EP2100139A2 - Compositions biologiquement actives, procédé pour leur obtention, et applications biologiques - Google Patents

Compositions biologiquement actives, procédé pour leur obtention, et applications biologiques

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EP2100139A2
EP2100139A2 EP07870278A EP07870278A EP2100139A2 EP 2100139 A2 EP2100139 A2 EP 2100139A2 EP 07870278 A EP07870278 A EP 07870278A EP 07870278 A EP07870278 A EP 07870278A EP 2100139 A2 EP2100139 A2 EP 2100139A2
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EP
European Patent Office
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fractions
extracts
plants
activity
tgr5
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07870278A
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German (de)
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Charles Mioskowski
Annelise Lobstein
Alain Wagner
Régis SALADIN
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Phytodia
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Original Assignee
Phytodia
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
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Publication date
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Definitions

  • the subject of the invention is novel biologically active compositions which can be obtained from plants. It also relates to a process for obtaining these compositions by extraction from selected plants with regard to a given activity.
  • the invention also relates to the biological applications of these compositions for the treatment in humans or animals of diseases which result from a disturbance of the metabolism and / or the energy balance, called metabolic diseases, in particular the treatment of type 2 diabetes.
  • metabolic diseases in particular the treatment of type 2 diabetes.
  • This test is based on the ability of the dehydrogenase enzymes contained in mitochondria to convert MTT, a solution-colored yellow molecule, into blue formazan crystals in solution. It makes it possible to obtain a measurement of the continuous dehydrogenase activity in the mitochondria after treatment with a given product and therefore to measure the amount of ATP produced by the mitochondria, which is the signature of the metabolic activity at the level of the mitochondria. of a cell.
  • the inventors have thus developed a method of screening novel molecules for their potential to act on the metabolic activity, using the MTT test, not only to measure the cytoxicity of extracts, fractions and compounds of selected plants, but also original, to measure the ability of these extracts, fractions and compounds to increase metabolic activity.
  • the TGR5 receptor belongs to the family of G-protein coupled receptors (GPCRs for short). It is the first membrane receptor activated by bile acids. TGR5 is described as a mediator of certain endocrine functions of bile acids.
  • the inventors found that the TGR5 activity was increased, relative to a control, when the CHO cells were treated with extracts and / or fractions obtainable from plants, or with molecules that could be obtained from these extracts or fractions.
  • a reporter plasmid for example the gene coding for luciferase
  • TGR5 as a biological target in accordance with the invention makes it possible to have products with a high specificity in terms of their effects on metabolism.
  • the invention therefore aims to provide a method of high reliability and easy to implement to obtain new compositions useful to prevent, accompany a diet and treat metabolic diseases.
  • compositions as new products and to use their properties for the manufacture of drugs or herbal supplements or plant active ingredients for the treatment and prevention of metabolic diseases .
  • the purpose of the invention is in particular to provide agonist products of TGR5, and aims at the applications of these products, in humans and animals, in particular in the therapeutic, nutritional and nutraceutical fields and, in general, to prevent and treat treat conditions, disorders and syndromes related to metabolic disorders.
  • the invention relates to a process for obtaining biologically active compositions, by extraction from one or more plants, characterized in that it comprises the steps a) separately treating the plants selected with respect to a given activity, or parts thereof, with one or more solvents to obtain total extracts or fractions enriched in active principles, especially apolar fractions and fractions; polar
  • This method advantageously comprises, besides the steps a) and b) defined above, a step c), implemented after step a), and / or after step b), this step c) comprising the analyzing said extracts or said selected fractions to determine the components they contain and isolate and purify, if desired, the active principle (s) carrying the bulk of the biological activity.
  • This analysis is carried out more particularly by HPLC profiles.
  • step a) the plants or parts of plants are preferably used in the form of a fine powder, obtained after grinding and drying.
  • Stage a) generally comprises one or more extractions, these extractions being carried out using supercritical CO 2 or with organic solvents, in particular an alcoholic solvent (in particular with ethanol or methanol) or cyclohexane or any other apolar solvent (petroleum ether, heptane, etc.), dichloromethane or chloroform, and several of these solvents or all these solvents, which can be used successively for the isolation of specific fractions
  • organic solvents in particular an alcoholic solvent (in particular with ethanol or methanol) or cyclohexane or any other apolar solvent (petroleum ether, heptane, etc.), dichloromethane or chloroform, and several of these solvents or all these solvents, which can be used successively for the isolation of specific fractions
  • compositions having antidiabetic activity and useful in particular for the prevention and treatment of type 2 diabetes.
  • the biological tests carried out according to step b) of the process defined above are tests for determining an antidiabetic activity, in particular on the insulin secretion.
  • Vaccinium myrtillus Cichorium intybus, Cynara scolymus, Geranium robertianum, Juglans regia, Kalanchoe crenata, Leptodenia madagascariensis, Morus nigra, Olea europaea, Rubus fructicosus, Spathodea campanulata.
  • compositions and products characterized in that they are capable of being obtained from plants chosen from the genera: Strychnos, Betia, Dema, Sclerocarya, Voacanga, Moringa, Agrimonia, Arctium, Alchemilla, Phaseolus ,
  • Vaccinium Cichorium, Cynara, Geranium, Juglans, Kalanchoe, Leptodenia, Morus, Olea,
  • compositions and products are obtainable from plants selected from the following families: Loganiaceae, Urticaceae, Ulmaceae, Anacardiaceae, Apocynaceae, Moringaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Ericaceae, Geraniacaea, Juglandacaea, Crassulaceae, Oleaceae, Bignoniacea .
  • compositions are fractions of Tréma orientalis
  • the invention is particularly directed to the use of products obtainable from plants, such as extracts, fractions, compounds and / or molecules as agonists specific for TGR5.
  • the products used in the use according to the invention are biologically active products, characterized in that they have a chemical structure different from that of the bile acids, known agonists of TGR5; have an EC 50 greater than or equal to that of a natural ligand of TGR5, such as lithocholic acid (LCA); and furthermore do not activate the FXR nuclear receiver.
  • these products lead to a reduction in fat-induced weight gain in a mouse model of metabolic syndrome and also lead to a reduction in the mass of epididymal fat pads in the same model. They also lead to improved glucose tolerance.
  • the products used as TGR5 agonists according to the invention are more particularly capable of being obtained from plants chosen from the group comprising Olea europaea, Alchemilla vulgaris, Juglans regia, Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus and Obetia radula.
  • Particularly preferred molecules in view of their activating effect of TGR5 include pentacyclic triterpenes. They are more particularly pentacyclic triterpenes of the oleanane type, such as oleanolic acid, of the ursane type, such as corosolic acid, or of the lupane type.
  • said TGR5 agonists according to the invention are highly innocuous and do not give rise to harmful side effects.
  • the invention therefore aims generally at making use of the compositions and products defined above, namely extracts, fractions and compounds of the invention.
  • the invention thus relates to novel pharmaceutical compositions, characterized in that they contain an effective amount of at least one composition or a product as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to the use of said biologically active compositions and products for the manufacture of medicaments intended for the prevention and / or treatment of metabolic disorders / syndromes, more particularly of obesity and / or associated diseases such as Syndrome X ( metabolic syndrome), type 2 diabetes.
  • metabolic disorders / syndromes more particularly of obesity and / or associated diseases such as Syndrome X ( metabolic syndrome), type 2 diabetes.
  • the invention is directed to the use of pentacyclic triterpenes of the ursane type, pentacyclic triterpenes of the oleanane type, or pentacyclic triterpenes of the lupane type.
  • the invention provides in particular the use of said extracts or fractions, or corosolic acid for the prevention and / or treatment of type 2 diabetes 5 of obesity and / or metabolic syndrome .
  • the invention relates to the use of said extracts or fractions, or oleanolic acid for the prevention and / or treatment of obesity or diabetes, particularly type 2 diabetes, and / or the metabolic syndrome.
  • the medicaments of the invention are advantageously in galenic forms for oral, topical or injection administration.
  • the pharmaceutical compositions are more particularly in the form of tablets, tablets, capsules, granules, drops, syrup, alcohol syrup.
  • compositions for topical administration, they are advantageously in the form of creams, milks, lotions, oils or patches.
  • Suitable galenic formulations include aerosols.
  • the dosage in the various forms and for the daily application will be established, in a conventional manner, depending on the type of effects to be treated.
  • said drugs based on said agonists will be administered at a rate of 0.1 mg to 5 g / day.
  • the antihyperglycemic, antihyperinsulineuric and weight gain effects of said products are also advantageously used in dietetics.
  • the invention thus relates to food supplements, characterized in that they contain an effective amount of at least one composition or a product as defined above for a nutraceutical application, in association with an inert excipient.
  • the invention thus particularly targets the use of TGR5 agonists defined above as food supplements intended for humans (adults or children) or animals.
  • Complements of the invention are incorporated into the diet during the preparation of food or during their packaging, or by using preparations already formulated with said products, to perform the desired supplementation.
  • They may also be in an ingestible form such as capsules, capsules, in liquid infusions, gum, powder, tablets, capsules, decoctions, this enumeration is not limiting.
  • the invention therefore proposes an alternative for the prevention of these metabolic diseases because these products of natural origin are associated with a better quality of life and secondly their often centuries-old use in the traditional pharmacopoeia ensures an exhaustive knowledge. side effects.
  • FIGS. 10 to 24 which illustrate the results obtained with fractions of 6 plant extracts (Olea europaea, Alchemilla vulgae, Juglans regia, Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus, Obetia radula), namely, respectively:
  • FIG. 10 the effect of fractions of Olea europaea on the activity of the TGR5 receptor
  • FIG. 11 the HPLC profile of the active Olea europaea fraction on the TGR5,
  • FIG. 12 the NMR spectrum of oleanolic acid, active principle on TGR5, extracted from Olea europaea,
  • FIG. 16 the effect of fractions of Juglans regia on the activity of the TGR5 receptor
  • FIG. 17 the HPLC profile of the Juglans regia fraction pool active on the TGR5, ⁇ ⁇
  • FIG. 18 the effect of Agrimonia eupatoria fractions on the activity of the TGR5 receptor
  • FIG. 19 the HPLC profile of the active fraction of Agrimonia eupatoria on the TGR5
  • FIG. 20 the effect of Vaccinium myrtillus fractions on the activity of the TGR5 receptor
  • FIG. 21 the HPLC profile of the active Vaccinium myrtillus fraction on TGR5,
  • FIG. 22 the effect of Obetia r adula fractions on the activity of the TGR5 receptor
  • FIG. 23 the HPLC profile of the active Obetia r adula fraction on TGR5, and
  • the parts of dried plants (leaves, roots, etc.) are crushed in order to obtain a fine powder intended for extraction.
  • the powder is exhausted by percolation or maceration, or by sonication with polar or apolar solvents.
  • solvents may be cyclohexane, dichloromethane, chloroform, acetone, ethyl acetate, butanol, ethanol, methanol, water or a mixture of these various solvents.
  • the extracts are obtained with yields of between 2 and 10%. They are evaporated to dryness under reduced pressure. Then fractionated either by liquid-liquid extraction, or by successive extractions by solvents of increasing polarity.
  • the pure compounds can be obtained in particular by fractionation by adsorption chromato graphy, exclusion chromato graphy, affinity chromatography, ion exchange chromatography, or by fractional crystallization. Chromatographic profiles
  • Extracts, enriched fractions, more or less purified fractions or pure compounds are analyzed by high pressure chromatography using a reverse phase column (RP-HPLC).
  • the stationary phase used corresponds in particular to a grafted silica C8 or Cl8, 5 to 10 granulometry.
  • the eluting mixtures correspond in particular to acidified water (pH 3) added with methanol or acetonitrile.
  • the gradient used varies from 98% to 0% acidified water over at least 60 min.
  • the INSl pancreatic transformed line used for this test is a donation from the European Diabetes Center (Hautepierre, France).
  • the cells are seeded at a density of 3 ⁇ 10 3 / well in 96-well plates and cultured in RPMI 1640 medium enriched with fetal calf serum (10%).
  • the cells are treated with the various plant extracts (200 ⁇ g / ml) for 24 hours and the MTT test then carried out: MTT (bromide 2 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium ) is a tetrazolium salt giving a yellow solution when diluted in a medium.
  • Langerhans islets of pork pancreas are obtained from the European Diabetes Center (Hautepierre, France). 100 cells / well are seeded in 24-well plates and cultured in RPMI 1640 medium enriched with fetal calf serum (10%). The cells are treated with the various plant extracts (200 ⁇ g / ml) for 60 minutes and the insulin secretion measured using an Elisa kit (Mercodia) according to the supplier's recommendations. The results are expressed as a percentage of the control (DMSO alone).
  • Example 1 A Study of the effect of selected plants on the metabolic activity of cells
  • INS1 cells were treated for 24 hours with 200 ⁇ g / ml of extract of plant obtained by extraction with ethanol, methanol or dichoromethane.
  • the MTT conversion rate was calculated and the effect of the extracts expressed as a percentage of the control.
  • FIGS. 1-8 give, respectively, the RP-HPLC profiles of the ethanolic fractions of Tréma orientalis, Strychnos myrtoides, Obetia radula, Vaccinium myrtillus, Sclerocarya birrea, Agrimonia eupatoria, Alchemilla vulgaris and Olea europaea.
  • INS 1 cells were treated with 100, 200, 400 or 800 ⁇ g / ml of plant extract for 24 hours.
  • An example of a result obtained with Tréma orientalis is presented in Figure 9.
  • the abbreviations given in this figure have the following meanings: TC: cell-only control; DMSO: cell-only control + solvent (DMSO); A-J: fractions obtained after RP-HPLC semi-preparative (details of the fractions presented in FIG. 1). The conversion rate is presented after measuring the optical density at 560 nm.
  • Example 3 A Effect of selected plant extracts on insulin secretion
  • sulfonylureas the latest drug in the United States for the treatment of type 2 diabetes. Sulfonylureas promote the secretion of insulin by the pancreas. thereby prevent hyperglycemia. Since the plants are active on cellular metabolism, to determine if the active ingredients belonged to one of the 4 known therapeutic classes, in particular the sulfonylureas, the activity of these extracts was verified on an insulin secretion test on Langherans pigs.
  • Pork Langherans islets were treated for 60 minutes with 200 ⁇ g / ml of plant extract. Insulin secretion is measured by ELISA and the effect of extracts expressed as a percentage of control.
  • Oleanolic acid is a product marketed by Extrasyn concerned (Genay, France) and oleuropein and lithocholic acid are products marketed by Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France).
  • the extraction with ethanol is carried out, exhaustively, on 10 g of air-dried and pulverized olive leaves (Olea europaea L. Oleaceae, PhytoEst, France) with an aqueous solution of ethanol at 80%, by maceration at room temperature for 3 hours.
  • the mixture is then filtered using a suction pump and the filtrate is concentrated by evaporation under reduced pressure.
  • the powdered plant material (10 to 20 g) is successively extracted with cyclohexane (100 ml), dichloromethane (100 ml) and methanol (100 ml), using an extractor.
  • Automatic Soxhlet (2055 Aventi Soxtex, Foss Tecator). This protocol makes it possible to obtain three types of extract in which the highly lipophilic, non-polar and polar constituents of the plant are respectively concentrated.
  • the solvent is removed by evaporation under reduced pressure and the corresponding residues are weighed and stored in the freezer until use.
  • the flow rate is 1 mL / min with the following gradient: H 2 O / CH 3 CN (20:80) for 30 min, CH3CN (100%) for 5 min, and H 2 O / CH 3 CN
  • the PDA is registered in the gamma from 200 to 500 nm, using 254 nm as the detection wavelength.
  • the analyzes are performed with an Application Layer Protocol Control Information (APCI) coupled to an electrospray ionization interface (ESI) in negative mode.
  • APCI Application Layer Protocol Control Information
  • EI electrospray ionization interface
  • a DPX300 NMR spectrometer operating at 300 MHz for 1 H is used.
  • the chemical shifts are expressed in ⁇ (parts per million) with reference to the solvent peak of 7.58 for the pyridine-d5 C5D5N.
  • CHO cells Chinese hamster ovary (CHO) cells were obtained from ATCC (Manassas, Virginia) and maintained in Minimum Essential Alpha Medium ( ⁇ -MEM) supplemented with 10% (v / v) serum fetal calf (FCS), 100 ⁇ M non-essential amino acids (NAA), 100 units / mL of penicillin and 100 ⁇ g / mL of streptomycin sulphate.
  • ⁇ -MEM Minimum Essential Alpha Medium
  • FCS fetal calf
  • NAA non-essential amino acids
  • TGR5 activity For the determination of the TGR5 activity, a stable cell line obtained by transfecting CHO cells with 3.8 ⁇ g of a plasmid, TGR5 expression vector (pCMVSPORT6 / TGR5), 3.8 ⁇ g of a luciferase reporter plasmid whose expression is controlled by the cAMP Response Element (CRE, pCRE-Luc) and 0.4 ⁇ g of a plasmid for expression of the neomycin resistance gene (pcDNA3.1 (+)) using of the
  • the transfected cells are selected with 400 ⁇ g / mL of sulfate
  • Luminescence is determined on a Centro XS3 LB960 (Berthold Technologies,
  • COSF (ATCC) cells are transfected with Lipofectamine 2000 with 25 ng of hFXR expression vector plasmid.
  • pCMX-hFXR 25 ng of mouse rexinoid receptor expression vector (RXR ⁇ ) plasmid (m)
  • RXR ⁇ mouse rexinoid receptor expression vector
  • m mouse rexinoid receptor expression vector
  • pCMX-mRXR ⁇ mouse rexinoid receptor expression vector
  • pEcREx7 -Luc luciferase reporter
  • the cells are incubated for 5 hours with different concentrations of each extract in fresh MEM (or DMEM). After this treatment, the cells are lysed and the standardized luciferase activity is determined by operating according to Picard et al.
  • SAFE Normal and balanced high-carbohydrate food
  • high-fat food (60% Kcal Fat, D12492) are obtained from Research Diets (New Brunswick, New Jersey).
  • mice are in cages of 4 or 5 animals under stable temperature, with a day / night cycle of 12 hours, and with 1 free access to food and water.
  • the animals are divided into four groups of 8 animals: one group is maintained under a diet rich in lipids only, another group receives the same diet supplemented with oleanolic acid at a dose of 100 mg / kg / day (food intake is measured throughout the study and the amount of compound adjusted to maintain the dosage stable), another group receives the same diet supplemented with corosolic acid at one dose of 100 mg / kg / day, finally a last group receives the same diet supplemented with active fraction of Jugions regia at a dose of 100 mg / kg / day. Body weight and food intake are determined every other day. This experience is carried out respecting ethical principles.
  • the test is performed on animals that have been allowed to fast for 10 hours.
  • the blood glucose is monitored using a portable blood glucose meter (Maxi Kit Glucometer 4, Bayer Diagnostics).
  • a portable blood glucose meter Maxi Kit Glucometer 4, Bayer Diagnostics.
  • Blood glucose is assessed by drawing blood from the tail vein at 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 and 180 minutes.
  • Example IB Identification of TGR5 agonists from Olea europaea
  • LCA (used as a positive control) on the luciferase assay in CHO-TGR5 cells were first screened.
  • the isolation of the active principle is continued by testing enriched extracts either in hydrophobic molecules (DCM extraction) or in hydrophilic molecules (MeOH). For Olea europaea, most of the activity is present in the DCM extract.
  • the active fraction 7 has a high purity. Detection
  • Example 2 B Identification of agonists of TGR5 from Alchemilla vulgar ⁇ s
  • Extracts and fractions are prepared by operating as above with Ole ⁇ europ ⁇ e ⁇ .
  • Figure 15 reports the NMR spectrum of corosolic acid, which is the active molecule contained in fraction 9.
  • Example 3 B Identification of agonists of TGR5 from Juglans regia
  • Example 1 The procedure is as indicated in Example 1 in connection with Olea europaea.
  • the results obtained with the fractions of the DCM extracts are given in FIG. 16 which shows the strong activity of the fractions 7, 8 and 9.
  • the HPLC profile of the pool of these fractions is given in FIG.
  • Example 4 B Identification of agonists of TGR5 from tfAgrimonia eupatoria
  • Example 5 B Identification of TGR5 agonists from Vaccinium myrtillus
  • Example 6 B Identification of TGR5 agonists from Obetia radula
  • mice are fed either with normal and balanced food or with high-fat food for 10 weeks before starting treatment with plant extracts. During this period, the fat mice show a 50% increase in their body weight, accompanied by a similar increase in caloric intake.
  • the mean blood glucose levels before IPGTT are 103 ⁇ 7, 154 ⁇ 5, 144 ⁇ 18, 141 ⁇ 2 and 159 ⁇ 3 mg / dL, respectively, in the normal-fed, high-lipid, high-lipid diet groups + oleanolic acid, diet rich in lipids + corosolic acid, and high fat diet + JRL.
  • the IPGTT curves clearly show that the administration of a high-fat diet induces glucose intolerance and insulin resistance (Figure 24). This glucose tolerance is partially corrected when the mice are treated with the active fractions of plants.
  • the invention thus provides highly specific and powerful TGR5 agonists and the results obtained show the high activity of these molecules, corresponding to pure and / or enriched fractions.

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Abstract

L'invention vise des compositions et produits susceptibles d'être obtenus à partir de plantes, tels qu'extraits, fractions et/ou molécules. Application pour fabriquer des médicaments pour l'homme ou l'animal, notamment pour prévenir et/ou traiter des troubles métaboliques, l'obésité et/ou des maladies qui lui sont associées comme le syndrome X (syndrome métabolique), le diabète de type 2, ou pour fabriquer des compléments alimentaires pour l'homme ou l'animal.

Description

Compositions biologiquement actives, procédé pour leur obtention, et applications biologiques
L'invention a pour objet de nouvelles compositions biologiquement actives, susceptibles d'être obtenues à partir de plantes. Elle concerne également un procédé d'obtention de ces compositions par extraction à partir de plantes sélectionnées au regard d'une activité donnée. L'invention vise en outre les applications biologiques de ces compositions pour le traitement chez l'homme ou l'animal de maladies qui découlent d'une perturbation du métabolisme et/ou de la balance énergétique, dites maladies métaboliques, en particulier le traitement du diabète de type 2. Depuis une trentaine d'années, la sédentarité et la surnutrition ont provoqué une explosion de l'incidence de l'obésité dans les pays industrialisés. Les obèses présentent un risque accru de développer d'autres syndromes ou maladies métaboliques, comme le syndrome X, la résistance à l'insuline, et le diabète de type 2. On dénombre près de 200 millions de personnes diabétiques dans le monde, dont environ 90% souffrent de diabète de type 2. On estime que ce chiffre doublera d'ici à 25 ans, affectant ainsi un peu plus de 5% de la population mondiale.
Les personnes atteintes de diabète ont d'autre part 2 à 4 fois plus de risques de développer des complications cérébro- et cardio-vasculaires. En plus de ces problèmes macro-vasculaires, les patients développent également un certain nombre de complications micro-vasculaires : rétinopathies, neuropathies et néphropathies. Après 10 ans d'évolution de la maladie, un tiers des patients diabétiques sont atteints de ces complications qui pourraient être considérablement réduites par une prise en charge à la fois comportementale — en particulier avec un régime adapté et accompagné de compléments alimentaires - et médicamenteuse. II existe différentes classes de médicaments disponibles pour le traitement des maladies métaboliques, lesquels ont en commun d'agir sur une des composantes du métabolisme. Néanmoins, le caractère multi-symptomatique des maladies métaboliques implique une multi-médicamentation, laquelle, outre son coût élevé pour les organismes de santé, augmente les risques d'effets secondaires par interaction médicamenteuse. C'est pourquoi, malgré l'existence d'un grand nombre d'outils thérapeutiques, il existe un très grand besoin médical pour ces maladies métaboliques. Les patients souffrant de maladies métaboliques voient leur maladie évoluer sur des périodes de 30, voire 40 ans. Pendant ces années, il n'y a pas de réel ressenti d'état malade et la plupart des personnes souffrant de maladies métaboliques ont beaucoup de mal à adhérer à des traitements composés de plusieurs médicaments lesquels sont souvent sources d'effets secondaires.
De plus, les produits utilisés à ce jour pour traiter le diabète n'ont pas de profil véritablement satisfaisant, leurs effets secondaires soutenus et nombreux restreignant leur emploi. La plupart des nouveaux médicaments en développement avancé ou récemment mis sur le marché présentent également des effets secondaires et il devient donc urgent de développer des produits efficaces plus satisfaisants.
Les recherches se poursuivent donc dans ce domaine, avec un intérêt particulier pour des solutions alternatives, basées en particulier sur des produits d'origine végétale, considérés comme naturels, par opposition aux composés de synthèse. Ces recherches aboutissent à la découverte de médicaments à base de plantes et/ou d'origine végétale, mais également à l'identification de compléments alimentaires à base de plantes. Il est en effet clairement établi que l'association d'un régime adapté intégrant l'utilisation de compléments alimentaires à base de certaines plantes et d'une activité physique adéquate, permet de prévenir le développement des maladies métaboliques, et en particulier celui de l'obésité et du diabète.
Au niveau mondial, on a attribué à près de 1200 plantes des effets sur les maladies métaboliques et en particulier le diabète de type 2. Cependant, dans la plupart des cas, la non toxicité des plantes n'a pas été démontrée, les principes actifs qu'elles contiennent n'ont pas été identifiés, leur pharmacologie afin de déterminer à quelle classe thérapeutique la plante appartient et éventuellement identifier une nouvelle classe thérapeutique n'a pas été effectuée ou encore aucune méthode d'extraction permettant d'obtenir de manière optimisée techniquement et économiquement leurs principes actifs n'a été décrite.
Il s'ensuit que ce manque de connaissances scientifiques précises sur leurs effets empêche leur utilisation thérapeutique. Sans ces informations scientifiques, l'utilisation en nutraceutique est elle aussi difficile, puisque le cadre réglementaire régissant ce domaine s'est récemment renforcé depuis la mise en application du nouveau décret 2006-352 relatif aux compléments alimentaires lequel est la transposition en droit français de la directive européenne 2002/46/CE.
Dans un souci d'obtention de données scientifiques précises et de développement d'actifs originaux, les inventeurs ont développé des moyens pour évaluer l'effet de compositions d'origine végétale sur l'activité métabolique au niveau mitochondrial. En effet, des études récentes ont montré que la diminution de l'activité métabolique elle-même, et en particulier au niveau de la mitochondrie, était l'une des perturbations majeure et précoce observée dans le développement des maladies métaboliques, notamment dans la pathogenèse du diabète de type 2 [Petersen et al].
Selon une première approche, les inventeurs ont constaté que le test du MTT
(bromure 2 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltetrazolium), couramment utilisé pour évaluer la cytotoxicité d'un produit chimique donné, d'origine synthétique ou naturelle (Mosmann), pouvait constituer un outil de grand intérêt pour sélectionner des compositions actives à partir des plantes et l'ont donc détourné de son utilisations habituelle.
Ce test est basé sur la capacité qu'ont les enzymes déshydrogénase contenues dans les mitochondries à convertir le MTT, molécule de couleur jaune en solution, en cristaux de formazan, de couleur bleue en solution. Il permet d'obtenir une mesure de l'activité déshydrogénase continue dans les mitochondries après traitement avec un produit donné et donc de mesurer la quantité d'ATP produite par la mitochondrie, laquelle est la signature de l'activité métabolique au niveau de la mitochondrie d'une cellule.
Les inventeurs ont ainsi développé une méthode de criblage de molécules originales pour leur potentiel à agir sur l'activité métabolique, en utilisant le test du MTT, non seulement pour mesurer la cytoxicité d'extraits, fractions et composés de plantes sélectionnées mais, de manière originale, pour mesurer la capacité de ces extraits, fractions et composés à augmenter l'activité métabolique.
La poursuite de leurs travaux a ensuite porté sur la recherche de produits d'origine végétale reconnaissant spécifiquement une cible biologique interférant avec la fonction mitochondriale, le TGR5. Le récepteur TGR5 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG en abrégé). Il s'agit du premier récepteur membranaire activé par les acides biliaires. TGR5 est décrit comme étant un médiateur de certaines fonctions endocrines des acides biliaires.
Ainsi, en utilisant une lignée de cellules de CHO transfectée de manière stable avec un vecteur d'expression du TGR5 et un plasmide rapporteur (à titre d'exemple le gène codant pour la luciférase), les inventeurs ont constaté que l'activité de TGR5 était augmentée, par rapport à un contrôle, lorsque les cellules CHO étaient traitées par des extraits et/ou fractions susceptibles d'être obtenus à partir de plantes, ou par des molécules susceptibles d'être obtenues à partir de ces extraits ou fractions. Ces extraits, fractions et molécules sont désignés globalement par les termes compositions ou « produits » dans la description et les revendications.
L'utilisation du TGR5 comme cible biologique conformément à l'invention permet de disposer de produits présentant une grande spécificité au niveau de leurs effets sur le métabolisme .
L'invention a donc pour but de fournir un procédé de grande fiabilité et facile à mettre en œuvre pour obtenir de nouvelles compositions utiles pour prévenir, accompagner un régime et traiter des maladies métaboliques.
Elle a également pour but de fournir de telles compositions en tant que produits nouveaux et de mettre à profit leurs propriétés pour la fabrication de médicaments ou encore de compléments alimentaires à base de plantes ou d'actifs végétaux pour le traitement et la prévention des maladies métaboliques.
L'invention a notamment pour but de fournir des produits agonistes de TGR5, et vise les applications de ces produits, chez l'homme et l'animal, notamment dans les domaines thérapeutiques, alimentaires, nutraceutiques et, de manière générale, pour prévenir et traiter les affections, troubles et syndromes liés à des désordres métaboliques.
Selon un premier aspect, l'invention vise un procédé d'obtention de compositions biologiquement actives, par extraction à partir d'une ou plusieurs plantes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes a) de traitement, séparément, des plantes sélectionnées par rapport à une activité donnée, ou de parties de ces plantes, avec un ou plusieurs solvants pour obtenir des extraits totaux ou des fractions enrichies en principes actifs, plus spécialement des fractions apolaires et des fractions polaires
b) de sélection d'extraits ou fractions présentant une activité métabolique dans le test MTT et une activité biologique dans au moins un test spécifique de cette activité métabolique.
Ce procédé comporte avantageusement, outre les étapes a) et b) définies ci-dessus, une étape c), mise en œuvre après l'étape a), et/ou après l'étape b), cette étape c) comprenant l'analyse desdits extraits ou desdites fractions sélectionnés pour déterminer les composants qu'elles renferment et isoler et purifier, si souhaité, le ou les principes actifs portant l'essentiel de l'activité biologique. Cette analyse est réalisée plus particulièrement par profils HPLC.
Cette disposition sur l'identification et l'isolement de composés actifs ouvre la perspective d'obtention de tels composés par voie de synthèse dans l'optique d'un développement pharmaceutique ou en nutraceutique.
Dans l'étape a), les plantes ou les parties de plantes sont utilisées, de préférence, sous forme de fine poudre, obtenue après broyage et séchage.
Il s'agit plus particulièrement des feuilles, des écorces, des racines, des parties aériennes, des fruits, graines ...
L'étape a) comprend généralement une ou plusieurs extractions, ces extractions étant réalisées à l'aide de CO2 supercritique ou avec des solvants organiques, notamment un solvant alcoolique (en particulier avec de l'éthanol ou du méthanol) ou du cyclohexane ou tout autre solvant apolaire (éther de pétrole, heptane...), du dichlorométhane ou du chloroforme, et, plusieurs de ces solvants ou tous ces solvants, pouvant être utilisés successivement pour l'isolement de fractions spécifiques
On notera que l'utilisation du test du MTT selon l'étape b), appliquée à des plantes auxquelles des effets biologiques étaient reconnus, mais ne pouvaient être utilisés efficacement faute de moyens pour leur caractérisation, permet de révéler des extraits et fractions qui n'avaient jamais été identifiés jusqu'à l'invention. Les compositions et produits, extraits, fractions composés et molécules susceptibles d'être obtenus par le procédé défini ci-dessus sont nouveaux et à ce titre entrent également dans le champ de l'invention.
L'invention est illustrée ci-après par son application à l'obtention de compositions possédant une activité antidiabétique et utiles en particulier pour la prévention et le traitement du diabète de type 2.
Dans ce but, les tests biologiques réalisés selon l'étape b) du procédé défini ci-dessus sont des tests pour déterminer une activité antidiabétique, notamment sur la sécrétion d'insuline.
Des compositions et produits préférés à cet égard sont susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies parmi les genres et espèces : Strychnos myrtoldes, Obetia radula, Tréma orientalis, Sclerocarya birrea, Voacanga thouarsii Moringa oleifera (= Moringa moringa, Moringa pterygosperma, Guilandina moringa), Agrimonia eupatoria, Arctium majus= Lappa major, Alchemilla vulgaris, Phaseolus vulgaris . Vaccinium myrtillus, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Géranium robertianum, Juglans regia, Kalanchoe crenata, Leptodenia madagascariensis, Morus nigra, Olea europaea, Rubus fructicosus, Spathodea campanulata.
Avantageusement, il s'agit de compositions et produits caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies parmi les genres : Strychnos, betia, Tréma, Sclerocarya, Voacanga, Moringa, Agrimonia, Arctium, Alchemilla, Phaseolus,
Vaccinium, Cichorium, Cynara, Géranium, Juglans, Kalanchoe, Leptodenia, Morus, Olea,
Rubus, Spathodea.
Des compositions et produits particulièrement préférés sont susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies parmi les familles : Loganiaceae, Urticaceae, Ulmaceae, Anacardiaceae, Apocynaceae, Moringaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Ericaceae, Geraniacaea, Juglandacaea, Crassulaceae, Oleaceae, Bignoniacea.
D'autres compositions particulièrement préférées sont des fractions de Tréma orientalis
Ulmaceae, Strychnos myrtoides Loganiaceae, Obetia radula Urticaceae, Vaccinium myrtillus Ericaceae, Sclerocarya birrea Anacardiaceae, Agrimonia eupatoria Rosaceae, Alchemilla vulgaris Rosaceae et Olea europaea Oleaceae, présentant respectivement, les profils HPLC des figures 1-8, ainsi que les composés biologiquement actifs issus de ces fractions.
Selon un autre aspect, l'invention vise particulièrement l'utilisation de produits susceptibles d'être obtenus à partir de plantes, tels qu'extraits, fractions, composés et/ou molécules comme agonistes spécifiques de TGR5.
On mesurera l'originalité de cet aspect de l'invention basée sur la mise en évidence du mécanisme d'action desdits produits qui permet le développement d'applications spécifiques.
Les produits mis en œuvre dans l'utilisation selon l'invention sont des produits biologiquement actifs, caractérisés en ce qu'ils présentent une structure chimique différente de celle des acides biliaires, agonistes connus de TGR5 ; possèdent une CE50 supérieure ou égale à celle d'un ligand naturel de TGR5, tel que l'acide lithocholique (LCA); et en outre n'activent pas le récepteur nucléaire FXR. De plus, ces produits entraînent une réduction de la prise de poids induite par une nourriture grasse dans un modèle murin de syndrome métabolique et entraînent également une réduction de la masse des coussinets graisseux de l'épididyme dans ce même modèle. Ils entraînent également une amélioration de la tolérance au glucose.
Grâce à ces effets spécifiques, ils s'avèrent ainsi particulièrement appropriés pour prévenir ou traiter des patients souffrant de pathologies telles que l'obésité, le syndrome métabolique (ou syndrome X) ou le diabète de type 2.
Les produits utilisés comme agonistes de TGR5 selon l'invention sont plus spécialement susceptibles d'être obtenus à partir de plantes choisies dans le groupe comprenant Olea europaea, Alchemilla vulgaris, Juglans regia, Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus et Obetia radula.
Des molécules particulièrement préférées compte tenu de leur effet activateur de TGR5 comprennent les triterpènes pentacycliques . II s'agit plus spécialement de triterpènes pentacycliques de type oléanane, tel l'acide oléanolique, de type ursane, tel l'acide corosolique, ou de type lupane.
La mise en évidence des effets antihyperglycémique, antihyperinsulinémique et sur l'obésité de l'acide oléanolique présente un caractère particulièrement surprenant étant donné qu'à ce jour les propriétés antihypertensive et hypoglycémique des feuilles d'olivier avaient été seulement attribuées à l'oleuropéine.
De manière avantageuse, lesdits agonistes de TGR5 selon l'invention présentent une grande innocuité et ne donnent pas lieu à des effets secondaires nocifs.
L'invention vise donc de manière générale la mise à profit des compositions et produits définis ci-dessus, à savoir extraits, fractions et composés de l'invention.
Selon un premier aspect, l'invention concerne ainsi de nouvelles compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins une composition ou un produit tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention vise également l'utilisation desdits compositions et produits biologiquement actifs pour la fabrication de médicaments destinés à la prévention et/ou traitement de troubles/syndromes métaboliques, plus spécialement de l'obésité et/ou de maladies associées comme le syndrome X (syndrome métabolique), le diabète de type 2.
Dans un mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation de triterpènes pentacycliques de type ursane, de triterpènes pentacycliques de type oléanane, ou de triterpènes pentacycliques de type lupane.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise en particulier l'utilisation desdits extraits, ou fractions, ou de l'acide corosolique pour la prévention et/ou le traitement du diabète de type 25 de l'obésité et/ou le syndrome métabolique .
Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation desdits extraits ou fractions, ou de l'acide oléanolique pour la prévention et/ou le traitement de l'obésité ou du diabète, notamment du diabète de type 2, et/ou le syndrome métabolique. Les médicaments de l'invention se présentent avantageusement sous des formes galéniques pour une administration par voie orale, topique, ou par injection.
Pour une administration par voie orale, les compositions pharmaceutiques se présentent plus particulièrement sous forme de comprimés, tablettes, gélules, granulés, gouttes, sirop, sirop alcoolique.
Pour une administration par voie topique, elles se présentent avantageusement sous forme de crèmes, laits, lotions, huiles ou patchs.
Des formulations galéniques appropriées comprennent les aérosols.
Pour une administration par voie injectable, elles se présentent sous forme de solutions dans des ampoules injectables par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables, ou encore de suspensions ou d'émulsions.
La posologie dans les différentes formes et pour l'application quotidienne, sera établie, de manière classique, selon le type d'effets à traiter.
A titre d'exemple, on administrera lesdits médicaments à base desdits agonistes à raison de 0.1mg à 5g/jour.
Les effets antihyperglycémiques, antihyperinsulinérniques et sur la prise de poids desdits produits sont également avantageusement mis à profit en diététique.
Selon un deuxième aspect, l'invention se rapporte donc à des compléments alimentaires, caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'au moins une composition ou un produit tels que définis ci-dessus pour une application en nutraceutique, en association avec un excipient inerte.
L'invention vise ainsi particulièrement l'utilisation des agonistes de TGR5 définis ci- dessus comme compléments alimentaires destinés à l'homme (adulte ou enfant) ou à l'animal. Les compléments de l'invention sont incorporés dans l'alimentation durant l'élaboration des aliments ou lors de leur conditionnement, ou en utilisant des préparations déjà formulées avec lesdits produits, permettant d'effectuer la supplémentation désirée.
Ils peuvent également se présenter sous une forme ingérable telle que gélules, capsules, sous forme liquide d'infusions, de gomme, de poudre, de comprimés, de gélules, décoctions, cette énumération n'étant pas limitative.
De manière générale, l'invention propose donc une alternative pour la prévention de ces maladies métaboliques car ces produits d'origine naturelle sont associés à une meilleure qualité de vie et d'autre part leur utilisation souvent séculaire dans la pharmacopée traditionnelle assure une connaissance exhaustive des effets secondaires.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés avec les exemples qui suivent de modes détaillés de réalisation de l'invention. Ces exemples servent à illustrer l'invention sans en limiter la portée. Il est fait référence dans ces exemples :
- A : aux figures 1 à 9 qui représentent les profils HPLC d'extraits de plantes selon l'invention (figures 1 à 8) et donnent un résultat de test MTT (figure 9), et
- B : aux figures 10 à 24 qui illustrent les résultats obtenus avec des fractions de 6 extraits de plantes (Olea europaea, Alchemilla vulgaήs, Juglans regia, d'Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus, Obetia radula), à savoir, respectivement :
- la figure 10 : l'effet de fractions d'Olea europaea sur l'activité du récepteur TGR5, - la figure 11 : le profil HPLC de la fraction d'Olea europaea active sur le TGR5,
- la figure 12 : le spectre RMN de l'acide oléanolique, principe actif sur le TGR5, extrait d'Olea europaea,
- la figure 13 : l'effet de fractions à? Alchemilla vulgaris sur l'activité du récepteur TGR5,
- la figure 14 : le profil HPLC de la fraction d: 'Alchemilla vulgaris active sur le TGR5, - la figure 15: le spectre RMN de l'acide corosolique, principe actif sur le TGR5, extrait d' Alchemilla vulgaris,
- la figure 16 : l'effet de fractions de Juglans regia sur l'activité du récepteur TGR5,
- la figure 17 : le profil HPLC du pool de fractions de Juglans regia actives sur le TGR5, ^ ^
- la figure 18 : l'effet de fractions d'Agrimonia eupatoria sur l'activité du récepteur TGR5,
- la figure 19 : le profil HPLC de la fraction active d'Agrimonia eupatoria sur le TGR5, la figure 20 : l'effet de fractions de Vaccinium myrtillus sur l'activité du récepteur TGR5,
- la figure 21 : le profil HPLC de la fraction de Vaccinium myrtillus active sur TGR5,
- la figure 22 : l'effet de fractions d'Obetia r adula sur l'activité du récepteur TGR5, la figure 23 : le profil HPLC de la fraction d'Obetia r adula active sur TGR5, et
- la figure 24 : l'effet de l'acide oléanolique (OA), de l'acide corosolique (AVA) et de la fraction active TGR5 de Juglans regia (JRL) sur le test de tolérance au glucose
(IPGTT) chez la souris soumise à un régime gras.
Exemples A
Matériel et méthode
Plantes
Les parties de plantes séchées (feuilles, racines....) sont broyées afin d'obtenir une poudre fine destinée à l'extraction.
Extraction-purification
La poudre est épuisée par percolation ou par macération, ou par sonication par des solvants polaires ou apolaires. Ces solvants peuvent être du cyclohexane, de dichorométhane, du chloroforme, de l'acétone, de l'acétate d'éthyle, du butanol, de Péthanol, du méthanol, de l'eau ou un mélange de ces différents solvants. Les extraits sont obtenus avec des rendements compris entre 2 et 10%. Ils sont évaporés à sec sous pression réduite. Puis fractionnés soit par extraction liquide-liquide, soit par extractions successives par des solvants de polarité croissante. Les composés purs peuvent être obtenus notamment par fractionnement par chromato graphie d'adsorption, chromato graphie d'exclusion, chromatographie d'affinité, chromatographie d'échanges d'ions, ou par cristallisation fractionnée Profils chromatographiques
Les extraits, les fractions enrichies, les fractions plus ou moins purifiées ou les composés purs sont analysés par chromatographie à haute pression en utilisant une colonne de phase inverse (RP-CLHP). La phase stationnaire utilisée correspond notamment à une silice greffée C8 ou Cl 8, de 5 à 10 de granulométrie. Les mélanges d'élution correspondent notamment à de l'eau acidifiée (pH 3) additionnée de méthanol ou d'acétonitrile. Le gradient utilisé varie de 98% à 0% d'eau acidifiée sur au moins 60 min.
Test MTT
La lignée transformée pancréatique INSl utilisée pour ce test est un don du Centre Européen du Diabète (Hautepierre, France). Les cellules sont ensemencées à une densité de 3 103/puit dans des plaques 96 puits et cultivées dans du milieu RPMI 1640 enrichi avec du sérum de veau fœtal (10%). Les cellules sont traitées avec les différents extraits de plantes (200 μg/ml) pendant 24 heures et le test MTT ensuite réalisé: le MTT (bromure 2 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltetrazolium) est un sel de tétrazolium donnant une solution de couleur jaune quand il est dilué dans un milieu. Il est converti en formazan violet insoluble dans le milieu de culture après clivage du cycle tétrazolium par les déshydrogénases mitochondriales actives des cellules vivantes seules. Les cellules mortes ne peuvent être le siège de ce changement. La solution de MTT (concentration finale de 0,5 mg/ml) est ajoutée aux cellules pour 4h d'incubation. Le milieu est ensuite aspiré avec précaution afin de ne pas aspirer les cristaux de formazan formés, lesquels seront solubilisés dans 100 μl de DMSO. Le matériel dissous est mesuré par spectrophotométrie donnant une absorbance proportionnelle à la concentration de colorant converti. L'absorbance de chaque puits est mesurée à 540-630 après soustraction du bruit de fond sur le spectrophotomètre. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (DMSO seul).
Test de sécrétion d'insuline
Les ilôts de Langerhans de pancréas de porc sont obtenus auprès du Centre Européen du Diabète (Hautepierre, France). 100 ilôts/puit sont ensemencés dans des plaques 24 puits et cultivés dans du milieu RPMI 1640 enrichi avec du sérum de veau fœtal (10%). Les cellules sont traitées avec les différents extraits de plantes (200 μg/ml) pendant 60 minutes et la sécrétion d'insuline mesurée à l'aide d'un kit Elisa (Mercodia) selon les recommandations du fournisseur. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (DMSO seul).
Exemple 1 A: Etude de l'effet de plantes sélectionnées sur l'activité métabolique de cellules
Des cellules INSl ont été traitées pendant 24 heures avec 200 μg/ml d'extrait de plante obtenus par extraction à l'aide d'éthanol, de méthanol ou de dichorométhane. Le taux de conversion du MTT a été calculé et l'effet des extraits exprimé en pourcentage du contrôle.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 : extraits éthanolique (total), méthanolique (enrichi en composés polaires) et dichlorométhanique (enrichi en composés apolaires). Dans ce tableau, EtOH = fraction éthanol ; MeOH = fraction méthanol ; DCM = fraction dichlorométhane.
Tableau 1
L'examen de ces résultats montre que l'ensemble des plantes sélectionnées a un effet sur l'activité métabolique des cellules. Exemple 2 A : Profils HPLC
Les fractions actives sont soumises à une RP-HPLC analytique afin d'avoir l'empreinte chromatographique des extraits par rapport à leur activité biologique. Les figures 1-8 donnent, respectivement, les profils RP-HPLC des fractions éthanoliques de Tréma orientalis, Strychnos myrtoides, Obetia radula, Vaccinium myrtillus, Sclerocarya birrea, Agrimonia eupatoria, Alchemilla vulgaris et Olea europaea.
Les fractions sont ensuite purifiées par RP-HPLC semi-préparative puis soumises au test de MTT afin de confirmer et d'identifier le principe actif. Pour ce test, les cellules INS 1 ont été traitées avec 100, 200, 400 ou 800 μg/ml d'extrait de plante pendant 24h. Un exemple de résultat obtenu avec Tréma orientalis est présenté dans la Figure 9. Les abréviations données sur cette figure ont les significations suivantes: TC: témoin cellule seule; DMSO: témoin cellule seule + solvant (DMSO); A-J: fractions obtenues après RP-HPLC semi- préparative (détail des fractions présenté figure 1). Le taux de conversion est présenté après mesure de la densité optique à 560 nm.
Exemple 3 A: Effet des extraits de plantes sélectionnées sur la sécrétion d'insuline
II existe quatre classes thérapeutiques d' antidiabétiques distinctes pour traiter le diabète de type 2. Parmi elles, les sulfonylurées, médicament phare aux Etats-Unis pour le traitement du diabète de type 2. Les sulfonylurées favorisent la sécrétion d'insuline par le pancréas et préviennent donc par ce biais l'hyperglycémie. Puisque les plantes sont actives sur le métabolisme cellulaire, afin de déterminer si les actifs appartenaient à une des 4 classes thérapeutiques connues, en particulier les sulfonylurées, l'activité de ces extraits a été vérifiée sur un test de sécrétion d'insuline sur ilôts de Langherans porcins.
Les ilôts de Langherans de porc ont été traités pendant 60 minutes avec 200 μg/ml d'extrait de plante. La sécrétion d'insuline est mesurée par test ELISA et l'effet des extraits exprimé en pourcentage du contrôle.
Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant. Dans ce tableau, EtOH, MeOH et DCM correspondent, respectivement, aux extraits éthanolique (total), méthanolique (enrichi en composés polaires) et dichlorométhanique (enrichi en composés apolaires). Tableau 2
Exemples B
Produits et procédés Produits
L'acide oléanolique est un produit commercialisé par Extrasynthèse (Genay, France) et l'oleuropéine et l'acide lithocholique sont des produits commercialisés par Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France).
Extraction à partir de plante
L'extraction à l'éthanol est effectuée, exhaustivement, sur 10 g de feuilles d'olivier séchées à l'air et pulvérisées (Olea europaea L. Oleaceae, PhytoEst, France) avec une solution aqueuse d'éthanol à 80%, par macération à température ambiante pendant 3 heures.
On filtre ensuite le mélange à l'aide d'une pompe aspirante et on concentre le filtrat par évaporation sous pression réduite.
Pour l'extraction au dichlorométhane et au méthanol, on extrait successivement la matière végétale en poudre (10 à 20 g) avec du cyclohexane (100 mL), du dichlorométhane (100 mL) et du méthanol (100 mL), en utilisant un extracteur Soxhlet automatique (2055 Aventi Soxtex, Foss Tecator). Ce protocole permet d'obtenir trois types d'extrait dans lesquels sont respectivement concentrés les constituants très lipophiles, non polaires et polaires du végétal.
On élimine le solvant par évaporation sous pression réduite puis on pèse les résidus correspondants et on les conserve au congélateur jusqu'à utilisation.
Analyse par HPLC
Pour les profils analytiques de chaque extrait, on soumet une solution méthanolique du résidu (5 mg/mL) à une HPLC analytique (Varian Pro Star) couplée à un détecteur DAD (Varian) en utilisant une colonne en phase inverse (Nucleodur 100- 10-Cl 8, 250/4,6, Mâcher ey-Nagel) . Pour l'élution, on utilise un mélange d'acétonitrile et d'eau acidifiée (0,1% d'acide trifluoroacétique) .
En conditions analytiques, le débit est de 1 mL/min avec le gradient suivant : H2O/CH3CN (20:80) pendant 30 min, CH3CN (100%) pendant 5 min, et H2O/CH3CN
(20:80) pendant 5 min. Pour l'analyse par LC/MS (Agilent 1200SL), on enregistre le PDA dans la gamine de 200 à 500 nm, en utilisant 254 nm en tant que longueur d'onde de détection. On procède aux analyses avec une APCI (Application Layer Protocol Control Information) couplée à une interface d'ionisation par électronébulisation (ESI) en mode négatif.
Analyse par RMN
On utilise un spectromètre de RMN DPX300 fonctionnant à 300 MHz pour 1H. Les déplacements chimiques sont exprimés en δ (parties par million) en référence au pic de solvant de 7,58 pour la pyridine-d5 C5D5N.
Dosage de l'activité TGR5 par un test luciférase
Des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) ont été obtenues auprès de l'ATCC (Manassas, Virginie) et maintenues dans du Milieu Essentiel Minimum alpha (α-MEM) auquel est ajouté 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF), 100 μM d'acides aminés non essentiels (AANE), 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de sulfate de streptomycine.
Pour le dosage de l'activité TGR5, on utilise une lignée cellulaire stable obtenue en transfectant des cellules CHO avec 3,8 μg d'un plasmide, vecteur d'expression du TGR5 (pCMVSPORT6/TGR5), 3,8 μg d'un plasmide rapporteur luciférase dont l'expression est contrôlée par le cAMP Response Elément (CRE,pCRE-Luc) et 0,4 μg d'un plasmide d'expression du gène de résistance à la néomycine (pcDNA3.1(+)) en utilisant de la
Lipofectamine 2000. Les cellules transfectées sont sélectionnées avec 400 μg/mL de sulfate
G418 et les clones individuels sont cultivés indépendamment sur une plaque à 96 puits. Les cellules CHO exprimant TGR5 sont traitées avec 10 μM d'acide lithocholique (LCA) ou d'extraits végétaux, puis soumises à des dosages de la luciférase [Picard ét al.]. La luminescence est déterminée sur un appareil Centro XS3 LB960 (Berthold Technologies,
Bad Wildbad, Allemagne).
Dosage de FXR par la luciférase
Pour évaluer l'activité FXR des extraits végétaux, on transfecte grâce à la Lipofectamine 2000 des cellules COSl (ATCC) avec 25 ng de plasmide vecteur d'expression du hFXR (pCMX-hFXR), 25 ng de plasmide vecteur d'expression du récepteur des rexinoïdes α (RXRα) de souris (m) (pCMX-mRXRα), rapporteur luciférase (pEcREx7 -Luc ) et 50 ng de pCMVβ utilisé en tant qu'étalon interne dans chaque puits.
Environ 18 heures après les transfections, les cellules sont incubées pendant 5 heures avec différentes concentrations de chaque extrait dans du MEM (ou du DMEM) frais. Après ce traitement, les cellules sont lysées et on détermine l'activité luciférase normalisée en opérant selon Picard et al ci-dessus.
Animaux et régime alimentaire
Des souris C57BL/6 mâles de six semaines, obtenues auprès de Charles River, sont utilisées.
La nourriture normale et équilibrée riche en glucides (SAFE, D04) et la nourriture riche en lipides (60% Kcal Fat, D12492 ) sont obtenues auprès de Research Diets (New Brunswick, New Jersey) .
Les souris sont par cages de 4 ou 5 animaux sous température stable, avec un cycle jour/nuit de 12 heures, et avec 1 accès libre à la nourriture et à l'eau. Les animaux sont maintenus pendant 10 semaines soit sous une alimentation normale et équilibrée (n = 5), soit sous une alimentation riche en lipides (n = 32). Après 10 semaines sous une alimentation riche en lipides, les animaux sont divisés en quatre groupes de 8 animaux : un groupe est maintenu sous une alimentation riche en lipides uniquement, un autre groupe reçoit la même alimentation additionnée d'acide oléanolique à une dose de 100 mg/kg/jour (l'absorption de nourriture est mesurée tout au long de l'étude et la quantité de composé ajustée de façon à maintenir le dosage stable), un autre groupe reçoit la même alimentation additionnée d'acide corosolique à une dose de 100 mg/kg/jour, enfin un dernier groupe reçoit la même alimentation additionnée de fraction active de Jugions regia à une dose de 100 mg/kg/jour. Le poids corporel et l'absorption de nourriture sont déterminés un jour sur deux. Cette expérience est réalisée en respectant les principes éthiques.
Test de tolérance au glucose
Le test est réalisé sur des animaux que l'on a laissé jeûner pendant 10 heures. La glycémie est surveillée à l'aide d'un glucomètre portatif (Maxi Kit Glucometer 4, Bayer Diagnostic). Pour ce test, on injecte par voie intrapéritonéale une solution stérile contenant 2 g de glucose/kg de poids corporel. La glycémie est évaluée en prélevant du sang dans la veine caudale à 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 et 180 minutes.
Exemple IB : identification d'agonistes de TGR5 à partir à'Olea europaea
• Extraction à partir de feuilles d'Olea europaea
Extraits éthanoliques totaux, extraits au DCM fdichlorométhane) et extraits au MeOH fméthanol) Les extraits totaux présentant une activation de TGR5 similaire à celle observée avec le
LCA (utilisé en tant que témoin positif) sur le test luciférase dans les cellules CHO-TGR5 ont d'abord été sélectionnés.
L'isolement du principe actif se poursuit en testant des extraits enrichis soit en molécules hydrophobes (extraction au DCM) , soit en molécules hydrophiles (MeOH). Pour Olea europaea, la majeure partie de l'activité est présente dans l'extrait DCM.
Fractionnement de l'extrait hvdrophobe
Le fractionnement de la fraction hydrophobe de l'extrait d'Olea europaea se poursuit par
HPLC en phase inverse préparative ou par chromatographie sur couche mince. Dix fractions numérotées de 1 à 10 sont obtenues et l'activité luciférase dans les CHO-TGR5 est mesurée avec à titre de contrôle, celle de LCA et celle de l'oleuropéine à des doses de 1,5,
5, 15 et 50 μg/mL.
Comme le montre la figure 10, l'activité n'est présente que dans les fractions 6 à 9. Avec l'oleuropéine à des doses allant de 1,5 à 50 μg/mL, on n'observe aucun effet agoniste sur TGR5. Ces données démontrent que la molécule active contenue dans l'extrait DCM d'Olea europaea est différente de l'oleuropéine.
• Molécule active de la fraction 7
De manière surprenante, la fraction active 7 présente une grande pureté. La détection
UV ne révèle qu'un pic principal avec un temps de rétention de 21,9 minutes (figure 11). L'analyse LC/MS de la fraction 7 permet d'identifier la masse moléculaire de la molécule à 455,3 g/mol. On réalise cette analyse en mode négatif, ce qui signifie qu'il manque un proton hydrogène sur la molécule. On estime donc la masse moléculaire réelle du pic principal détecté aux alentours de 456 à 457 g/mol. L'identification est terminée en analysant la fraction 7 par RMN (figure 12). Le spectre obtenu est caractéristique d'une molécule de type triterpénoïde. Les données analytiques de HPLC, de LC/MS et de RMN combinées avec celles disponibles pour les triterpènes de feuilles d'olivier déjà décrits, amènent à conclure que la molécule de la fraction 7 est l'acide oléanolique. Cette identification est confirmée en réalisant une co-injection en HPLC avec un étalon commercial (Extrasynthèse, Genay, France) et par comparaison du spectre de RMN obtenu avec celui déjà rapporté de l'acide oléanolique [Seebacher et al.]. La valeur de la CE50 obtenue pour l'acide oléanolique dans le test d'activité luciférase TGR5 humain qui est de 1,42 μM, est comparable à la CE50 de 0,89 μM obtenue pour le LCA, ligand naturel de
TGR5.
• Etude de la sélectivité de l'acide oléanolique vis-à-vis de TGR5
Pour exclure toute éventuelle implication du récepteur nucléaire des acides biliaires dans l'explication de l'activité biologique de l'acide oléanolique, on détermine ensuite si l'acide oléanolique active le FXR dans un dosage de gène rapporteur (luciférase) dépendant de FXR. Les résultats obtenus confirment que l'acide oléanolique n'active pas le FXR, ce qui démontre que ce triterpène est un agoniste sélectif de TGR5, le différenciant nettement des acides biliaires, qui activent à la fois TGR5 et FXR.
Exemple 2 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir d'Alchemilla vulgar±s
On prépare des extraits et fractions en opérant comme ci-dessus avec Oleα europαeα.
Les résultats obtenus avec les fractions des extraits DCM sont donnés sur la figure 13.
On constate la très forte réactivité de la fraction 9 dans le test TGR5.
Le profil HPLC de cette fraction est donné sur la figure 14.
La figure 15 rapporte le spectre RMN de l'acide corosolique, qui est la molécule active contenue dans la fraction 9. Exemple 3 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir de Juglans regia
On opère comme indiqué dans l'exemple 1 en rapport avec Olea europaea. Les résultats obtenus avec les fractions des extraits DCM sont donnés sur la figure 16 qui montre la forte activité des fractions 7, 8 et 9. Le profil HPLC du pool de ces fractions est donné sur la figure 17.
Exemple 4 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir tfAgrimonia eupatoria
On opère comme indiqué dans l'exemple 1 en rapport avec Olea europaea. Les résultats obtenus avec 8 fractions des extraits DCM sont donnés sur la figure 18 qui montre la forte activité de la fraction 4. Le profil HPLC de ces fractions est donné sur la figure 19.
Exemple 5 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir de Vaccinium myrtillus
On opère comme indiqué dans l'exemple 1.
Les résultats obtenus sur 9 fractions DCM sont donnés sur la figure 20. L'examen de cette figure montre que les fractions 3, 5, 6, 7, et 8 présentent une activité supérieure à celle de LCA, tout spécialement en ce qui concerne la fraction 6. Le profil HPLC de cette fraction est donné sur la figure 21.
Exemple 6 B : identification d'agonistes de TGR5 à partir d'Obetia radula
On opère comme indiqué dans l'exemple 1.
Les résultats obtenus sur 8 fractions DCM sont donnés sur la figure 22. L'examen de cette figure montre que les fractions 3, 4 et 6, tout spécialement la fraction 6 présentent une activité supérieure à celle du LCA. Le profil HPLC de cette fraction est donné sur la figure 23. Exemple 7 B : étude de l'effet de fractions actives d'extraits de plantes sur la tolérance au glucose chez les souris soumis à un régime gras
L'effet de fractions actives d'extraits de plantes selon l'invention a été évalué dans un modèle murin de syndrome métabolique, à savoir la souris soumise à un régime gras. Des souris C57BL/6 sont nourries soit avec de la nourriture normale et équilibrée, soit avec de la nourriture riche en lipides pendant 10 semaines avant de commencer le traitement par les extraits de plantes. Pendant cette période, les souris sous régime gras présentent une augmentation de 50% de leur poids corporel, accompagnée d'une augmentation similaire de l'apport calorique.
A la fin de la période de traitement (14 jours) avec les fractions de : Olea (OA), Alchemilla (AVA) et Juglans (JRL), les paramètres cliniques donnés dans le tableau 1 ci- dessous sont obtenus.
Tableau 1
Alimentation normale régime gras
Véhicule OA AVA JRL 100 mg/kg 100 mg/kg 100 mg/kg
JO 24,3 ± 0,5 36,1 ± 1 34,5 ± 0,7 34,1 ± 1 ,5 35 ± 1,3
Poids corporel (g) J14 26,3 ± 0,4 38,3 ± 1 ,1 30,4 ± 1 ,4 35 ± 1 ,4 35,9 ± 1 ,3
Prise moyenne d'aliments 7,20 ± 0,29 14,79 ± 0,88 11 ,43 ± 0,98 X X (Kcal/animal/jour)
WAT Epididymal (% Poids corporel) 1 ,73 ± 0,09 5,77 ± 0,27 3,7 ± 0,7* 4,8 ± 0,4* 5,1 ± 0,3
Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM, alimentation normales n=5, Véhicule, OA, AVA, JRL n=8. (* p<0,001) - WAT = tissu adipeux blanc
Une tendance à produire un effet inhibiteur sur la prise de poids corporel est observée, ainsi qu'une nette réduction de la masse des coussinets graisseux de l'épididyme, ce qui indique que les fractions actives affectent le métabolisme énergétique.
On mesurera que, dans ces expériences, une alimentation riche en gras est maintenue pendant 10 semaines avant de commencer le traitement. L'étude porte donc sur la capacité à corriger, plutôt qu'à prévenir, l'apparition d'une surcharge pondérale et d'une résistance à l'insuline. Les résultats de la figure 24 indiquent que ces fractions sont capables d'améliorer l'homéostasie métabolique chez les souris soumises à un régime gras. En particulier, la résistance à l'insuline induite dans ce modèle d'alimentation riche en gras et provoquant un effet pré-diabétique est corrigé: en effet après 14 jours de traitement avec les fractions actives de l'invention, une épreuve d'hyperglycémie provoquée par voie intrapéritonéale (IPGTT) est effectuée. La glycémie moyenne avant l'IPGTT est respectivement de 103 ± 7, 154 ± 5, 144 ± 18, 141 ± 2 et 159 ± 3 mg/dL pour les groupe à alimentation normale, à alimentation riche en lipides, à alimentation riche en lipides + acide oléanolique, à alimentation riche en lipides + acide corosolique, et à alimentation riche en lipides + JRL. Les courbes d'IPGTT montrent clairement que l'administration d'une nourriture riche en gras induit une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline (figure 24). Cette tolérance au glucose est partiellement corrigée lorsque les souris sont traitées avec les fractions actives de plantes.
L'invention fournit ainsi des agonistes de TGR5 hautement spécifiques et puissants et les résultats obtenus montrent la forte activité de ces molécules, correspondant à des fractions pures et/ou enrichies.
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W. Seebacher, N. Simic, R. Weiss, R. Sat, et O. Kunert. Magn. Reson. Chem. 41 (2003) 636-638.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé d'obtention de compositions biologiquement actives, par extraction à partir d'une ou plusieurs plantes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes
a) de traitement, séparément, des plantes sélectionnées par rapport à une activité donnée, ou de parties de ces plantes, avec un ou plusieurs solvants pour obtenir des extraits totaux bruts ou des fractions enrichies en principes actifs, plus spécialement des fractions apolaires et des fractions polaires
b) de sélection d'extraits ou fractions présentant une activité métabolique dans le test MTT et une activité biologique dans au moins un test spécifique de cette activité.
2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, outre les étapes a) et b) définies dans la revendication 1, une étape c), mise en œuvre après l'étape a), et/ou après l'étape b), cette étape c) comprenant l'analyse desdits extraits ou desdites fractions sélectionnées pour déterminer les composants qu'elles renferment et isoler, si souhaité, le ou les composés portant l'essentiel de l'activité biologique.
3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que dans l'étape a), les plantes ou les parties de plantes sont utilisées sous forme de fine poudre, obtenue après broyage et séchage.
4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les parties de plantes sont des feuilles, des écorces, des racines, des parties aériennes, des fruits et des graines.
5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) comprend une ou plusieurs extractions, ces extractions étant réalisées à l'aide de CO2 ou de solvants organiques, notamment un solvant alcoolique ou du cyclohexane ou tout autre solvant apolaire, du dichlorométhane ou du chloroforme, et, plusieurs de ces solvants ou tous ces solvants, pouvant être utilisés successivement pour l'isolement de fractions spécifiques
6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'analyse d'une fraction selon l'étape c) est réalisée par profils HPLC. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les tests biologiques réalisés selon l'étape b) sont des tests pour déterminer une activité antidiabétique, notamment sur la sécrétion d'insuline.
8 - Compositions biologiquement actives, caractérisées en ce qu'il s'agit d'extraits, de fractions susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9 - Compositions selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'il s'agit de composés susceptibles d'être isolés desdits extraits ou fractions.
10 - Compositions selon la revendication 8 ou 9, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à partir de plantes choisies parmi les genres et espèces :
Strychnos myrtoides, Obetia radula, Tréma orientalis, Sclerocarya birrea, Voacanga thouars i Moringa oleifera(= Moringa moringa, Moringa pterygosperma, Guilandina moringa) Âgrimonia eupatoria, Arctium majus (= Lappa major), Aîchemiîîa vulgaris, Phaseolus vulgaris, Vaccinium myrtillus, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Géranium robertianum, Jugions regia, Kalanchoe crenata, Leptodenia madagascariensis, Morus nigra, Olea europaea, Rubus fructicosus, Spathodea campanulata.
11 - Compositions selon la revendication 10, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à partir de plantes choisies parmi les genres: Strychnos, Obetia, Tréma, Sclerocarya, Voacanga, Moringa, Agrimonia, Arctium, Alchemilla, Phaseolus, Vaccinium, Cichorium, Cynara, Géranium, Jugions, Kalanchoe, Leptodenia, Morus, Olea, Rubus, Spathodea.
12 - Compositions selon la revendication 10, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à partir de plantes choisies parmi les familles : Loganiaceae, Urticaceae, Ulmaceae, Anacardiaceae, Apocynaceae, Moringaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Ericaceae, Geraniacaea, Juglandacaea, Crassulaceae, Oleaceae, Bignoniacea.
13 - Compositions selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'il s'agit de fractions purifiées à partir de Tréma orientalis Ulmaceae, Strychnos myrtoides Loganiaceae, Obetia radula Urticaceae, Vaccinium myrtillus Ericaceae, Sclerocarya birrea Anacardiaceae, Agrimonia eupatoria Rosaceae, Alchemilla vulgaris Rosaceae et Olea europaea Oleaceae,
14 - Utilisation des produits susceptibles d'être obtenus à partir de plantes, tels qu'extraits, fractions et/ou molécules comme agonistes spécifiques de TGR5.
15 - Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdits produits sont des extraits de plantes, ou des fractions susceptibles d'être obtenues à partir de ces extraits ou des molécules susceptibles d'être obtenues à partir de ces extraits ou fractions :
- présentant une CE50 supérieure ou égale à celle d'un ligand naturel de TGR5, tel que l'acide lithocholique (LCA),
- n'activant pas le récepteur nucléaire FXR,
- entraînant une réduction de la prise de poids induite par une nourriture grasse chez un modèle murin de syndrome métabolique ainsi qu'une réduction de la masse des coussinets graisseux de l'épididyme dans ce même modèle, - entraînant une amélioration de la tolérance au glucose.
16 - Utilisation selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que les plantes sont choisies dans le groupe comprenant Olea europaea, Alchemilla vulgaris, Jugions regia, Agrimonia eupatoria, Vaccinium myrtillus et Obetia radula.
17 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que les molécules comprennent un triterpène pentacy clique.
18- Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que les molécules comprennent un triterpène pentacyclique de type oléanane, tel que l'acide oléanolique.
19- Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que les molécules comprennent un triterpène pentacyclique de type ursane, tel que l'acide corosolique.
20- Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que les molécules comprennent un triterpène pentacyclique de type lupane. 21 - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins une composition selon Tune quelconque des revendications 8 à 13, ou un agoniste selon l'une quelconque des revendications 14 à 20 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22 - Compositions selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous des formes galéniques pour une administration par voie orale, topique, ou par injection.
23 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de comprimés, tablettes, gélules, granulés, gouttes, sirops, sirops alcooliques pour une administration par voie orale, ou sous forme d'aérosols.
24 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous des formes galéniques pour une administration par voie topique, telles que laits, crèmes, lotions, huiles ou patches.
25 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de solutions injectables par voie intraveineuse, sous- cutanée ou intramusculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables, ou encore de suspensions ou d'émulsions, pour une administration par voie injectable.
26 - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, ou un agoniste selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour le traitement du diabète.
27 - Utilisation des agonistes selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, pour fabriquer des médicaments pour l'homme ou l'animal pour prévenir et/ou traiter des troubles métaboliques, l'obésité et/ou des maladies qui lui sont associées comme le syndrome X (syndrome métabolique), le diabète de type 2.
28 - Utilisation selon la revendication 27, dans laquelle lesdits extraits, ou fractions, ou l'acide corosolique sont mis en œuvre pour prévenir et/ou traiter, le diabète de type 2, l'obésité et/ou le syndrome métabolique. 29 - Utilisation selon la revendication 27, dans laquelle lesdits extraits, ou fractions, ou l'acide oléanolique sont mis en œuvre pour la prévention et/ou le traitement de l'obésité ou du diabète, notamment du diabète de type 2 et/ou le syndrome métabolique
30 - Compléments alimentaires destinés à l'homme ou à l'animal, caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'au moins une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, ou d'un agoniste selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, pour une application en nutraceutique avec un excipient utilisable inerte.
31 - Compléments alimentaires selon la revendication 27, caractérisés en ce qu'ils se présentent sous forme ingérable, de gomme, de poudre, de comprimés, gélules, capsules, infusions, décoctions.
32 - Compléments alimentaires selon la revendication 31 ou 32 caractérisés en ce qu'ils sont incorporés dans l'alimentation durant l'élaboration des aliments ou lors de leur conditionnement, ou en utilisant des préparations déjà formulées avec lesdits produits, permettant d' effectuer la supplémentation désirée.
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