EP1287320A1 - Verfahren zur photonenzählung in laser-scanning-systemen - Google Patents
Verfahren zur photonenzählung in laser-scanning-systemenInfo
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- EP1287320A1 EP1287320A1 EP02722177A EP02722177A EP1287320A1 EP 1287320 A1 EP1287320 A1 EP 1287320A1 EP 02722177 A EP02722177 A EP 02722177A EP 02722177 A EP02722177 A EP 02722177A EP 1287320 A1 EP1287320 A1 EP 1287320A1
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J11/00—Measuring the characteristics of individual optical pulses or of optical pulse trains
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
- G01J1/42—Photometry, e.g. photographic exposure meter using electric radiation detectors
Definitions
- the comparator needs a certain (switching time) to get from one state to the other. If the individual photons are so close together that the comparator cannot detect the level changes of the adjacent photons with its switching time, it will only recognize one state and therefore only count one photon.
- Incoming photons are evaluated two-dimensionally by measuring the amplitude in several threshold values and measuring in a time grid, with a counting frequency at least twice the photon time (empirical duration of the required measurement for a photon), pulses of a higher frequency are counted than that by the photon time prescribed.
- Comparators, discriminators, triggers, but also in digital form AD converters and associated registers can be used for the threshold value determination.
- the photon time can be used as the gate time during which an even higher frequency runs into the counter
- the result can be summarized in a counter or in an adder and read out via a register. After each measurement, the register is cleared again by a clear pulse.
- the signal to be measured is present at the inputs of the 4 comparators. If the input signal exceeds the switching threshold S1, the tilts Comparator and 'releases the gate circuit (negator and AND operation) via the first negator N1.
- This formulation F 2lmpulse means that because of the sampling theorem at least two pulses have to be counted per one photon time. The determination of the total number of photons then has a factor of 1/2 in the formula. This results from the definition of at least 2 pulses per photon. If one were to define a 10-fold counting frequency, the factor 1/10 would have to be in the sum formula in order to arrive at the real number of photons. If comparator S2 has reached the threshold, the AND operation of the first comparator is blocked immediately with the output of the comparator and that of the second comparator is opened.
- the later switching of the second comparator is compensated for by the running time of the signal of the first comparator through the first negator N1, so that the second comparator can still safely block the first gate circuit.
- the pulses in counter 2 are multiplied by 2 (2xF), those in counter 3 by 3 (3xF) etc. and thus have a higher value than pulses that enter counter 1 via comparator one. This measures the second dimension, since photons in series only generate a higher amplitude, but can take the same time.
- the switching thresholds S3 and S4 behave in the same way.
- the counting channels underneath are blocked, whereby the further negators N2, N3 .., as with the first negator, provide for corresponding runtime compensation, so that the second or further gate switching can still be blocked.
- the highest threshold has priority.
- the count values Z of the counters i are combined with an adder (summation) and placed as a measured value ZP in a register, for example, and subsequently read and processed by a computer.
- the combination of the amplitude monitoring and the time measurement of the incoming photons give an exact picture of the actual number of photons that occur within a measurement time.
Abstract
Verfahren zur Photonenzählung im Detektionskanal einer laserscannenden Anordnung, vorzugsweise eines Laser-Scanning -Mikroskopes, wobei eine Amplitudenbestimmung der einlaufenden Photonen mittels mehrerer Schwellwerte erfolgt und die Schwellwertbestimmung mit einer zeitaufgelösten Messung gekoppelt ist, indem für einzelne Schwellwerte jeweils eine Pulszählung erfolgt und die Summe der Zählungen für die Schwellwerte ermittelt wird, wobei vorteilhaft bei Erreichen eines höheren Schwellwertes der Zählwert des niedrigen Schwellwertes für die Zählung abgespeichert wird.
Description
Verfahren zur Photonenzählung in Laser-Scanning-Systemen
Es ist bereits bei Laser-Scanning-Mikroskopen bekannt, von einem PMT detektierte Photonen einzeln aufzulösen, indem über einem PMT nachgeordnete Impulsverstärker und Schwellwertschalter wie Komparatoren eine Zählung der Photonen erfolgt - Fig.1.
In Fig.2 sind typische Beispiele dargestellt wie Fehlmessungen auftreten können.
Übereinanderliegende Photonen haben die gleiche Breite aber eine größere Amplitude
Mit einer Komparator/ Diskriminatorlösung können nur Einzeiphotonen einer festgelegten Amplitude gezählt werden. Wird die eingestellte Schwelle überschritten, dann wird ein Photon erkannt. Wenn zum gleichen Zeitpunkt zwei Photonen auftreffen, dann erhöht sich die Amplitude aber die Schaltschwelle wird auch nur einmal überschritten und damit einmal gezählt. Nebeneinanderliegende ( im Abstand nicht auflösbare Photonen ) sind breiter als ein Photon haben aber gleiche Amplitude.
Der Komparator benötigt eine gewisse (Schaltzeit) um von einem Zustand in den anderen zu gelangen. Liegen die einzelnen Photonen so eng aneinander, das der Komparator mit seiner Schaltzeit nicht die Pegeländerungen der nebeneinanderliegenden Photonen erfassen kann wird er nur einen Zustand erkennen und damit auch nur ein Photon zählen.
Dies ist in Fig.2 schematisch am Beispiel von zwei gleichzeitig auftretenden Photonen, die als eins gezählt werden sowie 5 Photonen dargestellt, wobei in diesem Fall 2 Photonen hintereinanderliegen , die ganz eng mit 3Photonen hintereinander zusammenliegen und damit für den Komparator nur wie ein Photon wirken.
Eine denkbare Variante, die Photonenzeit als Torzeit für eine Frequenzmessung zu nutzen, erfaßt genau die ineinanderfließenden Photonen aber nicht die übereinanderliegenden Photonen sodaß auch hier immer eine Ungenauigkeit bleiben wird.
Erfindungsgemäße Lösung
Ankommende Photonen werden zweidimensional ausgewertet, indem die Amplitude in mehreren Schwellwerten gemessen wird und die Messung in einem Zeitraster erfolgt , mit einer Zählfrequenz mindestend zweifach der Photonzeit ( empirische Dauer der erforderlichen Messung für ein Photon) werden Impulse einer höheren Frequenz gezählt als der durch die Photonenzeit vorgegebene.
Die Summenbildung aus Amplituden- und Zeitmessung bilden dann die wirkliche Photonenzahl ZP
Für die Schwellwertbestimmung können beispielsweise Komparatoren, Diskriminatoren, Trigger, aber auch in digitaler Form AD-Wandler und dazugehörige Register genutzt werden.
Für die zeitaufgelöste Bestimmung kann die Photonenzeit als Torzeit genutzt werden währenddessen eine noch höhere Frequenz in den Zähler läuft
Das Ergebnis kann sowohl in einem Zähler oder in einem Adder zusammengefaßt werden und über ein Register ausgelesen werden Nach jeder Messung wird das Register wieder durch einen Clear-Impuls gelöscht .
Das erfindungsgemäße Prinzip der zweidimensionalen Erfassung von Photonen wird nachstehend anhand Fig. 3 a) und b) beschrieben
Das zu messende Signal liegt gleichzeitig an den Eingängen der 4 Komparatoren an. Überschreitet das Eingangssignal die Schaltschwelle S1 , kippt der
Komparator und 'gibt über den ersten Negator N1 die Torschaltung ( Negator und UND-Verknüpfung ) frei.
Ist das Eingangssignal nur eine Photonzeit lang, laufen 2 Impulse (die Zählfrequenz ist so gewählt, daß während der Zeitdauer für ein Photon 2 Impulse gezählt werden ) durch die UND-Verknüpfung in den Zähler 1 (x1 ). Wird während der Messzeit ( Pixelzeit eines LSM, Verweildauer zur Erfassung eines Pixels) die Schaltschwelle S2 erreicht und die Impulsbreite des Komparators ist nur eine Photonzeit breit, laufen ebenfalls zwei Impulse über Leitung F, N2 und die UND- Verknüpfung in Zähler 2 ein.
Diese Formulierung F=2lmpulse heißt, das wegen des Abtasttheorems mindest zwei Impulse pro einer Photonzeit gezählt werden müssen. Die Ermittlung der Gesamtphotonenzahl hat in der Summenformel dann den Faktor 1/2 stehen. Dieser resultiert aus der Festlegung mindestens 2 Impulse pro Photon. Würde man eine 10 fache Zählfrequenz festlegen, so müßte in der Summenformel der Faktor 1/10 stehen um auf die wirkliche Photonenzahl zu kommen. Hat Komparator S2 die Schwelle erreicht, wird sofort mit dem Ausgang des Komparators die UND-Verknüpfung des 1. Komparators gesperrt und die des zweiten Komparators geöffnet. Das spätere Schalten des zweiten Komparators wird durch die Laufzeit des Signales des ersten Komparators durch den ersten Negator N1 kompensiert so daß der zweite Komparator noch sicher die erste Torschaltung sperren kann. Die Impulse im Zähler 2 werden mit 2 (2xF), die imZähler 3 mit 3( 3xF) usw. multipliziert und erhalten somit einen höheren Wert als Impulse die über Komparator eins in den Zähler 1 einlaufen. Damit wird die zweite Dimension gemessen, enn Photonen die hintereinander liegen erzeugen nur eine höhere Amplitude , können aber die gleiche Zeit dauern . Die Schaltschwelle S3 und S4 verhalten sich in gleicher Weise. Jedesmal, wenn eine höhere Schaltschwelle anspricht werden die darunterliegenden Zählkanäle gesperrt, wobei die weiteren Negatoren N2, N3 .. wie beim ersten Negator für eine entsprechende Laufzeitkompensation sorgen, so daß die zweite oder weitere Torschaltungen noch gesperrt werden können. Die jeweils höchste Schwelle hat Priorität. Nach Ablauf der Meßzeit werden die Zählwerte Z der Zähler i mit einem Adder zusammengefaßt (Summenbildung) und als Meßwert ZP z.B. in ein Register gestellt und nachfolgend von einem Computer gelesen und weiterverarbeitet. Bei Impulsen, die nur Komparator eins
ansprechen, aber länger als eine Photonezeit dauern sind werden entsprechend mehr Impulse über Leitung F, die UND-Verknüpfung in den Zähler X1 einlaufen. Damit werden verschmolzene bzw. eng aneinanderliegende Photonen erkannt und richtig gezählt und interpretiert.
Die Verbindung der Amplitudenüberwachung und der Zeitmessung der ankommenden Photonen geben ein genaues Abbild der wirklichen Anzahl von Photonen wieder, die innerhalb einer Meßzeit auftreten.
Durch Verbesserung der Genauigkeit wird erreicht
- daß durch mehrstufige Komparatoren unterschiedliche Amplituden des Photonenstromes ausgewertet werden
- daß durch Zeitmessung zusammenhängende Photonen separiert werden können
- daß das Ergebnis aus der Amplitudenmessung und der Zeitmessung die genaue Photonenzahl ergibt
Claims
Patentansprüche 1.
Verfahren zur Photonenzählung im Detektionskanal einer laserscannenden Anordnung, vorzugsweise eines Laser-Scanning -Mikroskopes, wobei eine Amplitudenbestimmung der einlaufenden Photonen mittels mehrerer Schwellwerte erfolgt und die Schwellwertbestimmung mit einer zeitaufgelösten Messung gekoppelt ist, indem für einzelne Schwellwerte jeweils eine Pulszählung erfolgt und die Summe der Zählungen für die Schwellwerte ermittelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei bei Erreichen eines höheren Schwellwertes der Zählwert des niedrigen Schwellwertes für die Zählung abgespeichert wird.
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