WO2005017194A2 - Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella - Google Patents

Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella Download PDF

Info

Publication number
WO2005017194A2
WO2005017194A2 PCT/DE2004/001821 DE2004001821W WO2005017194A2 WO 2005017194 A2 WO2005017194 A2 WO 2005017194A2 DE 2004001821 W DE2004001821 W DE 2004001821W WO 2005017194 A2 WO2005017194 A2 WO 2005017194A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
detection
legionella
probe
probes
species
Prior art date
Application number
PCT/DE2004/001821
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2005017194A3 (de
Inventor
Antje Breitenstein
Tarja Rosilainen
Peter Neubauer
Original Assignee
Scanbec Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scanbec Gmbh filed Critical Scanbec Gmbh
Priority to DE112004002047T priority Critical patent/DE112004002047D2/de
Priority to US10/554,238 priority patent/US20070184437A1/en
Priority to EP04762665A priority patent/EP1579014A2/de
Publication of WO2005017194A2 publication Critical patent/WO2005017194A2/de
Publication of WO2005017194A3 publication Critical patent/WO2005017194A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of bacteria of the genus Legionella by means of the sandwich hybridization method.
  • Legionella spp. are gram-negative, rod-shaped and facultative intracellular pathogens. There are more than 42 species with 64 sero groups.
  • Legionella pneumophila is the most important pathogen for legionellosis, but other species of the genus L. can also be considered as pathogens in humans.
  • US 5,569,568 A disclosed the use of the sandwich hybridization method. This method is based on the use of two oligonucleotide probes - a capture probe and a detection probe.
  • the capture probe is covalently bound to a solid surface.
  • the target nucleic acid to be examined hybridizes with the two probes at specific temperatures.
  • the target nucleic acid and the probe complex then bind to the solid surface of the capture probe.
  • the detection can be done with fluorescence or chemiluminescence, color reactions or radioactive labels. The properties of the are important for the success of this method Probes for the specific hybridization. This is only partially guaranteed by the current state of the art.
  • the object of the invention is therefore to produce and use new genus and species-specific oligonucleotides for the detection of bacteria of the genus Legionella.
  • the object is achieved in that a) for the detection of the entire genus Legionella, an oligonucleotide of the sequence 5- CCTCCTCCCCACTGAAAGT-3 ' as a capture probe and an oligonucleotide of the sequence 5 ' -CACTGTATGTCAAGGGTAGG as a detection probe; b) for the detection of Legionella pneumophila as a capture probe an oligonucleotide of the sequence 5 ' -ATCTGACCGTCCCAGGTT-3 ' and as a detection probe an oligonucleotide of the sequence 5 ' -TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3'; c) for the detection of Legionella feelei as capture probe an oligonucleotide of the sequence 5 '-GCGCCACTAACCTCATTCAT-3' and as a detection probe, an oligonucleotide of the sequence 5 '-TATACAACCACCTACGCACC-3' and d) for the detection of the
  • legjor 1 5'-CTTACGGTCCCCAGCI 1 1 1 1-3 'L. 192-211 detection legjor 50 ° C 2 5' -CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3 '435-454 scavenger jordanis
  • the oligonucleotides for capture probes and detection probes are interchangeable according to claim 2.
  • the detection of bacteria of the genus Legionella according to claim 3 is carried out with combinations of oligonucleotides for genus-specific probes and oligonucleotides for species-specific probes.
  • Another advantage is that the new genus and species-specific oligonucleotide probes were all developed for hybridization at temperatures of 50-55 ° C. This enables combinations of more than 2 probes, which are the prerequisite for the detection of more than 1 Legionella species in one test.
  • magnetic beads are mixed with different capture probes for the detection of individual Legionella species (multiplex analysis), for example capture probes for the detection of L. p. with capture probes for the detection of L. f. or others in combination with a genus-specific detection probe.
  • Figure 1 p.8 shows a schematic representation of the sand wipe hybridization method.
  • the capture probe 1 is labeled with biotin 4; binds to magnetic beads 7 coated with streptavidin 7.
  • detection is carried out with alkaline phosphatase 6 which is attached to the digoxigenin labeled detection probe 2 binds via Anti DIG Fab fragments.
  • the detection of the amplified fluorescence signal can be quantified by a fluorescence reader. Another possibility of detection is the detection of the activity of the alkaline phosphatase by electrochemical sensors.
  • the 16S ribosomal DNA was amplified from the total DNA of various Legionella species using the fD1 and rP2 universal primers for the 16SrDNA by means of PCR.
  • the promoter region of the T7 polymerase was contained in the fD1.
  • 166Sr RNA transcribed in vitro was prepared from the corresponding PCR products from Legionella (16SrDN A) using the DIG RNA LabelingKit (SP6 / T7) (Röche) or the MAXIscript-Kit / Ambion.
  • oligonucleotide probe was tested by the slot blot method.
  • In vitro transcribed 16SrRNA ribosomal of the small subunit of bacterial ribosomes was used as the target molecule.
  • the slot blot hybridizations were carried out according to the protocol of the DIG System User 's guide for Filter Hybridiziation, Boehringer Mannheim (1995). 1000 fmol of 16SrRNA of various Legionella species transcribed in vitro were prepared in RNA solution buffer (DEPC-HO, 20xSC, formaldehyde (5: 3: 2) and denatured for 10 minutes at 65 ° C. Then the
  • the hybridization then took place overnight in high SDS buffer with 100 pmol DIG-labeled oligonucleotide probe at 50-55 ° C. depending on the melting temperature of the probe.
  • the samples were triple at the 3 ' end with the DIG oligonucleotide Labeling kit (Röche Diagnostics GmbH) labeled with digoxigenin according to the manufacturer's protocol.
  • the membrane was washed twice with 2x SSC; 0.1% SDS washed for 5 minutes followed by two washes with 0.1 x SSC; 0.1% SDS, 0.2 x SSC; 0.1% SDS or 0.5 x SSC; 0.1% SDS for 20 minutes at hybridization temperature to remove the unbound probe.
  • the membrane was then incubated in maleic acid buffer (0.1 M maleic acid and 0.15 M NaCl, pH 7.5) with 0.3% Tween 20 TM for 5 minutes at room temperature in order to avoid non-specific binding of the alkaline phosphatase.
  • the membrane was incubated for 30 minutes in maleic acid buffer with 0.1% blocking solution (Röche).
  • the anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) was then diluted 1: 20,000 in maleic acid buffer with 1% blocking solution and the membrane was incubated in the antibody solution for 30 minutes. The membrane was washed twice with maleic acid buffer with 0.3% Tween 20 for 15 minutes and 1-equilibrated in detection buffer (100 mM Tris-HCl, pH 9.5 and 100 mM NaCl) for 5 minutes.
  • detection buffer 100 mM Tris-HCl, pH 9.5 and 100 mM NaCl
  • the CDP-Star TM substrate (Röche) used as substrate for the alkaline phosphase was diluted 1: 100 in detection buffer, applied to the surface of the membrane and sealed in plastic film for 10 minutes. The membrane was exposed (Hyperfilm ECL, Amersham Pharmacia Biotech). The time period was first 1 hour and later 10 or 5 minutes to reduce the color of the background.
  • the results of the slot blot test 's show the following. 1. Probes for the detection of the genus Legionella The Legall 11 probe hybridizes with the 16 rRNA transcribed in vitro to all examined Legionella species (15 species - see Table 2, p. 9). The binding was specific for all Legionella species. The Legall 22 probe also hybridized specifically with the in vitro transcribed 16SrRNA of all examined Legionella species. Both probes are suitable for detection of the genus Legionella in the sand hybridization detection with Legall 11 as a capture probe and Legall 22 as a detection probe. The hybridization temperature was 50 ° C.
  • the Legpneu 1 probe hybridized with the 16SrRNA of Legionella pneumo- phila serogroup 1 ATCC33152, Legionella pneumophila seragroup 6, Legionella pneumophila Philadelphia I R32 WT and with Legionella micdadei.
  • the Legpneu 2 probe hybridizes with in vitro transcribed 16S rRNA from Legionella pneumophila Philadelphia f JR32 WT. This probe is highly specific and can be used as a capture probe with the Legneu 1 probe in sandwich hybridization detection.
  • the hybridization pe temperature ar50 ° C.
  • the Legfeel 1 probe hybridizes only with the in vitro transcribed 16S rRNA from Legionella feelei and is specific. It can be used as a capture probe together with Leggfeel2 to detect Legionella feelei.
  • the Legfeeß probe hybridized only with the in vitro transcribed 16S RNA from Legionella feelei and is specific. It can be used as a detection probe because it has a lower binding efficiency than the Legfeell probe. These two Legfeel probes can be used to detect Legionella feelei in sandwich hybridization approaches. The specific hybridization temperature of both probes was 55 ° C.
  • the Legjor 2 probe hybridizes with the in vitro transcribed 16S rRNA from Legionella jordanis and Legionella feelei. Binding to the Legionella jordanis sample was specific and binding to the Legionella feelei sample was unspecific.
  • This probe can be used as a detection probe together with the Legjorl probe.
  • the Legjor 1 probe hybridized only with the in vitro transcribed 16S rRNA from Legionella jordanis. The binding of this probe to the target molecule was specific.
  • the probe can be used as a capture probe together with the Legjor2 probe.
  • the hybridization temperature for both probes was also 55 ° C.
  • the new oligonucleotides are particularly suitable for the sandwich hybridization method in terms of genus and species.
  • the use of combinations of the new oligonucleodites also has an advantageous effect.
  • Combinations with are also possible other oligonucleotide probes for example for use as primers for PCR, fluorescence-labeled for microscopic detection, for fluorescence sandwich hybridization and for sandwich hybridization with electrical signal reading.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella mittels der SandwichHybridisierungs-Methode bei Temperaturen von 50-55 °C. Erfindungsgemäss werden für das Nachweiverfahren neu entwickelte Oligonukleotide als Fänger- und Nachweissonden eingesetzt, deren Sequenzen den Nachweis der Bakterien und Gattung Legionella gattungs-oder artspezifisch ermöglichen. Vorteilhaft ist die gegenseitige Austauschbarkeit der Fänger- und Nachweissonden bei art- und gattungsspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies. Außerdem ist das Nachweisverfahren mit Kombinationen von Oligonukleotiden für artspezifische Sonden durchführbar.

Description

Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella mittels der Sandwich- Hybridisierungs-Methode.
Legionella spp. sind gram-negative, stäbchenförmige und fakultativ intrazelluläre Pathogene. Es werden mehr als 42 Spezies mit 64 Sero- Gruppen unterschieden.
Sie werden als intrazelluläre Parasiten von Amöben und Ciliaten normalerweise in wässriger Umgebung sowie in nassem Boden gefunden. Sie werden auch in oder an künstlich hergestellten Plätzen oder Produkten wie Kühltürmen, klinischen Beatmungs- Geräten, Whirlpools oder Duschen gefunden.
Der Mensch infiziert sich mit Legionellen nach dem Einatmen kontaminierter Aerosol- Tropfen aus den oben erwähnten Habitaten. In der Lunge befallen die Legionella-Bakterien Makrophagen und können eine Form der Lungenentzündung verursachen, bekannt als Legionärs-Krankheit. Die Symptome beginnen mit schwachem Husten, Unwohlsein, Muskelschmerzen, leichtem Fieber, sowie gastrointestinalen Störungen und steigern sich zu hohem Fieber, Alveolitis und Bronchitis. Legionella pneumophila ist der wichtigste Erreger für die Legionellose, aber auch andere Spezies der Gattung L. kommen als Krankheitserreger beim Menschen in Frage.
Zum Nachweis der Legionella-Spezies in Wasserproben sind aus der Literatur die Kultivierungs- Methode, auf Poiymerase-Kettenreaktionen beruhende Methoden sowie die Verwendung monoklonaler Antikörper bekannt Angewendet wird auch die Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden.
Weiter wurde aus der US 5.569.568 A die Anwendung der Sandwich- Hybridisierungs-Methode bekannt. Diese Methode basiert auf der Nutzung von zwei Oligonukleotid- Sonden - einer Fänger- Sonde und einer Nachweis-Sonde. Die Fänger- Sonde ist kovalent an einen festen Untergrund gebunden. Zunächst hybridisiert die zu untersuchende Ziel-Nukleinsäure bei spezifischen Temperaturen mit den beiden Sonden. Danach bindet die Ziel- Nukleinsäure und der Sondenkomplex an den festen Untergrund der Fänger-Sonde. Der Nachweis kann mit Fluoreszenz oder Chemilumineszenz, Farbreaktionen oder radioaktiven Markierungen erfolgen. Wichtig für den Erfolg dieser Methode sind die Eigenschaften der Sonden für die jeweilige spezifische Hybridisierung. Das wird durch den bisherigen Stand der Technik nur teilweise gewährleistet.
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb darin, neue gattungs- und artspezifische Oligonukleotide zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella herzustellen und zu verwenden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass a) zum Nachweis der gesamten Gattung Legionella als Fängersonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5- CCTCCTCCCCACTGAAAGT-3' und als Nachweissonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CACTGTATGTCAAGGGTAGG; b) zum Nachweis von Legionella pneumophila als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3' und als Nachweissonde ein Oligonukleotit der Sequenz 5'-TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3'; c) zum Nachweis von Legionella feelei als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-GCGCCACTAACCTCATTCAT-3'und als Nachweissonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3'und d) zum Nachweis von Legionella Jordaniens Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3' und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5 TrACGGTCCCCAGCTTTTT-3'verwendet werden und die Hybridisierung bei Temperaturen von fünfzig bis fünfundfünfzig Grad Celsius erfolgt.
Die wichtigsten Daten der neuen Oligonukleotid-Sonden sind in nachfolgender Tabelle 1 dargestellt.
Name der Sequenz Ziel- Position Sonde in der Spezifische Sonde ..Spezies in E.coli Sandwich- Hybridisie- 16SrRNA Hybridisierung rungs-Temp.
legpneu l 5'-TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3' L. 575-594 Nachweis 50° Iegpne 2 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3' pneumo- 626-643 Fänger phila legfeeM 5'-GCGCCACTAACCTCAπCAT-3' L. 840-859 Fänger 55°C legfeel 2 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3' feelei 575-594 Nachweis
legjor 1 5'-CTTACGGTCCCCAGCI 1 1 1 1-3' L. 192-211 Nachweis 50°C legjor 2 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3'jordanis 435-454 Fänger
legall 11 5'- CCTCCTCCCCACTGAAAGT-3' Genus 433-451 Fänger legall 22 5'- CACTGTATGTCAAGGGTAGG legionella 983-1001 Nachweis 50°C
Bei artspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies sind gemäß Patentanspruch 2 die Oligonukleotide für Fänger-Sonden und Nachweis-Sondengegeneinander austauschbar.
Weiterhin werden die Nachweise von Bakterien der Gattung Legionella gemäß Patentanspruch 3 mit Kombinationen von Oligonukleotiden für gattungsspezifische Sonden und Oligonukleotiden für artspezi- fische Sonden vorgenommen.
Von Vorteil ist weiter, dass die neuen gattungs- und artspezifischen Oligonukleotid-Sonden alle für eine Hybridisierung bei Temperaturen von 50 -55°C entwickelt wurden. Damit sind Kombinationen von mehr als 2 Sonden möglich, welche die Voraussetzung für den Nachweis von mehr als 1 Legionella -Spezies in einem Test sind. Hierzu werden magnetische Beads mit verschiedenen zum Nachweis von einzelnen Legionella-Spezies Fänger-Sonden gemischt (Multiplex-Analyse) beispielsweise Fänger-Sonden zum Nachweis von L. p. mit Fänger-Sonden zum Nachweis von L. f. oder anderen in Kombination mit einer gattungsspezifischen Nachweis-Sonde.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden unter Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Figur 1 S.8 zeigt eine schematische Darstellung der Sandwisch-Hybridisierungs- Methode.
Dabei ist die Fänger-Sonde 1 mit Biotin 4 markiert; bindet an mit Streptavidin 5 ummantelte magnetische Kugeln (magnetic beads ) 7. Nach erfolgter Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure mit den beiden Sonden 1 und 2 geschieht der Nachweis mit Alkalischer Phosphatase 6 die an die Digoxigenin- markierte Nachweis-Sonde 2 über Anti DIG Fab Fragmente bindet. Der Nachweis des amplifizierten Fluoreszenz Signals kann durch ein Fluoreszenz-Lesergerät quantifiziert werden. Eine weitere Nachweismöglichkeit ist die Erfassung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase durch elektrochemische Sensoren.
Zur Probenaufbereitung werden Gesamt-DNA-Proben verschiedener Legionella-Spezies verwendet. Die 16S ribosomale DNA (rDNA) wurde aus der Gesamt-DNA verschiedener Legionella-Spezies unter Verwendung der fD1 und rP2-Universal-Primer für die 16SrDNA mittels PCR amplifiziert. Der Promoter- Bereich derT7 Polymerase war im fD1 enthalten. In vitro transkribierten 166Sr RNA wurde von den entsprechenden PCR Produkten aus Legionella ( 16SrDN A) unter Verwendung des DIG RNA LabelingKit (SP6/T7) (Röche) oder des MAXIscript-Kits / Ambion hergestellt.
Die Wirksamkeit der Oligonukleotid-Sonde wurde durch die Slot-Blot-Methode getestet. In vitro transkribierte 16SrRNA (Ribosomale der kleinen Untereinheit der Bakterien-Ribosomen) wurde als Ziel-Molekül verwendet.
Die Slot-Blot-Hybridisierungen wurden entsprechend des Protokolls des DIG System User's guide for Filter Hybridiziation, Boehringer Mannheim (1995) durchgeführt. 1000 fmol in vitro transkribierter 16SrRNA verschiedenner Legionella-Spezies wurden in RNA-Lösungs-Puffer (DEPC-HO, 20xSC, Formaldehyd (5:3:2) präpariert und für 10 Minuten bei 65°C denaturiert. Anschließend werden die
Proben mittels eines Vakuum-Slot-Blotter (Bio-Rad) auf eine positive geladene Nylon-Membran (Hybond- N ) aufgebracht. Diese Membran war vor und nach dem Blotten mit 20xSSC(3MNaCI und 300 mM Natriumeitrat pH 7,0 ) gewaschen worden. Anschließend wurden die Nukleinsäuren mit UV-Licht (für 2 Minuten an die Membran gebunden.
Die Prä-Hybridisierung wurde in hoch-SDS-Puffer (7%SDS; 50% Formaldehyd, 5x SSC, 2% Blocking Reagent(Roche), 50mM Natriumphosphat pH 7 = und 0,1 % Laurylsarcosin) für zwei Stunden bei Hybridisierungs-Temperatur durchgeführt Danach erfolgte die Hybridisierung über Nacht in Hoch-SDS- Puffer mit 100 pmol DIG markierter Oligonukleotid-Sonde bei 50-55°C abhängig von der Schmelztemperatur der Sonde. Die Proben wurden am 3'-Ende mit dem DIG Oligonucleotide 3Εnd Labeling Kit (Röche Diagnostics GmbH) entsprechend des Protokolls des Herstellers mit Digoxigenin markiert.
Nach der Hybridisierung wurde die Membran zwei Mal mit 2x SSC; 0,1% SDS für 5 Minuten gewaschen, gefolgt von zweimaligen Waschen mit 0,1 x SSC; 0,1% SDS, 0,2 x SSC; 0,1% SDS oder 0,5 x SSC; 0,1% SDS für 20 Minuten bei Hybridisierungstemperatur, um die ungebundene Sonde zu entfernen. Anschließend wurde die Membran in Maleinsäure-Puffer (0,1 M Maleinsäure und 0,15 M NaCI, pH 7,5 ) mit 0,3% Tween 20™ für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Bindung der Alkalischen Phosphatase zu vermeiden. Die Membran wurde für 30 Minuten in Malein- säure Puffer mit 0,1% Blocking Lösung (Röche) inkubiert. Anschließend wurde die Anti-Digoxigenin- Alkalische -Phosphatase (AP) 1: 20 000 in Maleinsäure-Puffer mit 1% Blocking Lösung verdünnt und die Membran in der Antikörper-Lösung 30 Minuten inkubiert. Die Membran wurde 2 mal mit Maleinsäure-Puffer mit 0,3% Tween 20 für 15 Minuten gewaschen und für 5 Minuten in Nachweis- Puffer (100 mM Tris-HCI, pH 9,5 und 100 mM NaCI )1- äquilibriert. Das als Substrat für die Alkalische Phosphase benutzte CDP-Star™ Substrat (Röche) wurde 1 : 100 in Nachweis-Puffer verdünnt, auf die Oberfläche der Membran aufgetragen und in Plastik-Folie eingeschweißt für 10 Minuten inkubiert. Die Membran wurde exponiert (Hyperfilm ECL, Amersham Pharmacia Biotech). Zeitraum war zuerst 1 Stunde und später 10 oder 5 Minuten um die Färbung des Hintergrundes zu reduzieren.
Die Ergebnisse der Slot-Blot-Test's zeigen folgendes. 1. Sonden zum Nachweis der Gattung Legionella Die Sonde Legall 11 hybridisiert mit der in vitro transkribierten 16rRNA alle untersuchten Legionella Spezies (15 Arten - siehe Tabelle 2, S. 9). Die Bindung war spezifisch für alle Legionella- Spezies. Die Sonde Legall 22 hybridisierte ebenfalls spezifisch mit der in vitro transkribierten 16SrRNA aller untersuchten Legionella- Spezies. Beide Sonden sind für einen Nachweis der Gattung Legionella im Sand- Hybridisierungsnachweis mit Legall 11 als Fängersonde und Legall 22 als Nachweissonde geeignet.Die Hybridisierungstemperatur war 50°C.
2. Sonden zum Nachweis von Legionella pneumophila Die Sonde Legpneu 1 hybridisierte mit der in vitro transkribierten 16SrRNA der Legionella pneumo- phila Serogruppe 1 ATCC33152, Legionella pneumophila Seragruppe 6, Legionella pneumophila Philadelphia I R32 WT und mit Legionella micdadei. Die Sonde Legpneu 2 hybridisiert mit in vitro transkribierter 16S rRNA von Legionella pneumophila Philadelphia f JR32 WT. Diese Sonde ist hochspezifisch und kann als Fänger-Sonde mit der Leg- pneu 1 -Sonde m Sandwich-Hybridisierungs-Nachweisen verwendet werden . Die Hybridisierungs-pe- Temperatur ar50°C.
3. Sonden zum Nachweis von Legionella feelei Die Sonde Legfeel 1 hybridisiert nur mit der in vitro transkribierten 16S rRNA von Legionella feelei und ist spezifisch. Sie kann als Fänger-Sonde zusammen mit Leggfeel2 zum Nachweis von Legionella feelei benutzt werden. Die Sonde Legfeeß hybridisierte nur mit der in vitro transkribierten 16S RNA von Legionella feelei und ist spezifisch. Sie kann als Nachweis-Sonde verwendet werden, weil sie eine niedrige Bindungseffizienz besitzt als die Sonde Legfeell . Diese beiden Legfeel-Sonden können zum Nachweis von Legionella feelei in Sandwich-Hybridi- sierungs-Ansätzen verwendet werden. Die spezifische Hybridisierungs-Temperatur beider Sonden war 55°C.
4, Sonden zum Nachweis von Legionella jordanis Die Sonde Legjor 2 hybridisiert mit der in vitro transkribierten 16S rRNA von Legionella jordanis und Legionella feelei. Die Bindung mit der Legionella jordanis-Probe war spezifisch und die Bindung mit der Legionella feelei-Probe war unspezifisch. Diese Sonde kann als Nachweis-Sonde zusammen mit der Legjorl -Sonde verwendet werden. Die Sonde Legjor 1 hybridisierte nur mit der in vitro transkribierten 16S rRNA von Legionella jordanis. Die Bindung dieser Sonde zum Zielmolekül war spezifisch. Die Sonde kann als Fänger- Sonde zusammen mit der Sonde Legjor2 verwendet werden. Die Hybridisierungs-Temperatur für beide Sonden war ebenfalls 55°C.
Die Vorteile der Erfindung bestehen darin.dass die neuen Oligonukleotide gattungs-und artspezifisch für die Sandwich-Hybridisierungs-Methode besonders geeignet sind. Vorteilhaft wirkt sich weiter der Einsatz von Kombinationen der neuen Oligonukleodite aus. Möglich sind auch Kombinationen mit anderen Oligonukleotid-Sonden z.B. für den Einsatz als Primer für PCR, fluoreszenzmarkiert für mikroskopische Nachweise, zur Fluoreszenzsandwichhybridisierung und zur Sandwich-Hybridisierung mit elektrischer Signalauslesung.
Tabelle 2 : Untersuchte Legionella Spezies
Figure imgf000010_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella mittels der Sandwich-Hydbridisie- rungs-Methode dadurch gekennzeichnet, dass a) gattungsspezifisch zum Nachweis der Gattung Legionella als Fängersonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'- CCTCCTCCCCACTGAAAGT- 3'und als Nachweissonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'- CACTGTATGTCAAGGGTAGG; b) artspezifisch zum Nachweis von Legionella pneumophila als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3'und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'- TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3'; c) artspezifisch zum Nachweis von Legionella feelei als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-GCGCCA CTAACCTCATTAT-3'und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3'und d) artspezifisch zum Nachweis von Legionella jordanis als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3'und als Nachweis-Sonde ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CTTACGGTCCCCAGCTTTTT-3 verwendet werden und die Hybridisierung bei Temperaturen von 50 bis 55°C erfolgt.
2. Verfahren gemäß Patenanspruch 1., gekennzeichnet dadurch, dass bei artspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies die Oligonukleotide für die Fänger-Sonden und Nachweis-Sonden gegeneinander austauschbar sind.
3. Verfahren gemäß Patentanspruch 1., dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweise Kombinationen von Oligonukleotiden für gattungsspezifische Sonden und Oligonukleotiden für artspezifische Sonden vorgenommen werden.
PCT/DE2004/001821 2003-08-15 2004-08-13 Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella WO2005017194A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE112004002047T DE112004002047D2 (de) 2003-08-15 2004-08-13 Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella
US10/554,238 US20070184437A1 (en) 2003-08-15 2004-08-13 Method for the detection of legionella-type bacteria
EP04762665A EP1579014A2 (de) 2003-08-15 2004-08-13 Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10338123.6 2003-08-15
DE2003138123 DE10338123B3 (de) 2003-08-15 2003-08-15 Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005017194A2 true WO2005017194A2 (de) 2005-02-24
WO2005017194A3 WO2005017194A3 (de) 2005-07-21

Family

ID=34177691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2004/001821 WO2005017194A2 (de) 2003-08-15 2004-08-13 Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20070184437A1 (de)
EP (1) EP1579014A2 (de)
DE (2) DE10338123B3 (de)
WO (1) WO2005017194A2 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007047912A2 (en) * 2005-10-17 2007-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
WO2007129182A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Université Pierre et Marie Curie Microorganisms detection and enumeration method
US8609829B2 (en) 2005-10-17 2013-12-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Legionella pneumophila nucleic acid

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2202305A4 (de) * 2007-10-04 2011-01-19 Tosoh Corp Primer zur rrna-amplifikation eines bakteriums der gattung legionella, nachweisverfahren und nachweis-kit

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0272009A2 (de) * 1986-11-24 1988-06-22 James John Hogan Nukleinsäuresonden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nicht-viralen Organismen
WO1993020234A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company A rapid, high capacity nucleic acid based assay
WO1994028174A1 (en) * 1993-05-24 1994-12-08 Amoco Corporation Nucleic acid probes for bacteria of the genus legionella

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19515891C2 (de) * 1995-04-29 1999-10-28 Roche Diagnostics Gmbh Gattungs- und speziesspezifische Identifizierung von Legionellen

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0272009A2 (de) * 1986-11-24 1988-06-22 James John Hogan Nukleinsäuresonden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nicht-viralen Organismen
WO1993020234A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company A rapid, high capacity nucleic acid based assay
WO1994028174A1 (en) * 1993-05-24 1994-12-08 Amoco Corporation Nucleic acid probes for bacteria of the genus legionella

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRIMM D ET AL: "SPECIFIC DETECTION OF LEGIONELLA PNEUMOPHILIA: CONSTRUCTION OF A NEW 16S RRNA-TARGETED OLIGONUCLEOTIDE PROBE" APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON,DC, US, Bd. 64, Nr. 7, Juli 1998 (1998-07), Seiten 2686-2690, XP001148448 ISSN: 0099-2240 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007047912A2 (en) * 2005-10-17 2007-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
WO2007047912A3 (en) * 2005-10-17 2007-11-15 Gen Probe Inc Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
US8609829B2 (en) 2005-10-17 2013-12-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Legionella pneumophila nucleic acid
US9845509B2 (en) 2005-10-17 2017-12-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Legionella pneumophila nucleic acid
WO2007129182A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Université Pierre et Marie Curie Microorganisms detection and enumeration method
WO2007129182A3 (en) * 2006-05-02 2008-08-14 Univ Paris Curie Microorganisms detection and enumeration method

Also Published As

Publication number Publication date
DE112004002047D2 (de) 2006-08-10
US20070184437A1 (en) 2007-08-09
EP1579014A2 (de) 2005-09-28
WO2005017194A3 (de) 2005-07-21
DE10338123B3 (de) 2005-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AT411174B (de) Verfahren und chip zur analyse von nukleinsäuren
DE19732086C2 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien
DE3486467T3 (de) Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren
EP1790735B1 (de) Oligonukleotide zur schnellen Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS
DE69407187T2 (de) Identifizierung von salmonella durch die polymerase-ketten-reaktion
EP0739988B1 (de) Verfahren zur Gattungs- und speziesspezifische Identifizierung von Legionellen
EP2179054A1 (de) Verwendung von polynukleotiden zur erfassung von genaktivitäten für die unterscheidung zwischen lokaler und systemischer infektion
WO2005017194A2 (de) Verfahren zum nachweis von bakterien der gattung legionella
DE69527328T2 (de) NUKLEINSÄUREPROBEN ZUR DETEKTION VON -i(HAEMOPHILUS INFLUENZA)
WO2002070736A2 (de) Verfahren zur detektion von nukleinsäuremolekülen
CN106521035A (zh) 检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法
WO2004009839A2 (de) Obligonukleotide zum nachweis von mikroorganismen
EP2373813B1 (de) Verfahren zum nachweis methicillin-resistenter staphylococcus aureus (mrsa)-stämme
WO1999022023A2 (de) Verfahren zum nachweis von mikroorganismen
ATE357539T1 (de) Nukleinsäuresonden und breite primerbereiche aus topoisomerasegenbereichen und verfahren mit deren anwendung
EP1366189A2 (de) Nachweis von pathogenen bakterien
DE10154290B4 (de) Verfahren zum Nachweis Parodontitis und Karies assoziierter Bakterien
DE10228785B4 (de) Detektion von toxischen Algen
EP0977894B1 (de) Verfahren und kit zur identifizierung antibiotika-resistenter bakterienstämme
DE10244456A1 (de) Verfahren zum Nachweis und Differenzierung von Bakterien
DE102013213279B4 (de) Universelles Verfahren zur Detektion von diversen Analyten in Form von Nukleinsäuresequenzen
DE102012103730A1 (de) Nachweisverfahren für Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis
WO2002024904A2 (de) Verfahren zur herstellung von ribonukleinsäure (rns)
KR102142137B1 (ko) 광견병 바이러스 및 백신주를 감별하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 광견병 바이러스 및 백신주의 감별방법
WO2002042492A2 (de) Verfahren zum nachweis von protozoen der gattung naegleria

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004762665

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004762665

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1120040020476

Country of ref document: DE

REF Corresponds to

Ref document number: 112004002047

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20060810

Kind code of ref document: P

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 112004002047

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007184437

Country of ref document: US

Ref document number: 10554238

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10554238

Country of ref document: US