EP1516187A2 - Hts-f higes verfahren und testsystem zur ermittlung der wech selwirkung zwischen c-reaktivem protein und an c-reaktives protein bindenden komponenten - Google Patents

Hts-f higes verfahren und testsystem zur ermittlung der wech selwirkung zwischen c-reaktivem protein und an c-reaktives protein bindenden komponenten

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EP1516187A2
EP1516187A2 EP03759923A EP03759923A EP1516187A2 EP 1516187 A2 EP1516187 A2 EP 1516187A2 EP 03759923 A EP03759923 A EP 03759923A EP 03759923 A EP03759923 A EP 03759923A EP 1516187 A2 EP1516187 A2 EP 1516187A2
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EP
European Patent Office
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group
component
components
donor
compound
Prior art date
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Withdrawn
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EP03759923A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Aimo Kannt
Antje Pommereau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a HTS-capable method and test system for determining the interaction between C-reactive protein (CRP) or C1q and components binding to CRP or C1 q, for determining the concentration of a solution containing CRP or C1q and for determining of substances that influence the interaction of CRP or C1 q and components that bind to it.
  • CRP C-reactive protein
  • CRP C-reactive protein
  • PCh phosphocholine
  • the complement is part of the immune system and mainly involved in the antibody-mediated immune system.
  • the three physiological functions of the complement are the defense against bacterial infections, the connection of innate and acquired immunity and the elimination of immune complexes and apoptical cells.
  • the classic complement cascade leads to the lysis of bacterial cells and begins with the association of C1q with an antibody binding to the cell surface or CRP bound to PCh.
  • C-reactive protein is used as a marker and also as a predictor of coronary artery disease, the leading cause of death in industrialized countries (Rifai and Ridker (2001), Clinical Chemistry 47, 403-411). Based on new studies (Jialal et al (2001), Circulation 103, 1933-1935) it is believed that lowering the CRPr level or blocking the CRP-mediated effector functions, for example complement activation by binding to C1q, is useful for prevention and treatment which can be coronary artery disease.
  • the object is achieved by a method for determining a binding event of two components which bind directly or via one or more components to CRP or C1 q, comprising the following steps: (a) presentation of a CRP or C1q-containing solution, (b) Addition of at least one donor component or a group of
  • Component which comprises at least one compound or group of compounds which can receive the signal emitted by the compound or group of compounds according to (b) and emit it in the form of electromagnetic radiation (acceptor group), and wherein the acceptor component is capable of this to bind directly or via one or more components from the group of components mentioned to CRP or C1q,
  • the electromagnetic radiation emitted by the at least one compound or group of compounds according to (c) is preferably fluorescence radiation.
  • the light source according to (d) can be, for example, a laser or a lamp, for example a helium or halogen lamp.
  • the detection of the electromagnetic radiation according to (e) can take place, for example, with the aid of a photomultiplier.
  • the components to be used according to the invention are or preferably comprise polypeptides.
  • at least one of the components is an antibody.
  • the antibody can be a monoclonal or polyclonal antibody.
  • a group of components are preferably able to bind spatially in succession to CRP or C1 q or to one another.
  • the binding takes place in the form of a binding cascade, such as is achieved, for example, by the sequential binding of antibodies (primary antibodies, secondary antibodies, etc.).
  • the components which bind directly to CRP or C1 q according to (b) and (c) are preferably components which each bind to a specific binding region or to a specific epitope of CRP or C1 q, the component bound to CRP or C1q according to (b) binds to a different binding site than the component binding to CRP or C1q according to (c).
  • one of the components binding directly to CRP or C1q is a naturally occurring binding partner of CRP or C1q.
  • this is particularly preferably C1 q and vice versa.
  • the donor or acceptor component is bound directly to CRP or C1 q, then in this case it is accordingly either the donor or the acceptor component that is C1 q or CRP, comprising a donor or
  • a group of components that can form a binding cascade, it is C1q or CRP correspondingly around the first component binding to CRP or C1q, via which either the donor or the acceptor component can be bound to CRP or C1q.
  • the other components of the group of components are particularly preferably antibody molecules.
  • either the donor or acceptor component itself preferably comprises C1 q or the donor or acceptor component is bound to CRP via C1 q.
  • the donor or acceptor component can then comprise an anti-C1 q antibody or a secondary antibody attached to the anti-C1 q
  • the respective other component then comprises an anti-CRP antibody or an antibody which can bind to the anti-CRP antibody or a tertiary antibody directed against the latter.
  • the at least one compound or group of compounds according to (b) (donor group) and / or according to (c) (acceptor group) are localized on particles, the average diameter of the particles preferably being between 150 and 250 nm, particularly preferably at is about 200 nm. The particles are then removed from the donor or
  • the particles can be made of a polymeric material.
  • the method according to the invention is an HTS (high throughput screening) -capable method which can be carried out homogeneously in the form of a one-step method.
  • the method according to the invention is carried out according to the “mix and measure” principle, which leads to considerable time savings and greater accuracy of the measured values.
  • the method according to the invention allows the measurement of the binding of CRP to C1q, and thus the identification of substances that influence this binding, and the measurement of the concentration of CRP or C1q in complex media in less than 10 percent of the time using the previously described , inhomogeneous methods had to be used.
  • a special characteristic of the new process is that the binding between the two proteins can be followed in solution, since none of the reactants has to be immobilized on a solid phase.
  • the measurement can also be carried out directly with the proteins obtained from biological sources, without having to modify CRP or C1q, for example by binding a fluorophore.
  • a particular advantage of the method is therefore that the protein can be subjected to the test in its native state and the risk of denaturation, which would exist if the protein was immobilized and / or modified, is eliminated.
  • sample volume of the method according to the invention is considerably reduced compared to conventional methods. In this way, volumes of less than 10 ⁇ l can be used, which minimizes the material expenditure. Highly dilute solutions can also be used
  • Concentrations of CRP or C1q of less than 1 nM, even less than 100 pM can be used. It is also a very sensitive process. Furthermore, because of the foregoing, it is the first method that enables high-throughput screening for substances that influence complement activation by binding CRP to C1q.
  • the signal transmission from the at least one compound or group of compounds according to (a) (donor group) to the at least one compound or group of compounds according to (b) (acceptor group) takes place by singlet oxygen.
  • the donor group preferably comprises a compound which can convert triplet oxygen into singlet oxygen after excitation by a laser
  • the acceptor group comprises at least a first compound which can be excited by singlet oxygen and a second compound which is that of the can absorb energy absorbed by singlet oxygen excitable group without emissions and emit it in the form of fluorescent radiation.
  • the singlet oxygen formed can diffuse from the donor group to the acceptor group and react with the chemiluminescent substances located there.
  • the energy released in the process is transferred to the fluorophores, which ultimately emit the energy in the form of fluorescent radiation, which can be detected with a photomultiplier.
  • the prerequisite for a detectable signal is the spatial proximity of donor and acceptor beads, since the singlet oxygen is unstable and decays in aqueous solution.
  • the binding components to be used in this process are therefore chosen such that when the binding event occurs, the distance between the donor and acceptor groups is preferably less than 200 nm, since at a greater distance effective energy transfer by means of singlet oxygen, due to the disintegration time of the singlet Oxygen, is not possible.
  • the donor group and acceptor group are particularly preferably located on particles, the particles preferably having an average diameter of between 150 and 250 nm, particularly preferably of about 200 nm.
  • the particles are preferably used in such a way that there is a final concentration of particles bearing donor groups of 1-40 ⁇ g / ml and a final concentration of particles bearing acceptor groups of 1-80 ⁇ g / ml.
  • the binding capacity of the particles can be, for example, about 0.1 nM to 1 nM per ⁇ g / ml particle.
  • Alpha screen beads from Perkin-Elmer Life Sciences are particularly preferably used as particles for the method.
  • the donor group is excited by irradiation with a laser at a wavelength of 680 nm and the radiation emitted by the acceptor group can be detected at a wavelength between 520 and 600 nm.
  • the process can then be carried out accordingly in such a way that donor and acceptor beads which carry donor and acceptor groups are introduced.
  • Donor and acceptor beads are now bound to components that are able to bind to CRP or C1q either themselves or via additional components.
  • these components can either be C1q or CRP or an anti-CRP or anti-C1 q antibody or an anti-CRP or anti-C1 q antibody Act secondary antibodies.
  • the signal transmission from the at least one compound or group of compounds according to (b) (donor group) to the at least one compound or group of compounds according to (b) (acceptor group) takes place by emission-free energy transfer, particularly preferably by fluorescence resonance energy transfer.
  • the method can be carried out, for example, such that the at least one compound or group of compounds according to (a) (donor group) is one
  • Europium salt-containing compound and the at least one compound or group of compounds according to (b) (acceptor group) comprises allophycocyanin (Grepin et al. (2000), Drug Discovery Today 5, 212).
  • the donor and acceptor groups can be dyes that are suitable for emission-free energy transfer.
  • all compounds known to the person skilled in the art can be used which are suitable for emission-free energy transfer, in particular for fluorescence resonance energy transfer (see, for example, Pope et al. (1999), Drug Discovery Today 4, 350).
  • the binding components to be used are preferably chosen so that the distance between the donor and Acceptor groups after binding is less than 10 nm, since effective emission-free energy transfer is not possible at a greater distance.
  • the method according to the invention is used to determine the concentration of a CRP or C1 q-containing solution of unknown CRP or C1 q content, this solution preferably being blood plasma or blood serum or by means of a suitable physiological Buffer or blood plasma or blood serum diluted with water.
  • This method can be used, for example, for diagnostic purposes, in particular to determine the inflammatory state of an organism and / or to determine the risk of a heart attack and / or a stroke.
  • the present invention therefore also relates to an HTS-capable diagnostic test system for determining a binding event between CRP or C1q and a component binding to CRP or C1q, comprising the following components:
  • the HTS-capable test system preferably comprises the following additional components:
  • test substance added at least one test substance to observe whether this has an influence on the binding event.
  • substances can be determined which have a modulating, inhibiting or activating effect on the interaction between CRP or C1 q and a binder, in particular on the interaction between CRP and C1q.
  • a library of test substances is preferably screened in the HTS method in order to determine a substance with the desired properties.
  • the present invention therefore also relates to an HTS-capable device
  • Test system for determining active substances that have a modulating effect on the interaction between CRP or C1 q and a component that binds to CRP or C1q, comprising the following components:
  • the donor component being a component which comprises at least one compound or group of compounds which, after excitation by a light source, can emit a signal ( Donor group), and wherein the donor component is able to bind directly or via one or more components from the group of components mentioned to CRP or C1q,
  • the Acceptor component is a component which comprises at least one compound or group of compounds which can receive the signal emitted by the compound or group of compounds according to (b) and emit it in the form of electromagnetic radiation, and which the acceptor component is capable of to bind directly or via one or more components from the group of components mentioned to CRP or C1q,
  • This HTS-capable test system preferably comprises the following additional components:
  • HTS-capable test systems are preferably used here to carry out the previously described methods according to the invention.
  • Special embodiments of the components and components of the test systems therefore correspond to the aforementioned special embodiments which are used in the methods according to the invention.
  • an anti-C1 q antibody was used as the donor component, the donor group being located on particles which are bound to the anti-C1 q antibody.
  • the donor component can bind to the CRP via C1 q.
  • the acceptor component is an anti-rabbit secondary antibody, the acceptor group being located on particles which are bound to the anti-rabbit secondary antibody.
  • the acceptor component can bind to the CRP via an anti-CRP antibody from rabbits.
  • Exemplary embodiment binding assay for determining the binding of CRP to C1 q
  • the Alphascreen Detection Kit from Packard Bioscience was used to carry out the experiment. This includes donor and acceptor beads, the donor beads comprising compounds which, after excitation at a defined one
  • Wavelength can convert triplet oxygen to singlet oxygen
  • the acceptor leads include compounds that can be excited by singlet oxygen, as well as compounds that take energy from the excited compounds in the form of an emission-free energy transfer and can then emit in the form of fluorescent radiation
  • the compounds mentioned are each embedded in a hydrogel matrix.
  • the beads used had already been pre-coated by the manufacturer, namely the donor beads with streptavidin and the acceptor beads with anti-rabbit antibody.
  • the following reaction buffer was used in the alpha screen system: 20 mM Tris-HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 , 1 mM phosphorylcholine, 0.1% BSA.
  • Tris-NaCl buffer 3.15 g of Tris-HCl and 8.77 g of NaCl were dissolved in H 2 0, a pH of 7.2 was set using 1 M NaOH and then made up to 1 l with H 2 0.
  • the buffer is kept at room temperature.
  • the reaction buffer was prepared by adding 36.7 mg CaCl 2 , 12.9 mg phosphorylcholine and 50 mg BSA to 50 ml Tris-NaCl buffer.
  • the anti-C1q antibody In order to allow the anti-C1q antibody to bind to the streptavidin-coated donor bead, it first had to be biotinylated. For this purpose, 100 ⁇ l of anti-C1 q polyclonal serum were dialyzed twice against 200 ml of PBS for one hour at room temperature. After adding 20 ⁇ l of 1.5 mM sulfo-NHS solution (in Milli-Q water), the solution was left to stand at room temperature for 30 minutes and then dialyzed again against PBS twice in order to remove excess biotinylation reagent.
  • the negative controls do not give a positive result, while a strong signal can be seen when a solution containing C1 q and CRP is combined.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen C-reaktivem Protein (CRP) bzw. C1q und an CRP bzw. C1q bindenden Komponenten, zur Konzentrationsbestimmung einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung sowie zur Ermittlung von Substanzen, die die Interaktion von CRP bzw. Clq und an dieses bindende Komponenten, insbesondere die Wechselwirkung zwischen CRP und C1q, beeinflussen.

Description

Beschreibung
HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen C-reaktivem Protein und an C-reaktives Protein bindenden Komponenten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen C-reaktivem Protein (CRP) bzw. C1q und an CRP bzw. C1 q bindenden Komponenten, zur Konzentrationsbestimmung einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung sowie zur Ermittlung von Substanzen, die die Interaktion von CRP bzw. C1 q und an dieses bindende Komponenten beeinflussen.
Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein akute-Phase-Plasmaprotein, dessen Konzentration im Serum nach einer Infektion oder Gewebsverletzung schnell und in hohem Maße ansteigt (Volanakis (2001), Molecular Immunology 38, 189-197). In Gegenwart von Ca2+-lonen bindet CRP an Phosphocholin (PCh). Letzteres ist weit verbreitet in Polysacchariden pathogener Organismen und in Zellmembranen beschädigter und nekrotischer Zellen. An PCh gebundenes CRP kann durch Bindung an das Protein C1q die klassische Komplementkaskade aktivieren.
Das Komplement ist Teil des Immunsystems und hauptsächlich an der Antikörpervermittelten Immunabwehr beteiligt. Die drei physiologischen Funktionen des Komplements sind die Abwehr bakterieller Infektionen, die Verbindung von angeborener und erworbener Immunität und die Beseitigung von Immunkomplexen und apoptischen Zellen. Es werden die klassische, die alternative und die Mannose- • Lectin-Komplementkaskade unterschieden (Walport (2001), N Engl J Med 344, 1058- 1066). Die klassische Komplementkaskade führt zur Lyse bakterieller Zellen und beginnt mit der Assoziation von C1q an einen an die Zelloberfläche bindenden Antikörper oder an PCh gebundenes CRP.
C-reaktives Protein wird als Marker und darüber hinaus als Prädikator für die koronare Herzkrankheit, der häufigsten Todesursache in Industrieländern, verwendet (Rifai und Ridker (2001), Clinical Chemistry 47, 403-411). Aufgrund neuer Untersuchungen (Jialal et al (2001), Circulation 103, 1933-1935) wird angenommen, daß eine Senkung des CRPrSpiegels oder eine Blockierung der CRP- vermittelten Effektorfunktionen, beispielsweise der Komplementaktivierung durch Bindung an C1q, von Nutzen für die Vermeidung und Behandlung der koronaren Herzkrankheit sein kann.
Es ist daher wünschenswert, zum einen ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es erlaubt, die Konzentration von CRP und/oder C1q in Blutplasma auf einfache Weise zu bestimmen und das es desweiteren erlaubt, Substanzen zu identifizieren, die modulatorisch - aktivierend oder inhibierend - auf die Wechselwirkung von CRP und/oder C1 q mit anderen Komponenten, insbesondere auf die Wechselwirkung zwischen CRP und C1q, einwirken.
Verfahren zur Bestimmung der Bindung von CRP an C1q wurden beispielsweise von Jiang et al. (1991), J. Immunol. 146, 2324-2330. und Agrawal et al. (2001), J. Immunol. 166, 3998-4004 beschrieben. In beiden Publikationen kommt hierbei ein ELISA- Verfahren zum Einsatz. Es handelt es sich hierbei um sehr zeit- und materialaufwendige, mehrstufige inhomogene Verfahren. So muß zur Durchführung des Verfahrens stets einer der Reaktanten zunächst an einer festen Phase immobilisiert werden. Zudem sind zahlreiche Waschschritte notwendig.
Lebdue et al. (1998), Ann Clin Biochem 35, 745-753 beschreiben ein Verfahren zum immunonephelometrischen Nachweis von CRP. Hierzu wird die Probe mit Antikörper gegen CRP inkubiert, die mit Polystyrol-Partikel beladen sind. Ein entscheidender Nachteil dieses Verfahrens ist, daß man zur Durchführung ein Nephelometer zur Verfügung haben und eine relativ große Probenmenge einsetzen muß.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es erlaubt, die Konzentration von CRP oder C1q in Blutplasma auf einfache Weise zu bestimmen und das es des weiteren erlaubt, Substanzen zu identifizieren, die modulierend, aktivierend oder inhibierend auf die Wechselwirkung von CRP oder C1q mit anderen Komponenten, insbesondere auf die Wechselwirkung zwischen C1q und CRP, einwirken, wobei sich das Verfahren vorteilhaft gegenüber dem Stand der Technik auszeichnet, indem es sensitiver, kostengünstiger, materialsparender, einfacher und/oder schneller durchführbar ist als die bisher beschriebenen Verfahren.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Ermittlung eines Bindungsereignisses von zwei direkt oder über eine oder mehr Komponenten an CRP bzw. C1 q bindenden Komponenten, folgende Schritte umfassend: (a) Vorlage einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung, (b) Zugabe von mindestens einer Donorkomponente oder einer Gruppe von
Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, zu der CRP- bzw. C1 q- haltigen Lösung, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1 q zu binden,
(c) Zugabe von mindestens einer Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, zu der CRP bzw. C1q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine
Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(d) Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) durch eine Lichtquelle,
(e) Detektion der von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) emittierten elektromagnetischen Strahlung zum Nachweis des Bindungsereignis. Bei der emittierten elektromagnetischen Strahlung gemäß (c) handelt es sich hierbei vorzugsweise um Fluoreszenz-Strahlung. Bei der Lichtquelle gemäß (d) kann es sich beispielsweise um einen Laser oder um eine Lampe, beispielsweise eine Helium- oder Halogenlampe, handeln. Die Detektion der elektromagnetischen Strahlung gemäß (e) kann beispielsweise mit Hilfe eines Photomultipliers erfolgen.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Komponenten sind oder umfassen vorzugsweise Polypeptide. In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen Antikörper. Bei dem Antikörper kann es sich hierbei um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper handeln.
Wird eine Gruppe von Komponenten eingesetzt, so sind diese vorzugsweise dazu in der Lage, räumlich aufeinanderfolgend an CRP bzw. C1 q bzw. aneinander zu binden. Die Bindung erfolgt hierbei in Form einer Bindungskaskade, wie sie beispielsweise durch die aufeinanderfolgende Bindung von Antikörpern (Primär-Antikörper, Sekundär- Antikörper etc.) realisiert wird. Bei den gemäß (b) und gemäß (c) direkt an CRP bzw. C1 q bindenden Komponenten handelt es sich hierbei bevorzugt um Komponenten, die jeweils an eine bestimmte Bindungsregion bzw. an ein bestimmtes Epitop des CRP bzw. C1 q binden, wobei die an CRP bzw. C1q bindende Komponente gemäß (b) an einen andere Bindungsstelle bindet als die an CRP bzw. C1q bindende Komponente gemäß (c).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei einer der direkt an CRP bzw. C1q bindenden Komponente um einen natürlicherweise vorkommenden Bindungspartner des CRP bzw. C1 q. Im Falle des CRP handelt es sich hierbei besonders bevorzugt um C1 q und umgekehrt. Wird die Donor- oder Akzeptorkomponente direkt an CRP bzw. C1 q gebunden, so handelt es sich in diesem Fall ensprechend entweder bei der Donor- oder bei der Akzeptorkomponente um C1 q bzw. CRP, umfassend eine Donor- oder
Akzeptorgruppe. Wird eine Gruppe von Komponenten eingesetzt, die eine Bindungskaskade ausbilden können, so handelt es sich bei C1q oder CRP entsprechend um die erste an CRP bzw. C1q bindende Komponente, über die entweder die Donor- oder die Akzeptorkomponente an CRP bzw. C1q gebunden werden kann. Bei den übrigen Komponenten der Gruppe von Komponenten handelt es sich besonders bevorzugt um Antikörper-Moleküle.
Wird also beispielsweise eine CRP-haltige Lösung vorgelegt, so umfaßt in dieser Ausführungsform dann vorzugsweise entweder die Donor- oder die Akzeptorkomponente selbst C1 q oder die Donor- oder Akzeptorkomponente wird über C1 q an CRP gebunden. Die Donor- oder Akzeptorkomponente kann dann einen Anti- C1 q-Antikörper umfassen oder einen Sekundärantikörper, der an den Anti-C1 q-
Antikörper binden kann. Entsprechend umfaßt dann die jeweils andere Komponente (Akzeptor- oder Donorkomponente) einen Anti-CRP-Antikörper oder einen Antikörper, der an den Anti-CRP-Antikörper binden kann oder einen gegen letzteren gerichteten Tertiärantikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) und/oder gemäß (c) (Akzeptorgruppe) auf Partikeln lokalisiert, wobei der gemittelte Durchmesser der Partikel vorzugsweise zwischen 150 und 250 nm, besonders bevorzugt bei etwa 200 nm liegt. Die Partikel werden dann entsprechend von den Donor- bzw.
Akzeptorkomponenten umfaßt. Die Partikel können hierbei aus einem polymeren Material gefertigt sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein HTS (high throughput screening)-fähiges Verfahren, das homogen in Form eines Ein-Schritt-Verfahrens durchgeführt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren nach dem „mix and measure"-Prinzip durchgeführt, was zu erheblicher Zeitersparnis und höherer Genauigkeit der Meßwerte führt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Messung der Bindung von CRP an C1q, und damit die Identifizierung von Substanzen, die diese Bindung beeinflussen, sowie die Messung der Konzentration von CRP oder C1q in komplexen Medien in weniger als 10 Prozent der Zeit, die bei Verwendung bisher beschriebener, inhomogener Methoden aufgewendet werden mußte.
Ein besonderes Charakteristikum des neuen Verfahrens ist, daß sich die Bindung zwischen den beiden Proteinen in Lösung verfolgen läßt, da keiner der Reaktanten an einer festen Phase immobilisiert werden muß. Die Messung kann zudem direkt mit den aus biologischen Quellen gewonnenen Proteinen durchgeführt werden, ohne daß eine Modifikation von CRP oder C1q, beispielsweise durch Bindung eines Fluorophors, durchgeführt werden müßte. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens ist daher, daß das Protein in nativem Zustand dem Test unterworfen werden kann und die Gefahr der Denaturierung, die bei einer Immobilisierung und/oder Modifikation des Proteins bestehen würde, entfällt.
Ein weiterer Vorteil des er indungsgemäßen Verfahrens ist, daß das Probenvolumen des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erheblich reduziert ist. So können Volumina von kleiner 10 μl eingesetzt werden, was den Materialaufwand minimiert. Zudem können hoch verdünnte Lösungen mit
Konzentrationen an CRP oder C1q von kleiner als 1 nM, sogar kleiner als 100 pM eingesetzt werden. Es handelt sich also zudem um ein sehr sensitives Verfahren. Ferner handelt es sich aufgrund des zuvor Gesagten um die erste Methode, die ein Hochdurchsatz-Screening nach Substanzen, die die Komplementaktivierung durch Bindung von CRP an C1q beeinflussen, ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Signalübertragung von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe) auf die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Akzeptorgruppe) durch Singulett-Sauerstoff. Hierbei umfaßt die Donorgruppe vorzugsweise eine Verbindung, die nach Anregung durch einen Laser Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umwandeln kann und die Akzeptorgruppe umfaßt mindestens eine erste Verbindung, die durch Singulett- Sauerstoff angeregt werden kann, und eine zweite Verbindung, die die von der durch Singulett-Sauerstoff anregbaren Gruppe aufgenommene Energie emissionslos aufnehmen und in Form von Fluoreszenzstrahlung emittieren kann.
Der gebildete Singulett-Sauerstoff kann von der Donorgruppe zu der Akzeptorgruppe diffundieren und mit den sich dort befindlichen chemiluminiszenten Substanzen reagieren. Die dabei frei werdende Energie wird auf die Fluorophore übertragen, welche die Energie schließlich in Form von Fluoreszenz-Strahlung abstrahlen, die mit einem Photomultiplier detektiert werden kann. Voraussetzung für ein detektierbares Signal ist die räumliche Nähe von Donor- und Akzeptorbeads, da der Singulettsauerstoff instabil ist und in wässriger Lösung zerfällt. Die einzusetzenden bindenden Komponenten werden bei diesem Verfahren deshalb so gewählt, daß bei Eintreten des Bindungsereignisses der Abstand zwischen den Donor- und Akzeptorgruppen vorzugsweise weniger als 200 nm beträgt, da bei größerem Abstand ein effektiver Energietransfer mittels Singulett-Sauerstoff, aufgrund der Zerfallszeit des Singulett-Sauerstoffs, nicht möglich ist.
Besonders bevorzugt sind bei dieser Ausführungsform Donorgruppe und Akzeptorgruppe auf Partikel lokalisiert, wobei die Partikel vorzugsweise einen gemittelten Durchmesser von zwischen 150 und 250 nm, besonders bevorzugt von etwa 200 nm besitzen. Die Partikel werden hierbei vorzugsweise so eingesetzt, daß sich eine finale Konzentration an Donorgruppe tragenden Partikel von 1-40 μg/ml und eine finale Konzentration an Akzeptorgruppe tragenden Partikeln von 1-80 μg/ml einstellt. Die Bindekapazität der Partikel kann beispielsweise bei etwa 0.1 nM bis 1 nM pro μg/ml Partikel liegen.
Besonders bevorzugt werden für das Verfahren als Partikel Alpha-Screen-Beads von Perkin-Elmer Life Sciences verwendet. Bei dieser Ausführungsform erfolgt Anregung der Donorgruppe durch Bestrahlung mit einem Laser bei einer Wellenlänge von 680 nm und die durch die Akzeptorgruppe emittieren Strahlung kann bei einer Wellenlänge zwischen 520 und 600 nm detektiert werden.
Das Verfahren kann dann entsprechend so durchgeführt werden, daß Donor- und Akzeptorbeads, die Donor- und Akzeptorgruppen tragen, vorgelegt werden. An die
Donor- und Akzeptorbeads werden nun Komponenten gebunden, die dazu in der Lage sind entweder selbst oder über weitere Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden. Bei diesen Komponenten kann es sich wie bereits zuvor erwähnt entweder um C1q bzw. CRP oder um einen Anti-CRP- bzw. Anti-C1 q-Antikörper oder aber um einen gegen den Anti-CRP- bzw. Anti-C1 q-Antikörper gerichteten Sekundärantikörper handeln.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Signalübertragung von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) auf die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Akzeptorgruppe) durch emissionslosen Energietransfer, besonders bevorzugt durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer.
Das Verfahren kann hierbei beispielsweise so ausgeführt werden, daß die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe) eine
Europiumsalz-haltige Verbindung und die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Akzeptorgruppe) Allophycocyanin umfaßt (Grepin et al. (2000), Drug Discovery Today 5, 212). Oder es kann sich bei Donor- und Akzeptorgruppe um Farbstoffe handeln, die für den emissionslosen Energietransfer geeignet sind. Es können desweiteren alle dem Fachmann bekannten Verbindungen verwendet werden, die für den emissionslosen Energietransfer, inbesondere für den Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer geeignet sind (s. bspw. Pope et al. (1999), Drug Discovery Today 4, 350).
Die einzusetzenden bindenden Komponenten werden bei dieser Ausführungsform vorzugsweise so gewählt, daß der Abstand zwischen den Donor- und Akzeptorgruppen nach Bindung weniger als 10 nm beträgt, da bei größerem Abstand ein effektiver emissionsloser Energietransfer nicht möglich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform zur Konzentrationsbestimmung einer CRP- bzw. C1 q-haltigen Lösung unbekannten CRP- bzw. C1 q-Gehalts verwendet, wobei es sich bei dieser Lösung vorzugsweise um Blutplasma oder Blutserum handelt oder um mittels eines geeigneten physiologischen Puffers oder mittels Wasser verdünntes Blutplasma oder Blutserum. Dieses Verfahren kann beispielsweise für diagnostische Zwecke zum Einsatz kommen, insbesondere zur Ermittlung des Entzündungszustandes eines Organismus und/oder zur Ermittlung der Gefahr eines Herzinfarkts und/oder eines Schlaganfalls.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein HTS-fähiges, diagnostisches Testsystem zur Ermittlung eines Bindungsereignisses zwischen CRP bzw. C1q und einer an CRP bzw. C1 q bindenden Komponente, folgende Komponenten umfassend:
(a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von
Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1 q zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann, und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1 q zu binden. Das HTS-fähige Testsystem umfaßt hierbei vorzugsweise folgende weitere Komponenten:
(c) Blutserum oder Blutplasma oder mittels physiologischem Puffer oder mittels Wasser verdünntes Blut, (d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a),
(e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Strahlung gemäß (b).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor Schritt (a) und/oder vor Schritt (b) und/oder vor Schritt (c) und/oder vor Schritt
(d) mindestens eine Testsubstanz hinzugegeben, um zu beobachten, ob diese einen Einfluß auf das Bindungsereignis hat. Auf diese Weise können Substanzen ermittelt werden, die modulierend, inhibierend oder aktivierend auf die Wechselwirkung zwischen CRP bzw. C1 q und einem Binder, insbesondere auf die Wechselwirkung zwischen CRP und C1q einwirken. Vorzugsweise wird hierzu eine Bibliothek von Testsubstanzen im HTS-Verfahren gescreent, um eine Substanz mit den gewünschten Eigenschaften zu ermitteln.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein HTS-fähiges
Testsystem zur Ermittlung von Wirkstoffen, die modulierend auf die Wechselwirkung zwischen CRP bzw. C1 q und einer an CRP bzw. C1q bindenden Komponente einwirken, folgende Komponenten umfassend:
(a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann, und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(c) mindestens eine Testverbindung.
Dieses HTS-fähige Testsystem umfaßt hierbei vorzugsweise folgende weitere Komponenten:
(d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a),
(e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Stahlung gemäß (b), (f) eine CRP- bzw. C1 q-haltige Lösung.
Die erfindungsgemäßen HTS-fähigen Testsysteme werden hierbei vorzugsweise zur Durchführung der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Besondere Ausführungsformen der Bestandteile und Komponenten der Testsysteme entsprechen daher den zuvor genannten besonderen Ausführungsformen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen.
Im Schema 1 ist das im Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahren schematisch dargestellt. Hierbei wurde als Donorkomponente ein Anti-C1 q-Antikörper verwendet, wobei die Donorgruppe auf Partikel lokalisiert ist, die an den Anti-C1 q-Antikörper gebunden sind. Die Donorkomponente kann im vorliegenden Fall über C1 q an das CRP binden. Bei der Akzeptorkomponente handelt es sich im vorliegenden Fall um einen Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, wobei die Akzeptorgruppe auf Partikel lokalisiert ist, die an den Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper gebunden ist. Die Akzeptorkomponente kann im vorliegenden Fall über einen Anti-CRP-Antikörper aus Kaninchen an das CRP binden. Schema 1
Licht
Donor
Ausführungsbeispiel: Bindungsassay zur Ermittlung der Bindung von CRP an C1 q
Zur Versuchsdurchführung wurde der Alphascreen Detection Kit von Packard Bioscience verwendet. Dieser umfaßt Donor- und Akzeptorbeads, wobei die Donorbeads Verbindungen umfassen, die nach Anregung bei einer definierten
Wellenlänge Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umwandeln können, und wobei die Akzeptorbeads Verbindungen umfassen, die durch Singulett-Sauerstoff angeregt werden können, sowie Verbindungen, die von den angeregten Verbindungen Energie in Form eines emissionslosen Energietransfers übernehmen und anschließend in Form von Fluoreszenzstrahlung emittieren können. Die genannten Verbindungen sind hierbei jeweils in eine Hydrogelmatrix eingebettet. Die eingesetzten Beads waren vom Hersteller bereits vorbeschichtet, und zwar die Donorbeads mit Streptavidin und die Akzeptorbeads mit Anti-Kaninchen-Antikörper.
Tabelle 1 : Übersicht über die eingesetzten Materialien
Herstellung des Reaktionspuffers
Folgender Reaktionspuffer kam in dem Alpha-Screen-System zur Anwendung: 20 mM Tris-HCI, pH 7.2, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2, 1 mM Phosphorylcholin, 0.1 % BSA. Zur Herstellung einer Stammlösung an Tris-NaCI-Puffer wurden 3.15 g Tris-HCI und 8.77 g NaCI in H20 gelöst, mittels 1 M NaOH ein pH-Wert von 7.2 eingestellt und anschließend mit H20 auf 1 l aufgefüllt. Der Puffer wird bei Raumtemperatur aufbewahrt. Der Reaktionspuffer wurde hergestellt, indem 36.7 mg CaCI2, 12.9 mg Phosphorylcholin und 50 mg BSA zu 50 ml Tris-NaCI-Puffer hinzugegeben wurden.
Biotinylierung des Anti-C1q-Antikörpers
Um eine Bindung des Anti-C1q-Antikörpers an die Streptavidin-beschichteten Donorbeads zu ermöglichen, mußte dieser zunächst biotinyliert werden. Hierzu wurden 100 μl Anti-C1 q polyklonales Serum zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur gegen 200 ml PBS dialysiert. Nach Zugabe von 20 μl 1.5 mM Sulfo- NHS-Lösung (in Milli-Q-Wasser) wurde die Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend wieder zweimal gegen PBS dialysiert, um überschüssiges Biotinylierungsreagens zu entfernen.
Durchführung des Assays
Zur Durchführung des Assays wurden 2 μl Donorbead/Anti-CRP-Lösung vorgelegt, anschließend 2 μl C1q, 2 μl CRP und 2 μl Akzeptorbead/Anti-CRP hinzugegeben. Es wurden hierdurch folgende finale Konzentrationen eingestellt: CRP: 1 nM; C1 q: 10 nM; Anti-CRP: 7.3 nM; Anti-C1 q: 1 :1500; Donorbeads: 20 μg/ml; Akzeptorbeads: 40 μg/ml. Als Negativkontrolle wurden anstelle der CRP-Lösung, anstelle der C1q-Lösung oder anstelle dieser beiden Lösungen Reaktionspuffer eingesetzt. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Daten mittels eines AlphaQuest-Readers ausgelesen.
Ergebnisse
Bei einer CRP-Konzentration von 1 nM und einer C1 q-Konzentration von 10 nM wurden folgende Intensitäten der emittierten Strahlung gemessen (angegeben sind die Counts des Photomultipliers):
In Abwesenheit von CRP und Abwesenheit von C1 q: 952
In Gegenwart von CRP und Abwesenheit von C1 q: 1255
In Abwesenheit von CRP und Gegenwart von C1 q: 1114 In Gegenwart von CRP und Gegenwart von C1 q: 80376
Wie zu erkennen ist, liefern die Negativkontrollen kein positives Ergebnis, während bei Zusammengeben von C1 q- und CRP-haltiger Lösung ein starkes Signal zu erkennen ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Ermittlung eines Bindungsereignisses von zwei direkt oder über eine oder weitere Komponenten an CRP bindenden Komponenten, folgende Schritte umfassend:
(a) Vorlage einer CRP-haltigen Lösung,
(b) Zugabe von mindestens einer Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, zu der CRP-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden,
(c) Zugabe von mindestens einer Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, zu der CRP-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden,
(d) Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) durch eine Lichtquelle, (e) Detektion der von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von
Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) emittierten elektromagnetischen Strahlung zum Nachweis des Bindungsereignisses.
2. Verfahren zur Ermittlung eines Bindungsereignisses von zwei direkt oder über eine oder weitere Komponenten an C1q bindenden Komponenten, folgende Schritte umfassend:
(a) Vorlage einer C1q-haltigen Lösung, (b) Zugabe von mindestens einer Donorkomponente oder von einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, zu der C1q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1 q zu binden,
(c) Zugabe von mindestens einer Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, zu der C1 q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1 q zu binden,
(d) Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) durch eine Lichtquelle,
(e) Detektion der von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) emittierten elektromagnetischen Strahlung zum Nachweis des Bindungsereignisses.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der elektromagnetischen Strahlung um Fluoreszenz-Strahlung handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Lichtquelle gemäß (d) um einen Laser oder um eine Lampe handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion gemäß (e) mit Hilfe eines Photomultipliers erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten der Gruppe von Komponenten gemäß (b) und/oder (c) räumlich aufeinanderfolgend an CRP bzw. aneinander binden können.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten der Gruppe von Komponenten gemäß (b) und/oder (c) räumlich aufeinanderfolgend an C1q bzw. aneinander binden können.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Komponenten um Polypeptide handelt oder diese ein Polypeptid umfassen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen Antikörper handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen natürlichen Bindungspartner des CRP handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem natürlichen Bindungspartner des CRP um C1q handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe von Komponenten gemäß Anspruch 1 (a) oder Anspruch 1 (b) C1 q und einen Anti-C1 q- Antikörper umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen natürlichen Bindungspartner des C1 q handelt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem natürlichen Bindungspartner um CRP handelt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe von Komponenten gemäß Anspruch 2(a) oder Anspruch 2(b) CRP und einen Anti-CRP- Antikörper umfaßt.
17. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalübertragung von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) auf die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) durch emissionslosen Energietransfer erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem emissionslosen Engergietransfer um einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer handelt.
19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalübertragung durch Singulett-Sauerstoff erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß Anspruch 1 (b) oder 2(b) (Donorgruppe) eine Verbindung umfaßt, die nach Anregung durch einen Laser Triplett- Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umwandeln kann und die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß Anspruch 1 (b) oder 2(b)
(Akzeptorgruppe) mindestens eine erste Verbindung umfaßt, die durch Singulett- Sauerstoff angeregt werden kann, und mindestens eine zweite Verbindung umfaßt, die die von der durch Singulett-Sauerstoff anregbaren Verbindung aufgenommene Energie emissionslos aufnehmen und in Form von Fluoreszenzstrahlung emittieren kann.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Donorgruppe und/oder die Akzeptorgruppe auf Partikeln lokalisiert sind.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen mittleren Durchmesser von etwa 200 nm aufweisen.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Konzentrationsbestimmung einer CRP-haltigen Lösung unbekannten CRP-Gehalts verwendet wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Konzentrationsbestimmung einer C1q-haltigen Lösung unbekannten C1 q-Gehalts verwendet wird.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Lösung um Blutserum, Blutplasma oder mittels eines physiologischen Puffers oder mittels Wasser verdünntes Blutserum oder Blutplasma handelt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein diagnostisches Verfahren zur Ermittlung des Entzündungszustandes eines
Organismus und/oder zur Ermittlung der Herzinfarkt- und/oder Schlaganfallgefahr handelt.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein HTS-fähiges homogenes Verfahren handelt, das als Ein-Schritt-
Verfahren durchgeführt werden kann.
28. Verfahren nach Anspruch 1 , als zusätzlichen Schritt umfassend, daß vor Schritt (a) und/oder vor Schritt (b) und/oder vor Schritt (c) und/oder vor Schritt (d) mindestens eine Testsubstanz hinzugegeben wird, um zu beobachten, ob diese einen Einfluß auf das Bindungsereignis zwischen CRP und an CRP bindender Komponente hat.
29. Verfahren nach Anspruch 2, als zusätzlichen Schritt umfassend, daß vor Schritt (a) und/oder vor Schritt (b) und/oder vor Schritt (c) und/oder vor Schritt (d) mindestens eine Testsubstanz hinzugegeben wird, um zu beobachten, ob diese einen Einfluß auf das Bindungsereignis zwischen C1 q und an C1 q bindender Komponente hat.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren verwendet wird, um Substanzen zu ermitteln, die modulierend, inhibierend oder aktivierend auf das Bindungsereignis einwirken.
31. HTS-fähiges, diagnostisches Testsystem zur Ermittlung eines
Bindungsereignisses zwischen CRP und einer an CRP bindenden Komponente, folgende Komponenten umfassend:
(a) mindestens eine Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von
Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden.
32. HTS-fähiges, diagnostisches Testsystem zur Ermittlung eines
Bindungsereignisses zwischen C1q und einer an C1 q bindenden Komponente, folgende Komponenten umfassend: (a) mindestens eine Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden,
(b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden.
33. HTS-fähiges Testsystem nach Anspruch 31 oder 32, folgende weitere Komponenten umfassend: (c) Blutserum oder Blutplasma oder in physiologischem Puffer oder mittels Wasser verdünntes Blutserum oder Blutplasma,
(d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe),
(e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Stahlung gemäß (b).
34. HTS-fähiges Testsystem zur Ermittlung von Wirkstoffen, die modulierend auf die Wechselwirkung zwischen CRP und einer an CRP bindenden Komponente einwirken, folgende Komponenten umfassend: (a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) ausgesendete Signal zu empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abzugeben, wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere
Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden,
(b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden,
(c) mindestens eine Testverbindung.
35. HTS-fähiges Testsystem zur Ermittlung von Wirkstoffen, die modulierend auf die Wechselwirkung zwischen C1 q und einer an C1q bindenden Komponente einwirken, folgende Komponenten umfassend:
(a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) ausgesendete Signal zu empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abzugeben, wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1 q zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden,
(c) mindestens eine Testverbindung.
36. HTS-fähiges Testsystem nach Anspruch 34 oder 35, folgende weitere Komponenten umfassend:
(d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe),
(e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Stahlung gemäß (b).
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