EP1957659A1

EP1957659A1 - Fermentative herstellung organischer verbindungen

Info

Publication number: EP1957659A1
Application number: EP06830136A
Authority: EP
Inventors: Matthias Boy; Stephan Freyer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2008-08-20
Also published as: RU2008126156A; CA2628749C; CA2628749A1; MX292945B; WO2007060235A1; JP2009517012A; KR20140091723A; MX2008006372A; JP4944898B2; US8728762B2; BRPI0619020A2; ZA200805546B; UA95468C2; KR101440160B1; DE102005056667A1; RU2451081C2; US20080254515A1; CN101313076A; KR20080072079A; TW200801193A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens einer organischen Verbindung mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte: i) Vermählen einer Stärkequelle unter Erhalt eines Mahlguts, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält; ii) Suspendieren des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in einer Menge, dass ein Trockenmassegehalt in der Suspension von wenigstens 45 Gew.-% resultiert, iii) Hydrolyse des Stärkebestandteils im Mahlgut durch Verflüssigen und gegebenenfalls anschließendes Verzuckern, wobei man ein wässriges Medium M erhält, welches die hydrolysierte Stärkebestandteile der Stärkequelle und wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält; und iv) Verwendung des in Schritt iii) erhaltenen wässrigen Mediums M in einer Fermen- tation zur Kultivierung eines Mikroorganismus, welcher zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigt ist; wobei man in Schritt iii) die in Schritt ii) erhaltene Suspension durch Einbringen von Wasserdampf in die Suspension auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke erhitzt.

Description

Fermentative Herstellung organischer Verbindungen

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom unter Einsatz eines zuckerhaltigen Mediums, das zumindest einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst, zur Kultivierung der Mikroorganismen.

Zuckerhaltige Flüssigmedien sind eine grundlegende Nährstoffquelle für viele Fermentationsverfahren; die in den Medien enthaltenen Zuckeranteile werden von den eingesetzten Mikroorganismen verstoffwechselt, wobei man organische Wertprodukte erhält. Die Palette derart hergestellter mikrobieller Stoffwechselprodukte, d. h. organischer Verbindungen, umfasst hierbei z. B. niedermolekulare flüchtige Verbindungen wie E- thanol, nichtflüchtige Stoffwechselprodukte wie Aminosäuren, Vitamine und Carotenoi- de sowie eine Vielzahl weiterer Stoffe.

Für solche allgemein bekannten mikrobiellen Fermentationsverfahren werden in Ab- hängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen unterschiedliche Kohlenstoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, so genannten „high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologische Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advan- ces in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-1 12).

Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung mikrobieller Stoffwechsel- produkte etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.

Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung mikrobieller Stoffwechselprodukte ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktionsschritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z. B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen, Triticale oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und an- schließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fer- mentation zur Produktion der gewünschten Stoffwechselprodukte eingesetzt zu werden.

Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht aufgereinigter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fer- mentative Produktion mikrobieller Stoffwechselprodukte beschrieben worden. Typischerweise werden die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestand- teilen enthält, welche die Fermentation nachteilig beeinflussen können, werden diese Bestandteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/077252; JP 2001-072701 ; JP 56-169594; CN 12181 11 ), nach der Verflüssigung (WO 02/077252; CN 1 173541 ) oder im An- schluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.

Neuere Verfahren zur fermentativen Herstellung von organischen Verbindungen umfassen insbesondere eine Aufreinigung der Stärkequellen vor der Fermentation z. B. die Aufreinigung von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen (JP 57159500), oder stellen Methoden bereit, welche die Herstellung von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen (EP 1205557) ermöglichen sollen.

Nicht aufgereinigte Stärkequellen hingegen werden in großem Umfang bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol eingesetzt. Hierbei werden die Stärkequellen, üblicherweise ganze Getreidekörner, zunächst trocken vermählen und anschließend der Stärkebestandteil der Stärkequelle unter Einwirkungen von Enzymen hydrolysiert. Da- bei kann die Hydrolyse sowohl diskontinuierlich, z. B. in Rührkesseln, als auch kontinuierlich, z. B. In Jet-Kochern durchgeführt werden. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z. B. in „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Kapitel 2, S. 7 bis 23, und in McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from com starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580- 28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.

Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein gravierendes Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry-Milling-Verfahrens zur Herstellung anderer mikrobieller Stoffwechselprodukte ist jedoch der über die Zuckerlösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann, z. B. im Hinblick auf die Sauerstofftransferrate bzw. den Sauerstoffbedarf der eingesetzten Mikroorganismen (vgl. hierzu Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Ae- robic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370) als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschweren kann.

Zudem kann durch den Feststoffeintrag bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension die Viskosität der Suspension einen kritischen Wert erreichen, wodurch z. B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Dies ist im Hinblick auf die fermentative Bioethanol-Herstellung insofern nicht weiter relevant, da höhere Konzentrationen aufgrund der Toxizität des Produkts für die zur Fermentation eingesetzten Hefen ohnehin nicht sinnvoll umgesetzt werden könnten.

Bei der fermentativen Herstellung anderer organischer Stoffwechselprodukte als Etha- nol ist es prinzipiell von Nachteil, der Fermentation zuckerhaltige Medien mit geringer Zuckerkonzentrationen zuzuführen, weil dies zu einer überproportionalen Verdünnung der Fermentationsbrühe führt und sich folglich die erreichbare Endkonzentration der Wertprodukte verringert, was einerseits erhöhte Kosten bei deren Gewinnung aus dem Fermentationsmedium verursacht und die Raum-Zeit-Ausbeute abnimmt. Diese Erwägungen sind insbesondere für den Fall maßgeblich, wenn ein für eine großvolumige Bioethanol-Produktion hergestelltes Stärkehydrolysat, das herkömmlicherweise gerin- ge Zucker- bzw. Glucosekonzentrationen von bis zu etwa 30 oder 33 Gew.-% aufweist, teilweise einer geringervolumigen Nebenfermentation zur Herstellung anderer Chemikalien zugeführt werden soll.

Aufgrund der dargestellten Schwierigkeiten und Einschränkungen sind Dry-Milling- Verfahren, wie sie für die Bioethanolherstellung in breitem Umfang eingesetzt werden, bei der fermentativen Herstellung anderer mikrobieller Stoffwechselprodukte als Etha- nol bislang ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung geblieben.

Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung mikrobieller

Stoffwechselprodukte sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden. So beschreibt die JP 2001/275693 ein Verfahren zur fer- mentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermählen wurden. Zur Durchführung des Verfah- rens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von < 150 μm einzustellen. Bei der dazu angewendeten Filtration werden Teile des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Bei diesem Verfahren werden mäßige Zuckerkonzentrationen erreicht. Ein ähnliches Verfahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäurehaltigen Futterzusatzes beschrieben.

Erhöhte Zuckerkonzentrationen in dem zur Fermentation eingesetzten Flüssigmedium können bei Einsatz eines Mahlguts zur Verzuckerung, das weitgehend die festen, nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle enthält, durch das in der WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) der Anmelderin beschriebene Verfahren erreicht werden. Eine Abtrennung der in der Stärkequelle enthaltenen festen, nichtstärkehaltigen Bestandteile vor der Fermentation hat sich dabei überraschenderweise als nicht erforderlich erwiesen. Ein ähnliches Verfahren unter Einsatz von unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequellen wird in der PCT/EP2006/066057 (älteren Pa- tentanmeldung DE 10 2005 042 541.0) der Anmelderin beschrieben. Für eine kontinuierliche Bereitstellung zuckerhaltiger Medien mit hoher Zuckerkonzentration ist dieses Verfahren jedoch vergleichsweise aufwendig.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein weiteres Verfahren zur Herstel- lung organischer Verbindungen durch Fermentation bereitzustellen, das eine keine oder zumindest keine vollständige vorherige Abtrennung der in der Stärkequelle enthaltenen, nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile erfordert. Das Verfahren sollte insbesondere eine kontinuierliche Hydrolyse des Stärkebestandteils der Stärkequelle ermöglichen. Außerdem sollte es sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien und deren problemlosen Einsatz in der Fermentation auszeichnen. Insbesondere sollte das Verfahren die Verwendung von Getreide als Stärkequelle erlauben.

Es wurde überraschend gefunden, dass ein fermentatives Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen trotz des inhärent hohen Feststoffeintrags effizient durch- führbar ist, wenn den zur Fermentation notwendigen Zucker in Form eines wässrigen Mediums bereitstellt, das erhältlich ist durch

i) Vermählen einer Stärkequelle unter Erhalt eines Mahlguts, das wenigstens einen

Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält;

ii) Suspendieren des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in einer Menge, dass ein Trockenmassegehalt in der Suspension von wenigstens 45 Gew.-% resultiert,

iii) Hydrolyse des Stärkebestandteils im Mahlgut durch Verflüssigen und gegebe- nenfalls anschließendes Verzuckern, wobei man ein wässriges Medium M erhält, welches die hydrolysierten Stärkebestandteile der Stärkequelle und wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält, wobei die Hydrolyse das Erhitzen der Suspension des Mahlguts durch Einbringen von Wasserdampf in die Suspension auf Temperaturen oberhalb der Ver- kleisterungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke umfasst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens einer organischen Verbindung mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch Fermentation, umfassend neben den Schritten i) und ii) die folgenden Schritte:

iii) Hydrolyse des Stärkebestandteils im Mahlgut durch Verflüssigen und gegebenenfalls anschließendes Verzuckern, wobei man ein wässriges Medium M erhält, welches die hydrolysierten Stärkebestandteile der Stärkequelle und wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält; und

iv) Verwendung des in Schritt iii) erhaltenen wässrigen Mediums M in einer Fermentation zur Kultivierung eines Mikroorganismus, welcher zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigt ist;

wobei man in Schritt iii) die in Schritt ii) erhaltene Suspension durch Einbringen von

Wasserdampf in die Suspension auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstem- peratur der im Mahlgut enthaltenen Stärke erhitzt.

Trotz des hohen Trockenmassegehalt in der zur Hydrolyse eingesetzten Suspension lässt sich die Hydrolyse in der erfindungsgemäßen Weise problemlos durchführen und man erhält dementsprechend hohe Konzentrationen an verstoffwechselbaren Zuckern. Dabei spielt es überraschenderweise keine Rolle, ob der Zucker nach der Hydrolyse in Form von Mono- oder Disacchariden vorliegt oder in Form von Oligosacchariden (= Dextrinen). Der hohe Gehalt an festen, nicht-stärkehaltigen Bestandteilen der Stärkequelle im erhaltenen Medium stört überraschenderweise nicht die Fermentation. Zudem werden durch das erfindungsgemäße Verfahren Viskositätsprobleme, wie sie beim Verflüssigen der Stärkequelle bei höheren Konzentrationen an Mahlgut auftreten können, weitgehend vermieden. Aufgrund der mit dem hohen Trockenmassegehalt einhergehenden hohen Konzentration an verstoffwechselbaren Zuckern im Fermentationsmedium kann das Medium in besonders vorteilhafter weise in der Zufütterungs- phase der Fermentation eingesetzt werden, wodurch eine unerwünschte Verdünnung weitgehend vermieden oder zumindest deutlich verringert wird. Selbstverständlich eignet sich das erfindungsgemäß erhältlich Medium M als Zuckerquelle in der Batch- Phase der Fermentation. Die Begriffe "Stärkeanteil" und "Stärkebestandteil" werden hier und im Folgenden synonym verwendet.

Im Bezug auf das in Schritt iii) erhaltene wässrige Medium M werden die Begriffe "wässriges Medium", "Flüssigmedium" und "wässrige zuckerhaltige Flüssigkeit" synonym verwendet.

Der Begriff „Verflüssigung" bedeutet hier und im Folgenden den hydrolytischen Abbau von Stärke zu Oligosacchariden, insbesondere zu Dextrinen.

Die Begriffe „Verzuckerung" bzw. „Verzuckern" bedeuten hier und im Folgenden die Hydrolyse von Dextrinen zu Monosacchariden, insbesondere zu Monosacchariden wie Glucose. Unter einem "verzuckernden Enzym" wird folglich ein Enzym verstanden, das Dextrine zu Monosacchariden hydrolysiert.

Unter dem Begriff „Dextrin" werden hier und im Folgenden durch hydrolytischen Abbau von Stärke erhaltene Oligosaccharide verstanden, die in der Regel aus 3 bis 18, insbesondere 6 bis 12 Monosaccharid-Einheiten, insbesondere aus Glucose-Einheiten, bestehen.

Die Begriffe „Gehalt an Glucoseäquivalenten" und „Zuckerkonzentration" bezeichnet die Gesamtkonzentration an Mono-, Di- und Oligosacchariden im Medium, die potenziell für eine Fermentation zur Verfügung steht. Der Begriff „Glucoseäquivalente" um- fasst auch die von Glucose verschiedenen verstoffwechselbaren Zucker bzw. Zucker- einheiten.

Die Begriffe „überproduzierend" bzw. „Überproduktion" werden hier und im Folgenden in Bezug auf einen Mikroorganismus verwendet, um dessen Eigenschaft zu bezeichnen, ein oder mehrere seiner Stoffwechselprodukte in einer Menge zu produzieren, die über die zur Vermehrung des Mikroorganismus benötigte Menge hinausgeht, wodurch es zur Anreicherung im Fermentationsmedium kommt, wobei die Anreicherung extra- oder intrazellulär erfolgen kann.

Als Stärkequelle kommen für das Vermählen vor allem trockene Kornfrüchte oder Sa- men in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Triticale, Reis sowie in Zuckerrüben, Kartoffeln, Cassava und verschiedenen Hirsesorten, z. B. Sorghum und MiIo. Bevorzugt ist die Stärkequelle unter Getreide und speziell unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit analogen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Kornfrüchte oder Samen.

Zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums wird im Schritt i) die jeweilige Stärkequelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z. B. Wasser, vermählen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden.

Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt.

Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermählen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt i) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d. h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 μm in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der vermahlenen Mehlpartikel eine Korn- große von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z. B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermentationsschritt, führen.

Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Aus- mahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad entspricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls, bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z. B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermählen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich daher auch in der so genannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem A- schegehalt des Mehles beruht (so genannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d. h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuron- schicht der Getreidekörner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermählen und weiter verarbei- tet, gegebenenfalls nach vorheriger mechanischer Abtrennung von Keim und Spelzen.

Erfindungsgemäß enthält das verwendete Mahlgut zumindest einen Teil, vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-%, speziell wenigstens 90 Gew.-% und ganz speziell wenigstens 99 Gew.-% der in den vermahlenen Getrei- dekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts (und damit auf die Menge an verstoffwechselbarem Zucker im Medium M) beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile Mahlgut vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 15 Gew.-%, z. B. zwischen 15 und 75 Gew.- % und speziell zwischen 20 und 60 Gew.-%.

Anschließend wird das Mahlgut in Schritt ii) mit einer wässrigen Flüssigkeit, z. B. Frischwasser, rückgeführtem Prozesswasser, z. B. aus einer nachfolgenden Fermentation, oder mit einer Mischung dieser Flüssigkeiten vermischt, wobei man eine wässrige Suspension erhält. Dieser Vorgang wird häufig auch als Anmaischen bezeichnet.

In der Regel wird man eine solche Menge der Stärkequelle bzw. des Mahlguts mit der wässrigen Flüssigkeit vermischen, dass die erhaltene Suspension einen Trockenmassegehalt von wenigstens 45 Gew.-%, häufig wenigstens 50 Gew.-%, insbesondere we- nigstens 55 Gew.-%, speziell wenigsten 60 Gew.-%, z. B. 45 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 75 Gew.-%, insbesondere 55 bis 70 Gew.-% und speziell 60 bis 70 Gew.- % aufweist.

Grundsätzlich ist möglich, die zum Suspendieren des festen Mahlguts verwendete wässrige Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z. B. im Bereich von 40 bis 70 °C, vorzutemperieren. Es ist bevorzugt, dass die Temperatur der Flüssigkeit so ge- wählt ist, dass die erhaltene Suspension eine Temperatur unterhalb der Verkleiste- rungstemperatur, vorzugsweise wenigstens 5 K unterhalb der Verkleisterungstempera- tur der Stärke aufweist. Vorzugsweise wird die Temperatur der Suspension 60 °C, insbesondere 55 °C, nicht überschreiten.

Das Suspendieren des teilchenförmigen Mahlguts in der wässrigen Flüssigkeit, kann sowohl diskontinuierlich als auch kontinuierlichen in den hierfür üblichen Vorrichtungen erfolgen, beispielsweise diskontinuierlich in Rührwerksmischern oder in kontinuierlich betriebenen Mischvorrichtungen für das Vermischen vorn Feststoffen mit Flüssigkeiten, beispielsweise in Mischern, die nach dem Rotor-Stator-Prinzip arbeiten.

Zur Durchführung der Hydrolyse wird die das Mahlgut enthaltende wässrige Suspension zunächst durch Einbringen von Wasserdampf auf eine Temperatur oberhalb der Verkleisterungstemperatur der in der Stärkequelle bzw. dem Mahlgut enthaltenen Stär- ke erhitzt. Die hierzu für die jeweilige Stärke erforderliche Temperatur ist dem Fachmann bekannt (siehe das eingangs zitierte „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Kapitel 2, S. 11 ) oder kann von ihm in Routineexperimenten bestimmt werden. Typischerweise wird man auf eine Temperatur erhitzen, die wenigstens 10 K und insbesondere wenigstens 20 K, z. B. 10 bis 100 K, insbesondere 20 bis 80 K oberhalb der jeweiligen Verkleisterungstemperatur liegt. Insbesondere erhitzt man die Suspension auf Temperaturen im Bereich von 90 bis 150 °C, und speziell im Bereich von 100 bis 140 °C.

Bei dem zum Erhitzen eingesetzten Wasserdampf handelt es sich typischerweise um überhitzen Wasserdampf, der eine Temperatur von wenigstens 105 °C, insbesondere wenigstens 110 °C, z. B. 1 10 bis 210 °C aufweist. Vorzugsweise wird der Dampf mit Überdruck in die Suspension eingebracht. Dementsprechend weist der Dampf vorzugsweise einen Druck von wenigstens 1 ,5 bar, z. B. 1 ,5 bis 16 bar, insbesondere 2 bis 12 bar auf.

Das Einbringen von Wasserdampf in die Suspension erfolgt in der Regel so, dass man den Dampf mit Überdruck, vorzugsweise einem Überdruck von 1 bis 10 oder 11 bar, insbesondere 1 ,5 bis 5 bar und vorzugsweise mit hoher Geschwindigkeit in die Suspension einträgt. Durch das Eintragen des Dampfes erhitzt sich die Suspension au- genblicklich auf Temperaturen oberhalb 90 °C, also auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstemperatur.

Vorzugsweise erfolgt das Erhitzen mit Wasserdampf in einer kontinuierlich arbeitenden Vorrichtung, in welche man die Suspension kontinuierlich mit einem bestimmten För- derdruck, der sich aus der Viskosität der Suspension, der Fördergeschwindigkeit und der Geometrie der Vorrichtung ergibt, einspeist und in die man im Bereich des Einspei- sens der Suspension den heißen Dampf mit Überdruck, bezogen auf den Förderdruck, über eine regelbare Düse einspeist. Durch das Einspeisen des Dampfs mit Überdruck wird die Suspension nicht nur erhitzt sondern es wird auch mechanische Energie in das System eingetragen, welche eine weitere Zerteilung der Mahlgutpartikel fördert, einen besonders gleichmäßigen Energieeintrag bewirkt, und somit eine besonders gleichmäßige Verkleisterung der granulären Stärkepartikel im Mahlgut zur Folge hat. Typischerweise haben diese Vorrichtungen eine röhrenförmige Geometrie. Vorzugsweise erfolgt das Eintragen des Dampfes in Richtung der Längsachse der röhrenförmigen Vorrichtung. Die Zufuhr der Suspension erfolgt in der Regel in einem Winkel von wenigstens 45° oder senkrecht hierzu. Die regelbare Düse weist typischerweise eine konische Geometrie auf, die sich in Fließrichtung des Dampfs verjüngt. In dieser Düse ist eine Nadel oder ein auf einer in Längsrichtung verschiebbaren Stange angeordneter Kegel angeordnet. Nadel bzw. Kegel bildet mit dem Konus der Düse einen Spalt. Durch Verschieben der Nadel bzw. der Stange in Längsrichtung lässt sich die Größe des Spalts und damit die Querschnittsfläche der Düsenöffnung in einfacher Weise einstellen, wodurch man in einfacher Weise die Geschwindigkeit des Dampfeintrags regulieren kann.

Typischerweise weisen diese Vorrichtungen außerdem ein Vermischungsrohr auf, in welches die Suspension nach dem Dampfeintrag transportiert und aus der Vorrichtung ausgetragen wird. Dieses Vermischungsrohr ist üblicherweise in Richtung des Dampfeintrags und senkrecht zur Einspeisung angeordnet. Das Vermischungsrohr bildet typischerweise mit der Düse einen Spalt, durch den die Suspension transportiert wird. Durch diesen Spalt wirken beim Transport zusätzliche Scherkräfte auf die Suspension und erhöhen somit den mechanischen Energieeintrag in die Suspension. Das Vermischungsrohr kann in Längsrichtung verschiebbar angeordnet sein. Durch Verschieben des Vermischungsrohrs lässt sich in einfacher Weise die Größe der Spaltöffnung einstellen und damit das Druckgefälle in der Vorrichtung.

Derartige Vorrichtungen sind unter der Bezeichnung Jet-Kocher aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise die in „The Alcohol Textbook", Kapitel 2, loc. cit, Figur 13 dargestellte Vorrichtung und kommerziell erhältlich, beispielsweise unter der Bezeichnung HYDROHEATER® der Fa. Hydro Thermal Corp. Waukesha Wl, USA.

Bei kontinuierlicher Reaktionsführung wird die mit Wasserdampf behandelte Suspension in der Regel im Anschluss daran in eine Nachreaktionszone überführt, um das Gelieren der Stärkebestandteile fortzusetzen. In der Nachreaktionszone herrscht typischerweise Überdruck, typischerweise ein Absolutdruck im Bereich von 2 bis 8 bar. Die Temperaturen in der Nachreaktionszone liegen typischerweise im Bereich von 90 bis 150 °C. Die Verweilzeit in dieser Nachreaktionszone kann in Abhängigkeit von der Temperatur der Suspension im Bereich von 1 min bis 4 h betragen. Die Nachreakti- onszonen weisen typischerweise eine röhrenförmige oder säulenförmige Geometrie auf. In einer Ausführungsform handelt weist die Nachreaktionszone die Geometrie einer senkrecht angeordneten Säule auf. Die Suspension wird hierbei nach Verlassen der Vorrichtung zur Dampfbehandlung eine im oberen Bereich der Säule aufgebracht und im unteren Bereich entnommen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist die Nachreaktionszone eine röhrenförmige Geometrie auf.

Nach Verlassen der Nachreaktionszone wird die Suspension in der Regel entspannt und man führt dann eine Verflüssigung durch. Vorzugsweise führt man die Entspan- nung als Flash-Verdampfung durch, um die Suspension abzukühlen, vorzugsweise auf Temperaturen unterhalb 100 °C, insbesondere unterhalb 85 °C. In der Regel erfolgt dann eine Verflüssigung der so aufgeschlossenen Stärke in einem separaten Reaktionsgefäß. Die Verflüssigung kann in der oben beschriebenen Weise durchgeführt werden.

Die Verflüssigung kann in üblicher Weise durchgeführt werden. In der Regel erfolgt das Verflüssigen in Schritt ii) in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms, das in der Regel unter α-Amylasen ausgewählt ist. Andere unter den Reaktionsbedingungen aktive und stabile Stärke verflüssigende Enzyme sind ebenfalls einsetz- bar.

Zur Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut können grundsätzlich alle Stärke verflüssigenden Enzyme, insbesondere α-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1 ) eingesetzt werden, beispielsweise α-Amylasen, die aus Bacillus lichenformis oder Bacillus stae- rothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bio- ethanol verwendet werden. Bevorzugte Enzyme sind temperaturstabil, d. h. sie verlieren auch beim Erhitzen auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstemperatur ihre enzymatische Aktivität nicht. Die zum Verflüssigen geeigneten α-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeichnung Terma- myl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Bezeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener α-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.

Vorteilhafterweise werden die Mengen an Stärke verflüssigendem Enzym, insbesonde- re α-Amylase, so gewählt, dass ein rascher und vollständiger Abbau der Stärke zu Oligosacchariden erreicht wird. Die Gesamtmenge an Stärke verflüssigendem Enzym, insbesondere α-Amylase, liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Die α-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes der Verflüssigung zugegeben werden.

Für eine optimale Wirkung der α-Amylase (bzw. des verwendeten Stärke verflüssigen- den Enzyms) wird Schritt ii) vorzugsweise zumindest zeitweise bei einem pH-Wert im pH-Optimum des verflüssigenden Enzyms, häufig bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt ii) die pH- Einstellung vorgenommen wird; dieser pH-Wert wird während der Verflüssigung vor- zugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren wie H₂SO₄ oder H₃PO₄ bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie NaOH oder KOH.

Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca²⁺-lonen, z. B. mit CaCI₂, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z. B. Termamyl als α-Amylase eingesetzt, so ist es vorteilhaft, eine Ca²⁺-Konzentration von z. B. 10 bis 100 ppm, bevorzugt 20 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 30 bis 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen, wobei die Angabe ppm gewichtsbezogen ist und g/1000 kg bedeutet.

Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder mehrere weitere Teilmengen α-Amylase, z. B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt man wenigstens einen Teil oder die Gesamtmenge, in der Regel wenigstens 50 %, insbesondere wenigstens 80 % der Gesamtmenge oder die Gesamtmenge des die Stärke verflüssigenden Enzyms vor dem Erhitzen mit Wasserdampf zu der Suspension des Mahlguts in der wässrigen Flüssigkeit. Auf diese Weise erfolgt die Verflüssigung bereits während des Erhitzens auf Temperaturen oberhalb der Verkleisterungstemperatur. Das Erhitzen mit Wasserdampf und die Nachreaktionsphase werden entsprechend durchgeführt. Eine anschließende Verflüssigung in einem separaten Reaktionsgefäß kann entfallen. Vorzugsweise wird man jedoch eine solche Verflüssigung zur Vervollständigung des Abbaus der Stärke in Dextrine durchführen. Auf diese Weise erhält man eine wässriges Stärkehydrolysat, welches den verflüssigten Stärkeanteil aus dem Mahlgut, typischerweise Dextrine und gegebenenfalls weitere Oligosaccharide und Mono- oder Disaccharide, sowie die nicht-stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts, insbesondere die festen, nicht-stärkehaltigen Bestandteile des zur Verflüssigung eingesetzten Mahlguts enthält.

Dieses Hydrolysat kann als wässriges Medium M direkt einer Fermentation zur Herstellung der organischen Verbindung zugeführt werden. Häufig wird man jedoch noch einer Verzuckerung unterwerfen. Die Verzuckerung kann in Analogie zu den bekannten Verzuckerungsverfahren des Standes der Technik durchgeführt werden.

Die Verzuckerung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt. Das verflüssigte Medium wird hierzu typischerweise in einem speziellen Verzuckerungstank vollständig verzuckert, bevor es z. B. einem nachfolgenden Fermentationsschritt zugeführt wird. Hierzu wird man das nach Verflüssigung erhaltene wässrige Produkt mit einem die Verzuckerung bewirkenden Enzym, typischerweise einer Glucoamylase, unter den hierfür üblichen Bedingungen behandeln.

Zur Verzuckerung der Dextrine (d. h. Oligosaccharide) können grundsätzlich alle GIu- coamylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.3) eingesetzt werden, insbesondere Glucoamyla- sen, die aus Aspergilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verzuckern von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verzuckern geeigneten Glucoamylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeich- nung Dextrozyme GA; oder von Genencor unter der Bezeichnung Optidex. Es kann auch eine Kombination verschiedener Glucoamylasen verwendet werden.

Das verzuckernde Enzym wird dem nach der Verflüssigung erhaltenen dextrinhaltigen Hydrolysat üblicherweise in einer Menge von 0,001 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,005 bis 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zugesetzt.

In der Regel erfolgt die Verzuckerung bei Temperaturen im Bereich des Temperaturoptimums des verzuckernden Enzyms oder leicht darunter, z. B. bei 50 bis 70 °C, bevor- zugt bei 60 bis 65 °C. Vorzugsweise wird man das wässrige Verflüssigungsprodukt zunächst auf diese Temperaturen einstellen und anschließend mit dem die Verzuckerung bewirkenden Enzym versetzen. Vorteilhafterweise wird vor Zugabe des verzuckernden Enzyms, z. B. der Glucoamylase, der pH-Wert des wässrigen Hydrolysat auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich des eingesetzten Enzyms, vorzugsweise im Be- reich zwischen 3,5 und 6,0; besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,5 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 eingestellt. Nach Zugabe des verzuckernden Enzyms wird die dextrinhaltige Suspension vorzugsweise für einen Zeitraum von z. B. 2 bis 72 Stunden oder länger, sofern erforderlich, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Dextrine zu Monosacchariden verzuckert werden. Der Fortschritt der Verzuckerung kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, z. B. HPLC, Enzymtests oder Glucose- Teststäbchen, verfolgt werden. Die Verzuckerung ist abgeschlossen, wenn die Konzentration der Monosaccharide nicht mehr wesentlich ansteigt oder wieder fällt.

Da zur Herstellung des wässrigen Hydrolysats ein Mahlgut eingesetzt wird, welches im Wesentlichen alle Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest neben der Stärke auch einen Teil der festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile enthält (d. h. es wird keine vollständige Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle vorgenommen), umfasst das nach Verflüssigung und gegebenenfalls Verzuckerung erhaltene wässrige Hydrolysat auch einen Teil oder die Gesamtmenge der nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat, z. B. aus der Kornfrucht. Um die daraus resultierende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise dem Hydrolysat eine oder mehrere Phytasen zugesetzt, bevor man es einem Fermentati- onsschritt zugeführt wird. Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist. Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbedingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50 °C und besonders bevorzugt > 60 °C. Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 4000 Units/kg Stärkequelle.

Zur Erhöhung der Gesamtzuckerausbeute bzw. zur Gewinnung freier Aminosäuren können dem während der Verflüssigung oder während der Verzuckerung weitere En- zyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Glucanasen, Xylanasen, Glucosidasen oder Proteasen, zugesetzt werden. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d. h. herabsetzen (z. B. durch Spaltung langkettiger (auch bezeichnet als längerkettiger) Glucane und/oder von (Arabino-)Xylanen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von (Rest-)Stärke bewir- ken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird man keine oder nur eine teilweise Verzuckerung vor der Fermentation vornehmen. Die Verzuckerung erfolgt dann zu- mindest teilweise während der Fermentation, d. h. in-situ. Beispielsweise kann man hierbei so vorgehen, dass man eine Teilmenge der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, z. B. im Bereich von 10 bis 90 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 20 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Dextrine (bzw. der ursprünglichen Stärke), verzuckert und das resultierende zuckerhaltige Medium in der Fermentation einsetzt. Im Fermentationsmedium kann dann eine weitere Verzuckerung in situ erfol- gen. Die Verzuckerung kann des Weiteren unter Wegfall eines separaten Verzuckerungstanks direkt im Fermenter durchgeführt werden.

Die in situ-Verzuckerung kann unter Zusatz verzuckernder Enzyme, wie oben beschrieben, oder auch in Abwesenheit solcher Enzyme erfolgen, da viele Mikroorganis- men selber in der Lage sind, Oligosacharide zu verstoffwechseln. Dabei werden die Dextrine entweder als solche von dem Mikroorganismus aufgenommen und verstoff- wechselt oder nach vorheriger Verzuckerung durch Stamm-eigene verzuckernde Enzyme, z. B. Stamm-eigene Glukoamylasen, hydrolysiert und dann verstoffwechselt. Besonders vorteilhaft ist im letzteren Fall, dass während der Fermentation die Ge- schwindigkeit der Verzuckerung, insbesondere einer Glucosefreisetzung, einerseits durch die Menge an Biomasse und anderseits durch das Expressionsniveau der Stamm-eigenen verzuckernden Enzyme dem Bedarf der Mikroorganismen automatisch angepasst wird.

Vorteile der in-situ-Verzuckerung sind einerseits reduzierte Investitionskosten, andererseits kann durch eine retardierte Freisetzung der Glucose gegebenenfalls eine höhere Glucosekonzentration im Ansatz (Batch) vorgelegt werden, ohne dass eine Inhibierung oder Stoffwechseländerung der eingesetzten Mikroorganismen auftritt. Bei E. coli führt eine zu hohe Glucosekonzentration z. B. zur Bildung von organischen Säu- ren (Acetat), während Saccharomyces cerevisae in diesem Fall z. B. auf Vergärung umschaltet, obwohl in belüfteten Fermentern ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (Crabtree-Effekt). Eine retardierte Freisetzung von Glucose ist durch die Regelung der Glucoamylasekonzentration einstellbar. Hierdurch können die vorgenannten Effekte unterdrückt werden und es kann mehr Substrat vorgelegt werden, so dass die aus dem zugeführten Feed-Strom resultierende Verdünnung reduziert werden kann.

Das nach Verflüssigung und ggf. durchgeführter Verzuckerung erhaltene wässrige Hydrolysat, d. h. das Medium M weist typischerweise einen Trockenmassegehalt von wenigstens 45 Gew.-%, häufig wenigstens 50 gew.-%, insbesondere wenigstens 55 Gew.-%, speziell wenigsten 60 Gew.-%, z. B. 45 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 75 Gew.-%, insbesondere 55 bis 70 Gew.-% uns speziell 60 bis 70 Gew.-% auf. Dementsprechend weist das nach Hydrolyse erhaltene wässrige Medium M in der Regel eine Zuckerkonzentration, gerechnet als Glukoseäquivalente von mindestens 35 Gew.-%, häufig wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 45 Gew.-%, spe- ziell wenigstens 50 Gew.-%, z. B. 35 bis 70 Gew.-%, insbesondere 40 bis 65 Gew.-%, insbesondere 45 bis 60 Gew.-% und speziell 50 bis 60 Gew.-% auf. bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums M auf.

Die in dem se erhaltenen Medium M enthaltenen Glukoseäquivalente liegen je nach Verfahrensführung in Form von Mono- oder Oligosacchariden, insbesondere Dextrinen vor. Hauptbestandteil sind typischerweise Monosaccharide wie Hexosen und Pentosen, z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Sorbose, Xylose, Arabinose und Ribose, insbesondere Glucose oder Oligosaccharide dieser Monosaccharide. Der Anteil an von Glucose verschiedenen Monosacchariden in freier Form bzw. als Bestand- teile der Oligosaccharide im Medium M kann abhängig von der verwendeten Stärkequelle und den darin enthaltenen nicht-stärkehaltigen Bestandteilen variieren und durch die Verfahrensführung, beispielsweise durch Aufschluss von Cellulosebestand- teilen durch Zusatz von Cellulasen, beeinflusst werden. Typischerweise liegt der Anteil an Glucose, in freier oder gebundener Form, unter den Glukoseäquivalenten des Me- diums M im Bereich von 50 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 75 bis 97 Gew.-% und speziell von 80 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Menge an Glukoseäquivalenten.

Das in Schritt iii) erhaltene wässrige Medium M wird erfindungsgemäß in Schritt iv) zur fermentativen Herstellung der gewünschten organischen Verbindung verwendet. Hierzu wird das Medium M einer Fermentation zugeführt, wo es zur Kultivierung der in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen dient. Die jeweilige organische Verbindung wird hierbei als flüchtiges oder nichtflüchtiges mikrobielles Stoffwechselprodukt erhalten.

In der Regel wird man das Dextrin-haltige Medium M auf Fermentationstemperatur, üblicherweise im Bereich von 32 bis 37 °C, abkühlen, bevor man es der Fermentation zuführt.

Das wässrige Dextrin-haltige Medium M kann vor der Fermentation gegebenenfalls sterilisiert werden, wobei man die Mikroorganismen in der Regel durch thermische oder chemische Verfahren abtötet. Hierzu heizt man das wässrige Medium M üblicherweise auf Temperaturen oberhalb 80 °C auf. Die Abtötung bzw. Lyse der Zellen kann unmittelbar vor der Fermentation erfolgen. Hierzu wird das gesamte Medium M der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Diese kann z. B. thermisch oder chemisch erfolgen. Es hat sich jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als nicht notwendig erwiesen, vor der Fermentation einen Sterilisierungsschritt wie hier beschrieben durchzuführen, sondern es hat sich vielmehr als vorteilhaft erwiesen, keinen solchen Sterilisierungsschritt durchzuführen. Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungs- form der Erfindung ein Verfahren, bei dem das in Schritt iii) erhaltene Medium M unmittelbar, d. h. ohne vorherige Sterilisation, der Fermentation zugeführt wird. Bei der Fermentation erfolgt die Verstoffwechselung der im Medium enthaltenen Zucker. Sofern die im Medium enthaltenen Zucker in Form von Oligosacchariden, speziell in Form von Dextrinen, vorliegen, werden diese entweder als solche von dem Mikroor- ganismus oder nach vorheriger Verzuckerung durch zugesetzte oder Stamm-eigene verzuckernde Enzyme, insbesondere Glucoamylasen, aufgenommen und verstoff- wechselt. Sofern keine verzuckernden Enzyme zugesetzt werden und die im Medium enthaltenen Zucker in Form von Oligosacchariden, speziell Dextrinen vorliegen, erfolgt eine Verzuckerung der verflüssigten Stärkebestandteile parallel zur Verstoffwechse- lung des Zuckers, insbesondere des Monosaccharids Glucose, durch die Mikroorganismen.

Die Durchführung der Fermentation kann in der dem Fachmann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen. Hierzu wird in man der Regel den jeweils gewünschten Mikro- Organismus in dem nach dem hier beschriebenen Verfahren erhaltenen Flüssigmedium kultivieren.

Das Fermentationsverfahren kann sowohl diskontinuierlich (Batchfahrweise) als auch semikontinuierlich (Fed-Batch-Fahrweise, einschließlich Fedbatch mit Zwischenernten) betrieben werden, wobei die semikontinuierliche Fahrweise bevorzugt ist.

Beispielsweise kann man das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Medium M oder eine konventionelle Zuckerquelle, d. h. verstoffwechselbare Mono-, Di- und/oder Oligosaccharide oder Medien, die verstoffwechselbare Mono-, Di- und/oder Oligosaccharide enthalten, gegebenenfalls nach Verdünnen mit Wasser und Zugabe üblicher Medienbestandteile wie Puffer, Nährsalze, Stickstoffquellen wie Ammoniumsulfat, Harnstoff etc., komplexe Nährmedienbestandteile, enthaltend Aminosäuren, wie Hefeextrakte, Peptone, CSL und dergleichen, mit dem gewünschten Mikroorganismus inokulieren, und diesen unter Fermentationsbedingungen vermehren, bis die Mikroor- ganismenkonzentration den für die Fermentation gewünschten stationären Zustand erreicht. Hierbei wird der in dem Fermentationsmedium enthaltene Zucker verstoff- wechselt und das gewünschte Stoffwechselprodukt gebildet (so genannte Batchfahrweise oder Batchphase).

Bei der Fed-Batch-Fahrweise wird im Anschluss an die Batchphase, z. B. wenn die

Gesamtzuckerkonzentration unter einen bestimmten Wert abgesunken ist, das Medium M kontinuierlich oder diskontinuierlich zu dem Fermentationsmedium gegeben.

Eine typische Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Fed-Batch- Fahrweise, welche die folgenden Schritte umfasst: v) Kultivieren des zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten Mikroorganismus in einem wässrigen Fermentationsmedium F; und

vi) Zugabe des Mediums M zu dem Fermentationsmedium F, in welchem die im Medium M enthaltenen hydrolysierten Stärkebestandteile, d. h. die Zucker, durch die die organische Verbindung überproduzierenden Mikroorganismen unter Bildung der organischen Verbindung verstoffwechselt werden.

In Schritt v) kann man beispielsweise zunächst ein herkömmliches zuckerhaltiges Me- dium, in der Regel eine Glucoselösung, durch Verdünnung mit einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere Wasser auf eine geeignete Zuckerkonzentration einstellen und die zur Fermentation üblichen Medienbestandteile wie Puffer, Nährsalze, Stickstoffquellen wie Ammoniumsulfat, Harnstoff etc., komplexe Nährmedienbestandteile, enthaltend Aminosäuren, wie Hefeextrakte, Peptone, CSL und dergleichen, zugeben. Hierbei wird man das Verhältnis von Zuckermenge zu Flüssigkeit in der Regel vorzugsweise so wählen, dass die Gesamtkonzentration an Monosacchariden im Fermentationsmedium F weniger als 6 Gew.-%, z. B. im Bereich von > 0 bis 5 Gew.-%, gerechnet als Glukoseäquivalente und bezogen auf das Gesamtgewicht des Fermentationsmediums F, beträgt. Das so angesetzte zuckerhaltige Batch-Medium wird mit dem gewünschten Mikroorganismus inokuliert und der Mikroorganismus im Batch-Medium (Fermentationsmedium F) unter Fermentationsbedingungen vermehrt, bis die Konzentration an Mikroorganismen einen für die Fermentation gewünschten stationären Zustand erreicht. Hierbei wird der in dem Fermentationsmedium F vorgelegte Zucker verstoffwechselt und das gewünschte Stoffwechselprodukt gebildet.

Durch Zugabe gemäß Schritt vi) des wässrigen Mediums M zu dem Fermentationsmedium F wird der Fermentationsprozess aufrechterhalten und das vom Mikroorganismus überproduzierte Stoffwechselprodukt reichert sich in der Fermentationsbrühe an. Hierbei liegt das Volumenverhältnis von zugeführtem Medium M zu dem vorgeleg- ten und die Mikroorganismen enthaltenden Batch-Medium (Fermentationsmedium F) im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 :10 bis 10:1 und vorzugsweise bei etwa 1 :5 bis 5:1 und speziell im Bereich von 1 :1 bis 5:1. Insbesondere über die Zufuhrgeschwindigkeit des zuckerhaltigen Flüssigmediums kann der Zuckergehalt in der Fermentationsbrühe reguliert werden. In der Regel wird man die Zufuhrgeschwindigkeit so einstellen, dass der Monosaccharidgehalt in der Fermentationsbrühe im Bereich von > 0 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% liegt und insbesondere einen Wert von 3 Gew.-% nicht überschreitet.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fermentationsmedium F in Schritt v) (d. h. hier das Batch-Medium) im Wesentlichen das Medium M, die zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten Mikroorganismen, Nährsalze, übliche Hilfsstoffe wie Basen oder Puffer und gegebenenfalls Wasser zur Verdünnung. Hierzu wird man das Medium M gegebenenfalls auf die gewünschte Zuckerkonzentration verdünnen, z. B. im Bereich von 0,1 bis 10 Gew.-%, gerechnet als Glukoseäquivalente und bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums M, und dieses direkt zum Ansetzen des Fermentationsmediums F (Batch-Medium) verwenden.

Der Zuckergehalt des zur Aufrechterhaltung der Fermentation eingesetzten Dextrinhal- tigen Mediums gemäß Schritt vi), liegt üblicherweise höher, z. B. in den o. g. Bereichen, um die Verdünnung des Fermentationsmediums F zu minimieren.

Vorzugsweise wird man so vorgehen, dass man ein wässriges Medium M mit einer höheren Zuckerkonzentration, z. B. mindestens 40 Gew.-%, speziell mindestens 45 Gew.-% und ganz speziell mindestens 50 Gew.-%, gerechnet als Glukoseäquivalente und bezogen auf das Gesamtgewicht des wässrigen Mediums M, herstellt. Die- ses Medium M verwendet man dann einerseits gemäß Schritt v) nach Verdünnung mit Wasser zum Ansetzen des Batch-Mediums (Fermentationsmedium F) und andererseits gemäß Schritt vi) zur Zugabe zu dem Fermentationsmedium F.

Es versteht sich, dass erfindungsgemäß in der Batchphase und/oder in der Fed- Batchphase die Hauptmenge, vorzugsweise wenigstens 60 Gew.-%, insbesondere wenigstens 70 Gew.-% des in der Fermentation eingesetzten zu verstoffwechselnden Zuckers aus dem Medium M stammen. In einer Ausführungsform der Erfindung stammt ein Teil, z. B. 1 bis 50 Gew.-%, insbesondere 5 bis 40 Gew.-% und speziell 10 bis 30 Gew.-% des in der Fermentation eingesetzten zu verstoffwechselnden Zuckers aus konventionellen Zuckerquellen. Zu den konventionellen Zuckerquellen zählen Mono- und Disaccharide wie Glucose und Saccharose aber auch Medien, die verstoffwech- selbare Mono-, Di- und/oder Oligosaccharide in einer Konzentration von wenigstens 50 Gew.-% enthalten und die im Wesentlichen frei sind von in Wasser unlöslichen Feststoffen, beispielsweise Glucosesirupe, Saccharosesirupe, Dicksäfte, Maltosesiru- pe, Dextrinsirupe aber auch Abfallprodukte der Zuckerherstellung (Melassen), insbesondere Melassen aus der Rübenzuckerherstellung aber auch Melassen aus der Rohrzuckerherstellung.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können flüchtige und nichtflüchtige, insbeson- dere nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und 1 N-Atom fermentativ hergestellt werden.

Hierbei werden unter nichtflüchtigen Produkten solche Verbindungen verstanden, die sich auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrühe gewinnen las- sen. Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150 °C und insbesondere oberhalb 200 °C bei Normaldruck auf. In der Regel handelt es sich um Verbindungen, die bei Normalbedingungen (298 K, 101 ,3 kPa) in festem Zustand vorliegen.

Es ist jedoch auch möglich, das wässrige Medium M in einer Fermentation zur Herstel- lung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte einzusetzen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen.

Der Begriff nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte umfasst hierin insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen, z. B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Propionsäure, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, Glutar- säure, Lävulinsäure, Gluconsäure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäu- re; proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren, z. B. Lysin, Glutamat, Methio- nin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan und Threonin; Purin- und Pyrimidinba- sen; Nukleoside und Nukleotide, z. B. Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) und Adeno- sin-5'-monophosphat (AMP); Lipide; gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z. B. γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachi- donsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z. B. Propandiol und Butandiol; mehrwertige (auch bezeichnet als höher- wertige) Alkohole mit 3 oder mehr, z. B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z. B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; langkettige (auch bezeichnet als längerkettige) Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z. B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z. B. Butanol; Koh- lenhydrate, z. B. Hyaluronsäure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z. B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z. B. Ascorbinsäure, Vitamin B₆, Vitamin B₁₂ und Riboflavin, Cofaktoren und so genannte Nutrazeutika; Proteine, z. B. Enzyme wie Amylasen, Pektinasen, saure, hybride oder neutrale ZeIIuIa- sen, Esterasen wie Lipasen, Pankreasen, Proteasen, Xylanasen und Oxidoreduktasen wie Laccase, Katalase und Peroxidase, Glucanasen, Phytasen; Carotenoide, z. B. Ly- copin, ß-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z. B. Aceton und Acetoin; Lactone, z. B. γ-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z. B. Polyhydroxyacetat, Polyester, z. B. Polylactid, Polysaccharide, Polyisoprenoide, PoIy- amide; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrieben.

Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.

Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z. B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.

Insbesondere sind die hergestellten Stoffwechselprodukte unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen ausgewählt.

Es versteht sich für den Fachmann, dass die derart auf fermentativem Weg hergestellten Verbindungen jeweils in der von den eingesetzten Mikroorganismen produzierten Enantiomerenform erhalten werden (sofern unterschiedliche Enantiomere existieren). So erhält man z. B. von den Aminosäuren in der Regel das jeweilige L-Enantiomer.

Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen mikrobiellen Stoffwechselprodukten, wie unten im Einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind z. B. in Ta- belle A angegeben.

Tabelle A:

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die hergestellte organische Verbindung unter gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbon- säuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen; Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 4 bis 10 C-Atomen, mehrwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, längerkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutra- zeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lactonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt.

Eine erste bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von Enzymen wie Phytasen, Xylanasen oder Glucanasen.

Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin und Glutamat Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von Vitaminen wie Pantothensäure und Riboflavin, Vorläufern und Folgeprodukten davon.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen den Einsatz des erfindungsgemäß erhältlichen zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer fermentativen Herstellung von

- Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere aliphatischen Mono- und Dicar- bonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; längerkettigen Alkanolen wie zuvor genannt, insbesondere Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol;

Diolen wie zuvor genannt, insbesondere Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol;

Ketonen wie zuvor genannt, insbesondere Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; und - Kohlehydraten wie zuvor genannt, insbesondere Disacchariden wie Trehalose.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Po- lyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester mit anderen organi- sehen Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure und anderen, die in Steinbüchel (a.a.O.) beschrieben sind, z. B. auch langkettige (auch bezeichnet als längerkettige) Hydroxycarbonsäuren wie 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure und 3-Hydroxytetradecansäure, sowie Mischungen davon. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehenswei- sen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in S. Y. Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate produetion in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S. 431-438.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mik- roorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte überproduzieren:

Enzyme wie Phytase, Xylanase oder Glucanase; Aminosäuren wie Lysin, Threonin oder Methionin; - Vitamine wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon; Disaccharide wie Trehalose; aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure; aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; - Polyhydroxyalkanoate wie Poly-3-hydroxybutyrat und Copolyester der

3-Hydroxybuttersäure;

Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton;

Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; und Alkandiole mit 3 bis 8

C-Atomen wie Propandiol.

Geeignete Mikroorganismen sind üblicherweise ausgewählt unter den Gattungen Co- rynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum, Rhizopus arrhizus und Rhizopus oryzae.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismus um einen Stamm aus der Gattung Corynebacterium, insbesondere um einen Stamm des Corynebacterium glutamicum. Insbesondere handelt es sich um einen Stamm der Gattung Corynebacterium, speziell des Corynebacte- rium glutamicum, welcher eine Aminosäure, speziell Lysin, Methionin oder Glutamat überproduziert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismus um einen Stamm aus der Gattung Escheri- chia, insbesondere um einen Stamm des Escherichia coli. Insbesondere handelt es sich um einen Stamm der Gattung Escherichia, speziell des Escherichia coli, welcher eine Aminosäure, speziell Lysin, Methionin oder Threonin überproduziert.

In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fer- mentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in Pfefferle et al., a.a.O., und US 3,708,395. Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z. B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pan- tothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 01/021772.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Ri- boflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this ri- boflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Fu- marsäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z. B. in Rhodes et al, Production of Fumaric Acid in 20-L Fermen- tors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1 ), 9-15.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Bernsteinsäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 498 -504 (1976); EP 249773 (1987), Erf.: Lemme u. Datta; US 5504004 (1996), Erf.: Guettler, Jain u. Soni; Arch. Microbiol. 167, 332 -342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actinobacillus suc- cinogenes sp. nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan; 49 Pt 1 :207-16; US 5,723,322, US 5,573,931 , US 5,521 ,075, WO 99/06532, US 5,869,301 oder US 5,770,435.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine Phytase. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 98/55599.

Bei der Fermentation resultiert eine Fermentationsbrühe, die neben dem gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukt im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verflüssigten Stärkelösung und insbesondere die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, wie z. B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Puffer- und Nährsalze enthält. Dieses Flüssigmedium wird in der vorliegenden Anmeldung auch als Fermentationsbrühe bezeichnet, wobei die Fermentationsbrühe auch das zugegebene Dextrin-haltige Medium (1 ) umfasst, bei dem eine erst teilweise oder unvollständige fermentative Umsetzung der darin enthaltenen Zucker, d. h. eine teilweise oder unvollständige mikrobielle Verstoffwechselung der verwertbaren Zucker (z. B. Mono- und Di- saccharide), erfolgt ist.

Vor der Isolierung oder Abreicherung eines mikrobiellen Stoffwechselprodukts oder Abtrennung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe, wird gegebenenfalls ein Sterilisierungsschritt in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.

Eine spezielle Ausführungsform (I) der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem man wenigstens ein mikrobielles Stoffwechselprodukt aus der Fermentationsbrühe abreichert oder isoliert. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe werden anschließend weitgehend entfernt, wobei man eine feste oder halbfeste Proteinzusammensetzung erhält. Eine genauere Beschreibung zur Durchführung eines solchen Ver- fahrens und der dabei erhaltenen Proteinzusammensetzung ist Gegenstand der

WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) der Anmelderin, auf die bezüglich weiterer Details Bezug genommen wird.

Die Isolierung oder Abreicherung des Stoffwechselprodukts aus der Fermentationsbrü- he, d. h. der organischen Verbindung mit wenigstens 3 C-Atomen oder wenigstens 2 C-Atomen und wenigstens einen N-Atom (im folgenden auch Wertprodukt), erfolgt in der Regel derart, dass man wenigstens ein Stoffwechselprodukt so aus der Fermentationsbrühe abreichert oder isoliert, dass der Gehalt dieses Stoffwechselprodukts in der verbleibenden Fermentationsbrühe höchstens 20 Gew.-%, insbesondere höchstens 10 Gew.-%, speziell höchstens 5 Gew.-% und ganz speziell höchstens 2,5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der verbleibenden Fermentationsbrühe, beträgt.

Die Isolierung oder Abreicherung des mikrobiellen Stoffwechselprodukts aus der Fer- mentationsbrühe kann in einem oder mehreren Schritten erfolgen. Ein wesentlicher Schritt dabei ist die Abtrennung der festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe. Diese kann entweder vor oder nach der Isolierung des Wertprodukts durchgeführt werden. Sowohl zur Isolierung von Wertstoffen als auch zur Abtrennung von Feststoffen, d. h. Fest-Flüssig-Phasenseparation, sind im Fachgebiet übliche Methoden bekannt, die auch Schritte zur Grob- und Feinreinigung der Wertstoffe sowie zur Konfektionie- rung umfassen (z. B. beschrieben in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of In- dustrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH).

Zur Isolierung des Wertprodukts kann man vorteilhafterweise so vorgehen, dass man zunächst die festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe entfernt, z. B. mittels Zentrifugation oder Filtration, und anschließend das Wertprodukt aus der flüssigen Phase isoliert, z. B. durch Kristallisation, Fällung, Adsorption oder Destillation. Alternativ kann das Wertprodukt auch direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert werden, z. B. durch Einsatz chromatographischer Verfahren oder von Extraktions-Verfahren. Als chromatographisches Verfahren ist insbesondere die lonenaustauschchromatographie zu nennen, bei der das Wertprodukt selektiv auf der Chromatographiesäule isoliert werden kann. In diesem Fall erfolgt die Abtrennung der Feststoffe aus der verbleibenden Fermentationsbrühe vorteilhafterweise z. B. durch Dekantieren, Eindampfen oder/und Trocknung.

Im Falle flüchtiger oder öliger Verbindungen ist in der Regel eine Kontrolle der maximalen Temperaturen während der Aufarbeitung, insbesondere während der Trocknung erforderlich. Vorteilhaft können diese Verbindungen auch dadurch hergestellt werden, dass man sie in quasi fester Form (pseudofester Form) auf Adsorbentien formuliert. Zu diesem Zweck geeignete Adsorbentien sind z. B. in der WO 2005/116228

(PCT/EP2005/005728) der Anmelderin angegeben. Beispiele für Verbindungen, die vorteilhaft auf diese Weise hergestellt werden können, sind γ-Linolensäure, Dihomo-γ- Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, weiterhin Propionsäure, Milchsäure, Propandiol, Butanol und Aceton. Auch diese Verbindun- gen in pseudofester Formulierung werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in fester Form verstanden.

Eine weitere spezielle Ausführungsform (II) betrifft ein Verfahren, bei dem man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ohne vorherige Isolierung oder Abrei- cherung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts, und gegebenenfalls ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile, weitgehend entfernt, wobei man eine feste Formulierung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts erhält. Eine genauere Beschreibung zur Durchführung eines solchen Verfahrens findet sich in der PCT/EP2006/066057 (ältere Patentanmeldung DE 10 2005 042 541.0) der Anmelderin. Weitgehend bedeutet, dass nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile ein fester oder zumindest halbfester Rückstand verbleibt, der sich gegebenenfalls durch Zusatz von Feststoffen in ein festes Produkt überführen lässt. In der Regel bedeutet dies, die flüchtigen Bestandteile bis zu einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 30 Gew.-%, häu- fig nicht mehr als 20 Gew.-% und insbesondere nicht mehr als 15 Gew.-%, zu entfernen. In der Regel wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe vorteilhafterweise bis auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt im Bereich von 0,2 bis 30 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 2 bis 15 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 5 bis 15 Gew.-%, bezogen auf das nach Trocknung ermittelte Gesamt- gewicht der festen Bestandteile, aus der Fermentationsbrühe entfernen. Der Restfeuchtigkeitsgehalt kann durch übliche dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, z. B. mittels Thermogravimetrie (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).

Die Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form aus der Fermentationsbrühe kann in ein, zwei oder mehreren Stufen erfolgen, insbesondere in einem ein- oder zweistufigen Vorgehen. In der Regel wird mindestens eine, insbesondere die abschließende Stufe zur Gewinnung des Stoffwechselprodukts in fester Form einen Trocknungsschritt umfassen.

Bei der einstufigen Vorgehensweise wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, entfernen, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist.

Bei der zwei- oder mehrstufigen Vorgehensweise wird man die Fermentationsbrühe, zunächst aufkonzentrieren, z. B. mittels (Mikro-, Ultra-)Filtration oder thermisch durch Verdampfen eines Teils der flüchtigen Bestandteile. Der Anteil der flüchtigen Bestandteile, die in dieser Stufe entfernt werden beträgt in der Regel 10 bis 80 Gew.-% und insbesondere 20 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der flüchtigen Be- standteile der Fermentationsbrühe. In einer oder mehreren sich anschließenden Stufen werden die restlichen flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernt, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist.

Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile des Flüssigmediums erfolgt gemäß dieser Ausführungsform (II) im Wesentlichen ohne eine vorherige Abreicherung oder gar Isolierung des Wertprodukts. Folglich wird bei der Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt im Wesentlichen nicht zusammen mit den flüchtigen Bestandteilen des Flüssigmediums entfernt, sondern verbleibt mit wenigstens einem Teil, üblicherweise mit der Hauptmenge und insbeson- dere mit der Gesamtmenge der sonstigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe im so erhaltenen Rückstand. Dementsprechend können aber auch - Vorzugs- weise geringe - Anteile des gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselpro- dukts, in der Regel maximal 20 Gew.-%, z. B. 0,1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 10, insbesondere nicht mehr als 5 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 2,5 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 1 Gew.-%, bezogen auf das Ge- samttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, beim Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe zusammen mit diesen entfernt werden. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform verbleibt das gewünschte nichtflüchtige mikro- bielle Stoffwechselprodukt zu wenigstens 90 Gew.-%, insbesondere wenigstens 95 Gew.-%, speziell 99 Gew.-% und ganz speziell etwa 100 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, als Feststoff in Mischung mit dem nach Entfernen der flüchtigen Bestandteile erhaltenen Teil oder der Gesamtheit der festen Bestandteile des Fermentationsmediums.

Sofern gewünscht, kann vor dem Entfernen der flüchtigen Bestandteile ein Teil, z. B. 5 bis 80 Gew.-% und insbesondere 30 bis 70 Gew.-%, der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, z. B. mittels Zentrifugati- on oder Filtration. Gegebenenfalls wird man eine solche Vorabtrennung durchführen, um gröbere Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellem Stoffwechselprodukt enthalten, zu entfernen. Zur Vorfiltration können dem Fachmann bekannte, übliche Verfahren, z. B. unter Verwendung grobmaschiger Siebe, Netze, Lochbleche, oder dergleichen angewendet werden. Gegebenenfalls kann eine Abtrennung grober Feststoffpartikel auch in einem Fliehkraftabscheider erfolgen. Die hierbei eingesetzten Apparaturen wie Dekanter, Zentrifugen, Sedikanter und Separatoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt .Auf diese Weise erhält man einen festen oder halbfesten, z. B. pastösen Rückstand, welcher das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt und die nichtflüchtigen, in der Regel festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest große Teile davon, häufig wenigstens 90 Gew.-% oder die Gesamtmenge der festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile enthält.

Durch Zugabe von Formulierungshilfsmitteln wie Träger- und Coatingmaterialien, Bindemitteln sowie anderer Additive können die Eigenschaften des getrockneten und zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentation vorliegenden Stoffwechselprodukts gezielt hinsichtlich verschiedener Parameter wie Wirkstoffgehalt, Korngröße, Partikelform, Neigung zum Stauben, Hygroskopizität, Stabilität, insbesondere Lager- Stabilität, Farbe, Geruch, Fließverhalten, Agglomerationsneigung, elektrostatischer Aufladung, Licht- und Temperaturempfindlichkeit, mechanischer Stabilität und Redisper- gierbarkeit in an sich bekannter Weise konfektioniert werden.

Zu den üblicherweise verwendeten Formulierungshilfsmitteln gehören z. B. Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, Viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxi- dantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle o- der Mischungen hieraus. Derartige Formulierungshilfsmittel werden vorteilhaft insbesondere bei Anwendung von Formulierungs- und Trocknungsverfahren wie Sprüh-, Wirbelschicht- und Gefriertrocknung als Trocknungshilfsmittel eingesetzt. Wegen wei- terer Details wird auf die PCT/EP2006/066057 (ältere Anmeldung DE 10 2005 042 541.0) verwiesen.

Der Anteil an den vorgenannten Zusatzstoffen und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen wie Coatingmaterialien kann je nach den speziellen Erfordernissen des jeweiligen Stoffwechselprodukts sowie in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingesetzten Zusatzstoffe stark variieren und z. B. im Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 1 bis 30 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. Stoffgemischs, liegen.

Die Zugabe von Formulierungshilfsmitteln kann vor, während oder nach der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe (auch als Produktformulierung oder Feststoffdesign bezeichnet) und insbesondere während der Trocknung erfolgen. Eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln vor Aufarbeitung der Fermentationsbrühe bzw. des Stoffwechselprodukts kann insbesondere vorteilhaft sein, um die Prozessierbarkeit der auf- zuarbeitenden Stoffe bzw. Produkte zu verbessern. Die Formulierungshilfsmittel können sowohl dem in fester Form erhaltenen Stoffwechselprodukt als auch einer dieses enthaltenden Lösung oder Suspension zugegeben werden, z. B. nach abgeschlossener Fermentation direkt zu der Fermentationsbrühe oder zu einer im Verlauf der Aufarbeitung erhaltenen Lösung oder Suspension vor dem abschließenden Trocknungs- schritt.

So können die Hilfsstoffe z. B. in eine Suspension des mikrobiellen Stoffwechselprodukts eingemischt werden; eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z. B. durch Aufsprühen oder Untermischen. Die Zugabe von Formulierungshilfsstoffen während der Trocknung kann z. B. eine Rolle spielen, wenn eine das Stoffwechselprodukt enthaltende Lösung oder Suspension versprüht wird. Insbesondere nach der Trocknung erfolgt eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln z. B. beim Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf getrocknete Partikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach einem eventuellen Coatingschritt können dem Produkt weitere Hilfsmittel zugegeben werden.

Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe erfolgt in an sich bekannter Weise durch übliche Verfahren zur Abtrennung fester Phasen von flüssigen Phasen, einschließlich Filtrationsverfahren und Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile der flüssigen Phasen. Derartige Verfahren, die auch Schritte zur Grobreinigung der Wertstoffe sowie Schritte zur Konfektionierung umfassen können, werden z. B. in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnolo- gy, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH, beschrieben. Im Rahmen der Produktformulierung bzw. der Aufarbeitung nach abgeschlossener Fermentation anwendbare, dem Fachmann bekannte Verfahren, Apparaturen, Hilfsstoffe bzw. allgemeine und spezielle Ausführungsformen sind ferner in EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022, EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018 und WO 92/12645 beschrieben.

In einer ersten Variante dieser Ausführungsform (II) wird man das nichtflüchtige mikro- bielle Stoffwechselprodukt, sofern es in der flüssigen Phase gelöst vorliegt, aus der flüssigen Phase in die feste Phase überführen, z. B. durch Kristallisation oder Fällung. Anschließend erfolgt eine Abtrennung der nichtflüchtigen festen Bestandteile einschließlich des Stoffwechselprodukts, z. B. mittels Zentrifugation, Dekantieren oder FiIt- ration. In ähnlicher Weise kann man auch ölige Stoffwechselprodukte abtrennen, wobei man die jeweiligen öligen Fermentationsprodukte durch Zusatz von Adsorbentien, z. B. Kieselsäure, Kieselgele, Lehm, Ton und Aktivkohle, in eine feste Form überführt.

In einer zweiten Variante dieser Ausführungsform (II) werden die flüchtigen Bestandtei- Ie durch Verdampfen entfernt. Das Verdampfen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispiele für geeignete Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile sind die Sprühtrocknung, Wirbelschichttrocknung bzw. -agglomeration, Gefriertrocknung, Strom- und Kontakttrocknern sowie Extrusionstrocknung. Auch eine Kombination der vorgenannten Verfahren mit formgebende Verfahren wie Extrusion, Pelletierung oder Prilling kann vorgenommen werden. Bei diesen letztgenannten Verfahren werden vorzugsweise teilweise oder weitgehend vorgetrocknete Stoffwechselprodukt-haltige Stoffgemische eingesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Entfernen der flüchtigen Bestand- teile der Fermentationsbrühe ein Verfahren zur Sprühtrocknung oder ein Verfahren der Wirbelschichttrocknung, einschließlich der Wirbelschichtgranulierung. Hierzu wird die Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach einer Vorabtrennung zur Entfernung grober Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellen Stoffwechselprodukt enthalten, einer oder mehreren Sprüh- oder Wirbelschichttrock- nungsapparaturen zugeführt. Der Transport bzw. die Zuführung der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe erfolgt zweckmäßigerweise mittels üblicher Transportvorrichtungen für feststoffhaltige Flüssigkeiten, z. B. Pumpen wie Exzenterschneckenpumpen (z. B. der Fa. Delasco PCM) oder Hochdruckpumpen (z. B. der Fa. LEWA Herbert Ott GmbH). Die Durchführung einer Fermentation unter Verwendung des erfindungsgemäßen zuckerhaltigen Flüssigmediums kann auch derart erfolgen, dass man

vii) dem in Schritt iii) erhaltenen Medium M, das nicht-stärkehaltige feste Bestandtei- Ie der Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-%, z. B. im Bereich von 5 bis 45 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht, entnimmt und die Restmenge einer Fermentation zur Herstellung eines ersten Stoffwechselprodukts (A), z. B. eines nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts (A) in fester Form oder eines flüchtigen Stoffwechselprodukts (A), zuführt; und

viii) diese Teilmenge, gegebenenfalls nach vorheriger vollständiger oder teilweiser Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, einer Fermentation zur Herstellung eines zweiten Stoffwechselprodukts (B), das mit dem Stoffwechsel produkt (A) identisch oder davon verschieden ist, zuführt.

Im Falle der Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß vii) beträgt der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des Mediums M bevorzugt maximal 50 Gew.-%, insbesondere maximal 30 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-%. Insbesondere ist es in diesem Fall bevorzugt, die gesamten Feststoffe vor der Fermentation zur Herstellung des zweiten Stoffwechselprodukts (B) abzutrennen.

Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß vii) Mikroorganismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z. B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß viii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z. B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofakto- ren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipi- den, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotenoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotenoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.

Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stellen sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z. B. eine als Futtermitteladditiv zu verwendende Aminosäure, z. B. Lysin, Methionin, Threonin oder Glutamat, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z. B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Ami- nosäure unter Einsatz der gemäß viii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollständige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z. B. als Nah- rungsmitteladditiv, reduziert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise kann z. B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z. B. von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Glutamat oder Threonin, von Citronensäure oder von Ethanol, z. B. entsprechend den in der WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728) oder PCT/EP2006/066057 (ältere Anmeldung DE 10 2005 042 541.0) beschriebenen Verfahren oder entsprechend den zur fermentativen Herstellung von Bioethanol bekannten Verfahren. Gemäß vii) wird ein Teil des nach Schritt iii) erhaltenen Mediums M ent- nommen. Der gemäß vii) entnommene Teil kann gemäß viii) durch übliche Verfahren, z. B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit werden, je nach den Erfordernissen der Fermentation zur Herstellung von B. Das so gewonnene, gegebenenfalls vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite Medium M wird gemäß viii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselpro- dukts B zugeführt. Ein gemäß viii) abgetrennter Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des Mediums M der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.

Wenn das in der großvolumigen Fermentation hergestellte mikrobielle Stoffwechselprodukt (A) Ethanol ist, so weist das nach dem Schritt iii) hergestellte Medium M Kon- zentrationen an Mono-, Di- oder Oligosacchariden auf, wie sie bei der fermentativen Ethanol-Produktion (Bioethanol) üblich sind, z. B. im Bereich von 25 bis 33 Gew.-%. Die Durchführung einer Abtrennung von Feststoffen gemäß Schritt viii) richtet sich auch hier nach den Erfordernissen der Fermentation zur Herstellung des jeweiligen Stoffwechselprodukts B.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens implementiert man eine vorzugswei- se großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z. B. von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Glutamat oder, von Citronensäure oder von Etha- nol, wie oben beschrieben. Gemäß vii) wird ein Teil des nach Schritt iii) erhaltenen Mediums M entnommen und gemäß viii) durch übliche Verfahren, z. B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonnene, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite Medium M wird gemäß viii) einer Fermentation zur Produktion des Stoffwechselprodukts B, hier Riboflavin, zugeführt. Der gemäß viii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des Mediums M der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.

Die auf diese Art und Weise gemäß viii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrü- he kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in DE 4037441 , EP 464582, EP 438767 und DE 3819745. Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtrennung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z. B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß viii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z. B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit einer mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wäss- rig-sauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwech- selprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der WO 01/021772.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z. B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß vii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, Medium M wird einer Fermentation gemäß viii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum fest- stoffhaltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vorteilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmedi- ums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.

Die gemäß viii) hergestellte Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z. B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z. B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Fest- Stoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.

Die abgetrennten Feststoffe können im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumi- gen Fermentationsverfahrens zusammen mit dem jeweiligen gewünschten mikrobiel- len Stoffwechselprodukt (A) gewonnen werden.

Nach der Trocknung und/oder Formulierung bzw. Konfektionierung können der Produktformulierung bzw. Proteinzusammensetzung ganze oder gemahlene Getreidekörner, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Triticale und/oder Roggen zugegeben werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.

Beispiele

I. Vermählen der Stärkequelle

Die im Folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermählen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor- Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1 ; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1 ,5 mm) ergab die in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse.

Tabelle I

II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung

11.1 ) Verflüssigung im Jetkocher Zur kontinuierlichen Verflüssigung eines trocken vermahlenen Maismehls sind zwei Rührkessel von 250 L Volumen installiert, aus denen jeweils abwechselnd im Stundentakt das in Wasser angemaischte Maismehl dem Jetkocher zugeführt wird. Ein typischer Ansatz für diese Kessel erfolgt durch Vorlage von 1 17 kg Wasser, zu dem eine α-Amylase, z. B. Termamyl SC, in einer Konzentration von 0,10 Gew.-% (bezogen auf die eingesetzte Mehlmenge) zugegeben wird. Anschließend werden bei ca. 45 °C in mehreren Schritten 133 kg Maismehl zugefüttert und untergemischt. Nach Einstellung einer Ca²⁺-Konzentration von 50 ppm, z. B. durch Zugabe von CaCI₂, wird der pH- Wertes in einem Bereich zwischen 5,6 und 5,8 eingestellt. Nach Zugabe aller Kompo- nenten wird die Maismehlsuspension intensiv durch Rühren bis zur Verwendung im Jetkocher durchmischt. Diese Suspension wird dem Jetkocher dann mit 250 kg/h bei einem Druck von 5 bar zugeführt. Das Aufheizen der Maismehlsuspension über die Verkleisterungstemperatur hinaus auf 105 °C erfolgt durch parallele Zuführung von 25 kg/h Dampf (7,5 bar). In einem dem Jetkocher nachgeschalteten Rohrreaktor mit 5 min Haltezeit wird ein Teil der verkleisterten Stärke zu Dextrinen abgebaut (1. Verflüssigung). Anschließend wird die Temperatur der Reaktionsmischung durch Flashen auf 90 °C reduziert, wobei ca. 5 kg/h Dampf abgehen. Bei 90 °C wird dann in einem weiteren Rohrreaktor über einen Zeitraum von 100 min die zweite Verflüssigung zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen durchgeführt. Die erhaltene Reaktionsmi- schung wird dann durch erneutes Flashen unter einem Wasserverlust von ca. 14 kg/h auf die Verzuckerungstemperatur von 61 °C abgekühlt.

11.1 ) Verzuckerung

Ein Teil der aus 11.1 ) erhaltenen Reaktionsmischung wurde in einem Stichversuch verzuckert. Dazu wurden ca. 1000 g der Reaktionsmischung in einen Rührkessel überführt und unter stetem Rühren bei 61 °C gehalten. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H₂SO₄ auf 4,3 wurden 17,9 g (15,2 ml) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Die Temperatur wurde ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion per HPLC verfolgt wurde. Am Ende betrug die Glucosekonzentration 420 g/kg.

IM. Stamm ATCC 13032 lysC^fbr

In einigen der nachfolgenden Beispiele wurde ein modifizierter Stamm von Corynebac- terium glutamicum eingesetzt, der unter der Bezeichnung ATCC13032 lysC^fbr in der WO 05/059144 beschrieben wurde.

Beispiel 1 Verflüssigtes und verzuckertes Maismehlhydrolysat, das nach Vorschrift Il hergestellt worden war, wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacteri- um glutamicum eingesetzt.

Stamm

Es wurde der modifizierte Wildtyp mit feedback-deregulierter Aspartokinase

ATCC13032 lysC^fbr verwendet.

Herstellung des Inokulums

Die Zellen wurden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 1 ; 20 min bei 121 °C) über Nacht bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 2) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen wurden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD₆io = 0,5 bei 610 nm erreichte.

Tabelle 1 : Zusammensetzung der CM+CaAc-Agarplatten

Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzung des Kolbenmediums ist in Tabelle 2 aufgeführt. Der Versuch wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt.

Tabelle 2: Kolbenmedien

^* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung eingestellt

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt.

Beispiel 2:

Verflüssigtes und verzuckertes Maismehlhydrolysat, das nach Vorschrift Il hergestellt worden war, wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Aspergillus ni- ger eingesetzt.

Stamm Ein Aspergillus niger Phytase-Produktionsstamm mit 6 Kopien des phyA-Gens aus Aspergillus ficuum unter der Kontrolle des glaA-Promotors wurde analog zur im Detail in WO 98/46772 beschriebenen Herstellung von NP505-7 erzeugt. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit 3 modifizierten glaA Ampikons (analog ISO505), jedoch ohne integrierte phyA-Expressionskassetten verwendet.

Herstellung des lnokulums

20 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 3) in 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 100 μl einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 34 °C unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.

Tabelle 3: Zusammensetzung des Vorkulturmediums

^* mit verdünnter Schwefelsäure eingestellt

50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 4) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft

Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzung des Kolbenmediums ist in Tabelle 4 aufgeführt. Aus jeder Probe wurden zwei Kolben angesetzt.

Tabelle 4: Kolbenmedien

mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Phytinsäure als Substrat und auf einem geeignetem Phytaseaktivitätsniveau (Standard: 0,6 U/ml) in 250 mM Essigsäure/- Natriumacetat/Tween 20 (0,1 Gew.-%), pH 5,5 Puffer bestimmt. Der Assay wurde standardisiert für die Anwendung in Mikrotiterplatten (MTP). 10 μl der Enzymlösung wurden mit 140 μl 6,49 mM Phytatlösung in 250 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5 (Phy- tat: Dodecanatriumsalz der Phytinsäure) gemischt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens (150 μl) Trichloressig- säure gestoppt. Ein Aliquot dieser Mischung (20 μl) wurde überführt in 280 μl einer Lösung, die 0,32 N H₂SO₄, 0,27 Gew.-% Ammoniummolybdat und 1 ,08 Gew.-% Ascor- binsäure enthält. Anschließend erfolgte eine 25-minütige Inkubation bei 50 °C. Die Absorption der blau gefärbten Lösung wurde bei 820 nm gemessen.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung wenigstens einer organischen Verbindung mit mindestens 3 C-Atomen oder mit mindestens 2 C-Atomen und mindestens 1 N-Atom durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte:

i) Vermählen einer Stärkequelle unter Erhalt eines Mahlguts, das wenigstens einen Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält;

ii) Suspendieren des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in einer Menge, dass ein Trockenmassegehalt in der Suspension von wenigstens 45 Gew.- % resultiert,

wobei man in Schritt iii) die in Schritt ii) erhaltene Suspension durch Einbringen von Wasserdampf in die Suspension auf Temperaturen oberhalb der Verkleiste- rungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke erhitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Erhitzen mit Wasserdampf in einem Jet- kocher erfolgt.

3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man die erhitzte Suspension des Mahlguts durch Flashverdampfung auf Temperaturen unterhalb der Verkleisterungstemperatur abkühlt und anschließend die Verflüssigung der Stär- ke in Gegenwart eines Stärke verflüssigenden Enzyms durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei man der Suspension wenigstens ein Stärke verflüssigende Enzym vor dem Erhitzen zugibt.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Hydrolyse der Stärke einen Verzuckerungsschritt umfasst.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend zusätzlich die folgenden Schritte:

v) Kultivieren des zur Überproduktion der organischen Verbindung befähigten 5 Mikroorganismus in einem wässrigen, verstoffwechselbare Zucker enthaltenden Fermentationsmedium F; und

vi) Zugabe des wässrigen Mediums M zu dem Fermentationsmedium F, wobei die im wässrigen Medium M enthaltenen hydrolysierten Stärkebestandteile 10 durch die Mikroorganismen unter Bildung der organischen Verbindung verstoffwechselt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Fermentationsmedium F in Schritt v) im Wesentlichen das wässrige Medium M, die zur Überproduktion der organischen

15 Verbindung befähigten Mikroorganismen, Nährsalze, übliche Hilfsstoffe und

Wasser zur Verdünnung umfasst.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt ii) eingesetzte Mahlgut wenigstens 20 % der in der Stärkequelle

20 enthaltenen, festen, nicht stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle umfasst.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärkequelle Getreidekörner verwendet.

25 10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Stärke verflüssigende Enzym eine α-Amylase ist.

1 1. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellte organische Verbindung unter gegebenenfalls Hydroxylgruppen

30 tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen; Nukleosi- den, Nukleotiden, Lipiden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 4 bis 10 C-Atomen, mehrwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, langkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromati-

35 sehen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lactonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt ist.

12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der zur Fermentation 40 eingesetzte Mikroorganismus ausgewählt ist unter natürlichen oder rekombinan- ten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte überproduzieren: Enzyme, Aminosäuren, Vitamine, Disaccharide, aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatische Hydroxycarbon- säuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen, Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen und Polyhydroxyalkanoate.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die eine oder mehrere Aminosäuren überproduzieren, ausgewählt ist .

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die eine oder mehrere aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen überproduzieren, ausgewählt ist.

15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die ein oder mehrere Enzyme überproduzieren, ausgewählt ist .

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus unter solchen, die eine Phytase überproduzieren, ausgewählt ist.

17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Clostridium und Rhizopus.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Mikroorganismus unter Stämmen der Gattung Corynebakterium ausgewählt ist.

19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man wenigstens ein mikrobielles Stoffwechselprodukt aus der Fermentationsbrühe abreichert oder i- soliert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man eine feste oder halbfeste Proteinzusammensetzung erhält.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ohne vorherige Isolierung oder Abreicherung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts, und gegebenenfalls ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile, mindestens teilweise entfernt, wobei man eine feste Formulierung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts erhält.