EP1579014A2 - Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella - Google Patents
Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionellaInfo
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Definitions
- Figure 1 p.8 shows a schematic representation of the sand wipe hybridization method.
- the capture probe 1 is labeled with biotin 4; binds to magnetic beads 7 coated with streptavidin 7.
- detection is carried out with alkaline phosphatase 6 which is attached to the digoxigenin labeled detection probe 2 binds via Anti DIG Fab fragments.
- the detection of the amplified fluorescence signal can be quantified by a fluorescence reader. Another possibility of detection is the detection of the activity of the alkaline phosphatase by electrochemical sensors.
- the 16S ribosomal DNA was amplified from the total DNA of various Legionella species using the fD1 and rP2 universal primers for the 16SrDNA by means of PCR.
- the promoter region of the T7 polymerase was contained in the fD1.
- 166Sr RNA transcribed in vitro was prepared from the corresponding PCR products from Legionella (16SrDN A) using the DIG RNA LabelingKit (SP6 / T7) (Röche) or the MAXIscript-Kit / Ambion.
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella mittels der SandwichHybridisierungs-Methode bei Temperaturen von 50-55 °C. Erfindungsgemäss werden für das Nachweiverfahren neu entwickelte Oligonukleotide als Fänger- und Nachweissonden eingesetzt, deren Sequenzen den Nachweis der Bakterien und Gattung Legionella gattungs-oder artspezifisch ermöglichen. Vorteilhaft ist die gegenseitige Austauschbarkeit der Fänger- und Nachweissonden bei art- und gattungsspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies. Außerdem ist das Nachweisverfahren mit Kombinationen von Oligonukleotiden für artspezifische Sonden durchführbar.
Description
Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella mittels der Sandwich- Hybridisierungs-Methode.
Legionella spp. sind gram-negative, stäbchenförmige und fakultativ intrazelluläre Pathogene. Es werden mehr als 42 Spezies mit 64 Sero- Gruppen unterschieden.
Sie werden als intrazelluläre Parasiten von Amöben und Ciliaten normalerweise in wässriger Umgebung sowie in nassem Boden gefunden. Sie werden auch in oder an künstlich hergestellten Plätzen oder Produkten wie Kühltürmen, klinischen Beatmungs- Geräten, Whirlpools oder Duschen gefunden.
Der Mensch infiziert sich mit Legionellen nach dem Einatmen kontaminierter Aerosol- Tropfen aus den oben erwähnten Habitaten. In der Lunge befallen die Legionella-Bakterien Makrophagen und können eine Form der Lungenentzündung verursachen, bekannt als Legionärs-Krankheit. Die Symptome beginnen mit schwachem Husten, Unwohlsein, Muskelschmerzen, leichtem Fieber, sowie gastrointestinalen Störungen und steigern sich zu hohem Fieber, Alveolitis und Bronchitis. Legionella pneumophila ist der wichtigste Erreger für die Legionellose, aber auch andere Spezies der Gattung L. kommen als Krankheitserreger beim Menschen in Frage.
Zum Nachweis der Legionella-Spezies in Wasserproben sind aus der Literatur die Kultivierungs- Methode, auf Poiymerase-Kettenreaktionen beruhende Methoden sowie die Verwendung monoklonaler Antikörper bekannt Angewendet wird auch die Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden.
Weiter wurde aus der US 5.569.568 A die Anwendung der Sandwich- Hybridisierungs-Methode bekannt. Diese Methode basiert auf der Nutzung von zwei Oligonukleotid- Sonden - einer Fänger- Sonde und einer Nachweis-Sonde. Die Fänger- Sonde ist kovalent an einen festen Untergrund gebunden. Zunächst hybridisiert die zu untersuchende Ziel-Nukleinsäure bei spezifischen Temperaturen mit den beiden Sonden. Danach bindet die Ziel- Nukleinsäure und der Sondenkomplex an den festen Untergrund der Fänger-Sonde. Der Nachweis kann mit Fluoreszenz oder Chemilumineszenz, Farbreaktionen oder radioaktiven Markierungen erfolgen. Wichtig für den Erfolg dieser Methode sind die Eigenschaften der
Sonden für die jeweilige spezifische Hybridisierung. Das wird durch den bisherigen Stand der Technik nur teilweise gewährleistet.
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb darin, neue gattungs- und artspezifische Oligonukleotide zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella herzustellen und zu verwenden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass a) zum Nachweis der gesamten Gattung Legionella als Fängersonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5- CCTCCTCCCCACTGAAAGT-3' und als Nachweissonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CACTGTATGTCAAGGGTAGG; b) zum Nachweis von Legionella pneumophila als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3' und als Nachweissonde ein Oligonukleotit der Sequenz 5'-TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3'; c) zum Nachweis von Legionella feelei als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-GCGCCACTAACCTCATTCAT-3'und als Nachweissonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3'und d) zum Nachweis von Legionella Jordaniens Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3' und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5 TrACGGTCCCCAGCTTTTT-3'verwendet werden und die Hybridisierung bei Temperaturen von fünfzig bis fünfundfünfzig Grad Celsius erfolgt.
Die wichtigsten Daten der neuen Oligonukleotid-Sonden sind in nachfolgender Tabelle 1 dargestellt.
Name der Sequenz Ziel- Position Sonde in der Spezifische Sonde ..Spezies in E.coli Sandwich- Hybridisie- 16SrRNA Hybridisierung rungs-Temp.
legpneu l 5'-TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3' L. 575-594 Nachweis 50° Iegpne 2 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3' pneumo- 626-643 Fänger phila
legfeeM 5'-GCGCCACTAACCTCAπCAT-3' L. 840-859 Fänger 55°C legfeel 2 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3' feelei 575-594 Nachweis
legjor 1 5'-CTTACGGTCCCCAGCI 1 1 1 1-3' L. 192-211 Nachweis 50°C legjor 2 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3'jordanis 435-454 Fänger
legall 11 5'- CCTCCTCCCCACTGAAAGT-3' Genus 433-451 Fänger legall 22 5'- CACTGTATGTCAAGGGTAGG legionella 983-1001 Nachweis 50°C
Bei artspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies sind gemäß Patentanspruch 2 die Oligonukleotide für Fänger-Sonden und Nachweis-Sondengegeneinander austauschbar.
Weiterhin werden die Nachweise von Bakterien der Gattung Legionella gemäß Patentanspruch 3 mit Kombinationen von Oligonukleotiden für gattungsspezifische Sonden und Oligonukleotiden für artspezi- fische Sonden vorgenommen.
Von Vorteil ist weiter, dass die neuen gattungs- und artspezifischen Oligonukleotid-Sonden alle für eine Hybridisierung bei Temperaturen von 50 -55°C entwickelt wurden. Damit sind Kombinationen von mehr als 2 Sonden möglich, welche die Voraussetzung für den Nachweis von mehr als 1 Legionella -Spezies in einem Test sind. Hierzu werden magnetische Beads mit verschiedenen zum Nachweis von einzelnen Legionella-Spezies Fänger-Sonden gemischt (Multiplex-Analyse) beispielsweise Fänger-Sonden zum Nachweis von L. p. mit Fänger-Sonden zum Nachweis von L. f. oder anderen in Kombination mit einer gattungsspezifischen Nachweis-Sonde.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden unter Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Figur 1 S.8 zeigt eine schematische Darstellung der Sandwisch-Hybridisierungs- Methode.
Dabei ist die Fänger-Sonde 1 mit Biotin 4 markiert; bindet an mit Streptavidin 5 ummantelte magnetische Kugeln (magnetic beads ) 7. Nach erfolgter Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure mit den beiden Sonden 1 und 2 geschieht der Nachweis mit Alkalischer Phosphatase 6 die an die Digoxigenin-
markierte Nachweis-Sonde 2 über Anti DIG Fab Fragmente bindet. Der Nachweis des amplifizierten Fluoreszenz Signals kann durch ein Fluoreszenz-Lesergerät quantifiziert werden. Eine weitere Nachweismöglichkeit ist die Erfassung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase durch elektrochemische Sensoren.
Zur Probenaufbereitung werden Gesamt-DNA-Proben verschiedener Legionella-Spezies verwendet. Die 16S ribosomale DNA (rDNA) wurde aus der Gesamt-DNA verschiedener Legionella-Spezies unter Verwendung der fD1 und rP2-Universal-Primer für die 16SrDNA mittels PCR amplifiziert. Der Promoter- Bereich derT7 Polymerase war im fD1 enthalten. In vitro transkribierten 166Sr RNA wurde von den entsprechenden PCR Produkten aus Legionella ( 16SrDN A) unter Verwendung des DIG RNA LabelingKit (SP6/T7) (Röche) oder des MAXIscript-Kits / Ambion hergestellt.
Die Wirksamkeit der Oligonukleotid-Sonde wurde durch die Slot-Blot-Methode getestet. In vitro transkribierte 16SrRNA (Ribosomale der kleinen Untereinheit der Bakterien-Ribosomen) wurde als Ziel-Molekül verwendet.
Die Slot-Blot-Hybridisierungen wurden entsprechend des Protokolls des DIG System User's guide for Filter Hybridiziation, Boehringer Mannheim (1995) durchgeführt. 1000 fmol in vitro transkribierter 16SrRNA verschiedenner Legionella-Spezies wurden in RNA-Lösungs-Puffer (DEPC-HO, 20xSC, Formaldehyd (5:3:2) präpariert und für 10 Minuten bei 65°C denaturiert. Anschließend werden die
Proben mittels eines Vakuum-Slot-Blotter (Bio-Rad) auf eine positive geladene Nylon-Membran (Hybond- N ) aufgebracht. Diese Membran war vor und nach dem Blotten mit 20xSSC(3MNaCI und 300 mM Natriumeitrat pH 7,0 ) gewaschen worden. Anschließend wurden die Nukleinsäuren mit UV-Licht (für 2 Minuten an die Membran gebunden.
Die Prä-Hybridisierung wurde in hoch-SDS-Puffer (7%SDS; 50% Formaldehyd, 5x SSC, 2% Blocking Reagent(Roche), 50mM Natriumphosphat pH 7 = und 0,1 % Laurylsarcosin) für zwei Stunden bei Hybridisierungs-Temperatur durchgeführt Danach erfolgte die Hybridisierung über Nacht in Hoch-SDS- Puffer mit 100 pmol DIG markierter Oligonukleotid-Sonde bei 50-55°C abhängig von der Schmelztemperatur der Sonde. Die Proben wurden am 3'-Ende mit dem DIG Oligonucleotide 3Εnd
Labeling Kit (Röche Diagnostics GmbH) entsprechend des Protokolls des Herstellers mit Digoxigenin markiert.
Nach der Hybridisierung wurde die Membran zwei Mal mit 2x SSC; 0,1% SDS für 5 Minuten gewaschen, gefolgt von zweimaligen Waschen mit 0,1 x SSC; 0,1% SDS, 0,2 x SSC; 0,1% SDS oder 0,5 x SSC; 0,1% SDS für 20 Minuten bei Hybridisierungstemperatur, um die ungebundene Sonde zu entfernen. Anschließend wurde die Membran in Maleinsäure-Puffer (0,1 M Maleinsäure und 0,15 M NaCI, pH 7,5 ) mit 0,3% Tween 20™ für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Bindung der Alkalischen Phosphatase zu vermeiden. Die Membran wurde für 30 Minuten in Malein- säure Puffer mit 0,1% Blocking Lösung (Röche) inkubiert. Anschließend wurde die Anti-Digoxigenin- Alkalische -Phosphatase (AP) 1: 20 000 in Maleinsäure-Puffer mit 1% Blocking Lösung verdünnt und die Membran in der Antikörper-Lösung 30 Minuten inkubiert. Die Membran wurde 2 mal mit Maleinsäure-Puffer mit 0,3% Tween 20 für 15 Minuten gewaschen und für 5 Minuten in Nachweis- Puffer (100 mM Tris-HCI, pH 9,5 und 100 mM NaCI )1- äquilibriert. Das als Substrat für die Alkalische Phosphase benutzte CDP-Star™ Substrat (Röche) wurde 1 : 100 in Nachweis-Puffer verdünnt, auf die Oberfläche der Membran aufgetragen und in Plastik-Folie eingeschweißt für 10 Minuten inkubiert. Die Membran wurde exponiert (Hyperfilm ECL, Amersham Pharmacia Biotech). Zeitraum war zuerst 1 Stunde und später 10 oder 5 Minuten um die Färbung des Hintergrundes zu reduzieren.
Die Ergebnisse der Slot-Blot-Test's zeigen folgendes. 1. Sonden zum Nachweis der Gattung Legionella Die Sonde Legall 11 hybridisiert mit der in vitro transkribierten 16rRNA alle untersuchten Legionella Spezies (15 Arten - siehe Tabelle 2, S. 9). Die Bindung war spezifisch für alle Legionella- Spezies. Die Sonde Legall 22 hybridisierte ebenfalls spezifisch mit der in vitro transkribierten 16SrRNA aller untersuchten Legionella- Spezies. Beide Sonden sind für einen Nachweis der Gattung Legionella im Sand- Hybridisierungsnachweis mit Legall 11 als Fängersonde und Legall 22 als Nachweissonde geeignet.Die Hybridisierungstemperatur war 50°C.
2. Sonden zum Nachweis von Legionella pneumophila Die Sonde Legpneu 1 hybridisierte mit der in vitro transkribierten 16SrRNA der Legionella pneumo-
phila Serogruppe 1 ATCC33152, Legionella pneumophila Seragruppe 6, Legionella pneumophila Philadelphia I R32 WT und mit Legionella micdadei. Die Sonde Legpneu 2 hybridisiert mit in vitro transkribierter 16S rRNA von Legionella pneumophila Philadelphia f JR32 WT. Diese Sonde ist hochspezifisch und kann als Fänger-Sonde mit der Leg- pneu 1 -Sonde m Sandwich-Hybridisierungs-Nachweisen verwendet werden . Die Hybridisierungs-pe- Temperatur ar50°C.
3. Sonden zum Nachweis von Legionella feelei Die Sonde Legfeel 1 hybridisiert nur mit der in vitro transkribierten 16S rRNA von Legionella feelei und ist spezifisch. Sie kann als Fänger-Sonde zusammen mit Leggfeel2 zum Nachweis von Legionella feelei benutzt werden. Die Sonde Legfeeß hybridisierte nur mit der in vitro transkribierten 16S RNA von Legionella feelei und ist spezifisch. Sie kann als Nachweis-Sonde verwendet werden, weil sie eine niedrige Bindungseffizienz besitzt als die Sonde Legfeell . Diese beiden Legfeel-Sonden können zum Nachweis von Legionella feelei in Sandwich-Hybridi- sierungs-Ansätzen verwendet werden. Die spezifische Hybridisierungs-Temperatur beider Sonden war 55°C.
4, Sonden zum Nachweis von Legionella jordanis Die Sonde Legjor 2 hybridisiert mit der in vitro transkribierten 16S rRNA von Legionella jordanis und Legionella feelei. Die Bindung mit der Legionella jordanis-Probe war spezifisch und die Bindung mit der Legionella feelei-Probe war unspezifisch. Diese Sonde kann als Nachweis-Sonde zusammen mit der Legjorl -Sonde verwendet werden. Die Sonde Legjor 1 hybridisierte nur mit der in vitro transkribierten 16S rRNA von Legionella jordanis. Die Bindung dieser Sonde zum Zielmolekül war spezifisch. Die Sonde kann als Fänger- Sonde zusammen mit der Sonde Legjor2 verwendet werden. Die Hybridisierungs-Temperatur für beide Sonden war ebenfalls 55°C.
Die Vorteile der Erfindung bestehen darin.dass die neuen Oligonukleotide gattungs-und artspezifisch für die Sandwich-Hybridisierungs-Methode besonders geeignet sind. Vorteilhaft wirkt sich weiter der Einsatz von Kombinationen der neuen Oligonukleodite aus. Möglich sind auch Kombinationen mit
anderen Oligonukleotid-Sonden z.B. für den Einsatz als Primer für PCR, fluoreszenzmarkiert für mikroskopische Nachweise, zur Fluoreszenzsandwichhybridisierung und zur Sandwich-Hybridisierung mit elektrischer Signalauslesung.
Tabelle 2 : Untersuchte Legionella Spezies
Claims
1. Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella mittels der Sandwich-Hydbridisie- rungs-Methode dadurch gekennzeichnet, dass a) gattungsspezifisch zum Nachweis der Gattung Legionella als Fängersonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'- CCTCCTCCCCACTGAAAGT- 3'und als Nachweissonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'- CACTGTATGTCAAGGGTAGG; b) artspezifisch zum Nachweis von Legionella pneumophila als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3'und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'- TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3'; c) artspezifisch zum Nachweis von Legionella feelei als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-GCGCCA CTAACCTCATTAT-3'und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3'und d) artspezifisch zum Nachweis von Legionella jordanis als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3'und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CTTACGGTCCCCAGCTTTTT-3 verwendet werden und die Hybridisierung bei Temperaturen von 50 bis 55°C erfolgt.
2. Verfahren gemäß Patenanspruch 1., gekennzeichnet dadurch, dass bei artspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies die Oligonukleotide für die Fänger-Sonden und Nachweis-Sonden gegeneinander austauschbar sind.
3. Verfahren gemäß Patentanspruch 1., dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweise Kombinationen von Oligonukleotiden für gattungsspezifische Sonden und Oligonukleotiden für artspezifische Sonden vorgenommen werden.
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