EP2179054A1 - Verwendung von polynukleotiden zur erfassung von genaktivitäten für die unterscheidung zwischen lokaler und systemischer infektion - Google Patents

Verwendung von polynukleotiden zur erfassung von genaktivitäten für die unterscheidung zwischen lokaler und systemischer infektion

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EP2179054A1
EP2179054A1 EP08785273A EP08785273A EP2179054A1 EP 2179054 A1 EP2179054 A1 EP 2179054A1 EP 08785273 A EP08785273 A EP 08785273A EP 08785273 A EP08785273 A EP 08785273A EP 2179054 A1 EP2179054 A1 EP 2179054A1
Authority
EP
European Patent Office
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gene
seq
infection
patient
nucleic acids
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08785273A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Russwurm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Analytik Jena AG
Original Assignee
SIRS Lab GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SIRS Lab GmbH filed Critical SIRS Lab GmbH
Publication of EP2179054A1 publication Critical patent/EP2179054A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to the use of polynucleotides and / or their gene loci and / or their transcripts for detecting gene activities for distinguishing a state associated with a local infection from a condition of a patient associated with a systemic infection according to claim 1 and the use of Patient samples obtained gene activities for the distinction of a condition associated with a local infection from a condition of a patient associated with a systemic infection according to claim 3 and claim 15.
  • the invention further relates to a method for in vitro measurement of gene activities according to claim 17 and a kit according to claim 25th
  • the present invention relates in particular to marker genes and / or fragments thereof and their use for differentiating local from systemic infections by means of gene expression analyzes.
  • the invention further relates to PCR primers and probes derived from the marker genes.
  • Bacterial cell wall components such as lipopolysaccharides cause changes in cytokine levels in the blood (Mathiak 2003), and individual protein markers such as procalcitonin (PCT) and mannan-binding lectin (MBL) are used to indicate postoperative infections (Siassi 2005).
  • PCT procalcitonin
  • MBL mannan-binding lectin
  • the immune response of blood to bacterial pathogens can also be characterized by functional genomics (Feezor and Moldawer 2003, M. Foti et al, 2006) and bacterial proteins cause transcriptional and translational changes in host cells (FIo 2004).
  • Gene expression profiles can therefore also be used to determine the mechanisms of antibacterial substances (Hutter 2004).
  • a transcriptional analysis of genes in a blood sample was used to characterize differences in surviving and non-surviving sepsis patients (Pachot 2006).
  • transcripts including mRNA and small RNA, especially microRNA and other RNAs
  • quantification of transcripts with variable concentration of blood, blood cells and cells from organs and peripheral tissues, which are located in whole blood, provide a prerequisite for blood-based diagnostic tools represents.
  • the starting point for the invention disclosed in the present patent application is the recognition that gene activities of various genes present in blood cells in samples of an individual in local and systemic infection differ from the gene activities of the affected genes of individuals in which no infection, no local or systemic infection were diagnosed and can be used together or individually as marker genes with disease-related change in concentration of transcripts of blood. Normalization or relative quantification of the activities of these genes can be used as tools for diagnosis, prognosis, therapy and follow-up.
  • a kit according to claim 25 solves the problem as well.
  • the subclaims represent preferred embodiments of the invention.
  • a local infection is an infection in which the pathogens remain at the site of infection and cause symptoms only at this site without redistributing in the body.
  • a local infection may be respiratory infection, diarrhea, or boil on the skin.
  • a systemic infection is an infection in which the pathogens spread through an entire organ system or the entire organism.
  • Biological fluids within the meaning of the invention are understood to be all body fluids of mammals, including humans.
  • a gene is a section of the deoxyribonucleic acid (DNA) that contains basic information for the production of a biologically active ribonucleic acid (RNA).
  • genes are also understood as meaning all derived DNA sequences, partial sequences and synthetic analogs (for example peptido-nucleic acids (PNA)).
  • PNA peptido-nucleic acids
  • Genlocus is the position of a gene in the genome. If the genome consists of several chromosomes, the position within the chromosome on which the gene is located is meant. Different manifestations or variants of this gene are referred to as alleles, all located at the same site on the chromosome, namely the gene locus. Thus, the term "gene locus” includes, on the one hand, the pure genetic information for a specific gene product and, on the other hand, all regulatory DNA segments as well as any additional DNA sequences which are in any functional or non-functional context with the gene at the gene locus. Gene activity: Genetic activity is the measure of the ability of a gene to be transcribed and / or to form translation products.
  • Gene Expression The process of forming a gene product and / or expression of a genotype into a phenotype.
  • a marker gene is a gene that displays a disease-related change in its expression and transcription across different RNA samples and whose variable gene activity is used to diagnose, monitor and control the therapy of various samples.
  • Hybridization Conditions Physical and chemical parameters well known to those skilled in the art that may affect the establishment of a thermodynamic equilibrium of free and bound molecules. In the interest of optimal hybridization conditions, the duration of contact of the probe and sample molecules, cation concentration in the hybridization buffer, temperature, volume, and concentrations and ratios of the hybridizing molecules must be matched.
  • Amplification conditions cyclically changing reaction conditions which allow the amplification of the starting material in the form of nucleic acids.
  • the reaction mixture are the individual components (deoxynucleotides) for the resulting nucleic acids, as well as short oligonucleotides, which can attach to complementary regions in the starting material, as well as a nucleic acid synthesis enzyme, called polymerase.
  • the cation concentrations, pH, volume and the duration and temperature of the individual cyclically repeating reaction steps which are well known to the person skilled in the art are of importance for the course of the amplification.
  • Primer is an oligonucleotide which serves as a starting point for DNA-replicating enzymes such as DNA polymerase. Primers may consist of both DNA and RNA (primer 3, see, e.g., http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi of MIT).
  • a probe is a
  • Nucleic acid fragment (DNA or RNA) (with a molecular marker such as fluorescent markers, in particular molecular beacons, TaqMan ® probes, Isotopic labeling, etc.) and used for sequence-specific detection of target DNA and / or target RNA molecules.
  • a molecular marker such as fluorescent markers, in particular molecular beacons, TaqMan ® probes, Isotopic labeling, etc.
  • PCR is the abbreviation for the term "polymerase chain reaction.”
  • the polymerase chain reaction is a method to amplify DNA in vitro outside a living organism using a DNA-dependent DNA polymerase according to the present invention, to amplify short parts - up to about 3,000 base pairs - of a DNA strand of interest, which may be a gene or just a part of a gene or non-coding DNA sequences.
  • PCR a number of PCR methods are known in the art, all of which are encompassed by the term "PCR”. This applies in particular to the "real-time PCR”.
  • PCR primers typically, PCR requires two primers to set the starting point of DNA synthesis on each of the two strands of DNA, thereby limiting the range of duplication on both sides.
  • primers are well known to those skilled in the art, for example from the website "Primer3", see for example http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi of MIT.
  • RNA transcript For the purposes of the present application, a transcript is understood to mean any RNA product which is produced on the basis of a DNA template.
  • small RNA Small RNAs in general. Representatives of this group are in particular, but not limited to: a) small cytoplasmic RNA (scRNA), which is one of several small RNA molecules in the cytoplasm of a eukaryote. b) snRNA (small nuclear RNA), one of the many small RNA forms found only in the nucleus. Some of the snRNAs play a role in splicing or in other RNA-processing reactions.
  • scRNA small cytoplasmic RNA
  • snRNA small nuclear RNA
  • RNAs small non-protein-coding RNAs, which include the so-called small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) and small double-stranded RNAs (dsRNAs), which increase gene expression on many levels, including chromatin architecture, RNA editing, RNA stability, translation, and possibly also transcription and splicing.
  • small nucleolar RNAs small nucleolar RNAs
  • miRNAs microRNAs
  • siRNAs short interfering RNAs
  • dsRNAs small double-stranded RNAs
  • these RNAs are processed in multiple ways from the introns and exons of longer primary transcripts, including protein coding transcripts. Although only 1, 2% of the human genome encodes proteins, a large part is nevertheless transcribed.
  • ncRNA non-protein-coding RNAs
  • snoRNAs Small nucleolar RNAs regulate the sequence-specific modification of nucleotides in target RNAs.
  • modifications There are two types of modifications, namely 2'-O-ribosemethylation and pseudouridylation, which are regulated by two large snoRNA families, called box C / D snoRNAs on the one hand, and box H / ACA snoRNAs on the other.
  • box C / D snoRNAs two large snoRNA families
  • box H / ACA snoRNAs Such snoRNAs have a length of about 60 to 300 nucleotides.
  • miRNAs are even smaller RNAs with generally 21 to 25 nucleotides. miRNAs are derived from endogenous short hairpin precursor structures and usually use other loci with similar - but not identical - sequences as the target of translational repression.
  • siRNAs arise from longer double-stranded RNAs or long hairpins, often of exogenous origin. They usually target homologous sequences at the same locus or elsewhere in the genome, where they participate in so-called gene silencing, a phenomenon also called RNAi.
  • miRNAs and siRNAs are fluid.
  • small RNA may also include so-called transposable elements (TEs) and in particular retroelements, which are also understood for the purposes of the present invention by the term “small RNA”.
  • TEs transposable elements
  • retroelements which are also understood for the purposes of the present invention by the term “small RNA”.
  • the invention describes the identification of novel marker genes from blood, suitable microarray probes and their use, also in combination, for the determination of normalized and quantitative expression data from blood and blood cells in microarrays, real-time PCR assays and other measurement systems with or without amplification and with different quantification and Visualization possibilities for the determination of local inflammations and for the differentiation of generalized systemic inflammations, infections and resulting immune reactions in the systemic reaction to it.
  • the method according to the invention is characterized in that, in a sample of a biological fluid, in particular a blood sample or a tissue sample of an individual, the activity of one or more marker genes is normalized by determining the presence and amount of the gene product also relative to the amounts of the gene products of control genes or quantified by further methods known to those skilled in the art, to distinguish between local and systemic infection.
  • sequences from blood and blood cells as well as probes derived therefrom which can be used for the determination, visualization, normalization and quantification of gene activities and transcripts, are disclosed.
  • the sequences of the oligonucleotide probes in a preferred embodiment are set forth in Tables 1 to 5 and correspond to those in the attached sequence listing SEQ ID No 1 to SEQ ID No 69.
  • the sequences of the oligonucleotide probes may also have further sequences, in a preferred embodiment of a length of 50 -100 nucleotides which specifically bind transcripts of the genes set forth in Table 1 to 5 with sequences SEQ ID No 1 to SEQ ID No 69.
  • the length and combination of sequences used in amplification methods such as PCR may be arbitrary as far as they support the desired enzymatic manipulation and amplification.
  • the marker genes can be used singly or in combination of several. Typically, marker gene activity may be as described herein with hybridization probes for microarrays or PCR primers and real-time PCR be determined. However, the marker genes and their expression products can also be determined by other methods known to those skilled in the art, such as, for example, NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) and in various combinations. They can also be determined using a number of other methods or visualization options, for example by means of beach displacement or with the aid of monoclonal antibodies. Probes can be used for the gene, the expression product (mRNA), fragments or expression intermediates that are not completely processed into mRNA.
  • mRNA the expression product
  • the probes bind a specific region of the marker genes or their transcripts disclosed herein.
  • the probes may interact with any region of the gene sequences disclosed herein or sequences transcribed therefrom.
  • the primers and probes may interact via continuous base pairing but may not continuously interact with the complete complementary sequence, the buffer compositions, salt concentrations, washes and temperatures may be chosen to be variable.
  • these changes of the marker genes can be compared with the expression values (or data derived therefrom, such as average values) of one or more reference samples, which need not be determined simultaneously with the target sample but are stored in a database, for example, in the manner of a calibration or as values or tables become.
  • An embodiment of the invention is characterized in that expression values using marker genes of Table 1 to 5 and nucleic acids and transcripts of these marker genes from blood and blood cells by comparing the expression levels with one or more control genes (as in the non-prepublished patent application DE 10 2007 010 252.8) and quantification of marker gene expression values relative to marker nucleic acid.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that nucleic acids and DNA probes with the sequences according to Tables 1 to 5 and their binding of RNA including small RNA, in particular microRNA, siRNA and / or repeats and / or of transcripts (RNA or mRNA) in Blood or from blood cells of genes according to Tables 1 to 5 in any combination in solution or immobilized on surfaces or particles or beads and the use of the bound transcripts of these genes for normalization by comparison of the bound amounts (expression levels) of the nucleic acids with one or more probe nucleic acid-bound nucleic acids and for quantification in relation to the bound marker nucleic acid.
  • RNA including small RNA, in particular microRNA, siRNA and / or repeats and / or of transcripts (RNA or mRNA) in Blood or from blood cells of genes according to Tables 1 to 5 in any combination in solution or immobilized on surfaces or particles or beads and the use of the bound transcripts of these genes for normalization by comparison of the bound amounts (expression levels) of the nucleic acids
  • An embodiment of the invention is characterized in that the method for the ex vivo, in vitro differentiation of local and systemic infection based on reference of the RNA amounts from control gene and marker gene comprises the following steps:
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the marker gene RNA is hybridized with the DNA before the marker gene RNA is measured and the marker signals of the control RNA / DNA complex are detected, optionally further transformed and optionally in the form of a calibration curve or table.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that RNA of the marker genes or parts thereof are identified and quantified by sequencing or partial sequencing, for example via pyrosequencing.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that mRNA or microRNA is used as the marker gene RNA.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the DNA for specific binding of the marker gene RNA or its in vitro transcripts at predetermined areas on a support in the form of a microarray arranged, in particular immobilized, is.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the biological sample is that of a human.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the immobilized or free probes derived from sequences corresponding to Tables 1 to 5 are labeled.
  • immobilized or free probes derived from sequences corresponding to Tables 1 to 5 are labeled.
  • self-complementary oligonucleotides so-called molecular beacons
  • They carry a fluorophore / quencher pair at their ends, so that in the absence of a complementary sequence they are present in a folded hairpin structure and only deliver a fluorescence signal with a corresponding sample sequence.
  • the hairpin structure of the Molecular Beacons is stable until the probe hybridizes to the specific capture sequence, resulting in a conformational change and concomitant release of reporter fluorescence.
  • RNA sequences within the meaning of the invention, all derived DNA sequences, partial sequences and synthetic analogs (for example peptidonucleic acids, PNA) are understood as aptamers.
  • PNA peptidonucleic acids
  • RNA of the marker genes is isolated from the whole blood of corresponding patients.
  • the RNA is then labeled, for example radioactively with 32 P or with dye molecules (fluorescence).
  • labeling molecules it is possible to use all molecules and / or detection signals known for this purpose in the prior art.
  • Corresponding molecules and / or labeling methods are also known to the person skilled in the art.
  • the thus-labeled RNA is then hybridized with immobilized on a microarray DNA molecules.
  • the DNA molecules immobilized on the microarray represent a specific selection of the genes according to the present invention for distinguishing between local and systemic infection.
  • the intensity signals of the hybridized molecules are subsequently measured by suitable measuring devices (phosporimagers, microarray scanners) which are well known in the prior art and analyzed by further software-supported evaluations.
  • suitable measuring devices phosporimagers, microarray scanners
  • the expression ratios between the marker genes of the patient sample and the control genes are determined from the measured signal intensities. From the expression ratios of the under- and / or overregulated genes can be, as shown in the below Draw conclusions about the distinction between local and systemic infection.
  • a further application of the method according to the invention consists in the measurement of the differential gene expression for the therapy-accompanying determination of the probability that patients will respond to the planned therapy, and / or for the determination of the response to a specialized therapy and / or on the determination of the Therapy end in the sense of a "drug monitoring" in patients with proven systemic infection and their severity grades.
  • the RNA test RNA and control RNA
  • the RNA samples are marked together and hybridized with selected marker genes as well as control genes immobilized on a microarray, thus allowing the assessment of the likelihood that patients will respond to the planned therapy by assessing the expression relationships between one or more control genes and marker genes and / or whether the initiated therapy is effective and / or how long the patients still need to be treated accordingly and / or whether the maximum therapeutic effect has already been achieved with the dose and duration used.
  • RNA of the genes according to the invention for obtaining quantitative information by hybridization-independent methods, in particular enzymatic or chemical hydrolysis, surface plasmon resonance method (SPR method), subsequent quantification of the nucleic acids and / or derivatives and / or fragments thereof
  • the transcripts of control genes amplified and quantified by means of PCR constitute a further embodiment according to the present invention for normalizing gene expression data in the differentiation of local and systemic infection and their degrees of severity.
  • the intensity signals of the amplified transcripts are subsequently measured by suitable measuring devices (PCR fluorescence detector) and analyzed by further software-supported evaluations.
  • the expression ratios between the marker genes of the patient sample and the control genes are determined from the measured signal intensities. From the expression ratios of the under- and / or overregulated genes can be, as shown in the below Experiments, conclusions on the distinction between local and systemic infection, if necessary, draw their severity.
  • a further application of the method according to the invention consists in the normalization of an optionally amplified mRNA quantity in several samples comprising a) a comparison of the expression values of one or more nucleic acids selected from SEQ ID 1 to SEQ ID 69 via different samples; b) deriving a value for normalizing expression values of one or more nucleic acids selected from SEQ ID 1 to SEQ ID 69 over several samples and c) normalizing the expression of other nucleic acids isolated from several samples based on step b)
  • the invention may further relate to a kit comprising a selection of polynucleotides having the sequences of SEQ ID 1 to SEQ ID 69 and / or gene fragments thereof of at least 1-100, more preferably 1-5 and 1-10 nucleotides for determination of gene expression profiles in vitro in a patient sample, for use as marker genes.
  • the invention may also relate to a kit comprising a selection of hybridization probes according to SEQ ID No.1 to SEQ ID NO. 69 and / or gene fragments thereof containing at least 50 nucleotides for determining gene expression profiles in vitro in a patient sample for use as marker genes.
  • An alternative embodiment of the present invention is a use of gene activities obtained in vitro from at least one patient sample for distinguishing a condition associated with a local infection from a condition of a patient associated with a systemic infection, wherein the gene activities are obtained from a method comprising steps:
  • Amplification conditions wherein the length of the amplified portion comprises 50 to 3000 nucleotides and the markers are those gene products which are present in varying amounts in patients with local and systemic infection;
  • Another application of the via microarray analysis or other quantification methods such as e.g. Genetic activities and gene expression data determined in real-time PCR are used to distinguish local and systemic infection for electronic further processing for the purpose of producing software for diagnostic purposes (eg to assess the severity of an individual immune response, especially in the case of bacterial infection, also in the context of patient data management systems) or expert systems) or for modeling cellular signal transduction pathways.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least one of the polynucleotides according to SEQ ID No 1 to SEQ ID No 69, in particular nucleic acid probes or their complements are used for binding the transcripts or their complements of the marker genes.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the synthetic analogs of the marker genes or the synthetic oligonucleotides which bind the transcripts of the control genes, in particular comprise about 60 base pairs.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that a radioactive marker, in particular 32 P, 14 C, 125 1, 33 P or 3 H, is used as the detectable marker.
  • the detectable marker is a non-radioactive marker, in particular a staining or fluorescence marker, an enzyme marker or immune marker, and / or quantum dots or an electrically measurable signal, in particular potential and / or conductivity and / or capacity change, eg. In hybridizations.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the marker gene RNA and control gene RNA and / or enzymatic or chemical derivatives thereof carry the same label.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the marker gene RNA and control gene RNA and / or enzymatic or chemical derivatives carry different labels.
  • nucleic acid probes are immobilized on a support material, e.g. Glass or plastic, to be immobilized.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the individual DNA molecules are immobilized via a covalent bond to the carrier material.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the individual DNA molecules are immobilized on the carrier material by means of electrostatic and / or dipole-dipole and / or hydrophobic interactions and / or hydrogen bonds.
  • a kit according to claim 25 and clusters of polynucleotides also solve the problem.
  • the present invention is for companion clinical evaluation of patients with local or systemic infection.
  • the present invention may also be used to prepare "in silico" expert systems and / or for "in silico” modeling of more cellular signal transduction pathways.
  • a plurality of specific genes and / or gene fragments are used, which are selected from the group in Tables 1 to 5 consisting of SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 69 and gene fragments thereof having at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
  • the present invention relates to the use of gene expression profiles obtained in vitro from a patient sample and / or of the probes used therefor, which are selected from the group consisting of SEQ ID no. 1 to SEQ ID NO. 69 and gene fragments thereof with at least 5-2,000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides, for switching off or switching on and / or for activity modification of target genes and / or for determining the gene activity for monitoring local or systemic infection and course a local Infection to a systemic infection of a patient.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least one specific marker gene and / or gene fragment is selected from the group consisting of SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 69 and gene fragments thereof having at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that at least 2 to 69 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the SEQ ID NO. 1 - SEQ ID NO. 69 listed genes or gene fragments and / or derived from their RNA sequences are replaced by corresponding synthetic analogues, aptamers and Peptidonukleinklaren.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the synthetic analogs of the genes comprise 5-100, in particular about 70 base pairs.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the gene activities are determined by means of hybridization methods.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the gene activity is determined by means of microarrays.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the gene activity is determined by hybridization-independent methods, in particular enzymatic and / or amplification methods, preferably PCR, subsequent quantification of the nucleic acids and / or of derivatives and / or fragments thereof.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that cell samples are optionally subjected to a lytic treatment in order to release their cell contents.
  • Fig. 1 is a heat map showing a random selection from the relevant genes for the distinction between local and systemic infection.
  • the technical replicates (multiple spots of the same sample) on the microarray are filtered out of the corrected and transformed signal intensities depending on their spot quality. For each spot, the highest-labeled replicas are selected and the associated signal intensity is averaged. The expression of spots with only unmeasurable replicates are marked with "NA" (not available).
  • the total RNA from cell lines SIG-M5 served as reference samples.
  • the patients' whole blood in the intensive care unit was approved by the patients using the PAXGene kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen). After collection of the whole blood, the total RNA of the samples was isolated using the PAXGene Blood RNA Kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen).
  • This mixture was centrifuged at 1000 xg for 5 minutes at room temperature and suspended in 10 ml of the above-mentioned medium.
  • the subsequent cell count gave the following result: 1, 5 x 10 7 cells per ml, 10 ml total volume, total number of cells: 1, 5 x 10 8 . Since the cell count was still insufficient, 2.5 ml of the above-mentioned cell suspension in 30 ml of the above medium was added to a 250 ml (75 cm 2 ) flask (total of 4 flasks). After 72 hours of incubation, 20 ml each of fresh medium was added to the flasks.
  • the cell count was as described above, giving a total cell number of 3.8 x 10 8 cells.
  • the cells were resuspended in 47.5 ml of the above medium in 4 flasks. After an incubation period of 24 hours, the cells were centrifuged and washed twice with phosphate buffer without Ca 2+ and Mg 2+ (Biochrom AG).
  • RNA isolation is carried out using the NucleoSpin RNA L kit (Machery & Nagel) according to the manufacturer's instructions. The procedure described above was repeated until the required number of cells was reached. This was required to achieve the required amount of 6 mg total RNA, which corresponds approximately to an efficiency of 600 ⁇ g RNA per 10 8 cells.
  • RNA of the samples was isolated and tested for quality using the PAXGene Blood RNA Kit (PreAnalytiX) according to the manufacturer's instructions. From each sample, 10 ⁇ g total RNA were aliquoted and, together with 10 ⁇ g total RNA from SIGM5 cells as reference RNA to complementary DNA (cDNA) with the reverse transcriptase Superscript II (Invitrogen) rewritten and the RNA then by alkaline hydrolysis removed the approach. In the reaction mixture, a portion of the dTTP was replaced by aminoallyl-dUTP (AA-dUTP), to allow later the coupling of the fluorescent dye to the cDNA.
  • AA-dUTP aminoallyl-dUTP
  • the cDNA of the samples and controls were covalently labeled with the fluorescent dyes Alexa 647 and Alexa 555 and hybridized on a microarray from SIRS-Lab.
  • the microarray used are 5308 immobilized polynucleotides with a length of 55-70 base pairs, each representing a human gene and control spots for quality assurance.
  • An exemplary microarray is divided into 28 subarrays with a grid of 15x15 spots.
  • the hybridization and subsequent washing or drying was carried out in the hybridization station HS 400 (Tecan) according to the manufacturer for 10.5 hours at 42 0 C.
  • the hybridization solution used consists of the respective labeled cDNA samples, 3.5 ⁇ SSC (1x SSC contains 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), 0.3% sodium dodecyl sulfate (v / v) 25% formamide (V ⁇ /) and 0 each, 8 ⁇ g ⁇ l-1 cot-1 DNA, yeast t-RNA and poly-A RNA.
  • the subsequent washing of the microarrays was carried out with the following program at room temperature: rinse for 90 seconds with washing buffer 1 (2 ⁇ SSC, 0.03% sodium dodecyl sulfate), with Wash Buffer 2 (1x SSC) and finally with Wash Buffer 3 (0.2x SSC). Thereafter, the microarrays were dried under a stream of nitrogen at a pressure of 2.5 bar at 30 0 C for 150 seconds.
  • hybridization signals of the microarrays were read using a GenePix 4000B scanner (Axon) and the expression ratios of the differentially expressed genes were determined using the GenePix Pro 4.0 or 5.0 (Axon) software.
  • the mean intensity of a spot was determined as the median value of the associated spot pixels.
  • each array was normalized one at a time using Box-Cox potency transformations (Box and Cox 1964, median and MAD (median absolute deviations from median).
  • the minimum of the classification error estimated by cross-validation was obtained for 69 gene samples.
  • the determination of the 69 gene samples indicated in Table 1-5 was carried out using the bootstrap method. Thus, the selection of the best 69 gene samples was repeated 5000 times using bootstrap samples and then sorting the gene samples according to the frequency of their selection.
  • the classification error estimated using 100 repetitions of a 10-fold cross-validation for the 69 gene samples given in Table 1-5 is 15.7% overall. In the group of patients with local infection the error is 26,7%, in the group of patients with systemic infection 11,1%. The patients with systemic infection are thus recognized with a safety of approximately 90%.
  • Gene expression was measured from a randomly selected ITS patient whose infection changes from systemic to local. The analysis took into account 8 consecutive ITS days of the patient.
  • the total RNA from cell lines SIG-M5 served as reference samples.
  • A Use according to A, characterized in that the gene activities by means of hybridization methods, in particular those on microarrays and / or enzymatic methods, in particular amplification method, preferably PCR, preferably real-time PCR, are created.
  • probe nucleic acids represent genes and / or gene loci or their transcripts that distinguish a condition associated with a local infection from that associated with a systemic infection Permit the condition of a patient and wherein the probe nucleic acid comprises at least one polynucleotide according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 69 or at least one such polynucleotide with a length of 2 to 100% of the number of nucleotides of the individual sequences according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID NO.
  • step d) comparing the marker signals obtained in step d) with at least one reference value in order to make a statement as to whether a patient has a condition associated with a local infection or a condition associated with a systemic infection.
  • sample nucleic acid is RNA, in particular total RNA
  • probe nucleic acid is DNA, in particular cDNA, or mRNA.
  • the amplification mixture contains further constituents, in particular deoxynucleotides, polymerases, salts, buffers and fluorescence dyes attaching to nucleic acids.
  • a method of measuring gene activities in vitro for distinguishing a condition associated with a local infection from a condition of a patient associated with a systemic infection comprising the steps of:
  • probe nucleic acids represent genes and / or gene loci and / or their transcripts, which distinguishes a condition associated with a local infection from a with a systemic Infection associated condition of a patient and wherein the probe nucleic acid at least one polynucleotide according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID No. 69 or such a polynucleotide having a length of 2 to 100% of the number of nucleotides of the individual sequences according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 69;
  • step d Comparing the marker signals obtained in step d) with at least one reference value to determine whether a patient is experiencing a condition associated with a local infection or a condition associated with a systemic infection.
  • Method according to Q characterized in that the gene fragments comprise 5 to 1000, preferably 20-200, preferably 20-80 nucleotides.
  • Method according to Q to R characterized in that the polynucleotides according to Seq-ID No 1 to SEQ ID No 69 and / or sequences derived therefrom are replaced by: synthetic analogs, aptamers, spiegelmers as well as peptido- and morpholinonucleic acids.
  • Method according to Q to U characterized in that the sample is selected from: tissue, body fluids, in particular blood, serum, plasma, urine, saliva or cells or cell components; or a mixture of them.
  • Method according to Q to V characterized in that samples, in particular cell samples, are subjected to a lytic treatment to release their cell contents.
  • Method according to Q to W characterized in that the sample nucleic acid is RNA, in particular total RNA, the probe nucleic acid is DNA, in particular cDNA, or mRNA.
  • Kit containing at least one of the polynucleotide sequences SEQ ID NO. 1 - SEQ ID NO. 69 and / or primers and / or probes and / or antisense nucleotides therefor or which are specific for detecting the condition of an infection (local or systemic) of a patient, and / or polynucleotides of 2 to 100% of the number of nucleotides in length individual sequences according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 69 for the determination of gene activities in vitro in a patient sample, and / or for determining the course of a patient's infection from local to systemic or from systemic to local.
  • Kit according to Y characterized in that the polynucleotide sequences also include gene loci, mRNA, small RNA, in particular scRNA, snoRNA, microRNA, siRNA, dsRNA, ncRNA or transposable elements.
  • FIG. 1 shows a so-called heat map for the representation of a random selection from the relevant genes for the distinction between local and systemic infection.
  • Fig. 1 Shown in Fig. 1 in the rows are the normalized expression data of the individual transcripts centered on the mean (i.e., for each gene, the mean is determined across all patients). The columns represent the different patients. Light gray / white stands for Expression higher than the mean and dark gray / black for Expression lower than the mean.
  • the light gray bar above the heatmap stands for the patients with local infection, the dark gray bar for the patients with systemic infection.
  • a hierarchical clustering was also performed using the "complete" method known to those skilled in the art, using as distance Pearson's correlation distance.
  • the dendrogram on the left shows that the transcripts can essentially be divided into 4 clusters.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polynukleotiden mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei sämtliche Sequenzen gemäß SEQ- ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 verwendet werden; sowie ein Verfahren und einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Beschreibung
Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und svstemischer Infektion
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polynukleotiden und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten gemäß Anspruch 1 sowie die Verwendung von aus Patientenproben erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten gemäß Anspruch 3 und Anspruch 15. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro Messung von Genaktivitäten gemäß Anspruch 17 sowie einen Kit gemäß Anspruch 25.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Markergene und/oder deren Fragmente und ihre Verwendung zur Differenzierung lokaler von systemischen Infektionen mittels Genexpressionsanalysen. Die Erfindung betrifft ferner von den Markergenen abgeleitete PCR-Primer und Sonden.
Bakterienzellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide verursachen Veränderungen der Cytokinkonzentrationen im Blut (Mathiak 2003) und einzelne Proteinmarker wie Procalcitonin (PCT) und Mannan-binding lectin (MBL) werden zur Anzeige postoperativer Infektionen benutzt (Siassi 2005). Die Immunantwort von Blut auf bakterielle Pathogene ist auch mittels funktioneller Genomik charakterisierbar (Feezor und Moldawer 2003, M. Foti et al, 2006)) und bakterielle Proteine verursachen Veränderungen der Transkription und Translation in Wirtszellen (FIo 2004). Genexpressionsprofile können daher auch zur Bestimmung der Mechanismen antibakterieller Substanzen verwendet werden (Hutter 2004). Eine Transkriptionsanalyse von Genen in einer Blutprobe wurde eingesetzt um Unterschiede bei überlebenden und nicht-überlebenden Sepsispatienten zu charakterisieren (Pachot 2006).
Obwohl Expressionsveränderungen einzelner Gene bei verschiedenen Erkrankungen bekannt sind und auch bei lokaler Infektion einzelne Expressionsänderungen im Muskelgewebe der Maus (A. Boelen, 2005) und mehrere in Epithelzellen bei lokaler viraler Infektion von Hühnern (X. Wang, 2006) oder in der Darmmukosa von Schweinen (T. A. Niewold, 2006) beschrieben wurden, sind keine Markergene und deren Transkripte sowie die kombinierte Verwendung mehrerer quantitativer Transkriptionswerte aus Vollblutproben und Blutzellen zur Differenzierung lokaler von systemischen Infektionen bekannt. Jedoch ist aus der Literatur (Rittirsch et al., 2006 und Esmond, 2004) bekannt, dass an Tiermodellen durchgeführte Expressionsanalysen nicht unbedingt auf die humane Pathophysiologie übertragbar sind.
Die Quantifizierung von Transkripten (auch mRNA und small RNA, insbesondere microRNA sowie weitere RNAs) mit veränderlicher Konzentration aus Blut, aus Blutzellen und aus Zellen aus Organen und peripherem Gewebe, welche in Vollblut lokalisiert sind, stellen eine Voraussetzung für Blut-basierte Hilfsmittel der Diagnostik dar.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarte Erfindung ist die Erkenntnis, dass Genaktivitäten verschiedener Gene, welche in Blutzellen vorkommen, in Proben eines Individuums bei lokaler und systemischer Infektion sich von den Genaktivitäten der betroffenen Gene von Individuen, bei denen keine Infektion, keine lokale oder systemische Infektion diagnostiziert wurde, unterscheiden und gemeinsam oder einzeln als Markergene mit erkrankungsbedingter Konzentrationsänderung von Transkripten aus Blut verwendet werden können. Eine Normalisierung oder relative Quantifizierung der Aktivitäten dieser Gene kann als Hilfsmittel zur Diagnose, Prognose, Therapie- und Verlaufskontrolle genutzt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche eine Differenzierung lokaler von systemischer Infektion, Diagnose und/oder Verlaufskontrolle und/oder Therapie ermöglicht durch Unterscheidung krankheitsbedingter Genexpressionsänderungen in einer biologischen Probe.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 , 3 und 15 gelöst.
Verfahrenstechnisch wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 17 gelöst.
Ein Kit gemäß Anspruch 25 löst die Aufgabe ebenfalls. Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar.
Definitionen:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:
Lokale Infektion: Eine lokale infektion ist eine Infektion, bei der die Erreger am Infektionsort verbleiben und nur an dieser Stelle Symptome verursachen, ohne sich im Körper weiterzuverteilen. Eine lokale infektion ist beispielsweise eine Infektion der Atemwege, ein Durchfall oder ein Furunkel an der Haut.
Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über ein gesamtes Organsystem oder den gesamten Organismus ausbreiten.
Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.
Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA- Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido- Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA- Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus" einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzlichen DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen oder nicht funktionellen Zusammenhang stehen. Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.
Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.
Markergen: Ein Markergen ist ein Gen, welches eine erkrankungsbezogene Änderung seiner Expression und Transkription über verschiedene RNA Proben zeigt und dessen veränderliche Genaktivität der Diagnose, Verlaufs- und Therapiekontrolle über verschiedene Proben dient.
Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -Verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.
Amplifikationsbedingungen: Sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxynukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen sich zyklisch wiederholenden Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.
Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für DNA-replizierende Enzyme wie die DNA- Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z.B. http://frodo.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)
Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein
Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z.B. Fluoreszenzlabel, insbesondere molecular beacons, TaqMan®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA-Molekülen eingesetzt wird.
PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction" (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile - bis zu etwa 3.000 Basenpaare - eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR" mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „real-time-PCR".
PCR-Primer: Typischerweise benötigt eine PCR zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird. Derartige Primer sind dem Fachmann wohlbekannt, beispielsweise aus der Website „Primer3", siehe z.B. http://frodo.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT.
Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.
small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich: a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist. b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle. c) small non-protein-coding RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), Short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA- Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den lntrons und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1 ,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen.
Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf.
miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs )sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere loci mit ähnlichen - jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression.
siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind.
Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.
d) Zusätzlich kann der Begriff "small RNA" auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA" verstanden werden.
Die Erfindung beschreibt die Identifikation von neuen Markergenen aus Blut, geeignete Mikroarray-Sonden und ihre Verwendung, auch in Kombination, zur Bestimmung von normalisierten und quantitativen Expressionsdaten aus Blut und Blutzellen in Microarrays, real-time PCR assays und anderen Messsystemen mit oder ohne Amplifikation und mit verschiedenen Quantifizierungs- und Visualisierungsmöglichkeiten zur Bestimmung lokaler Entzündungen und zur Differenzierung von generalisierten systemischen Entzündungen, Infektionen und daraus resultierenden Immunreaktionen bei der systemischen Reaktion darauf.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere Blutprobe oder einer Gewebeprobe eines Individuums die Aktivität von einem oder mehreren Markergenen durch Feststellung der Anwesenheit und der Menge des Genprodukts auch relativ zu den Mengen der Genprodukte von Kontrollgenen oder normalisiert oder quantifiziert über weitere, dem Fachmann bekannten Verfahren, zwischen lokaler und systemischer Infektion unterscheiden kann.
Offenbart werden hierzu Gensequenzen aus Blut und Blutzellen sowie daraus abgeleitete Sonden, welche zur Bestimmung, Visualisierung, Normalisierung und Quantifizierung von Genaktivitäten und Transkripten verwendet werden können. Die Sequenzen der Oligonukleotidsonden in bevorzugter Ausführung sind in Tabelle 1 bis 5 dargelegt und entsprechen dem im beigefügten Sequenzprotokoll SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 69. Dabei können die Sequenzen der Oligonukleotidsonden auch weitere Sequenzen, in bevorzugter Ausführung von einer Länge von 50-100 Nukleotiden annehmen, welche spezifisch Transkripte der in Tabelle 1 bis 5 dargelegten Gene mit Sequenzen SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 69 binden. Die Länge und Kombination der in Amplifikationsverfahren wie PCR verwendeten Sequenzen kann beliebig sein soweit sie die gewünschte enzymatische Manipulation und Amplifikation unterstützen.
Tabelle 4
Seq Nr. Zelloberflächenrezeptoren-vermittelte Signal Transduktion
38 IL7R NM 002185
39 DO K2 NM 003974
40 MYD88 NM 002468
Tabelle 5
Seq Nr. Sonstige Signalwege
41 CCR2 NM 000647
42 CCR2 NM 000648
43 GPR109A NM 177551
44 GZMB NM 004131
45 CLU NM 001831
46 CLU NM 203339
47 ATP2B1 NM 001001323
48 ATP2B1 NM 001682
49 CLIC1 NM 001288
50 MAP2K1 NM 002755
51 ARPC1 B NM 005720
52 TNFAIP2 NM 006291
53 CCBP2 NM 001296
54 ZNF746 NM 152557
55 MXH NM 005962
56 MXH NM 130439
57 MXH NM 001008541
58 DMD NM 004009
59 DMD NM 004010
60 DMD NM 000109
61 DMD NM 004006
62 NSMAF NM 003580
63 CD82 NM 001031700
64 CD82 NM 001024844
65 FLJ43146 fis AK125136
66 C4orf18 NM 001031700
67 C4orf18 NM 016613
68 FLOT1 NM 005803
69 ZFP36L2 NM 006887
Die Markergene können einzeln oder in Kombination von mehreren verwendet werden. Üblicherweise kann die Aktivität von Markergenen wie hier beschrieben mit Hybridisierungssonden für Microarrays oder PCR Primern und real-time PCR bestimmt werden. Die Markergene und ihre Expressionsprodukte können aber auch mit anderen dem Fachmann bekannten Methoden wie beispielsweise NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) und in verschiedener Kombination ermittelt werden. Sie können auch mit einer Reihe weiterer Methoden oder Visualisierungsmöglichkeiten wie beispielsweise mittels Strand displacement oder mit Hilfe monoklonaler Antikörper bestimmt werden. Sonden können für das Gen, das Expressionsprodukt (mRNA), Fragmente oder Expressionszwischenprodukte, welche nicht komplett zu mRNA prozessiert werden, eingesetzt werden.
In weiteren Ausführungen binden die Sonden eine spezifische Region der hier offenbarten Markergene oder ihrer Transkripte. Die Sonden können aber mit jeder Region der hier offenbarten Gensequenzen oder daraus transkribierten Sequenzen wechselwirken. Die Primer und Sonden können über fortlaufende Basenpaarung wechselwirken müssen aber nicht kontinuierlich mit der kompletten komplementären Sequenz wechselwirken, die Pufferzusammensetzungen, Salzkonzentrationen, Waschschritte und Temperaturen können hier variabel gewählt werden.
Ebenso können diese Veränderungen der Markergene mit den Expressionswerten (oder daraus abgeleiteten Daten wie z.B. Durchschnittswerten) einer oder mehrerer Referenzproben verglichen werden, welche nicht gleichzeitig mit der Zielprobe ermittelt werden müssen, sondern beispielsweise nach Art einer Kalibrierung oder als Werte oder Tabelle in einer Datenbank abgelegt werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man Expressionswerte unter Anwendung von Markergenen der Tabelle 1 bis 5 sowie Nukleinsäuren und Transkripte dieser Markergene aus Blut und aus Blutzellen durch Vergleich der Expressionswerte mit einem oder mehreren Kontrollgenen (wie in der nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung DE 10 2007 010 252.8) und durch Quantifizierung der Markergenexpressionswerte in Bezug zur Markernukleinsäure ermittelt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Nukleinsäuren und DNA Sonden mit den Sequenzen nach Tabelle 1 bis 5 und deren Bindung von RNA inklusive small RNA, insbesondere microRNA, siRNA und/oder Repeats und/oder von Transkripten (RNA oder mRNA) in Blut oder aus Blutzellen von Genen nach Tabelle 1 bis 5 in beliebiger Kombination in Lösung oder immobilisiert auf Oberflächen oder Partikeln oder Beads und die Verwendung der gebundenen Transkripte dieser Gene zur Normalisierung durch Vergleich der gebundenen Mengen (Expressionswerte) der Nukleinsäuren mit einer oder mehreren an Sonden gebundenen Markernukleinsäuren und zur Quantifizierung in Bezug zur gebundenen Markernukleinsäure verwendet werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur ex vivo, in vitro Unterscheidung lokaler und systemischer Infektion basierend durch In-Bezug-Setzen der RNA-Mengen aus Kontrollgen und Markergen, folgende Schritte umfasst:
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6 als Ein- oder
Ausschlusskriterium von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion in klinische Studien der Phasen 2-4.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Markergen -RNA vor dem Messen der Markergen-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfasst, ggf. weiter transformiert und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass RNA der Markergene oder Teile davon über Sequenzierung oder teilweise Sequenzierung beispielsweise über Pyrosequenzierung identifiziert und quantifiziert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als Markergen-RNA mRNA oder microRNA verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die DNA zur spezifischen Bindung der Markergen-RNA oder deren in vitro Transkripte an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biologischen Probe um die eines Menschen handelt.
Diese Sequenzen mit der Sequenz-ID No. 1 bis zur Sequenz-ID No. 69 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfasst und sind dem angefügten 69 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen offenbart. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten oder freien Sonden abgeleitetet von Sequenzen entsprechend Tabelle 1 bis 5 markiert werden. Für diese Ausführungsform finden z.B. selbstkomplementäre Oligonukleotide, sogenannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so dass sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.
Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA- Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptidonukleinsäuren, PNA) so wie Aptamere verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Ermittlung von Messdaten der differentiellen Genexpression aus Vollblut, zur Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion. Hierzu wird die RNA der Markergene aus dem Vollblut von entsprechenden Patienten isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit 32P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle und/oder Detektionssignale eingesetzt werden. Entsprechende Moleküle und/oder Markierungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
1. Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten DNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten DNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion dar.
2. Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch im Stand der Technik wohl bekannte, geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen den Markergenen der Patientenprobe und den Kontrollgenen bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich, wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf die Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion ziehen.
3. Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitende Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, dass Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden, und/oder für die Bestimmung des Ansprechens auf eine spezialisierte Therapie und/oder auf die Festlegung des Therapieendes im Sinne eines „drug monitoring" bei Patienten mit nachgewiesener systemischer Infektion und deren Schweregrade. Hierzu_wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Test-RNA und Kontroll-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen markiert und mit ausgewählten Markergenen sowie Kontrollgenen, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den Expressionsverhältnissen zwischen einzelnen oder mehreren Kontrollgenen und Markergenen lässt sich somit beurteilen, welche Wahrscheinlichkeit besteht, dass Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden und/oder ob die begonnene Therapie wirksam ist und/oder wie lange die Patienten noch entsprechend therapiert werden müssen und/oder ob der maximale Therapieeffekt mit der verwendeten Dosis und Dauer schon erreicht worden ist.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung der RNA der erfindungsgemäßen Gene zur Gewinnung von quantitativen Informationen durch hybridisierungsunabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische oder chemische Hydrolyse, Surface Plasmon Resonanz- Verfahren (SPR-Verfahren), anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben
4. Die mittels PCR (auch weitere Amplifikationsverfahren wie beispielsweise NASBA) amplifizierten und quantifizierten Transkripte von Kontrollgenen stellen eine weitere Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung zur Normalisierung von Genexpressionsdaten bei der Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion und deren Schweregrade dar. Die Intensitätssignale der amplifizierten Transkripte werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (PCR-Fluoreszenzdetektor) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen den Markergenen der Patientenprobe und den Kontrollgenen bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich, wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion ggf. deren Schweregrade ziehen.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Normalisierung einer ggf. amplifizierten mRNA Menge in mehreren Proben umfassend a) einen Vergleich der Expressionswerte einer oder mehrerer Nukleinsäuren ausgewählt aus SEQ ID 1 bis SEQ-ID 69 über verschiedene Proben; b) Ableitung eines Wertes zur Normalisierung von Expressionswerten einer oder mehrerer Nukleinsäuren ausgewählt aus SEQ ID 1 bis SEQ-ID 69 über mehrere Proben und c) eine Normalisierung der Expression anderer Nukleinsäuren, welche aus mehreren Proben isoliert wurden, basierend auf Schritt b)
Die Erfindung kann ferner einen Kit betreffen, der eine Auswahl von Polynucleotiden mit den Sequenzen gemäß SEQ-ID 1 bis SEQ-ID 69 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 1-100, in bevorzugter Ausführung 1-5 und 1- 10 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Verwendung als Markergene enthält.
Die Erfindung kann ferner auch einen Kit betreffen, der eine Auswahl von Hybridisierungssonden gemäß SEQ-ID No.1, bis SEQ-ID No. 69 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 50 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe enthält, für die Verwendung als Markergene.
Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in einer Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten:
a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe;
b) In-Kontakt-Bringen und Vervielfältigung der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 mit synthetischen markierten oder unmarkierten Oligonukleotidprimern unter
Amplifikationsbedingungen, wobei die Länge des vervielfältigten Abschnittes 50 bis 3000 Nukleotide umfasst und die Marker diejenigen Genprodukte darstellen, welche in unterschiedlicher Menge in Patienten mit lokaler und systemischer Infektion vorliegen;
c) Erfassen des Verlaufes der Vervielfältigung durch qualitative, semiquantitative oder quantitative Messung der vervielfältigten Nukleinsäurestränge und Erstellung eines Genaktivitätsdatensatzes durch Vergleich der Amplifikationssignale, welche ein Maß für die amplifizierte Nukleinsäuremenge sind, mit den Amplifikationssignalen einer Menge von Referenz-Nukleinsäuren.
Eine weitere Anwendung der über Microarrayanalyse oder anderen Quantifizierungsmethoden wie z.B. real-time PCR ermittelten Genaktivitäten und Genexpressionsdaten besteht in der Anwendung zur Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion für die elektronische Weiterverarbeitung zum Zweck der Herstellung von Software für Diagnosezwecke (z.B. zur Einschätzung der Schwere einer individuellen Immunantwort insbesondere bei bakterieller Infektion, auch im Rahmen von Patientendatenmanagementsystemen oder Expertensystemen) oder zur Modellierung zellulärer Signalübertragungswege.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Polynucleotide gemäß SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 69, insbesondere Nukleinsäuresonden oder deren Komplementäre zur Bindung der Transkripte oder deren Komplementäre der Markergene verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Markergene bzw. die synthetischen Oligonukleotide, welche die Transkripte der Kontrollgene binden, insbesondere ca. 60 Basenpaare umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 1251, 33P oder 3H verwendet wird. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung, z. B. bei Hybridisierungen, verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Markergen-RNA und Kontrollgen-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate davon dieselbe Markierung tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Markergen-RNA und Kontrollgen-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate unterschiedliche Markierungen tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Sonden auf ein Trägermaterial wie z.B. Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen DNA-Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen DNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen und der Beschreibung dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne jede Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Ein Kit gemäß Anspruch 25 sowie Cluster von Polynucleotiden lösen die Aufgabe ebenfalls.
Ferner dient die vorliegende Erfindung der therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion. Die vorliegende Erfindung kann auch zur Herstellung von „in silico" Expertensystemen und/oder zur „in silico" - Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen verwendet werden.
Zur Erstellung des Genexpressionsprofiles gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrzahl von spezifischen Genen und/oder Genfragmenten verwendet, welche ausgewählt werden aus der Gruppe in Tabellen 1 bis 5 bestehend aus SEQ- ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5- 2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden, zum Ausschalten oder Einschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zur Überwachung lokaler oder systemischer Infektion und Verlauf eine lokalen Infektion zu einer systemischen Infektion eines Patienten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein spezifisches Markergen und/oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 2 bis 69 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die in SEQ-ID No. 1 - SEQ-ID No. 69 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch entsprechende synthetische Analoga, Aptamere sowie Peptidonukleinsäuren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität durch hybridisierungsunabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar.
Für die Zwecke einer vollständigen Offenbarung der vorliegenden Lehre wird festgestellt, dass mit den ursprünglich eingereichten Ansprüchen auch sämtliche und/oder-Kombinationen der Ansprüche für den Fachmann mit offenbart sind.
Die Daten der Patienten können aus den Tabellen 6 bis 8 entnommen werden.
Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus den Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
Fig. 1 eine Heatmap zur Darstellung einer zufälligen Auswahl aus den relevanten Genen für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion.
Ausführunqsbeispiele Mikroarray-Experimentbeschreibung
(Nach der Minimum Information About a Microarray Experiment [MIAME] Checkliste - Neuauflage Januar 2005, basierend auf Brazma et al. 2001) auf welches hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird)
Einlesen der Südes / technische Spezifikationen des Scanners
a) Scanner: GenePix 4000B konfokaler Auflichtfluoreszenz-Scanner (Axon Instruments)
b) Software zum Scannen: GenPix Pro 4.0 bzw. 5.0
c) Scan-Parameter : Laser-Power: Cy3 Kanal - 100%
Cy5 Kanal - 100%
PMT-Spannung: Cy3 Kanal - 700 V Cy5 Kanal - 800 V
d) räumliche Auflösung (pixel space) - 10 μm.
Auslesen und Prozessieren der Daten
Im Rahmen der Experimente wurde RNA aus 59 Blutproben von Patienten hybridisiert. Jedes RNA-Paar (Patient gegen Vergleichs-RNA) wurde auf einem Mikroarray cohybridisiert. Dabei wurde die Patienten-RNA mit einem rot fluoreszierenden und die Vergleichs-RNA mit einem grün fluoreszierenden Farbstoff markiert. Die digitalisierten Bilder des hybridisierten Arrays wurden mit der GenePix Pro 4.0 bzw. 5.0 Software von Axon Instruments ausgewertet. Zur Spot-Detektion, Signalquantifizierung und Bewertung der Spot-Qualität wurde die GenePix™ Analysis Software verwendet. Die Spots wurden entsprechend der Einstellungen in der GenePix™ Software mit 100 = „good", 0 = "found", -50 = "not found", -75 = "absent", -100 = "bad" markiert. Die Rohdaten werden in einer entsprechenden Datei abgelegt.
Normalisierung, Transformation und Datenauswahlverfahren
e) Transformation und Normalisierung der Signaldaten Die Signaldaten wurden unter Verwendung von Box-Cox Potenztransformationen (Box and Cox 1964), Median und MAD (Median der absoluten Abweichungen vom Median) normalisiert.
f) Filtern
Die technischen Replikate (mehrfache Spots derselben Probe) auf dem Mikroarray werden aus den korrigierten und transformierten Signalintensitäten abhängig von ihrer Spot-Qualität herausgefiltert. Für jeden Spot werden die Replikate mit der höchsten Kennzeichnung ausgewählt und die zugehörige Signalintensität gemittelt. Die Expression von Spots mit ausschließlich nicht messbaren Replikaten werden mit „NA" (not available) gekennzeichnet.
Ausführungsbeispiel 1
Identifizierung von Markergenen zur Identifizierung lokaler infektion oder systemischer Infektion aus Blut und aus Blutzellen:
Messung der Genexpression:
Es wurde die Genexpression von 51 ITS-Patienten gemessen. Es handelte sich um 15 Patienten mit einer lokalen und 36 Patienten mit einer systemischen Infektion. In der Analyse wurde pro Patient ein ITS-Tag berücksichtigt (Tabelle 6).
Als Referenzproben dienten die Gesamt-RNA aus Zelllinien SIG-M5.
Alle Patientenproben wurden mit der Referenzprobe jeweils auf einem Microarray co-hybridisiert.
Experimentelle Beschreibung:
Blutabnahme und RNA-Isolation
Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen. Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.
Zellkultivierung
Für die Zellkultivierung (Kontrollproben) wurden 19 Kryozellkulturen (SIGM5) (eingefroren in flüssigem Stickstoff) genutzt. Die Zellen wurden jeweils mit 2 ml Iscove's Medium (Biochrom AG) beimpft ergänzt mit 20% fetalen Kälber Serum (FCS). Die Zellkulturen wurden anschließend für 24 Stunden bei 37° C unter 5% CO2 in 12-well Platten inkubiert. Danach wurde der Inhalt von 12 Wells in 2 Teile mit jeweils dem gleichen Volumen geteilt, so dass schließlich 3 Platten des gleichen Formats (insgesamt 36 Wells) zur Verfügung standen. Die Kultivierung wurde anschließend für 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgeführt. Im Anschluss daran wurden die resultierenden Kulturen von 12 Wells jeder Platte vereint und zentrifugiert (1000 x g, 5 min, Raumtemperatur). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 40 ml des oben genannten Mediums gelöst. Diese 40 ml gelöste Zellen wurden in zwei 250 ml Kolben zu gleichen Teilen aufgeteilt und nach 48 Stunden Inkubation und Zugabe von 5 ml des oben genannten Mediums wiederum inkubiert. Von den restlichen 2 ml der zwei verbleibenden Platten wurden 80 μl in leere Wells der gleichen Platten gegeben, welche bereits vorher mit 1 ml des Mediums präpariert waren. Nach 48 Stunden Inkubation wurde nur eine der 12 WeII- Platten wie folgt prozessiert: Aus jedem Well wurden 500 μl entnommen und vereint. Die daraus resultierenden 6 ml wurden in einen 250 ml Kolben gegeben, welcher ca. 10 ml frisches Medium enthielt. Dieses Gemisch wurde mit 1000 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und in 10 ml des oben genannten Mediums suspendiert. Die anschließende Zellzählung ergab folgendes Ergebnis: 1 ,5 x 107 Zellen pro ml, 10 ml Gesamtvolumen, Gesamtzahl der Zellen: 1 ,5 x 108. Da die Zellzahl noch nicht ausreichend war, wurden 2,5 ml der oben genannten Zellsuspension in 30 ml des oben genannten Mediums in einen 250 ml (75 cm2) Kolben gegeben (insgesamt 4 Kolben). Nach 72 Sunden Inkubationszeit wurden jeweils 20 ml frischen Mediums in die Kolben gegeben. Nach folgender 24-stündiger Inkubation erfolgte die Zellzählung wie oben beschrieben, die eine Gesamtzellzahl von 3,8 x 108 Zellen ergab. Um die gewünschte Zellzahl von 2 x 106 Zellen zu erreichen, wurden die Zellen in 47,5 ml des oben genannten Mediums in 4 Kolben resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zellen zentrifugiert und zweimal mit Phosphatpuffer ohne Ca2+ und Mg2+ (Biochrom AG) gewaschen.
Die Isolation der Gesamt-RNA erfolgt mittels des NucleoSpin RNA L Kits (Machery&Nagel) entsprechend den Angaben des Herstellers. Die oben beschriebene Prozedur wurde wiederholt bis die erforderliche Zellzahl erreicht wurde. Dies war erforderlich, um die erforderliche Menge von 6 mg Gesamt-RNA zu erreichen, was etwa einer Effizienz von 600 μg RNA pro 108 Zellen entspricht.
Reverse Transkription / Markierung / Hybridisierung Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Verwendung des PAXGene Blood RNA Kits (PreAnalytiX) gemäß den Vorgaben des Herstellers isoliert und auf ihre Qualität geprüft. Von jeder Probe wurden 10 μg Gesamt-RNA aliquotiert und zusammen mit 10 μg Gesamt-RNA aus SIGM5-Zellen als Referenz-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript Il (Invitrogen) umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Im Reaktionsansatz wurde ein Teil des dTTP durch Aminoallyl-dUTP (AA-dUTP) ersetzt, um später die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an die cDNA zu ermöglichen.
Nach der Aufreinigung des Reaktionsansatzes wurden die cDNA der Proben und Kontrollen mit den Fluoreszenzfarbstoffen Alexa 647 und Alexa 555 kovalent markiert und auf einem Microarray der Firma SIRS-Lab hybridisiert. Auf dem verwendeten Microarray befinden sich 5308 immobilisierte Polynukleotide mit einer Länge von 55 - 70 Basenpaaren, die jeweils ein humanes Gen repräsentieren und Kontrollspots zur Qualitätssicherung. Ein beispielhafter Microarray unterteilt sich in 28 Subarrays mit einem Raster von 15x15 Spots.
Die Hybridisierung und das anschließende Waschen bzw. Trocknen wurde in der Hybridisierungsstation HS 400 (Tecan) nach Angaben des Herstellers über 10,5 Stunden bei 42 0C durchgeführt. Die verwendete Hybridisierungslösung besteht aus den jeweiligen gelabelten cDNA-Proben, 3,5x SSC (1x SSC enthält 150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natriumeitrat), 0,3% Natriumdodecylsulfat (V/V) 25% Formamid (VΛ/) und je 0,8 μg μl-1 cot-1 DNA, Hefe t-RNA und poly-A RNA. Das anschließende Waschen der Mikroarrays wurde mit nachfolgendem Programm bei Raumtemperatur durchgeführt: je 90 Sekunden spülen mit Waschpuffer 1 (2x SSC, 0,03% Natriumdodecylsulfat), mit Waschpuffer 2 (1x SSC) und abschließend mit Waschpuffer 3 (0,2x SSC). Danach wurden die Mikroarrays unter einem Stickstoffstrom mit einem Druck von 2,5 bar bei 30 0C über 150 Sekunden getrocknet.
Nach der Hybridisierung wurden die Hybridisierungssignale der Microarrays mit einem GenePix 4000B Scanner (Axon) ausgelesen und die Expressionsverhältnisse der differenziert exprimierten Gene mit der Software GenePix Pro 4.0 bzw. 5.0 (Axon) bestimmt.
Auswertung:
Für die Auswertung wurde die mittlere Intensität eines Spots als der Medianwert der zugehörigen Spotpixel bestimmt.
Normalisierung:
Für die weiteren Analysen wurden nur die roten Signalintensitäten verwendet. Jedes Array wurde einzeln unter Verwendung von Box-Cox Potenztransformationen (Box and Cox 1964, Median und MAD (Median der absoluten Abweichungen vom Median) normalisiert.
Auswahl der Klassifikator Genproben:
Die Auswahl der Klassifikator Genproben erfolgte unter Verwendung eines sogenannten Filters. Zuerst wurden die 1000 Genproben mit dem größten Variationskoeffizienten bestimmt. Anschließend wurden die beiden Gruppen (lokale bzw. systemische Infektion) auf der Basis dieser 1000 Genproben unter Verwendung des Mann-Whitney Tests miteinander verglichen. Die Genproben mit einem p-Wert <= 0.001 wurden mittels des Hodges-Lehmann Schätzers angeordnet und diejenigen Gensonden, die den größten Schätzwert (Absolutbetrag) aufwiesen, für die Klassifikation verwendet.
Klassifikation:
Zur Klassifikation wurde die Methode der k nächsten Nachbarn mit k = 3 verwendet. Der Klassifikationsfehler wurde mittels 100 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung geschätzt. Optimale Anzahl von Genproben:
Das Minimum des mittels Kreuzvalidierung geschätzten Klassifikationsfehlers wurde für 69 Genproben erzielt. Die Festlegung auf die in Tabelle 1-5 angegebenen 69 Genproben erfolgte unter Verwendung der Bootstrap-Methode. So wurde die Auswahl der besten 69 Genproben mittels Bootstrap-Stichproben 5000-mal wiederholt und anschließend die Genproben nach der Häufigkeit ihrer Auswahl sortiert.
Klassifikationsfehler:
Der mittels 100 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung geschätzte Klassifikationsfehler für die in Tabelle 1-5 angegebenen 69 Genproben liegt insgesamt bei 15,7 %. In der Gruppe der Patienten mit lokaler Infektion beträgt der Fehler 26,7 %, in der Gruppe der Patienten mit systemischer Infektion 11 ,1 %. Die Patienten mit systemischer Infektion werden also mit einer Sicherheit von annähernd 90 % erkannt.
Ausführungsbeispiel 2
Validierung der Klassifikatorgene anhand eines Patienten Verlaufs von systemischer zu lokaler Infektion.
Messung der Genexpression:
Es wurde die Genexpression von einem zufällig ausgewählten ITS-Patienten, dessen Infektion sich von systemisch nach lokal verändert, gemessen. In der Analyse wurden 8 aufeinanderfolgende ITS-Tage des Patienten berücksichtigt.
Als Referenzproben dienten die Gesamt-RNA aus Zelllinien SIG-M5.
Alle Patientenproben wurden mit der Referenzprobe jeweils auf einem Microarray Co-hybridisiert (Tabelle 7, 8)
Normalisierung:
Für die weiteren Analysen wurden nur die roten Signalintensitäten verwendet. Jedes Array wurde einzeln unter Verwendung von Box-Cox Potenztransformationen, Median und MAD (Median der absoluten Abweichungen vom Median) normalisiert. Auswahl der Klassifikator Genproben:
Für die Klassifikation der Patiententage wurde ein Subset von 31 Gensonden verwendet, welches sich wie folgt zusammensetzt:
Seq-ID: 5, 6, 9, 10-14, 17, 18, 23-26, 31 , 37, 38, 40, 43, 45-48, 51 , 53, 55-57, 62, 66, 67.
Klassifikation:
Die Klassifikation wurde mittels der Methode der k nächsten Nachbarn mit k = 3 durchgeführt. Als Trainingsdatensatz wurden die in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Patienten verwendet.
Klassifikationsfehler:
Es wurden alle Patiententage (Tag 1-6: systemische Infektion, Tag 7,8: lokale Infektion) richtig klassifiziert.
Im Folgenden sind alternative Ausführungsformen der Erfindung angegeben, welche die Aufgabe ebenfalls lösen können:
Alternativen
A.) Verwendung wenigstens eines Polynukleotides mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ- ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei wenigstens eine der Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 verwendet wird.
B.) Verwendung nach A, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays und/oder enzymatischen Verfahren, insbesondere Amplifikations- verfahren, bevorzugt PCR, vorzugsweise real-time PCR, erstellt werden.
C.)Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten:
a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b) Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder Sonden-Nukleinsäuren mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden-Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden- Nukleinsäure wenigstens ein Polynukleotid gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfasst oder wenigstens ein solches Polynukleotid mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfasst; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden- Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d) Erfassen, insbesondere quantitatives Erfassen, der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden- Nukleinsäuren; e) Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
D.) Verwendung der Genaktivitätsdaten nach C, für die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung einer Infektion von einer lokalen Infektion zu einer systemischen Infektion oder einer systemischen Infektion zu einer lokalen Infektion und/oder für die Ermittlung einer geeigneten Therapie.
E.) Verwendung nach C oder D, für die Klassifizierung von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion.
F.) Verwendung nach C bis E, wobei die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynukleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 69 zu Genaktivitätsclustem zusammengefasst werden. G.) Verwendung nach C bis D als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion in klinische Studien der Phasen 2-4.
H.) Verwendung nach C bis G zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung.
I.) Verwendung nach C bis H, wobei die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose und/oder Krankheitsverlauf eines Patienten, als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsysteme eingesetzt werden.
J.) Verwendung nach C bis I, wobei die in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zellulären Signalübertragungswegen eingesetzt werden.
K.) Verwendung nach C bis J, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 aufweisen.
L.) Verwendung nach K, wobei die Genfragmente insbesondere 5 - 1000, bevorzugt 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide, umfassen.
M.)Verwendung nach C bis L, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben- Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
N.) Verwendung nach C bis M, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitätsdaten ein Genexpressionsprofil bilden.
O. ) Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten: a. Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe;
b. In-Kontakt-Bringen und Vervielfältigung wenigstens einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 mit synthetischen markierten oder unmarkierten Oligonukleotidprimern unter Amplifikationsbedingungen, wobei die Länge des vervielfältigten Abschnittes 50 bis 2000 Nukleotide umfasst und die Marker diejenigen Genprodukte darstellen, welche in unterschiedlicher Menge in Patienten mit lokaler und systemischer Infektion vorliegen;
c. Erfassen des Verlaufes der Vervielfältigung durch qualitative, semiquantitative oder quantitative Messung der vervielfältigten Nukleinsäurestränge und Erstellung eines Genaktivitätsdatensatzes durch Vergleich der Amplifikationssignale, welche ein Maß für die amplifizierte Nukleinsäuremenge sind, mit den Amplifikationssignalen einer Menge von Referenz-Nukleinsäuren.
P.) Verwendung nach O, dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsansatz weitere Bestandteile, insbesondere Desoxynukleotide, Polymerasen, Salze, Puffer und sich an Nukleinsäuren anlagernde Fluoreszenzfarbstoffe, enthält.
Q.) Verfahren zur in vitro Messung von Genaktivitäten für eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a. Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe;
b. Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder wenigstens einer Sonden- Nukleinsäure mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden- Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci und/oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden-Nukleinsäure wenigstens ein Polynukleotid gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 oder ein solches Polynukleotid mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfasst;
c. In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden- Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen;
d. quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben- Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren;
e. Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
R.) Verfahren nach Q, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 5 bis 1000, bevorzugt 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen.
S.) Verfahren nach Q bis R, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotide gemäß Seq-ID No 1 bis SEQ-ID No 69 und/oder davon abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch: synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren.
T.) Verfahren nach S, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 20-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
U.) Verfahren nach Q bis T, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
V.) Verfahren nach Q bis U, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt wird aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
W.) Verfahren nach Q bis V, dadurch gekennzeichnet, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen. X.) Verfahren nach Q bis W, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben- Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
Y.) Kit, enthaltend wenigstens eine der Polynukleotidsequenzen SEQ-ID No. 1 - SEQ-ID No. 69 und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür oder die spezifisch für die Feststellung des Zustands einer Infektion (lokal oder systemisch) eines Patienten sind, und/oder Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 zur Bestimmung von Genaktivitäten in vitro in einer Patientenprobe, und/oder für die Feststellung des Verlaufs einer Infektion eines Patienten von lokal zu systemisch oder von systemisch zu lokal .
Z.) Kit nach Y, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotidsequenzen auch Genloci, mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, microRNA, siRNA, dsRNA , ncRNA oder transposable Elemente umfassen.
LITERATURVERZEICHNIS
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In Fig. 1 ist eine sogenannte Heatmap für die Darstellung einer zufälligen Auswahl aus den relevanten Genen für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion wiedergegeben.
Dargestellt sind in der Fig. 1 in den Zeilen die normalisierten und am Mittelwert (d.h., für jedes Gen wird der Mittelwert über alle Patienten ermittelt) zentrierten Expressionsdaten der einzelnen Transkripte. Die Spalten stehen für die verschiedenen Patienten. Hell-grau/weiß steht für Expression höher als der Mittelwert und dunkel-grau/schwarz für Expression niedriger als der Mittelwert.
Der hell-graue Balken oberhalb der Heatmap steht für die Patienten mit lokaler Infektion, der dunkel-graue Balken für die Patienten mit systemischer Infektion. Für die Zeilen (Transkripte) wurde zudem ein hierarchisches Clustering durchgeführt unter der Verwendung der dem Fachmann bekannten Methode "complete", wobei als Abstand der Korrelationsabstand nach Pearson verwendet wurde. Anhand des Dendrogramms auf der linken Seite erkennt man, dass die Transkripte im Wesentlichen in 4 Cluster eingeteilt werden können.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung von Polynukleotiden mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei sämtliche Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 verwendet werden.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays und/oder enzymatischen Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt PCR, vorzugsweise real-time PCR, erstellt werden.
3. Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten:
a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b) Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder Sonden-Nukleinsäuren mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden-Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden- Nukleinsäuren sämtliche Polynukleotide gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ- ID Nr. 69 umfassen oder solche Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfassen; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden- Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren; e) Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
4. Verwendung der Genaktivitätsdaten nach Anspruch 3, für die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung einer Infektion von einer lokalen Infektion zu einer systemischen Infektion oder einer systemischen Infektion zu einer lokalen Infektion und/oder für die Ermittlung einer geeigneten Therapie.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, für die Klassifizierung von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynukleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 69 zu Genaktivitätsclustern zusammengefasst werden.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6 als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion in klinische Studien der Phasen 2-4.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7 zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose und/oder Krankheitsverlauf eines Patienten, als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangement- systeme, eingesetzt werden.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei die in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zellulären Signalübertragungswegen eingesetzt werden.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 aufweisen.
12. Verwendung nach Anspruch 11 , wobei die Genfragmente insbesondere 5 - 1000, bevorzugt 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide, umfassen.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitätsdaten ein Genexpressionsprofil bilden.
15. Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten:
a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe;
b) In-Kontakt-Bringen und Vervielfältigung der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 mit synthetischen markierten oder unmarkierten Oligonukleotidprimern unter Amplifikationsbedingungen, wobei die Länge des vervielfältigten Abschnittes 50 bis 2000 Nukleotide umfaßt und die Marker diejenigen Genprodukte darstellen, welche in unterschiedlicher Menge in Patienten mit lokaler und systemischer Infektion vorliegen;
c) Erfassen des Verlaufes der Vervielfältigung durch qualitative, semiquantitative oder quantitative Messung der vervielfältigten Nukleinsäurestränge und Erstellung eines Genaktivitätsdatensatzes durch Vergleich der Amplifikationssignale, welche ein Maß für die amplifizierte Nukleinsäuremenge sind mit den Amplifikationssignalen einer Menge von Referenz-Nukleinsäuren.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsansatz weitere Bestandteile, insbesondere Deoxynukleotide, Polymerasen, Salze, Puffer und sich an Nukleinsäuren anlagernde Fluoreszenzfarbstoffe, enthalten.
17. Verfahren zur in vitro Messung von Genaktivitäten für eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe;
b) Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder Sonden- Nukleinsäuren mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden- Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden-Nukleinsäuren sämtliche Polynukleotide gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfassen oder solche Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfassen;
c) In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden- Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren;
e) Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 5 bis 1000, bevorzugt 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotide gemäß Seq-ID No 1 bis SEQ-ID No 69 und/oder davon abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch: synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren.
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 20-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
25. Kit, enthaltend die Polynukleotidsequenzen SEQ-ID No. 1 - SEQ-ID No. 69 und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür oder die spezifisch für die Feststellung des Zustande einer Infektion (lokal oder systemisch) eines Patienten sind, und/oder Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 zur Bestimmung von Genaktivitäten in vitro in einer Patientenprobe, und/oder für die Feststellung des Verlaufs einer Infektion eines Patienten von lokal zu systemisch oder von systemisch zu lokal .
26. Kit nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotidsequenzen auch Genloci, mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA , ncRNA oder transposable Elemente umfassen.
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