EP2089547A2 - Verfahren zum durchführen einer enzymatischen reaktion - Google Patents

Verfahren zum durchführen einer enzymatischen reaktion

Info

Publication number
EP2089547A2
EP2089547A2 EP07818225A EP07818225A EP2089547A2 EP 2089547 A2 EP2089547 A2 EP 2089547A2 EP 07818225 A EP07818225 A EP 07818225A EP 07818225 A EP07818225 A EP 07818225A EP 2089547 A2 EP2089547 A2 EP 2089547A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
substrate
reaction
eukaryotic cell
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07818225A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Gauer
Wolfgang Mann
Marianna Alunni-Fabbroni
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beckman Coulter Inc
Original Assignee
Olympus Life Science Research Europa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olympus Life Science Research Europa GmbH filed Critical Olympus Life Science Research Europa GmbH
Publication of EP2089547A2 publication Critical patent/EP2089547A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for carrying out an enzymatic reaction, in particular for carrying out a single-cell polymerase chain reaction, and to a substrate, on which one or more eukaryotic cells are provided.
  • enzymatic reactions Due to the sensitivity of enzymes to contaminants such as salt, organic solvents and the like, purified samples must be used in enzymatic reactions to ensure an efficient enzymatic reaction. This also applies in particular to enzymatic reactions in which the substrate of the enzyme is a nucleic acid, for example DNA. Examples of such enzymatic reactions are restriction hydrolyses, ligations and amplification reactions, such as the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • nucleic acid solutions are regularly expressed in terms of the absorption quotient at 260 nm divided by the absorbance at 280 nm and this quotient should be greater than 1.8 for the use of the nucleic acid solutions in enzymatic reactions.
  • heme groups of the hemoglobin of human erythrocytes whose central porphyrin skeleton is suitable for complexing enzymatic cofactors, such as Mg 2+ , and thus suppressing the enzymatic reaction. Due to hemoglobin, PCR or similar amplification reactions from whole blood are not possible.
  • sample preparation usually represents the greatest cost factor of the overall process, since the other steps, namely the performance of the enzymatic reaction and the subsequent detection, can be miniaturized better than the sample preparation, whereby the costs for the aforementioned steps can be reduced.
  • the known methods often give false results.
  • This test is often integrated into the method such that first the cell is labeled, for example, with a fluorescently labeled antibody for a cell membrane surface protein and sorted with a FACS flow cytometer and placed on a glass slide or similar substrate before the glass slide with a microscope is examined for the presence of a cell, and then to carry out the enzymatic reaction after addition of the required buffer and the enzyme.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for carrying out an enzymatic reaction in which it is possible to dispense with extraction of nucleic acids from cells, which is simple and quick to carry out and which in particular also applies when using fewer cells, in particular one cell results in a clear result.
  • this object is achieved by a method according to claim 1 and in particular by a method for carrying out an enzymatic reaction, in particular a PCR, with a sample containing at least one eukaryotic cell, comprising the following steps:
  • step e By first staining the nucleus of the eukaryotic cell (s) to be deposited on a reaction site of the substrate in the method according to the invention and examining the substrate in step e) for nuclear staining or for the presence of at least one stained nucleus, it can be clearly determined whether prior to carrying out the enzymatic reaction, provide DNA to the substrate in a form accessible to the enzyme used in the enzymatic reaction; irrespective of whether the cell was mechanically lysed when it was deposited on the substrate or not. Likewise, this procedure may preclude erroneous results due to any fluorescence artifacts.
  • the process steps b), c) and d) can be carried out in any desired order.
  • the nuclear staining according to method step c) before or after depositing the eukaryotic cell (s) on a reaction site of the substrate according to process step d) and in particular also before or after the removal of at least one eukaryotic cell from the starting material according to process step b) become.
  • the method according to the invention is particularly suitable for carrying out an enzymatic reaction, in particular a PCR, on individual eukaryotic cells or on a few eukaryotic cells.
  • a maximum of 10 eukaryotic cells more preferably between 1 and 5 cells, most preferably between 1 and 3 cells, and most preferably 1 or 2 cells per reaction site of the substrate are deposited.
  • Particularly preferred is the implementation of a single cell reaction, in which case exactly one cell is deposited on a reaction site of the substrate.
  • Erythrocytes for example, have an average cell diameter of 7.5 microns, while granulocytes have a cell diameter between 9 and 16 microns and the cell diameter of lymphocytes, depending on the organism, 5 to 18 microns.
  • bacterial cells have an average cell diameter between 1 and 5 ⁇ m. Assuming an average cell diameter of 10 ⁇ m, the volume of a cell assuming a spherical shape of the cell is 4/3 ⁇ ⁇ ⁇ r 3 , ie approximately 4200 ⁇ m 3 .
  • the ratio of the cell volume to the total reaction volume is about 0.00042%.
  • the above ratio of cell volume to total reaction volume increases to 0.0042% for 10 cells, 0.042% for 100 cells and 0.42% for 1,000 cells. This relationship is shown in FIG. 1.
  • Withdrawal of the individual eukaryotic cell (s) from the starting material according to process step b) can be carried out by any person skilled in the art carried out for this purpose known method.
  • the individual eukaryotic cells can be removed with a glass capillary from a cell suspension which may have been diluted to a suitable value before removal and may contain exclusively eukaryotic cells or a mixture of eukaryotic and prokaryotic cells.
  • the mmi Cellector® from MMI Mobile Machines & Industries AG has proven to be particularly suitable for micromechanical removal of the individual eukaryotic cell (s) from the starting material according to method step b) with a capillary.
  • the absolute number of eukaryotic cells to be deposited per reaction site or discarded eukaryotic cell can be done, for example, microscopically, with a light microscopic or fluorescence microscopic quantification of the absolute number of the eukaryotic cell (s) deposited on a reaction site of the substrate having proven particularly suitable.
  • the method according to the present invention is also not particularly limited with respect to the type of nuclear staining or of the colorant used in process step c). Good results are obtained, in particular, with colorants which are specific for the cell nucleus, ie, in addition to the cell nucleus, they do not or only stain other cell structures to a minor extent. Examples of suitable colorants are those which consist of hematoxylin, alum carmine, alcoholic boraxamine solution, paracarmin, naphthazarin, carmin acetic acid and any combinations thereof are selected.
  • fluorescent dyes have also proven suitable for this purpose, preferably those selected from among 7-amino actinomycin D (7-AAD), acridines orange, BOBO-I, BOBO-3, DAPI nucleic acid stain, dihydroethidium, ethidium bromide, ethidium homodimer - 1, Hexidium iodide, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, LDS 751, Nissl substance, Nuclear yellow, Propidium iodide, SYTO 11, SYTO 13, SYTO 16, SYTOX Green stain, SYTOX Orange, TO-PRO-3, TOTO -3, YO-PRO-1, YOYO-I and any combination thereof.
  • 7-AAD 7-amino actinomycin D
  • acridines orange BOBO-I, BOBO-3
  • DAPI nucleic acid stain dihydroethidium, ethidium bromide,
  • the at least one eukaryotic cell in method step d) is proposed to deposit the at least one eukaryotic cell in method step d) on an inner hydrophilic region of a reaction site of the substrate surrounded by a hydrophobic region.
  • the inner hydrophilic region of the reaction site (s) on the substrate is substantially circular and surrounded by a substantially annular hydrophobic region, preferably concentric, is / are.
  • a particularly preferred arrangement consists of a circular hydrophilic region concentrically surrounded by two circular rings, wherein the inner of the two circular rings is hydrophobic and the outer of the two circular rings is hydrophilic, wherein the outer hydrophilic circular ring is surrounded on the outside by a hydrophobic region.
  • the diameter of the inner hydrophilic region of the reaction site is between 0.3 and 3 mm.
  • the substrate may be a plastic reaction vessel.
  • a microtitre plate as substrate, for example a 96-well, 128-well, 256-well or 528-well microtiter plate.
  • a microscope slide as a substrate, particularly preferably a slide, the surface of which is coated with epoxy and subdivided into individual reaction sites or anchor sites with lithographically produced hydrophilic and hydrophobic areas.
  • Such slides are commercially available, for example, from Advalytix under the trade name AmpliGrid TM.
  • a slide or a microtiter plate used, in particular an AmpliGrid TM which comprises the above-described reaction sites of circular hydrophilic and hydrophobic regions, is particularly suitable as a substrate.
  • the at least one eukaryotic cell in process step d) is preferably in a liquid volume of less than 5 .mu.l, more preferably of less than 2 .mu.l and most preferably less than 1 .mu.l deposited on a reaction site of the substrate.
  • the at least one eukaryotic cell in process step d) in a liquid volume of less than 100 nl, preferably of less than 10 nl and particularly preferably of not more than 1 nl on a reaction site of the substrate.
  • This embodiment ensures that the cells used in the enzymatic reaction contain sufficiently little contaminants which inhibit the enzymatic reaction.
  • the on the Substrate applied cell suspension evaporated to evaporate the liquid surrounding the cells.
  • contaminants present in the liquid such as salts present in the liquid phase of the suspension or any proteases, lipids, nucleases and the like, remain on the substrate. These contaminants can then interfere with the later enzymatic reaction.
  • eukaryotic cell which are not lysed are preferably applied to the substrate. This avoids that before the start of the enzymatic reaction by liberated proteases or nucleases the substrate for the subsequent enzymatic reaction is chemically decomposed.
  • enzymatic reactions such as restriction hydrolyses, ligations or common amplification reactions, in particular PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction) or RCA (rolling circle amplification).
  • the reaction mixture is repeatedly subjected to temperature cycles, each temperature cycle from a Denatursammlungs intimid at 94 ° C for separating the double-stranded DNA into single-stranded DNA, an attachment step usually at a temperature between 40 and 60 0 C for attaching the PCR Primer to the template DNA and an extension step at 72 ° C, at which the Taq polymerase catalyses the incorporation of nucleotides in the primer bound on the template DNA. Since the cells provided on the substrate burst at the initial denaturation step at 94 ° C., the nucleic acid of the cells becomes accessible to the Taq polymerase.
  • depositing the at least one eukaryotic cell on a reaction site of the substrate by passing a liquid suspension containing at least one eukaryotic cell through a nozzle, the liquid flow or stream of the liquid suspension at the nozzle into individual separate liquid droplets is separated, the individual liquid drops each having a containing certain number of eukaryotic cells, all or individual liquid droplets are electrically charged after separation from the nozzle and the individual liquid droplets are passed through an electric field, whereby one or more electrically charged liquid droplets are directed to one or more reaction sites of the substrate before subsequently stored eukaryotic cell enzyme and optionally also reaction buffer is added and finally the enzymatic reaction, for example by adjusting the reaction solution to a suitable temperature, is started.
  • the liquid stream containing the eukaryotic cell (s) at the nozzle By separating the liquid stream containing the eukaryotic cell (s) at the nozzle into individual liquid droplets separated from one another, it can be ensured in a simple manner by adjusting the concentration of the eukaryotic cells in the liquid suspension and by adjusting the size of the individual liquid droplets Liquid drop a predetermined number of eukaryotic cells, for example, exactly one eukaryotic cell per drop of liquid is included.
  • the individual liquid droplets can be separated from one another so that selectively individual liquid droplets or a targeted liquid droplet containing the target cells can be applied to a reaction site of the substrate. For example, if the fluid suspension contains genetically different cells, it is possible to randomly randomly charge a drop of liquid statistically, whereas the other drops of liquid will not be electrically charged.
  • the parameters when guiding the liquid suspension through the nozzle, at the separation of the liquid droplets at the nozzle and in the management of the liquid droplets are set by the electric field that at least one eukaryotic cell in a volume of less than 100 nl, preferably of less than 10 nl and more preferably of not more than 1 nl is deposited on a reaction site of the substrate.
  • the eukaryotic cell (s) are hydrodynamically passed through the nozzle. This can be done, for example, by passing the liquid suspension through a cannula and exiting it via a circular opening and, after emerging from the cannula, focused by a sheath flow of a second fluid and passing through the nozzle located below the cannula opening.
  • the nozzle has an inner diameter between 1 .mu.m and 1 mm. Particularly good results are obtained when the inner diameter of the nozzle is between 10 .mu.m and 500 .mu.m and in particular between 50 .mu.m and 100 .mu.m.
  • each liquid drop of defined and reproducible size contains a predetermined number of eukaryotic cells, for example exactly one eukaryotic cell.
  • the separation of the drops from the nozzle is due to the momentum of the pressure fluctuations supported by gravity.
  • the method according to the invention is suitable both for depositing a specific number of genetically identical eukaryotic cells from, for example, a cell culture medium containing exclusively genetically identical cells, for example cells of a clone, on a reaction site of a substrate as well as for depositing a specific number of genetically identical eukaryotic cells from a mixture of genetically lower - different cells on a substrate.
  • a specific number of genetically different eukaryotic cells from a corresponding cell mixture can also be deposited on the substrate and subjected there to an enzymatic reaction.
  • the first-mentioned process variant can be realized, for example, by virtue of the fact that only genetically identical eukaryotic cells are present in the liquid suspension, the liquid flow at the nozzle is separated into individual liquid droplets so that each liquid droplet contains exactly one eukaryotic cell, and so many liquid droplets be electrically charged as eukaryotic cells are needed on the substrate.
  • the subsequent guidance of the liquid drops through the electric field only the electrically charged drops are deflected and applied to a correspondingly positioned substrate.
  • the corresponding deflection of the electrically charged liquid drops can be effected for example by guiding the liquid drops through a capacitor.
  • the second-mentioned method variant can be realized by genetically different cells, for example eukaryotic cells and prokaryotic cells, being present in the fluid suspension, a single cell or multiple cells being labeled with a fluorescently labeled antibody or a fluorescent dye, the liquid flow at the nozzle separated into individual separate liquid droplets, the individual liquid drops separated from the liquid stream at the nozzle are passed through a laser beam, by which the fluorescence of the individual droplets is measured, then the individual liquid droplets depending on the fluorescence of the cell contained therein ( n) are electrically charged with a certain electrical charge and the individual liquid droplets are passed through an electric field so that the liquid droplets with a vorgeKindle in a vorgeexcellent The area lying electric charge can be directed to the substrate.
  • cells for example eukaryotic cells and prokaryotic cells
  • fluorescently labeled antibodies are preferably used when the genetically distinct cells are cells of different organisms
  • labeling individual cells with a fluorescent dye has been found particularly suitable when the genetically distinct cells are from the same organism.
  • the dye can, for example, be combined with a DNA probe. that is specific to a gene or gene segment of a particular cell type. It is equally possible to use several different fluorescently labeled antibodies or several different fluorescent dyes to label genetically distinct cells each with a specific fluorescently labeled antibody or a specific fluorescent dye. Thus, two or more different cell types can be detected by the laser, these can later be electrically charged and deflected to different substrates.
  • the corresponding selective deflection in the corresponding electric field can be achieved in the case of two different cells to be separated in the electric field, for example, by positively charging the liquid drops of one target type and of negatively charging the liquid drops with the other target type.
  • selective separation can be achieved by providing each of the different different cells with a different amount of electrical charge, for example cell I with an electrical charge of XC, cell II with an electrical charge of 2C. XC, cell III with an electrical charge of 3-XC and so on.
  • the eukaryotic cell (s) are applied to one or more reaction site (s) of the substrate by means of a flow cytometer.
  • FACS fluorescence-activated cell sorters
  • FACS fluorescence activated cell sorters
  • the deposition of the at least one eukaryotic cell on a reaction site of the substrate according to step d) and / or the removal of the eukaryotic cell (s) from the starting material according to process step b) may also be effected by laser microdissection ("laser capture microdissection"; LCM) or laser pressure catapultation (LPC) Suitable devices for the former technology are, for example, the Veritas TM microdissection instrument from Arcturus, which is part of the company Molecular Devices, or Leica LMD6000 of the Leica, while a device suitable for LPC technology is the PALM laser capture microdissection system from PALM in Wolfratshausen.
  • LCM laser capture microdissection
  • LPC laser pressure catapultation
  • At least one AmpliGrid TM as the substrate, wherein the at least one AmpliGrid TM is positioned in a frame, which preferably has a capacity for four different AmpliGrid 1 s TM.
  • a frame may for example be designed as a hollow frame, wherein the individual recesses of the hollow frame each have the shape and size of an AmpliGrid's TM.
  • one or more substrates are preferably used which each have 2 to 1,000, preferably 12 to 256, particularly preferably 24 to 96 and very particularly preferably 48 different reaction sites comprising an inner hydrophilic area, the respective numbers the eukaryotic cell (s) deposited in the process step d) per reaction site are stored on a data carrier, for example a hard disk, during or after method step d).
  • a data carrier for example a hard disk
  • the inventive method is suitable for carrying out an enzymatic reaction using all known eukaryotic cell types.
  • it is suitable for enzymatic reactions of human cells, wherein the method according to the invention has proven particularly suitable for carrying out an enzymatic reaction on erythrocytes, granulocytes, lymphocytes, platelets and cancer cells.
  • Fig. 3a is a plan view of one for carrying out the present invention
  • Invention suitable substrate according to an embodiment and Fig. 3b is a reaction point of the substrate shown in Fig. 3a.
  • FIG. 1 shows the dependence of the ratio of the ratio of the cell volume per reaction volume on the number of cells used for cells with a diameter of 10 ⁇ m and at a reaction volume of 1 ⁇ l. Assuming a spherical cell shape results for a cell with a cell diameter of 10 microns, a cell volume of about 4200 microns. 3 Since a reaction volume of 1 ⁇ l corresponds to 10 9 ⁇ m 3 , the ratio of cell volume to reaction volume for a cell proportioned as above in a standard PCR reaction volume of 1 ⁇ l is about 0.004%. If the reaction mixture contains more than one cell, this ratio increases proportionally with the number of cells used. When ten cells are used, the corresponding ratio is already 0.004% in the aforementioned case and even 0.4% when 1,000 cells are used. Since the cells next to the substrate for the Taq
  • Polymerase-serving DNA containing further components, such as proteins, lipids and the like, which can inhibit the Taq polymerase means a greater ratio of cell volume to reaction volume and the increasing risk that the PCR is inhibited or at least not optimal. For this reason, it is preferable to deposit a maximum of 10 eukaryotic cells on a reaction site of the substrate in the method according to the invention. Particularly good results are obtained when a maximum of 5 eukaryotic cells and in particular a maximum of 3 eukaryotic cells are deposited on a reaction site of the substrate. Best results are obtained when exactly one cell is deposited on a reaction site of the substrate.
  • the device shown in FIG. 2 consists of a housing 1 in which a chamber 2 for a liquid jacket stream is located. Furthermore, the device has a cannula 3 for passing a cell Suspension, ie a suspension of cells in liquid on.
  • the chamber 2 for the sheath flow tapers down to a nozzle 4.
  • a piezoceramic 5 is provided which can exert periodic pressure fluctuations on the nozzle 4.
  • the device comprises a laser source (not shown), which generates a laser beam 6 below the nozzle 4.
  • a laser source (not shown), which generates a laser beam 6 below the nozzle 4.
  • baffles 7 are provided, to which for the purpose of generating an electric field between the baffles 7, an electrical voltage can be applied.
  • a cell suspension having a predetermined cell concentration for example a suspension of cells in cell culture medium
  • a cell suspension having a predetermined cell concentration is guided via the cannula 3 into the device and guided into the chamber 2 via an outlet 8.
  • sheath liquid is passed through the inlet 9 at a high pressure in the chamber 2 and flowed through it. Due to the pressure of the jacket liquid, the liquid jet emerging from the outlet 8 is hydrodynamically focused and guided to the nozzle 4.
  • a piezoelectric modulation is applied to the nozzle 4, through which the nozzle 4 is exposed to periodic pressure fluctuations. Due to these pressure fluctuations, individual liquid drops 10 are separated from the liquid jet at the nozzle 4. Thereafter, the drops 10 fall down by gravity and pass through the laser beam 6 through which any fluorescently labeled antibodies bound to the cell membrane or fluorescent dyes incorporated into the cells can be detected. Before passing or after passing the laser beam 6, the individual liquid Droplet 10 by means of a corresponding device (not shown) selectively or electrically charged differently.
  • individual liquid droplets 10 receive an electric charge while other liquid droplets 10 remain electrically neutral, or individual liquid droplets 10 receive a positive electrical charge, whereas the remaining liquid droplets 10 receive a negative electrical charge, or the individual liquid droplets 10 each receive a different amount
  • the amount of electrical charge applied per liquid drop 10 is proportional to the intensity of the fluorescence per liquid drop 10 detected by the laser beam.
  • the individual liquid droplets 10 are passed through an electric field generated by deflecting plates 7, in which electrically charged liquid droplets 10 are deflected.
  • a substrate 11 in the form of a slide, which is arranged so that liquid droplets 10 are deflected with a certain electrical charge to a reaction point 12 of this substrate 11.
  • the parameters when guiding the liquid suspension through the nozzle 4, when separating the liquid droplets 10 from the nozzle 4 and when guiding the liquid droplets 10 through the electric field, are adjusted so that the eukaryotic cell (n ) no longer have any surrounding fluid or at least largely no extracellular fluid.
  • the substrate 11 shown in FIG. 3a is rectangular and has a total of 48 reaction sites 12, which are distributed over 6 rows arranged one below the other with 8 reaction sites 12 each.
  • each reaction point 12 has an inner or central, hydrophilic area 13 of circular design.
  • This inner hydrophilic region 13 is surrounded on the outside concentrically by an annular (inner) hydrophobic region 14, which in turn is surrounded concentrically on the outside by an annular (central) hydrophilic region 15.
  • the (middle) hydrophilic region 15 is surrounded on the outside by an (outer) hydrophobic region 16.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion, insbesondere zum Durchführen einer PCR, umfasst die Entnahme wenigstens einer Eukaryontenzelle aus einem Ausgangsmaterial, das Anfärben des Zellkerns bzw. der Zellkerne der Eukaryontenzelle(n), das Ablegen wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle eines festen Substrats in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 μl, das Detektieren, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf einer Reaktionsstelle des Substrats vorliegt, die anschließende Zugabe von Enzym und gegebenenfalls Reaktionspuffer zu der/ den Eukaryontenzelle(n) sowie abschließend den Start der enzymatischen Reaktion. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz eines Durchflusszytometers durchgeführt.

Description

Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion, insbesondere zum Durchführen einer Einzelzell- Polymerase-Kettenreaktion, sowie ein Substrat, auf dem eine oder mehrere Eukaryontenzellen vorgesehen sind.
Aufgrund der Empfindlichkeit von Enzymen gegenüber Kontaminanten, wie Salz, organischen Lösemitteln und dergleichen, müssen in enzymatischen Reaktionen aufgereinigte Proben eingesetzt werden, um einen effektiven Ablauf der enzymatischen Reaktion zu gewährleisten. Dies gilt ins- besondere auch für enzymatische Reaktionen, bei denen das Substrat des Enzyms eine Nukleinsäure, beispielsweise DNA, ist. Beispiele für solche enzymatische Reaktionen sind Restriktionshydrolysen, Ligationen und Amplifikationsreaktionen, wie beispielsweise die Polymerase-Ketten- reaktion (PCR).
Um für eine enzymatische Reaktion DNA mit einer hinreichenden Reinheit herzustellen, sind eine Reihe von Verfahren bekannt. Zudem werden eine Vielzahl an entsprechenden Kits zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, wie beispielsweise das QIAamp® DNA Blood Kit zur Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut, kommerziell angeboten. Ziel dieser Verfahren und Kits ist es, eine spätere enzymatische Reaktion störende Zellbestandteile, wie Lipide, Proteine - beispielsweise DNA- Nukleasen - und dergleichen, von der DNA abzutrennen. Die Reinheit von Nukleinsäurelösungen wird regelmäßig über den Quotienten der Absorpti- on bei 260 nm geteilt durch die Absorption bei 280 nm ausgedrückt und dieser Quotient sollte für den Einsatz der Nukleinsäurelösungen in enzy- matischen Reaktionen größer als 1,8 sein. Weitere, enzymatische Reaktionen inhibierende Kontaminanten neben Proteinen, Salzen und organischen Lösungsmitteln sind beispielsweise die Häm-Gruppen des Hämog- lobins menschlicher Erythrozyten, deren zentrales Porphyringerüst geeignet ist, enzymatische Cofaktoren, wie Mg2+, zu komplexieren und damit die enzymatische Reaktion zu unterbinden. Aufgrund des Hämoglobins sind eine PCR oder ähnliche Amplifϊkationsreaktionen aus Vollblut nicht möglich.
Aus den vorgenannten Gründen gliedert sich die klassische molekularbiologische Diagnostik bzw. Humangenetik heute in die Bereiche Probenvorbereitung, nämlich regelmäßig Extraktion der Nukleinsäuren aus Zellen, Durchführen der enzymatischen Reaktion, beispielsweise Amplifikation, wie PCR, sowie Detektion, welche beispielsweise über Fluoreszenz erfolgt. Wirtschaftlich gesehen stellt die Probenvorbereitung meist den größten Kostenfaktor des Gesamtverfahrens dar, da die anderen Schritte, nämlich die Durchführung der enzymatischen Reaktion sowie die anschließende Detektion, besser als die Probenvorbereitung miniaturisierbar sind, wo- durch die Kosten für die vorgenannten Schritte reduziert werden können.
In jüngerer Zeit wurden auch Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen vorgeschlagen, in denen als Enzymsubstrat anstelle von isolierter und aufgereinigter Nukleinsäure einzelne Zellen eingesetzt werden. Dies hat den Vorteil, dass auf eine kostenträchtige Probenvorbereitung verzichtet werden kann. Da eine einzelne Zelle das ganze Genom eines Organismus enthält, reichen wenige Zellen oder theoretisch gar eine einzige Zelle aus, um eine enzymatische Reaktion durchzuführen. Diese Verfahren führen jedoch nur in etwa 50 % der Fälle zu einem positiven Er- gebnis, d.h. in etwa der Hälfte aller Fälle findet die enzymatische Reaktion nicht statt. Dies liegt in einer Vielzahl der Fälle darin begründet, dass bei der Isolierung der einzelnen Zelle häufig signifikante Mengen an Kontami- nanten in der Probe verbleiben, welche die nachfolgende Enzymreaktion inhibieren.
Ein weiteres, in der Praxis bei an Einzelzellen durchgeführten enzymati- schen Reaktionen auftretendes Problem sind falsch negative Ergebnisse. Bei einer an Einzelzellen durchgeführten enzymatischen Reaktion muss vor der Durchführung der Reaktion geprüft werden, ob in dem Reaktions- gefäß eine Zelle in einer für die Enzymreaktion zugänglichen Form vorliegt, um in dem Fall, dass in der Enzymreaktion, bspw. einer PCR, kein Reaktionsprodukt, bspw. kein PCR-Produkt, erhalten wird, eindeutig folgern zu können, dass in der DNA der vorgelegten Zelle keine Bindungsstellen für die in der PCR eingesetzten Primer vorhanden sind. Wird diese Prüfung nicht vorgenommen, kann das Fehlschlagen der PCR auch darin begründet liegen, dass aufgrund von Präparationsfehlern in dem Reaktionsgefäß keine Zelle abgelegt wurde. Allerdings kommt es bei den bekannten Verfahren, selbst wenn vor der Durchführung der enzymatischen Reaktion geprüft wird, ob in dem Reaktionsgefäß eine Zelle vorliegt, oft zu falschen Ergebnissen. Diese Prüfung wird häufig so in das Verfahren integriert, dass zunächst die Zelle bspw. mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper für ein Oberflächenprotein der Zellmembran markiert und mit einem FACS-Durchflusszytometer sortiert und auf einem Glasträger oder einem ähnlichen Substrat abgelegt wird, bevor der Glasträger mit einem Mikroskop bezüglich des Vorliegens einer Zelle untersucht wird, um anschließend nach Zugabe der erforderlichen Puffer und des Enzyms die enzymatische Reaktion durchzuführen.
Allerdings kommt es bei dieser Vorgehensweise, wie man durch Kontroll- proben feststellen kann, häufig vor, dass man unter dem Mikroskop Fluo- reszenz detektiert, aber eine nachfolgende PCR negativ verläuft, obwohl die in der PCR eingesetzten Primer definitiv zu der in der Zelle enthaltenden Nukleinsäure kompatibel sind, d.h. die Nukleinsäure Bindungsstellen für die in der PCR eingesetzten Primer aufweist. Ursache für dieses falsche Ergebnis sind in diesem Fall Fluoreszenzartefakte, die sich bspw. aufgrund des Zusammenlagerns von Antikörpern gebildet haben, ohne dass auf dem Substrat eine Zelle abgelegt wurde. Der Anwender wäre in diesem Fall also zu dem falschen Ergebnis gelangt, dass die Zelle keine zu den eingesetzten Prümern kompatible DNA enthält, obwohl das fehlende PCR- Produkt lediglich darauf zurückzuführen ist, dass auf dem Substrat keine Zelle abgelegt wurde.
Oftmals wird bei der vorgenannten Vorgehensweise unter dem Mikroskop auch keine Fluoreszenz detektiert (woraus fälschlicherweise zu folgern wäre, dass auf dem Substrat keine Zelle abgelegt wurde), obgleich in einer nachfolgenden PCR PCR-Produkte erhalten werden. Dieses falsche Ergebnis ist in den häufigsten Fällen darauf zurückzuführen, dass die Zelle beim Auftreffen auf das Substrat mechanisch zerstört wurde und daher unter dem Mikroskop nicht mehr zu erkennen war, obgleich die DNA der eingesetzten, nunmehr zerstörten Zelle auf dem Substrat in einer für die nachfolgende PCR zugänglichen Form vorlag.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion bereitzustellen, bei dem auf eine Extraktion von Nukleinsäuren aus Zellen verzichtet werden kann, welches einfach und schnell durchzuführen ist und welches insbesondere auch bei Einsatz weniger Zellen, insbesondere einer Zelle, zu einem eindeutigen Ergebnis führt. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 und insbesondere durch ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion, insbesondere einer PCR, mit einer wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Probe umfassend die nach- folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Ausgangsmaterials, b) Entnahme von wenigstens einer Eukaryontenzelle aus dem Aus- gangsmaterial, c) Anfärben des Zellkerns bzw. der Zellkerne der Eukaryonten- zelle(n), d) Ablegen wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle eines festen Substrats in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 μl, e) Detektieren, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf einer Reaktionsstelle des Substrat vorliegt, sowie f) Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf dem Substrat,
wobei der Verfahrensschritt e) nach den Verfahrensschritten c) und d) durchgeführt wird.
Indem in dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst der Zellkern der auf einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegenden Eukaryontenzelle (n) gefärbt wird und das Substrat in dem Verfahrensschritt e) auf Zellkernfärbung bzw. auf das Vorliegen wenigstens eines gefärbten Zellkerns untersucht wird, kann eindeutig festgestellt werden, ob auf dem Substrat vor der Durchführung der enzymatischen Reaktion DNA in einer für das in der enzymatischen Reaktion eingesetzte Enzym zugänglichen Form vor- liegt, und zwar unabhängig davon, ob die Zelle beim Ablegen auf das Substrat mechanisch lysiert wurde oder nicht. Gleichermaßen können durch diesen Verfahrensschritt falsche Ergebnisse aufgrund etwaiger Fluoreszenzartefakte ausgeschlossen werden. Mithin werden durch das erfin- dungsgemäße Verfahren die vorstehend beschriebenen, bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren auftretenden Fälle von falsch positiven Ergebnissen zuverlässig ausgeschlossen, so dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eindeutige Ergebnisse erhalten werden. Zudem kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, indem ein oder mehrere Eukaryontenzellen, welche das gesamte genetische Material eines Organismus aufweisen, eingesetzt werden, auf eine zeitaufwendige und kostenintensive Extraktion von Nukleinsäuren aus den Zellen verzichtet werden.
Erfindungsgemäß können die Verfahrensschritte b), c) und d) in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden. Insbesondere kann die Kernfärbung gemäß Verfahrensschritt c) vor oder nach dem Ablegen der Euka- ryontenzelle(n) auf einer Reaktionsstelle des Substrats gemäß Verfahrensschritt d) und insbesondere auch vor oder nach der Entnahme wenigstens einer Eukaryontenzelle aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrens- schritt b) durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für die Durchführung einer enzymatischen Reaktion, insbesondere einer PCR, an einzelnen Eukaryontenzellen oder wenigen Eukaryontenzellen. Vorzugsweise werden bei dem Verfahrensschritt d) maximal 10 Eukaryontenzellen, besonders bevorzugt zwischen 1 und 5 Zellen, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 3 Zellen und höchst bevorzugt 1 oder 2 Zellen pro Reaktionsstelle des Substrats abgelegt. Insbesondere bevorzugt ist die Durchführung einer Einzelzellreaktion, wobei in diesem Fall genau eine Zelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wird. Durch den Einsatz we- niger Eukaryontenzelle in der enzymatischen Reaktion wird gewährleistet, dass nur minimale Mengen der in der intrazellulären Flüssigkeit vorliegenden Kontaminanten auf das Substrat gelangen, auf dem später die enzymatische Reaktion stattfindet. Dies sei an dem nachfolgenden Re- chenbeispiel verdeutlicht. Menschliche Zellen oder grundsätzlich Säugetierzellen weisen Größenunterschiede auf. Erythrozyten beispielsweise haben einen durchschnittlichen Zelldurchmesser von 7,5 μm, während Granulozyten einen Zelldurchmesser zwischen 9 und 16 μm aufweisen und der Zelldurchmesser bei Lymphozyten, je nach Organismus, 5 bis 18 μm beträgt. Bakterienzellen hingegen weisen einen durchschnittlichen Zelldurchmesser zwischen 1 und 5 μm auf. Ausgehend von einem durchschnittlichen Zelldurchmesser von 10 μm beträgt das Volumen einer Zelle unter Annahme einer Kugelform der Zelle 4/3 • π • r3, also ca. 4200 μm3. Wird demnach eine Zelle in einer PCR mit einem Standardreaktionsvolu- men von 1 μl entsprechend 109 μm3 eingesetzt, beträgt das Verhältnis des Zellvolumens zu dem gesamten Reaktionsvolumen etwa 0,00042 %. Werden hingegen in demselben Reaktionsvolumen 10, 100 oder gar 1.000 Zellen eingesetzt, vergrößert sich das vorgenannte Verhältnis von Zellvolumen zu dem gesamten Reaktionsvolumen auf 0,0042 % für 10 Zellen, auf 0,042 % für 100 Zellen und 0,42 % für 1.000 Zellen. Dieser Zusammenhang ist in der Fig. 1 dargestellt. Da Zellen neben den Nukleinsäuren, welche das spätere Substrat für die enzymatische Reaktion sind, hauptsächlich aus potentiell die enzymatische Reaktion störenden Kontaminanten, wie Proteinen, Lipiden und dergleichen, bestehen, wird durch die Reduktion des Quotienten von Zellvolumen zu Reaktionsvolumen der Anteil der in den Zellen intrazellulär vorliegenden und in die enzymatische Reaktion eingebrachten Kontaminanten drastisch abgesenkt.
Die Entnahme der einzelnen Eukaryontenzelle (n) aus dem Ausgangs- material gemäß Verfahrensschritt b) kann mit jedem dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren erfolgen. Beispielsweise können die einzelnen Eukaryontenzellen mit einer Glaskapillare aus einer Zellsuspension, welche ggf. vor der Entnahme auf einen geeigneten Wert verdünnt wurde und ausschließlich Eukaryontenzellen oder eine Mischung von Eukaryontenzen und Prokaryontenzellen enthalten kann, entnommen werden. Beispielsweise hat sich der mmi Cellector® der Firma MMI MoIe- cular Machines & Industries AG für die mikromechanische Entnahme der einzelnen Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) mit einer Kapillare als besonders geeignet erwiesen.
Um in dem Verfahrensschritt d) die Anzahl der auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegten Eukaryontenzellen kontrollieren bzw. steuern zu können, wird vor oder während des Ablegens der wenigstens einen Euka- ryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats vorzugsweise die absolute Anzahl der pro Reaktionsstelle abzulegenden bzw. abgelegten Euka- ryontenzelle(n) bestimmt. Dies kann beispielsweise mikroskopisch erfolgen, wobei sich insbesondere eine lichtmikroskopische oder fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung der absoluten Anzahl der auf einer Reak- tionsstelle des Substrats abgelegten Eurkaryontenzelle(n) als besonders geeignet erwiesen hat.
Auch bezüglich der Art der Zellkernfärbung bzw. des eingesetzten Färbemittels in Verfahrensschritt c) ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht besonders beschränkt. Gute Ergebnisse werden insbesondere mit Färbemitteln erhalten, welche für den Zellkern spezifisch sind, also neben dem Zellkern andere Zellstrukturen gar nicht oder nur in einem untergeordneten Ausmaß anfärben. Beispiele für geeignete Färbemittel sind solche, welche aus der aus Hämatoxylin, Alaunkarmin, alkoho- lische Boraxaminlösung, Parakarmin, Naphthazarin, Karminessigsäure und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Insbesondere haben sich für diesen Zweck auch Fluoreszenzfarbstoffe bewährt, vorzugsweise solche ausgewählt aus der aus 7-Amino- actinomycin D (7-AAD), Acridine orange, BOBO-I, BOBO-3, DAPI Nucleic Acid Stain, Dihydroethidium, Ethidiumbromid, Ethidium Homodimer- 1 , Hexidiumiodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, LDS 751, Nissl substance, Nuclear yellow, Propidiumiodid, SYTO 11, SYTO 13, SY- TO 16, SYTOX Green stain, SYTOX Orange, TO-PRO-3, TOTO-3, YO-PRO- 1, YOYO-I und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) auf einen, von einem hydrophoben Bereich umgebenen, inneren hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegen. Durch die Ablage wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einem von einem hydrophoben Bereich umgebenen hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle eines Substrats wird die Ausbildung eines aus der an der wenigstens einen Eukaryontenzelle haftenden oder aus der der wenigstens einen Eukaryontenzelle nach dem Ablegen auf der Reaktionsstelle zugefügten Flüssigkeit gebildeten Flüssig- keitstropfens ermöglicht, der vergleichsweise fest an dem Substrat haftet, so dass die nachfolgende Enzymreaktion direkt auf der Reaktionsstelle durchgeführt werden kann, ohne dass die Eukaryontenzelle in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen überführt werden muss. Dadurch werden zum einen arbeits- und zeitaufwendige Transferschritte vermieden. Ferner wird dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat umfassend eine entsprechende Anzahl an voneinander räumlich getrennten hydrophilen Reaktionsstellen mehrere Proben parallel aufbereitet werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden Flüssigkeitstropfen bei geringfügigen Erschütterungen oder aufgrund des Verlaufene von Flüssigkeitstropfen infolge zu hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen.
Zudem hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der innere hydrophile Bereich der Reaktionsstelle(n) auf dem Substrat im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet und von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich, vorzugsweise konzentrisch, umgeben ist/ sind.
Eine noch bessere Ausbildung von Flüssigkeitstropfen auf dem Substrat wird erreicht, wenn der den inneren hydrophilen Bereich der Reaktionsstelle umgebende hydrophobe Bereich auf dem Substrat außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, welcher vorzugsweise im Wesentlichen kreisringförmig ist und den hydrophoben Bereich, besonders bevorzugt, konzentrisch, umgibt. Bevorzugt ist auch der mittlere hydrophile Kreisring außenseitig von einem äußeren hydrophoben Bereich umgeben. Somit besteht eine besonders bevorzugte Anordnung aus einem von zwei Kreisringen konzentrisch umgebenen kreisförmigen hydrophilen Bereich, wobei der innere der beiden Kreisringe hydrophob und der äußere der beiden Kreisringe hydrophil ist, wobei der äußere hydrophile Kreis- ring außenseitig von einem hydrophoben Bereich umgeben ist.
Besonders gute Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn die Hyd- rophilie des inneren hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle und die Hydrophobie des diesen umgebenden Bereichs derart eingestellt werden, dass sich bei Auftrag von weniger 10 μl Wasser auf die Reaktionsstelle ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet. Dadurch wird gewährleistet, dass sich ein stabiler Flüssigkeitstropfen ausbildet, der fest an der Reaktionsstelle haftet, so dass sich der Flüssigkeitstropfen nicht schon bei geringsten Vibrationen des Substrats, wie diese etwa beim Transport des Substrats beispielsweise innerhalb eines Labors vorkommen, von der Glasplatte löst oder auf der Glasplatte verläuft.
Vorzugsweise beträgt der Durchmesser des inneren hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle, sofern dieser, wie dies bevorzugt ist, im Wesentlichen kreisförmig ausgestaltet ist, zwischen 0,3 und 3 mm.
Um das parallele Aufbereiten mehrerer Proben zu ermöglichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, auf dem Substrat 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils im Wesentlichen kreisförmige innere hydrophile Bereiche umfassende Reaktionsstellen vorzusehen, wobei die inneren hydrophilen Bereiche jeweils konzentrisch von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich umgeben sind, welcher außenseitig von einem im Wesentlichen kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, an den sich außenseitig vorzugsweise wiederum ein äußerer hydrophober Bereich anschließt.
Bezüglich der Art des eingesetzten Substrats ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert. Beispielsweise kann es sich bei dem Substrat um ein Reaktionsgefäß aus Kunststoff handeln. Ebenso gut ist es jedoch möglich, als Substrat eine Mikro titerplatte, beispielsweise eine 96-well, 128-well, 256-well oder 528-well Mikro titerplatte, einzusetzen. Alternativ dazu hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als Substrat einen Objektträger vorzusehen, besonders bevorzugt einen Objektträger, dessen Oberfläche mit Epoxy beschichtet und mit lithographisch herstellten hydrophilen und hydrophoben Bereichen in einzelne Reaktionsstellen bzw. Ankerplätze unterteilt ist. Solche Objektträger werden beispielsweise von der Firma Advalytix unter dem Handelsnamen AmpliGrid™ kommerziell vertrieben. Vorzugsweise wird als Substrat ein Objektträger oder eine Mikro titerplatte eingesetzt, wobei insbesondere ein AmpliGrid™, welcher die zuvor beschriebenen Reaktionsstellen aus kreisförmigen hydrophilen und hydrophoben Bereichen umfasst, als Substrat besonders geeignet ist.
Um die Menge etwaiger aus der Probenpräparation stammender Kontami- nanten, welche die nachfolgende enzymatische Reaktion stören könnten, auf dem Träger zu minimieren, wird die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) vorzugsweise in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 5 μl, besonders bevorzugt von weniger als 2 μl und ganz be- sonders bevorzugt von weniger als 1 μl auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt.
Aus dem gleichen Grund ist es insbesondere bevorzugt, die wenigstens eine Eukaryontenzelle in dem Verfahrensschritt d) in einem Flüssigkeits- volumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegen. Diese Ausführungsform gewährleistet, dass die in der enzymatischen Reaktion eingesetzten Zellen hinreichend wenig, die enzymatische Reaktion inhibierende Kontaminanten enthalten. Dies ist ein weiterer, besonderer Vorteil gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Einzelzellverfahren, bei denen die Isolierung einzelner Zellen üblicherweise durch Entnahme einer Teilmenge einer Suspension von Zellen in Zellmedium erfolgt, wonach die Teilmenge auf ein Substrat, auf dem bzw. in dem die spätere enzymatische Reaktion stattfinden soll, auf- getragen wird. Zur Durchführung der enzymatischen Reaktion muss der Teilmenge der Suspension noch Enzym sowie Reaktionspuffer zugegeben werden, um die für die enzymatische Reaktion optimalen Salzbedingungen und den optimalen pH-Wert einzustellen. Um das Reaktionsvolumen der enzymatischen Reaktion möglichst klein zu halten, wird bei einigen Ver- fahren vor Zugabe des Enzyms und des Reaktionspuffers die auf dem Substrat aufgetragene Zellsuspension eingedampft, um die die Zellen umgebende Flüssigkeit zu verdampfen. Dabei verdampft jedoch nur die die Zellen umgebende Flüssigkeit, wohingegen in der Flüssigkeit vorhandene Kontaminanten, wie in der Flüssigphase der Suspension vorhandene Salze oder etwaige Proteasen, Lipide, Nukleasen und dergleichen, auf dem Substrat verbleiben. Diese Kontaminanten können dann die spätere enzymati- sche Reaktion stören. Dieses Problem wird bei der vorgenannten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf einfache Weisen gelöst, da die Zellen bereits weitestgehend ohne zusätzliche bzw. extrazelluläre Flüssig- keit auf eine Reaktionsstelle des Substrats aufgegeben werden, so dass die enzymatische Reaktion in einem minimalen Reaktionsvolumen durchgeführt werden kann, ohne dass überflüssige extrazellulär vorliegende Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfung entfernt werden muss. Indem die Zellen keine oder nur minimale Mengen an extrazellulärer Flüssigkeit aufweisen, wird die Anzahl an in dem späteren Reaktionsvolumen vorliegenden Kontaminanten auf ein Minimum, nämlich die Menge der in den Zellen selbst vorliegenden Kontaminanten, beschränkt. Zudem kann auf vorherige zeitaufwändige Waschschritte verzichtet werden, da die Zellen aufgrund der allenfalls minimalen Menge an extrazellulärer Flüssigkeit bereits in reiner Form auf das Substrat aufgegeben werden. Insgesamt ergibt sich somit ein einfaches, kostengünstiges und schnelles Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei dem sichergestellt ist, dass die enzymatische Reaktion effizient abläuft.
Um eine etwaige Zersetzung der als Substrat für die enzymatische Reaktion dienenden Zellbestandteile, insbesondere Nukleinsäuren, vor der Zugabe des Enzyms zu vermeiden, werden vorzugsweise auf das Substrat Eukaryontenzelle(n) aufgegeben, die nicht-lysiert sind. So wird vermieden, dass vor Beginn der enzymatischen Reaktion durch freigesetzte Proteasen oder Nukleasen das Substrat für die spätere enzymatische Reaktion chemisch zersetzt wird.
Bezüglich der Art der enzymatischen Reaktion ist die vorliegende Erfin- düng nicht beschränkt. Lediglich beispielsweise seien enzymatische Reaktionen, wie Restriktionshydrolysen, Ligationen oder gängige Amplifikati- onsreaktionen, insbesondere PCR (Polymerase-Kettenreaktion), LCR (Liga- se-Kettenreaktion) oder RCA (Rolling-Circle-Amplifikation), genannt. Bei einer PCR wird die Reaktionsmischung wiederholt Temperaturzyklen un- terworfen, wobei jeder Temperaturzyklus aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C zum Auftrennen der Doppelstrang-DNA in Einzelstrang-DNA, einem Anlagerungsschritt üblicherweise bei einer Temperatur zwischen 40 und 600C zur Anlagerung der PCR-Primer an die Matrizen-DNA und einem Verlängerungsschritt bei 72°C, bei dem die Taq-Polymerase den Einbau von Nukleotiden in den auf der Matrizen-DNA gebundenen Primer katalysiert, besteht. Da durch den initialen Denaturierungsschritt bei 940C die auf dem Substrat vorgesehenen Zellen platzen, wird die Nukleinsäure der Zellen für die Taq-Polymerase zugänglich.
Zum Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten Verfahren eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats dadurch, dass eine wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltende Flüssigkeitssuspension durch eine Düse geführt wird, der Flüssigkeitsstrom bzw. Strom der Flüssigkeitssuspension an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, wobei die einzelnen Flüssigkeitstropfen jeweils eine vor- bestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen enthalten, alle oder einzelne Flüssigkeitstropfen nach der Abtrennung von der Düse elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen durch ein elektrisches Feld geführt werden, wodurch ein oder mehrere elektrisch aufgeladene Flüssigkeitstropfen auf eine oder mehrere Reaktionsstellen des Substrats gelenkt werden, bevor anschließend den abgelegten Eukaryontenzellen Enzym und gegebenenfalls ebenfalls Reaktionspuffer zugegeben wird und abschließend die enzymatische Reaktion, beispielsweise durch Einstellen der Reaktionslösung auf eine geeignete Temperatur, gestartet wird. Indem der die Eukaryontenzelle(n) enthaltende Flüssigkeitsstrom an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, kann durch Einstellung der Konzentration der Eukaryontenzellen in der Flüssigkeitssuspension und durch Einstellung der Größe der einzelnen Flüssigkeitstropfen auf einfache Art und Weise gewährleistet werden, dass in den einzelnen Flüssigkeitstropfen eine vorbestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen, beispielsweise genau eine Eukaryontenzelle pro Flüssigkeitstropfen, enthalten ist. Durch elektrisches Aufladen einzelner Flüssigkeitstropfen nach der Abtrennung von der Düse und anschließendes Führen durch ein elektrisches Feld können die einzelnen Flüssigkeitstropfen von- einander getrennt werden, so dass selektiv einzelne Flüssigkeitstropfen oder ein gezielter Flüssigkeitstropfen enthaltend die Zielzellen auf einer Reaktionsstelle des Substrats aufgebracht werden können. Wenn die Flüssigkeitssuspension genetisch unterschiedliche Zellen enthält, ist es beispielsweise möglich, statistisch willkürlich einen Flüssigkeitstropfen elektrisch aufzuladen, wohingegen die anderen Flüssigkeits tropfen nicht elektrisch aufgeladen werden.
Werden die einzelnen Flüssigkeitstropfen anschließend durch das elektrische Feld geführt, wird nur der elektrisch aufgeladene Tropfen abgelenkt und auf das entsprechend positionierte Substrat aufgebracht. Aufgrund der Ablenkung durch das elektrische Feld und insbesondere durch die Geschwindigkeiten der Flüssigkeitstropfen wird gewährleistet, dass die Eukaryontenzelle(n), wenn diese auf das Substrat auftreffen, weitestge- hend keine extrazelluläre Flüssigkeit mehr enthalten. Vorzugsweise wer- den die Parameter beim Führen der Flüssigkeitssuspension durch die Düse, bei der Auftrennung der Flüssigkeits tropfen an der Düse und bei der Führung der Flüssigkeitstropfen durch das elektrische Feld so eingestellt, dass wenigstens eine Eukaryontenzelle in einem Volumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wird.
Vorzugsweise werden die Eukaryontenzelle(n) hydrodynamisch durch die Düse geführt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Flüssigkeitssuspension durch eine Kanüle geführt wird und aus dieser über eine kreisförmige Öffnung austritt und nach dem Austreten aus der Kanüle durch einen Mantelstrom einer zweiten Flüssigkeit fokussiert und durch die unterhalb der Kanülenöffnung angeordnete Düse geführt wird.
Um eine gute Auftrennung der einzelnen Flüssigkeitstropfen zu erreichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, dass die Düse einen Innendurchmesser zwischen 1 μm und 1 mm aufweist. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn der Innendurchmesser der Düse zwischen 10 μm und 500 μm und insbesondere zwischen 50 μm und 100 μm beträgt.
Zur Auftrennung der Flüssigkeitssuspension an der Düse in einzelne Tropfen können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren eingesetzt werden. Lediglich beispielsweise sei die Auftrennung der Flüssigkeitssuspension an der Düse durch piezoelektrische Modulation genannt. Bei der piezoelektrischen Modulation wird auf den durch die Düse strömenden Flüssigkeitsstrahl eine periodische Druckschwankung ausgeübt, aufgrund der sich an der Düse Flüssigkeitstropfen mit einer definierten und reproduzierbaren Größe ausbilden und diese von dem Flüssigkeitsstrahl abreißen. Durch entsprechende Einstellung der Kon- zentration der Eukaryontenzellen in der Flüssigkeitssuspension, der Strömungsgeschwindigkeit der Suspension und entsprechende Einstellung der piezoelektrischen Modulation kann erreicht werden, dass jeder Flüssigkeitstropfen definierter und reproduzierbarer Größe eine vorbestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen, beispielsweise genau eine Eukary- ontenzelle, enthält. Die Abtrennung der Tropfen von der Düse erfolgt aufgrund des Impulses der Druckschwankungen unterstützt durch die Schwerkraft.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zum Ablegen einer bestimmten Anzahl genetisch gleicher Eukaryontenzellen aus beispielsweise einem Zellkulturmedium enthaltend ausschließlich genetisch gleiche Zellen, beispielsweise Zellen eines Klones, auf einer Reaktionsstelle eines Substrats als auch zum Ablegen einer bestimmten Anzahl genetisch gleicher Eukaryontenzellen aus einer Mischung von genetisch unter- schiedlichen Zellen auf einem Substrat. Zudem kann mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren auch eine bestimmte Anzahl genetisch unterschiedlicher Eukaryontenzellen aus einer entsprechenden Zellmischung auf dem Substrat abgelegt und dort einer enzymatischen Reaktion unterworfen werden.
Die erstgenannte Verfahrensvariante lässt sich beispielsweise dadurch realisieren, dass in der Flüssigkeitssuspension nur genetisch gleiche Eukaryontenzellen vorhanden sind, der Flüssigkeitsstrom an der Düse so in einzelne Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, dass jeder Flüssigkeitstrop- fen genau eine Eukaryontenzelle enthält, und so viele Flüssigkeitstropfen elektrisch aufgeladen werden, wie Eukaryontenzellen auf dem Substrat benötigt werden. Bei der anschließenden Führung der Flüssigkeitstropfen durch das elektrische Feld werden nur die elektrisch aufgeladenen Tropfen abgelenkt und auf ein entsprechend positioniertes Substrat aufge- bracht. Die entsprechende Ablenkung der elektrisch aufgeladenen Flüssigkeitstropfen kann beispielsweise durch Führung der Flüssigkeitstropfen durch einen Kondensator erfolgen.
Alternativ dazu kann die zweitgenannte Verfahrensvariante dadurch reali- siert werden, dass in der Flüssigkeitssuspension genetisch verschiedene Zellen, beispielsweise Eukaryontenzellen und Prokaryontenzellen, vorhanden sind, eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einem fluoreszierenden Farbstoff markiert werden, der Flüssigkeitsstrom an der Düse in einzelne voneinander ge- trennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, die einzelnen an der Düse von dem Flüssigkeitsstrom abgetrennten Flüssigkeitstropfen durch einen Laserstrahl geführt werden, durch den die Fluoreszenz der einzelnen Tropfen gemessen wird, anschließend die einzelnen Flüssigkeitstropfen in Abhängigkeit von der Fluoreszenz der darin enthaltenen Zelle(n) mit einer bestimmten elektrischen Ladung elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen so durch ein elektrisches Feld geführt werden, dass die Flüssigkeitstropfen mit einer in einem vorgewählten Bereich liegenden elektrischen Ladung auf das Substrat gelenkt werden.
Während fluoreszenzmarkierte Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden, wenn die genetisch verschiedenen Zellen Zellen unterschiedlicher Organismen sind, hat sich die Markierung einzelner Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff insbesondere als geeignet erwiesen, wenn die genetisch verschiedenen Zellen aus demselben Organismus stammen. Der Farbstoff kann in diesem Fall beispielsweise mit einer DNA-Sonde verbun- den sein, die für ein Gen oder einen Genabschnitt einer bestimmten Zellsorte spezifisch ist. Genauso gut ist es möglich, mehrere verschiedene fluoreszenzmarkierte Antikörper oder mehrere verschiedene fluoreszierende Farbstoffe einzusetzen, um genetisch verschiedene Zellen jeweils mit einem spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einem spezifischen fluoreszierenden Farbstoff zu markieren. So können durch den Laser zwei oder mehr verschiedene Zelltypen erkannt, diese später unterschiedlich elektrisch aufgeladen werden und auf verschiedene Substrate abgelenkt werden. Die entsprechende selektive Ablenkung in dem ent- sprechenden elektrischen Feld kann in dem Falle von zwei in dem elektrischen Feld aufzutrennenden unterschiedlichen Zellen beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Flüssigkeitstropfen mir dem einen Zieltyp positiv und die Flüssigkeitstropfen mir dem anderen Zieltyp negativ aufgeladen werden. Bei mehr als zwei Zelltypen kann die selektive Auftrennung dadurch erreicht werden, dass die einzelnen unterschiedlichen Zellen jeweils mit einer unterschiedlichen Menge an elektrischer Ladung versehen werden, beispielsweise die Zelle I mit einer elektrischen Ladung von X C, die Zelle II mit einer elektrischen Ladung von 2-X C, die Zelle III mit einer elektrischen Ladung von 3-X C und so weiter.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Eukaryontenzelle(n) mittels eines Durchflusszyto- meters auf einer oder mehreren Reaktionstelle(n) des Substrats aufgegeben. Diese, auch Fluoreszenz aktivierte Zellsortierer (FACS bzw. Fluores- cence Activated Cell Sorter) genannten Geräte werden beispielsweise von den Firmen Beckton & Dickinson und Dako kommerziell vertrieben.
Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn als Durchflusszytome- ter ein FACS-Vantage SE Durchflusszytometer eingesetzt wird. Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform kann das Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats gemäß Schritt d) und/ oder die Entnahme der Eukaryontenzelle (n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) auch durch Laser- Mikrodissektion ("Laser Capture Microdissection" ; LCM) oder durch Laser- Druck- Katapultation (" Laser Pressure Catapultation!' ; LPC) erfolgen. Geeignete Geräte für die erstgenannte Technologie sind beispielsweise das Veritas™ Microdissection Instrument der Firma Arcturus, welche Teil der Firma Molecular Devices ist, oder Leica LMD6000 der Firma Leica, wäh- rend eine für die LPC Technik geeignete Vorrichtung das PALM laser capture microdissection System der Firma P.A.L.M. in Wolfratshausen ist.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, als Substrat wenigstens ein AmpliGrid™ einzusetzen, wobei der wenigstens eine AmpliGrid™ in einem Rahmen positioniert ist, welcher vorzugsweise eine Kapazität für vier verschiedene AmpliGrid1 s™ aufweist. Ein solcher Rahmen kann zum Beispiel als Hohlrahmen ausgestaltet sein, wobei die einzelnen Aussparungen des Hohlrahmens jeweils die Form und Größe eines AmpliGrid' s™ aufweisen.
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein oder mehr Substrate eingesetzt, welche jeweils 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils einen inneren hydrophilen Bereich umfassende Re- aktionsstellen aufweisen, wobei die jeweiligen Anzahlen der in dem Verfahrens schritt d) pro Reaktionsstelle abgelegten Eukaryontenzelle(n) während oder nach dem Verfahrensschritt d) auf einem Datenträger, beispielsweise einer Festplatte, gespeichert werden. In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Detek- tion in dem Verfahrensschritt e) des erfmdungsgemäßen Verfahrens mikroskopisch, bevorzugt lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch, vorzunehmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion unter Einsatz aller bekannten Eukaryontenzell- typen. Insbesondere ist es für enzymatische Reaktionen von humanen Zellen geeignet, wobei sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion an Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten, Thrombozyten und Krebszellen als besonders geeignet erwiesen hat.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung rein beispielhaft anhand vor- teilhafter Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Dabei zeigen:
Fig. 1 die Abhängigkeit des Verhältnisses des Quotienten Zellvolumen durch Reaktionsvolumen von der eingesetzten Zellzahl,
Fig. 2 eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung,
Fig. 3a eine Draufsicht eines zur Durchführung der vorliegenden
Erfindung geeignetes Substrat gemäß eines Ausführungsbeispiels und Fig. 3b eine Reaktionsstelle des in der Fig. 3a gezeigten Substrats.
In der Fig. 1 ist die Abhängigkeit des Verhältnisses des Quotienten des Zellvolumens pro Reaktionsvolumen von der eingesetzten Zellzahl für ZeI- len mit einem Durchmesser von 10 μm und bei einem Reaktionsvolumen von 1 μl dargestellt. Unter Annahme einer kugelförmigen Zellform ergibt sich für eine Zelle mit einem Zelldurchmesser von 10 μm ein Zellvolumen von ca. 4200 μm3. Da ein Reaktionsvolumen von 1 μl 109 μm3 entspricht, beträgt das Verhältnis Zellvolumen durch Reaktionsvolumen für eine wie vorstehend proportionierte Zelle in einem PCR-Standardreaktionsvolumen von 1 μl etwa 0,004 %. Sofern die Reaktionsmischung mehr als eine Zelle enthält, vergrößert sich dieses Verhältnis proportional mit der eingesetzten Zellzahl. Bei Einsatz von zehn Zellen beträgt das entsprechende Verhältnis im vorgenannten Fall bereits 0,004 % und bei Einsatz von 1.000 Zellen sogar 0,4 %. Da die Zellen neben der als Substrat für die Taq-
Polymerase dienenden DNA weitere Bestandteile, wie Proteine, Lipide und dergleichen, enthalten, welche die Taq-Polymerase inhibieren können, bedeutet ein größeres Verhältnis Zellvolumen zu Reaktionsvolumen auch die steigende Gefahr, dass die PCR inhibiert wird oder zumindest nicht optimal verläuft. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren maximal 10 Eukaryontenzellen auf einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegen. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn maximal 5 Eukaryontenzellen und insbesondere maximal 3 Eukaryontenzellen auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wer- den. Beste Ergebnisse werden erhalten, wenn genau eine Zelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wird.
Die in der Fig. 2 dargestellte Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse 1 , in dem sich eine Kammer 2 für einen Flüssigkeitsmantelstrom befindet. Des Weiteren weist die Vorrichtung eine Kanüle 3 zum Durchleiten einer Zell- Suspension, d.h. einer Suspension von Zellen in Flüssigkeit, auf. Die Kammer 2 für den Mantelstrom verjüngt sich nach unten zu einer Düse 4. Am Kopf der Vorrichtung ist eine Piezokeramik 5 vorgesehen, welche an der Düse 4 periodische Druckschwankungen ausüben kann.
Des Weiteren umfasst die Vorrichtung eine Laserquelle (nicht dargestellt), welche unterhalb der Düse 4 einen Laserstrahl 6 erzeugt. Unterhalb des Laserstrahls 6 sind Ablenkplatten 7 vorgesehen, an die zwecks Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen den Ablenkplatten 7 eine elektrische Spannung angelegt werden kann.
Zur Durchführung des erfϊndungsgemäßen Verfahrens wird eine Zellsuspension mit einer vorbestimmten Zellkonzentration, beispielsweise eine Suspension von Zellen in Zellkulturmedium, über die Kanüle 3 in die Vor- richtung geführt und über einen Auslass 8 in die Kammer 2 geführt. Parallel dazu wird Mantelflüssigkeit durch den Einlass 9 mit einem hohen Druck in die Kammer 2 geführt und durch diese hindurch geströmt. Aufgrund des Drucks der Mantelflüssigkeit wird der aus dem Auslass 8 austretende Flüssigkeitsstrahl hydrodynamisch fokussiert und zu der Düse 4 geführt.
Durch die Piezokeramik 5 ist an der Düse 4 eine piezoelektrische Modulation angelegt, durch welche die Düse 4 periodischen Druckschwankungen ausgesetzt ist. Aufgrund dieser Druckschwankungen werden an der Düse 4 einzelne Flüssigkeitstropfen 10 von dem Flüssigkeitsstrahl abgetrennt. Danach fallen die Tropfen 10 aufgrund der Schwerkraft nach unten und passieren den Laserstrahl 6, durch den etwaig an die Zellmembran gebundene fluoreszenzmarkierte Antikörper oder in die Zellen eingebaute fluoreszierende Farbstoffe detektiert werden können. Vor dem Passieren oder nach dem Passieren des Laserstrahls 6 werden die einzelnen Flüssig- keitstropfen 10 mittels einer entsprechenden Vorrichtung (nicht dargestellt) selektiv oder unterschiedlich elektrisch aufgeladen. Das heißt, einzelne Flüssigkeitstropfen 10 erhalten eine elektrische Ladung, während andere Flüssigkeitstropfen 10 elektrisch neutral bleiben, oder einzelne Flüssigkeitstropfen 10 erhalten eine positive elektrische Ladung, wohingegen die übrigen Flüssigkeitstropfen 10 eine negative elektrische Ladung erhalten, oder die einzelnen Flüssigkeitstropfen 10 erhalten jeweils eine unterschiedliche Menge an elektrischer Ladung, wobei die Menge an pro Flüssigkeitstropfen 10 angelegter elektrischer Ladung beispielsweise pro- portional zu der Intensität der durch den Laserstrahl detektierten Fluoreszenz pro Flüssigkeitstropfen 10 ist. Anschließend werden die einzelnen Flüssigkeitstropfen 10 durch ein durch Ablenkplatten 7 erzeugtes elektrisches Feld geführt, in dem elektrisch geladene Flüssigkeitstropfen 10 abgelenkt werden. Unterhalb der Ablenkplatten 7 befindet sich ein Substrat 11 in Form eines Objektträgers, das so angeordnet ist, dass Flüssigkeitstropfen 10 mit einer bestimmten elektrischen Ladung auf eine Reaktionsstelle 12 dieses Substrat 11 abgelenkt werden.
Dabei werden die Parameter beim Führen der Flüssigkeitssuspension durch die Düse 4, bei der Abtrennung der Flüssigkeitstropfen 10 von der Düse 4 und bei der Führung der Flüssigkeitstropfen 10 durch das elektrische Feld so eingestellt, dass die auf der Reaktionsstelle 12 des Substrats 11 auftreffenden Eukaryontenzelle(n) keine umgebende Flüssigkeit mehr aufweisen oder zumindest weitestgehend keine extrazelluläre Flüssigkeit aufweisen.
Das in der Fig. 3a dargestellte Substrat 11 ist rechteckig ausgebildet und weist insgesamt 48 Reaktionsstellen 12 auf, welche auf 6 untereinander angeordnete Reihen mit jeweils 8 Reaktionsstellen 12 verteilt sind. Wie in der Fig. 3b zu erkennen, weist jede Reaktionsstelle 12 einen inneren bzw. zentralen, kreisförmig ausgestalteten hydrophilen Bereich 13 auf. Dieser innere hydrophile Bereich 13 ist außenseitig konzentrisch von einem kreisringförmigen (inneren) hydrophoben Bereich 14 umgeben, wel- che wiederum außenseitig von einem kreisringförmigen (mittleren) hydrophilen Bereich 15 konzentrisch umgeben ist. Schließlich ist der (mittlere) hydrophile Bereich 15 außenseitig von einem (äußeren) hydrophoben Bereich 16 umgeben.
Durch diese Ausgestaltung der Reaktionsstellen 12 wird erreicht, dass sich nach Ablage wenigstens einer Eukaryontenzelle hierauf aus der an der wenigstens einen Eukaryontenzelle haftenden oder aus der der wenigstens einen Eukaryontenzelle nach dem Ablegen auf der Reaktionsstelle zugefügten Flüssigkeit Flüssigkeitstropfen bilden, die vergleichsweise fest an dem Substrat haften, so dass die nachfolgende Enzymreaktion direkt auf den Reaktionsstellen durchgeführt werden kann, ohne dass die Eukaryontenzellen in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen überführt werden müssen. Dadurch werden zum einen arbeits- und zeitaufwendige Transferschritte vermieden. Ferner wird dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat 11 mehrere Proben parallel aufbereitet werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden Flüssigkeitstropfen bei geringfügigen Erschütterungen oder aufgrund des Verlaufens von Flüssigkeitstropfen infolge zu hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen. Bezugszeichenliste
1 Gehäuse
2 Kammer für Mantelstrom
3 Kanüle für Zellsuspension
4 Düse
5 Piezokeramik 6 Laserstrahl
7 Ablenkplatten
8 Auslass der Kanäle
9 Kammereinlass
10 Flüssigkeitstropfen 11 Substrat
12 Reaktionsstelle
13 innerer hydrophiler Bereich
14 innerer hydrophober Bereich
15 mittlerer hydrophiler Bereich 16 äußerer hydrophober Bereich

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit einer wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Probe umfassend die nachfolgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Ausgangsmaterials, b) Entnahme von wenigstens einer Eukaryontenzelle aus dem Ausgangsmaterial, c) Anfärben des Zellkerns bzw. der Zellkerne der Eukaryontenzelle (n), d) Ablegen wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einer Reaktions- stelle (12) eines festen Substrats (1 1) in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 μl, e) Detektieren, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrat (11) vorliegt, sowie f) Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf dem Substrat (11),
wobei der Verfahrensschritt e) nach den Verfahrensschritten c) und d) durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahrensschritt d) maximal 10 Eukaryontenzellen pro Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahrensschritt d) zwischen 1 und 5 Eukaryontenzellen, bevorzugt zwischen 1 und 3 Eukaryontenzellen, besonders bevorzugt 1 oder 2 Eukaryontenzellen und ganz besonders bevorzugt genau 1 Eukary- ontenzelle pro Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt c) vor oder nach dem Verfahrensschritt d) und vor oder nach dem Verfahrensschritt b) durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder während des Ablegens der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) gemäß Verfahrensschritt d) die absolute Anzahl der pro Reakti- onsstelle (12) abzulegenden bzw. abgelegten Eukaryontenzelle(n) bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung der absoluten Anzahl der wenigstens einen Eukary- ontenzelle mikroskopisch, bevorzugt lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch, erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Anfärben des wenigstens einen Zellkerns in Verfahrensschritt c) eine aus der aus Hämatoxylin, Alaunkarmin, alkoholische Boraxaminlösung, Parakarmin, Naphthazarin, Karminessigsäure, 7-Amino-actinomycin D (7 -AAD), Acridine orange, BO- BO-I, BOBO-3, DAPI Nucleic Acid Stain, Dihydroethidium, Ethidi- umbromid, Ethidium Homodimer-1, Hexidiumiodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, LDS 751, Nissl substance, Nuclear yellow, Propidiumiodid, SYTO 11, SYTO 13, SYTO 16, SYTOX Green stain, SYTOX Orange, TO-PRO-3, TOTO-3, YO-PRO-I, YOYO-I und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindung eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) auf den von einem hydrophoben Bereich (14) umgebenen inneren hydrophilen Bereich (13) einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der innere hydrophile Bereich (13) der Reaktionsstelle (12) auf dem Substrat (11) im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet und von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich (14), vorzugsweise konzentrisch, umgeben ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der den inneren hydrophilen Bereich (13) der Reaktionsstelle (12) umgebende hydrophobe Bereich (14) auf dem Substrat (11) außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich ( 15) umgeben ist, welcher vorzugsweise im Wesentlichen kreisringförmig ist und den hydrophoben Bereich (14) besonders bevorzugt konzentrisch umgibt, und der äußere hydrophile Bereich (15) außenseitig von einem äuße- ren hydrophoben Bereich (16) umgeben ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrophilie des inneren hydrophilen Bereichs (13) der Reaktionsstelle (12) und die Hydrophobie des diesen umgeben- den Bereichs (14) derart eingestellt werden, dass sich bei Auftrag von weniger als 10 μl Wasser auf die Reaktionsstelle (12) ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der innere hydrophile Bereich (13) der Reaktionsstelle (12) im Wesentlichen kreisförmig ausgestaltet ist und einen Durchmesser zwischen 0,3 und 3 mm aufweist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (11) 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils einen im Wesentlichen kreisförmigen inneren hydrophilen Bereich (13) umfassende Reaktionsstellen (12) auf- weist, wobei die inneren hydrophilen Bereiche (13) jeweils konzentrisch von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich (14) umgeben sind, welcher außenseitig von einem mittleren, im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophilen Bereich (15) umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem äußeren hydrophoben Bereich (16) umgeben ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (11) ein Objektträger oder eine Mikro titerplatte, vorzugsweise ein AmpliGrid™, ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 5 μl, bevorzugt von weniger als 2 μl und besonders bevorzugt von weniger als 1 μl auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) in einem
Flüssigkeitsvolumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatischen Reaktion in Verfahrensschritt f) eine PCR, LCR oder RCA ist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird, indem eine die wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltende Flüssigkeitssuspension durch eine Düse (4) geführt wird, der Flüssigkeitsstrom an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen (10) aufgetrennt wird, wobei die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) jeweils eine vorbestimmte Anzahl an Eukaryon- tenzellen enthalten, alle oder einzelne Flüssigkeitstropfen (10) nach der Abtrennung von der Düse (4) elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) durch ein elektrisches Feld ge- führt werden, wodurch ein oder mehrere elektrisch aufgeladene
Flüssigkeitstropfen (10) auf eine oder mehrere Reaktionsstellen (12) des Substrats (11) gelenkt werden, anschließend den Eukaryonten- zellen Enzym und ggf. Reaktionspuffer zugegeben wird und abschließend die enzymatische Reaktion gestartet wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter beim Führen der Flüssigkeitssuspension durch die Düse (4), bei der Auftrennung der Flüssigkeitstropfen (10) an der Düse (4) und bei der Führung der Flüssigkeitstropfen (10) durch das elektri- sehe Feld so eingestellt werden, dass wenigstens eine Eukaryonten- zelle in einem Volumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Eukaryontenzelle(n) hydrodynamisch durch die Düse (4) geführt werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Düse (4) einen Innendurchmesser zwischen 1 μm und 1 mm, bevorzugt zwischen 10 μm und 500 μm und besonders bevorzugt zwischen 50 μm und 100 μm aufweist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Eukaryontenzelle(n) an der Düse (4) durch piezoelektrische Modulation in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen (10) aufgetrennt werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekenn- zeichnet, dass in der Flüssigkeitssuspension nur genetisch gleiche
Eukaryontenzellen vorhanden sind, der Flüssigkeitsstrom (10) an der Düse (4) so in einzelne Flüssigkeitstropfen (10) aufgetrennt wird, dass jeder Flüssigkeitstropfen (10) genau eine Eukaryontenzelle enthält, und so viele Flüssigkeitstropfen (10) elektrisch aufgeladen wer- den wie Eukaryontenzellen auf dem Substrat (11) benötigt werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass in der Flüssigkeitssuspension genetisch verschiedene Zellen vorhanden sind, eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einem fluoreszierenden
Farbstoff markiert werden, der Flüssigkeitsstrom oder die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) durch einen Laserstrahl geführt werden, durch den die Fluoreszenz der einzelnen Zellen gemessen wird, die einzelnen von dem Flüssigkeitsstrom abgetrennten Flüssigkeitstrop- fen (10) in Abhängigkeit von der Fluoreszenz der darin enthaltenen
Zelle(n) mit einer bestimmten elektrischen Ladung elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) so durch ein elektrisches Feld geführt werden, dass der bzw. die Flüssigkeitstropfen ( 10) mit einer vorgewählten elektrischen Ladung auf das Sub- strat (11) gelenkt wird/werden.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) mittels eines Durchflusszytometers auf wenigstens einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchflusszytometer ein FACS-Vantage SE Durchflusszytometer ist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats gemäß Schritt d) und/ oder die Entnahme der Eukaryontenzelle (n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) durch Laser-Mikrodissektion ["Laser Capture Microdissection") oder durch Laser-Druck-Katapultation (" Laser Pressure Catapultation"), vorzugsweise mit einem Veritas™ Microdissection Instrument der Firma Arcturus, einem Leica LMD6000 der Firma Leica oder einem PALM laser capture microdissection System der Firma P. A. L. M., erfolgt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Entnahme der Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) mikromechanisch mit einer Kapillare, vorzugsweise mit einem mmi Cellector® der Firma MMI Mόlecular Machines & Industries AG, erfolgt.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat (11) wenigstens ein AmpliGrid™ eingesetzt wird, wobei der wenigstens eine AmpliGrid™ in einem Rahmen positioniert ist, welcher vorzugsweise eine Kapazität für vier verschiedene AmpliGrid' s™ aufweist.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehr Substrate (11) eingesetzt wer- den, welche jeweils 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils einen inneren hydrophilen Bereich (13) umfassende Reaktionsstellen (12) aufweisen und dass die einzelnen Anzahlen der in dem Verfahrensschritt d) pro Reaktionsstelle (12) abgelegten Euka- ryontenzelle(n) während oder nach dem Verfahrensschritt d) auf einem Datenträger gespeichert werden.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion in Verfahrensschritt e) mikro- skopisch, bevorzugt lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch, erfolgt.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt e) abgelegte wenigstens eine Eukaryontenzelle wenigstens eine humane Zelle ist, welche bevorzugt aus der aus Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten, Thrombozyten und Krebszellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
33. Substrat (11) mit wenigstens einer Reaktionsstelle (12), auf dem eine oder mehrere Zellen vorgesehen sind, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32.
EP07818225A 2006-11-30 2007-09-18 Verfahren zum durchführen einer enzymatischen reaktion Withdrawn EP2089547A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006056694A DE102006056694B4 (de) 2006-11-30 2006-11-30 Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion
PCT/EP2007/008123 WO2008064730A2 (de) 2006-11-30 2007-09-18 Verfahren zum durchführen einer enzymatischen reaktion

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2089547A2 true EP2089547A2 (de) 2009-08-19

Family

ID=39032321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP07818225A Withdrawn EP2089547A2 (de) 2006-11-30 2007-09-18 Verfahren zum durchführen einer enzymatischen reaktion

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20110081684A1 (de)
EP (1) EP2089547A2 (de)
JP (1) JP2010510782A (de)
DE (1) DE102006056694B4 (de)
WO (1) WO2008064730A2 (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007059476B3 (de) * 2007-12-11 2009-07-30 Advalytix Ag Vorrichtung und Verfahren zur Vermehrung und zur anschließenden Charakterisierung von Zellen
JP5924077B2 (ja) 2012-03-30 2016-05-25 ソニー株式会社 微小粒子分取装置及び微小粒子分取装置における軌道方向判定方法
WO2013145905A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 ソニー株式会社 微小粒子分取装置及び該装置における流体ストリーム最適化方法
WO2014115409A1 (ja) 2013-01-28 2014-07-31 ソニー株式会社 微小粒子分取装置、微小粒子分取方法及びプログラム
WO2014168043A1 (ja) * 2013-04-09 2014-10-16 東京エレクトロン株式会社 測定装置及び測定方法
EP3035030B1 (de) 2013-10-16 2019-07-10 Sony Corporation Partikelfraktionierungsvorrichtung, partikelfraktionierungsverfahren und programm
JP6136843B2 (ja) 2013-10-17 2017-05-31 ソニー株式会社 粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラム
JP6465036B2 (ja) 2014-02-13 2019-02-06 ソニー株式会社 粒子分取装置、粒子分取方法、プログラム及び粒子分取システム
JP6102783B2 (ja) 2014-02-14 2017-03-29 ソニー株式会社 粒子分取装置、粒子分取方法及びプログラム
JP6657625B2 (ja) 2014-09-05 2020-03-04 ソニー株式会社 液滴分取装置、液滴分取方法及びプログラム
WO2017068822A1 (ja) 2015-10-19 2017-04-27 ソニー株式会社 画像処理装置、微小粒子分取装置及び画像処理方法
JP6629429B2 (ja) * 2016-03-28 2020-01-15 富士フイルム株式会社 細胞分析システム
JP7059712B2 (ja) * 2018-03-14 2022-04-26 株式会社リコー プレートの生成方法、プレートの生成装置、及びオリフィスの径可変プログラム

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6540895B1 (en) * 1997-09-23 2003-04-01 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials
US20020064809A1 (en) * 2000-11-29 2002-05-30 Mutz Mitchell W. Focused acoustic ejection cell sorting system and method
DE10103954B4 (de) * 2001-01-30 2005-10-06 Advalytix Ag Verfahren zur Analyse von Makromolekülen
WO2002101087A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Chemometec A/S A method and a system for counting cells from a plurality of species
DE10136008B4 (de) * 2001-07-24 2005-03-31 Advalytix Ag Verfahren zur Analyse von Makromolekülen und Verfahren zur Herstellung einer Analysevorrichtung
DE10164358C2 (de) * 2001-12-28 2003-11-27 Advalytix Ag Charakterisierungsverfahren für funktionalisierte Oberflächen
US20060024272A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Large Scale Biology Corporation C-terminally truncated interferon
DE102005056639A1 (de) * 2005-11-28 2007-06-06 Advalytix Ag Verfahren, Vorrichtung und Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PANACCIO M ET AL: "Direct PCR from solid tissues without DNA extraction.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH 25 SEP 1993, vol. 21, no. 19, 25 September 1993 (1993-09-25), pages 4656, XP001537468, ISSN: 0305-1048 *
ROJAS FRANCISCO J ET AL: "Enzymatic amplification of specific deoxyribonucleic acid sequences from single cells: Evaluation of a simplified and rapid method for use in preimplantation genetic diagnosis", FERTILITY AND STERILITY, ELSEVIER SCIENCE INC, NEW YORK, NY, USA, vol. 64, no. 2, 1 January 1995 (1995-01-01), pages 255 - 260, XP008159870, ISSN: 0015-0282 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008064730A3 (de) 2008-07-24
WO2008064730A2 (de) 2008-06-05
DE102006056694A1 (de) 2008-06-05
DE102006056694B4 (de) 2010-08-05
JP2010510782A (ja) 2010-04-08
US20110081684A1 (en) 2011-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2089547A2 (de) Verfahren zum durchführen einer enzymatischen reaktion
EP1390492B1 (de) Gerichtete evolution von biomolekülen unter der verwendung von mikrostrukturen
DE60028819T2 (de) Verfahren zur behandlung einer matrixnukleinsäure unter verwendung einer integrierten mikrofluidischen platte
EP1121460B1 (de) Verfahren und mittel zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren an oberflächen
DE69618790T2 (de) Chemisch, biochemisch und biologisch verarbeitung bei dünner schichten
DE60010058T2 (de) Biochemische reinigungsgeräte mit immobilisierten fangsonden und ihre anwendungen
DE112015007082B4 (de) Zellanalyseeinrichtung, Vorrichtung und ein diese verwendendes Zellanalyseverfahren
DE102004021822B3 (de) Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien
DE102014118532B4 (de) Vorrichtung mit einer Filterschicht und Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Proben
WO2012013316A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur passiven trennung und sortierung von tropfen, insbesondere in einem mikrofluidischen system, durch verwendung von nicht-optischen markern für reaktionen innerhalb der tropfen
DE102004021904B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit diskreten, separaten Messbereichen zur biologischen, biochemischen oder chemischen Analyse
EP1511856A1 (de) Verfahren zur parallelen sequenzierung eines nukleinsäuregemischs mittels einer durchflussanordnung
EP0958300A1 (de) Elektrokinetische probenvorbereitung
DE102012219156A1 (de) Integriertes mikrofluidisches bauteil zur anreicherung und extraktion biologischer zellbestandteile
EP1498492B1 (de) Probenzubereitungseinheit
DE29923907U1 (de) Miniaturisierter Objektträger zur Durchführung einer Vielzahl von Testreihen im Submikroliterbereich
DE112016003660T5 (de) Vorbereitung biologischer Probe zum Testen
DE4317414C1 (de) Mittel zur komplexen Diagnostik der Genexpression und Verfahren zur Anwendung für die medizinische Diagnostik und die Genisolierung
DE112018007861T5 (de) Biochemische Kassette und biochemische Analysevorrichtung
DE102006014000B4 (de) Verfahren zur Charakterisierung einer Mischprobe
EP3927842B1 (de) Vorrichtung zur untersuchung einer biologischen probe
WO2007059839A1 (de) Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung von makromolekülen in einer probe
DE102012206064A1 (de) Verfahren zum Aufschließen von biologischen Zellen
EP1896615A1 (de) Verfahren zum nachweis von nukleotidsequenzen, verwendung des verfahrens und testbesteck
DE102007056398A1 (de) Flexibles Extraktionsverfahren für die Herstellung sequenzspezifischer Molekülbibliotheken

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20090522

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL PL PT RO SE SI SK TR

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: MANN, WOLFGANG

Inventor name: ALUNNI-FABBRONI, MARIANNA

Inventor name: GAUER, CHRISTOPH

17Q First examination report despatched

Effective date: 20091120

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: BECKMAN COULTER, INC.

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: BECKMAN COULTER, INC.

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20130403