EP1274712A1 - Neue flavonglykosid-derivate für den einsatz in kosmetika, pharmazeutika und ernährung - Google Patents

Neue flavonglykosid-derivate für den einsatz in kosmetika, pharmazeutika und ernährung

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EP1274712A1
EP1274712A1 EP01923722A EP01923722A EP1274712A1 EP 1274712 A1 EP1274712 A1 EP 1274712A1 EP 01923722 A EP01923722 A EP 01923722A EP 01923722 A EP01923722 A EP 01923722A EP 1274712 A1 EP1274712 A1 EP 1274712A1
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EP
European Patent Office
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flavone
acid
derivatives
formula
sugar
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01923722A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Otto
Bernadette Geers
Albrecht Weiss
Dirk Petersohn
Kordula Schlotmann
Klaus Rudolf SCHRÖDER
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Cognis IP Management GmbH
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Cognis Deutschland GmbH and Co KG
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Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA, Cognis Deutschland GmbH and Co KG filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1274712A1 publication Critical patent/EP1274712A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
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    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
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    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to new, biologically active flavone and isoflavone glycoside derivatives of the general formula (I)
  • active ingredients are becoming increasingly important in cosmetics.
  • the active ingredients that are already used in cosmetics are not always natural substances.
  • the optimization of known active ingredients and the production of new active ingredients are the subject of much research.
  • active substances are substances that - occurring or supplied in relatively small amounts - can have a great physiological effect.
  • active substances are substances that - occurring or supplied in relatively small amounts - can have a great physiological effect.
  • hormones vitamins, enzymes, trace elements etc.
  • pharmaceuticals medicinal substances
  • feed additives fertilizers
  • Flavones are 2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-ones, in which hydroxyl groups are present or may be absent at different positions on the rings.
  • An example of a flavone is apigenin, the chemical name of which is 2- (p-hydroxyphenyl) -4H-1- (5,7-dihydroxybenzopyran-4-one) (see Römpp Chemie-Lexikon, 9th edition, volume 2, p.
  • flavones are understood to mean substances which contain hydrogenation, Represent oxidation or substitution products of 2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one, where hydrogenation can take place in the 2,3-position of the carbon skeleton, and with substitution the replacement of one or more hydrogen atoms by hydroxy or methoxy Groups to be understood.
  • This definition therefore includes flavans, flavan-3-oles (catechins), flavan-3,4-diols (leucoanthocyanidins), flavones, flavonols and flavanones in the conventional sense.
  • the flavones according to the invention include, for example, chrysine, galangin, fisetin, luteolin, camphor oil, quercetin, poppy seeds, robinetin, gossypetin, taxifolin, myricetin, rhamnetin, isorhamnetin, naringenin, eriodyctiol, hesperetin, liquiritigenin, catechin and epicatechin.
  • isoflavones are understood to mean substances which are hydrogenation, oxidation or substitution products of 3-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one, with hydrogenation in the 2,3-position of the carbon skeleton can take place, and wherein substitution is to be understood to mean the replacement of one or more hydrogen atoms by hydroxyl or methoxy groups.
  • the isoflavones according to the invention include, for example, daidzein, genistein, prunetin, biochanin, Orobol, Santal, pratensein, irigenin, glycitein, biochanin A and formononetin.
  • Flavones and fiavone glycosides such as aspartin, orientin (lutexin), cisorientin (lutonaretin), isoquercitin, rutin, naringin and the above-mentioned, but also isoflavones and isoflavone glycosides (isoflavonoids) are known to be scavengers of oxygen radicals and the skin, thereby causing protease radicals and inhibitors they can actively counteract aging of the skin and scarring. Because of their coloring properties, some flavones such as quercetin are used as food colors. At the same time, due to their ability to capture oxygen radicals, they also act as antioxidants.
  • flavonoids are inhibitors of aldose reductase. This plays a crucial role in the development of diabetes damage (vascular damage, cataracts). Other flavonoids (such as hesperidin and rutin) find therapeutic use particularly as vasodilator, capillary active agents.
  • the derivatizations carried out according to the invention achieve an improved effect and an increased bioavailability, as has already been shown using salicine derivatives as an example.
  • salicin a glycosidic active ingredient from willow bark
  • NSAIA non-steroidal anti-inflammatory agent
  • new arylaliphatic salicine esters such as phenylacetoyl-salicin or phenylbutyroyl-salicin were successfully synthesized, the esterification preferably taking place on the primary OH groups of salicin (first on the sugar, then on the benzyl radical) in the salicin.
  • the PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • CLAs conjuggated linoleic acids
  • pharmaceutical effects are also important: they can have anti-inflammatory effects (inhibition of prostaglandin or leukotriene synthesis), but also thrombolytic and hypotensive effects.
  • PUFA is defined as a polyunsaturated fatty acid with 16 to 26 carbon atoms, the fatty acid having at least four isolated and / or at least two conjugated double bonds.
  • PUFAs are the twelve octadecadienoic acids isomeric to linoleic acid (ice, ice, 9,12-octadecadienoic acid) (which occur in nature), which have conjugated double bonds at the carbon atoms 9 and 11, 10 and 12, or 11 and 13.
  • Human skin is the largest organ in the human body. It is a very complex organ, which consists of a variety of different cell types and forms the body's interface with the environment. This fact makes it clear that the cells of the skin are particularly exposed to exogenous signals of the environment, physical and chemical in nature. Many of these exogenous pollutants contribute to the aging process of the skin.
  • the macroscopic phenomena of aging skin are based on the one hand on intrinsic or chronological aging, and on the other hand on extrinsic aging due to environmental stress.
  • the visible signs of aged skin are to be understood as an integral of intrinsic and extrinsic aging (eg due to sunlight), the events of extrinsic aging accumulating in the skin over a longer period of time.
  • Exogenous signals are received by cells and lead to changes in the gene expression pattern, partly via complex signal transduction cascades.
  • each cell responds to signals from its environment by adapting its metabolism.
  • the cells of the skin notice the high-energy radiation from the sun and react to this by changing their RNA and protein synthesis capabilities.
  • Some molecules are increasingly synthesized after a stress stimulus (e.g. sunlight) (e.g. the collagenase MMP-1), others are produced to a lesser extent (e.g. collagen).
  • a stress stimulus e.g. sunlight
  • collagenase MMP-1 the collagenase MMP-1
  • Induction of collagenase MMP-1 by sunlight or other stress factors is considered to be the main cause of the process of extrinsic skin aging.
  • the collagenase MMP-1 destroys the most important component of the connective tissue of the skin, the collagen, and among other things leads to a reduction in skin elasticity and the formation of deep wrinkles.
  • TIMP-1 tissue Inhibitor of Matrix Metalloprotease-1
  • MMP-1 tissue Inhibitor of Matrix Metalloprotease-1
  • the expression of MMP-1 is affected by skin stress, e.g. increased exposure to sunlight.
  • the synthesis of the inhibitor TIMP-1 is not changed significantly. Therefore it comes under the influence of exogenous stress, e.g. Sunlight, excessive collagen breakdown in the skin. The result is premature aging of the skin.
  • Efforts to cosmetically treat the effects of stress-induced skin aging are aimed at reducing MMP-1 activity or increasing the synthesis of collagen.
  • retinoic acid or retinol By using retinoic acid or retinol, the MMP-1 Synthesis in the skin is reduced or collagen synthesis is increased.
  • the use of retinoic acid for cosmetics is not permitted in Europe due to its teratogenic properties. Cytotoxic effects, insufficient stability in formulations, undesirable side effects or even the disturbing intrinsic color lead to the limitation of the cosmetic use of active ingredients, such as alpha-tocopherol, propyl gallate or various plant extracts.
  • the object on which the present invention is based was therefore to provide substances which have few side effects, have a good action and are easy to process and apply.
  • Flavone and isoflavone glycosides are e.g. known from nature.
  • esters of such flavone and isoflavone glycosides in which at least one of the hydroxyl groups of the sugar is esterified with an (unsaturated) carboxylic or fatty acid, and in which possibly still are not known (neither from plants, microorganisms or animal cells nor synthetically produced) there is another ester grouping between one of the hydroxyl groups of the flavone or isoflavone portion and another unsaturated fatty acid.
  • the inventors found that certain flavone and isoflavone glycoside esters have improved bioavailability, enhanced activity and / or a broader spectrum of activity than the known individual components (fatty acid or (iso) flavone glycoside).
  • the flavones or isoflavones are glycosidically linked to at least one sugar via at least one hydroxyl group.
  • the sugar can be linked to the (iso) flavone residue via an OH group on the benzopyran ring or via an OH group on the phenyl ring.
  • Suitable sugars are mono- and oligosaccharides, in particular D-glucose, D-galactose, D-xylose, D-apiose, L-rhamnose, L-arabinose and rutinose.
  • Examples of the flavone glycoside residues in the compounds according to the invention are rutin, hesperidin and naringin.
  • Preferred examples of the isoflavone glycoside residues in the compounds according to the invention are daidzin and genistin.
  • the compounds of the present invention are flavone and isoflavone glycoside
  • Preferred sugar fractions are generally those Z which mean a monosaccharide.
  • the following monosaccharides are particularly preferred: rhamnose, threose, erythrose, arabinose, lyxose, ribose, xylose, allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose and fructose, the naturally occurring stereoisomers of sugar being the preferred form in each case , Also preferred are disaccharides which are built up from the monosaccharides mentioned above, the naturally occurring stereoisomers of sugar being the preferred form in each case.
  • the binding of the (iso) flavone body to the sugar takes place via a primary alcohol group of the sugar (e.g. via OH to C ⁇ of the glucose).
  • Z-O-X is the naringin skeleton with the formula (III)
  • flavones / flavonoids (X or X-O-Z) in the general formula (I) are asparagine, orientin (lutexin), cisorientin (lutonaretin), isoquercitin, naringin, rutin, camphor oil and quercetin.
  • Preferred compounds of the general formula (I) are especially those in which XOZ is naringin according to formula (III) and A 2 are the acyl radicals of the following acids: p- Chlorophenylacetic, hydrocinnamic, stearic, 12-hydroxystearic, palmitic, lauric, oleic, coumaric, capric, cinnamon, 4-phenylbutter, 4-hydroxyphenylacetic, 5-phenylvaleric acid or those under the trade names available mixtures Edenor UKD 6010 and UKD 7505. Edenor UKD 6010 and UKD 7505, p-chlorophenylacetic and hydrocinnamic acid are particularly preferred acids.
  • all secondary OH groups of the sugar can also be considered as preferred embodiments for the esterification.
  • the primary OH group in the sugar Ai either the 5-OH group of the benzopyran or the 4'-hydroxy group of the phenyl ring.
  • the present invention further provides a process for the preparation of the compounds of the formula (I) according to the invention.
  • the process according to the invention is characterized in that an acetal (from sugar and flavone / isoflavone base body) with a polyunsaturated fatty acid (with at least four isolated double bonds or with at least two conjugated double bonds) such as a conjugated linoleic acid (octadecadienoic acid), with an arylaliphatic carboxylic acid , is esterified or transesterified with an ester of these carboxylic acids or with an activated fatty acid derivative under the catalytic action of one or more enzymes. Esterification at primary OH groups of the sugar is preferred, but secondary alcohol groups of the sugar can also be esterified.
  • Suitable enzymatic catalysts for the esterification of the acids mentioned and the acetal components containing hydroxyl groups include the hydrolases, especially the lipases (ester hydrolases) such as the lipases from Candida rugosa (formerly Candida cylindracea), Candida antarctica, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Rhizopus arrhizus and Mucor miehei.
  • the lipases especially the lipases (ester hydrolases) such as the lipases from Candida rugosa (formerly Candida cylindracea), Candida antarctica, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Rhizopus arrhizus and Mucor miehei.
  • a preferred lipase is the lipase (isoenzyme B) from Candida antarctica, for which there are two reasons. First, it shows a particularly high selectivity in the esterification of the acetals with the unsaturated fatty acids, although these are not among their typical substrates. Furthermore, it shows no interface activation (a crucial feature for the classification of hydrolases in the group of lipases), since it lacks an important lipase structural feature, a movable peptide chain at the active center (so-called lid).
  • region-specific means that only a certain OH group of a polyol is esterified.
  • regioselective means that a particular OH group of a polyol is preferably, but not exclusively, esterified.
  • a process must generally follow in order to purify the desired compound (s). It is therefore a further object of the present invention to provide a process for the purification of the compounds of the formula (I), which is characterized in that it is an aqueous two-phase extraction process with organic solvents, by means of which the target compound is selective from the non implemented fatty acids can be separated.
  • the organic solvent is preferably n-hexane, cyclohexane, THF, dieethyl ether.
  • the purification can also be carried out by a chromatographic process on silica gel, preferably with ethyl acetate / methanol or dichloromethane / methanol mixtures with small proportions of acetic acid and / or water, which can also be carried out in addition to an aqueous two-phase extraction process with organic solvents.
  • flavone / isoflavone glycosides of the formula (I) have good bioavailability and activity, they can be used in cosmetic and pharmaceutical preparations and / or as food additives, with the result that the quality of these products is significantly improved.
  • the compounds of the formula (I) according to the invention have an inhibition of skin proteases (anti-aging, anti-wrinkling), an antioxidative potential, skin-lightening effect and an inhibition of transcription. That is particularly surprising skin-lightening effect (as a result of an inhibition of tyrosinase) of these compounds, in particular the good skin-lightening effect of the compounds according to the invention in which ZOX means naringin and the primary OH group of which is esterified either with phenylpropionic acid, with hydroxyphenylacetic acid or with p-chlorophenylacetic acid.
  • the compounds of the formula (I) according to the invention are capable of causing sunlight To influence expression of MMP-1, TIMP and Col ⁇ i in a cosmetically desired manner and thus to counteract the loss of collagen in the Dennis.
  • these compounds are outstandingly suitable for a cosmetic treatment of the skin, by means of which aging of the skin induced by sunlight is prevented and / or by which the consequences thereof are reduced.
  • MMP - quantification of the enzyme activity of MMP-1
  • mRNA The production of mRNA is the first and most important step in the course of protein synthesis. Active substances that have an effect on mRNA production therefore automatically also have an effect on the amount of protein and enzyme activity. In a subsequent step, the effects of the effects on mRNA production can be demonstrated by the detection of the protein collagen in the skin model itself. In the context of the invention it was possible to show that naringin derivatives according to the invention are able to reduce the expression of MMP, to increase the expression of TIMP, to increase the expression of COICH and to increase the formation of collagen.
  • MMP-1 is predominantly produced by fibroblasts, but the reactions of the skin to stress should not be viewed as reactions of individual, isolated skin cells. Rather, every cell is integrated into a complex communication network. This network effects the exchange of information directly between neighboring cells, but also between cells located further apart, e.g. the cells of the epidermis and dermis.
  • the communication mechanisms between the cells of the skin include signaling molecules such as Interleukins, growth factors (e.g. KGF, EGF or FGF) etc. involved. For this reason, the analysis of the drug effects was carried out on skin models consisting of a dermal and an epidermal compartment.
  • the compounds according to the invention are considerably less phototoxic compared to conventional active substances against photoaging of the skin.
  • the compounds according to the invention can be incorporated particularly well into lipophilic base formulations and can be easily formulated as stable emulsions.
  • the compounds of formula (I) according to the invention are used for the production of cosmetic and / or pharmaceutical preparations and / or food or feed.
  • the compounds according to the invention can be present or used in the form of the pure substance or as a mixture of plant extracts of different origins.
  • the (iso-) flavones and their glycosides are preferably used in the preparations / additives as components of a mixture of substances obtained from a plant, in particular a vegetable extract.
  • Such vegetable substance mixtures can be obtained in a manner familiar to the person skilled in the art, for example by pressing or extracting them from plants such as citrus plants (family of the Rutaceae) or acacias.
  • the invention further relates to the use of the compounds of the formula (I) for the production of cosmetic and / or pharmaceutical preparations; the use as food supplements or additives in food preparations and in feed (e.g. for animal breeding); cosmetic and pharmaceutical preparations as well as food preparations and animal feeds containing (a) compound (s) of the formula (I).
  • the cosmetic preparations obtainable using the compounds (I) according to the invention, such as hair shampoos, hair lotions, bubble baths, shower baths, creams, gels, lotions, alcoholic and aqueous / alcoholic solutions, emulsions, wax / fat compositions, stick preparations, powders or ointments as auxiliaries and additives, mild surfactants, oil bodies, emulsifiers, superfatting agents, pearlescent waxes, consistency agents, thickening agents, polymers, silicone compounds, fats, waxes, stabilizers, biogenic agents, deodorants, antidandruff agents, film formers, swelling agents, UV light protection factors, antioxidants, hydrotropes, Contain preservatives, insect repellents, self-tanners, solubilizers, perfume oils, dyes, germ-inhibiting agents and the like.
  • auxiliaries and additives mild surfactants, oil bodies, emulsifiers, superfatting agents, pearlescent waxes, consistency agents
  • the amount of the compounds according to the invention in the cosmetic (but also pharmaceutical) preparations is usually in the range from 0.01 to 5% by weight, but preferably in the range from 0.1 to 1% by weight, based on the total mass of the preparations ,
  • the compounds of the general formula (I) according to the invention optionally in combination with other active substances, together with one or more inert substances usual carriers and / or diluents, e.g. B. with corn starch, milk sugar, cane sugar, microcrystalline cellulose, magnesium stearate, polyvinylpyrrolidone, citric acid, tartaric acid, water, water / ethanol, water / glycerin, water / sorbitol, water / polyethylene glycol, propylene glycol, carboxymethyl cellulose or fatty substances such as hard fat or their suitable mixtures , in common galenical preparations such as tablets, dragees, capsules, powders, suspensions, drops, ampoules, juices or suppositories.
  • inert substances usual carriers and / or diluents, e.g. B. with corn starch, milk sugar, cane sugar, microcrystalline cellulose, magnesium stearate, polyvinylpyrrolidone, cit
  • the daily dosage required to achieve a corresponding effect in pharmaceutical applications is advantageously 0.1 to 10 mg / kg body weight, preferably 0.5 to 2 mg / kg body weight.
  • An example of use in the food industry is for the compounds of the formula (I) as colorings and / or spices.
  • the reaction was carried out by means of thin layer chromatography (silica gel KG60 plates with fluorescent indicator; eluent: ethyl acetate / methanol 10: 1 v / v; visualization: UV detection and by means of acetic acid / sulfuric acid / anisaldehyde (100: 2: 1 v / v / v) immersion reagent
  • the product was extracted with 20 ml of n-hexane and purified by column chromatography (silica gel F60; mobile phase: ethyl acetate / methanol 10/1 v / v).
  • Rf value 0.47 (ethyl acetate / methanol 10: 1)
  • naringin 1.5 g of 3-phenylpropionic acid, 3.7 g of molecular sieve, 15 ml of t-butanol and 11 g of immobilized lipase B from Candida antartica were incubated for 24 hours at 60 ° C. and 100 rpm in a 250 ml flask , The reaction was followed by thin layer chromatography (silica gel 60 F 254 ; eluent ethyl acetate / methanol 10: 1 v / v; visualization by UV detection). When the reaction was stopped, the conversion based on naringin was 20%. The product was extracted with 20 ml of n-hexane and purified by column chromatography (silica gel F60; eluent: ethyl acetate / methanol 10/1 v / v).
  • naringin 5.8 g of naringin, 1.7 g of p-chlorophenylacetic acid, 3.8 g of molecular sieve, 15 ml of t-butanol and 11 g of immobilized lipase B from Candida antartica were incubated at 60 ° C. and 100 rpm in a 250 ml flask for 24 hours , The reaction was followed by thin layer chromatography (silica gel 60 F 254 ; eluent ethyl acetate / methanol 10: 1 v / v; visualization by UV detection). When the reaction was stopped, the conversion based on naringin was 20%. The product was extracted with 20 ml of n-hexane and purified by column chromatography (silica gel F60; eluent: ethyl acetate / methanol 10/1 v / v).
  • Naringin derivatives prepared as described in Example 1 (reaction with Novozym SP435 for 48 h at 65 ° C, stirring speed 1200 rpm). The reaction was checked by means of thin layer chromatography and the conversion (based on the naringin used) was determined.
  • Example 5 Inhibition of tyrosinase activity
  • Tyrosinases catalyze an important physiological step in melanin synthesis (L-dopa to L-dopaquinone, which continues to cyclize and is converted to dopachrome again by a tyrosinase). Inhibiting tyrosinase can lead to a skin-lightening effect.
  • the linear increase in absorption (A) of the Dopachromes per unit time (t) is a measure of the activity of tyrosinase ( ⁇ A / ⁇ t).
  • the activity of the tyrosinase in the absence of the active substances ( ⁇ Ai / ⁇ ti) served as a reference and was set to 100%.
  • the residual tyrosinase activity was determined under analogous conditions in the presence of the active compounds ( ⁇ A 2 / ⁇ t 2 ). Each measurement was carried out twice in parallel batches. The fluctuation in the results of the method is approximately ⁇ 10%.
  • L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine
  • JT Baker JT Baker
  • reaction cocktail like the tyrosinase stock solution, was only prepared before the start of the experiment.
  • the tyrosinase stock solution must be stored in a cool place.
  • the L-DOPA solutions should be kept dark and in well-sealed containers with the exclusion of oxygen. If the color changes to gray (oxidation by atmospheric oxygen), the solution must be freshly prepared.
  • Test system sample volume 1 ml
  • reaction procedure 33 ⁇ l tyrosinase stock solution 100 ⁇ l active ingredient stock solution 5 ad 1000 ⁇ l reaction cocktail
  • Active ingredient 6-O-naringin (3-phenyl-propionic acid) ester from Example 2 15 active ingredient concentration in the test system 0.005% 0.05% 0.5% (w / v in H 2 O bidist.) Residual activity of the tyrosinase in% 98.9 69.1 0.7
  • Active ingredient 6-O-naringin (p-CI-phenylacetic acid) ester from Example 3 .0 active ingredient concentration in the test system 0.01% 0.1% (w / v in 98% ethanol)
  • Dermal fibroblasts of human skin were found with increasing concentrations of retinol (Table 1), 6-O-naringin (p-CI-phenylacetic acid) ester (Table 2) and 6-O-naringin (3-phenylpropionic acid) ester (Table 3) cultured.
  • the phototoxicity of the substances was measured using an MTT test.
  • the treated cells were irradiated with simulated sunlight, corresponding to a dose of 10 J UV-A / cm2.
  • the vitality of untreated cells was set to 100% and all other values related to it.
  • the cells were irradiated with a sunlight simulator, from whose emission spectrum the UV-A portion of the radiation was measured for quantification.
  • the advantage of this experimental design is the fact that the entire spectrum of sunlight is used and the everyday situation is thus perfectly reproduced. In contrast, many other research laboratories work with pure UV-A and / or UV-B lamps.
  • Example 7 Effects on light-induced expression of MMP-1, TIMP and Colc mRNA
  • RNA used in the experiments were carried out with an 18S-specific gene probe.
  • the autoradiograms were measured densitometrically and the values of the signals for MMP1, TIMP and Colch were related to the associated values of the 18S signals.
  • the numerical values in the tables represent the densitometric quantification of the signals of a Northern blot after their normalization.
  • the light-induced expression of MMP1, TIMP and Col ⁇ ⁇ in the case of untreated cells was set to 100% in each case and all other values based on this.
  • TIMP Irradiation of skin models with simulated sunlight resulted in a strong induction of MMP1 mRNA synthesis, while the synthesis of collagen was down-regulated. The production of TIMP remained largely unaffected.
  • Table 4 shows that 50 ppm 6-O-naringin (p-CI-phenylacetic acid) ester very effectively reduced the sunlight-induced expression of MMP-1.
  • the expression of TIMP was only slightly influenced, the expression of Col ⁇ i is significantly increased compared to the irradiated, untreated sample.
  • Treatment of the cells with 100 ppm 6-O-naringin (3-phenyl-propionic acid) ester reduced the sunlight-induced expression of MMP-1 to the level of the unirradiated, untreated sample (Table 5).
  • the expression of TIMP increased by approx. 35%.
  • the expression of Col ⁇ i could be increased to the level of the unirradiated, untreated culture.
  • fibroblasts were treated with the test substances in a three-dimensional culture system for 5 days. On the sixth day, the amount of collagen formed compared to non-collagen protein was determined by incorporating tritiated protein. Table 7 shows the percentage increase in the proportion of collagen in the total protein, determined from treated fibroblast cultures compared to untreated cultures.

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Abstract

Flavon- und Isoflavonglykosid-Derivate der allgemeinen Formel (I): [A1-C(=O)O]m-[X-O-Z]-[O-C(=O)-A2]n (I), worin [X-O-Z] eine Flavon- oder Isoflavonglykosid-Struktur darstllt, worin X einen Flavon- oder Isoflavongrundkörper der Formel (IIa) bzw. (IIb) darstellt, wobei der (Iso-)Flavongrundkörper einfach oder mehrfach substituiert und/oder einfach oder mehrfach reduziert (hydriert) ist, worin Z (Zucker) für ein Mono-, Disaccharid oder Polysaccharid steht, das acetalisch an den Rest X gebunden und n-fach esterartig mit A2 substituiert ist, worin [A1-C(=O)] einen Acylrest am Flavon- oder Isoflavongrundkörper darstllt, worin A1 und A2 unabhängig voneinander einen mehrfach ungesättigten C15- C25-Alkenylrest mit mindestens 4 isolierten und/oder mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen oder einen arylaliphatischen Rest mit 1-4 Methylengruppen zwischen Ester-Gruppe und aromatischem Ring darstellen, worin [C(=O)A2] einen Acylrest am Zucker Z darstellt, worin n eine ganze Zahl (1, 2, 3, ...), nicht aber 0 ist, worin m eine ganze Zahl einschliesslich 0 (0, 1, 2, 3, ...) ist, und worin R1, R2, R3 Hydroxylgruppen oder Wasserstoff-Atome darstellen.

Description

Neue Flavonglykosid-Derivate für den Einsatz in Kosmetika, Pharmazeutika und Ernährung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, biologisch aktive Flavon- und Isoflavonglykosid- Derivate der allgemeinen Formel (I)
[A1-C(=0)O]m-[X-O-Z]-[O-C(=O)-A2]n (I) von aliphatischen und arylaliphatischen Carbonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen, ebenso wie deren Einsatz als Zusatzstoffe in der Ernährung und in Futtermitteln.
In der Kosmetik wird die Anwendung von Wirkstoffen immer wichtiger. Bei den Wirkstoffen, die bisher bereits Anwendung in der Kosmetik finden, handelt es sich nicht immer um Naturstoffe. Die Optimierung bekannter Wirkstoffe und die Herstellung neuer Wirkstoffe sind Gegenstand vieler Forschungsarbeiten.
Im weitesten Sinne sind Wirkstoffe solche Stoffe, die - in relativ kleinen Mengen vorkommend oder zugeführt - große physiologische Wirkung entfalten können. Hier ist an Hormone, Vitamine, Enzyme, Spurenelemente etc. zu denken, aber auch an Pharmaka (Arzneistoffe), Futterzusätze, Düngemittel und
Schädlingsbekämpfungsmittel. Nicht selten kann man auch Synergismus beobachten.
Flavone und Isoflavone/Flavonoide und Isoflavonoide bzw. Flavonqlvkoside und Isoflavon-qlykoside
Flavone sind 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-one, bei denen an verschiedenen Positionen der Ringe Hydroxylgruppen vorliegen oder auch fehlen können. Ein Beispiel für ein Flavon ist Apigenin, dessen chemischer Name 2-(p-Hydroxyphenyl)-4H-1-(5,7- dihydroxybenzopyran-4-on lautet (siehe Römpp Chemie-Lexikon, 9. Auflage, Band 2, S. 1373/4). Die zusätzlichen Hydroxylgruppen sitzen dabei, wie das genannte Beispiel zeigt, an dem Phenyl- und/oder dem Benzopyranring. Anders ausgedrückt: im Sinne der vorliegenden Erfindung sind unter Flavonen Stoffe zu verstehen, die Hydrierungs-, Oxidations- oder Substitutionsprodukte des 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-ons darstellen, wobei eine Hydrierung in der 2,3-Stellung des Kohlenstoffgerüsts erfolgen kann, und wobei unter Substitution der Ersatz eines oder mehrerer Wasserstoffatome durch Hydroxy- oder Methoxy-Gruppen zu verstehen ist. Bei dieser Definition sind also Flavane, Flavan-3-ole (Catechine), Flavan-3,4-diole (Leukoanthocyanidine), Flavone, Flavonole und Flavanone im herkömmlichen Sinn eingeschlossen. Zu den erfindungsgemäßen Flavonen zählen neben Apigenin beispielsweise Chrysin, Galangin, Fisetin, Luteolin, Kampferöl, Quercetin, Mohn, Robinetin, Gossypetin, Taxifolin, Myricetin, Rhamnetin, Isorhamnetin, Naringenin, Eriodyctiol, Hesperetin, Liquiritigenin, Catechin und Epicatechin.
Unter Isoflavonen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung hingegen solche Stoffe zu verstehen, die Hydrierungs-, Oxidations- oder Substitutionsprodukte des 3-Phenyl-4H- 1-benzopyran-4-ons darstellen, wobei eine Hydrierung in der 2,3-Stellung des Kohlenstoffgerüsts erfolgen kann, und wobei unter Substitution der Ersatz eines oder mehrerer Wasserstoffatome durch Hydroxy- oder Methoxy-Gruppen zu verstehen ist. Zu den erfindungsgemäßen Isoflavonen zählen beispielsweise Daidzein, Genistein, Prunetin, Biochanin, Orobol, Santal, Pratensein, Irigenin, Glycitein, Biochanin A und Formononetin.
Flavone und Fiavonglykoside (Flavonoide) wie Asparatin, Orientin (Lutexin), Cisorientin (Lutonaretin), Isoquercitin, Rutin, Naringin und die oben genannten, aber auch Isoflavone und Isoflavonglykoside (Isoflavonoide) sind bekanntermaßen Fänger von Sauerstoffradikalen sowie Hemmer von Proteasen der Haut, wodurch sie aktiv der Alterung der Haut und Vernarbungen entgegenwirken können. Wegen ihrer färberischen Eigenschaften sind einige Flavone wie Quercetin als Lebensmittelfarbstoffe in Gebrauch. Gleichzeitig wirken sie auf Grund ihrer Fähigkeit, Sauerstoffradikale einzufangen, auch als Antioxidantien. Einige Flavonoide sind Inhibitoren der Aldose-Reduktase. Diese spielt bei der Entstehung von Diabetesschäden (Gefäßschäden, Grauer Star) eine entscheidende Rolle. Andere Flavonoide (wie Hesperidin und Rutin) finden therapeutische Verwendung insbesondere als gefäßerweiterende, kapillaraktive Mittel. Die erfindungsgemäß durchgeführten Derivatisierungen erzielen eine verbesserte Wirkung sowie eine erhöhte Bioverfügbarkeit, wie es bereits früher am Beispiel von Salicinderivaten gezeigt wurde.
Viele natürlich vorkommende Alkyl- und Phenol-Glucoside zeigen antivirale, antimikrobielle und teilweise antiinflammatorische Wirkungen. Sie sind jedoch oft aufgrund ihrer Polarität wenig bioverfügbar bzw. ihre Selektivität ist zu gering. Beispielsweise ist Salicin (ein glykosidischer Wirkstoff aus der Weidenrinde) ein nichtsteroidales antiinflammatorisches Agenz (NSAIA), das nach Derivatisierung (Veresterungen) deutlich verbesserte Wirksamkeit zeigt. Kürzlich gelang die Synthese neuer arylaliphatischer Salicinester wie Phenylacetoyl-Salicin oder Phenylbutyroyl- Salicin, wobei die Veresterung bevorzugt an den primären OH-Gruppen des Salicins (zunächst am Zucker, dann am Benzylrest) im Salicin erfolgte. Aufgrund des arylaliphatischen Restes wird der Stofftransport an den Wirkort verbessert und die Selektivität der Wirkung erhöht. So inhibieren diese Derivate im Gegensatz zu unmodifiziertem Salicin bevorzugt die Prostaglandinsynthase 2 (geringere Gefahr von Nebenwirkungen) (Ralf T. Otto, Biotechnologische Herstellung und Charakterisierung neuer pharmazeutisch aktiver Glykolipide, Dissertation (1999) ISBN 3-86186-258-1).
PUFAs und CLAs
Die PUFAs (engl. polyunsaturated fatty acids) und CLAs (conjugated linoleic acids) gehören in der Ernährung zu der Gruppe der essentiellen Fettsäuren und zeigen zusätzlich eine positive Wirkung beim Einsatz in der Prophylaxe von Arteriosklerose. Daneben sind auch pharmazeutische Effekte von Bedeutung: Sie können antiinflammatorische (Hemmung der Prostaglandin- bzw. Leukotriensynthese), aber auch eine thrombolytische und hypotensive Wirkung aufweisen.
Erfindungsgemäß wird PUFA definiert als eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 26 C-Atomen, wobei die Fettsäure mindestens vier isolierte und/oder mindestens zwei konjugierte Doppelbindungen aufweist. Beispiele für PUFAs sind die insgesamt zwölf zur Linolsäure (eis, eis, 9,12-Octadecadiensäure) isomeren Octadecadiensäuren (die in der Natur vorkommen), die über konjugierte Doppelbindungen an den C-Atomen 9 und 11 , 10 und 12, oder 11 und 13 verfügen.
Diese Isomeren der Linolsäure (z.B. eis, trans, 9,11-Octadecadiensäure, trans, eis, 10,12-Octa-decadiensäure, eis, eis, 9,11-Octadecadiensäure, trans, eis, 9,11- Octadecadiensäure, trans, trans, 9,11-Octadecadiensäure, eis, eis, 10,12- Octadecadiensäure, eis, trans, 10,12-Octadecadiensäure, trans, trans, 10,12- Octadecadiensäure) lassen sich auf herkömmlichem Weg mittels chemischer Isomerisierung der Linolsäure herstellen, wobei diese Reaktionen in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen ausschließlich zu CLA-Gemischen unterschiedlichster Zusammensetzung führen (z.B. Edenor UKD 6010, Henkel KGaA). Aufgrund ihrer konjugierten Doppelbindungen werden diese isomeren Octadecadiensäuren auch als "conjugated linoleic acids" (CLAs) bezeichnet.
Obwohl in der Literatur bereits zahlreiche pharmakologisch wirksame Stoffe beschrieben sind, die beispielsweise in die Entzündungskaskade eingreifen, besteht weiterhin ein Bedarf an besser wirksamen, an Nebenwirkungen armen Wirkstoffen. Weiter besteht ein Bedarf an Wirkstoffen mit einer guten Resorbierbarkeit und einer schnellen Penetration in die Haut, die zudem gut in pharmazeutische oder kosmetische Formulierungen einarbeitbar sein müssen.
Weiterhin besteht ein besonderes Interesse an der Auffindung von Wirkstoffen, welche den Alterungsprozessen der menschlichen Haut vorbeugen können.
Die menschliche Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer und chemischer Natur ausgesetzt. Viele dieser exogenen Noxen tragen zum Alterungsprozeß der Haut bei.
Die makroskopischen Phänomene alternder Haut beruhen zum einen auf der intrinsischen oder chronologischen Alterung, zum anderen auf der extrinsischen Alterung durch Umweltstress. Die Fähigkeit lebender Hautzellen, auf Ihre Umwelt zu reagieren, verändert sich mit der Zeit. Es finden Alterungsprozesse statt, die zur Seneszenz und letztendlich zum Zelltod führen. Die sichtbaren Zeichen gealterter Haut sind als Integral der intrinsischen und der extrinsischen Alterung (z.B. durch Sonnenlicht) zu verstehen, wobei die Ereignisse der extrinsischen Alterung über einen längeren Zeitraum in der Haut akkumulieren.
Exogene Signale werden von Zellen empfangen und führen, zum Teil über komplexe Signaltransduktionskaskaden, zu Veränderungen im Genexpressionsmuster. Auf diese Weise reagiert jede Zelle auf Signale aus ihrer Umgebung mit der Anpassung ihres Metabolismus. Z.B. bemerken die Zellen der Haut die energiereiche Strahlung der Sonne und reagieren darauf mit der Umstellung ihrer RNA- und Proteinsyntheseleistungen. Einige Moleküle werden nach einem Stressstimulus (z.B. Sonnenlicht) vermehrt synthetisiert (z.B. die Kollagenase MMP-1), andere wiederum werden in einem geringerem Umfang produziert (z.B. Kollagencπ). Weiterhin wird bei einer Vielzahl der Syntheseprozesse keine signifikante Veränderung erfolgen (z.B. TIMP-1).
Die Induktion der Kollagenase MMP-1 durch Sonnenlicht oder andere Stressfaktoren wird als Hauptursache für den Prozess der extrinsischen Hautalterung angesehen. Die Kollagenase MMP-1 zerstört den wichtigsten Bestandteil des Bindegewebes der Haut, das Kollagen, und führt dadurch unter anderem zu einer Reduktion der Hautelastizität und zur Ausbildung tiefer Falten. In der jungen und nicht gestressten Haut wird die Aktivität der Kollagenase durch einen natürlich vorkommenden Inhibitor TIMP-1(Tissue Inhibitor of Matrix Metalloprotease-1) reguliert. Zwischen MMP-1 und TIMP-1 besteht ein äußerst sensibles Gleichgewicht, welches durch exogenen Stress empfindlich gestört wird. Die Expression von MMP-1 wird durch Hautstress, wie z.B. die Bestrahlung mit Sonnenlicht verstärkt. Demgegenüber wird die Synthese des Inhibitors TIMP-1 nicht signifikant verändert. Daher kommt es unter Einwirkung von exogenem Stress, wie z.B. Sonnenlicht, in der Haut zu einem übermäßigen Abbau von Kollagen. Die Folge ist eine vorzeitige Alterung der Haut.
Bestrebungen zur kosmetischen Behandlung der Effekte einer stressinduzierten Hautalterung haben die Reduktion der MMP-1-Aktiviät oder die verstärkte Synthese von Kollagen zum Ziel. Durch die Verwendung von Retinsäure bzw. Retinol soll die MMP-1 Synthese in der Haut vermindert oder die Kollagensynthese verstärkt werden. Jedoch ist der Einsatz von Retinsäure für Kosmetika in Europa aufgrund teratogener Eigenschaften nicht gestattet. Zytotoxische Effekte, unzureichende Stabilität in Formulierungen, unerwünschte Nebenwirkungen oder auch die störende Eigenfarbe führen zur Limitierung der kosmetischen Verwendung von Wirkstoffen, wie z.B. bei alpha-Tocopherol, Propylgallat oder diversen Pflanzenextrakten.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, bestand also darin, nebenwirkungsarme, gut wirkende und gut zu verarbeitende und zu applizierende Substanzen bereitzustellen.
Flavon- und Isoflavonglykoside sind z.B. aus der Natur bekannt. Nicht bekannt (weder aus Pflanzen, Mikroorganismen oder tierischen Zellen noch synthetisch hergestellt) sind hingegen Ester solcher Flavon- und Isoflavonglykoside, bei denen mindestens eine der Hydroxylgruppen des Zuckers mit einer (ungesättigten) Carbon- bzw. Fettsäure verestert ist, und bei denen weiterhin eventuell eine weitere Estergruppierung zwischen einer der Hydroxylgruppen des Flavon- oder Isoflavon-Anteils und einer weiteren ungesättigten Fettsäure vorliegt.
Überraschenderweise wurde von den Erfindern gefunden, daß bestimmte Flavon- und Isoflavonglykosid-Ester eine gegenüber den bekannten Einzelkomponenten (Fettsäure bzw. (Iso-) Flavonglykosid) verbesserte biologische Verfügbarkeit, verstärkte Wirkung und/oder ein verbreitertes Wirkspektrum aufweisen. Bei diesen (Iso-)Flavon-Glykosid- Derivaten sind die Flavone oder Isoflavone über mindestens eine Hydroxylgruppe mit mindestens einem Zucker glykosidisch verknüpft. Dabei kann der Zucker über eine OH- Gruppe am Benzopyran-Ring oder über eine OH-Gruppe am Phenylring des (Iso- )Flavonrestes mit diesem verknüpft sein. Auch die Gruppierung [Aι-C(=O)] kann über eine OH-Gruppe am Benzopyran-Ring oder über eine OH-Gruppe am Phenylring des (Iso-)Flavonrestes mit diesem verknüpft sein. Es ist bevorzugt, wenn der Zucker über den Benzopyran-Ring und die Fett-/Carbonsäure ebenfalls über den Benzopyran-Ring oder über den Phenylring des (Iso-)Flavonrestes mit diesem verknüpft ist. Als Zucker kommen Mono- und Oligosaccharide, insbesondere D-Glucose, D- Galactose, D-Xylose, D-Apiose, L-Rhamnose, L-Arabinose und Rutinose in Betracht. Beispiele für die Flavon-Glykosid-Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind Rutin, Hesperidin und Naringin. Bevorzugte Beispiele für die Isoflavon-Glykosid-Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind Daidzin und Genistin.
Durch die Bereitstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung konnten die Erfinder die gestellte Aufgabe lösen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Flavon- und Isoflavonglykosid-
Derivate der allgemeinen Formel (I):
[A1-C(=O)O]m-[X-O-Z]-[O-C(=O)-A2]n (I), worin [X-O-Z] eine Flavon- oder Isoflavonglykosid-Struktur darstellt, worin X einen Flavon- oder Isoflavongrundkorper der Formel (Ila) bzw. (Ilb)
(Ila) (Ilb)
darstellt, wobei der (Iso-)Flavongrundkörper einfach oder mehrfach substituiert und/oder einfach oder mehrfach reduziert (hydriert) ist, worin Z (Zucker) für ein Mono-, Disaccharid oder Polysaccharid steht, das acetalisch an den Rest X gebunden und n-fach esterartig mit A2 substituiert ist. worin [Aι-C(=O)] einen Acylrest am Flavon- oder Isoflavongrundkorper darstellt, worin A^ und A2 unabhängig voneinander einen mehrfach ungesättigten C15 - C25-
Alkenylrest mit mindestens 4 isolierten und/oder mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen oder einen arylaliphatischen Rest mit 1-4 Methylengruppen zwischen
Ester-Gruppe und aromatischem Ring darstellen, worin [C(=O)A2] einen Acylrest am Zucker Z darstellt, worin n eine ganze Zahl (1 , 2, 3, ...), nicht aber 0 ist, worin m eine ganze Zahl (1, 2, 3, ...) einschließlich 0 ist, und worin R1 , R2, R3 Hydroxylgruppen oder Wasserstoff-Atome darstellen.
Bevorzugte Zuckeranteile sind allgemein solche Z, die ein Monosaccharid bedeuten. Insbesondere bevorzugt sind folgende Monosaccharide: Rhamnose, Threose, Erythrose, Arabinose, Lyxose, Ribose, Xylose, Allose, Altrose, Galactose, Glucose, Gulose, Idose, Mannose, Talose und Fructose, wobei die natürlich vorkommenden Stereoisomere der Zucker die jeweils bevorzugte Form ist. Ebenfalls bevorzugt sind Disaccharide, die aus den zuvor genannten Monosacchariden aufgebaut sind, wobei wiederum die natürlich vorkommenden Stereoisomere der Zucker die jeweils bevorzugte Form ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung des (Iso- )Flavongrundkörpers an den Zucker über eine primäre Alkoholgruppe des Zuckers (z.B. über OH an Cβ der Glukose). Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Z-O-X das Naringin-Gerüst mit der Formel (III)
(III)
Weitere bevorzugte Flavone/Flavonoide (X bzw. X-O-Z) in der allgemeinen Formel (I) sind Asparatin, Orientin (Lutexin), Cisorientin (Lutonaretin), Isoquercitin, Naringin, Rutin, Kampferöl und Quercetin handelt.
Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind vor allem solche, bei denen X-O-Z Naringin gemäß Formel (III) ist, und A2 die Acylreste folgender Säuren sind: p- Chlorphenylessig-, Hydrozimt-, Stearin-, 12-Hydroxystearin-, Palmitin-, Laurin-, Öl-, Coumar-, Caprin-, Zimt-, 4-Phenylbutter-, 4-Hydroxyphenylessig-, 5- Phenylvaleriansäure oder die unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505. Edenor UKD 6010 und UKD 7505, p-Chlorphenylessig- und Hydrozimtsäure sind besonders bevorzugte Säuren. Besonders bevorzugt ist für alle diese Kombinationen aus Naringin und den genannten Fettsäuren, wenn n=1 oder n=2 und m gleichzeitig 0 ist. Wenn n=1 (und m=0) , ist die bevorzugte Position von A2 die primäre OH-Gruppe am Zucker-Anteil in der Formel (III). Aber auch alle sekundären OH-Gruppen des Zuckers kommen als bevorzugte Ausführungsformen für die Veresterung in Betracht. Wenn n=2 (und m=0), ist es bevorzugt, wenn eine Veresterung an der primären OH-Gruppe und die zweite an einer der sekundären OH-Gruppen des Zuckers.Jnsbesondere an einer der beiden sekundären OH-Gruppen am selben oder an einer der drei sekundären OH-Gruppen des zweiten Sechsrings, erfolgt.
Weitere bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind solche, bei denen X- O-Z Naringin ist, A2 die Acylreste folgender Säuren sind: p-Chlorphenylessig-, Hydrozimt-, Stearin-, 12-Hydroxystearin-, Palmitin-, Laurin-, öl-, Coumar-, Caprin-, Zimt-, 4-Phenylbutter-, 4-Hydroxyphenylessig-, 5-Phenylvaleriansäure oder die unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505; n = 1 oder n=2 und m gleichzeitig 1 ist. Wenn n und m beide 1 sind, ist die bevorzugte Position von A2 die primäre OH-Gruppe im Zucker, die=von Ai entweder die 5-OH- Gruppe des Benzopyran- oder die 4'-Hydroxy-Gruppe des Phenylrings. Aber wie im Fall, wenn m=0, kann A2 auch über alle sekundären OH-Gruppen des Zuckers verestert werden. Wenn n = 2 und m gleichzeitig 1 ist, ist es bevorzugt, wenn die eine Veresterung von A2 an der primären OH-Gruppe und die zweite an einer der sekundären OH-Gruppen des Zuckers, insbesondere an einer der beiden sekundären OH-Gruppen am selben oder an einer der drei sekundären OH-Gruppen des zweiten Sechsrings, und die Veresterung von A^ über den Benzopyran- oder den Phenylring erfolgt.
Die Erfinder haben herausgefunden, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) überraschenderweise durch milde lipasekatalysierte Veresterungen gewonnen werden können. Demnach ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I). Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Acetal (aus Zucker und Flavon-/lsoflavon-Grundkörper) mit einer polyungesättigten Fettsäure (mit mindestens vier isolierten Doppelbindungen oder mit mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen) wie einer konjugierten Linolsäure (Octadecadiensäure), mit einer arylaliphatischen Carbonsäure, mit einem Ester dieser Carbonsäuren oder mit einem aktivierten Fettsäurederivat unter katalytischer Einwirkung von einem oder mehreren Enzymen verestert oder umgeestert wird. Die Veresterung an primären OH-Gruppen des Zuckers ist dabei bevorzugt, aber auch sekundäre Alkohol-Gruppen des Zuckers können verestert werden.
Zu den geeigneten enzymatischen Katalysatoren zur Veresterung der genannten Säuren und den Hydroxylgruppen enthaltenden Acetal-Komponenten zählen die Hydrolasen, speziell die Lipasen (Ester-Hydrolasen) wie die Lipasen aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea), Candida antarctica, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Rhizopus arrhizus und Mucor miehei.
Eine bevorzugte Lipase ist die Lipase (Isoenzym B) aus Candida antarctica, wofür es zwei Gründe gibt. Erstens zeigt sie eine besonders hohe Selektivität bei der Veresterung der Acetale mit den ungesättigten Fettsäuren, obwohl diese nicht zu ihren typischen Substraten zählen. Des weiteren zeigt sie keine Grenzflächenaktivierung (ein entscheidendes Merkmal zur Klassifizierung von Hydrolasen in die Gruppe der Lipasen), da ihr ein wichtiges Lipasestrukturmerkmal, eine bewegliche Peptidkette am aktiven Zentrum (sog. lid) fehlt.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen nach den üblichen Methoden der chemischen Synthese kommt es wegen der Anwesenheit mehrerer freier Hydroxylgruppen des Zuckers und/oder Flavon-/lsofiavon-Grundkörpers in der Regel zur Bildung von Gemischen aus einfach und mehrfach veresterten Produkten, so daß die Einführung und Entfernung von Schutzgruppen notwendig ist, wenn man gezielt eine bestimmte Verbindung synthetisieren will. Gerade die gezielte Veresterung ist aber für die biologische Verfügbarkeit und Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Substanzen entscheidend. Die chemische Synthese führt jedoch aufgrund mangelnder Regioselektivität zu groben Produktgemischen. Daher ist die hier beschriebene enzymatische (siehe Beispiele) milde und regioselektive Synthese von Vorteil. Erfindungsgemäß bedeutet regiospezifisch, daß nur e i n e bestimmte OH-Gruppe eines Polyols verestert wird. Entsprechend bedeutet regioselektiv, daß e i n e bestimmte OH-Gruppe eines Polyols bevorzugt, aber nicht ausschließlich, verestert wird.
Sind die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) erst einmal mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt worden, muß in aller Regel ein Verfahren folgen, um die gewünsche(n) Verbindung(en) aufzureinigen. Somit besteht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Aufreinigung der Verbindungen der Formel (I) bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein wäßriges Zweiphasen-Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln handelt, mit dem die Zielverbindung selektiv von den nicht umgesetzten Fettsäuren getrennt werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem organischen Lösungsmittel um n-Hexan, Cyclohexan, THF, Dieethylether. Alternativ kann die Aufreinigung auch durch ein chromatographisches Verfahren an Kieselgel, vorzugsweise mit Ethylacetat/Methanol- oder Dichlormethan/Methanol-Gemischen mit geringen Anteilen Essigsäure und/oder Wasser erfolgen, das auch zusätzlich zu einem wäßrigen Zweiphasen-Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden kann.
Da die erfindungsgemäßen Flavon-/Isoflavonglykoside der Formel (I) eine gute biologische Verfügbarkeit und Wirkung haben, lassen sie sich in kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen und/oder als Nahrungsmittel-Zusatzstoffe verwenden mit dem Ergebnis, daß die Qualität ebendieser Produkte deutlich verbessert wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel(l) weisen eine Inhibition von Hautproteasen (anti-aging, anti-wrinkling), ein antioxidatives Potential, hautaufhellende Wirkung sowie eine Inhibition der Transkription auf. Überraschend ist vor allem die hautaufhellende Wirkung (infolge einer Hemmung der Tyrosinase) dieser Verbindungen, insbesondere die gute hautaufhellende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen Z-O-X Naringin bedeutet und deren primäre OH-Gruppe entweder mit Phenylpropionsäure, mit Hydroxyphenylessigsäure oder mit p- Chlorphenylessigsäure verestert ist.
Weiterhin wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel(l), insbesondere diejenigen Verbindungen, bei denen Z-O-X Naringin bedeutet und deren primäre OH-Gruppe entweder mit Phenylpropionsäure, mit Hydroxyphenylessigsäure oder mit p-Chlorphenylessigsäure verestert ist, in der Lage sind, die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1 , TIMP und Colαi in kosmetisch erwünschter Weise zu beeinflussen und somit dem Verlust an Kollagen in der Dennis entgegenzuwirken. Dadurch eignen sich diese Verbindungen hervorragend für eine kosmetische Behandlung der Haut, durch welche einer sonnenlichtinduzierten Alterung der Haut vorgebeugt wird und/oder durch welche deren Folgen vermindert werden.
Die Bildung des Kollagens wird insbesondere durch das Ausmaß der Expression von MMP und TIMP beeinflusst. Zur Analyse der Faktoren, die am Prozeß der Homöostase sonnenlichtbestrahlter Hautzellen beteiligt sind, sind folgende Strategien möglich: a) MMP: - Quantifizierung der Enzymaktivität von MMP-1
- Quantifizierung des synthetisierten MMP-1 -Proteins.
- Quantifizierung der synthetisierten MMP-1-mRNA.. b) TIMP - Quantifizierung des synthetisierten TIMP-Proteins.
- Quantifizierung der synthetisierten TIMP-mRNA.. c) Kollagen - Quantifizierung des synthetisierten Kollagen-Proteins.
- Quantifizierung der synthetisierten Colαi-mRNA..
Die Produktion der mRNA ist im Verlauf der Proteinsynthese der erste und damit wichtigste Schritt. Wirkstoffe, die einen Effekt auf die mRNA-Produktion zeigen, haben somit automatisch auch einen Effekt auf die Proteinmenge und die Enzymaktivität. In einem anschließenden Schritt können die Auswirkungen der Effekte auf die mRNA- Produktion durch den Nachweis des Proteins Kollagen im Hautmodell selbst nachgewiesen werden. Im Rahmen der Erfindung konnte gezeigt werden, daß erfindungsgemäße Naringin- Derivate in der Lage sind, die Expression vom MMP zu reduzieren, die Expression von TIMP zu erhöhen, die Expression von COICH ZU erhöhen sowie die Bildung von Kollagen zu erhöhen.
In der fotogealterten Haut wird MMP-1 zwar zum überwiegenden Teil von Fibroblasten produziert, die Reaktionen der Haut auf Stress dürfen aber nicht als Reaktionen einzelner, isolierter Hautzellen betrachtet werden. Vielmehr ist jede Zelle in ein komplexes Kommunikationsnetzwerk eingebunden. Dieses Netzwerk bewirkt den Informationsaustausch direkt benachbarter Zellen, aber auch zwischen weiter voneinander entfernt lokalisierten Zellen, wie z.B. den Zellen der Epidermis und der Dermis. An den Kommunikationsmechanismen zwischen den Zellen der Haut sind Signalmoleküle wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren (z.B. KGF, EGF oder FGF) usw. beteiligt. Aus diesem Grund wurde die Analyse der Wirkstoffeffekte an Hautmodellen durchgeführt, die aus einem dermalen und einem epidermalen Kompartiment bestehen.
Weiterhin wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen im Vergleich zu herkömmlichen Wirkstoffen gegen eine Lichtalterung der Haut erheblich weniger phototoxisch sind.
Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders gut in lipophile Basisrezepturen einarbeitbar und lassen sich auf einfache Weise als stabile Emulsionen formulieren.
Dementsprechend werden die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zubereitungen und/oder Nahrungs- bzw. Futtermitteln verwendet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form der Reinsubstanz oder als Gemisch aus Pflanzenextrakten unterschiedlicher Herkunft vorliegen bzw. verwendet werden. Bevorzugterweise werden dabei die (Iso-)Flavone und deren Glykoside als Bestandteile eines aus einer Pflanze gewonnenen Substanzgemisches, insbesondere eines pflanzlichen Extraktes, in den Zubereitungen/Zusatzstoffen verwendet. Solche pflanzlichen Substanzgemische können in einer dem Fachmann geläufigen Weise, beispielsweise durch Auspressen oder Extrahieren aus Pflanzen wie Zitrusgewächsen (Familie der Rutaceae) oder Akazien gewonnen werden.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind danach die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zubereitungen; die Verwendung als Nahrungsergänzungs- oder -Zusatzstoffe in Nahrungszubereitungen und in Futtermitteln (z.B. für die Tierzucht); kosmetische und pharmazeutische Zubereitungen sowie NahrungsmittelAzubereitungen und Futtermittel, die (eine) Verbindung(en) der Formel (I) enthalten.
Die unter erfindungsgemäßer Verwendung der Verbindungen (I) erhältlichen kosmetischen Zubereitungen, wie Haarshampoos, Haarlotionen, Schaumbäder, Duschbäder, Cremes, Gele, Lotionen, alkoholische und wäßrig/alkoholische Lösungen, Emulsionen, Wachs/Fett-Massen, Stiftpräparate, Puder oder Salben, können ferner als Hilfs- und Zusatzstoffe milde Tenside, ölkörper, Emulgatoren, Überfettungsmittel, Perlglanzwachse, Konsistenzgeber, Verdickungsmittel, Polymere, Siliconverbindungen, Fette, Wachse, Stabilisatoren, biogene Wirkstoffe, Deowirkstoffe, Antischuppenmittel, Filmbildner, Quellmittel, UV-Lichtschutzfaktoren, Antioxidantien, Hydrotrope, Konservierungsmittel, Insektenrepellentien, Selbstbräuner, Solubilisatoren, Parfümöle, Farbstoffe, keimhemmende Mittel und dergleichen enthalten.
Die Einsatzmenge der erfindungsgemäßen Verbindungen in den kosmetischen (aber auch pharmazeutischen) Zubereitungen liegt üblicherweise im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise jedoch im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitungen.
Zur Herstellung pharmazeutischer oder auch kosmetischer Zubereitungen lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I), gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirksubstanzen, zusammen mit einem oder mehreren inerten üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln, z. B. mit Maisstärke, Milchzucker, Rohrzucker, mikrokristalliner Cellulose, Magnesiumstearat, Polyvinylpyrrolidon, Zitronensäure, Weinsäure, Wasser, Wasser/Ethanol, Wasser/Glycerin, Wasser/Sorbit, Wasser/Polyethylenglykol, Propylenglykol, Carboxymethylcellulose oder fetthaltigen Substanzen wie Hartfett oder deren geeigneten Gemischen, in übliche galenische Zubereitungen wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Pulver, Suspensionen, Tropfen, Ampullen, Säfte oder Zäpfchen einarbeiten.
Die zur Erzielung einer entsprechenden Wirkung bei pharmazeutischen Anwendungen erforderliche tägliche Dosierung beträgt zweckmäßigerweise 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,5 bis 2 mg/kg Körpergewicht.
Die unter erfindungsgemäßer Verwendung der Verbindungen der Formel (I) erhältlichen Nahrungsersatz- und -Zusatzstoffe wie Sportler-Drinks enthalten geeigneterweise die Verbindung(en) der Formel (I) in einer Menge, die bei einem üblichen Bedarf an Flüssigkeitsaufnahme von 1 bis 5 Litern pro Tag zu einer Dosierung dieser Verbindungen von an 0.1 bis 10 mg, vorzugsweise 0,5 bis 5 mg, pro kg Körpergewicht führt. Eine beispielhafte Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie besteht für die Verbindungen der Formel (I) als Färbe- und/oder Gewürzstoffe.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von 6-O-cis-9,trans-11-Octadecadienoyl-Naringin
2 g D-(-)-Naringin 5 g, CLA (Edenor UKD 6010), 12 g Molekularsieb, 15 ml t-Butanol und 10 g immobilisierte Lipase B aus Candida antarctica wurden 40 Stunden bei 60°C und 100 rpm am Magnetrührer im 250 ml Erlenmeyerkolben inkubiert. Die Umsetzung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel KG60-Platten mit Fluoreszenzindikator; Laufmittel: Ethylacetat/Methanol 10:1 v/v; Visualisierung: UV- Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefelsäure/Anisaldehyd (100:2:1 v/v/v) Tauchreagenz nachgewiesen. Das Produkt wurde mit 20 ml n-Hexan extrahiert und über Säulenchromatographie (Kieselgel F60; Laufmittel: Ethylacetat/Methanol 10/1 v/v) gereinigt. Rf-Wert: 0.47 (Ethylacetat/Methanol 10:1)
Beispiel 2: Herstellung von 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester
5,8 g Naringin, 1,5 g 3-Phenylpropionsäure, 3,7 g Molekularsieb, 15 ml t-Butanol und 11 g immobilisierte Lipase B aus Candida antartica wurden 24 Stunden bei 60°C und 100 rpm in einem 250 ml Kolben inkubiert. Die Umsetzung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60 F254; Laufmittel Ethylacetat/Methanol 10:1 v/v; Visualisierung durch UV-Detektion) verfolgt. Bei Abbruch der Reaktion betrug der Umsatz bezogen auf Naringin 20%. Das Produkt wurde mit 20 ml n-Hexan extrahiert und über Säulenchromatographie (Kieselgel F60; Laufmittel: Ethylacetat/Methanol 10/1 v/v) gereinigt.
RrWert: 0,16 (Ethylacetat/Methanol 10:1 v/v) Ausbeute: 0,85 g
Die säulenchromatographische Trennung wurde nicht optimiert. Neben Fraktionen mit dem reinen Produkt wurden weiterhin Mischfraktionen erhalten, die unumgesetztes Naringin enthielten. Zur Bestimmung der angegebenen Ausbeute wurden lediglich diejenigen Fraktionen aus der Säulenchromatographie verwendet, welche ausschließlich das gewünschte Produkt enthielten. Beispiel 3: Herstellung von 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester
5,8 g Naringin, 1 ,7 g p-Chlorphenylessigsäure, 3,8 g Molekularsieb, 15 ml t-Butanol und 11 g immobilisierte Lipase B aus Candida antartica wurden 24 Stunden bei 60°C und 100 rpm in einem 250 ml Kolben inkubiert. Die Umsetzung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60 F254; Laufmittel Ethylacetat/Methanol 10:1 v/v; Visualisierung durch UV-Detektion) verfolgt. Bei Abbruch der Reaktion betrug der Umsatz bezogen auf Naringin 20%. Das Produkt wurde mit 20 ml n-Hexan extrahiert und über Säulenchromatographie (Kieselgel F60; Laufmittel: Ethylacetat/Methanol 10/1 v/v) gereinigt.
RrWert: 0,20 (Ethylacetat/Methanol 10:1 v/v) Ausbeute: 0,50 g
Die säulenchromatographische Trennung wurde nicht optimiert. Neben Fraktionen mit dem reinen Produkt wurden weiterhin Mischfraktionen erhalten, die unumgesetztes Naringin enthielten. Zur Bestimmung der angegebenen Ausbeute wurden lediglich diejenigen Fraktionen aus der Säulenchromatographie verwendet, welche ausschließlich das gewünschte Produkt enthielten.
Beispiel 4: Herstellung weiterer Naringin-Derivate
Naringin-Derivate, hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben (Umsetzung mit Novozym SP435 für 48 h bei 65°C, Rührgeschwindigkeit 1200 Upm). Mittels Dünnschichtchromatographie wurde die Umsetzung kontrolliert sowie der Umsatz (bezogen auf das eingesetzte Naringin) bestimmt.
Umsatz
4.1 Stearinsäure +
4.2 Palmitinsäure ++ Umsatz
4.3 Laurinsäure ++
4.4 ölsäure +
4.5 Coumarsäure +
4.6 Caprinsäure +
4.7 Zimtsäure +
4.8 4- ++
Hydroxyphenylessigsäure
4.9 5-Phenylvaleriansäure ++
4.10 4-Phenylbuttersäure ++
4.11 12-Hydroxy-Stearinsäure
4.12 Edenor UKD6010
+ bedeutet bis 15 % Umsatz ++ bedeutet über 15 % Umsatz
Beispiel 5: Hemmung der Tyrosinaseaktivität
Tyrosinasen katalysieren physiologisch einen wichtigen Schritt in der Melanin-Synthese (L-Dopa zu L-Dopaquinone, das weiter cyclisiert und erneut durch eine Tyrosinase zu Dopachrom umgesetzt wird). Eine Hemmung der Tyrosinase kann damit zu einer hautaufhellenden Wirkung führen.
Die Aktivität von Pilz-Tyrosinase (Sigma) wurde in Gegenwart unterschiedlicher
Konzentrationen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe anhand der enzymatischen
Umsetzung von LDOPA zu Dopachrom bestimmt. Das Absorptionsmaximum des Dopachroms (rotbraun) liegt bei λ=475nm. Der lineare Anstieg der Absorption (A) des Dopachroms pro Zeiteinheit (t) ist ein Maß für die Aktivität der Tyrosinase (ΔA/Δt). Die Aktivität der Tyrosinase in Abwesenheit der Wirkstoffe (ΔAi/Δti) diente als Referenz und wurde auf 100% gesetzt. Unter analogen Bedingungen wurde die Tyrosinase- Restaktivität in Gegenwart der Wirkstoffe (ΔA2/Δt2) bestimmt. Jede Messung wurde 5 zweifach in parallelen Ansätzen durchgeführt. Die Schwankung der Ergebnisse der Methode liegt bei ca. ±10%.
Verwendete Chemikalien:
L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) (Sigma) o KH2PO4 (J.T. Baker)
Tyrosinase, 50.000 units (Sigma)
KOH
Benötigte Lösungen: 5 50 mM KH2PO4 - Puffer in H2O bidest. (Einstellung auf pH = 6.5 mit 1 M wäßriger KOH)
2.5 mM L-DOPA in H2O bidest.
340 U/ml Tyrosinase Stammlösung in kaltem KH2PO4- Puffer, pH = 6.5
Stammlösungen des zu prüfenden Wirkstoffs in bidest. Wasser bzw. Ethanol, worin die Konzentration des Wirkstoffs 10-fach höher war als in der Zeile „Wirkstoffkonzentration 0 im Testsystem" unter „Ergebnisse" angegeben
Reaktionscocktail:
10 ml KH2PO4- Puffer 10 ml L-DOPA 9 ml H2O bidest.
Der Reaktionscocktail wurde ebenso wie die Tyrosinase-Stammlösung erst vor Versuchsbeginn hergestellt. Die Tyrosinase-Stammlösung muß unbedingt kühl gelagert werden. Die L-DOPA-Lösungen sollten dunkel und in gut verschlossenen Gefäßen unter Sauerstoffausschluß aufbewahrt werden. Bei evtl. Grauverfärbung (Oxidation durch Luftsauerstoff) muß die Lösung frisch angesetzt werden. Testsvstem (Probenvolumen 1 ml) und Reaktionsdurchführung: 33 μl Tyrosinase-Stammlösung 100 μl Wirkstoff-Stammlösung 5 Ad 1000 μl Reaktionscocktail
Die Aktivität der Tyrosinase in Abwesenheit der Wirkstoffe diente als Referenz und wurde auf 100% gesetzt. Sämtliche Proben wurden vor Meßbeginn am Vibrofix gut durchmischt. Der pH-Wert wurde kontrolliert und ggf. auf pH= 6.5 eingestellt. Die Messung erfolgte mit einem Uvikon-860-Photometer der Fa. Kontron. Die Absorption Ό des Dopachroms wurde am Absorptionsmaximum bei λ=475nm über einen Zeitraum von 5 min. bei 25°C detektiert, wobei das Meßintervall 20-30 s betrug.
Ergebnisse:
Wirkstoff: 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester aus Beispiel 2 15 Wirkstoffkonzentration im Testsystem 0.005% 0.05% 0.5% (w/v in H2O bidest.) Restaktivität der Tyrosinase in % 98.9 69.1 0.7
(IC50= 0.18%)
Wirkstoff: 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester aus Beispiel 3 .0 Wirkstoffkonzentration im Testsystem 0.01% 0.1% (w/v in 98% Ethanol)
Restaktivität der Tyrosinase in % 45.1 15.4
Beispiel 6: Phototoxizität 5
Dermale Fibroblasten menschlicher Haut wurden mit steigenden Konzentrationen von Retinol (Tabelle 1), 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester (Tabelle 2) und 6-O- Naringin-(3-phenylpropionsäure)ester (Tabelle 3) kultiviert. Mit Hilfe eines MTT-Tests wurde die Phototoxizität der Substanzen gemessen. Für die Ermittlung der 0 Phototoxizität wurden die behandelten Zellen mit simuliertem Sonnenlicht, entsprechend einer Dosis von 10 J UV-A/cm2 bestrahlt. Die Vitalität nicht behandelter Zellen wurde gleich 100 % gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen. Die Bestrahlung der Zellen erfolgte mit einem Sonnenlichtsimulator, aus dessen Emissionsspektrum der UV-A Anteil der Strahlung zur Quantifizierung gemessen wurde. Vorteil dieses experimentellen Designs ist die Tatsache, daß mit dem kompletten Spektrum des Sonnenlichts gearbeitet wird und somit die Alltagssituation hervorragend nachgestellt wird. Demgegenüber arbeiten viele andere Forschungslaboratorien mit reinen UV-A und/oder UV-B Strahlern.
Tabelle 1 : Phototoxizität von Retinol
Konzentration Retinol (ppm) Vitalität (%; in Klammern: SEM)
0,0028 99 (7,4)
0,014 95 (19,8)
0,028 80 (25,9)
0,14 28 (11 ,8)
0,28 4 (2,1)
Tabelle 2: Phototoxizität von 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester
Konzentration des Naringinderivats (ppm) Vitalität (%; in Klammern: SEM)
5 115 (15)
10 96 (17,2)
50 81 (8,3)
100 3 (1 ,7)
500 3 (1 ,8)
Tabelle 3: Phototoxizität von 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester Konzentration des Naringinderivats (ppm) Vitalität (%; in Klammern: SEM)
5 125 (5,8) 10 103 (19,8) 50 98 (15,1) 100 101 (8,3) 500 29 (4,5) 1000 2 (0,5) Die Resultate zeigen, daß 6-0-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester und 6-O- Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester verglichen mit Retinol erst in höheren Konzentrationen toxische Effekte aufweisen. Retinol ist bereits in sehr niedrigen Konzentrationen toxisch. Die Verringerung der Vitalität um mehrere Zehnerpotenzen belegt die starke Phototoxizität von Retinol.
Beispiel 7: Wirkungen auf die lichtinduzierte Expression von MMP-1-, TIMP- und Colc -mRNA
Die Wirkungen von 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester (Tabelle 4) bzw. 6-O- Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester (Tabelle 5) auf die lichtinduzierte Expression von MMP-1 , TIMP und COICH wurden bei subphototoxischen Konzentrationen gemessen. Hierzu wurde die mRNA-Menge für MMP1 , TIMP und Colc quantifiziert. Hautmodelle wurden für 12 Stunden mit den Testsubstanzen behandelt und dann mit simuliertem Sonnenlicht, entsprechend einer Dosis von 10 J UV-A/cm2, bestrahlt. Nach weiteren 48 Stunden in Gegenwart der Wirkstoffe wurde die RNA der Zellen präpariert und durch Northern-Blots mit spezifischen Gensonden analysiert. Zur Kontrolle der in den Experimenten eingesetzten RNA-Menge wurden Northern-Blots mit einer 18S- spezifischen Gensonde durchgeführt. Zur Quantifizierung der Signalintensitäten wurden die Autoradiogramme densitometrisch vermessen und die Werte der Signale für MMP1 , TIMP und Colch auf die dazugehörigen Werte der 18S Signale bezogen. Die Zahlenwerte in den Tabellen stellen die densitometrische Quantifizierung der Signale eines Northern-Blots nach deren Normalisierung dar. Die lichtinduzierte Expression von MMP1 , TIMP und Colαι bei nicht behandelten Zellen wurde jeweils auf 100 % gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen.
Tabelle 4: Effekte von 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester auf die Expression von MMP1 , TIMP und Collagen
Konzentration des
Naringinderivats ( ppm) MMP1 TIMP Collagen
0, unbestrahlt 100 100 100
0, bestrahlt 135 89 66
5, bestrahlt 129 62 56
50, bestrahlt 40 77 79 Tabelle 5: Effekte von 6-0-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester auf die Expression von MMP1 , TIMP und Collagen
Konzentration des
Naringinderivats ( ppm) MMP1 TIMP Coll
0, unbestrahlt 100 100 100 0, bestrahlt 135 89 66
10, bestrahlt 167 104 74
100, bestrahlt 87 134 99
Die Bestrahlung von Hautmodellen mit simuliertem Sonnenlicht führte zu einer starken Induktion der MMP1-mRNA-Synthese, während die Synthese von Kollagen herunterreguliert wurde. Die Produktion von TIMP blieb weitgehend unbeeinflußt. Tabelle 4 zeigt, daß 50 ppm 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1 sehr effektiv reduzierten. Die Expression von TIMP wurde nur geringfügig beeinflußt, die Expression von Colαi ist gegenüber der bestrahlten, unbehandelten Probe deutlich gesteigert. Die Behandlung der Zellen mit 100 ppm 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester reduzierte die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1 auf das Niveau der unbestrahlten unbehandelten Probe (Tabelle 5). Demgegenüber stieg die Expression von TIMP um ca. 35% an. Die Expression von Colαi konnte auf das Niveau der unbestrahlten, unbehandelten Kultur gesteigert werden.
Die prozentuale Veränderung der Expression von MMP, TIMP und Colαi in Kulturen bestrahlter Fibroblasten nach Behandlung mit 50 bzw. 100 ppm der geprüften Naringinderivate im Vergleich zu bestrahlten, unbehandelten Kulturen ist in Tabelle 6 zusammengefaßt.
Tabelle 6:
Expression von 6-O-Naringin- 6-0-Naringin-(3-phenyl
(p-CI-phenylessigsäure)ester propionsäure)ester (50 ppm) (100 ppm)
MMP -70% -37% TIMP -15% 50% Colαi 27% 64% Die jeweils in Tabelle 6 angegebene Konzentration führte für beide Naringinderivate zu einer deutlichen Hemmung der MMP-Expression und einer gesteigerten Colαi. Produktion. Die 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure)ester steigerte die TIMP- Produktion erheblich, während 6-0-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure)ester nur einen geringen Einfluß nahm.
Beispiel 8: Wirkung auf die Kollagenproduktion
Zum Nachweis der erhöhten Produktion von Kollagen auf Proteinebene wurden Fibroblasten in einem dreidimensionalen Kultursystem für 5 Tage mit den Prüfsubstanzen behandelt. Am sechsten Tag wurde die Menge des gebildeten Kollagens im Vergleich zu Nichtkollagenprotein über den Einbau tritiierten Proteins bestimmt. Tabelle 7 zeigt die prozentuale Steigerung des Kollagenaπteils am Gesamtprotein, bestimmt aus behandelten Fibroblastenkulturen gegenüber unbehandelten Kulturen.
Tabelle 7:
6-O-Naringin-(3-phenyl- 6-O-Naringin-
(propionsäure)ester (p-CI-phenylessigsäure)ester
Konzentration 1 ppm 10ppm 100ppm 5ppm 50ppm
Steigerung der
Kollagenproduktion 8% 8% 19% -3% 41%

Claims

Patentansprüche
1. Flavon- und Isoflavonglykosid-Derivate der allgemeinen Formel (I): [Aι-C(=0)0]m-[X-O-Z]-[O-C(=O)-A2]n (I), worin [X-O-Z] eine Flavon- oder Isoflavonglykosid-Struktur darstellt, worin X einen Flavon- oder Isoflavongrundkorper der Formel (Ila) bzw. (Ilb)
(Ila) (Ilb)
darstellt, wobei der (Iso-)Flavongrundkörper einfach oder mehrfach substituiert und/oder einfach oder mehrfach reduziert (hydriert) ist, worin Z (Zucker) für ein Mono-, Disaccharid oder Polysaccharid steht, das acetalisch an den Rest X gebunden und n-fach esterartig mit A2 substituiert ist, worin [Aι-C(=O)] einen Acylrest am Flavon- oder Isoflavongrundkorper darstellt, worin Ai und A2 unabhängig voneinander einen mehrfach ungesättigten C15 - C25-
Alkenylrest mit mindestens 4 isolierten und/oder mindestens zwei konjugierten
Doppelbindungen oder einen arylaliphatischen Rest mit 1-4 Methylengruppen zwischen Ester-Gruppe und aromatischem Ring darstellen, worin [C(=O)A2] einen Acylrest am Zucker Z darstellt, worin n eine ganze Zahl (1, 2, 3, ...), nicht aber 0 ist, worin m eine ganze Zahl einschließlich 0 (0, 1 , 2, 3, ...) ist, und worin R1 , R2, R3 Hydroxylgruppen oder Wasserstoff-Atome darstellen.
2. Die Derivate von Anspruch 1 , wobei Z ein Monosaccharid, insbesondere Rhamnose, Threose, Erythrose, Arabinose, Lyxose, Ribose, Xylose, Allose, Altrose, Galactose, Glucose, Gulose, Idose, Mannose, Talose und Fructose, oder ein Disaccharid, insbesondere ein Disaccharid, das aus den zuvor genannten Monosacchariden aufgebaut ist, in ihren jeweils natürlich vorkommenden stereoisomeren Formen, ist.
3. Die Derivate von Anspruch 1 oder 2, wobei der (Iso-)Flavonglykosid-Grundkörper X- O-Z in der allgemeinen Formel (I) Asparatin, Orientin (Lutexin), Cisorientin (Lutonaretin), Isoquercitin, Naringin, oder Rutin ist.
4. Die Derivate von einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der (Iso- )Flavonglykosid-Grundkörper X-O-Z Naringin der Formel (III)
(III) ist.
5. Die Derivate von einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X-O-Z Naringin gemäß Formel (III) ist; wobei A der Acylrest einer der folgenden Säuren ist: p- Chlorphenylessig-, Hydrozimt-, Stearin-, 12-Hydroxystearin-, Palmitin-, Laurin-, Öl-, Coumar-, Caprin-, Zimt-, 4-Phenylbutter-, 4-Hydroxyphenylessig-, 5- Phenylvaleriansäure oder eines der unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505; und wobei n 1 oder 2 und m gleichzeitig 0 ist.
6. Die Derivate von Anspruch 5, wobei n 1 , m 0 ist und A an die primäre OH-Gruppe des Zuckers in Formel (III) gebunden ist.
7. Die Derivate von einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X-O-Z Naringin gemäß Formel (III) ist; wobei A der Acylrest einer der folgenden Säuren ist: p-Chlorphenylessig-, Hydrozimt-, Stearin-, 12-Hydroxystearin-, Palmitin-, Laurin-, Öl-, Coumar-, Caprin-, Zimt-, 4-Phenylbutter-, 4-Hydroxyphenylessig-, 5-Phenylvaleriansäure oder eines der unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505; und wobei n 1 oder 2 und m gleichzeitig 1 ist.
8. Die Derivate von Anspruch 7, wobei n und m 1 sind, A2 an die primäre OH-Gruppe des Zuckers in Formel (III) und A1 entweder an die 5-OH-Gruppe des Benzopyran- oder an die 4'-Hydroxy-Gruppe des Phenylrings gebunden sind.
9. Die Derivate von Anspruch 8, wobei n 2 und m 1 sind, ein A2 an die primäre OH- Gruppe und das zweite A2 an eine der sekundären OH-Gruppen, insbesondere an eine der beiden sekundären OH-Gruppen am selben oder an eine der drei sekundären OH-Gruppen des zweiten Sechsrings, des Zuckers in Formel (III) und A1 entweder an die 5-OH-Gruppe des Benzopyran- oder an die 4-Hydroxy-Gruppe des Phenylrings gebunden sind.
10.Verfahren zur Herstellung der Derivate der Formel (I) von einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Acetal X-O-Z aus
Zucker und (Iso-)Flavon-Grundkörper, wobei diese (Iso-)Flavon-Grundkörper in Form der Reinsubstanz oder als Gemisch aus Pflanzenextrakten unterschiedlicher Herkunft vorliegen, mit einer polyungesättigten Fettsäure mit mindestens vier isolierten Doppelbindungen und/oder mit mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen, mit einer arylaliphatischen Carbonsäure, mit einem Ester dieser
Carbonsäuren oder mit einem aktivierten Fettsäurederivat unter katalytischer Einwirkung von einem oder mehreren Enzymen verestert oder umgeestert wird.
11. Das Verfahren von Anspruch 10, wobei die polyungesättigten Fettsäure eine konjugierte Linolsäure (Octadecadiensäure) ist.
12.Das Verfahren von Anspruch 10 oder 11 , wobei das oder die Enzyme eine oder mehrere Hydrolasen ist bzw. sind.
13.Das Verfahren von Anspruch 12, wobei die Hydrolase(n) die Lipasen aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea), Candida antarctica, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Rhizopus arrhizus und Mucor miehei, insbesondere die Lipase (Isoenzym B) aus Candida antarctica, ist (sind).
14. Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei sich an die Veresterungsreaktion ein Schritt zur Aufreinigung der Verbindungen der Formel (I) anschließt, der entweder ein wäßriges Zweiphasen-Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln wie n-Hexan, Cyclohexan, THF oder Dieethylether oder ein chromatographisches Verfahren an Kieselgel, vorzugsweise mit Ethylacetat/Methanol- oder Dichlormethan/Methanol-Gemischen mit geringen Anteilen Essigsäure und/oder Wasser, ist.
15.Kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung oder Nahrungs- bzw. Futtermittel-Zusammensetzung, enthaltend mindestens eines der Derivate von einem der Ansprüche 1 bis 9.
16. Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur kosmetischen Behandlung der sonnenlichtinduzierten Alterung der menschlichen Haut.
17. Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur kosmetischen Hautaufhellung.
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