EP1513920A2 - Kultursysteme zur sterilen kontinuierlichen kultivierung von zellen - Google Patents

Kultursysteme zur sterilen kontinuierlichen kultivierung von zellen

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Publication number
EP1513920A2
EP1513920A2 EP03737924A EP03737924A EP1513920A2 EP 1513920 A2 EP1513920 A2 EP 1513920A2 EP 03737924 A EP03737924 A EP 03737924A EP 03737924 A EP03737924 A EP 03737924A EP 1513920 A2 EP1513920 A2 EP 1513920A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
gels
cultivation
culture
poly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03737924A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marco Riedel
Uwe Marx
Hikmat Bushnaq-Josting
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ProBioGen AG
Original Assignee
ProBioGen AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ProBioGen AG filed Critical ProBioGen AG
Publication of EP1513920A2 publication Critical patent/EP1513920A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Definitions

  • the invention relates to culture systems and methods for the sterile continuous cultivation of cells in high densities and for reducing the seeding density at the beginning of the cultivation of cells in bioreactors.
  • biodegradable gels that release low molecular weight components as nutrients for cell culture or 0 semisolid media that are diluted during the course of the culture and thereby release the culture space for colonization with cells in high density
  • Polypeptide (block) copolymers partially consisting of poly (L-glutamine), are used as biodegradable gels, and methyl celluloses, alginates and agaroses 5 are used as semisolid media.
  • the object of the invention is to enable new solutions for the cultivation of cells of high cell density and to reduce the minimum starting cell density (seeding density).
  • the object was achieved by the development of culture systems and methods for the sterile continuous cultivation of cells in high densities, in which the cells are separated from the supply medium by embedding the cells in a gel and / or semisolide medium, which a support material is held.
  • the solution according to the invention surprisingly makes it possible to start the cultivation of cells with very low seeding densities of ⁇ 10,000 cells per milliliter.
  • the culture systems according to the invention contain, as gels, crosslinked polypeptides with a high glutamine content and / or as semisolid media, viscous liquids, in particular methyl celluloses, or liquids from microscopic gel pieces produced according to the invention.
  • the semisolid medium used according to the invention is biodegradable or is diluted in the course of the culture and, as a result, the culture space can be used to the maximum by the cells in high density.
  • Another advantage of the gels or semisolid matrices used according to the invention is that the low-molecular components released by biodegradation can serve as nutrients for cell culture.
  • the term cells denotes natural and randomly or by manipulation degenerated cells of any species, and cells in high densities are understood here to mean concentrations of single cells in sterile culture of over 10 million cells per milliliter.
  • the culture systems according to the invention contain a culture room with a plurality of fixed chambers and a supply room with a device for generating a variably adjustable gel / cell culture media mixture, the culture room and the supply room being semi-permeable from one another.
  • the products obtained with the aid of the solution according to the invention - are cell components, viruses and active substances produced in and by cells - are free of compounds which are not typical of the media.
  • Another surprising advantage of the solution according to the invention is that high cell densities are obtained in one and the same culture area and there is thus no need to switch to larger culture areas in the cultivation phase.
  • Gels are crosslinked polypeptides with a high glutamine content or crosslinked alginates;
  • Semisolid media are viscous liquids with a viscosity that is at least 20-100 times higher than that of water or even higher, e.g. Solutions made from methyl cellulose (MC) or agar (note: not agarose, see http://www.mgm.musin.de/ête/elba/algen/algenl3.htm) as well as liquids consisting of microscopic gel pieces.
  • a medium is referred to as a gel, semisolid medium or growth-promoting semisolide medium in which individual cells can be deposited and propagated.
  • Such gels are preferably cross-linked polypeptides with a high proportion of glutamine or cross-linked alginates, whereas semi-insulating media consist of viscous liquids, preferably methyl celluloses, or liquids consist of microscopic pieces of gel.
  • the semisolid media optionally contain support materials.
  • a support material eg a hollow fiber membrane
  • Suitable materials are flat membranes, tubular membranes and woven networks.
  • the membranes consist of polymers, for example polysulfones, polyether sulfones or polycarbonates, and also of polyesters from the group of polyalkylene terephthalates, in particular polyethylene terephthalate.
  • Tubular membranes are hollow fiber membranes which e.g. can be produced by spinning processes or extrusion processes or which consist of flat membranes wound and welded into a tube.
  • Woven nets are nonwovens in any geometry. Tubular membranes and nonwovens can be made of the same materials as the flat membranes. Filling the cell culture room in a bioreactor with a gel or a semisolid matrix leads to a higher viscosity in the cell culture room. If this cell culture area is inoculated with cells, then they are "fixed" in the matrix. The matrix reduces the rate of mass transfer around the cells, so that a micro-environment can arise. With an optimal matrix, each cell can build up its own micro-milieu, so that the cultivation of a single cell is possible.
  • proteolytically degradable gels such as polypeptide (block) copolymers (AP Nowak, V. Breedveld, L. Pakstis, B. Ozbas, DJ Pine, D. Pochan and TJ Deming, Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptides amphiphiles, Nature 417 (2002), pp. 424-428), the proteolytic degradation with the concentration of cell-specific proteases, ie with the cell number, positively correlated. If these polypeptide (block) copolymers are predominantly made up of poly (L-glutamine), the amino acid L-glutamine is formed during biodegradation, which in addition to glucose serves as the main nutrient source in animal cells.
  • polypeptide (block) copolymers AP Nowak, V. Breedveld, L. Pakstis, B. Ozbas, DJ Pine, D. Pochan and TJ Deming, Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptides amphiphiles
  • a novel polypeptide (block) copolymer according to the invention is obtained by reacting poly (L-glutamic acid) in oxalyl chloride and introducing ammonia (Example 2.3.). It consists of poly (L-glutamine) and poly (L-glutamic acid), for example 89 mol% of poly (L-glutamine) and 11 mol% of poly (L-glutamic acid).
  • methyl celluloses can also be used, the usability of which has been checked in cell culture. Methyl celluloses are currently mainly used in cell culture in cloning; they are commercial for this application and therefore readily available
  • the new semisolid media according to the invention include gels which are obtained from human serum albumin (HSA) and glutardialdehyde by crosslinking.
  • HSA human serum albumin
  • glutardialdehyde by crosslinking.
  • water is added to the solidified gels and comminuted using a dispersing device (Example 3). After processing, gel pieces result which have a size between 10 ⁇ m and 100 ⁇ m.
  • 5 cells (mammalian cells) are cultivated.
  • the features of the invention emerge from the elements of the claims and from the description, both individual features and several in the form of combinations representing advantageous designs for which protection is provided with this document is requested.
  • the essence of the invention consists of a combination of known (general components of bioreactors) and new elements (semisolide media, held by supporting materials), which mutually influence one another and, in their new overall effect, result in a use advantage and the desired success, which lies in the fact that For the first time, a possibility to significantly reduce the minimum starting cell density (inoculation density) when culturing cells in high density is opened.
  • the use of the culture systems and / or the methods according to the invention lies in the cultivation of cells of high density and in the reduction of the starting cell density at the beginning of the cultivation in bioreactors. It also lies in the production of cell products, cell components, viruses or active substances as well as in the production of pharmaceuticals and in the production of diagnostics. It also lies in the fact that gels and / or semisolide matrices are used to build up a micromilieu around the individual cell and thus as a prerequisite for lowering the inoculation density, they are diluted during the course of the culture and thereby the culture space for colonization with cells in high density release. It is also because they release small molecules as nutrients for cell culture.
  • Cages are made from a penneable membrane and a plastic housing.
  • the permeable membrane is a flacli membrane made of polyethylene terephthalate with uniform pores - with a pore diameter of 0.4 ⁇ m.
  • Plastic housing is made of polycarbonate.
  • the cages each contain an ImL culture room. They are kept submerged in a nutrient-containing solution so that the cells can be supplied via the membrane.
  • the cages are infested with a 2% methyl cellulose / medium mixture (MC) and inoculated with cells.
  • the inoculation concentrations are 5 x 10 3 , 5 x 10 4 , 5 x 10 5 and 5 x 10 6 cells / mL (Z / mL). These concentrations are given in Table 1 as day 0 cell concentrations.
  • FIG. 1 Cell counts and vitalities
  • Cells (1) are separated from the supplying medium (4), characterized in that they contain a gel (2) or a semisolide medium which is held by a support material (3).
  • polypeptide (block) copolymers are prepared as follows: 2.1 .: Preparation of a monomer
  • the N-carboxylic anhydride of glutamic acid is formed.
  • the solvent is removed completely.
  • the purification is carried out by recrystallization from ethyl acetate. Two bands are found in the Fourier-transformed IR spectrum at 1750 and 1815 cm “1 , which are typical for the cyclic anhydride formed.
  • oxalyl chloride 1.0 g of poly (L-glutamic acid) is added.
  • Oxalyl chloride is also a solvent.
  • the polymer dissolves due to the reaction to the acid chloride. After 48 hours at room temperature, the solvent is stripped off and the remaining polymer is dissolved in 50 ml of THF.
  • Gaseous ammonia is passed into the polymer solution, the polymer beginning to precipitate out. After the gas has been introduced for two hours, the precipitate is removed, washed with THF, dried and dialyzed in water in a 10 kD dialysis tube.
  • the extracted gel is mixed with 5 times the volume of water and comminuted with a dispersing device into pieces of gel. After 10 minutes of processing, gel pieces with a dimension of between 10 ⁇ m and 100 ⁇ m result. The strength of the gel pieces and their size can be adjusted by selecting the HSA concentration, the glutardialdehyde concentration, the dispersing tool and the processing time. [0048] The gel pieces were autoclaved. In a cell culture experiment, 900 ⁇ L of the comminuted gel was mixed with 100 ⁇ L of a cell suspension which had a concentration of 1 10 4 cells / mL. The resulting cell density was thus 1 '10 3 cells / mL. 500 ⁇ L of this suspension are placed in a 24-well cell culture plate.
  • the gel containing cells in the cell culture plate is overlaid with 500 ⁇ L of fresh medium and cultivated at 37 ° C. in an incubator (5% by volume of CO 2 ). The cell number is determined daily. As the culture period progresses, the number of cells in the gel increases (see FIG. 3).
  • 500 ⁇ L of this suspension are placed in a 24-well cell culture plate. This corresponds to a gel bed height of approx. 3 mm.
  • the gel containing cells in the cell culture plate is overlaid with 500 ⁇ L of fresh medium and cultivated at 37 ° C. in an incubator (5% by volume of CO 2 ).
  • the old medium is exchanged for fresh medium every three or four days.
  • the concentration of the antibody which was produced by the cells in the course of the cultivation is determined from the supernatant of the old medium.
  • the cells are counted on the day of the medium change (see Table 2).
  • Figure 1 Cell counts and vitalities / ratio of cell counts to inoculation density
  • Figure 2 Culture systems for the sterile continuous cultivation of cells in high densities and for reducing the starting cell density at the beginning of the cultivation in biorectors
  • FIG. 3 Increase in the number of cells with the culture duration in the cultivation of CHO cells (CHO - Chinese Hamster Ovary)

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Abstract

Die Erfindung betrifft Kultursysteme sowie Verfahren zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Animpfdichte im Beginn der Kultivierung von Zellen in Bioreaktoren. Durch den Einsatz von biodegradierbaren Gelen, die niedermolekulare Bestandteile als Nährstoffe für die Zellkultur freisetzen oder semisoliden Medien, die im Laufe der Kulturführung verdünnt werden und dadurch den Kulturraum zur Besiedlung mit Zellen in hoher Dichte freigeben, gelingt es, die Startzelldichte zu Beginn der Kultivierung in Bioreaktoren deutlich herabzusetzen. Als biodegradierbare Gele finden Polypeptid-(Block)-Copolymere, zum Teil bestehend aus Poly(L-glutamin), und als semisolide Medien Methylcellulosen, Alginate und Agarosen Verwendung.

Description

Kultursysteme zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen
Beschreibung s
[0001] Die Erfindung betrifft Kultursysteme sowie Verfahren zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Animpfdichte im Beginn der Kultivierung von Zellen in Bioreaktoren. Durch den Einsatz von biodegradierbaren Gelen, die niedermolekulare Bestandteile als Nährstoffe für die Zellkultur freisetzen oder 0 semisoliden Medien, die im Laufe der Kulturführung verdünnt werden und dadurch den Kulturraum zur Besiedlung mit Zellen in hoher Dichte freigeben, gelingt es, die Startzelldichte zu Beginn der Kultivierung in Bioreaktoren deutlich herabzusetzen. Als biodegradierbare Gele finden Polypeptid-(Block)-Copolymere, zum Teil bestehend aus Poly(L-glutamin), und als semisolide Medien Methylcellulosen, Alginate und Agarosen 5 Verwendung.
Charakteristik des bekannten Standes
[0002] Unter den vielen verschiedenen Zellkulturvorrichtungen, die für unterschiedlichste Aufgabengebiete entwickelt worden sind, spielt das Kultivieren von Zellen zur Herstellung 0 von Arzneimitteln eine bedeutende Rolle. Gegenwärtig werden die Zellen vor allem durch zwei grundsätzlich verschiedene Verfahren in Kultur gehalten:
1. Die Suspensionskultur in gängigen sterilen Rührkesselbioreaktoren.
2. Die stationäre Kultivierung in hohen Zelldichten, die vor allem durch das Vorhandensein geeigneter Trennmembranen möglich wurde und 1974 erstmals von Knazek et al. im Patent 5 US 3,821,087 beschrieben wurde. Neben Kultursystemen aus Hohlfasermembranen sind auch Flachmembranen (Scheirer und Katinger 1985, DE 3409501) eingesetzt worden. In den genannten Verfahren und Vorrichtungen ist jedoch die gleichmäßige Nährstoffversorgung und insbesondere die Sauerstoffversorgung problematisch. Sowohl der Versuch, dieses Problem über komplexe Verfahrensschritte mit Druckbeaufschlagung zu lösen (1989, US 0 4,804,628), als auch das direkte Einbringen von Sauerstoff in den Zellkulturraum über ein weiteres Membransystem (1986, DE 2431450 und 1995, DE 4230194) führten nicht zu beliebig im Maßstab vergrößerbaren Kultursystemen, in denen die Zellen gleichmäßig versorgt werden können. Membranverfahren an sich besitzen mehrere Vorteile gegenüber konventionellen Suspensionskulturen. Durch ihre Betreibung als Perfusionskulturen können sie - durch eine große Membranfläche pro Volumeneinheit - sehr hohe Zelldichten (107-108 Zellen/mL) erreichen. Außerdem sind die Zellen vor schädlichen Scherkräften geschützt, bedürfen weniger Nährstoffe und weisen eine höhere Produktkonzentration auf (Piret JM, Cooney CL. 1990: Immobilized mammalian cell cultivation in hollow fiber bioreactors, Biotechnol. Adv. 8: 763-783). Außerdem können mit Hohlfasern sowohl Suspensionszellen als auch adhärente Zellen kultiviert werden [Lipman NS, Jackson LR. 1998: Hollow fibre bioreactors: an alternative to murine ascites for small scale (<lgram) monoclonal antibody production, Res Immunol Jul-Aug;149(6):571-6]. [0003] In verschiedenen Schriften spielen die Komponenten Versorgungsraum, Gel und Stützmaterial bereits eine Rolle. So haben DE 19725318 AI, DE 19540487 AI oder US 5736399 A das Tissue Engineering von 3D-Strukturen zum Inhalt. Dabei geht es darum, Zell- Zell-Interaktionen zu ermöglichen. Gemäß EP 666322 AI sollen Mikroorganismen im Sinne von Bakterien kultiviert werden. Hierin geht es, wie bei den bereits bekannten und im Handel erhältlichen Abklatschplatten, um die Kultivierung von Bakterien / Pilzen und die anschließende Keimzahlbestimmung.
[0004] Die Kultivierung von Zellen in Bioreaktoren beginnt immer mit dem Beimpfen. Dabei werden Zellen mit einer definierten Zelldichte in den Bioreaktor gebracht. Diese Startzelldichte ist nach unten begrenzt und abhängig vom Bioreaktor. Es wird vermutet, dass diese minimale Startzelldichte nötig ist, eine wie auch immer geartete "Eigenkonditionierung" durchzuführen, um dadurch erst die Kultivierung zu ermöglichen. Über die wesentlichen Mechanismen der Eigenkonditionierung sowie die dafür verantwortlichen Moleküle gibt es nach wie vor viele Unklarheiten (Gstraunthaler G. et al.: Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose Content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures; Are renal cells in tissue culture hypoxic? Cell. Physiol. Biochem. 9: 150-172, 1999). Gleichzeitig ist die in diesen Bioreaktoren erreichbare Zelldichte nach oben begrenzt. Die Limitation ist vor allem durch verringerten Metabolitaustausch der Einzelzelle charakterisiert.
Das Wesen der Erfindung [0005] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Lösungswege zur Kultivierung von Zellen hoher Zelldichte zu ermöglichen und die minimale Startzelldichte (Animpfdichte) herabzusetzen. [0006] Die Aufgabe wurde durch die Entwicklung von Kultursystemen und Verfahren zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten gelöst, in denen die Trennung der Zellen von dem versorgenden Medium durch Einbettung der Zellen in ein Gel und / oder semisolides Medium erfolgt, das von einem Stützmaterial gehalten wird. Die erfindungsgemäße Lösung macht es überraschenderweise möglich, dass die Kultivierung von Zellen mit sehr geringen Animpfdichten von < 10.000 Zellen pro Milliliter begonnen werden kann.
[0007] Die erfindungsgemäßen Kultursysteme enthalten als Gele vernetzte Polypeptide mit einem hohen Glutaminanteil und / oder als semisolide Medien viskose Flüssigkeiten, insbesondere Methylcellulosen, oder Flüssigkeiten aus erfindungsgemäß hergestellten mikroskopisch kleinen Gelstücken.
[0008] Zu den Eigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten und gegebenenfalls wachstumsfördernden semisoliden Mediums gehört es, dass es biodegradierbar ist bzw. im Laufe der Kulturführung verdünnt wird und dadurch der Kulturraum von den Zellen in hoher Dichte maximal genutzt werden kann. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß verwendeten Gele bzw. semisoliden Matrizen besteht darin, dass die durch Biodegradation freigesetzten niedermolekularen Bestanteile als Nährstoffe für die Zellkultur dienen können. [0009] Mit dem Begriff Zellen werden im Rahmen dieser Erfindungsbeschreibung natürliche und zufällig bzw. durch Manipulation entartete Zellen jeglicher Spezies bezeichnet, und unter Zellen in hohen Dichten werden hier Konzentrationen von Einzelzellen in steriler Kultur von über 10 Millionen Zellen pro Milliliter verstanden.
[0010] Die erfindungsgemäßen Kultursysteme enthalten einen Kulturraum mit mehreren fixierten Kammern und einem Versorgungsraum mit einer Einrichtung zur Erzeugung eines variabel einstellbaren Gel-/Zellkultunnediengemisches, wobei der Kulturraum und der Versorgungsraum semipermeabel voneinander getrennt sind.
[0011] Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lösung gewonnenen Produkte - das sind Zellbestandteile, Viren sowie in und durch Zellen produzierte Wirkstoffe - sind frei von medienuntypischen Verbindungen. [0012] Ein weiterer überraschender Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung besteht darin, dass in ein und dem selben Kulturraum hohe Zelldichten erhalten werden und dadurch ein Wechsel auf größere Kulturräume in der Anzuchtphase entfallt.
[0013] Es ist eines der Grundanliegen der Erfindung, in dem Reaktor die Zellen über mehrere Größenordnungen in der Zellkonzentration zu kultivieren, so dass ein Wechsel auf nächstgrößere Reaktorsysteme unnötig wird. [0014] In Zellkultursystemen findet die eigentliche Zellvermehrung zwischen der minimalen Startzelldichte (Animpfdichte) und der maximal erreichbaren Zelldichte statt. In einem Bioreaktor lassen sich so im Durchschnitt die Zelldichten und bei konstantem Volumen die Zellzahlen verhundertfachen. [0015] Im Bereich des Tissue-Engineering ist es oft problematisch, genügend Zellen oder Gewebematerial für eine erfolgreiche Kultivierung zur Verfügung zu stellen. [0016] Für die Kultivierung im Produktionsmaßstab sind sehr hohe Zellzahlen notwendig, die aus einem Pool (working cell bank, WCB) hochgezüchtet werden müssen. Dazu sind die Zellen um den Faktor 1.000.000 zu expandieren. Dies gelingt nur dadurch, dass die Zellen in wenigstens drei in der Maßstabsvergrößerung aufeinander abgestimmten Bioreaktorsystemen kultiviert werden.
[0017] Es ist von einem enormen Vorteil, wenn es gelingt, die Startzelldichte drastisch zu verringern, da dadurch mehrere Bioreaktorsysteme entfallen können. Das Entfallen des Zeil- Transfers von einem Bioreaktorsystem in das nächste ist gleichbedeutend mit einer Verringerung der Kulturdauer, mit einer Risikominimierung (Kontaminationsgefahr) und mit Einsparungen bei den Anlageninvestitionen. Bei Rührkesselbioreaktoren beträgt diese minimale Startzelldichte üblicherweise lxlO5 Zellen/mL, bei Hohlfaserbioreaktoren dagegen 2xl06 Zellen/mL. [0018] Die erfindungsgemäße Lösung liegt im Einsatz von Gelen bzw. semisoliden Matrizen, um die oben beschriebenen Problemen zu lösen und die minimale Startzelldichte (Animpfdichte) drastisch zu reduzieren.
[0019] Unter Gelen werden vernetzte Polypeptide mit einem hohen Glutaminanteil verstanden oder vernetzte Alginate; semisolide Medien sind viskose Flüssigkeiten mit einer Viskosität, die mindestens 20-100 mal höher ist als die von Wasser oder noch höher, so z.B. Lösungen aus Methylcellulose (MC) oder Agar (Anm.: nicht Agarose, siehe http://www.mgm.musin.de/projekte/elba/algen/algenl3.htm) sowie Flüssigkeiten, die aus mikroskopischen Gelstückchen bestehen.
[0020] Als Gel, semisolides Medium bzw. wachstumsförderndes semisolides Medium wird im Rahmen dieser Erfindungsbeschreibung ein Medium bezeichnet, in dem einzelne Zellen abgelegt und zur Vermehrung gebracht werden können. Solche Gele sind vorzugsweise vernetzte Polypeptide mit einem hohen Glutaminanteil oder vernetzte Alginate, wohingegen semisolide Medien aus viskosen Flüssigkeiten, vorzugsweise Methylcellulosen, oder Flüssigkeiten aus mikroskopisch kleinen Gelstücken bestehen. [0021] Die semisoliden Medien enthalten gegebenenfalls Stützmaterialien. Ein Stützmaterial (z.B. eine Hohlfasermembran) fixiert das Gel bzw. semisolide Medium im Kulturraum und ermöglicht einen ungehinderten Stofftransport zwischen Umgebung und Gel bzw. semisolidem Medium. Geeignete Materialien sind Flachmembranen, tubuläre Membranen und gewobene Netze. Die Membranen bestehen aus Polymeren, z.B. aus Polysulfonen, Polyethersulfonen oder Polycarbonaten, auch aus Polyestern der Gruppe der Polyalkylenterephthalate, insbesondere Polyethylenterephthalat.
[0022] Tubuläre Membranen stellen Hohlfasermembranen dar, die z.B. durch Spinnprozesse oder Extrusionsprozesse hergestellt werden können oder die aus zu einem Schlauch gewickelte und verschweißte Flachmembranen bestehen.
[0023] Gewobene Netze sind Vliese in beliebigen Geometrien. Tubuläre Membranen und Vliese können aus den gleichen Materialien wie die Flachmembranen bestehen. [0024] Das Füllen des Zellkulturraumes in einem Bioreaktor mit einem Gel bzw. einer semisoliden Matrix führt zu einer höheren Viskosität im Zellkulturraum. Wird dieser Zellkulturraum mit Zellen beimpft, dann werden sie in der Matrix "fest" gehalten. Die Matrix verringert die Geschwindigkeit des Stoffaustausches um die Zellen, so dass ein Mikromilieu entstehen kann. Bei einer optimalen Matrix kann sich jede Zelle ihr eigenes Mikromilieu aufbauen, so dass die Kultivierung einer einzigen Zelle möglich ist.
[0025] Im Laufe der Zellexpansion wird das Gel nach und nach durch Zellen ersetzt. Unterstützt wird dieser Prozess durch die Verwendung von proteolytisch degradierbaren Gelen wie Polypeptid-(Block)-Copolymeren (A. P. Nowak, V. Breedveld, L. Pakstis, B. Ozbas, D. J. Pine, D. Pochan und T. J. Deming, Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptide amphiphiles, Nature 417 (2002), S. 424-428), wobei der proteolytische Abbau mit der Konzentration an zelleigenen Proteasen, d.h. mit der Zellzahl, positiv korreliert. Werden diese Polypeptid-(Block)-Copolymere zu einem überwiegenden Anteil aus Poly(L-glutamin) aufgebaut, so entsteht bei der Biodegradation die Aminosäure L-Glutamin, die neben Glukose als Hauptnährstoffquelle bei tierischen Zellen dient.
[0026] Ein erfindungsgemäßes neues Polypeptid-(Block)-Copolymer wird durch Umsetzung von Poly(L-glutaminsäure) in Oxalylchlorid und Einleiten von Ammoniak gewonnen (Beispiel 2.3.). Es besteht aus Poly(L-glutamin) und Poly(L-glutaminsäure), z.B. zu 89 mol-% aus Poly(L-glutamin) und zu 11 mol-% aus Poly(L-glutaminsäure). [0027] Anstelle der erfindungsgemäß eingesetzten Gele auf der Basis von Polypeptiden lassen sich auch Methylcellulosen verwenden, deren Verwendbarkeit in der Zellkultur überprüft ist. Methylcellulosen werden momentan in der Zellkultur hauptsächlich in der Klonierung eingesetzt; sie sind für diese Anwendung kommerziell und daher leicht erhältlich
5 (Kanakura, Y., Sonoda, S., Nakano, T., Fujita, J., Kuriu, A., Asai, H., and Kitamura, Y. Formation of mast cell colonies in methylcellulose by mouse skin cells and development of mucosal-like mast cells from the Pathol., 129:168-176,1987.cloned cells in the gastric mucosa of W/Wv mice. Am. J.). Als semisolide Matrix zum Aufbau eines Mikromilieus um die einzelne Zelle und damit als Voraussetzung der Herabsetzung der Animpfdichte sind sie 0 bislang nicht eingesetzt worden. Darin liegt eine neue, die erfindungsgemäße Verwendung von semisoliden Matrices.
[0028] Zu den erfmdungsgemäßen neuen semisoliden Medien gehören Gele, die aus Humanem Serumalbumin (HSA) und Glutardialdehyd durch Vernetzung gewonnen werden. Nach Beendigung der Reaktion werden die erstarrten Gele mit Wasser versetzt und mit einem 5 Dispergiergerät zerkleinert (Beispiel 3). Nach der Bearbeitung resultieren Gelstückchen, die in ihrer Abmessung zwischen 10 μm und 100 μm liegen.
[0029] Die Vernetzung zu Gelen und ihre anschließende Zerkleinerung fuhren zu Produkten, die es möglich machen, sie mit Zellen zu mischen und in ein Stützmaterial (z.B. in eine Hohlfasermembran) einzubringen. Der Effekt ist dann der gleiche wie bei Methylcellulose. o Die Zellen bleiben a) im Kulturraum fixiert, d.h. sie können nicht sedimentieren und b) der Stoffaustausch durch Diffusion wird behindert, und es erfolgt eine bessere Eigenkonditionierung - sichtbar an der geringeren Zellzahl, die eingsetzt werden kann. [0030] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können pflanzliche Zellen oder tierische
:5 Zellen (Säugerzellen) kultiviert werden.
[0031] Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Kultursysteme
(Vorrichtungen) eignen sich hervorragend für die Gewinnung von Proteinen, Wirkstoffen und
Arzneimitteln.
[0032] Bei der erfindungsgemäßen Zellkultivierung findet zwischen den Zellen kein aktiver, o sondern nur diffusiver Transport von Nährstoffen statt.
[0033] Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Das Wesen der Erfindung besteht aus einer Kombination aus bekannten (allgemeine Bestandteile von Bioreaktoren) und neuen Elementen (semisolide Medien, gehalten von Stützmaterialien), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass erstmals eine Möglichkeit zur deutlichen Reduzierung der minimalen Startzelldichte (Animpfdichte) bei der Kultivierung von Zellen in hoher Dichte eröffnet wird.
[0034] Die erfindungsgemäße Verwendung der Kultursysteme und / oder der Verfahren liegt in der Kultivierung von Zellen hoher Dichte und in der Reduzierung der Startzelldichte zu Beginn der Kultivierung in Biorektoren. Sie liegt des weiteren in der Gewinnung von Zellprodukten, Zellbestandteilen, Viren oder Wirkstoffen sowie in der Gewinnung von Arzneimitteln und in der Herstellung von Diagnostika. Des weiteren liegt sie darin, dass Gele und / oder semisolide Matrices zum Aufbau eines Mikromilieus um die einzelne Zelle und damit als Voraussetzung der Herabsetzung der Animpfdichte eingesetzt werden, sie im Laufe der Kulturfuhrung verdünnt werden und dadurch den Kulturraum zur Besiedlung mit Zellen in hoher Dichte freigeben. Sie liegt auch darin, dass sie niedermolekulare Bestandteile als Nährstoffe für die Zellkultur freisetzen.
[0035] Darin liegt auch die erfinderische Verwendung von Methylcellulosen.
[0036] In den zitierten Schriften DE 19725318 AI, DE 19540487 AI oder US 5736399 A, die das Tissue Engineering von 3D-Strukturen zum Inhalt haben, geht es nicht - wie in der vorliegenden Erfindung - um die Ablage einer sehr geringen Anzahl von Zellen im Kulturraum und die Expansion zu hohen Zelldichten, sondern um das Ermöglichen von Zell- Zell-Interaktionen. Der Unterschied zu EP 666322 AI, in der die Kultivierung von Bakterien / Pilzen und die anschließende Keimzahlbestimmung im Vordergrund steht, besteht darin, dass die Gele nur als Nährstoff- und Feuchtereservoir dienen sollen und die Bakterien nicht in das Gel oder in ein semisolides Medium eingebracht werden müssen, sondern auf der Oberfläche bleiben.
[0037] Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein. Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
[0038] Es werden Käfige aus einer penneablen Membran und einem Kunststoffgehäuse hergestellt. Die permeable Membran stellt eine Flaclimembran aus Polyethylenterephthalat mit gleichförmigen Poren dar - mit einem Porendurchmesser von 0,4 μm. Das
Kunststoffgehäuse besteht aus Polycarbonat.
[0039] Die Käfige enthalten jeweils einen ImL-Kulturraum. Sie werden in einer nährstoffhaltigen Lösung submers gehalten, so dass die Zellen über die Membran versorgt werden können.
[0040] Die Käfige werden mit einer 2%igen Methylcellulose-/Mediummischung (MC) befällt und mit Zellen beimpft. Die Animpfkonzentrationen betragen jeweils 5 x 103, 5 x 104, 5 x 105 und 5 x 106 Zellen/mL (Z/mL). Diese Konzentrationen sind in der Tabelle 1 als Tag 0 Zellkonzentrationen angegeben.
Tabelle 1: Mittelwerte (n=3) der Zellkonzentrationen (Hybridoma-Zellen) in den jeweiligen Käfigen
Versuch Zeitpunkt vital [Z/mL] tot [Z/mL]
5 x 103 Zellen/mL in 2% Methylcellulose TagO 5xl03 lxlO3 Tag 4 33 x 103 35xl03
5 xlO4 Zellen/mL in 2% Methylcellulose TagO 5xl04 l lO4 Tag 4 31,5 xlO4 16,5 x 104
5 xlO5 Zellen/mL in 2% Methylcellulose TagO 5xl05 lxlO5 Tag4 2,9 xlO5 3,8 xlO5
5 x 106 Zellen/mL in 2% Methylcellulose TagO 5xl06 1 x 106 Tag 4 3,5 x 106 1,9 xlO6
5 x 103 Zellen/mL TagO 5xl03 lxlO3 Tag 4 0 0
5 xlO4 Zellen/mL TagO 5 l04 l lO4 Tag 4 2,2 x 104 3,9 x 104
5 x 105 Zellen/mL TagO 5xl05 lxlO5 Tag 4 4,4 xlO5 4,2 xlO5
5 xlO6 Zellen/mL TagO 5 l06 l lO6 Tag 4 7,5 x 106 3,4 x 106 [0041] Diese Daten zeigen eindeutig, dass die Methylcellulose eine Reduzierung der benötigten mindest- Animpfkonzentration um den Faktor 10-100 erlaubt hat.
Figur 1 : Zellzahlen und Vitalitäten
Figur 2:
Kultursysteme (5) zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Startzelldichte im Beginn der Kultivierung in Biorektoren, in denen die
Zellen (1) von dem versorgenden Medium (4) getrennt sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Gel (2) oder ein semisolides Medium enthalten, das von einem Stützmaterial (3) gehalten wird.
Beispiel 2:
Die Herstellung der Polypeptid-(Block)-Copolymeren erfolgt folgendermaßen: 2.1.: Herstellung eines Monomers
[0042] Es werden 0,03 mol Glutaminsäure und 0,011 mol Triphosgen in 70 mL THF (Tetrahydrofuran) bei 50 °C umgesetzt.
[0043] Es bildet sich das N-Carbonsäureanhydrid von Glutaminsäure. Das Lösungsmittel wird vollständig abgezogen. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Ethylacetat. Es werden zwei Banden im fouriertransformierten IR-Spektrum bei 1750 und 1815 cm"1 gefunden, die typischen für das gebildete cyclische Anhydrid sind.
2.2.: Herstellung eines Homopolymers
[0044] Umgesetzt werden 0,01 mol des Monomers mit 0,3 mmol Triethylamin in 20 mL Tetrahydrofuran (THF) bei Raumtemperatur (RT). Die Reaktion dauert 7 Tage. Durch Zugabe von Ethylacetat wird das Polymer vollständig gefällt und gewaschen. Die gebildete Poly(L- glutaminsäure) ist wasserlöslich.
2.3.: Funktionalisierung des Polymers
[0045] In 50 mL Oxalylchlorid wird 1,0 g Poly(L-glutaminsäure) hinzugegeben. Dabei ist Oxalylchlorid gleichzeitig Lösungsmittel. Durch die Reaktion zum Säurechlorid geht das Polymer in Lösung. Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel abgezogen und das verbleibende Polymer in 50 mL THF gelöst. In die Polymerlösung wird gasförmiges Ammoniak geleitet, wobei das Polymer beginnt auszufallen. Nach zweistündiger Gaseinleitung wird der Niederschlag entnommen, mit THF gewaschen, getrocknet und in einem 10 kD Dialyseschlauch in Wasser dialysiert. Die Elemantaranalyse ergab, dass 89 mol- % des Polymers aus Poly(L-glutamin) und 11 mol-% aus Poly(L-glutaminsäure) bestehen. Die Bestimmung des Molekulargewichtes mit Hilfe der Membranosmometrie ergab ein Zahlenmittel von 53000 g/mol. In Wasser ergab sich bei 20°C eine dynamische Viskosität von 1020 mPa ' s (Millipascalsekunden).
Beispiel 3: Semisolide Medien
[0046] In einem Becherglas werden 6 ' 10 v°5 mol vom Protein Humanes Serum Albumin
(HSA) mit 8.4 ' 10"4 mol Glutardialdehyd in 10.37 mL Wasser bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach 48 Stunden wird das erstarrte Gel in einen Soxhlet-Apparat überführt und mit Wasser für 12 Stunden bei 100°C extrahiert.
[0047] Das extrahierte Gel wird mit dem 5fachen Volumen Wasser versetzt und mit einem Dispergiergerät in Gelstückchen zerkleinert. Nach lOminutiger Bearbeitung resultieren Gelstücke, die in ihrer Abmessung zwischen 10 μm und 100 μm liegen. Durch die Wahl der HSA-Konzentration, der Glutardialdehyd-Konzentration, des Dispergierwerkzeuges sowie der Bearbeitungsdauer lassen sich die Festigkeit der Gelstücke sowie deren Größe einstellen. [0048] Die Gelstücke wurden autoklaviert. In einem Zellkulturversuch wurden 900 μL des zerkleinerten Gels mit 100 μL einer Zellsuspension vermengt, die eine Konzentration von 1 1O4 Zellen/mL hatte. Die resultieren Zelldichte betrug somit 1 ' 103 Zellen/mL. [0049] 500 μL dieser Suspension werden in eine 24-Well-Zellkulturplatte gegeben. Das entspricht, einer Gelbetthöhe von ca. 3 mm. Das Zellen beinhaltende Gel in der Zellkulturplatte wird mit 500 μL frischem Medium überschichtet und bei 37°C im Brutschrank (5 Vol.-% CO2) kultiviert. Täglich wird die Zellzahl bestimmt. Mit fortschreitender Kulturdauer nimmt die Zellzahl im Gel zu (siehe Figur 3).
Beispiel 4:
[0050] Gelstücke aus HSA wurden autoklaviert. In einem Zellkulturversuch wurden 900 μL des zerkleinerten Gels mit 100 μL einer Zellsuspension vermengt, die eine Konzentration von 5 104 Zellen/mL hatte. Die resultieren Zelldichte betrug somit 5 103 Zellen/mL.
[0051] 500 μL dieser Suspension werden in eine 24-Well-Zellkulturplatte gegeben. Das entspricht einer Gelbetthöhe von ca. 3 mm. Das Zellen beinhaltende Gel in der Zellkulturplatte wird mit 500 μL frischem Medium überschichtet und bei 37°C im Brutschrank (5 Vol.-% CO2) kultiviert. Alle drei bzw. vier Tage wird das alte Medium gegen frisches Medium ausgetauscht. Aus dem Überstand des alten Mediums wird die Konzentration des Antikörpers bestimmt, der durch die Zellen im Laufe der Kultivierung produziert worden ist. [0052] Am Tag des Mediumwechsels erfolgt die Zellzählung (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2: Mittelwerte (n = 3) der Zellkonzentration bei der Kultivierung von CHO-Zellen in mikroskopischen Gelstücken aus HSA sowie die Antikörperkonzentration im Zellkultur- überstand
Bezugszeichen (Figur 2)
1 Zellen
2 Gel / semisolides Medium
3 Stützmaterial
4 versorgendes Medium
5 Kultursystem
Legende zu den Figuren
Figur 1 : Zellzahlen und Vitalitäten / Verhältnis von Zellzahlen zur Animpfdichte
Figur 2: Kultursysteme zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Startzelldichte im Beginn der Kultivierung in Biorektoren
Figur 3 : Zunahme der Zellzahl mit der Kulturdauer bei der Kultivierung von CHO-Zellen (CHO - Chinese Hamster Ovary)

Claims

Patentansprüche
1. Kultursysteme zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Startzelldichte im Beginn der Kultivierung in Bioreaktoren, in denen die Zellen von dem versorgenden Medium getrennt sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Gele vernetzte Polypeptide mit einem hohen Glutaminanteil enthalten und / oder als semisolide Medien viskose Flüssigkeiten oder Flüssigkeiten aus mikroskopisch kleinen Gelstücken.
2. Kultursysteme nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Gele oder semisolide Medien
2.1. Polypeptid-(Block)-Copolymeren und / oder
2.2. Poly(L-glutamin) oder 2.3. Alginate sowie Agar oder
2.4. als viskose Flüssigkeiten Methylcellulosen enthalten.
3. Kultursysteme nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gele oder semisoliden Medien von einem Stützmaterial gehalten werden.
4. Kultursysteme nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gele oder semisoliden Medien aus
4.1. Polypeptid-(Block)-Copolymeren, die sowohl Poly(L-glutamin) als auch Poly(L- glutaminsäure) enthalten, oder aus
4.2. HSA-Glutardialdehyd-Gelen bestehen.
5. Kultursysteme nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stützmaterialien aus Flaclimembranen, tubulären Membranen oder gewobenen Netzen bestehen.
6. Verfahren zur sterilen kontinuierlichen Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Startzelldichte im Beginn der Kultivierung in Bioreaktoren, in denen die Zellen von dem versorgenden Medium getrennt sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung durch Einbettung der Zellen in Gele oder semisolide Medien gemäß Anspruch 1, 2 und / oder 4 erfolgt, die von einem Stützmaterial gehalten werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Gele und / oder semisolide Medien
7.1. Polypeptid-(Block)-Copolymeren und / oder
7.2. Poly(L-glutamin) oder
7.3. Methylcellulosen, Alginate oder Agar oder
7.4. HSA-Glutardialdehyd-Gele eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass Polypeptid-(Block)- Copolymeren, die sowohl Poly(L-glutamin) als auch Poly(L-glutaminsäure) enthalten, dadurch gewonnen werden, dass Poly(L-glutaminsäure) in Oxalylchlorid umgesetzt und danach Ammoniak eingeleitet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass HSA-Glutardialdehyd- Gele dadurch gewonnen werden, dass Humanes Serumalbumin (HSA) mit Glutardialdehyd umgesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die HSA-Glutardialdehyd-Gele mit Wasser versetzt und mit einem Dispergiergerät zu mikroskopisch kleinen Gelstücken zerkleinert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung von Zellen mit sehr geringen Animpfdichten von < 10.000 Zellen pro Milliliter begonnen wird und in ein und dem selben Kulturraum die Kultivierung der Zellen vervielfacht wird.
12. Verwendung der Kultursysteme und / oder der Verfahren nach Anspruch 1 bis 11 zur Kultivierung von Zellen in hohen Dichten und zur Reduzierung der Startzelldichte / Animpfdichte im Beginn der Kultivierung in Biorektoren.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Gele und / oder semisolide Matrices zum Aufbau eines Mikromilieus um die einzelne Zelle und damit als Voraussetzung der Herabsetzung der Animpfdichte eingesetzt werden.
5 14. Verwendung von Gelen und semisoliden Matrices nach Anspruch 12 und 13.
15. Verwendung von Methylcellulosen nach Anspruch 12 und 13.
16. Verwendung nach Anspruch 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass Gele und / oder iö semisolide Matrices im Laufe der Kulturführung verdünnt werden und dadurch den
Kulturraum zur Besiedlung mit Zellen in hoher Dichte freigeben.
17. Verwendung nach Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Gele und / oder semisolide Matrices niedermolekulare Bestandteile als Nährstoffe für die Zellkultur
15 freisetzen.
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