to the invention for producing such a aforementioned transgenic plant with at least one transformed cell, in particular especially in connection with at least one of the aforementioned vectors.
  • sequence listing is part of this description and illustrates the present invention; it contains the sequences with SEQ ID No. 1 to 7:
  • SEQ ID No. 1 shows the 1041 nucleotides
  • SEQ ID No. 2 shows the 222 amino acid polypeptide sequence of the soluble beta-pyrophosphatase from Beta vulgaris (BSP1); SEQ ID No. 3 shows the 245 amino acids
  • DNA sequence of the nucleic acid molecule encoding the vacuolar beta pyrophosphatase from beta vulgaris of isoform I (bvpl); SEQ ID No. 5 ' shows the 764 amino acids
  • Polypeptide sequence of the vacuolar beta-pyrophosphatase from beta vulgaris of isoform I (BVP1); SEQ ID No. 6 shows the 1733 nucleotide DNA sequence of the bvpl promoter for the vacuolar beta-pyrophosphatase from Beta vulgaris of the isoform. I; SEQ ID No. 7 shows the 962 nucleotides
  • SEQ ID No. 8 shows the 18-nucleotide DNA sequence of the sense primer according to
  • SEQ ID No. 9 shows the 22 nucleotide DNA sequence of the antisense primer according to Example 1.
  • SEQ ID No. 10 shows the 38 nucleotide
  • SEQ ID No. 11 shows the 38 nucleotide DNA sequence of the antisense primer according to Example 2.
  • SEQ ID No. 12 shows the 31-nucleotide DNA sequence of the sense primer according to Example 4.
  • SEQ ID No. 13 shows the 31-nucleotide DNA sequence of the antisense primer according to Example 4.
  • SEQ ID No. 14 shows the 30-nucleotide DNA sequence of the sense primer according to Example 5.
  • SEQ ID No. 15 shows the 31-nucleotide DNA sequence of the antisense primer according to Example 5.
  • SEQ ID No. 16 shows the 34-nucleotide DNA sequence of the sense primer according to
  • SEQ ID No. 17 shows the 35 nucleotide DNA sequence of the antisense primer according to Example 6.
  • SEQ ID No. 18 shows the 20 nucleotide
  • SEQ ID No. 19 shows the 21 nucleotides • DNA sequence of an antisense primer according to Example 7.
  • SEQ ID No. 20 shows the 24-nucleotide DNA sequence of a sense primer according to Example 7.
  • SEQ ID No. 21 shows the 20 nucleotide DNA sequence of an antisense primer according to Example 7.
  • Figure 1 shows fluorescence micrographs of transformed beet cells:
  • Figure la shows a transformed Beta vulgaris
  • FIG. 1b shows the subcellular localization of the RFP Control plasmids in the plastids and FIG. 1c shows the subcellular localization of soluble pyrophosphatase (BSPl) fused with GFP in the cytoplasmic and near-core regions of the protoplast;
  • BSPl soluble pyrophosphatase
  • FIG. 2 shows biochemical properties of soluble beta-pyrophosphatase (BSPL): FIG. 2a shows the pH dependence and FIG. 2b shows the temperature dependence of the enzyme activity, FIG. 2c shows the determination of the K m value for pyrophosphate (Eadie-Hofstee diagram) ;
  • FIG. 3 shows the proton pumping activity in beets stored for three months: FIG. 3a shows the V-PPase activity, FIG. 3b shows the V-ATPase activity;
  • FIG. 4 shows Western blot analysis for BSPl in leaf and beet
  • FIG. 5 shows a Western blot analysis of the V-PPase in the sugar beet (Beta vulgaris);
  • FIG. 6 shows the Northern blot analysis of V-PPase and V-ATPase in seedlings of the sugar beet
  • FIG. 7 shows the Northern blot analysis of the V-PPase in the stress treatment of suspension culture cells of the sugar beet
  • Figure 8 shows Northern blot analysis of expression patterns after sugar beet wounding
  • FIG. 9 shows the Northern blot analysis of the development-dependent expression of the polypeptide of the V-PPase from Beta vulgaris of Isoform II (BVP2);
  • FIG. 10 shows the schematic structure of recombinant vectors: FIG. 10a shows the vector obtained according to Example 4, FIG. 10
  • FIG. 10b the vector obtained according to Example 5
  • FIG. 10c the vector obtained according to Example 6.
  • Example 1 Isolation of the cDNA sequence of a soluble pyrophosphatase from Beta vulgaris L. (BSPl)
  • RNA The total RNA according to Logemann et al. was extracted from suspension culture cells from Beta vulgaris L. (Analyt. Biochem., 163 (1987), 16-20) isolated and transcribed into cDNA by means of reverse transcriptase. On the basis of sequence comparisons, degenerate primers were produced with the aid of which a 435 bp partial cDNA sequence from the coding region of the soluble pyrophosphatase from sugar beet (bspl) was amplified by PCR:.
  • Sense primer a 435 bp partial cDNA sequence from the coding region of the soluble pyrophosphatase from sugar beet
  • the sequence of the bspl full-length cDNA (1041 bp) was then determined by RLM-RACE technology (GeneRacer TM Kit, Vitrogen, Groningen, the Netherlands), which was accordingly derived from a 666 bp long ORF which is flanked by a 118 bp long 5'-UTR and a 257 bp long 3 'UTR.
  • the amino acid sequence encoded by the ORF of the bspl cDNA is shown in SEQ ID No. 2 and has 222 amino acids.
  • Tables 1 and 2 show the biochemical properties of BSPl and the influence of divalent cations on the activity of the BSPl:
  • FIG. 2a shows the results of the pH value determination (pH 8.5)
  • FIG. 2b the results of the temperature optimum determination (53 ° C.)
  • FIG. 2c the " results of the K M value determination (160 ⁇ mol / 1 PPi ).
  • the coding region was cloned into a modified pFF i9 G vector (Timmermanns et al., J. Biotech. 14 (1990), 333-344), which instead of the ⁇ - Glucoronidase structural gene carries the sequence of the "green fluorescent protein" (GFP) (Sheen, et al., Plant J. 8 (5) (1995), 777-784).
  • GFP green fluorescent protein
  • the sense primer used for this contains a “Kozak” sequence immediately before the start ATG in order to ensure optimal translation.
  • the antisense primer contains both a PstI and a Sall interface (underlined):
  • the cell walls were digested using lytic enzymes, and after a further 24 hours the transient expression of the two fusion proteins in the protoplasts was examined by fluorescence microscopy using an inverted microscope.
  • the GFP fusion protein was analyzed using a FITC filter (excitation: 450-490 nm, emission: 515 nm long pass), in the case of the dsRED fusion protein an XF137-2 filter (excitation: 540 + 30 nm, emission : 585 nm long pass) is used.
  • Figure 1 shows the subcellular localization of BSPl determined by fluorescence microscopic GFP analysis of transformed beet cells: It can be seen from Figure la that a transformed Beta vulgaris cell is indistinguishable from an untransformed one.
  • Figure lb relates to the RFP control plasmid. It can be seen that the plastids light up red (bright) due to the plastid signal peptide of the plastid ⁇ -ECS.
  • FIG. 1c the excitation of the GFP shows that the soluble pyrophosphatase fused to the GFP has no plastid signal peptide.
  • BSPl is obviously a cytosolic or core-localized soluble pyrophosphatase. This is also called C-PPase.
  • the coding sequence for the beta vulgaris C-PPase was amplified by PCR.
  • the primers used for this were the same as in the amplification described above for the pFF ⁇ 9 :: GFP construct (Example 2).
  • the cloning into the expression vector pQE30 -. (Qia-. Gen ® , Hilden) was carried out via BamRI / Sal.
  • the construct was transformed together with a pUBS520 plasmid (Brinkmann et al., Gene 85 (1) (1989), 109-114) into E. co! I-DH5 ⁇ cells.
  • the purification of BSPl was carried out under native conditions. The cells were disrupted using a French press.
  • the lysis buffer used contained 50 mmol / 1 MOPS (pH 8), 300 mmol / 1 NaCl, 10 mmol / 1 imidazole and 5 mmol / 1 MgCl 2 .
  • N-terminal Histidine-mediated binding to a nickel-NTA matrix was carried out in several washing steps with increasing imidazole concentration (20-75 mmol / 1) under otherwise the same buffer conditions.
  • the elution was carried out analogously using 100-250 mmol / 1 imidazole.
  • reaction buffer standard: 50 mmol / 1 Tris (pH 8.5), 1 mmol / 1 pyrophosphate, 2.5 mmol / 1 MgCl 2
  • staining solution 3.4 mmol / 1 ammonium molybdate in 0.5 mol / 1 sulfuric acid, 0.5 mol / 1 SDS, 0.6 mol / 1 ascorbic acid: 6: 2: 1, v / v / v
  • the absorption was measured at 820 nm (Rojas-Belträn et al. 39 (1999), 449-461).
  • the 1041 bp full length cDNA (SEQ ID NO. 1) of the soluble pyrophosphatase (bspl) by PCR was amplified.
  • the ends of the primers were with KpnI (sense Primer) or Xbal- (antisense primer)
  • Antisense primer CTA GTC TAG AAG CCT CCT AAA CCA AAC ATG A (SEQ ID No. 13)
  • the vector obtained is shown in FIG. 10a.
  • Example 5 Cloning of the vacuolar pyrophosphatase (V-PPase) into the transformation vector pBinAR
  • Amplificate (SEQ ID No. 4) then into the vector pCR ⁇ 2.1-T0PO ⁇ (Invitrogen, Groningen, Nieder- land) intermediate cloned.
  • the amplificate obtained contains the region coding for the beta-V-PPase (BVP1) (SEQ ID No. 5).
  • the restriction sites Kpnl and Xbal of the TOPO vector located to the left and right of the insertion site were used to cut out the sequence of the V-PPase and then to ligate into the MCS of the plant transformation vector pBinAR, which was also cut by Kpnl / Xbal.
  • the vector thus obtained is shown in FIG. 10b.
  • Example 6 Preparation of the double construct by cloning the sequences of V-PPase and C-PPase in pBinAR
  • the entire expression cassette of the C-PPase was amplified from the corresponding pBinAR construct by PCR.
  • it contains the CaMV35S promoter (540 bp) and the OCS terminator (196 bp).
  • the sense primer used for the amplification binds at the 5 'end of the CaMV35S promoter and has an Apal interface
  • the antisense primer engages at the 3' end of the OCS terminator and has a Clal interface (underlined):
  • Sense primer AAG TCG GGG CCC GAA TTC CCA TGG AGT CAA AGA T (SEQ ID No. 16)
  • Antisense primer AAG TCG GGG CCC GAA TTC CCA TGG AGT CAA AGA T (SEQ ID No. 16)
  • Antisense primer AAG TCG GGG CCC GAA TTC CCA TGG AGT CAA AGA T (SEQ ID No. 16)
  • the amplificate obtained using these primers was digested with Apal and Clal and then ligated into the V-PPase / pBinAR construct, which was also digested with Apal and Clal. These two interfaces are located here between the OCS terminator and the right border region of the T-DNA. Due to the position of the Apal and Clal interfaces, the two expression cassettes are in the opposite orientation in the pBinAR double construct. The double vector is shown in FIG. 10c.
  • the promoter sequence (SEQ ID No. 6) of the V-PPase isoform I (BSPl) was isolated using a genomic DNA bank, which was generated using the Lambda-ZAP-Xhol partial fill-in vector kit (Stratagene, Ams- terdam, The Netherlands) (Lehr et al., Plant Mol. Biol., 39 (1999), 463-475).
  • the promoter sequence (SEQ ID No. 7) of isoform II (BSP2) was determined by means of "inverse ⁇ -PCR. Genomic DNA was isolated from sugar beet leaves by the method of Murray and Thompson (Nucl. Acids Res. 8 (1980), 4321-4325). After digestion with the Tagl restriction enzyme, the ends of the cleavage products were ligated so that circular DNA molecules were formed. These served in a "PCR” as a template, the • sense primer originating from the region near the 5 'of the coding region, the antisense primer originating from the 5' UTR: sense primer:
  • the homogenate was filtered through 200 ⁇ m gauze and then centrifuged for 5 min at 4200 xg. The supernatant was centrifuged for 30 min at 300,000 xg in a Beckman 50.2 Ti rotor to obtain the microsomal fraction.
  • the pellets obtained were resuspended in 50 ml of homogenization medium. 25 ml each were underlaid with 8 ml of gradient medium (5 mmol / 1 HEPES (pH 7.5), 2 mmol / 1 DTT and 25% (w / w) sucrose) and centrifuged at 100,000 xg for 90 min.
  • 1 ml of interphase which represents the tonoplast fraction, was removed from both gradients with a pateur pipette and with dilution medium
  • V-PPase proton pump activity was determined according to Palmgren (Plant Physiol., 94 (1990), 882-886). 50 ⁇ g of tonoplast protein was used. Results :
  • FIGS 3a and 3b show the H + pumping activity in beets stored for three months:
  • the specific activity of the V-ATPase is about twice as high as that of the V-PPase.
  • Vigna radiata a polyclonal antiserum from rabbit directed against the V-PPase of the mung bean (Vigna radiata) was used (Maeshima and Yoshida, J. Biol. Chem., 264 (1989), 20068- 20073).
  • V-ATPase vacuolar adenosine triphosphatase
  • each 5 ug protein enriched tonoplast fraction were in a native '12% polyacrylamide gel separated e- lektrophoretisch.
  • C-PPase 0.5 g leaf and beet material was ground in liquid nitrogen and the homogenate was taken up directly in 1 ml reducing 2x application buffer (RotinLoadl, Roth, Düsseldorf). 5 ⁇ l crude extract (corresponding to 2.5 mg fresh weight equivalents) was separated in a 15% polyacrylamide gel.
  • FIG. 4 shows the results of a Western blot analysis for BSPL:
  • BSPl is present in both the beet and the leaf.
  • FIG. 5 shows the results of a Western blot analysis for the V-PPase: • The V-PPase can be detected in the beet of Beta vulgaris.
  • Example 10 RNA extraction and Northern blot analysis
  • Beta vulgaris suspension culture cells were grown in "Ga borg B 5 " medium with 2% sucrose, with the addition of the following phytohormones: 0.2 mg / 1 kinetin, 0.5 mg / 1 naphthylacetic acid (NAA), 0.5 mg / 1 Indole-3-acetic acid (IAA) and 2 mg / 1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D).
  • 6-day-old cells were first transferred to fresh medium and, after two more days, transferred to 0.9% agar plates, where they were left for 3 days.
  • the plates contained Gamborg B 5 medium with 2% sucrose, but additionally 125 mmol / 1 mannitol and 125 mmol / 1 sorbitol.
  • the cells were grown in places without mannitol and sorbitol, without phytohormones, without sucrose, without phosphate or with 100 mmol / 1 KCl or NaCl.
  • beta vulgaris seeds diploid hybrids, KWS, Einbeck
  • the dishes were covered with a plastic hood and then kept in the dark at 23 ° C (control plants germinated under light with a light / dark rhythm of 12/12 h).
  • the plants germinated in the dark were exposed to the light and their hypocotyl divided into tips (upper 0.5 cm) and base and their cotyledons at the times 0, 3, 6, 9 and 12 h after the start of the exposure harvested.
  • some of the plants were left in the dark for a further 24 h before appropriate control samples were taken.
  • V-PPase V-PPase
  • RNA was determined using the method of Logemann et al. (Analyt. Biochem., 163 (1987), 16-20). Each with 15 ug of RNA per lane was separated in a ica l, 4% Aga rosegel e- lektrophoret with a formaldehyde content of 2% '. The RNA was then transferred by capillary transfer to a nylon membrane (Duralon, Stratagene, Amsterdam) and fixed thereon by UV (Crosslinker, Stratagene, Amsterdam). The detection was carried out with Biotin-labeled probes according to Löw and Rausch
  • FIG. 6 shows a Northern blot analysis of V-PPase and V-ATPase transcripts in different tissues of 6-day-old, etiolated sugar beet seedlings which, following dark growth, had a different exposure time (0, 3, 6, 9 and 12 h, respectively) ) had been suspended.
  • some dark germs were left in the dark for a further 24 h, i.e. a total of 7 days, in order to compare their transcript quantities (lane 9 or 15) with those of the 6-day-old, seeded seedlings without light contact (lane 4 or 10) can.
  • a further control was 6-day-old light germs, which had grown under a 12/12 h light / dark rhythm at 160 ⁇ mol photons per m 2 / s (lanes 3 and 16). 15 ⁇ g of RNA were applied in each case.
  • FIG. 6 shows the results of a Northern blot analysis for the expression of V-PPase and V-ATPase in beta seedlings.
  • V-PPase is in tissues with a high division rate (hypocotyl tip) or synthesis performance (cotyledons) strongly expressed, while the expression in differentiated tissues (hypocotyl base) is low.
  • V-ATPase The subunits of V-ATPase are ' expressed less strongly in the cotyledons than in the hypocotyl base, regardless of the degree of exposure. In the divisionally active area of the hypocotyl peaks, expression is high in etiolated seedlings, but increases already a few hours after exposure. from.
  • FIGS. 7a and 7b show the results of a Northern blot analysis of the effects of various stress treatments on the transcript levels of vacuolar pyrophosphatase (isoform I and II) in suspension culture cells from Beta vulgaris L.
  • FIG. 8 shows the results of a Northern blot analysis, from which a contradicting expression pattern of V-ATPase and V-PPase genes in beta beets emerges after being wounded.
  • Example 11 Expression of V-PPase and C-PPase in Arabidopsis thaliana
  • the vacuolar pyrophosphatase (V-PPase) from Beta vulgaris or the simultaneous overexpression of both pyrophosphatases on the growth, in particular the rosette growth, of Arabidopsis thaliana, j transgenic Arabidopsis plants are provided in each case with the abovementioned methods according to the invention.
  • the pBinAR vectors used for this purpose contained the CaMV35S promoter in addition to the full-length cDNA of the respective pyrophosphatase.
  • the overexpression of the pyrophosphatases in the transgenic Arabidopsis plants leads to a significant increase in the ' total shoot dry weight (rosette) of these plants compared to the wild Arajidopsis type.
  • the simultaneous overexpression of both cytosolic and vacuolar pyrophosphatase in Arabidopsis thaliana shows a particularly strong effect on the total shoot dry weight; an increase of about 26% was achieved.
  • the transgenic plant obtainable according to the invention has increased growth as a result of increased meristema activity.
  • transgenic beta vulgaris beets were provided in each case using the abovementioned methods according to the invention in addition to the full-length cDNA of the respective pyrophosphatase, also the CaMV35S promoter.
  • the overexpression of the respective pyrophosphatases took place under the control of this CaMV35S promoter.
  • the influence on the fresh beet weight of Beta vulgaris compared to Beta vulgaris wild type 6 B 2840 was examined (Table 4).
  • transgenic beet plants obtainable according to the invention have an increased sucrose content and an increased growth as a result of increased meristem activity.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Herstellung einer verbesserten Zuckerrübe, insbesondere einer Zuckerrübe, die einen gesteigerten Saccharosegehalt, eine verringerte Ab baurate von Saccharose während der Lagerung sowie ein verbessertes Wachstum aufweist. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung mindestens zweier Gen konstrukte zur Generierung einer solchen Pflanze sowie dabei eingesetzte Nucleotidsequenzen.

Description

Veränderte PPase-Expression in Zuckerrübe
B e s ehr e ibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Herstellung einer verbesserten Zuckerrübe, insbesondere einer Zuckerrübe, die einen gesteigerten Saccharosegehalt in ihrem Speicherorgan, einen verringerten Saccharoseabbau während der Lagerung und ein gesteigertes Wachstum der Rübe auf- weist. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung mindestens zweier Genkonstrukte zur Generierung einer solchen Pflanze sowie dabei eingesetzte Nucleotidsequenzen.
Während der Lagerung von Zuckerrüben (Beta v lga- ris) , das heißt während des Zeitraums zwischen Ernte und weiterer Verarbeitung, insbesondere der Zuckerextraktion, kommt es zu erheblichen Saccharoseverlusten durch Saccharoseabbau in den Speicheror- ..ganen. Dieser Saccharoseabbau findet auch nach Ab- schluss des Rübenwachstums zur Aufrechterhaltung eines „maintenance -Metabolismus im Rübenkörper statt. Während der Lagerung der Rüben wird hauptsächlich die im Rübenkörper akkumulierte Saccharose abgebaut. Der Saccharoseabbau ist zum einen von verschiedenen Umweltfaktoren aber auch vom Ernte- prozess selbst abhängig. Er ist auch an eine Qualitätsminderung der Zuckerrüben gekoppelt, da dadurch der Anteil reduzierender Zucker wie Fructose oder Glucose im Rübenkörper zunimmt (Burba, M. , Zei t- schrift für die Zucker industrie 26 (1976) , 647- 658) .
Im Verwundungsbereich zum Beispiel geköpfter geernteter Rüben ist der Saccharoseabbau in erster Linie durch die enzymatische Hydrolyse durch eine wundinduzierte Invertase vermittelt, die primär in den Vakuolen der Rübenzellen lokalisiert ist. Vakuoläre und/oder zellwandgebundene Invertase-Isoformen werden auch bei de novo-Verwundungen von Rübegewebe induziert (Rosenkranz, H. et a.1. , ". Exp. Bod. 52 (2001) , 2381-2385) . Diesem Vorgang kann durch Expression eines Invertaseinhibitors (WO 98/04722) oder durch die Expression eines antisense- beziehungsweise eines dsRNA-Konstruktes für die vakuolä- re Invertase (WO 02/50109) begegnet werden. Dadurch wird der Saccharoseabbau im Rübenkörper jedoch nur teilweise verhindert. Dies hauptsächlich deshalb, da im restlichen Rübenkörper, also außerhalb des Verwundungsbereichs, überwiegend infolge der dort herrschenden anaeroben Bedingungen der Abbau der Saccharose über revers agierende Saccharosesyntha- se, UGPase und PFP in einem signifikantem Umfang stattfindet. Für die Enzymaktivität . der UGPase (U- ridin-diphosphoglucose-Pyrophosphorylase) und der PFP (Pyrophosphat :Fructose-6-phosphat-Phosphotrans- ferase) in diesem Abbauweg ist cytosolisches anorganisches Pyrophosphat (PPi) erforderlich (Stitt, M., Bot. Acta 111 (1998), 167-175).
Es ist bekannt, dass neben ATP-abhängigen Stoff- Wechselprozessen in der Pflanzenzelle, hauptsäch- lieh unter anaeroben Bedingungen, dissimilierende Enzymreaktionen stattfinden, die von cytosolischem Pyrophosphat als Energielieferant abhängig sind. Demgemäß existieren in der Pflanzenzelle im wesent- liehen zwei verschiedene Abbauwege zum Abbau von Saccharose (Stitt, M. , a.a.O.):
1) Hydrolyse der Saccharose in Fructose und Glu- cose durch Invertase, wobei die durch Hexokinase und Fructokinase in Gegenwart von ATP phosphorylierte Hexose durch die Phosphofruc- tokinase (PFK) ebenfalls unter ATP-Verbrauch in Fructose-1, 6-bis-phosphat umgewandelt wird.
2) Der Abbau von Saccharose durch Saccharose- synthase in UDP-Glucose und in Fructose mit anschließender Konversion der UDP-Glucose zu Hexosephosphat durch UGPase in Gegenwart von Pyrophosphat und Umwandlung des Hexo- sephosphats in Fructose-1, 6-Bisphosphat durch PFP ebenfalls in Gegenwart von Pyrophosphat.
Der zweite und PPi-abhängige Abbauweg wird unter anaeroben Bedingungen, die bei der Lagerung der Rübenkörper auftreten, in der Pflanzenzelle sogar bevorzugt durchlaufen, da dadurch ATP-Reserven, die bei dem ersten Abbauweg der Saccharose verbraucht werden würden, erhalten werden. Da bisher bekannte Maßnahmen zur Reduzierung des Saccharoseverlustes hauptsächlich die Hemmung des ersten Abbauwegs (zum Beispiel Invertase-Inhibition) betreffen, welcher - außer in Verwundungsbereichen - für den Saccharoseverlust bei gelagerten Rüben wenig relevant ist, gibt es zur Zeit keine befriedigende Lösung für das Problem lagerungsbedingter Saccharoseverluste . An- dere bekannte Maßnahmen bestehen in der allgemeinen Reduktion enzymatischer Aktivität durch Lagerung bei niederen Temperaturen, beispielsweise unter 12°C, bei gleichzeitig hoher Luftfeuchtigkeit.
Darüber hinaus besteht der Wunsch, Pflanzen, insbe- sondere Rübenpflanzen, bereitzustellen, die bereits einen gesteigerten Saccharosegehalt in ihren Speicherorganen aufweisen bzw. Rübenpflanzen, die durch verstärktes Wachstum in Folge längerer Meristemaktivität auch einen größeren Rübenkörper bilden und damit mehr Saccharose speichern.
Meristematische Gewebe zeigen einen intensiven Pyrophosphat-Stoffwechsel . Zentrale Syntheseleistungen in den Meristemen wie Zellwandsynthese, Proteinsynthese und Nukleinsäuresynthese bilden Py- rophosphat als Reaktionsprodukt, so dass dessen Spaltung die betroffenen enzymatischen Reaktionen fördert. Aus diesem Grund stellt die Kontrolle des Pyrophosphat-Pools in Cytoplasma und Kern durch Pyrophosphat-spaltende bzw. -verbrauchende enzymati- sehe Reaktionen einen wichtigen Mechanismus zur Beeinflussung der meristematischen Aktivität dar. Neben Enzymreaktionen, die Pyrophosphat als Co- Substrat verwenden (PFP, UGPase, s.o.) sind hierbei vakuoläre H+-Pyrophosphatasen und lösliche Py- rophosphatasen beteiligt . Somit liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein System bereitzustellen, das im Wesentlichen Saccharoseverluste in Pflanzen, insbesondere Rübenpflanzen, weiter vermindert, und auch zu Pflanzen führt, die einen gesteigerten Saccharose- gehalt und/oder einen vergrößerten Rübenkörper aufweisen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer transgenen Pflanze, insbesondere Rübenpflanze, bevorzugt Zuckerrübe (Beta vulgaris) , mit gesteigertem Saccharosegehalt und bevorzugt vermindertem Saccharoseabbau während der Lagerung gemäß Anspruch 1 gelöst. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß auch ge- löst durch die Bereitstellung einer durch dieses Verfahren erhältlichen transgenen Pflanze mit einem gesteigerten Saccharosegehalt und insbesondere einem vermindertem Saccharoseabbau während der Lagerung. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß auch gelöst durch die Bereitstellung mindestens eines Nuclein- säuremoleküls, codierend für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer löslichen Pyrophosphatase aus Beta vulgaris, insbesondere einer cytoso- lischen Pyrophosphatase (C-PPase) , bevorzugt der- selben Pyrophosphatase, die durch Einfügen mindestens einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) in ihrer Kompartimentierung geändert ist, sowie durch die Bereitstellung mindestens eines Nucleinsäure ole- küls, das einen Promotor einer vakuolären Py- rophosphatase (V-PPase) aus Beta vulgaris codiert. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer transgenen Rübenpflanze mit gesteigertem Saccharosegehalt umfasst
a) das Transformieren mindestens einer Rübenzel- le mit mindestens zwei Transgenen, wobei das erste Transgen für eine vakuoläre Pyrophosphatase (V-PPase) insbesondere aus Beta vulgaris und das zweite Transgen für eine cy- tosolische oder kernlokalisierte lösliche Py- rophosphatase (C-PPase) insbesondere aus Beta vulgaris codiert, und daran anschließend
b) das Kultivieren und Regenerieren der so transformierten mindestens einen Rübenzelle unter Bedingungen, die zur -teilweisen, be- vorzugt vollständigen- Regeneration einer transgenen Rübenpflanze mit gesteigertem Saccharosegehalt führen, wobei anschließend
c) eine transgene regenerierte Rübenpflanze mit gesteigertem Saccharosegehalt in der Rübe er- halten wird, die einen gesteigerten Saccharosegehalt in der Rübe, bevorzugt einen verminderten Saccharoseabbau während der Lagerung, und/oder bevorzugt einen durch gesteigerte Meristemaktivität vergrößerten Rübenkörper aufweist .
Die Erfinder fanden überraschend, dass durch gleichzeitige Expression eines als erstes Transgen bereitgestellten Nucleinsäuremoleküls, das eine V- PPase insbesondere aus Beta vulgaris codiert, vorzugsweise eine V-PPase-cDNA, und eines als zweites Transgen bereitgestellten Nucleinsäuremoleküls, das eine C-PPase insbesondere aus Beta vulgaris co- diert, vorzugsweise eine C-PPase-cDNA, in der transgenen Zelle einer Rübenpflanze der Saccharo- seflux aus der Vakuole gedrosselt, der Transport von Saccharose in die Vakuole hinein gesteigert und der cytosolische Abbau der Saccharose auf dem PPi- abhängigen Weg minimiert wird. Die verminderte Verfügbarkeit vakuolärer Saccharose im Cytosol ist dabei primär auf die verstärkte Aktivität des ΔpH- abhängigen Saccharosetransports von Saccharose über die Tonoplastenmembran in die Vakuole zurückzufüh- ren. Der für den Saccharosetransport erforderliche pH-Gradient ist in hohem Maße von der Aktivität der membranständigen V-PPase abhängig. Diese zeigt noch bei geringer Konzentration des Substrats Pyrophosphat hohe Aktivität (KM < 10 μmol/1) , während die Affinität löslicher PPasen deutlich niedriger ist (KM > 100 μmol/1) . Überraschenderweise kann
:durch das erfindungsgemäße Verfahren eine transgene
Pflanzenzelle, insbesondere eine transgene Pflanze, mit gesteigerter Saccharoseakkumulation erhalten werden.
Durch die erfindungsgemäß vermittelte Expression, insbesondere die Überexpression, transgener cytoso- lischer bzw. Kern-lokalisierter und/oder transgener vakuolärer Pyrophosphatase wird der Pyrophosphatge- halt in der Pflanzenzelle reduziert. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist dabei die erfindungsge- maß vermittelte Expression, insbesondere Überexpression, transgener cytosolischer bzw. Kernlokalisierter zusammen, bevorzugt gleichzeitig, mit der erfindungsgemäß vermittelten Expression, , insbe- sondere Überexpression, transgener vakuolärer Pyrophosphatase. Dadurch wird einerseits der Pyrophosphat-abhängige Saccharoseabbau entscheidend vermindert, andererseits fördert der gesteigerte Pyrophosphatabbau im Cytosol und Zellkern auch ver- schiedene Syntheseleistungen in den Meristemen der Pflanze, was wiederum wachstumssteigernd wirkt, so dass vergrößerte Rübenkörper . erhalten werden. In vorteilhafter Weise wird der Saccharosegehalt in der Vakuole^ durch die gesteigerte Aktivität der V-PPase erhöht, der Saccharoseabbau im Cytosol signifikant vermindert und die Aktivität der Meristeme, insbesondere lokalisiert an der Peripherie des wachsenden Rübenkörpers, erhöht .
Eine so erhältliche transgene Pflanze weist ein ge- steigertes Wachstum sowie insbesondere einen gesteigerten Saccharosegehalt, insbesondere bereits zum Zeitpunkt der Ernte, auf. Der lagerungsbedingte Abbau von Saccharose in der Pflanze ist vermindert und die so erhältliche transgene Pflanze ist lage- rungsbeständiger.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „gesteigerten Saccharosegehalt" ein Gehalt an Saccharose hauptsächlich im Speichergewebe von Pflanzen, insbesondere Rüben, verstanden, der normalerweise um mindestens 5%, insbesondere min- destens 10%, bevorzugt mindestens 20%, besonders bevorzugt mindestens 30% über dem durchschnittlichen Saccharosegehalt in entsprechenden Geweben vergleichbarer bekannter Rüben liegt. Der ..'durch- schnittliche Saccharosegehalt in der Speicherwurzel der Zuckerrübe (Beta vulgaris) lag in den letzten 20 Jahren in Deutschland bei 17,14 ± 0,56 Gewichts- % (siehe z.B. Zuckerindustrie 126 (2001) 2: S. 162) . ' Bevorzugt beträgt der durchschnittliche Sac- charosegehalt im Speichergewebe der erfindungsgemäß erhältlichen Rüben mehr als 18 Gewichts-%, insbesondere mehr als 21 Gewichts-%.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „gesteigerten" oder „erhöhten Meriste- maktivität" beziehungsweise einem- „verbesserten Meristemwachstum" eine Steigerung des Wachstums der Rübe (bezogen auf das Frischgewicht) normalerweise um mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 19% gegenüber dem durch- schnittlichen Wachstum vergleichbarer bekannter Rüben verstanden.
Im Zusammenhang, mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Transgen" ein Gen verstanden, das in Form von DNA oder RNA, vorzugsweise cDNA, in eine Eukaryontenzelle transfiziert, das heißt transformiert, werden kann, wodurch insbesondere fremde genetische Information in die transfizierte Eukaryontenzelle eingebracht wird. Dabei wird unter einem „Gen" mindestens eine unter der operativen Kontrol- le mindestens eines regulatorischen Elementes ste- hende insbesondere Protein-codierende Nucleotidse- quenz, das heißt ein oder mehrere informationstragende Abschnitte von DNA-Molekülen, verstanden. Transgene liegen nach erfolgter Transfektion der Eukaryontenzelle als Nueleinsäuremolekül (e) tran- sient oder aber in das Genom der transfizierten Zelle integriert vor, wobei diese natürlicherweise in dieser Zelle nicht vorkommen, oder sie liegen an einem Ort im Genom dieser Zelle integriert vor, an dem sie natürlicherweise nicht vorkommen, das heißt Transgene sind in einer anderen genomischen Umgebung lokalisiert oder liegen in einer anderen als der natürlichen Kopienzahl vor oder stehen unter Kontrolle eines anderen Promotors.
Erfindungsgemäß bevorzugt umfasst das erste Trans- gen, welches für eine V-PPase insbesondere aus Beta vulgaris codiert, mindestens ein Nueleinsäuremolekül, wobei die Sequenz dieses Nucleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in Sequenz ID Nr. 4, der komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz dargestellt in Sequenz ID Nr. 5 codiert sowie deren komplementäre Nucleotidse- quenz und
c) einer modifizierten Nucleotidsequenz, wobei ein modifiziertes Nueleinsäuremolekül der modifizierten Nucleotidsequenz mit dem Nuclein- säuremolekül mit der Nucleotidsequenz nach a) oder b) hybridisiert und dabei eine Sequenz- identität von mehr als 80%, bevorzugt mehr als 90%, 95% oder 99%, aufweist.
Erfindungsgemäß bevorzugt umfasst das zweite Transgen, welches für eine C-PPase insbesondere aus Beta vulgaris codiert, mindestens ein Nueleinsäuremolekül, wobei die Sequenz dieses Nucleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in Sequenz ID Nr. 1, der komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz, dargestellt in Sequenz ID Nr. 2 codiert, sowie deren komplementäre Nucleotid- sequenz und
c) einer modifizierten Nucleotidsequenz, wobei ein modifiziertes Nueleinsäuremolekül der modifizierten Nucleotidsequenz mit dem Nuclein-
. säuremolekül mit der Nucleotidsequenz nach a) oder b) hybridisiert und dabei eine Sequenzidentität von mehr als 80%, bevorzugt mehr als 90%, 95% oder 99%, aufweist.
In einer bevorzugten Variante umfasst die Nucleotidsequenz des vorgenannten erfindungsgemäß bevor- zugten C-PPase-Nucleinsäuremoleküls außerdem mindestens eine Kernlokalisierungssequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das mindestens eine erste Transgen auf einem Vektor angeordnet . Erfindungsgemäß bevorzugt kann auch das mindestens eine zweite Transgen auf einem Vektor angeordnet sein. Besonders bevorzugt sind sowohl erstes als auch zweites Transgen auf einem Vektor, insbesondere dem gleichen Vektor angeordnet. Der Vektor liegt in bevorzugter Ausführung in isolierter und gereinigter Form vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind • das mindestens eine erste Transgen, codierend für eine V-PPase, und das mindestens eine zweite Transgen, codierend für eine C-PPase, auf einem einzigen Vektor zusammen angeordnet, wobei insbesondere das erste Transgen in 5'- zu 3 '-Richtung vor dem zweiten Transgen angeordnet ist. In einer alternativen Variante ist das zweite Transgen in 5'- zu 3 '-Richtung vor dem ers- ten Transgen auf dem Vektor angeordnet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist mindestens ein erstes Transgen auf mindestens einem ersten Vektor und mindestens ein zweites Transgen auf mindestens einem vom dem ersten Vektor verschiedenen zweiten Vektor angeordnet .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden erstes und zweites Transgen gleichzeitig in mindestens eine Pflanzenzelle, insbesondere Rübenzelle transfiziert, das heißt transformiert. Bevor- zugt wird die Transformation durch ballistische In- jektion, das heißt durch biolistische Transformation, in an sich bekannter Weise durchgeführt. In einer weiteren Variante findet die Transformation durch Elektrotransformation, bevorzugt mittels E- lektroporation, in an sich bekannter Weise statt. In einer weiteren Variante wird die Transformation durch Agrobakterien, bevorzugt mittels insbesondere Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizo- genes, als Transformationsmittel in an sich bekann- ter Weise durchgeführt. In einer weiteren Variante wird die Transformation mittels Viren in an sich bekannter Weise durchgeführt .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Vektoren" insbesondere Liposomen,. Cosmi- de, Viren, Baeteriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik übliche Vektoren verstanden. Bevorzugt werden darunter Plasmide verstanden. In einer besonders bevorzugten Variante ist dies der pBinAR-Vektor (Höfgen und Willmitzer, 1990) . Diese Vektoren besitzen bevorzugt noch mindestens eine weitere Funktionseinheit, die insbesondere eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors im Wirtsorganismus..bewirkt oder dazu beiträgt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Vektoren eingesetzt, bei denen mindestens ein erfindungsgemäßes Nueleinsäuremolekül unter der funktioneilen Kontrolle von mindestens einem regulatorischen Element steht. Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff "regulatorisches Element" solche Elemente verstan- den, welche die Transkription und/oder Translation von Nucleinsäuremolekülen in prokaryontisehen und/oder eukaryontisehen Wirtszellen gewährleisten, so dass ein Polypeptid oder Protein exprimiert wird. Bei regulatorischen Elementen kann es sich um Promotoren, Enhancer, Silencer und/oder Transkrip- tionsterminationssignale handeln. Regulatorische Elemente, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz, insbesondere den Protein-codierenden Abschnitten dieser Nucleotidsequenz, funktionell verbunden sind, können Nucleotidsequenzen sein, die aus anderen Organismen oder anderen Genen stammen als die Protein-codierende Nucleotidsequenz selbst. In einer bevorzugten Variante besitzt der erfin- dungsgemäß bevorzugt eingesetzte Vektor mindestens ein weiteres Regulationselement, insbesondere mindestens einen Intrans-Enhancer.
Bevorzugt sind die eingesetzten Vektoren zur Überexpression des ersten oder zweiten Transgens oder beider Transgene ausgestattet . Dies wird insbesondere dadurch erreicht, dass das mindestens eine erste und/oder das mindestens eine zweite Transgen auf dem Vektor operativ verknüpft zu mindestens einem Promotor vorliegen. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist der Promotor ein gewebespezifischer Promotor, ein konstitutiv exprimierender (=konstitutiver) Promotor oder ein induzierbarer Promotor. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Promotor auch ein lagerungsspezifischer Promotor. In ei- ner besonders bevorzugten Variante besitzt der Pro- motor auf dem vorgenannten Vektor eine Kombination der Eigenschaften der vorgenannten Promotoren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine Promotor ein Promotor aus einer Rübenpflanze, insbesondere aus Beta vulgaris . Bevorzugt ist dies ein Promotor der vakuolären Pyrophosphatase (V-PPase-Promotor) . In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der mindestens eine Promotor ein Promotor aus Arabidopsis thaliana oder ein Promotor aus dem Blumenkohlmosaik-Virus (CaMV) , insbesondere der CaMV35S-Promotor. In einer weiteren bevorzugten Variante ist der mindestens eine Promotor ein Saccharosesynthase- Promotor .
Die erfindungsgemäß bevorzugte Überexpression der vakuolären Pyrophosphatase, bevorzugt unter der Kontrolle mindestens eines CaMV35S-Promotors, führt zu einer deutlich verbesserten Energetisierung der Vakuole, das heißt zu einem erhöhten pH-Gradienten, was hauptsächlich zur verstärkten Akkumulation von Speicherstoffen, insbesondere von Saccharose in der Vakuole führt; .hauptsächlich deshalb, da durch die durch die erfindungsgemäß bevorzugte Überexpression bedingte Ansäuerung der Vakuole der aktive Saccha- rosetransport in das Lumen der Vakuole gesteigert wird.
Darüber hinaus wird durch die erfindungsgemäß bevorzugte Überexpression der C-PPase insbesondere erreicht, dass der Abbau an cytosolischem bezie- hungsweise nuklearem Pyrophosphat (PP±) im Vergleich zu einer nicht transformierten Rübenzelle erheblich gesteigert wird. Ein auf diese Weise wesentlich verminderter Anteil an cytosolischem be- ziehungsweise nuklearem Pyrophosphat führt zu einem verminderten PPj.-abhängigen Saccharoseabbau beziehungsweise durch Aktivierung verschiedener Syntheseleistungen (s.o.) zu einer gesteigerten Meristemaktivität. Zusammen mit der durch die Überexpres- sion der V-PPase gesteigerten Akkumulation von Speicherstoffen, insbesondere von Saccharose in der Vakuole kommt es bevorzugt bereits vor der Ernte, das heißt beim Heranwachsen der Pflanze, in der er-, findungsgemäß erhältlichen transgenen Rübe zu einem gesteigerten Saccharosegehalt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nueleinsäuremolekül, das ein Protein mit der biologischen Aktivität einer löslichen Pyrophosphatase insbesondere aus Beta vulgaris, ins- besondere einer cytosolisehen Pyrophosphatase (C- _PPase) - bevorzugt nach dem an sich bekannten universellen genetischen Standardcode - codiert, wobei die Sequenz dieses Nucleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in Sequenz ID Nr. 1, der komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz, welche in Sequenz ID Nr. 2 darge- stellt ist, codiert sowie deren komplementäre Nucleotidsequenz und
c) einer modifizierten Nucleotidsequenz, wobei ein modifiziertes Nueleinsäuremolekül der mo- difizierten Nucleotidsequenz mit dem Nueleinsäuremolekül mit der Nucleotidsequenz nach a) oder b) hybridisiert und dabei eine Sequenzidentität von mehr als 80%, bevorzugt mehr als 90%, 95% oder 99%, aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nueleinsäuremolekül, das ein Protein mit der biologischen Aktivität einer vakuolären Pyrophosphatase insbesondere aus Beta vulgaris - bevorzugt nach dem an sich bekannten universellen genetischen Standardcode - codiert, wobei die Sequenz dieses Nucleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt Sequenz ID Nr. 4, der komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz, welche in Sequenz ID Nr. 5 dargestellt ist, codiert sowie deren komplementäre Nucleotidsequenz und
c) einer modifizierten Nucleotidsequenz, wobei ein modifiziertes Nueleinsäuremolekül der modifizierten Nucleotidsequenz mit dem Nueleinsäuremolekül mit der Nucleotidsequenz nach a) oder b) hybridisiert und dabei eine Sequenz- identität von mehr als 80%, bevorzugt mehr als 90%, 95% oder 99%, aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nueleinsäuremolekül, das für einen Promotor der vakuolären Pyrophosphatase (V-PPase) insbesondere aus Beta vulgaris - bevorzugt nach dem an sich bekannten universellen genetischen Standardcode - codiert, wobei die Sequenz des Nucleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in Sequenz ID Nr. 6, der komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz dargestellt in Sequenz ID Nr. 7, der komplementären Sequenz davon und
c) einer modifizierten Nucleotidsequenz, wobei ein modifiziertes Nueleinsäuremolekül der modifizierten Nucleotidsequenz mit dem Nueleinsäuremolekül nach a) oder b) hybridisiert und dabei eine Sequenzidentität von mehr als 80%, 90%, 95% oder 99% auf eist.
Das Nueleinsäuremolekül ist dabei bevorzugt ein DNA-Molekül,' zum Beispiel cDNA oder genomische DNA, oder ein RNA-Molekül, zum Beispiel mRNA. Das Nuc- leinsäuremolekül stammt bevorzugt aus der Zuckerrübe Beta vulgaris . Vorzugsweise liegt das Nuclein- säuremolekül in isolierter und gereinigter Form vor.
Die Erfindung umfasst somit auch modifizierte Nuc- leinsäuremoleküle mit einer modifizierten Nucleo- tidsequenz, die beispielsweise durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder einiger Basen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure- moleküls, insbesondere innerhalb der codierenden Sequenz einer Nucleinsäure, erhältlich sind, das heißt Nucleinsäuremoleküle, die als Mutanten, Derivate oder funktioneile Äquivalente eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls bezeichnet werden können. Solche Manipulationen der Sequenzen werden beispielsweise durchgeführt, um die von einer Nuc- leinsäure codierte Aminosäuresequenz gezielt zu verändern. Zum Beispiel codieren die erfindungsgemäß bevorzugten modifizierten Nucleinsäuren veränderte Enzyme, insbesondere veränderte vakuoläre und/oder cytosolische Pyrophosphatäsen und/oder insbesondere mit veränderter enzymatiseher Aktivi- tät und werden insbesondere zur Transformation landwirtschaftlich genutzter Pflanzen verwendet, hauptsächlich um transgene Pflanzen herzustellen.
Solche Modifikationen dienen erfindungsgemäß bevor- zugt auch dem Ziel, innerhalb der Nucleinsäurese- quenz geeignete Restriktionsschnittstellen bereitzustellen oder nicht erforderliche Nucleinsäurese- quenzen oder Restriktionsschnittstellen zu entfernen. Dabei werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäu- remoleküle in Plasmiden insertiert und mittels Standardverfahren der Mikrobiologie beziehungsweise Molekularbiologie in an sich bekannter Weise einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterzogen.
Zur Erzeugung von Insertionen, Deletionen oder Sub- stitutionen, wie Transitionen und Transversionen, sind beispielsweise Verfahren zur in vitro- Mutagenese, "primer repair" -Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren geeignet (vgl. Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) . Sequenzveränderungen lassen sich auch durch Anlagerung natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen erreichen. Beispiele für synthetische Nucleinsäuresequenzen sind Adaptoren oder Linker, die u.a. auch zur Verknüpfung von Nucleinsäure-Fragmenten an diese Fragmente angefügt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch natürlich vorkommende Sequenzvarianten der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsäuremoleküle .
Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Formulierungen analog zu der Formulierung "modifiziertes Nueleinsäuremolekül, das mit einem Nueleinsäuremolekül hybridisiert" bedeuten, dass ein Nueleinsäuremolekül in an sich bekannter Weise unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem anderen, davon verschiedenen Nueleinsäuremolekül hybridisiert. Beispielsweise kann die Hybridisierung mit einer radioaktiven Gensonde in einer Hybridisierungslösung (zum Beispiel: 25% Formamid, 5 x SSPE, 0,1% SDS, 5 x Denhardt-Lösung, 50 mg/ml Heringsperma-DNA, bezüglich Zusammensetzung der Einzelkomponenten) 20 Stunden bei 37°C erfolgen (vgl. Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) . Anschließend wird die unspezifisch gebundene Sonde beispielsweise durch mehrfaches Waschen der Filter in 2 x SSC/0,1% SDS bei 42°C entfernt. Vorzugsweise wird 0,5 x SSC/0,1% SDS, besonders bevorzugt mit 0,1 x SSC/0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Diese erfindungsgemäß bevorzugten hybridisierenden Nucleinsäuremoleküle weisen in bevorzugter Ausführungsform mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, 90%, 95%, 98% und besonders • bevorzugt mindestens 99% Homologie, das heißt Se- queήzidentität auf Nucleinsäureebene zueinander auf .
Der Ausdruck "Homologie" bezeichnet in diesem Zusammenhang den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Nucleinsäuremolekülen, der durch
.die Übereinstimmung zwischen ihren Nucleotidsequen- zen bestimmt wird. Der Prozentsatz der "Homologie" ergibt sich aus dem Prozentsatz übereinstimmender
Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berück- sichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten. Bevorzugt werden dafür die zu vergleichenden Nucleotidsequenzen der Nucleinsäuremoleküle ü- ber ihre gesamte Sequenzlänge verglichen.
Bevorzugte und an sich bekannte Verfahren zur Be- Stimmung der Homologie, die hauptsächlich in Compu- terprogrammen verwirklicht sind, erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen, zum Beispiel das GCG- Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, . J. , et al . , Nucleic Acids Research, 12 (12) (1984), 387; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI) ) ,- BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S., et al . , J. Molec Bio 215 (1990), 403-410). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung der Homologie verwendet werden. Die Auswahl der Programme hängt sowohl von dem durchzuführenden Vergleich als auch davon ab, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren durchgeführt wird, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwi- sehen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt eingesetz- ter Vektor, welcher mindestens eine der Sequenzen der vorgenannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist dieser Vektor ein., viraler Vektor. In einer weiteren Variante ist dieser Vektor bevorzugt ein Plasmid, in einer besonders bevorzugten Variante der pBinAR- Vektor. In einer Variante werden bevorzugt auch die Vektoren erfasst, bei denen das in ihnen enthaltene mindestens eine erfindungsgemäße Nueleinsäuremolekül mit mindestens einem regulatorischen Element operativ verbunden ist, das die Transkription und Synthese translatierbarer Nucleinsäuremoleküle in Pro- und/oder Eukaryontenzellen gewährleistet. Derartige regulatorische Elemente sind bevorzugt Promotoren, Enhancer, Operatoren und/oder Transcripti- onsterminationssignale. Die vorgenannten erfin- dungsgemäßen Vektoren enthalten bevorzugt zusätzlich Antibiotikum-Resistenzgene, Herbizid- Resistenzgene und/oder andere übliche Selektions- marker.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit mindestens einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Vektoren transformiert ist, wobei diese Wirtszelle bevorzugt eine bakterielle Zelle, eine pflanzliche Zelle oder eine tierische Zelle . ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine transgene und vorzugsweise fertile Pflanze, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, wobei mindestens eine der Zellen dieser Pflanze transformiert ist und diese Pflanze bevorzugt durch einen gesteiger- ten Saccharosegehalt und/oder ein gesteigertes Wachstum in Folge vermehrter Meristemaktivität gekennzeichnet sind. Selbstverständlich umfasst die Erfindung auch die aus den erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen erhaltenen Nachkommen und Wei- terzüchtungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß eingesetzten Nueleinsäuremolekül (en) transformiert, das heißt transfiziert wurden, sowie transgene Pflanzenzel- len, die von derartigen transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäß eingesetzte oder erfindungsgemäße Nueleinsäuremolekül (e) , wobei diese (s) vorzugs- weise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, welche die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie min- destens ein erfindungsgemäßes oder erfindungsgemäß eingesetztes Nueleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt, und/oder dadurch, dass ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt, das heißt in einer anderen genomischen Umgebung oder in einer anderen als der natürlichen Kopienzahl vorliegt und/oder unter der Kontrolle mindestens eines anderen Promotors steht .
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die mindestens eine, bevorzugt jedoch eine Vielzahl von Zellen enthalten, welche die erfindungsgemäßen oder die erfindungsgemäß eingesetzten Vektorsysteme, aber auch Derivate oder Teile davon enthalten, und welche aufgrund der Aufnahme dieser Vektorsysteme, Derivate oder Teile davon zu einer Synthese von Polypeptiden (Proteinen) befähigt sind, die eine modifizierte Pyrophosphataseaktivität bewirken. Die Erfindung ermöglicht also die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, welche insbesondere die vorgenannten Charakteristika aufweisen. Bei den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen handelt es sich prinzipiell um monocotyle oder dicotyle Pflanzen wie Graminae, Pinidae, Magnoliidae, Ranun- culidae, Caryophyllidae, Rosidae, Asteridae, Ari- dae, Liliidae, Arecidae, Commelinidae sowie Gym- nospermae aber auch um Algen, Moose, Farne oder auch Calli, Pflanzenzellenkulturen etc., sowie um Teile, Organe, Gewebe, Ernte- oder Vermehrungsmate-' rialien • davon. Bevorzugt handelt es sich aber um Nutzpflanzen, insbesondere um Saccharose synthetisierende und/oder speichernde Pflanzen wie die Zuckerrübe .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist Erntematerial und Vermehrungsmaterial der vorgenannten erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, beispielsweise Blüten, Früchte, Samen, Knollen, Wurzeln, Blätter, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von mindestens einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Herstellung einer solchen vorgenannten transgenen Pflanze mit mindestens einer transformierten Zelle, insbe- sondere in Verbindung mit mindestens einem der vorgenannten Vektoren.
Das Sequenzprotokoll ist Teil dieser Beschreibung und erläutert die vorliegende Erfindung; es enthält die Sequenzen mit SEQ ID Nr. 1 bis 7:
SEQ ID Nr. 1 zeigt die 1041 Nucleotide umfassende
DNA-Sequenz des die lösliche Beta-
Pyrophosphatase codierenden Nuclein- säuremoleküls aus Beta vulgaris (bspl) ;
SEQ ID Nr. 2 zeigt die 222 Aminosäuren umfassende Polypeptidsequenz der löslichen Beta-Pyrophosphatase aus Beta vulgaris (BSP1) ; SEQ ID Nr. 3 zeigt die 245 Aminosäuren umfassende
Polypeptidsequenz einer rekombinan- ten löslichen Beta-Pyrophosphatase in Vektor pQE30 mit N-terminalem His-Tag; SEQ ID Nr. 4 zeigt die 2810 Nucleotide umfassende
DNA-Sequenz des die vakuoläre Beta- Pyrophosphatase codierenden Nuclein- säuremoleküls aus Beta vulgaris der Isoform I (bvpl) ; SEQ ID Nr. 5' zeigt die 764 Aminosäuren umfassende
Polypeptidsequenz der vakuolären Beta-Pyrophosphatase aus Beta vulgaris der Isoform I (BVP1) ; SEQ ID Nr. 6 zeigt die 1733 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des bvpl-Promotors für die vakuoläre Beta-Pyrophosphatase aus Beta vulgaris der Isoform.. I; SEQ ID Nr. 7 zeigt die 962 Nucleotide umfassende
DNA-Sequenz des bvp2 -Promotors für die vakuoläre Beta-Pyrophosphatase aus Beta vulgaris der Isoform II.
SEQ ID Nr. 8 zeigt die 18 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Sense-Primers gemäß
Beispiel 1.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die 22 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Antisense-Primers gemäß Beispiel 1. SEQ ID Nr. 10 zeigt die 38 Nucleotide umfassende
DNA-Sequenz des Sense-Primers gemäß Beispiel 2.
SEQ ID Nr. 11 zeigt die 38 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Antisense-Primers gemäß Beispiel 2.
SEQ ID Nr. 12 zeigt die 31 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Sense-Primers gemäß Beispiel 4.
SEQ ID Nr. 13 zeigt die 31 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Antisense-Primers gemäß Beispiel 4.
SEQ ID Nr. 14 zeigt die 30 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Sense-Primers gemäß Beispiel 5. SEQ ID Nr. 15 zeigt die 31 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Antisense-Primers gemäß Beispiel 5.
SEQ ID Nr. 16 zeigt die 34 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Sense-Primers gemäß
Beispiel 6.
SEQ ID Nr. 17 zeigt die 35 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Antisense-Primers gemäß Beispiel 6. SEQ ID Nr. 18 zeigt die 20 Nucleotide umfassende
DNA-Sequenz eines Sense-Primers gemäß Beispiel 7.
SEQ ID Nr. 19 zeigt die 21 Nucleotide umfassende • DNA-Sequenz eines Antisense-Primers gemäß Beispiel 7.
SEQ ID Nr. 20 zeigt die 24 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz eines Sense-Primers gemäß Beispiel 7.
SEQ ID Nr. 21 zeigt die 20 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz eines Antisense-Primers gemäß Beispiel 7.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Figuren 1 bis 10 und die folgenden Beispiele näher erläutert.
Figur 1 zeigt fluoreszensmikroskopische Aufnahmen transformierter Rübenzellen: Figur la zeigt eine transformierte Beta vulgaris-
Zelle im Durchlicht, Figur lb zeigt die subzelluläre Lokalisation des RFP- Kontrollplasmids in den Piastiden und Figur lc zeigt die subzelluläre Lokalisation mit GFP fusionierter löslicher Pyrophosphatase (BSPl) in den cytoplasmati- sehen und kernnahen Bereichen des Protoplasten;
Figur 2 zeigt biochemische Eigenschaften der löslichen Beta-Pyrophosphatase (BSPl) : Figur 2a zeigt die pH-Abhängigkeit und Figur 2b die Temperatur-Abhängigkeit der Enzymaktivität, Figur 2c zeigt die Ermittlung des Km-Werts für Pyrophosphat (Eadie- Hofstee-Diagramm) ;
Figur 3 zeigt die .Protonen-Pumpaktivität in drei Monate gelagerten Rüben: Figur 3a zeigt die V-PPase-Aktivität , Figur 3b zeigt die V-ATPase-Aktivität ;
Figur 4 zeigt eine Westernblot-Analyse für BSPl in Blatt und Rübe; Figur 5 zeigt eine Westernblot-Analyse der V- PPase in der Zuckerrübe (Beta vulgaris) ;
Figur 6 zeigt die Northernblot-Analyse von V- PPase und V-ATPase in Keimlingen der Zuckerrübe; Figur 7 zeigt die Northernblot-Analyse der V- PPase bei Stressbehandlung von Suspensionskulturzellen der Zuckerrübe; Figur 8 zeigt die Northernblot-Analyse der Expressionsmuster nach Verwundung von Zuckerrüben;
Figur 9 zeigt die Northernblot-Analyse der ent- wicklungsabhängigen Expression des Poly- peptids der V-PPase aus Beta vulgaris der Isoform II (BVP2) ;
Figur 10 zeigt den schematischen Aufbau von rekom- binanten Vektoren: Figur 10a zeigt den gemäß Beispiel 4 erhaltenen Vektor, Figur
10b den gemäß Beispiel 5 erhaltenen Vektor, Figur 10c den gemäß Beispiel 6 erhaltenen Vektor.
Beispiel 1: Isolierung der cDNA-Sequenz einer lös- liehen Pyrophosphatase aus Beta vulgaris L. (BSPl)
Aus Suspensionskulturzellen von Beta vulgaris L. wurde die Gesamt-RNA nach Logemann et al . (Analyt . Biochem., 163 (1987), 16-20) isoliert und mittels reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Auf- grund von Sequenzvergleichen wurden degenerierte Primer hergestellt mit deren Hilfe durch PCR eine 435 bp lange partielle cDNA-Sequenz aus dem codierenden Bereich der löslichen Pyrophosphatase aus Zuckerrübe (bspl) amplifiziert wurde: . Sense-Primer:
TGC TGC TCA TCC WTG GCA (SEQ ID Nr. 8) Antisense-Primer :
TCR TTY TTC TTG TAR TCY TCA A (SEQ ID Nr. 9)
Durch RLM-RACE-Technologie (GeneRacer™ Kit, In- vitrogen, Groningen, Niederlande) wurde anschließend die Sequenz der bspl-Vollängen-cDNA (1041 bp) (SEQ ID Nr. 1) bestimmt, die demnach aus einem 666 bp langen ORF besteht, welcher von einer 118 bp langen 5'-UTR und einer 257 bp langen 3 ' -UTR flankiert wird. Die von dem ORF der bspl-cDNA codierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt und weist 222 Aminosäuren auf.
Die Tabellen 1 und 2 zeigen biochemische Eigenschaften von BSPl und den Einfluss zweiwertiger Kationen auf die Aktivität des BSPl:
Tabelle 1:
*) ermittelt anhand des rekombinanten Proteins, pQE30-Vektor (Qiagen®, Hilden, Deutschland) mit N-terminalem HIS-Tag; die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 3 dargestellt. Für die Amplifikation des codierenden Bereichs von bspl wurden dieselben Primer verwendet, die unter Beispiel 2 beschrieben sind (SEQ ID Nr. 10 und 11) .
Tabelle 2 :
Ergebnisse :
Figur 2a zeigt die Ergebnisse der pH-Wert- Bestimmung (pH 8,5), Figur 2b die Ergebnisse der Temperaturoptimum-Bestimmung (53°C) und Figur 2c die" Ergebnisse der KM-Wert-Bestimmung (160 μmol/1 PPi) . Beispiel 2 : Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von BSPl
Neben der computergestützten Analyse der BSP1- Primärsequenz im Hinblick auf Signalpeptide wurde der codierende Bereich in einen modifizierten pFFi9G-Vektor (Timmermanns et al . , J. Biotech. 14 (1990), 333-344) kloniert, der anstelle des ß- Glucoronidase-Strukturgens die Sequenz des "green fluorescent protein" (GFP) trägt (Sheen, et al . , Plant J. 8(5) (1995), 777-784). Der dafür verwendete Sense-Primer enthält neben einer BamHI- Schnittstelle (unterstrichen) unmittelbar vor dem Start-ATG eine „Kozak"-Sequenz, um eine optimale Translation zu gewährleisten. Der Antisense-Primer enthält sowohl eine PstI- als auch eine Sall - Schnittstelle (unterstrichen) :
Sense-Primer:
GTC GGG ATC CGC CAC CAT GGA TGA GGA GAT GAA TGC TG (SEQ ID Nr. 10) Antisense-Primer:
GAA GCT GCA GGT CGA CTC TCC TCA ATG TCT GTA GGA TG (SEQ ID Nr. 11)
Nachdem sowohl das bspl-Amplifikat als auch der pFFι9G-Vektor mit BamHI und PstI geschnitten worden waren, erfolgte die Ligation und anschließend die biolistische Transformation von Beta vulgaris- Suspensionskulturzellen mit Hilfe einer Partikelkanone (Biolistic PDS-1000/He, BioRad, Hercules, Kalifornien, USA) . Dabei wurde gleichzeitig ein pFF19G-Kontrollplasmid eingebracht, das die Sequenz für ein Fusionsprotein aus einem 81 Aminosäuren langen Peptid der plastidären γ-ECS aus Brassica juncea und dem " red fluorescent protein " aus Discosoma spec. (dsRED) enthielt (Jach et al . , Plant J. 28(4) (2001), 483-491). 24 h nach dem Beschuss wurden die Zellwände mittels lytischer Enzyme verdaut, und nach weiteren 24 h wurde die transiente Expres- sion der beiden Fusionsproteine in den Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch an einem Inverslicht- mikroskop untersucht. Die Analyse des GFP- Fusionsproteins erfolgte mit Hilfe eines FITC- Filters (Anregung: 450-490 nm, Emission: 515 nm Langpass) , im Fall des dsRED-Fusionsproteins wurde ein XF137-2-Filter (Anregung: 540+30 nm, Emission: 585 nm Langpass) verwendet.
Ergebnisse :
Figur 1 zeigt die subzelluläre Lokalisation von BSPl ermittelt durch fluoreszenzmikroskopische GFP- Analyse transformierter Rübenzellen: Aus Figur la wird ersichtlich, dass eine transformierte Beta vulgaris-Zelle nicht von einer untransformierten zu unterscheiden ist . Figur lb betrifft das RFP- Kontrollplasmid. Zu erkennen ist, dass die Plast- iden rot (hell) aufleuchten aufgrund des plastidären Signalpeptids der plastidären γ-ECS. In Figur lc zeigt die Anregung des GFP, dass die mit dem GFP fusionierte lösliche Pyrophosphatase kein plastidä- res Signalpeptid aufweist. Deutlich ist die cy- toplasmatische und Kernlokalisation im Protoplasten zu erkennen. BSPl ist offensichtlich eine cytosoli- sche beziehungsweise kernlokalisierte lösliche Pyrophosphatase. Diese wird auch als C-PPase bezeich- net .
Beispiel 3: Funktionsnachweis durch Überexpression von BSPl in E. coli
Die codierende Sequenz für die C-PPase aus Beta vulgaris (BSPl) wurde mittels PCR amplifiziert . Die dafür verwendeten Primer waren dieselben wie bei der oben beschriebenen Amplifikation für das pFFχ9: :GFP-Konstrukt (Beispiel 2).
Die Klonierung in den Expressionsvektor pQE30 -.(Qia-. gen®, Hilden) erfolgte über BamRl/Sall . Das Kon- strukt wurde zusammen mit einem pUBS520-Plasmid (Brinkmann et al . , Gene 85(1) (1989), 109-114) in E. co!i-DH5α-Zellen transformiert.
Die Produktion von BSPl wurde mittels 1 mmol/1 IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactopyranosid) induziert, nach- dem die Bakterien eine Dichte von OD6oo=l erreicht hatten. Das Wachstum erfolgte über Nacht bei 37° C. Die Aufreinigung von BSPl wurde unter nativen Bedingungen durchgeführt. Der Aufschluss der Zellen erfolgte mittels einer French-Presse. Der dabei verwendete Lysispuffer enthielt 50 mmol/1 MOPS (pH 8) , 300 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Imidazol und 5 mmol/1 MgCl2. Nach der durch die 6 N-terminalen Histidine vermittelten Bindung an eine Nickel-NTA- Matrix erfolgten mehrere Waschschritte mit steigender Imidazol-Konzentration (20-75 mmol/1) unter sonst gleichen Pufferbedingungen. Die Elution er- folgte analog mittels 100-250 mmol/1 Imidazol .
Für den Aktivitätsassay wurde 50 μl Proteinlösung mit 200 μl Reaktionspuffer (Standard: 50 mmol/1 Tris (pH 8,5), 1 mmol/1 Pyrophosphat, 2,5 mmol/1 MgCl2) versetzt und 15 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit 750 μl Färbelösung (3,4 mmol/1 Ammonium- molybdat in 0,5 mol/1 Schwefelsäure, 0,5 mol/1 SDS, 0,6 mol/1 Ascorbinsäure : 6:2:1, v/v/v) gestoppt. Nach 20 min wurde die Absorption bei 820 nm gemessen (Rojas-Belträn et al . 39 (1999), 449-461).
Beispiel 4 : Klonierung der löslichen Pyrophosphatase BSPl (C-PPase) in den Transformationsvektor pBinAR
Anhand der im folgenden genannten Primer und der "oben beschriebenen cDNA aus Suspensionskulturzellen wurde die 1041 bp lange Vollängen-cDNA (SEQ ID Nr. 1) der löslichen Pyrophosphatase (BSPl) mittels PCR amplifiziert . Die Enden der Primer waren mit Kpnl- (Sense-Primer) bzw. Xbal- (Antisense-Primer)
Schnittstellen (unterstrichen) versehen, um das: Am- plifikat anschließend in den oben beschriebenen Pflanzentransformationsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (2) (1990), 221-230) ligieren zu können. Sense-Primer:
CCG GGG TAC CAÄ GGA ATT TGT AGA TCT CCG A (SEQ ID Nr. 12)
Antisense-Primer: CTA GTC TAG AAG CCT CCT AAA CCA AAC ATG A (SEQ ID Nr. 13)
In Figur 10a ist der erhaltene Vektor dargestellt.
Beispiel 5 : Klonierung der vakuolären Pyrophosphatase (V-PPase) in den Transformationvektor pBinAR
Folgende Primer wurden generiert, welche zu Beginn der 5'-UTR (Sense-Primer) und am Ende der 3'-UTR (Antisense-Primer) der Isoform I der V-PPase aus Zuckerrübe binden (Kim et al . , Plant. Physiol. 106 (1994) , 375-382) : Sense-Primer:
ACA CTC TTC CTC TCC CTC TCT TCC AAA CCC (SEQ ID Nr. 14)
Antisense-Primer:
TAG ATC CAA TCT GCA AAA TGA GAT AAA TTC C (SEQ ID Nr. 15)
Mit Hilfe dieser Primer wurde die V-PPase-Sequenz
(bvpl) mittels PCR aus der oben beschriebenen Ge- samt-cDNA heraus amplifiziert und das 2860 bp lange
Amplifikat (SEQ ID Nr. 4) anschließend in den Vek- tor pCRβ2.1-T0POΘ (Invitrogen, Groningen, Nieder- lande) zwischenkloniert . Das erhaltene Amplifikat enthält den die Beta-V-PPase (BVP1) codierenden Bereich (SEQ ID Nr. 5) .
Die links und rechts der Insertionsstelle befindli- chen Restriktionsschnittstellen Kpnl und Xbal des TOPO-Vektors wurden dazu genutzt, die Sequenz der V-PPase auszuschneiden und anschließend in die MCS des ebenfalls Kpnl /Xbal-geschnittenen Pflanzentransformationsvektor pBinAR zu ligieren. In Figur 10b ist der so erhaltene Vektor dargestellt.
Beispiel 6: Herstellung des Doppelkonstrukts durch Klonierung der Sequenzen von V-PPase und C-PPase in pBinAR
Die gesamte Expressionskassette der C-PPase wurde aus dem entsprechenden pBinAR-Konstrukt über PCR amplifiziert . Sie enthält neben der Vollängen-cDNA der C-PPase den CaMV35S-Promotor (540 bp) sowie den OCS-Terminator (196 bp) . Der für die Amplifikation benutzte Sense-Primer bindet am 5 '-Ende des CaMV35S-Promotors und besitzt eine Apal- Schnittstelle, der Antisense-Primer greift am 3'- Ende des OCS-Terminators und verfügt eine Clal- Schnittstelle (unterstrichen) :
Sense-Primer: AAG TCG GGG CCC GAA TTC CCA TGG AGT CAA AGA T (SEQ ID Nr. 16) Antisense-Primer :
GAA GCC ATC GAT AAG CTT GGA CAA TCA GTA AAT TG (SEQ ID Nr. 17)
Das mittels dieser Primer gewonnene Amplifikat wur- de mit Apal und Clal verdaut und anschließend in das ebenfalls Apal und Clal verdaute V-PPase/pBinAR-Konstrukt einligiert . Diese beiden Schnittstellen befinden sich hier zwischen dem OCS- Terminator und der rechten Grenzregion der T-DNA. Aufgrund der Position der Schnittstellen Apal und Clal befinden sich die beiden Expressionskassetten damit in umgekehrter Orientierung im pBinAR- Doppelkonstrukt . In Figur 10c ist der Doppelvektor dargestellt .
Beispiel 7: Klonierung der V-PPase-Promotoren
Die Promotorsequenz (SEQ ID Nr. 6) der V-PPase- Isoform I (BSPl) wurde mittels einer genomischen DNA-Bank isoliert, die mit Hilfe des Lambda-ZAP- Xhol-Partial-Fill-In -Vektorkits (Stratagene, Ams- terdam, Niederlande) hergestellt worden war (Lehr et al . , Plant Mol. Biol . , 39 (1999), 463-475). Als Biotin-Sonde diente eine 569 bp lange Sequenz aus dem codierenden Bereich, die mittels degenerierter Primer hergestellt worden war: Sense-Primer :
GGW GGH ATT GCT GAR ATG GC (SEQ ID Nr. 18) Antisense-Primer:
AGT AYT TCT TDG CRT TVT CCC (SEQ ID Nr. 19)
Die Promotorsequenz (SEQ ID Nr. 7) der Isoform II (BSP2) wurde mittels „ inverse^-PCR ermittelt. Aus Zuekerrübenblättern wurde genomische DNA nach dem Verfahren von Murray und Thompson (Nucl. Acids Res. 8 (1980), 4321-4325) isoliert. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Tagl wurden die Enden der Spalt- produkte ligiert, so dass zirkuläre DNA-Moleküle entstanden. Diese dienten in einer ,PCR als „Template", wobei der • Sense-Primer aus dem 5' -nahen Bereich der codierenden Region, der Antisense-Primer aus der 5 ' -UTR stammte : Sense-Primer:
CCA AAA CGT CGT CGC TAA ATG TGC (SEQ ID Nr. 20)
Antisense-Primer:
ACC GGA ACC CTA ACT TTA CG " (SEQ ID Nr. 21)
Beispiel 8: Aktivität der V-PPase
a) Tonoplasten-Isolation
Tonoplasten aus Zuckerrüben wurden in Anlehnung an Ratajczak et al . (Planta, 195 (1995), 226-236) iso- liert. 45 g Rübenmaterial (4 Monate bei 4° C gelagert) wurden in 160 ml Homogenisierungsmedium (pH 8,0), 450 mmol/1 Mannitol, 200 mmol/1 Tricin, 3 mmol/1 MgS04, 3 mmol/1 EGTA, 0,5% (w/v) Polyvinyl- pyrrolidon (PVP) , 1 mmol/1 DTT) in einem Mixer zerkleinert. Das Homogenat wurde durch 200 μm-Gaze filtriert und anschließend 5 min bei 4200 x g zentrifugiert . Der Überstand wurde zur Gewinnung der mikrosomalen Fraktion 30 min bei 300000 x g in einem Beckman -50.2-Ti-Rotor zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden in 50 ml Homogenisie- rungsmedium resuspendiert. Je 25 ml wurden mit 8 ml Gradientenmedium (5 mmol/1 HEPES (pH 7,5), 2 mmol/1 DTT und 25% (w/w) Saccharose) unterschichtet und 90 min bei 100000 x g zentrifugiert. Von beiden Gradienten wurde jeweils 1 ml Interphase, welche die Tonoplastenfraktion repräsentiert, mit einer Pas- teurpipette abgenommen und mit Verdünnungsmedium
(50 mmol/1 HEPES (pH 7,0), 3 mmol/1 MgS04 und 1 mmol/1 DTT) gemischt. Anschließend wurden die To- noplasten 30 min bei 300000 x g pelletiert, in 500 μl Lagermedium (10 mmol/1 HEPES (pH 7,0), 40% Gly- cerol, 3 mmol/1 MgS04 und 1 mmol/1 DTT) resuspen- diert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die anschließende Lagerung erfolgte bei -80° C.
b) Nachweis der Protonenpumpaktivität
Die Bestimmung der V-PPase-Protonenpumpaktivität erfolgte nach Palmgren (Plant Physiol., 94 (1990), 882-886) . Eingesetzt wurde 50 μg Tonoplastenpro- tein. Ergebnisse :
Die Figuren 3a und 3b zeigen die H+-Pumpaktivität in drei Monate gelagerten Rüben:
• Die spezifische Aktivität der V-ATPase ist etwa doppelt so hoch wie die der V-PPase.
• die vesikuläre Ansäuerung führt zu vergleichbaren pH-Gradienten.
Beispiel 9: Antiseren und Immunoblot-Analyse
Zum Nachweis der V-PPase-Proteine aus Beta vulgaris wurde ein gegen die V-PPase der Mungbohne { Vigna radiata) gerichtetes, polyclonales Antiserum aus Kaninchen verwendet (Maeshima und Yoshida, J. Biol. Chem., 264 (1989), 20068-20073). Zur Detektion der V-ATPase-Proteine wurde ein gegen das Holoenzym der vakuolären Adenosintriphosphatase (V-ATPase) von Kalanchoe daigremontiana gerichteter Antikörper aus "Kaninchen eingesetzt (Haschke et al . , In: Plant Membrane Transport, Herausgeber: Dainty, J. , De Mi- chelis, M. I., Marre, E. und Rasi-Caldogno, F., 1989, 149-154, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam) .
Im Falle der C-PPase wurde ein polyklonales Antiserum aus Kaninchen benutzt, das von der Firma Euro- gentec (Herstal, Belgien) hergestellt worden war. Als Antigen wurde dabei das rekombinante, über Ni- NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigte Protein BSPl injiziert.
Immunoblot-Analysen wurden wie bei Weil und Rausch beschrieben (Planta, 193 (1994) , 430-437) durchge- führt. Abweichend davon wurde zur Blockierung statt 8% BSA 5% Magermilchpulver eingesetzt. Als Substrat wurde „SuperSignal West Dura " (Pierce, Rockford, USA) verwendet .
Zum Nachweis von V-PPase und V-ATPase wurden je 5 μg Protein der angereicherten Tonoplastenfraktion in einem nativen ' 12%igen Polyacrylamid-Gel e- lektrophoretisch aufgetrennt. Im Falle der C-PPase wurde je 0,5 g Blatt- und Rübenmaterial in flüssigem Stickstoff gemörsert und das Homogenat direkt in 1 ml reduzierendem 2x Auftragspuffer (RotinLo- adl, Roth, Karlsruhe) aufgenommen. Je 5 μl Rohextrakt (entspricht 2,5 mg Frischgewichtsäquivalenten) wurde in einem 15%igen Polyacrylamid-Gel aufgetrennt .
"Ergebnisse :
Figur 4 zeigt die Ergebnisse einer Westernblot- Analyse für BSPl :
• BSPl ist sowohl in der Rübe als auch im Blatt vorhanden.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse einer Westernblot- Analyse für die V-PPase: • Die V-PPase kann in der Rübe von Beta vulgaris detektiert werden.
Beispiel 10: RNA-Extraktion und Northernblot- Analyse
Beta vulgaris-Suspensionskulturzellen wurden in „Ga borg B5"-Medium mit 2% Saccharose, unter Zugabe folgender Phytohormone angezogen: 0,2 mg/1 Kinetin, 0,5 mg/1 Naphtylessigsäure (NAA) , 0,5 mg/1 Indol-3- Essigsäure (IAA) und 2 mg/1 2,4-Dichlor- phenoxyessigsäure (2,4-D).
Für die Stressexperimente wurden 6 Tage alte Zellen zunächst in frisches Medium überführt und nach zwei weiteren Tagen auf 0,9%ige Agarplatten übertragen, wo sie für 3 Tage belassen wurden. Die Platten enthielten standardmäßig wie das Flüssigmedium Gamborg B5-Medium mit 2% Saccharose, jedoch zusätzlich noch 125 mmol/1 Mannitol und 125 mmol/1 Sorbitol . Unter Stressbedingungen wurden die Zellen auf Platzten ohne Mannitol und Sorbitol, ohne Phytohormone, ohne Saccharose, ohne Phosphat oder mit 100 mmol/1 KCl bzw. NaCl angezogen.
Für die Untersuchungen an Keimlingen wurden Beta vulgaris-Samen (diploide Hybride, KWS, Einbeck) in Schalen mit feuchtem Sand ausgesät. Zum Schutz vor Verdunstung wurden die Schalen mit einer Plastikhaube bedeckt und anschließend im Dunkeln bei 23° C aufbewahrt (Kontrollpflanzen keimten unter Licht mit einem Hell/dunkel-Rhythmus von 12/12 h) . Nach 6 Tagen wurden die im Dunkeln gekeimten Pflanzen dem Licht exponiert und ihr in Spitze (obere 0,5 cm) und Basis unterteiltes Hypokotyl sowie ihre' Keim- blätter zu den Zeitpunkten 0, 3, 6, 9 und 12 h nach Beginn der Belichtung geerntet . Um entwicklungsabhängige Effekte ausschließen zu können, wurde ein Teil der Pflanzen für weitere 24 h im Dunkeln belassen, bevor entsprechende Kontrollproben genommen wurden.
Um die entwicklungsabhängige Expression der V-PPase zu untersuchen, wurden Zuckerrüben unter Freilandbedingungen angezogen. Im Abstand mehrerer Wochen wurden Proben unterschiedlicher Gewebe genommen und bis zur Aufarbeitung bei -80° C gelagert.
Die für das Verwundungsexperiment verwendeten Zuckerrüben' wurden nach der Ernte 6 Monate bei 4° C gelagert. Die Verwundung wurde nach Rosenkranz et al . (J. Exp. Bot., 52 (2001), 2381-2384) durchge- führt .
Gesamt-RNA wurde nach der Methode von Logemann et al . (Analyt. Biochem. , 163 (1987), 16-20) isoliert. Je 15 μg RNA pro Spur wurde in einem l,4%igen Aga- rosegel mit einem Formaldehydgehalt von 2% e- lektrophoret'isch aufgetrennt. Anschließend wurde die RNA per Kapillarübertragung auf eine Nylon- Membran (Duralon, Stratagene, Amsterdam) transferiert und durch UV darauf fixiert (Crosslinker , Stratagene, Amsterdam) . Die Detektion erfolgte mit- tels Biotin-markierter Sonden nach Löw und Rausch
(In: Biomethods; A laboratory guide to biotin- labelling in biomolecule analysis, Herausgeber:
Meier, T. und Fahrenholz, F., 1996, 201-213, Birk- häuser Verlag, Basel) .
Figur 6 zeigt eine Northernblot-Analyse von V-PPase- und V-ATPase-Transkripten in verschiedenen Geweben 6 Tage alter, etiolierter Zuckerrübenkeimlinge, die im Anschluß an die Dunkelanzucht einer unterschiedlich langen Belichtungsdauer (0, 3, 6, 9 bzw. 12 h) ausgesetzt worden waren. Zur Kontrolle entwicklungsabhängiger Veränderungen wurden einige Dunkelkeimer weitere 24 h, also insgesamt 7 Tage, im Dunkeln gelassen, um ihre Transkriptmengen (Bahn 9 bzw. 15) mit denen der 6 Tage alten, vergeilten Keimlinge ohne Lichtkontakt (Bahn 4 bzw. 10) vergleichen zu können. Als weitere Kontrolle dienten 6 Tage alte Lichtkeimer, die unter einem 12/12 h Licht/Dunkelheit-Rhythmus bei 160 μmol Photonen pro m2/s gewachsen waren (Bahn 3 und 16) . Es wurden jeweils 15 μg RNA aufgetragen.
Ergebnisse :
Figur 6 zeigt die Ergebnisse einer Northernblot- Analyse zur Expression von V-PPase und V-ATPase in Beta-Keimlingen.
• Unabhängig vom Belichtungsgrad ist die V-PPase in Geweben mit hoher Teilungsrate (Hypoko- tylspitze) oder Syntheseleistung (Kotyledonen) stark exprimiert, während die Expression in ausdifferenzierten Geweben (Hypokotylbasis) niedrig ist .
• Die Untereinheiten der V-ATPase werden' in den Keimblättern schwächer exprimiert als in der Hypokotylbasis, und zwar unabhängig vom Grad der Belichtung. Im teilungsaktiven Bereich der Hypokotylspitzen ist die Expression bei im Dunkeln angezogenen, etiolierten Keimlingen hoch, nimmt aber bereits wenige Stunden nach Belichtung stark. ab.
Die. Figuren 7a und 7b zeigen die Ergebnisse einer Northernblot-Analyse der Effekte verschiedener Stressbehandlungen auf die Transkriptspiegel der vakuolären Pyrophosphatase (Isoform I und II) in Suspensionskulturzellen von Beta vulgaris L.
Die Figur 8 zeigt die Ergebnisse einer Northernblot-Analyse, aus der ein gegenläufiges Expressionsmuster von V-ATPase und V-PPase-Genen in Beta-Rüben nach Verwundung hervorgeht.
Schließlich zeigt die Figur 9 eine Northernblot- Analyse zur entwicklungsabhängigen Expression der vakuolären Pyrophosphatase (Isoform II = BVP2) in verschiedenen Geweben von Beta vulgaris . Beispiel 11 : Expression von V-PPase und C-PPase in Arabidopsis thaliana
Um den Einfluss der Überexpression der cytosolisehen Pyrophosphatase (C-PPase) von Beta vulgaris, der vakuolären Pyrophosphatase (V-PPase) von Beta vulgaris beziehungsweise der gleichzeitigen Überexpression beider Pyrophosphatasen auf das Wachstum, insbesondere das Rosettenwachstum, von Arabidopsis thaliana zu untersuchen, wurden j eweils mit den vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren transgene Arabidopsis- Pf lanzen bereitgestellt . Die dazu verwendeten pBinAR-Vektoren (Figur lOa-c) enthielten neben der Vollängen-cDNA der j eweiligen Pyrophosphatase auch den CaMV35S -Promotor . Die Über- expression der j eweiligen Pyrophosphatasen fand unter der Kontrolle dieses 35S-Promotors statt . Es wurde der Einfluss auf das Rosettenwachstum von A- rabidopsis thaliana im Vergleich zum Wildtyp untersucht . Dabei wurden die Trockengewichte von sechs Wochen alten Pflanzen bestimmt (Tabelle 3) .
Tabelle 3 :
Ergebnisse:
Die Überexpression der Pyrophosphatasen in den transgenen Arabidopsis-Pflanzen führt zu einer signifikanten Steigerung des ' Gesamt- Sprosstrockengewichts (Rosette) dieser Pflanzen im Vergleich zum Arajidopsis-Wildtyp. Dabei zeigt die gleichzeitige Überexpression von beiden, sowohl der cytosolisehen als auch der vakuolären Pyrophosphatase in Arabidopsis thaliana einen besonders star- ken Effekt auf das Gesamt-Sprosstrockengewicht; es wurde eine Steigerung um etwa 26% erreicht.
Die erfindungsgemäß erhältliche transgene Pflanze weist ein gesteigertes Wachstum in Folge vermehrter Meristemaktivität auf.
Beispiel 12: Expression von V-PPase und C-PPase in Beta vulgaris
Um den Einfluss der Überexpression der cytosoli-
-" sehen Pyrophosphatase (C-PPase) von Beta vulgaris, der vakuolären Pyrophosphatase (V-PPase) von Beta vulgaris beziehungsweise der gleichzeitigen Überexpression beider Pyrophosphatasen auf das Wachstum hauptsächlich der Speicherwurzel, insbesondere das Rübenfrischgewicht, von Beta vulgaris sowie auf- den Saccharosegehalt im Rübenkörper zu untersuchen, wurden jeweils mit den vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren transgene Beta vulgaris-Rüben bereitgestellt. Die dazu verwendeten Vektoren enthielten neben der Vollängen-cDNA der jeweiligen Pyrophosphatase auch den CaMV35S-Promotor. Die Überexpression der jeweiligen Pyrophosphatasen fand unter der Kontrolle dieses CaMV35S-Promotors statt. Es wurde der Einfluss auf das Rübenfrischgewicht, von Beta vulgaris im Vergleich zum Beta vulgaris Wildtyp 6 B 2840 untersucht (Tabelle 4) .
Tabelle 4 :
Es wurde der Einfluss auf den Saccharosegehalt in der Rübe von Beta vulgaris im Vergleich zum Saccharosegehalt in der Rübe des Beta vulgaris Wildtyp 6 B 2840 untersucht (Tabelle 5) .
Tabelle 5:
Ergebnisse :
Die Überexpression der Pyrophosphatasen in den transgenen Beta vulgaris-Rüben führt jeweils zu einer signifikanten Steigerung des Rübenfrischge- wichts und des Saccharosegehalts dieser Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp. Dabei zeigt die gleichzeitige Überexpression von beiden, sowohl der cytosolisehen als auch der vakuolären, Pyrophosphatase einen besonders starken Effekt auf das Rübenfrischge- wicht und den Saccharosegehalt. Es wurde beim Rübenfrischgewicht eine Steigerung um etwa 19% erreicht. Gleichzeitig war der Saccharosegehalt auf einen Wert von etwa 21% erhöht, was eine Steigerung im Vergleich zum Wildtyp um etwa 31% entsprach.
Die erfindungsgemäß erhältlichen transgenen Rübenpflanzen weisen einen gesteigerten Saccharosegehalt und ein gesteigertes Wachstum in Folge erhöhter Meristemaktivität auf.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zuckerrübenpflanze umfassend:
a) Transformieren mindestens einer Zuckerrübenzelle mit mindestens zwei Transgenen, wobei das erste Transgen für eine vakuoläre Pyrophosphatase (V-PPase) und das zweite Transgen für eine cytosolische und/oder kernlokalisierte lösliche Pyrophosphatase (C-PPase) codiert,
b) Kultivieren und Regenerieren der transformierten Zellen unter Bedingungen, die zur vollständigen Regeneration der transgenen Rübenpflanze führen, und
c) Erhalten einer transgenen Rübenpflanze mit gesteigertem Saccharosegehalt in der Rübe, gesteigerter und/oder velängerter Meristem- aktivität ■ und/oder verringerter Saccharoseabbaurate während der Lagerung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Transgen eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nucleotidse- quenzen bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 4 , einer komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz codierend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 5, einer komplementären Sequenz davon und
c) einer Nucleotidsequenz, die mit der Sequenz nach a) oder b) eine Sequenzidentität von mehr als 80% aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , wobei das zweite Transgen eine Nucleinsäuresequenz um- fasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nucleotidsequenzen bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 1 , einer komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz codierend die Amino- säuresequenz dargestellt in SEQ ID
Nr. 2, einer komplementären Sequenz davon und
c) einer Nucleotidsequenz, die mit der Sequenz nach a) oder b) eine Sequenzidentität von mehr als 80% aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste und/oder zweite Transgen auf einem Vektor angeordnet ist .
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden An- sprüche, wobei der Vektor zur Überexpression des ersten und/oder zweiten Transgens ausgestattet ist.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das erste und/oder zweite Transgen auf dem Vektor operativ verknüpft zu einem Promotor vorliegt .
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein gewebespezifischer Promotor, ein konstitutiver Promotor, ein in- duzierbarer Promotor- oder eine Kombination davon ist .
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein Promotor aus Beta vulgaris, Arabidopsis thaliana oder dem Blu- menkohlmosaik-Virus ist .
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Promotor der CaMV35S-Promotor ist .
10. Verfahren nach einem der vorstehenden , An- sprüche, wobei der Promotor ein V-
PPasepromotor aus Beta vulgaris ist.
11. Verfahren nach vorstehendem Anspruch, wobei der Promotor eine Nucleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nucleo- tidsequenzen bestehend aus
a) einer Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr . 6 oder 7, einer komplementären Sequenz davon und
b) einer Nucleotidsequenz, die mit einer der Sequenzen nach SEQ ID Nr. 6 oder 7 eine Se- quenzidentität von mehr als 80% aufweist.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Promotor der Saccharose- synthasepromotor ist.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden An- sprüche, wobei der Promotor ein lagerungs- spezifischer Promotor ist.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Vektor Intrans-Enhancer o- der sonstige Regulationselemente aufweist.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das erste und zweite Transgen auf einem einzigen Vektor zusammen angeordnet sind.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden An- sprüche, wobei das erste und zweite Transgen auf verschiedenen Vektoren angeordnet sind.
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei erstes und zweites Transgen gleichzeitig transformiert werden.
18. Verfahren nach einem der vorstehenden An- sprüche, wobei die Transformation eine bio- listische Transformation, eine Elektro- transformation, eine Agrobakterien-vermittelte Transformation und/oder eine Viren-vermittelte Transformation ist.
19. Transgene, vorzugsweise fertile, Pflanzen mit mindestens einer transformierten Zelle, erhalten nach einem Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche .
20. Transgene Pflanze nach vorstehendem An- Spruch, gekennzeichnet durch einen gesteigerten Saccharosegehalt .
21. Transgene Pflanze nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine erhöhte Meristemaktivität während der Wachstums.
22. Transgene Pflanze nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine verringerte Abbaurate von Saccharose während der Lagerung.
23. Ernte- oder Vermehrungsmaterial einer trans- genen Pflanze nach einem der vorstehenden Ansprüche .
24. Nueleinsäuremolekül codierend ein Protein mit der biologischen Aktivität einer löslichen Pyrophosphatase aus Beta vulgaris, insbesondere einer C-PPase, wobei die Sequenz des Nuc- leinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe der Nucleotidsequenzen bestehend aus :
a) einer Nucleotidsequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 1, einer komplementären Sequenz davon,
b) einer Nucleotidsequenz codierend die Amino- säuresequenz dargestellt in SEQ ID
Nr. 2, einer komplementären Sequenz davon und
c) einer Nucleotidsequenz, die mit der Sequenz nach a) oder b) eine Sequenzidentität von mehr als 80% aufweist.
25. Nueleinsäuremolekül codierend für einen Promotor einer vakuolären Pyrophosphatase (V- PPase) aus Beta vulgaris, wobei die Sequenz des Nucleinsäuremoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
: a) einer Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 6 oder 7, eine komplementären Sequenz davon und
b) einer Nucleotidsequenz die mit einer der Sequenzen nach SEQ ID Nr. 6 oder 7 eine Sequenzidentität von mehr als 80% aufweist.
26. Verwendung des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 24 zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit mindestens einer transformierten Zelle.
27. Vektor enthaltend die Sequenz des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 24 und/oder 25.
28. Vektor nach Anspruch 27, der ein viraler Vektor oder Plasmid ist.
29. Verwendung des Vektors nach Anspruch 27 oder 28 zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit mindestens einer transformierten Zelle.
30. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 27 oder 28.
31. Wirtszelle nach Anspruch 30, die eine bakterielle Zelle, pflanzliche Zelle oder tierische Zelle ist.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101457234A (zh) * 2007-12-14 2009-06-17 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种提高植物产量的方法及其表达盒
DE102008064184A1 (de) * 2008-12-22 2010-08-12 Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt Verfahren zur Steigerung des Saccharoseertrages beim landwirtschaftlichen Anbau von Zuckerrüben und Zuckerrohr
US20100257639A1 (en) * 2009-02-26 2010-10-07 Robert Edward Bruccoleri Methods and compositions for altering sugar beet or root crop storage tissue
BRPI1008189A2 (pt) * 2009-06-30 2015-08-25 Du Pont Planta transgenica semente transgenica obtida a partir da planta transgencia semente transgencia metodo de produção de uma planta transgenica metodo de produção de sementes transgenicas metodo de produto e ou subproduto da semente transgenica e semente transgenica obtida pelo metodo

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4035756A1 (de) * 1990-11-08 1992-05-14 Inst Genbiologische Forschung Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzen
DE4317596A1 (de) * 1993-05-24 1994-12-01 Schering Ag DNA-Sequenzen und Plasmide zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration
WO1994028146A2 (en) * 1993-05-24 1994-12-08 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Dna sequences and plasmids for the preparation of sugar beet with changed sucrose concentration

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004083440A1 *

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