EP1397519A2 - Verfahren zum spezifischen schnellnachweis bierschädlicher bakterien - Google Patents

Verfahren zum spezifischen schnellnachweis bierschädlicher bakterien

Info

Publication number
EP1397519A2
EP1397519A2 EP02762296A EP02762296A EP1397519A2 EP 1397519 A2 EP1397519 A2 EP 1397519A2 EP 02762296 A EP02762296 A EP 02762296A EP 02762296 A EP02762296 A EP 02762296A EP 1397519 A2 EP1397519 A2 EP 1397519A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
lactobacillus
bacteria
beer
seqidno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02762296A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Claudia Beimfohr
Jiri Snaidr
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vermicon AG
Original Assignee
Vermicon AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vermicon AG filed Critical Vermicon AG
Publication of EP1397519A2 publication Critical patent/EP1397519A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the invention relates to a method for the specific rapid detection of beer-damaging bacteria by in situ hybridization, oligonucleotide probes suitable for the method, and kits with which the detection method can be carried out.
  • the EU's annual beer production is around 313 million hectoliters, of which 112 million hectoliters are produced in Germany alone. With approximately 1270 breweries located here and an annual turnover of about DM 18 billion, the brewing process is one of the most important industrially used biotechnological processes in Germany ("Data from the European brewing industry 1999", Deutscher Brauer Bund, 2001, Bonn, http: //www.brauer -bund.de).
  • microbiological quality control is also of great importance.
  • microorganisms Due to the extremely selective and partly bacteriocidal effect of beer, only a very narrow spectrum of microorganisms is found in brewing systems. For persistence in the beer habitat, microorganisms must tolerate a low pH value, an anaerobic atmosphere, bitter hop substances, alcohol and a very small amount and variety of nutrients and growth agents. (W. Back, color atlas and manual of beverage biology, 1994, publisher Hans Carl, Nuremberg). Accordingly, predominantly lactic acid bacteria of the genera Lactobacillus and Pediococcus as well as representatives of the genera Pectinatus and Megasphaera are known as beer-damaging microorganisms.
  • Lactic acid bacteria are all gram-positive, non-spore-forming, catalase-negative rods and cocci. To date, nine different genera (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, Weissella and Streptococcus) are summarized under the term lactic acid bacteria. Phylogenetically, all representatives of the lactic acid bacteria are classified as members of the gram-positive bacteria with a low GC content in the DNA. (Brock, microbiology, 2001, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelb erg-B er lin).
  • Lactobacillus is used for the fermentation of cheese, yoghurt, buttermilk, sour cream, sauerkraut, meat and sausage products and other foods.
  • lactic acid bacteria are by no means only relevant in a positive sense for the food and beverage industry. Rather, some representatives of different genres play an important role as food spoilers.
  • Lactobacillus The representatives of the very heterogeneous genus Lactobacillus are described as gram-positive, non-spore-forming, homo- or heterofermentative, catalase-negative and usually immobile rods. There are currently over 50 different species in this genus, of which only a very small number are identified as harmful to beer.
  • Pediococci are characterized as gram-positive, non-spore-forming, homofermentative, catalase-negative and mainly found in tetrads. Also in this genus there are only a few species to grow in Beer and the resulting spoilage of the beer. (Brock, microbiology, 2001, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg-Berlin; general microbiology, H. Schlegel, 1992, Georg Thieme Verlag Stuttgart).
  • Lactobacillus brevis Lactobacillus buchneri, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pseudoplantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus per olens, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus frigidus, Pediococcus damnosus, Pediococcus inopinatus (W. Back, color atlas and manual of beverage biology, 1994, publisher Hans Carl, Nuremberg). Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri and Pediococcus damnosus are of particular importance in practice.
  • some gram-negative bacteria of the genera Pectinatus and Megasphaera are also known as beer spoilers.
  • the rod-shaped cells of the genus Pectinatus are described as strictly anaerobic, motile and slightly curved bacteria.
  • the spherical or slightly oval coccoid cells of the genus Megasphaera are also strictly anaerobic microorganisms. (W. Back, Color Atlas and
  • PCR the polymerase chain reaction
  • a characteristic piece of the respective bacterial genome is amplified with specific primers. If the primer finds its destination, a piece of the genetic material multiplies millions of times.
  • a qualitative evaluation can take place by means of an agarose gel that separates DNA fragments. In the simplest case, this leads to the statement that the target sites for the primers used were present in the examined sample. No further statements are possible; these target sites can originate from a living bacterium as well as from a dead bacterium or from naked DNA.
  • FISH fluorescence in situ hybridization method
  • the FISH technique is based on the fact that there are certain molecules in bacterial cells that, due to their vital function, have undergone only little mutation in the course of evolution: the 16S and the 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNA). Both are components of the ribosomes, the sites of protein biosynthesis, and due to their ubiquitous distribution, their size, and their structural and non-constancy, they can serve as specific markers (Woese, CR, 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, p. 221 -271). Based on a comparative sequence analysis, phylogenetic relationships can be established based solely on this data. To do this, this sequence data must be aligned.
  • rRNA ribosomal ribonucleic acid
  • these gene probes which are complementary to a specific region on the ribosomal target sequence, are introduced into the cell.
  • the gene probes are usually small, 16-20 base long, single-stranded deoxyribonucleic acid pieces and are directed against a target region, which is typical for a type or group of bacteria. If the fluorescence-labeled gene probe finds its target sequence in a bacterial cell, it binds to it and the cells can be detected in the fluorescence microscope due to their fluorescence.
  • the FISH analysis is always carried out on a slide, since during the evaluation the bacteria are visualized, ie made visible, by irradiation with high-energy light.
  • This is one of the disadvantages of the classic FISH analysis: since only relatively small volumes can naturally be analyzed on a slide, the sensitivity of the method can be unsatisfactory and not sufficient for a reliable analysis.
  • the present invention therefore combines the advantages of classic FISH analysis with those of cultivation. A comparatively short cultivation step ensures that the bacteria to be detected in sufficient numbers are available before the bacteria are detected using specific FISH.
  • the implementation of the method according to the invention for the specific rapid detection of beer-damaging bacteria thus comprises the following steps:
  • “cultivation” means the multiplication of the bacteria contained in the sample in a suitable cultivation medium.
  • the methods suitable for this are well known to the person skilled in the art.
  • fixing the bacteria is understood to mean a treatment with which the bacterial envelope is made permeable to nucleic acid probes. Ethanol is usually used for fixing. If the cell wall cannot be penetrated by the nucleic acid probes with these measures, the person skilled in the art will know Sufficient additional measures are known which lead to the same result, such as, for example, methanol, mixtures of alcohols, a low-percentage paraformaldehyde solution or a dilute formaldehyde solution, enzymatic treatments or the like
  • the enzymes include, for example, lysozyme, proteinase K and mutanolysin, and adequately suitable processes are known to the person skilled in the art and he will be able to easily determine which agent is particularly suitable for cell disruption depending on the bacterium.
  • the “fixed” bacteria are incubated with fluorescence-labeled nucleic acid probes for the “hybridization”.
  • These nucleic acid probes which consist of an oligonucleotide and a marker attached to it, can then penetrate the cell envelope and bind to the target sequence corresponding to the nucleic acid probe inside the cell.
  • the bond is to be understood as the formation of hydrogen bonds between complementary pieces of nucleic acid.
  • the nucleic acid probe can be complementary to a chromosomal or episomal DNA, but also to an mRNA or rRNA of the microorganism to be detected. It is advantageous to choose a nucleic acid probe that is complementary to an area that is present in the number of copies of more than 1 in the microorganism to be detected.
  • the sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1,000-50,000 times.
  • the rRNA is preferably used as the target site, since the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis are present thousands of times in each active cell.
  • the nucleic acid probe in the sense of the invention can be a DNA or RNA probe which will generally comprise between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 500, more preferably between 12 and 200, particularly preferably between 17 and 50 and between 15 and 40 and most preferably between 17 and 25 nucleotides.
  • the nucleic acid probes are selected on the basis of whether a complementary sequence is present in the microorganism to be detected. By selecting a defined sequence, a bacterial species, a bacterial genus or an entire bacterial group can be recorded. Complementarity should be at a probe of 15 Nucleotides must be given over 100% of the sequence. In the case of oligonucleotides with more than 15 nucleotides, one to more, preferably one, two or three mismatching sites are permitted.
  • nucleic probe molecules of the lengths and sequences given below are noted in the 5 '-3' direction.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention are for the detection of beer-damaging lactic acid bacteria of the genera Lactobacillus and Pediococcus, in particular of the species Pediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus per olens, Lactobacillus lactner, Lactobacillivobillillacillus, Lactobacillivobillillacillus, Lactobacillivacillusacillus Lactobacillusacillus, Lactobacillivacillusacillus Lactobacillusacillus Lactobacillusacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lacto
  • sequences SEQ ID No. 1 to 3 are particularly suitable for the detection of Lactobacillus perolens.
  • SEQ ID No. 1 to 3 illustrate preferred embodiments of the invention.
  • SEQ ID No.4 illustrate preferred embodiments of the invention.
  • SEQ ID No. 4 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus buchneri.
  • SEQ ID No. 4 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID No. 5 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus plantarum.
  • SEQ ID No. 5 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID No. 6 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus fructivorans.
  • SEQ ID No. 6 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID NO. 7 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus casei.
  • SEQ ID No. 7 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID NO. 8 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus coryniformis.
  • SEQ ID NO. 8 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID No. 9 and 10 illustrate preferred embodiments of the invention. These sequences are particularly suitable for the detection of Lactobacillus brevis.
  • SEQ ID No. 11 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus lindneri.
  • SEQ ID No. 11 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID No. 12 is particularly suitable for the detection of Pediococcus damnosus.
  • SEQ ID No. 12 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID No. 13 is particularly suitable for the detection of Lactobacillus lindneri.
  • GCT ACC CAY GCT TTC GAG SEQ ID No. 12 is suitable for the detection of the genera Pediococcus and Lactobacillus.
  • SEQ ID No. 15 is particularly suitable for the detection of bacteri of the genus Pediococcus, in particular of P. acidilactici, P. pentosaceus, P. damnosus, P. parvulus.
  • SEQ ID No. 16 is suitable for the detection of L. casei.
  • SEQ ID No. 17 is particularly suitable for the detection of L. coryniformis.
  • SEQ ID NO. 18 is particularly suitable for the detection of L. fructivorans.
  • SEQ ID No. 20 TTA CAA GAC CAG ACA GCC SEQ ID No. 19 and 20 are suitable for the detection of P. damnosus.
  • SEQ ID NO. 21 is suitable for the detection of L. brevis.
  • SEQ ID NO. 22 and 23 are suitable for the detection of L. plantarum.
  • SEQ ID No. 24 and 25 are suitable for the detection of the genera Pediococcus and Lactobacillus.
  • SEQ ID No. 26 is suitable for the detection of L. lindneri.
  • SEQ ID No. 27 is suitable for the detection of L. lindneri.
  • SEQ ID No. 27 is suitable for the detection of L. brevis.
  • the SEQ ID No. 28 to 67 are particularly suitable for the detection of P. damnosus.
  • sequences SEQ ID No.68 to 107 are suitable for the detection of L. brevis.
  • SEQ ID NO. 108 to SEQ ID No. 146 are suitable for the detection of L. lindneri.
  • SEQ ID NO.147 to 187 are suitable for the detection of L. buchneri.
  • SEQ ID No. 188 to 226 are suitable for the detection of L. casei.
  • SEQ ID NO. 227 to 265 are suitable for the detection of L. coryniformis.
  • the SEQ ID No. 266 to 304 are suitable for the detection of L. fructivorans.
  • SEQIDNo.312 AGACCATGCGGTCTCCGT
  • the SEQ ID No. 305 to 343 are suitable for the detection of Lactobacillus perolens.
  • the SEQ ID No. 344 to 356 are suitable for the detection of Lactobacillus plantarum.
  • TCC GAC ACT CCA GTC CGG SEQ H) NO. 357 and SEQ ID No. 358 are particularly suitable for the detection of Megasphaera cerevisiae.
  • SEQ ID No. 358 illustrates a preferred embodiment of the invention.
  • SEQ ID No. 359 and 360 are particularly suitable for the detection of Pectinatus cerevisuphilus.
  • SEQ ID No. 361 to 400 are particularly suitable for the detection of bacteria of the genus Pectinatus.
  • SEQ ID No. 401 to 439 are particularly suitable for the detection of Megasphaera cerevisiae.
  • SEQ ID No. 440 is particularly suitable for the detection of the genus Pectinatus.
  • SEQ ID No. 441 and 442 are particularly suitable for the detection of Pectinatus cerevisuphilus.
  • K stands for "G + T”
  • M stands for "A + C”
  • R for "A + G”
  • W for "A + T”
  • Y for "C + T”.
  • the invention also relates to modifications of the above oligonucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 442.
  • This includes in particular a) Nuclear acid molecules which (i) with one of the above oligonucleotide sequences (SEQ ID NO. 1 to SEQ ID No. 442) in at least 80%, 84%, 87% and preferably in at least 90%, 92% and most preferably match in at least 94, 96, 98% of the bases (where the
  • Sequence area of the nucleic acid molecule is to be considered, which corresponds to the sequence area of one of the above-mentioned oligonucleotides (SEQ ID No. 1 to 442), and not approximately the entire sequence of a possibly. compared to the oligonucleotides given above by one to numerous bases extended oligonucleotides) or (ii) differ from the above
  • oligonucleotide sequences by one or more deletions and / or additions and a specific hybridization with nucleic acid sequences of lactic acid bacteria of the genera Lactobacillus and Pediococcus which are harmful to beer, in particular of the species Pediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens,
  • the degree of sequence identity of a nucleic acid molecule with the probes SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 442 can be determined using standard algorithms.
  • the program for determining sequence identity is suitable here, which is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (on this page e.g. the link "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]").
  • hybridizing can be synonymous with complementary.
  • the scope of this invention also includes those oligonucleotides that hybridize with the (theoretical) counter-strand of an inventive ohgonucleotide, including the modifications according to the invention of SEQ ID No. 1 to 442.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention can be used with various hybridization solutions in the context of the detection method according to the invention.
  • Various organic solvents can be used in concentrations of 0 - 80%.
  • Compliance with stringent hybridization conditions ensures that the nucleic acid probe molecule actually hybridizes with the target sequence.
  • Moderate conditions in the sense of the invention are, for example, 0% formamide in a hybridization buffer as described below.
  • Stringent conditions For the purposes of the invention, for example, 20-80% formamide are in the hybridization buffer.
  • “specifically hybridize” means that a molecule binds preferentially to a certain nucleotide sequence under stringent conditions if this sequence is present in a complex mixture of (for example total) DNA or RNA.
  • stringent conditions stands for conditions under which a probe will preferentially hybridize to its target sequence and to a significantly lesser extent or not at all to other sequences. Stringent conditions are in part sequence-dependent and will be different under different circumstances. Longer Sequences hybridize specifically at higher temperatures.
  • stringent conditions are selected so that the temperature is about 5 ° C below the thermal melting point (T m ) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH.
  • T m is the temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe molecules complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in an equilibrium state (since the target sequences are usually in excess, 50% of the probes are occupied in equilibrium) .
  • Typical stringent e Conditions where the salt concentration is at least about 0.01 to 1.0 M sodium ion concentration (or other salt) at a pH between 7.0 and 8.3 and the temperature is at least about 30 ° C for short probes (e.g. 10-50 nucleotides).
  • a typical hybridization solution contains 0-80% formamide, preferably 20-60% formamide and particularly preferably 35% formamide and has a salt concentration of 0.1 mol / 1 - 1.5 mol / 1, preferably 0, 5 mol / 1 to 1.0 mol / 1, more preferably from 0.7 mol / 1 to 0.9 mol / 1, particularly preferably from 0.9 mol / 1, the salt preferably being sodium chloride.
  • the hybridization solution usually comprises a detergent, such as sodium dodecyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% to 0.2%, preferably in a concentration of 0.005-0.05%, more preferably 0.01-0.03% and am most preferably 0.01%.
  • a detergent such as sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES can be used to buffer the hybridization solution, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol 1, preferably 0.01 to 0.08 mol 1, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0-8.0.
  • the preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / 1 Tris-HCl, pH 8.0.
  • nucleic acid molecule enables specific detection of nucleic acid sequences from target organisms and can therefore be used reliably in the context of the invention.
  • the concentration of the probe can vary greatly depending on the marking and the number of target structures to be expected. To enable fast and efficient hybridization, the amount of probes should exceed the number of target structures by several orders of magnitude. However, with fluorescence in situ hybridization (FISH) care must be taken to ensure that an excessive amount of fluorescence-labeled hybridization probe leads to increased background fluorescence leads.
  • the amount of probe should therefore be in a range between 0.5 ng / ⁇ l and 500 ng / ⁇ l, preferably between 1.0 ng / ⁇ l and 100 ng / ⁇ l and particularly preferably 1.0–50 ng / ⁇ l.
  • the preferred concentration in the context of the method according to the invention is 1-10 ng of each nucleic acid molecule used per ⁇ l hybridization solution.
  • the volume of the hybridization solution used should be between 8 ⁇ l and 100 ml, in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention it is 40 ⁇ l.
  • the duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferably carried out for about 1.5 hours.
  • the hybridization temperature is preferably between 44 ° C. and 48 ° C., particularly preferably 46 ° C., the parameter of the hybridization temperature and the concentration of salts and detergents in the hybridization solution in
  • nucleic acid probes in particular their lengths and the degree of complementarity to the target sequence in the cell to be detected can be optimized.
  • the person skilled in the art is familiar with the relevant calculations here.
  • this washing solution can contain 0.001-0.1% of a detergent such as SDS, a concentration of 0.01% being preferred, and Tris-HCl in a concentration of 0.001-0.1 mol / 1, preferably 0.01 0.05 mol / 1, particularly preferably 0.02 mol / 1, the pH of Tris-HCl being in the range from 6.0 to 9.0, preferably from 7.0 to 8.0, particularly is preferably 8.0.
  • a detergent may be included, but is not essential.
  • the washing solution also usually contains NaCl, the concentration depending on the stringency required being from 0.003 mol / 1 to 0.9 mol 1, preferably from 0.01 mol / 1 to 0.9 mol / 1. A NaCl is particularly preferred. Concentration of 0.07 mol / 1. Furthermore, the washing solution can contain EDTA in a concentration of up to 0.01 mol 1, the concentration preferably being 0.005 mol / 1. Furthermore, the washing solution can also contain preservatives known to the person skilled in the art in suitable amounts.
  • buffer solutions are used in the washing step, which in principle can look very similar to hybridization buffers (buffered sodium chloride solution), except that the washing step is carried out in a buffer with a lower salt concentration or at a higher temperature.
  • the formamide content (which should be as low as possible due to the toxicity of the formamide) of the wash buffer can be replaced by a correspondingly lower sodium chloride content.
  • the “washing off” of the unbound nucleic acid probe molecules usually takes place at a temperature in the range from 44 ° C. to 52 ° C., preferably from 44 ° C. to 50 ° C. and particularly preferably at 46 ° C. for a period of 10-40 minutes, preferably for 15 minutes.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention are used in the so-called Fast-FISH method for the specific detection of the specified target organisms.
  • the Fast FISH method is known to the person skilled in the art and e.g. in German patent application DE 199 36 875.9 and international application WO
  • the specifically hybridized nucleic acid probe molecules can then be detected in the respective cells.
  • the prerequisite for this is that the nucleic acid probe molecule is detectable, e.g. in that the nucleic acid probe molecule is linked to a marker by covalent binding.
  • detectable markers e.g. fluorescent groups such as CY2 (available from Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3
  • nucleic acid probe molecules in such a way that at their 5 'or 3' end there is another suitable for hybridization Nucleic acid sequence is present.
  • This nucleic acid sequence in turn comprises approximately 15 to 1,000, preferably 15-50 nucleotides.
  • This second nucleic acid region can in turn be recognized by a nucleic acid probe molecule which can be detected by one of the means mentioned above.
  • Another possibility is to couple the detectable nucleic acid probe molecules with a hapten, which can then be brought into contact with an antibody that recognizes the hapten.
  • Digoxigenin can be cited as an example of such a hapten.
  • those skilled in the art are also well known.
  • the final evaluation is possible depending on the type of marking of the probe used with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, fluorometer etc.
  • Another advantage is the simultaneous detection of all relevant beer-damaging lactic acid bacteria as well as the simultaneous possible detection of gram-negative beer pests.
  • nucleic acid probe molecules used can be used to specifically detect the genus Lactobacillus as well as highly specifically the species Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus Lobiobisociacti, Lactilliobioci, Lactilli, Lactilli, Speci, Lactilli, Lactilli, Speci, Lacti, Lactilli, Lactilli, Speci Likewise, both the genus Pectinatus and the highly specific species Pectinatus fr isingensis and Pectinatus cerevisuphilus as well as additionally the species Megasphaera cerevisiae can
  • Time saving the hybridization generally takes 4 hours in the prior art, and only 1.5 hours in the method according to the invention.
  • Another advantage of the method according to the invention is that it is easy to handle. Thus, the method can easily test large quantities of samples for the presence of the bacteria mentioned.
  • the method according to the invention can be used in a variety of ways. Both clear and cloudy yeast beers can be analyzed, as well as, for example, yeast samples (pure breeding, harvesting or operating yeasts and yeast bottoms) and rinsing water.
  • Another area of application for the method according to the invention is the microbiological control of all foods, in which the detected bacteria play a role as food spoilers.
  • kits for carrying out the method according to the invention are also provided.
  • the included in these kits are also provided.
  • Hybridization arrangement is e.g. described in German patent application 100 61 655.0. The disclosure contained in this document regarding the in situ hybridization arrangement is hereby expressly incorporated by reference.
  • kits comprise, as the most important component, the respective hybridization solution with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected (referred to as the VIT solution).
  • the corresponding hybridization buffer (Solution C) and a concentrate of the corresponding washing solution (Solution D) are also included.
  • Fixation solutions Solution A and Solution B
  • an additional cell disruption solution Breaker_2
  • an embedding solution finisher
  • Finishers are commercially available, among other things they prevent the rapid fading of fluorescent probes under the fluorescence microscope. If necessary, solutions for the parallel execution of a positive control and a negative control are included.
  • a sample is appropriately cultivated for 20-44 h (e.g. NBB medium, 48 h, 28 ° C).
  • a suitable aliquot of the fixed cells (preferably 40 ⁇ l) is then applied to a slide and dried (46 ° C., 30 min or until completely dry).
  • the dried cells are then completely dehydrated by adding a further fixation solution (Solution B, absolute ethanol, preferably 40 ⁇ l).
  • Solution B absolute ethanol, preferably 40 ⁇ l
  • the slide is dried again (room temperature, 3 min or until completely dry).
  • a suitable volume of the cell disruption solution (Breaker_2, preferably 40 ⁇ l) is applied to the slide and the slide is incubated (10 min, RT).
  • the cell disruption solution is washed off by immersing the slide in a vessel filled with distilled water, preferably the VIT reactor, and the slide is then dried in a lateral position.
  • the hybridization solution (VIT solution) with the nucleic acid probe molecules which are described above and which are specific for the microorganisms to be detected in each case is then applied to the fixed, dehydrated cells.
  • the preferred volume is 40 ul.
  • the slide is then incubated in a chamber moistened with hybridization buffer (Solution C, corresponds to the hybridization solution without oligonucleotides), preferably the VIT reactor (46 ° C., 90 min).
  • the slide is then removed from the chamber, the chamber is filled with washing solution (Solution D, 1:10 diluted in distilled water) and the slide is incubated in it (46 ° C, 15 min).
  • washing solution Solution D, 1:10 diluted in distilled water
  • the chamber is then filled with distilled water, the slide is briefly immersed and then air-dried in the lateral position (46 ° C, 30 min or until completely dry).
  • the slide is then embedded in a suitable medium (finisher).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien durch in situ-Hybridisierung, für das Verfahren geeignete Oligonukleotidsonden, sowie Kits, mit denen das Nachweisverfahren durchgeführt werden kann.

Description

Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien durch in situ-Hybridisierung, für das Verfahren geeignete Oligonukleotidsonden, sowie Kits, mit denen das Nachweisverfahren durchgeführt werden kann.
Die jährliche Bierproduktion der EU liegt bei etwa 313 Millionen Hektolitern, davon werden allein 112 Millionen Hektoliter in Deutschland hergestellt. Mit ungefähr 1270 ansässigen Brauereien und einem Jahresumsatz von etwa 18 Milliarden DM ist der Brauprozess einer der wichtigsten industriell eingesetzten biotechnologischen Prozesse in Deutschland („Daten aus der Brauwirtschaft Europa 1999", Deutscher Brauer Bund, 2001 , Bonn, http://www.brauer-bund.de).
Um den hohen Anforderungen an die Qualität des Produktes Bier gerecht zu werden, ist neben der Auswahl der Rohstoffe und dem Brauvorgang selbst auch die mikrobiologische Qualitätskontrolle von sehr großer Bedeutung.
Aufgrund der äußerst selektiven und teilweise bakterioziden Wirkung des Bieres ist in Brauanlagen nur ein sehr enges Spektrum von Mikroorganismen angesiedelt. Zur Persistenz im Habitat Bier müssen Mikroorganismen ein niedrigen pH- Wert, eine anaerobe Atmosphäre, Hopfenbitterstoffe, Alkohol und eine sehr geringe Nähr- und Wuchsstoffmenge und -Vielfalt tolerieren. (W. Back, Farbatlas und Handbuch der Getränkebiologie, 1994, Verlag Hans Carl, Nürnberg). Als bierschädliche Mikroorganismen sind dementsprechend überwiegend Milchsäurebakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus sowie Vertreter der Gattungen Pectinatus und Megasphaera bekannt.
Unter dem Begriff Milchsäurebakterien werden alle gram-positiven, nicht sporenbildenden, Katalase-negativen Stäbchen und Kokken zusammengefasst. Bis dato werden neun verschiedene Gattungen (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, Weissella und Streptococcus) unter dem Begriff Milchsäurebakterien zusammengfasst. Phylogenetisch werden alle Vertreter der Milchsäurebakterien als Mitglieder der gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt der DNS eingestuft. (Brock, Mikrobiologie, 2001, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelb erg-B er lin) .
Einige dieser Gattungen sind für die Lebensmittelindustrie von großer Bedeutung. So werden Vertreter der Gattungen Lactobacillus, Lactococcus und Streptococcus zur Fermentation von Käse, Jogurt, Buttermilch, Sauerrahm, Sauerkraut, Fleisch- und Wurstprodukten und anderen Lebensmitteln eingesetzt.
Allerdings sind Milchsäurebakterien keineswegs nur im positiven Sinne relevant für die Lebensmittel- und Getränkeindustrie. Vielmehr spielen einige Vertreter verschiedener Gattungen eine wichtige Rolle als Lebensmittelverderber.
So sind z. B. einige Arten der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus für mehr als 90 % des durch mikrobielles Wachstum verursachten Bierverderbs verantwortlich. Der durch diese Organismen verursachte Produktverderb geht mit Geschmacks- und Geruchsveränderungen und in der Regel mit starker Trübung des Bieres einher.
Die Vertreter der sehr heterogenen Gattung Lactobacillus werden als gram-positive, nicht sporenbildende, homo- oder heterofermentative, Katalase-negative und gewöhnlich nicht bewegliche Stäbchen beschrieben. Zur Zeit sind in dieser Gattung über 50 verschiedene Arten vereint, von denen nur eine sehr geringe Anzahl als bierschädlich ausgewiesen ist.
Pediokokken werden als gram-positive, nicht-sporenbildende, homofermentative, Katalase-negative und hauptsächlich in Tetraden vorkommenden Kokken charakterisiert. Auch in dieser Gattung sind nur wenige Arten zum Wachstum im Bier und dem daraus resultierenden Verderb des Bieres befähigt. (Brock, Mikrobiologie, 2001, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg-Berlin; Allgemeine Mikrobiologie, H. Schlegel, 1992, Georg Thieme Verlag Stuttgart).
Die folgenden Arten unter den Milchsäurebakterien sind als potentiell bierschädlich beschrieben: Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pseudoplantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus per olens, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus frigidus, Pediococcus damnosus, Pediococcus inopinatus (W. Back, Farbatlas und Handbuch der Getränkebiologie, 1994, Verlag Hans Carl, Nürnberg). In der Praxis von Bedeutung sind vor allem Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri und Pediococcus damnosus.
Zusätzlich zu den genannten gram-positiven Milchsäurebakterien sind auch einige gram-negative Bakterien der Gattungen Pectinatus und Megasphaera als Bierverderber bekannt. Die stäbchenförmigen Zellen der Gattung Pectinatus werden als strikt anaerobe, motile und leicht gekrümmte Bakterien beschrieben. Die sphaerischen oder leicht ovalen kokkoiden Zellen der Gattung Megasphaera zählen ebenfalls zu den strikt anaeroben Mikroorganismen. (W. Back, Farbatlas und
Handbuch der Getränkebiologie, 1994, Verlag Hans Carl, Nürnberg). Während die weiter oben genannten gram-positiven Bierschädlinge als sogenannte Primär- kontaminanten im Bier selbst vorkommen, treten Kontaminationen mit Megasphaera und Pectinatus zumeist erst im Abfüllbereich direkt am Abfüller auf, weswegen die Bakterien auch als Sekundärkontaminanten bezeichnet werden.
Als bierschädliche gram-negative Bakterien wurden bislang beschrieben: Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiae (W. Back, Farbatlas und Handbuch der Getränkebiologie, 1994, Verlag Hans Carl, Nürnberg). Die Heterogenität der bierschädlichen Mikroorganismen stellt höchste Anforderungen an die mikrobiologische Qualitätskontrolle in Brauereien. Hinzu kommt das im Vergleich zur Chargengröße von bis zu 1 000 Hektolitern sehr geringe Volumen (in der Regel 250 bis 500 ml) der zur Analyse verwendeten Probe (Back, W. und Pöschl, P., Bypass-Membranfiltration [BM-System] - Verbesserung des Spurennachweises nach der Filtration. Brauwelt 138: 2312-2315).
Standardmäßig erfolgt der Nachweis bierschädlicher Bakterien bis heute durch Kultivierung. Hierfür stehen verschiedene Selektivmedien, wie NBB, VLB-S7S, UBA und MRS, zur Verfügung. Alle eingesetzten Selektivmedien sollen das Wachstum der bierschädlichen Bakterien begünstigen, wobei gleichzeitig das Wachstum der mikrobiellen Begleitflora und oder brauereispezifischer Hefekulturen durch Hemmstoffe inhibiert wird. Allen Kultivierungsverfahren ist gemeinsam, dass sie lediglich eine qualitative Aussage bezüglich der An- oder Abwesenheit von Bierschädlingen ermöglichen. Ein quantitativer Nachweis erfolgt nicht. Die traditionellen Kultivierungsverfahren sind zudem mit bis zu zwölf Tagen Kultivierungsdauer äußerst zeitaufwendig. Dies führt zu hohen indirekten Kosten durch die notwendige Lagerung des Bieres bis zum Abschluss der Qualitätskontrolle und der Freigabe der Produktionscharge.
Bei jedem positiven Ergebnis der Kultivierung wäre eine nachfolgende Charakterisierung des detektierten Bierschädlings sinnvoll. Eine solche weitergehende Bestimmung erfolgt bislang deshalb nicht, weil keine anwenderfreundlichen Methoden hierfür zur Verfügung stehen. Zur genauen Bestimmung des bierschädlichen Bakteriums müssten weitere physiologische Tests (wie Gram-Färbung, Zuckerverwertungsreihen) durchgeführt werden. Dies ist zum einen sehr zeitaufwendig, zum andern stellt die sachgerechte Durchführung dieser Analysen hohe Anforderungen an die Qualifikation des ausführenden Personals. Der Verzicht auf die genauere Analyse bedeutet zugleich aber den Verzicht auf die Vorteile, welche in einer solchen Analyse liegen. So lässt die genaue Kenntnis des Schädlings Rückschlüsse auf die mögliche Kontaminationsquelle zu und eröffnet so die Möglichkeit, durch effektive Bekämpfung des Bierschädlings weiteren Kontaminationen entgegen zu wirken. In diesem Zusammenhang ist es auch hilfreich zu wissen, ob immer der gleiche Bierschädling oder ob verschiedene Keime für den Produktverderb verantwortlich sind.
Als logische Konsequenz aus den Schwierigkeiten, welche die traditionellen Kultivierungsverfahren beim Nachweis bierschädlicher Bakterien haben, bieten sich daher Nachweisverfahren auf Nukleinsäurebasis an.
Bei der PCR, der Polymerase-Kettenreaktion, wird, nach einer Voranreicherung der Untersuchungsprobe (zumeist in NBB-Medium), mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Bakteriengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z.B. mittels eines DNA- Fragmente auftrennenden Agarose-Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine
Differenzierung ist hier nicht möglich. Dies erweist sich für die Untersuchung von Bierproben als äußerst problematisch. Im Bier selbst und in den unterschiedlichen auf Würzebasis bestehenden Selektivmedien ist ein hohe Anzahl toter, zur biologischen Säuerung eingesetzter Milchsäurebakterien enthalten. Da die PCR- Reaktion auch bei Anwesenheit solcher toten Bakterien oder deren nackter DNA positiv ausfällt, kommt es hier fast zwangsläufig zu falsch positiven Ergebnissen. Andererseits können diverse im Bier vorhandene Stoffe eine Inhibierung des DNA amplifizierenden Enzyms, der Taq-Polymerase, herbeiführen. Dies ist eine häufige Ursache falsch negativer Ergebnisse. Eine Weiterführung der PCR-Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Bakterien und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität, leichten Anwendbarkeit und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und damit falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden.
Einen einzigartigen Ansatz, die Spezifität molekularbiologischer Methoden wie der PCR zu realisieren, ohne die mit dieser Methode verbunden Nachteile in Kauf nehmen zu müssen, bietet die Methode der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH; Amann, R. I., W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143-169). Hierbei können Bakterienarten, -gattungen oder - gruppen hochspezifisch identifiziert und visualisiert werden.
Die FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen bestimmte Moleküle gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS). Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese, und können aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer Größe, und ihrer strukturellen und ninktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen (Woese, C. R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, S. 221-271). Ausgehend von einer vergleichenden Sequenzanalyse können phylogenetische Beziehungen allein aufgrund dieser Daten aufgestellt werden. Dazu müssen diese Sequenzdaten in ein Alignment gebracht werden. Im Alignment, welches sich auf Kenntnisse über die Sekundärstruktur und Tertiärstruktur dieser Makromoleküle stützt, werden die homologen Positionen der ribosomalen Nukleinsäuren in Einklang miteinander gebracht. Ausgehend von diesen Daten können phylogenetische Berechnungen durchgeführt werden. Der Einsatz modernster Computertechnologie macht es möglich, auch großangelegte Berechnungen schnell und effektiv auszufuhren, sowie große Datenbanken, welche die Alignment-Sequenzen der 16S-rRNA und 23S-rRNA beinhalten, anzulegen. Durch den schnellen Zugriff auf dieses Datenmaterial können neu erhaltene Sequenzen in kurzer Zeit phylogenetisch analysiert werden. Diese rRNA Datenbanken können dazu verwendet werden, art- und gattungsspezifische Gensonden zu konstruieren. Hierbei werden alle verfügbaren rRNA Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder -gruppe erfassen.
Bei der FISH (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung)-Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind, in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind i.d.R. kleine, 16-20 Basen lange, einzelsträngige Desoxyribonukleinsäurestücke und richten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.
Die FISH- Analyse wird grundsätzlich auf einem Objektträger durchgeführt, da bei der Auswertung die Bakterien durch Bestrahlung mit einem hochenergetischen Licht visualisiert, also sichtbar gemacht werden. Hierin liegt allerdings einer der Nachteile der klassischen FISH- Analyse: da auf einem Objektträger naturgemäß nur relative kleine Volumina analysiert werden können, kann die Sensitivität der Methode unbefriedigend und für eine verlässliche Analyse nicht ausreichend sein. Mit der vorliegenden Erfindung werden daher die Vorteile der klassischen FISH- Analyse mit denen der Kultivierung verknüpft. Durch einen vergleichsweise kurzen Kultivierungsschritt wird sichergestellt, dass die nachzuweisenden Bakterien in ausreichender Zahl vorliegen, bevor der Nachweis der Bakterien mittels spezifischer FISH durchgeführt wird.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien umfasst somit die folgenden Schritte:
- Kultivierung der in der untersuchten Probe enthaltenen Bakterien
- Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien
- Inkubation der fixierten Bakterien mit Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen - Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle und
- Detektieren der mit den Nukleinsäuresondenmolekülen hybridisierten Bakterien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Kultivieren" die Vermehrung der in der Probe enthaltenen Bakterien in einem geeigneten Kultivierungsmedium verstanden. Die hierzu geeigneten Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Fixieren" der Bakterien eine Behandlung verstanden, mit der die Bakterienhülle für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Nukleinsäuresonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung, enzymatische Behandlungen oder ähnliches. Es kann sich in einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein enzymatischer Schritt zum vollständigen Aufschluss der Bakterien anschließen. Als Enzyme sind hier beispielsweise zu nennen Lysozym, Proteinase K und Mutanolysin. Dem Fachmann sind hier ausreichend geeignete Verfahren bekannt und er wird auf einfache Weise feststellen können, welches Mittel für den Zellaufschluss je nach Bakterium besonders geeignet ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die „Hybridisierung" die fixierten Bakterien mit fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresonden inkubiert. Diese Nukleinsäuresonden, die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen, können dann die Zellhülle penetrieren und sich an die der Nukleinsäuresonde entsprechenden Zielsequenz im Zellinneren binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.
Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500 - 100.000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1.000 - 50.000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen.
Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 12 und 500, bevorzugter zwischen 12 und 200, besonders bevorzugt zwischen 17 und 50 und zwischen 15 und 40 und am meisten bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl einer definierten Sequenz, kann dadurch eine Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine ganze Bakteriengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere, vorzugsweise ein, zwei oder drei Fehlpaarungsstellen erlaubt.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens haben die erfindungsgemäßen
Nukleinsondenmoleküle die nachstehend angegebenen Längen und Sequenzen (alle Nukleinsondenmoleküle sind in 5' -3 '-Richtung notiert).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle sind für den Nachweis bierschädlicher Milchsäurebakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus, insbesondere der Spezies Pediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus per olens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis sowie für den Nachweis bierschädlicher gram-negativer Bakterien der Gattungen Pectinatus und Megasphaera, insbesondere der Spezies Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiiphilus, Megasphaera cerevisiae geeignet und werden entsprechend in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren eingsetzt.
SEQ ID No. 1 TGG TGA TGC AAG CAC CAC
SEQ ID No. 2
ATG MTG ATG CAA GCA CCA R
SEQ ID NO. 3
CAT GCG GTC TCC GTG GTT
Die Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 sind vor allem zum Nachweis von Lactobacillus perolens geeignet. SEQ ID No. 1 bis 3 stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. SEQ ID No.4
ACG CTGAGT GGC GCG GGT
SEQ ID No. 4 eignet sich vor allem zum Nachweis von Lactobacillus buchneri. SEQ ID No. 4 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
SEQ ID No. 5
GCG GGA CCATCC AAA AGT G
SEQ ID No. 5 eignet sich vor allem zum Nachweis von Lactobacillus plantarum. SEQ ID No. 5 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
SEQ ID No.6 GGC GGC AGG GTC CAAAAG
SEQ ID No. 6 eignet sich vor allem zum Nachweis von Lactobacillus fructivorans. SEQ ID No. 6 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
SEQ ID No. 7
CGT CAC GCC GAC AAC AGT
SEQ ID NO. 7 eignet sich vor allem zum Nachweis von Lactobacillus casei. SEQ ID No. 7 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
SEQ ID NO. 8
GGC GGC TAGTTC CCT AAA
SEQ ID NO. 8 eignet sich vor allem zum Nachweis von Lactobacillus coryniformis. SEQ ID NO. 8 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. SEQ ID No. 9
ACC GTC AAC CCT TGA ACA GT
SEQ ID No. 10
GAC TCC CGA AGGTTA TCT
SEQ ID No. 9 und 10 stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Diese Sequenzen eignen sich besonders für den Nachweis von Lactobacillus brevis.
SEQ ID No. 11
TCG GTC AGA TCT ATC GTC
SEQ ID No. 11 eignet sich vor allem zum Nachweis von Lactobacillus lindneri. SEQ ID No. 11 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
SEQ H) No. 12
GCT ACG TAT CAC AGC CTT
SEQ ID No. 12 eignet sich vor allem zum Nachweis von Pediococcus damnosus. SEQ ID No. 12 stellt eine bevorzugte Ausf hrungsform der Erfindung dar.
SEQ ID No. 13
GCG GCG GAC TCC GTAAAG
SEQ ID No. 13 eignet sich besonders für den Nachweis von Lactobacillus lindneri.
SEQ ID No. 14
GCT ACC CAY GCT TTC GAG SEQ ID No. 12 eignet sich für den Nachweis der Gattungen Pediococcus und Lactobacillus.
SEQ ID No. 15 CCA ATG CAC TTC TTC GGT
SEQ ID No. 15 eignet sich besonders für den Nachweis von Bakterin der Gattung Pediococcus, insbesondere von P. acidilactici, P. pentosaceus, P. damnosus, P. parvulus.
SEQ ID No. 16
GCT CGC TCC CTAAAAGGC
SEQ ID No. 16 eignet sich für den Nachweis von L. casei.
SEQ ID No. 17
ACT GCA AGC AGC TTC GGT
SEQ ID No. 17 eignet sich for allem für den Nachweis von L. coryniformis.
SEQ ID No. 18
CGC CGC GGATCC ATC CAA
SEQ ID NO. 18 eignet sich vor allem zum Nachweis von L. fructivorans.
SEQ ID No. 19
TGC TTT CGA GAC CTC AGC
SEQ ID No. 20 TTA CAA GAC CAG ACA GCC SEQ ID No. 19 und 20 eignen sich für den Nachweis von P. damnosus.
SEQ ID No.21 ACC GTC AAC CCT TGAACA GT
SEQ ID NO. 21 eignet sich für den Nachweis von L. brevis.
SEQ ID No. 22 ACG CCG CGG GAC C AT CCA
SEQ ID No. 23
AGT TCG CCA CTC ACT CAA
SEQ ID NO. 22 und 23 eignen sich für den Nachweis von L. plantarum.
SEQ ID No. 24
CGC TAC CCA TGC TTT CGK G
SEQ ID No. 25
CCA CTA CCC ATG CTT TCGAG
SEQ ID No. 24 und 25 eignen sich für den Nachweis der Gattungen Pediococcus und Lactobacillus.
SEQ ID No. 26
CAA GCA CCA GCT ATC AGT
SEQ ID No. 26 eignet sich für den Nachweis von L. lindneri. SEQ ID No. 27
ACG TCA TTC AAC GGA AGC
SEQ ID No. 27 eignet sich für den Nachweis von L. brevis.
SEQ ID No. 28
AGC TTC GAT GCA AGC ATC
SEQ ID No. 29 TACAAGACCAGACAGCCG
SEQ ID No. 30 GTTACAAGACCAGACAGC
SEQ ID No. 31
ACAAGACCAGACAGCCGC
SEQ ID No. 32
CGTCAGTTACAAGACCAG
SEQ ID No. 33 GCGTCAGTTACAAGACCA
SEQ ID No. 34 GAGACCTCAGCGTCAGTT
SEQ ID No. 35 AGCGTCAGTTACAAGACC
SEQ ID No. 36 CAAGACCAGACAGCCGCC
SEQ ID No. 37 ACCCATGCTTTCGAGACC
SEQ ID No. 38 ACGTATTACCGCGGCTCG
SEQ ID No. 39 TAAAAAAACCGCCTGCGC
SEQ ID No. 40 ATGCTTTCGAGACCTCAG
SEQ ID No. 41
CCATGCTTTCGAGACCTC
SEQ ÜD No. 42 TGCTTTCGAGACCTCAGC
SEQ ID No. 43 CATGCTTTCGAGACCTCA
SEQ ID No. 44 CCCATGCTTTCGAGACCT
SEQ ID No. 45 AGACCTCAGCGTCAGTTA
SEQ ID No. 46 CTTTCGAGACCTCAGCGT
SEQ ID No. 47 CGAGACCTCAGCGTCAGT
SEQ ID No. 48 GCTTTCGAGACCTCAGCG
SEQ ID No. 49 TCGAGACCTCAGCGTCAG
SEQ ID No. 50 TTTCGAGACCTCAGCGTC
SEQ ID No. 51
TTCGAGACCTCAGCGTCA
SEQ ID No. 52 TACGTATTACCGCGGCTC
SEQ ID No. 53 AAAAAAACCGCCTGCGCT
SEQ ID No. 54 GCTTCGATGCAAGCATCT
SEQ ID No. 55 CAGCTTCGATGCAAGCAT
SEQ ID No. 56 ATCAGCTTCGATGCAAGC
SEQ ID No. 57 TCAGCTTCGATGCAAGCA
SEQ ID No. 58 CAGCGTCAGTTACAAGAC
SEQ ID NO. 59 AAGACCAGACAGCCGCCT
SEQ ID No. 60 TACCCATGCTTTCGAGAC
SEQ ID No. 61
TAGCTCCCGAAGGTTACT
SEQ ID No. 62
CGAAGGTTACTCCACCGG
SEQ ID No. 63 CCGAAGGTTACTCCACCG
SEQ ID NO. 64 GCTCCCGAAGGTTACTCC
SEQ ID NO. 65 CCCGAAGGTTACTCCACC
SEQ ID No. 66 TCCCGAAGGTTACTCCAC
SEQ ID No. 67 CTCCCGAAGGTTACTCCA
Die SEQ ID No. 28 bis 67 eignen sich vor allem für den Nachweis von P. damnosus.
SEQ ID No. 68 CCGTCAACCCTTGAACAG
SEQ ID No. 69 CATTCAACGGAAGCTCGT
SEQ ID NO. 70 ACCGTCAACCCTTGAACA
SEQ ID No. 71 CTTAGCCTCACGACTTCG
SEQ ID NO. 72
TACCGTCAACCCTTGAAC
SEQ ID No. 73
AACGGAAGCTCGTTCGAC
SEQ ID No. 74 TTAGCCTCACGACTTCGC
SEQ ID NO. 75 GCAAGCACGTCATTCAAC SEQ ID No. 76 TCGCCACTCGCTTCATTG
SEQ ID No. 77 TCAACGGAAGCTCGTTCG
SEQ ID No. 78 TTCAACGGAAGCTCGTTC
SEQ ID No. 79 CAAGCACGTCATTCAACG
SEQ ID No. 80 CACGTCATTCAACGGAAG
SEQ ID No. 81 TCATTCAACGGAAGCTCG
SEQ ID No. 82
TGACTCCCGAAGGTTATC
SEQ ID No. 83
CGTCATTCAACGGAAGCT
SEQ ID No. 84 GCTTAGCCTCACGACTTC
SEQ ID No. 85 TTCGCCACTCGCTTCATT SEQ ID No. 86 GTCATTCAACGGAAGCTC
SEQ JX> No. 87 CCTGCTTCTGGGCAGATT
SEQ ID No. 88 CTGCTTCTGGGCAGATTT
SEQ ID No. 89 GCACGTCATTCAACGGAA
SEQ JX> No. 90 CAACGGAAGCTCGTTCGA
SEQ ID No. 91 ACGGAAGCTCGTTCGACT
SEQ ÜJ No. 92
AGCACGTCATTCAACGGA
SEQ ID NO. 93 TCTGGGCAGATTTCCCAC
SEQ ID NO. 94 CGGAAGCTCGTTCGACTT
SEQ ID NO. 95 AAGCACGTCATTCAACGG SEQ ID No.96 GTTCGCCACTCGCTTCAT
SEQ ID No.97 CCCTGCTTCTGGGCAGAT
SEQ ID No.98 CTGACTCCCGAAGGTTAT
SEQ ID No.99 TGCTTCTGGGCAGATTTC
SEQIDNo.100 TTCTGGGCAGATTTCCCA
SEQ ID No.101 ACTCCCGAAGGTTATCTC
SEQIDNo.102
CTTCTGGGCAGATTTCCC
SEQ ID No.103 CTGGGCAGATTTCCCACG
SEQIDNo.104 ACTAATACGCCGCGGGAT
SEQIDNo.105 GTGCAAGCACGTCATTCA SEQIDNo.106 ACGGCTGACTCCCGAAGG
SEQIDNo.107
TTAGACGGCTGACTCCCG
Die Sequenzen SEQ ID No.68 bis 107 sind für den Nachweis von L. brevis geeignet.
SEQIDNo.108 GTCACACCGTGAGCAGTT
SEQIDNo.109 CGTCACACCGTGAGCAGT
SEQIDNo.110 CCACTCGGTCAGATCTAT
SEQIDNo.111
GATGCAAGCACCAGCTAT
SEQIDNo.112 TCGGTCAGATCTATCGTC
SEQIDNo.113 CGGTCAGATCTATCGTCA
SEQIDNo.114 CTCGGTCAGATCTATCGT SEQIDNo.115 TCACACCGTGAGCAGTTG
SEQIDNo.116
CCGTCACACCGTGAGCAG
SEQIDNo.117 CTGATGCAAGCACCAGCT
SEQIDNo.118 CGGCGGACTCCGTAAAGG
SEQIDNo.119 GCTGATGCAAGCACCAGC
SEQ ID NO.120 ACCGTCACACCGTGAGCA
SEQIDNo.121
CAGATGCAGACCAGACAG
SEQ ID No.122 TGATGCAAGCACCAGCTA
SEQ ID No.123 AGTTAGGAGACCTCGTTC
SEQ ID No.124 GGCGGACTCCGTAAAGGT SEQ ID No.125 GTTAGGAGACCTCGTTCG
SEQ ID No.126 AGTTGCTCTCACGGTCGT
SEQ ID No.127 GCACCAGCTATCAGTTAG
SEQ ID No.128 TACCGTCACACCGTGAGC
SEQ ID NO.129 AGATACCGTCACACCGTG
SEQIDNo.130 TAGATACCGTCACACCGT
SEQIDNo.131
TGCTCTCACGGTCGTTCT
SEQIDNo.132 ACCATGTGGTTCTCGTTG
SEQ ID No.133 ATGCAAGCACCAGCTATC
SEQIDNo.134 GGCGGCGGACTCCGTAAA SEQIDNo.135 AGGCGGCGGACTCCGTAA
SEQ ID No.136 CACACCGTGAGCAGTTGC
SEQIDNo.137 TTAGATACCGTCACACCG
SEQ ID No.138 GAACCATGTGGTTCTCGT
SEQIDNo.139 GCTCTCACGGTCGTTCTT
SEQIDNo.140 CACCAGCTATCAGTTAGG
SEQ ID No.141
GCCACTCGGTCAGATCTA
SEQ ID No.142 GATACCGTCACACCGTGA
SEQ ID No.143 TCAGATGCAGACCAGACA
SEQIDNo.144 TAGGCGGCGGACTCCGTA SEQ ID No.145 CCATGTGGTTCTCGTTGT
SEQ ID No.146
CAAGCACCAGCTATCAGT
SEQ ID NO. 108 bis SEQ ID No. 146 sind für den Nachweis von L. lindneri geeignet.
SEQ ID No. 147 CGCTGAGTGGCGCGGGTT
SEQ ID No. 148 CCGGATTCCGACGACGTT
SEQ ID No. 149 CGCCAACCTTCCCAGATT
SEQ ID No. 150
ACGACGTTTCACGTGTGT
SEQ ID No. 151 CGACGACGTTTCACGTGT
SEQ ID No. 152 CAAGTCCACAGTCTCGGT
SEQ ID No. 153 CTACCCAGCGGTGGCGGT SEQIDNo.154 AACCTGGCATGTTACCGT
SEQIDNo.155
GCGCACAGCACCCCTTCT
SEQIDNo.156 ACCAGTCCTTAACGGTCT
SEQIDNo.157 AGGTCAAGTCCACAGTCT
SEQIDNo.158 TTCCCCACGTCTACCTCT
SEQIDNo.159 TCCACTCCCAACCTATCT
SEQIDNo.160
GGGCTTCATTTCTGGGCT
SEQ ID No.161 GATTCTACGTCCGAGGCT
SEQ ID No.162 TGCACAACTTAGCCTCCT
SEQ ID No.163 CTTGCGCACAGCACCCCT SEQIDNo.164 AGTTCCCCACGTCTACCT
SEQIDNo.165
GCTCCGGCTTTTAAACCT
SEQIDNo.166 AGCCTCCCCAGGAAACCT
SEQ ID No.167 GTTGGTTGCTTCCCTACT
SEQIDNo.168 GGCGGTGGCGGCGCAACT
SEQIDNo.169 CCCCACGTCTACCTCTAT
SEQIDNo.170
CTTCCACTCCCAACCTAT
SEQIDNo.171 TCGCCAACCTTCCCAGAT
SEQIDNo.172 TTGGTCCGCTCCGTACAT
SEQIDNo.173 GCTGTGTCAACACCCAAT SEQIDNo.174 GCCAACCTTCCCAGATTG
SEQIDNo.175 GACGACGTTTCACGTGTG
SEQIDNo.176 TACCCAGCGGTGGCGGTG
SEQIDNo.177 GCACAACTTAGCCTCCTG
SEQIDNo.178 GCGGTGGCGGCGCAACTG
SEQIDNo.179 ACCCAGCGGTGGCGGTGG
SEQIDNo.180
CGGTGGCGGCGCAACTGG
SEQIDNo.181 TTGATTTCACCTACGGGG
SEQIDNo.182 CACGCTGAGTGGCGCGGG
SEQIDNo.183 AGGATCCTGAACTGAGGG SEQIDNo.184 TCAAGTCCACAGTCTCGG
SEQIDNo.185
CAGCGGTGGCGGTGGCGG
SEQIDNo.186 CCACGCTGAGTGGCGCGG
SEQIDNo.187 TCCATACGGTACCACCGG
SEQ ID NO.147 bis 187 sind für den Nachweis von L. buchneri geeignet.
SEQIDNo.188 CCGTCACGCCGACAACAG
SEQIDNo.189 ACCGTCACGCCGACAACA
SEQ ID NO.190 ATACCGTCACGCCGACAA
SEQIDNo.191
TACCGTCACGCCGACAAC
SEQIDNo.192 GATACCGTCACGCCGACA SEQ ID No.193 GGATACCGTCACGCCGAC
SEQ ID No.194 ACGCCGACAACAGTTACT
SEQ ID No.195 GGCTCGCTCCCTAAAAGG
SEQIDNo.196
CTCTGCCGACCATTCTTC
SEQIDNo.197 CTGCCGACCATTCTTCTC
SEQIDNo.198 CGCCGACAACAGTTACTC
SEQIDNo.199 CACGCCGACAACAGTTAC
SEQ H> No.200 TCACGCCGACAACAGTTA
SEQ ID No.201
TCTGCCGACCATTCTTCT
SEQ ID No.202 ACAACAGTTACTCTGCCG SEQ ID No. 203 CGGCTCGCTCCCTAAAAG
SEQ ID No. 204 GACAACAGTTACTCTGCC
SEQ ID No. 205 ACGGCTCGCTCCCTAAAA
SEQ ID No. 206
CGACAACAGTTACTCTGC
SEQ H) NO. 207 CCGACAACAGTTACTCTG
SEQ ID No. 208 ACTCTGCCGACCATTCTT
SEQ ID No. 209 CTCGCTCCCTAAAAGGGT
SEQ ID No. 210 TGCCGACCATTCTTCTCC
SEQ ID No. 211
GCCGACCATTCTTCTCCA
SEQ ID No. 212 CGCCATCTTTCAGCCAAG SEQIDNo.213 GACGGCTCGCTCCCTAAA
SEQ ID No.214 CGACCATTCTTCTCCAAC
SEQIDNo.215 GTCACGCCGACAACAGTT
SEQIDNo.216
CCTGATCTCTCAGGTGAT
SEQIDNo.217 AACAGTTACTCTGCCGAC
SEQIDNo.218 TACTCTGCCGACCATTCT
SEQIDNo.219 CCGACCATTCTTCTCCAA
SEQ ID No.220 GCCGACAACAGTTACTCT
SEQIDNo.221
TTACTCTGCCGACCATTC
SEQ ID No.222 TCCCTAAAAGGGTTACGC SEQ ID No. 223 CAACAGTTACTCTGCCGA
SEQ ID No. 224 AGACGGCTCGCTCCCTAA
SEQ ID No. 225 ACGCCATCTTTCAGCCAA
SEQ ID No. 226
AACCTGATCTCTCAGGTG
SEQ ID No. 188 bis 226 sind für den Nachweis von L. casei geeignet.
SEQ ID No. 227
ACTGCAAGCAGCTTCGGT
SEQ ID No. 228 CGTCCACTGCAAGCAGCT
SEQ DO No. 229 GTCAATCAACGTCCACTG
SEQ ID No. 230 CACTGCAAGCAGCTTCGG
SEQ ID No. 231 GTCTGAATGGTTATGCGG
SEQ ID No. 232 TCGACGTCAGTGCGTTCG
SEQ ID No. 233 CCACTGCAAGCAGCTTCG
SEQ ID No. 234 TGCAAGCAGCTTCGGTCG
SEQ ID No. 235 AAGCAGCTTCGGTCGACG
SEQ ÜD No. 236 AACGTCCACTGCAAGCAG
SEQ ID No. 237
GTCGACGTCAGTGCGTTC
SEQ ID No. 238 TCCACTGCAAGCAGCTTC
SEQ ID No. 239 GCAGCTTCGGTCGACGTC
SEQ ID No. 240 TCAATCAACGTCCACTGC
SEQ ID No. 241 ACGTCCACTGCAAGCAGC
SEQ ID NO. 242 TCAACGTCCACTGCAAGC
SEQ ID NO. 243 CAAGCAGCTTCGGTCGAC
SEQ ID No. 244 CGACGTCAGTGCGTTCGA
SEQ ID NO. 245 GCAAGCAGCTTCGGTCGA
SEQ ID No. 246 CAGCTTCGGTCGACGTCA
SEQ ID No. 247
CAATCAACGTCCACTGCA
SEQ ID NO. 248 CAACGTCCACTGCAAGCA
SEQ ID No. 249 GACGTCAGTGCGTTCGAC
SEQ ID No. 250 GTCCACTGCAAGCAGCTT
SEQ ID No. 251 ATCAACGTCCACTGCAAG
SEQ ID NO. 252 CCGTCAAAGGACTAACAG
SEQ ID No. 253 GGTCTGAATGGTTATGCG
SEQ ID No. 254 CGTCAATCAACGTCCACT
SEQ ID No. 255 CAGTTACTCTAGTCCCTG
SEQ ID No. 256 AGCTTCGGTCGACGTCAG
SEQ ID No. 257
CTGCAAGCAGCTTCGGTC
SEQ ID NO. 258 CTAGTCCCTGTTCTTCTC
SEQ ID No. 259 GGATACCGTCAAAGGACT
SEQ ID NO. 260 AGCAGCTTCGGTCGACGT
SEQ ID No. 261 ACGTCAATCAACGTCCAC
SEQ ID No. 262 GCTTCGGTCGACGTCAGT
SEQ ID NO. 263 ACGTCAGTGCGTTCGACT
SEQ ID NO. 264 ACCATGTGGTCTGAATGG
SEQ ID No. 265 TCCCTAAAAGGGTTACCC
SEQ ID NO. 227 bis 265 sind für den Nachweis von L. coryniformis geeignet.
SEQ ID No. 266 CTATCATTAGGCGCAGCT
ACTATCATTAGGCGCAGC
SEQ ID No. 268
GGCGCAGCTCGTTCGACT
SEQ ID No. 269 GCGGCAGGCTCCAAAAGG
SEQ ÜD No. 270 ATTAGGCGCAGCTCGTTC
SEQ ID No. 271 ATCATTAGGCGCAGCTCG SEQ ID No. 272 AGGCGCAGCTCGTTCGAC
SEQ ID No. 273 CGGCAGGCTCCAAAAGGT
SEQ ID No. 274 TCATTAGGCGCAGCTCGT
SEQ ID No. 275 GCGCAGCTCGTTCGACTT
SEQ ID No. 276 TTAGGCGCAGCTCGTTCG
SEQ ID No. 277 GGCAGGCTCCAAAAGGTT
SEQ ID No. 278
TATCATTAGGCGCAGCTC
SEQ ID No. 279 GCAGGCTCCAAAAGGTTA
SEQ ID No. 280 CGCAGCTCGTTCGACTTG
SEQ ID No. 281 CATTAGGCGCAGCTCGTT SEQ ID No. 282 TAGGCGCAGCTCGTTCGA
SEQ ID NO. 283
TAGATACCGTCGCGACGT
SEQ ID No. 284 TTAGATACCGTCGCGACG
SEQ ID NO. 285 ATACCGTCGCGACGTGAG
SEQ ID No. 286 TACCGTCGCGACGTGAGC
SEQ ID NO. 287 GTTAGATACCGTCGCGAC
SEQ ID No. 288
GATACCGTCGCGACGTGA
SEQ ID No. 289 ACCGTCGCGACGTGAGCA
SEQ ID No. 290 CAGGCTCCAAAAGGTTAC
SEQ ID No. 291 CACGCCCGTTCTTCTCTA SEQ ID No. 292 GCGACGTGAGCAGTTACT
SEQ ID No. 293 CGCGACGTGAGCAGTTAC
SEQ ID No. 294 GCACAAAGGCCATCTTTC
SEQ ID No. 295 AGGCGGCAGGCTCCAAAA
SEQ ID No. 296 AGTTACTCTCACGCCCGT
SEQ ID No. 297 GATAGCACAAAGGCCATC
SEQ ID No. 298
TCGCGACGTGAGCAGTTA
SEQ ID No. 299 CCACCTTAGGCGGCAGGC
SEQ ID NO. 300 ACCTTAGGCGGCAGGCTC
SEQ ID No. 301 TAGGCGGCAGGCTCCAAA SEQ ID No. 302 GCAGTTACTCTCACGCCC
SEQ ID No. 303
CGACGTGAGCAGTTACTC
SEQ ID No. 304 CAGTTACTCTCACGCCCG
Die SEQ ID No. 266 bis 304 sind für den Nachweis von L. fructivorans geeignet.
SEQ ID No.305 CCATGCGGTCTCCGTGGT
SEQ IDNo.306 CATGCGGTCTCCGTGGTT
SEQ ID No.307 TGCGGTCTCCGTGGTTAT
SEQ ID No.308 GACCATGCGGTCTCCGTG
SEQ ID No.309
GGTGATGCAAGCACCACC
SEQ ID No. 310 CATCTTTTACCCGGAGAC SEQIDNo.311 ATGCGGTCTCCGTGGTTA
SEQIDNo.312 AGACCATGCGGTCTCCGT
SEQIDNo.313 GTGATGCAAGCACCACCG
SEQIDNo.314
ATTGGTGATGCAAGCACC
SEQIDNo.315 TGATGCAAGCACCACCGC
SEQIDNo.316 : ACCATGCGGTCTCCGTGG
SEQIDNo.317 TTGGTGATGCAAGCACCA
SEQIDNo.318 CTTTTACCCGGAGACCAT
SEQIDNo.319
ATCTTTTACCCGGAGACC
SEQ ID No.320 TTACCCGGAGACCATGCG SEQ ID No. 321 TCTTTTACCCGGAGACCA
SEQ ID No. 322 GGTCTCCGTGGTTATACG
SEQ ID No. 323 GATGCAAGCACCACCGCA
SEQ ID No. 324
GAGACCATGCGGTCTCCG
SEQ ID No. 325 CGGTCTCCGTGGTTATAC
SEQ ID No. 326 TTTACCCGGAGACCATGC
SEQ ID No. 327 TGCAAGCACCACCGCAAA
SEQ ID No. 328 GGAGACCATGCGGTCTCC
SEQ ID No. 329
GCAAGCACCACCGCAAAC
SEQ ID No. 330 TTTTACCCGGAGACCATG SEQ ID No. 331 AGCACCACCGCAAACTGA
SEQ ID No. 332 AAGCACCACCGCAAACTG
SEQ ID No. 333 CCATCTTTTACCCGGAGA
SEQ ID No. 334
ATGCAAGCACCACCGCAA
SEQ ID No. 335 GTCTCCGTGGTTATACGG
SEQ ID No. 336 GCGGTCTCCGTGGTTATA
SEQ ID No. 337 CAAGCACCACCGCAAACT
SEQ H No. 338 TCTCCGTGGTTATACGGT
SEQ ID No. 339
CTCCGTGGTTATACGGTA
SEQ ID No. 340 GCCATCTTTTACCCGGAG SEQ ID NO. 341 CGCCATCTTTTACCCGGA
SEQ ID No. 342 CAGCTGATCTCTCAGCCT
SEQ ID No. 343 CGCAAACTGACCAAACCT
Die SEQ ID No. 305 bis 343 eignen sich für den Nachweis von Lactobacillus perolens.
SEQ ID No. 344 AAGCTCGGACCATGCGGT
SEQ ID No. 345 CTTTCAAGCTCGGACCAT
SEQ ID NO. 346 TTTCAAGCTCGGACCATG
SEQ ID NO. 347 GCCATCTTTCAAGCTCGG
SEQ ID NO. 348
CAAGCTCGGACCATGCGG
SEQ ID No. 349 AGCCATCTTTCAAGCTCG SEQ ID No. 350 TCAAGCTCGGACCATGCG
SEQ ID No. 351 AGCTCGGACCATGCGGTC
SEQ ID No. 352 TTCAAGCTCGGACCATGC
SEQ ID No. 353
CGAAGCCATCTTTCAAGC
SEQ ID No. 354 GCTCGGACCATGCGGTCC
SEQ ID No. 355 ATCTTTCAAGCTCGGACC
SEQ U> No. 356 CATCTTTCAAGCTCGGAC
Die SEQ ID No. 344 bis 356 eignen sich für den Nachweis von Lactobacillus plantarum.
SEQ ID No. 357
CAT GCG GCC TTT AGA TCG
SEQ ID No. 358
TCC GAC ACT CCA GTC CGG SEQ H) NO. 357 und SEQ ID No. 358 sind besonders für den Nachweis von Megasphaera cerevisiae geeignet. SEQ ID No. 358 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
SEQ ID No. 359
ATA GTG CCG TTC GTC CCC
SEQ ID No. 360
TTGCTC CGG CAC AGAAAG
SEQ ID No. 359 und 360 sind für den Nachweis von Pectinatus cerevisuphilus besonders geeignet.
SEQ ÜD No. 361 GCC CCT TAG CCG GCT TCG GG
SEQ ID No. 362 GCGGCCCTTAGCCGGCTT
SEQ ID No. 363
TGCGGCCCTTAGCCGGCT
SEQ ID No. 364 CCTTGCGGCCCTTAGCCG
SEQ ID No. 365 CGGCCCTTAGCCGGCTTC
SEQ ID No. 366 TTGCGGCCCTTAGCCGGC SEQ ED No. 367 TGCGCCGTTACCGTCACC
SEQ ID No. 368
GGCCCTTAGCCGGCTTCG
SEQ ID No.369 GCGCCGTTACCGTCACCA
SEQ ID No.370 CGCACTTTTAAGATCCGC
SEQ ID No.371 GTGCGCCGTTACCGTCAC
SEQ ID No.372 CGCCGTTACCGTCACCAA
SEQ ID No.373
AGACGGTCGGTGCCTTGC
SEQ ID No. 374 GCCCTTAGCCGGCTTCGG
SEQ ID No. 375 GGTGCGCCGTTACCGTCA
SEQ ID NO. 376 GACGGTCGGTGCCTTGCG SEQ ID No. 377 TGCCTTGCGGCCCTTAGC
SEQ ID No. 378
GCCTTGCGGCCCTTAGCC
SEQ ID No. 379 TGACCTGCGATTAGTAGC
SEQ ID No. 380 CTTGCGGCCCTTAGCCGG
SEQ ID No. 381 TGGTGCGCCGTTACCGTC
SEQ ID NO. 382 GACCTGCGATTAGTAGCG
SEQ ID No. 383
CCTTAGCCGGCTTCGGGT
SEQ ID No. 384 CCGCACTTTTAAGATCCG
SEQ ID No. 385 CTGACCTGCGATTAGTAG
SEQ ID No. 386 GTGCCTTGCGGCCCTTAG SEQ ID No. 387 ACGGTCGGTGCCTTGCGG
SEQ ID No. 388
TACTGCCATTCGTCCCCT
SEQ ID No. 389 GACCAGTTCGAATCCCAT
SEQ ID No. 390 CCTCAGTTCGGACCCCAT
SEQ ID No. 391 ACTGCCATTCGTCCCCTG
SEQ ID No. 392 TTCGGACCCCATCACGGG
SEQ ID No. 393
GTTCGGACCCCATCACGG
SEQ ID No.394 AGTTCGAATCCCATCACG
SEQ ID No.395 ACCAGTTCGAATCCCATC
SEQ ID NO.396 CTCAGTTCGGACCCCATC SEQ ID No. 397 CTGCCATTCGTCCCCTGC
SEQ ID No. 398
ATCCGCTTAATGTTCCGC
SEQ ID No. 399 AAGCGACAGCTAAAAGCC
SEQ ID No. 400 ATGACCAGTTCGAATCCC
SEQ ID No. 361 bis 400 sind für den Nachweis von Bakterien der Gattung Pectinatus besonders geeignet.
SEQ ID No. 401 TCCAGGATCGGCTCCTTT
SEQ ID No. 402
CTCCAGGATCGGCTCCTT
SEQ ID No. 403 TCAGACGCAAACCCCTCT
SEQ ID NO. 404 GCTCCAGGATCGGCTCCT
SEQ ID No. 405 CTCTTCCGGCGATAGACT SEQ ID No.406 GCGGCCTTTAGATCGTAT
SEQ ID No.407
CTTCCGGCGATAGACTAT
SEQ ID No.408 CACGGCGTATGGGTATTG
SEQ ID No.409 GGTTTGCTCCAGGATCGG
SEQIDNo.410 CGCAAACCCCTCTTCCGG
SEQIDNo.411 GGGTTTGCTCCAGGATCG
SEQ ID No.412
TACGGTACCGTCACGGCG
SEQIDNo.413 ACGCAAACCCCTCTTCCG
SEQ ID No.414 CGGCGATAGACTATTCAG
SEQIDNo.415 GACACTCCAGTCCGGCAG SEQ ID No. 416 CCAGGATCGGCTCCTTTC
SEQ ID No. 417 AGACGCAAACCCCTCTTC
SEQ ID No. 418 TCCGGCGATAGACTATTC
SEQ ID No. 419 ATCAGACGCAAACCCCTC
SEQ ID No. 420 GTTTGCTCCAGGATCGGC
SEQ ID No. 421 GCAAACCCCTCTTCCGGC
SEQ ID NO. 422
CCGACACTCCAGTCCGGC
SEQ ID No. 423 CCTCTTCCGGCGATAGAC
TCTTCCGGCGATAGACTA
SEQ ID NO. 425 ACGGCGTATGGGTATTGA SEQ ID No. 426 CCGGCGATAGACTATTCA
SEQ ID No. 427
CGACACTCCAGTCCGGCA
SEQ ID No. 428 TCCGGCAGTTTCAATCCC
SEQ ID No. 429 TGCTCCAGGATCGGCTCC
SEQ ID No. 430 ATGCGGCCTTTAGATCGT
SEQ ID No. 431 ATCCCTGGCACTCAATGT
SEQ ID No. 432
AATCAGACGCAAACCCCT
SEQ ID No. 433 CAAACCCCTCTTCCGGCG
SEQ ID No. 434 TCATGCGGCCTTTAGATC
SEQ ID No. 435 GACGCAAACCCCTCTTCC SEQ ID No. 436 TGCGGCCTTTAGATCGTA
SEQ ÜJ No. 437
TCTCTATCCCTGGCACTC
SEQ ID NO. 438 GGCTCCTTTCGCTTCCCT
SEQ ID No. 439 CAGGATCGGCTCCTTTCG
SEQ ID No. 401 bis 439 sind für den Nachweis von Megasphaera cerevisiae besonders geeignet.
SEQ ID No. 440
CCG CAC TTT TAA GAT CCG
SEQ ID No. 440 ist für den Nachweis der Gattung Pectinatus besonders geeignet.
SEQ ID No. 441
GAT CCG CTT AGT CAT CCG
SEQ ID No.442
CTA CTG CCATTC GTC CCC
SEQ ID No. 441 und 442 sind für den Nachweis von Pectinatus cerevisuphilus besonders geeignet. In den Sequenzen steht K für „G+T", M für „A+C", R für „A+G", W für „A+T" und Y für „C+T".
Gegenstand der Erfindung sind auch Abwandlungen der obigen Oligonukleotidsequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 442. Hierunter fallen insbesondere a) Nuklemsäuremoleküle, die (i) mit einer der obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID No. 442) in mindestens 80 %, 84 %, 87 % und bevorzugt in mindestens 90 %, 92 % und am meisten bevorzugt in mindestens 94, 96, 98 % der Basen übereinstimmen (wobei der
Sequenzbereich des Nukleinsäuremoleküls zu betrachten ist, der dem Sequenzbereich eines der oben angegebenen Oligonukleotide (SEQ ID No. 1 bis 442) entspricht, und nicht etwa die gesamte Sequenz eines u.U. im Vergleich zu den oben angegebenen Oligonukleotiden um eine bis zahlreiche Basen verlängerten Oligonukleotids) oder (ii) sich von obigen
Oligonukleotidsequenzen durch eine oder mehrere Deletionen und/oder Additionen unterscheiden und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von bierschädlichen Milchsäurebakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus, insbesondere der Spezies Pediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens,
Lactobacillus buchneri Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis bzw. von bierschädlichen gram-negativen Bakterien der Gattungen Pectinatus und Megasphaera, insbesondere der Spezies Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisuphilus, Megasphaera cerevisiae ermöglichen. Dabei bedeutet
„spezifische Hybridisierung", daß unter den hier beschriebenen oder den dem Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit in situ-Hybridisierungs- techniken bekannten Hybridisierungsbedingungen nur die ribosomale RNA der Ziel-Organismen, nicht aber die rRNA von Nicht-Ziel-Organismen an das Oligonukleotid bindet. b) Nuklemsäuremoleküle, die mit einer Sequenz, die zu einem Oligonukleotid unter a) oder einer der Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 442 komplementär ist, unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisieren, c) Nuklemsäuremoleküle, die eine Oligonukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 bis 442 oder die Sequenz eines Ohgonukleotids nach a) oder b) umfassen und zusätzlich zu den genannten Sequenzen bzw. deren Abwandlungen nach a) oder b) mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Zielorganismen ermöglichen.
Der Grad der Sequenzidentität eines Nukleinsäuremoleküls mit den Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 442 kann mit üblichen Algorithmen bestimmt werden. Geeignet ist hier beispielsweise das Programm zur Bestimmung der Sequenzidentität, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (auf diese Seite z.B. der Link „Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]") zugänglich ist.
„Hybridisieren" kann im Rahmen dieser Erfindung gleichbedeutend sein mit komplementär. Im Rahmen dieser Erfindung sind auch solche Oligonukleotide umfasst, die mit dem (theoretischen) Gegenstrang eines erfindungsgemäßen Ohgonukleotids, einschließlich der erfindungsgemäßen Abwandlungen der SEQ ID No. 1 bis 442, hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle können im Rahmen des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden. Verschiedene organische Lösungsmittel können hierbei in Konzentrationen von 0 - 80 % eingesetzt werden. Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, dass das Nukleinsäuresondenmolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z.B. 0% Formamid in einem Hybridisierungspuffer wie er nachfolgend beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80% Formamid im Hybridi- sierungspuffer.
Darüber hinaus können stringente Hybridisierungsbedingungen natürlich auch der Literatur und Standardwerken entnommen werden (wie z.B. dem Manual von
Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Allgemein bedeutet "spezifisch hybridisieren", dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z.B. Gesamt-) DNA oder RNA vorliegt. Der Begriff „stringente Bedingungen" steht für Bedingungen, unter denen eine Sonde präferenziell an ihre Zielsequenz hybridisieren wird, und zu einem deutlich geringeren Ausmaß oder überhaupt nicht an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind z.T. Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5 °C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Sondenmoleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. (Da die Targetsequenzen in der Regel im Überschuss vorliegen, sind im Gleichgewicht 50% der Sonden besetzt). Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionen- Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 beträgt und die Temperature mindestens ungefähr 30 °C für kurze Sonden (also z.B. 10-50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen, wie oben bereits erwähnt, durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält eine typische Hybridisierungslösung 0-80%» Formamid, bevorzugt 20-60% Formamid und besonders bevorzugt 35 % Formamid und hat eine Salzkonzentration von 0,1 mol/1 - 1,5 mol/1, bevorzugt 0,5 mol/1 bis 1,0 mol/1, bevorzugter von 0,7 mol/1 - 0,9 mol/1, besonders bevorzugt von 0,9 mol/1, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % bis 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005-0,05 %, bevorzugter 0,01-0,03 % und am meisten bevorzugt von 0,01 %. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium- Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol 1, bevorzugt 0,01 bis 0,08 mol 1 eingesetzt werden, in einem pH- Wert-Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0-8,0. Die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0.
Es versteht sich, dass der Fachmann die angegebenen Konzentrationen der Bestandteile des Hybridisierungspuffer derart auswählen kann, dass die gewünschte Stringenz der Hybridisierungsreaktion erzielt wird. Besonders bevorzugte Ausführungsformen geben stringente bis besonders stringente Hybrisidierungs- bedingungen wieder. Unter Einsatz dieser stringenten Bedingungen kann der
Fachmann feststellen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül einen spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von Ziel-Organismen ermöglicht und somit im Rahmen der Erfindung zuverlässig eingesetzt werden kann.
Die Konzentration der Sonde, kann je nach Markierung und Anzahl der zu erwartenden Zielstruktur stark schwanken. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Sondenmenge die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonde zu erhöhter Hintergrund- fluoreszenz führt. Die Menge an Sonde sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 ng/μl und 500 ng/μl, bevorzugt zwischen 1,0 ng/μl und 100 ng/μl und besonders bevorzugt bei 1,0 - 50 ng/μl liegen.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Konzentration beträgt 1-10 ng jedes verwendeten Nukleinsäuremoleküls pro μl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren beträgt es 40 μl.
Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44 °C und 48 °C, besonders bevorzugt 46 °C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in
Abhängigkeit von den Nukleinsäuresonden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.
Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Nukleinsäuresondenmoleküle entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1% eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01% bevorzugt wird, sowie Tris-HCl in einer Konzentration von 0,001-0,1 mol/1, bevorzugt 0,01-0,05 mol/1, besonders bevorzugt 0,02 mol/1, enthalten, wobei der pH- Wert von Tris-HCl im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 7,0 bis 8,0, besonders bevorzugt bei 8,0 liegt. Ein Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 mol/1 bis 0,9 mol 1, bevorzugt von 0,01 mol/1 bis 0,9 mol/1, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl- Konzentration von 0,07 mol/1. Des Weiteren kann die Waschlösung EDTA in einer Konzentration bis zu 0,01 mol 1 enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 mol/1 beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.
Allgemein kommen bei dem Waschschritt Pufferlösungen zum Einsatz, die prinzipiell sehr ähnlich aussehen können, wie Hybridisierungspuffer (gepufferte Natriumchloridlösung), nur dass der Waschschritt in einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration, bzw. bei höherer Temperatur durchgeführt wird.
Zur theoretischen Abschätzung der Hybridisierungsbedingungen kann folgende Formel verwendet werden:
Td = 81,5 + 16,6 lg[Na+] + 0,4 x (% GC) - 820/n - 0,5 X (% FA)
Td = Dissoziationstemperatur in °C [Na+] = Molarität der Natriumionen
% GC = Anteil der Guanin- und Cytosinnukleotide an der Anzahl der Basen n = Länge des Hybrids % FA= Formamidgehalt
Mit Hilfe dieser Formel kann z.B. der Formamidanteil (der wegen der Toxizität des Formamids möglichst gering sein sollte) des Waschpuffers ersetzt werden durch einen entsprechend niedrigeren Natriumchloridgehalt. Allerdings ist dem Fachmann aus der umfangreichen Literatur zu in situ-Hybridisierungsmethoden bekannt, dass und aufweiche Weise die genannten Bestandteile variiert werden können. Bezüglich der Stringenz der Hybrdisierungsbedingungen gilt das oben im Zusammenhang mit dem Hybridisierungspuffer Gesagte. Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Nukleinsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44 °C bis 52 °C, bevorzugt von 44 °C bis 50 °C und besonders bevorzugt bei 46 °C für eine Dauer von 10 - 40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle im sogenannten Fast-FISH- Verfahren zum spezifischen Nachweis der angegebenen Ziel-Organismen eingesetzt. Das Fast-FISH- Verfahren ist dem Fachmann bekannt und z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 199 36 875.9 und der internationalen Anmeldung WO
99/18234 beschrieben. Auf die in diesen Dokumenten enthaltene Offenbarung zur Durchführung der dort beschriebenen Nachweisverfahren wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass das Nukleinsäuresondenmolekül nachweisbar ist, z.B. dadurch dass das Nukleinsäuresondenmolekül durch kovalente Bindung mit einen Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden z.B. fluoreszierende Gruppen wie z.B. CY2 (erhältlich von Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3
(ebenfalls erhältlich von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (erhältlich von Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC (erhältlich von Molecular Probes Inc. Eugene, USA) oder FLUOS-PRTME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
Tabelle
Enzyme Chromogen
1. Alkalische Phosphatase und 4-Methylumbelliferylphosphat (*), saure Phosphatase Bis(4-Methyiumbelliferylphosphat), (*) 3-O- Methylfluoreszein, Flavon-3- Diphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase Tyraminhydrochlorid (*), 3-(p-Hydroxyphenyl)- Propionsäure (*), p-Hydroxyphenethyl- alkohol(*), 2,2'-Azino-di-3- ethylbenzthiazolinsulfonsäure (ABTS), ortho- Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5- Aminosalicylsäure, p-Ucresol (*), 3,3'- dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2- benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase H O2 + Diammoniumbenzidin H2O2 + Tetramethylbenzidin
4. ß-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galaktosid 5. Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau
^Fluoreszenz
Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, dass an ihrem 5 '- oder 3 '-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15 - 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Nukleinsäuresondenmolekül erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele hinaus auch noch weitere wohlbekannt.
Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung der verwendeten Sonde möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u.a.
Ein wichtiger Vorteil des in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahrens zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien gegenüber den weiter oben beschriebenen traditionellen Nachweismethoden ist die Schnelligkeit. Im Vergleich zu herkömmlichen Kultivierungsverfahren, die sieben bis zwölf Tage für den Nachweis benötigen, liegt das Ergebnis bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb von 48 Stunden vor.
Ein weiterer Vorteil liegt im gleichzeitigen Nachweis aller relevanten bierschädlichen Milchsäurebakterien sowie gleichzeitig parallel möglichen Nachweis der gram-negativen Bierschädlinge.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Spezies der Gattung Lactobacillus. Diese ist durch die Verwendung unterschiedlich markierter Nukleinsäuresondenmoleküle leicht und zuverlässig möglich. Ein weiterer Vorteil liegt in der Spezifität dieses Verfahrens. Durch die verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküle können sowohl spezifisch die Gattung Lactobacillus als auch hochspezifisch die Spezies Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis sowie zusätzlich die Spezies Pediococcus damnosus nachgewiesen und visualisiert werden. Ebenso können sowohl spezifisch die Gattung Pectinatus als auch hochspezifisch die Spezies Pectinatus fr isingensis und Pectinatus cerevisuphilus sowie zusätzlich die Spezies Megasphaera cerevisiae nachgewiesen und visualisiert werden. Durch die Visualisierung der Bakterien kann eine gleichzeitige visuelle Kontrolle stattfinden. Falsch positive Ergebnisse sind somit ausgeschlossen.
Insgesamt stellt die Möglichkeit des gleichzeitigen Nachweises der genannten Keime einen wesentlichen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar. Der Einsatz von entsprechenden Mischungen von Sonden, insbesondere der vorangehend als bevorzugte Sonden bezeichneten Sonden, ermöglicht bspw. den gleichzeitgen Nachweis aller genannten Keime. Das ist ein immenser Vorteil, da somit alle in der Praxis relevanten bierschaedlichen Bakterien in einem Schritt erfasst werden.
Ein weiterer Vorteil gegenueber dem Stand der Technik ist die konkrete
Zeitersparnis: die Hybridisierung dauert im Stand der Technik in der Regel 4 Stunden, beim erfindungsgemäßen Verfahren nur 1 ,5 Stunden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der leichten Handhabbarkeit. So können durch das Verfahren leicht große Mengen an Proben auf das Vorhandensein der genannten Bakterien getestet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vielfältig angewendet werden. Es können sowohl klare als auch hefetrübe Biere analysiert werden, außerdem z.B. Hefeproben (Reinzucht-, Ernte- oder Betriebshefen und Hefebodensätze) und Spülwässer.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die mikrobiologische Kontrolle sämtlicher Lebensmittel, bei denen die nachgewiesenen Bakterien als Lebensmittelverderber eine Rolle spielen.
Erfindungsgemäß werden weiterhin Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung gestellt. Die in diesen Kits enthaltene
Hybridisierungsanordnung ist z.B. in der deutschen Patentanmeldung 100 61 655.0 beschrieben. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich der in situ-Hybridisierungsanordnung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Außer der beschriebenen Hybridisierungsanordnung (als VIT-Reactor bezeichnet) umfassen die Kits als wichtigsten Bestandteil die jeweilige Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen (als VIT-Lösung bezeichnet). Weiterhin ist jeweils enthalten der entsprechende Hybridisierungspuffer (Solution C) und ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung (Solution D). Weiterhin sind enthalten gegebenenfalls Fixierungslösungen (Solution A und Solution B), eine zusätzliche Zellaufschlusslösung (Breaker_2) sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung (Finisher). Finisher sind im Handel erhältlich, sie verhindern u.a. das rasche Ausbleichen fluoreszierender Sonden unter dem Fluoreszenzmikroskop. Gegebenenfalls sind Lösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle (Positive Control) sowie einer Negativkontrolle (Negative Control) enthalten.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken: Beispiel
Spezifischer Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien in einer Probe
Eine Probe wird in geeigneter Weise 20 - 44 h kultiviert (z.B. NBB-Medium, 48 h, 28 °C) .
Ein Aliquot der Kultur wird zentrifugiert (5 min, 8 000 Upm, RT), der Überstand wird verworfen und das Sediment in einem geeigneten Volumen Fixierungslösung (Solution A, 50% Ethanol) resuspendiert.
Anschließend wird ein geeignetes Aliquot der fixierten Zellen (bevorzugt 40 μl) auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken).
Anschließend werden die getrockneten Zellen vollständig dehydratisiert durch Zusatz einer weiteren Fixierungslösung (Solution B, Ethanol absolut, bevorzugt 40 μl). Der Objektträger wird erneut getrocknet (Raumtemperatur, 3 min oder bis vollständig trocken). Zum vollständigen Zellaufschluss wird ein geeignetes Volumen der Zellaufschlusslösung (Breaker_2, bevorzugt 40 μl) auf den Objektträger aufgebracht und der Objektträger inkubiert (10 min, RT).
Die Zellaufschlusslösung wird durch Eintauchen des Objektträgers in ein mit destilliertem Wasser gefülltes Gefäß, bevorzugt den VIT-Reactor, abgewaschen und der Objektträger anschließend in seitlicher Stellung getrocknet.
Anschließend wird auf die fixierten, dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung (VIT-Lösung) mit den weiter oben beschriebenen für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen aufgebracht. Das bevorzugte Volumen beträgt 40 μl. Der Objektträger wird anschließend einer mit Hybridisierungspuffer (Solution C, entspricht der Hybridisierungslösung ohne Oligonukleotide) befeuchteten Kammer, bevorzugt dem VIT-Reactor inkubiert (46 °C, 90 min).
Anschließend wird der Objektträger aus Kammer entnommen, die Kammer mit Waschlösung befüllt (Solution D, 1:10 verdünnt in destilliertem Wasser) und der Objektträger in dieser inkubiert (46 °C, 15 min).
Anschließend wird die Kammer mit destilliertem Wasser befüllt, der Objektträger kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken).
Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Medium (Finisher) eingebettet.
Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Oligonukleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Oligonukleotiden mit einer der nachfolgenden Nukleotidsequenz (jeweils in
5 '-> 3 '-Richtung)
TGGTGATGC AAG CAC CAC
ATGMTGATG CAA GCA CCAR CAT GCG GTC TCC GTG GTT
ACG CTGAGT GGC GCG GGT
GCGGGA CCATCC AAAAGT G
GGC GGC AGG GTC CAAAAG
CGT CAC GCC GAC AAC AGT GGC GGC TAGTTC CCT AAA
ACCGT CAA CCC TTGAAC AGT
GAC TCC CGAAGG TTATCT
TCGGTC AGA TCT ATC GTC
GCTACG TAT CAC AGC CTT GCG GCG GAC TCC GTAAAG
GCT ACC CAY GCT TTC GAG
CCAATG CAC TTC TTC GGT
GCT CGC TCC CTAAAA GGC
ACT GCAAGC AGC TTC GGT CGC CGC GGA TCC ATC CAA
TGC TTT CGA GAC CTC AGC
TTA CAA GAC CAG ACA GCC
ACC GTC AAC CCT TGAACA GT
ACG CCG CGG GAC CAT CCA AGT TCG CCA CTC ACT CAA CGC TAC CCA TGC TTT CGK G CCA CTA CCC ATG CTT TCG AG CAA GCA CCA GCT ATC AGT ACG TCA TTC AAC GGA AGC AGC TTC GAT GCA AGC ATC TACAAGACCAGACAGCCG GTTACAAGACCAGACAGC ACAAGACCAGACAGCCGC CGTCAGTTACAAGACCAG GCGTCAGTTACAAGACCA GAGACCTCAGCGTCAGTT AGCGTCAGTTACAAGACC CAAGACCAGACAGCCGCC ACCCATGCTTTCGAGACC ACGTATTACCGCGGCTCG TAAAAAAACCGCCTGCGC ATGCTTTCGAGACCTCAG CCATGCTTTCGAGACCTC TGCTTTCGAGACCTCAGC CATGCTTTCGAGACCTCA CCCATGCTTTCGAGACCT AGACCTCAGCGTCAGTTA CTTTCGAGACCTCAGCGT CGAGACCTCAGCGTCAGT GCTTTCGAGACCTCAGCG TCGAGACCTCAGCGTCAG TTTCGAGACCTCAGCGTC TTCGAGACCTCAGCGTCA TACGTATTACCGCGGCTC AAAAAAACCGCCTGCGCT GCTTCGATGCAAGCATCT CAGCTTCGATGCAAGCAT ATCAGCTTCGATGCAAGC TCAGCTTCGATGCAAGCA CAGCGTCAGTTACAAGAC AAGACCAGACAGCCGCCT TACCCATGCTTTCGAGAC TAGCTCCCGAAGGTTACT CGAAGGTTACTCCACCGG CCGAAGGTTACTCCACCG GCTCCCGAAGGTTACTCC CCCGAAGGTTACTCCACC TCCCGAAGGTTACTCCAC CTCCCGAAGGTTACTCCA CCGTCAACCCTTGAACAG CATTCAACGGAAGCTCGT ACCGTCAACCCTTGAACA CTTAGCCTCACGACTTCG TACCGTCAACCCTTGAAC AACGGAAGCTCGTTCGAC TTAGCCTCACGACTTCGC GCAAGCACGTCATTCAAC TCGCCACTCGCTTCATTG TCAACGGAAGCTCGTTCG TTCAACGGAAGCTCGTTC CAAGCACGTCATTCAACG CACGTCATTCAACGGAAG TCATTCAACGGAAGCTCG TGACTCCCGAAGGTTATC CGTCATTCAACGGAAGCT GCTTAGCCTCACGACTTC TTCGCCACTCGCTTCATT GTCATTCAACGGAAGCTC CCTGCTTCTGGGCAGATT CTGCTTCTGGGCAGATTT GCACGTCATTCAACGGAA CAACGGAAGCTCGTTCGA ACGGAAGCTCGTTCGACT AGCACGTCATTCAACGGA TCTGGGCAGATTTCCCAC CGGAAGCTCGTTCGACTT AAGCACGTCATTCAACGG GTTCGCCACTCGCTTCAT CCCTGCTTCTGGGCAGAT CTGACTCCCGAAGGTTAT TGCTTCTGGGCAGATTTC TTCTGGGCAGATTTCCCA ACTCCCGAAGGTTATCTC CTTCTGGGCAGATTTCCC CTGGGCAGATTTCCCACG ACTAATACGCCGCGGGAT GTGCAAGCACGTCATTCA ACGGCTGACTCCCGAAGG TTAGACGGCTGACTCCCG GTCACACCGTGAGCAGTT CGTCACACCGTGAGCAGT CCACTCGGTCAGATCTAT GATGCAAGCACCAGCTAT TCGGTCAGATCTATCGTC CGGTCAGATCTATCGTCA CTCGGTCAGATCTATCGT TCACACCGTGAGCAGTTG CCGTCACACCGTGAGCAG CTGATGCAAGCACCAGCT CGGCGGACTCCGTAAAGG GCTGATGCAAGCACCAGC ACCGTCACACCGTGAGCA CAGATGCAGACCAGACAG TGATGCAAGCACCAGCTA AGTTAGGAGACCTCGTTC GGCGGACTCCGTAAAGGT GTTAGGAGACCTCGTTCG AGTTGCTCTCACGGTCGT GCACCAGCTATCAGTTAG TACCGTCACACCGTGAGC AGATACCGTCACACCGTG TAGATACCGTCACACCGT TGCTCTCACGGTCGTTCT ACCATGTGGTTCTCGTTG ATGCAAGCACCAGCTATC GGCGGCGGACTCCGTAAA AGGCGGCGGACTCCGTAA CACACCGTGAGCAGTTGC TTAGATACCGTCACACCG GAACCATGTGGTTCTCGT GCTCTCACGGTCGTTCTT CACCAGCTATCAGTTAGG GCCACTCGGTCAGATCTA GATACCGTCACACCGTGA TCAGATGCAGACCAGACA TAGGCGGCGGACTCCGTA CCATGTGGTTCTCGTTGT CAAGCACCAGCTATCAGT CGCTGAGTGGCGCGGGTT CCGGATTCCGACGACGTT CGCCAACCTTCCCAGATT ACGACGTTTCACGTGTGT CGACGACGTTTCACGTGT CAAGTCCACAGTCTCGGT CTACCCAGCGGTGGCGGT AACCTGGCATGTTACCGT GCGCACAGCACCCCTTCT ACCAGTCCTTAACGGTCT AGGTCAAGTCCACAGTCT TTCCCCACGTCTACCTCT TCCACTCCCAACCTATCT GGGCTTCATTTCTGGGCT GATTCTACGTCCGAGGCT TGCACAACTTAGCCTCCT CTTGCGCACAGCACCCCT AGTTCCCCACGTCTACCT GCTCCGGCTTTTAAACCT AGCCTCCCCAGGAAACCT GTTGGTTGCTTCCCTACT GGCGGTGGCGGCGCAACT CCCCACGTCTACCTCTAT CTTCCACTCCCAACCTAT TCGCCAACCTTCCCAGAT TTGGTCCGCTCCGTACAT GCTGTGTCAACACCCAAT GCCAACCTTCCCAGATTG GACGACGTTTCACGTGTG TACCCAGCGGTGGCGGTG GCACAACTTAGCCTCCTG GCGGTGGCGGCGCAACTG ACCCAGCGGTGGCGGTGG CGGTGGCGGCGCAACTGG TTGATTTCACCTACGGGG CACGCTGAGTGGCGCGGG AGGATCCTGAACTGAGGG TCAAGTCCACAGTCTCGG CAGCGGTGGCGGTGGCGG CCACGCTGAGTGGCGCGG TCCATACGGTACCACCGG CCGTCACGCCGACAACAG ACCGTCACGCCGACAACA ATACCGTCACGCCGACAA TACCGTCACGCCGACAAC GATACCGTCACGCCGACA GGATACCGTCACGCCGAC ACGCCGACAACAGTTACT GGCTCGCTCCCTAAAAGG CTCTGCCGACCATTCTTC CTGCCGACCATTCTTCTC CGCCGACAACAGTTACTC CACGCCGACAACAGTTAC TCACGCCGACAACAGTTA TCTGCCGACCATTCTTCT ACAACAGTTACTCTGCCG CGGCTCGCTCCCTAAAAG GACAACAGTTACTCTGCC ACGGCTCGCTCCCTAAAA CGACAACAGTTACTCTGC CCGACAACAGTTACTCTG ACTCTGCCGACCATTCTT CTCGCTCCCTAAAAGGGT TGCCGACCATTCTTCTCC GCCGACCATTCTTCTCCA CGCCATCTTTCAGCCAAG GACGGCTCGCTCCCTAAA CGACCATTCTTCTCCAAC GTCACGCCGACAACAGTT CCTGATCTCTCAGGTGAT AACAGTTACTCTGCCGAC TACTCTGCCGACCATTCT CCGACCATTCTTCTCCAA GCCGACAACAGTTACTCT TTACTCTGCCGACCATTC TCCCTAAAAGGGTTACGC CAACAGTTACTCTGCCGA AGACGGCTCGCTCCCTAA ACGCCATCTTTCAGCCAA AACCTGATCTCTCAGGTG ACTGCAAGCAGCTTCGGT CGTCCACTGCAAGCAGCT GTCAATCAACGTCCACTG CACTGCAAGCAGCTTCGG GTCTGAATGGTTATGCGG TCGACGTCAGTGCGTTCG CCACTGCAAGCAGCTTCG TGCAAGCAGCTTCGGTCG AAGCAGCTTCGGTCGACG AACGTCCACTGCAAGCAG GTCGACGTCAGTGCGTTC TCCACTGCAAGCAGCTTC GCAGCTTCGGTCGACGTC TCAATCAACGTCCACTGC ACGTCCACTGCAAGCAGC TCAACGTCCACTGCAAGC CAAGCAGCTTCGGTCGAC CGACGTCAGTGCGTTCGA GCAAGCAGCTTCGGTCGA CAGCTTCGGTCGACGTCA CAATCAACGTCCACTGCA CAACGTCCACTGCAAGCA GACGTCAGTGCGTTCGAC GTCCACTGCAAGCAGCTT ATCAACGTCCACTGCAAG CCGTCAAAGGACTAACAG GGTCTGAATGGTTATGCG CGTCAATCAACGTCCACT CAGTTACTCTAGTCCCTG AGCTTCGGTCGACGTCAG CTGCAAGCAGCTTCGGTC CTAGTCCCTGTTCTTCTC GGATACCGTCAAAGGACT AGCAGCTTCGGTCGACGT ACGTCAATCAACGTCCAC GCTTCGGTCGACGTCAGT ACGTCAGTGCGTTCGACT ACCATGTGGTCTGAATGG TCCCTAAAAGGGTTACCC CTATCATTAGGCGCAGCT ACTATCATTAGGCGCAGC GGCGCAGCTCGTTCGACT GCGGCAGGCTCCAAAAGG ATTAGGCGCAGCTCGTTC ATCATTAGGCGCAGCTCG AGGCGCAGCTCGTTCGAC CGGCAGGCTCCAAAAGGT TCATTAGGCGCAGCTCGT GCGCAGCTCGTTCGACTT TTAGGCGCAGCTCGTTCG GGCAGGCTCCAAAAGGTT TATCATTAGGCGCAGCTC GCAGGCTCCAAAAGGTTA CGCAGCTCGTTCGACTTG CATTAGGCGCAGCTCGTT TAGGCGCAGCTCGTTCGA TAGATACCGTCGCGACGT TTAGATACCGTCGCGACG ATACCGTCGCGACGTGAG TACCGTCGCGACGTGAGC GTTAGATACCGTCGCGAC GATACCGTCGCGACGTGA ACCGTCGCGACGTGAGCA CAGGCTCCAAAAGGTTAC CACGCCCGTTCTTCTCTA GCGACGTGAGCAGTTACT CGCGACGTGAGCAGTTAC GCACAAAGGCCATCTTTC AGGCGGCAGGCTCCAAAA AGTTACTCTCACGCCCGT GATAGCACAAAGGCCATC TCGCGACGTGAGCAGTTA CCACCTTAGGCGGCAGGC ACCTTAGGCGGCAGGCTC TAGGCGGCAGGCTCCAAA GCAGTTACTCTCACGCCC CGACGTGAGCAGTTACTC CAGTTACTCTCACGCCCG CCATGCGGTCTCCGTGGT CATGCGGTCTCCGTGGTT TGCGGTCTCCGTGGTTAT GACCATGCGGTCTCCGTG GGTGATGCAAGCACCACC CATCTTTTACCCGGAGAC ATGCGGTCTCCGTGGTTA AGACCATGCGGTCTCCGT GTGATGCAAGCACCACCG ATTGGTGATGCAAGCACC TGATGCAAGCACCACCGC ACCATGCGGTCTCCGTGG TTGGTGATGCAAGCACCA CTTTTACCCGGAGACCAT ATCTTTTACCCGGAGACC TTACCCGGAGACCATGCG TCTTTTACCCGGAGACCA GGTCTCCGTGGTTATACG GATGCAAGCACCACCGCA GAGACCATGCGGTCTCCG CGGTCTCCGTGGTTATAC TTTACCCGGAGACCATGC TGCAAGCACCACCGCAAA GGAGACCATGCGGTCTCC GCAAGCACCACCGCAAAC TTTTACCCGGAGACCATG AGCACCACCGCAAACTGA AAGCACCACCGCAAACTG CCATCTTTTACCCGGAGA ATGCAAGCACCACCGCAA GTCTCCGTGGTTATACGG GCGGTCTCCGTGGTTATA CAAGCACCACCGCAAACT TCTCCGTGGTTATACGGT CTCCGTGGTTATACGGTA GCCATCTTTTACCCGGAG CGCCATCTTTTACCCGGA CAGCTGATCTCTCAGCCT CGCAAACTGACCAAACCT AAGCTCGGACCATGCGGT CTTTCAAGCTCGGACCAT TTTCAAGCTCGGACCATG GCCATCTTTCAAGCTCGG CAAGCTCGGACCATGCGG AGCCATCTTTCAAGCTCG TCAAGCTCGGACCATGCG AGCTCGGACCATGCGGTC TTCAAGCTCGGACCATGC CGAAGCCATCTTTCAAGC GCTCGGACCATGCGGTCC ATCTTTCAAGCTCGGACC CATCTTTCAAGCTCGGAC CAT GCG GCC TTT AGA TCG TCC GAC ACT CCA GTC CGG ATA GTG CCG TTC GTC CCC TTG CTC CGG CAC AGA AAG GCCCC TTA GCC GGC TTC GGG GCGGCCCTTAGCCGGCTT TGCGGCCCTTAGCCGGCT CCTTGCGGCCCTTAGCCG CGGCCCTTAGCCGGCTTC TTGCGGCCCTTAGCCGGC TGCGCCGTTACCGTCACC GGCCCTTAGCCGGCTTCG GCGCCGTTACCGTCACCA CGCACTTTTAAGATCCGC GTGCGCCGTTACCGTCAC CGCCGTTACCGTCACCAA AGACGGTCGGTGCCTTGC GCCCTTAGCCGGCTTCGG GGTGCGCCGTTACCGTCA GACGGTCGGTGCCTTGCG TGCCTTGCGGCCCTTAGC GCCTTGCGGCCCTTAGCC TGACCTGCGATTAGTAGC CTTGCGGCCCTTAGCCGG TGGTGCGCCGTTACCGTC GACCTGCGATTAGTAGCG CCTTAGCCGGCTTCGGGT CCGCACTTTTAAGATCCG CTGACCTGCGATTAGTAG GTGCCTTGCGGCCCTTAG ACGGTCGGTGCCTTGCGG TACTGCCATTCGTCCCCT GACCAGTTCGAATCCCAT CCTCAGTTCGGACCCCAT ACTGCCATTCGTCCCCTG TTCGGACCCCATCACGGG GTTCGGACCCCATCACGG AGTTCGAATCCCATCACG ACCAGTTCGAATCCCATC CTCAGTTCGGACCCCATC CTGCCATTCGTCCCCTGC ATCCGCTTAATGTTCCGC AAGCGACAGCTAAAAGCC ATGACCAGTTCGAATCCC TCCAGGATCGGCTCCTTT CTCCAGGATCGGCTCCTT TCAGACGCAAACCCCTCT GCTCCAGGATCGGCTCCT CTCTTCCGGCGATAGACT GCGGCCTTTAGATCGTAT CTTCCGGCGATAGACTAT CACGGCGTATGGGTATTG GGTTTGCTCCAGGATCGG CGCAAACCCCTCTTCCGG GGGTTTGCTCCAGGATCG TACGGTACCGTCACGGCG ACGCAAACCCCTCTTCCG CGGCGATAGACTATTCAG GACACTCCAGTCCGGCAG CCAGGATCGGCTCCTTTC AGACGCAAACCCCTCTTC TCCGGCGATAGACTATTC ATCAGACGCAAACCCCTC GTTTGCTCCAGGATCGGC GCAAACCCCTCTTCCGGC CCGACACTCCAGTCCGGC CCTCTTCCGGCGATAGAC TCTTCCGGCGATAGACTA ACGGCGTATGGGTATTGA CCGGCGATAGACTATTCA CGACACTCCAGTCCGGCA TCCGGCAGTTTCAATCCC TGCTCCAGGATCGGCTCC ATGCGGCCTTTAGATCGT ATCCCTGGCACTCAATGT AATCAGACGCAAACCCCT CAAACCCCTCTTCCGGCG TCATGCGGCCTTTAGATC GACGCAAACCCCTCTTCC TGCGGCCTTTAGATCGTA TCTCTATCCCTGGCACTC GGCTCCTTTCGCTTCCCT CAGGATCGGCTCCTTTCG CCG CAC TTT TAA GAT CCG GAT CCG CTT AGT CAT CCG CTA CTG CCA TTC GTC CCC.
2. Verfahren zum Nachweis von bierschädlichen Bakterien in einer Probe, umfassend die Schritte
- Kultivierung der in der Probe enthaltenen Bakterien, - Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien,
- Inkubation der fixierten Bakterien mit mindestens einem Oligonukleotid nach Anspruch 1, um eine Hybridisierung herbeizuführen,
- Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Oligonukleotide und - Detektieren, und ggf. Quantifizieren und Visualisieren, der bierschädlichen
Bakterien mit hybridisierten Oligonukleotiden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei den bierschädlichen Bakterien um Milchsäurebakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus, insbesondere der Spezies Pediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus per olens, Lactobacillus buchneri Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, oder um gram-negative Bakterien der Gattungen Pectinatus und Megasphaera, insbesondere der Spezies Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisuphilus, Megasphaera cerevisiae handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Probe eine Bierprobe, eine Hefeprobe oder eine Spülwasserprobe ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Probe eine Lebensmittelprobe ist.
6. Verwendung eines Ohgonukleotids nach Anspruch 1 zum Nachweis von bierschädlichen Bakterien in einer Probe.
7. Verwendung eines Ohgonukleotids nach Anspruch 6, wobei es sich bei den bierschädlichen Bakterien um
Milchsäurebakterien der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus, insbesondere der Spezies Pediococcus damnosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus perolens, Lactobacillus buchneri Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, oder um gramnegative Bakterien der Gattungen Pectinatus und Megasphaera, insbesondere der Spezies Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisuphilus, Megasphaera cerevisiae handelt.
8. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 5, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 1.
9. Kit nach Anspruch 8, in dem das mindestens eine Oligonukleotid in einer
Hybridisierungslösung enthalten ist.
10. Kit nach Anspruch 8 oder 9, weiter enthaltend eine Waschlösung und ggf. eine oder mehrere Fixierungslösungen sowie ggf. eine Zellaufschluss- bzw. Enzymlösung.
EP02762296A 2001-06-19 2002-06-19 Verfahren zum spezifischen schnellnachweis bierschädlicher bakterien Withdrawn EP1397519A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10129410 2001-06-19
DE10129410A DE10129410A1 (de) 2001-06-19 2001-06-19 Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien
PCT/EP2002/006808 WO2002103043A2 (de) 2001-06-19 2002-06-19 Verfahren zum spezifischen schnellnachweis bierschädlicher bakterien

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1397519A2 true EP1397519A2 (de) 2004-03-17

Family

ID=7688610

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP02762296A Withdrawn EP1397519A2 (de) 2001-06-19 2002-06-19 Verfahren zum spezifischen schnellnachweis bierschädlicher bakterien

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20040219574A1 (de)
EP (1) EP1397519A2 (de)
JP (1) JP2004529662A (de)
CA (1) CA2451067A1 (de)
DE (1) DE10129410A1 (de)
WO (1) WO2002103043A2 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI116030B (fi) * 2002-11-06 2005-09-15 Kemira Oyj Paperi- ja kartonkikoneiden termofiilisten mikrobien biofilminmuodostuksen esto
DE10344057B3 (de) * 2003-09-23 2005-06-09 Vermicon Ag Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis getränkeschädlicher Mikroorganismen
JP2005229838A (ja) * 2004-02-17 2005-09-02 Sapporo Breweries Ltd 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法
KR101151493B1 (ko) * 2004-02-25 2012-05-30 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 세균 검출 기구, 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트
EP1904079A4 (de) * 2005-06-02 2009-10-21 Advandx Inc Peptid-nukleinsäure-sonden zur untersuchung von mikroorganismen
US9303281B2 (en) * 2012-07-23 2016-04-05 Pall Corporation Compositions for detecting foodstuff spoilage microorganisms
EP3447146A1 (de) 2017-08-22 2019-02-27 Vermicon AG Verfahren zum spezifischen nachweis von mikroorganismen
US10918690B2 (en) * 2018-09-06 2021-02-16 Louise Wilkie Apparatus and method for processing organic bamboo leaf extract products
WO2020210140A1 (en) * 2019-04-06 2020-10-15 Banu Ip Llc Apparatus and method for processing organic bamboo leaf extract products

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0497464A1 (de) * 1991-01-31 1992-08-05 Amoco Corporation Schnellnachweis von Mikroben durch in situ-Hybridisation in wässeriger Suspension
US5426025A (en) * 1992-05-28 1995-06-20 Florida State University Species-specific DNA probes for vibrio vulnificus methods and kits
US5484909A (en) * 1993-09-10 1996-01-16 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of bacteria of the genera Pediococcus and Lactobacillus and methods for the detection of the bacterial agents causing spoilage of beer
WO2000065093A2 (en) * 1999-04-22 2000-11-02 Science And Technology Corporation In situ hybridization methods for reducing the occurrence of false positives and for targeting multiple microorganisms
DE19945964A1 (de) * 1999-09-24 2001-04-05 Biotecon Diagnostics Gmbh Verfahren und Nukleinsäuren zum Nachweis von brauereirelevanten Mikroorganismen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO02103043A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002103043A2 (de) 2002-12-27
DE10129410A1 (de) 2003-01-02
US20040219574A1 (en) 2004-11-04
JP2004529662A (ja) 2004-09-30
CA2451067A1 (en) 2002-12-27
WO2002103043A3 (de) 2003-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60131284T2 (de) Methode zum nachweis von mikroorganismen
DE69534516T2 (de) Gleichzeitiger nachweis, identifizierung und differenzierung von eubakterien unter verwendung eines hybridisierungs-assays
DE69434255T2 (de) Nukleinsäuresonde zum nachweis von lactobacillus
DE68907772T2 (de) Hybridisationssonden zum nachweis von neisseria-staemme.
Juvonen et al. Group-specific PCR-RFLP and real-time PCR methods for detection and tentative discrimination of strictly anaerobic beer-spoilage bacteria of the class Clostridia
EP0739988B1 (de) Verfahren zur Gattungs- und speziesspezifische Identifizierung von Legionellen
WO2002103043A2 (de) Verfahren zum spezifischen schnellnachweis bierschädlicher bakterien
DE10344057B3 (de) Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis getränkeschädlicher Mikroorganismen
EP1214450B1 (de) Verfahren und nukleinsäuren zum nachweis von brauereirelevanten mikroorganismen
Nebra et al. The effect of reducing agents on the recovery of injured Bifidobacterium cells
DE102015012691A1 (de) Verfahren zum quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae
WO2002102824A2 (de) Verfahren zum spezifischen schnellnachweis von trinkwasser relevanten bakterien
WO2002053771A2 (de) Nachweis von pathogenen bakterien
WO2004009839A2 (de) Obligonukleotide zum nachweis von mikroorganismen
DE69631413T2 (de) Nachweis einer bakterie der pectinatus gattung
DE60118392T2 (de) Verfahren zum nachweis von mikroorganismen
DE10204858B4 (de) Gensonden zum Nachweis von Spezies der Gattung Oenococcus
EP1335991B1 (de) Verfahren zum nachweis von protozoen der gattung naegleria
EP1490507A1 (de) Verfahren zum nachweis von mikroorganismen mittels in situ-hybridisierung und durchflusszytometrie
WO2003066893A1 (de) Verfahren zum spezifischen schnellnachweis pathogener lebensmittelrelevanter bakterien
DE10004147A1 (de) Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von 16S-rRNA-Genen von Bakterien
DE10001140C2 (de) Oligonukleotide zur Amplifikation und zum Nachweis von bakteriellen Genen für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen (Apr), neutrale Metallopeptidasen (Npr) und Serinpeptidasen (Spr)
WO2002101089A2 (de) Verfahren zum spezifischen schnellnachweis fadenförmiger bakterien
AT503401A1 (de) Microarray zur erkennung von pathogenen
DE10160666A1 (de) Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis von Trinkwasser relevanten Bakterien

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20031126

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO SI

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: SNAIDR, JIRI

Inventor name: BEIMFOHR, CLAUDIA

17Q First examination report despatched

Effective date: 20060901

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20120103