EP1252310A2 - Mlp-gen, nukleinsäuren, polypeptide und deren verwendung - Google Patents

Mlp-gen, nukleinsäuren, polypeptide und deren verwendung

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Publication number
EP1252310A2
EP1252310A2 EP01905718A EP01905718A EP1252310A2 EP 1252310 A2 EP1252310 A2 EP 1252310A2 EP 01905718 A EP01905718 A EP 01905718A EP 01905718 A EP01905718 A EP 01905718A EP 1252310 A2 EP1252310 A2 EP 1252310A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
mlp
seq
mutation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01905718A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralph c/o Schäfer Helga KNÖLL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering AG filed Critical Schering AG
Publication of EP1252310A2 publication Critical patent/EP1252310A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • MLP gene nucleic acids, polypeptides and their use
  • the present invention relates to nucleic acids coding for MLP, a polypeptide encoded thereby, probes for these nucleic acids, methods for the detection of and / or screening for myocardial diseases, kits for the detection of the nucleic acids and the polypeptide, regulatory nucleic acids, these comprehensive vectors, these comprehensive Cells and this comprehensive medication.
  • DCM Dilated cardiomyopathy
  • HCM hypertrophic cardiomyopathy
  • the MLP knock out which is associated with a DCM, fits well into the thought model mentioned above (Arber et al .; Cell 88, 393-403 (1997)).
  • the MLP was first described in 1994 using a subtractive cloning technique as a positive regulator of myogenesis (Arber S. et al .; Cell 79, 221-31 (1994)) and gained considerable importance in cardiology in 1997 when it became known (Arber et al .; Cell 88, 393-403 (1997)) that the MLP knock out in a mouse model is accompanied by a DCM. This was also the first genetically engineered organism to develop this clinical picture. However, it is still completely unclear in the prior art whether mutations in this gene also lead to DCM in humans.
  • the MLP itself belongs to the LIM protein group. This group was named about 10 years ago after the initial letters of its first 3 members (lin 11, islet 1, mec3) and has essentially three subgroups: 1.
  • the MLP belongs to the group of “LIM only” proteins (Morgan, M. et al .; Biochem Biophys Res Com 212, 840-846 (1995)).
  • the protein itself consists of 194 amino acids and forms two LIM double zinc fingers, each followed by a glycine-rich amino acid sequence.
  • the protein probably acts due to its location on the Z band as a cytoskeletal protein, where it binds to f-actin structures (Arber, S. et al .; Genes Dev 10, 289-300 (1996)).
  • the present invention has for its object to provide an agent that allows preventive treatment of dilated cardiomyopathy.
  • the remedy is also intended to demonstrate the disposition of an individual to develop the clinical picture of the dilated Allow cardiomyopathy.
  • the agent to be provided should enable the diagnosis of dilated cardiomyopathy.
  • the invention is based on the object of providing a regulatory nucleic acid which allows the tissue-specific, in particular muscle-specific, expression of nucleic acids.
  • nucleic acid which codes for an MLP and comprises a sequence according to SEQ ID NO: 1, the sequence having a mutation at base no. 10 of exon 2 of the translated sequence.
  • the mutation is an exchange from T to C.
  • nucleic acid which codes for an MLP and comprises a sequence according to SEQ ID NO: 1, the sequence having a mutation at the third position of codon 112 in exon 4 of the translated sequence.
  • the mutation is an exchange from A to G.
  • the nucleic acid only comprises the sequences coding for an amino acid sequence.
  • nucleic acid which codes for an MLP and which comprises the sequence from positions 58 to 639 of SEQ ID NO: 1, a mutation being present at position 67.
  • the mutation is a mutation from T to C.
  • nucleic acid which codes for an MLP and comprises the sequence from positions 58 to 639 of SEQ ID NO: 1, a mutation being present at position 393.
  • the mutation is a mutation from A to G.
  • nucleic acid coding for MLP the sequence would correspond to a nucleic acid according to the invention without the degeneracy of the genetic code.
  • nucleic acid coding for MLP the nucleic acid hybridizing with a nucleic acid according to the invention.
  • the object is achieved according to the invention by an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid according to the invention or parts thereof.
  • the amino acid sequence according to the invention is encoded by the sequence (s) of the nucleic acid according to the invention or parts thereof, which one or both of the aforementioned mutations, i.e. at Base No. 10 of exon 2 of the translated sequence or at the third position of codon 112 in exon 4 of the translated sequence.
  • the object is achieved according to the invention by an MLP comprising an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid according to the invention or a part thereof, or by the MLP comprising an amino acid sequence according to the invention.
  • the object is achieved according to the invention by a probe for a nucleic acid according to the invention, the probe comprising a sequence according to SEQ ID NO: 4.
  • the probe is used for the detection and / or amplification of the nucleic acid according to the invention.
  • the object is achieved according to the invention by a probe for a nucleic acid according to the invention, the probe comprising the sequence according to SEQ ID NO: 5.
  • the probe is used for the detection and / or the amplification of the nucleic acid according to the invention.
  • nucleic acids and / or the probes according to the invention are used to diagnose and / or screen for myocardial diseases.
  • myocardial disease is dilated cardiomyopathy.
  • the object is achieved according to the invention by a method for the detection of and / or screening for myocardial diseases, a nucleic acid according to the invention and / or a probe according to the invention being used.
  • the myocardial disease is dilated cardiomyopathy.
  • the object is achieved according to the invention by a method for the detection of and / or screening for myocardial diseases, wherein a sample comprising a sequence coding for MLP is digested with a restriction enzyme and the presence of a mutated coding coding for MLP by the occurrence a restriction enzyme digestion pattern changed compared to the restriction enzyme digestion pattern of a non-mutated sequence coding for MLP is detected.
  • the myocardial disease is dilated cardiomyopathy.
  • the method is an embodiment of the method according to the invention for the detection of and / or screening for myocardial diseases, wherein one nucleic acid according to the invention and / or a probe according to the invention is used.
  • the sequence coding for MLP is amplified by means of PCR before digestion.
  • the detection or screening is directed to a nucleic acid according to the invention.
  • the amplification is carried out with a primer, the primer comprising a sequence according to SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 14.
  • restriction enzyme digestion is carried out by Nci I.
  • the PCR product in the case of a non-mutated sequence has a length of approximately 308 bp and in the case of a mutation at base no. 10 of exon 2 or a mutation at position 67 of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, where the mutation is an exchange from T to C, two PCR products with approximately 205 and approximately 103 bp occur.
  • the detection or screening is directed to a nucleic acid according to the invention, preferably to a nucleic acid which has a mutation at the third position of codon no. 112 in exon 4 of the translated sequence from SEQ ID NO: 1 has.
  • the amplification is carried out with a primer, the primer comprising the sequence according to SEQ ID NO: 15 and / or SEQ ID NO: 16.
  • the restriction enzyme is digested by Cvi Rl.
  • a probe according to the invention for the detection of and / or screening for myocardial diseases, in particular dilated cardiomyopathy, in which a probe according to the invention is used, it can be provided that for the detection of or the screening for a nucleic acid sequence according to the invention, a hybridization of one to be examined Sample is carried out with a probe, the probe comprising a sequence according to SEQ ID NO: 4.
  • the hybridization takes place at 60 ° C.
  • a probe according to the invention for the detection of or the screening for a nucleic acid sequence according to the invention a hybridization of a sample to be examined done with a probe, the probe comprising a sequence according to SEQ ID NO: 5.
  • the object of the invention is achieved by a method for the detection of and / or screening for myocardial diseases, an amino acid sequence according to the invention or an MLP according to the invention being detected.
  • the myocardial disease is dilated cardiomyopathy.
  • the amino acid sequence or the MLP is detected by means of an antibody.
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • the object is achieved by a kit for detecting a nucleic acid according to the invention, it being provided that the kit comprises at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one probe according to the invention.
  • the object is achieved according to the invention by a kit for detecting an MLP according to the invention or for detecting an amino acid sequence according to the invention coding for an MLP, the kit comprising at least one antibody against the MLP according to the invention or against an amino acid sequence according to the invention.
  • the object is achieved by a regulatory nucleic acid sequence which comprises approximately 500 base pairs, the 500 base pairs being those which are arranged upstream of the first base of the first exon of the human genomic sequence coding for MLP.
  • the regulatory nucleic acid comprises approximately 1000 base pairs, the 1000 base pairs being those which are arranged upstream of the first base of the first exon of the human genomic sequence coding for MLP.
  • the object is achieved by a regulatory nucleic acid which can be represented on the basis of human genomic DANN using two primers in a PCR reaction, the upstream primer comprising SEQ ID NO: 9 and the downstream primer SEQ ID NO: 10.
  • the object is achieved by a regulatory nucleic acid sequence comprising a sequence according to SEQ ID NO: 8.
  • the regulatory nucleic acid is a promoter.
  • the object is achieved according to the invention by a vector comprising a regulatory sequence according to the invention.
  • the regulatory sequence is contained in the vector pAdCMVssTnl, the CMV promoter in this vector being replaced by the regulatory sequence according to the invention.
  • the vector according to the invention is an adenoviral vector.
  • the vector according to the invention comprises a coding sequence which is under the control of the regulatory nucleic acid according to the invention.
  • the coding sequence is selected from the group comprising hsp70 and the "slow skeletal troponin I".
  • the object is achieved by a cell comprising a regulatory nucleic acid according to the invention and / or a vector according to the invention.
  • the cell is a eukaryotic cell.
  • the cell is a mammalian cell.
  • the cell is a human cell.
  • the object is achieved according to the invention by a medicament comprising a regulatory nucleic acid according to the invention, a vector according to the invention and / or a cell according to the invention.
  • the medicament is used in the context of gene therapy.
  • the medicament is one for the treatment and / or prevention of cardiovascular diseases.
  • cardiovascular diseases are those in which a point mutation in a gene leads to a clinical picture.
  • the point mutation lies in genes which code for proteins of the sarcomere, the dystrophin and cardiac actin.
  • the cardiovascular disease is selected from the group comprising hypertrophic cardiomyopathy, long QT syndrome and dilated cardiomyopathy.
  • the invention is based on the surprising finding that genetic causes for the development or disposition for the development of dilated cardiomyopathy in humans are of crucial importance. This finding is based on the discovery by the inventor that variants which are associated with dilated cardiomyopathy can be found in various exons of the human MLP gene.
  • the present genomic human sequence of the MLP gene is organized into six exons, all exons having the classic intron-exon transitions and elements which are characteristic of a promoter being found at the 5 ' end.
  • the position of the individual exons in the human genomic sequence of the MLP gene can be described as follows:
  • Exon 1 from 12983 - 1301 1 (total 28 bp)
  • Exon 2 from 22480 - 22620 (total 140 bp)
  • Exon 3 from 26653 - 26823 (total 170 bp)
  • the entire gene thus extends to approximately 20,000 bp.
  • Exon 1 of the gene encodes only a 5 ' untranslated region; the translated areas are coded on exons 2 to 6.
  • a computer-aided promoter analysis showed that there is a classic TATA box in front of the 1st exon.
  • a large number of patients with familial DCM were analyzed and it was surprisingly found that point mutations occur in the coding sequence of the genomic human sequence of the MLP gene, and thus also in the corresponding mRNA or the derived cDNA.
  • a patient from such a family showed a base pair exchange (T-> C) in exon 2 which leads to an amino acid exchange from tryptophan to arginine at position 4 (W4R).
  • the mutation causing this exchange occurs more precisely at base no. 10 of exon 2 of the translated human genomic sequence for MLP.
  • the position corresponds to position 67 of the sequence according to SEQ ID No. 1.
  • the mutated sequence can be found here as SEQ ID No. 2
  • the variant in the MLP gene discovered by the inventor leads to a new restriction interface, which is why large patient populations can be analyzed quickly.
  • a further patient collective the members of which suffer from DCM, was examined, the exon 2 being amplified from genomic DNA from patients with DCM and digested with the corresponding enzyme.
  • six more patients with the variant could be detected from a collective of 500 patients.
  • family trees were created and, as far as possible, family members were summoned to take blood.
  • two families have so far been found in which the disease is genegosegregated.
  • the amino acid tryptophan present in the wild type belongs to the heterocyclic amino acids, which is exchanged for this, ie in the O 01/57208 _-j e> _ PCT / EP01 / 01042
  • Mutant nucleic acid present arginine is the most basic amino acid. So it is a structurally disruptive exchange.
  • the amino acid exchange is in a highly conserved area of the protein, whereby not only the tryptophan is highly conserved at this point between the MLPs of different species (human, pig, rat, mouse), but also the neighboring amino acids at the amino terminal end of the protein. This applies not only to the MLP itself, but also to the most closely related proteins (CRPI and CRP2). It can be concluded from this that the amino-terminal region of the protein is needed to transport the MLP to its destination in the myocyte ("docking", such sequences are the same for many proteins and therefore occur ubiquitously). If so, could the modified MLP could no longer be transported to its destination and would have no biological effect.
  • the variant in exon 2 has a pathogenetically important function in the genesis of a DCM in the corresponding patients with a probability bordering on certainty.
  • the nucleic acids disclosed herein are important in many ways. By correlating the disclosed mutated MRL sequences with heart diseases, in particular dialatative cardiomyopathy, examinations can be carried out on biological material in order to check whether the sample and thus the person from whom the sample originates has or at least has heart disease due to the genetic makeup carries the risk of developing this heart disease.
  • the disclosed nucleic acids can thus be used both for the purposes of prevention and for diagnosis.
  • a patient collective can also be the subject of investigations that use the nucleic acids disclosed or make use of them.
  • the sequences claimed here are not only intended to be the sequences according to SEQ ID No. 2 and SEQ ID No.
  • nucleic acids disclosed herein also include those which contain the sequences according to SEQ ID No. 2 or SEQ ID No.
  • each of the two sequences being separated by a nucleotide or a sequence of several nucleotides.
  • An example of such a sequence is the genomic MLP sequence which has said mutations and whose coding regions are separated from one another by introns.
  • genomic human MLP sequence is described in the examples herein.
  • the probes disclosed herein are allele-specific oligonucleotides that are complementary to those regions of the nucleic acids that carry the mutations disclosed. These probes can be used in particular in the polymerase chain reaction as primers for the amplification of the nucleic acid and allow detection even with small sample amounts.
  • the probes can be used either after the polymerase reaction or directly for the detection of the nucleic acids containing the mutations. For this purpose, the probes can be in labeled form. Such markings can include radioactive or fluorescent markers. O 01/57208 _ ⁇ g_ PCT / EP01 / 01042
  • sequences of the probes or primers for detecting the mutation in exon 2 are:
  • the sequence of the probes or primers for detecting the wild-type sequence corresponding to the respective mutations is:
  • sample preparation steps customary for the detection of nucleic acids or gene products are used performed that are known to those skilled in the art.
  • blood or biopsy material can be used as the starting material.
  • the method according to the invention is based on the detection of the mutation via the generation of an additional interface for a restriction enzyme which is not present in the wild-type sequence, be it now in the genomic sequence, the mRNA or a cDNA, the nucleic acid obtained Fragments are usually separated on an agarose gel.
  • an agarose gel is used, the various nucleic acid fragments can be made visible by staining with, for example, ethidium bromide or as a result of a radioactive marker.
  • kits according to the invention comprise at least one of the nucleic acids, probes or a gene product of said nucleic acids.
  • the kit according to the invention particularly preferably comprises at least one probe which is specific for one of the two mutations described.
  • the probe corresponding to the wild type can be included as a negative control.
  • the nucleic acids according to the invention can be contained in the kit as a positive and / or negative control.
  • a restriction enzyme can be contained in the kit, which cuts at the interface newly created by the mutation and thus allows restriction digestion of the mutated sequence compared to the non-mutated sequence and thus to a different pattern of the - cut - Nucleic acid, ie leads to a restriction length polymorphism.
  • the nucleic acids, probes or gene products can be present in a suitable buffer in the kit.
  • the kit can also comprise a carrier on which a nucleic acid or a polypeptide or protein can be immobilized.
  • the invention relates to a regulatory nucleic acid, in particular a promoter.
  • regulatory nucleic acid The terms regulatory nucleic acid, promoter structure and promoter are used synonymously here.
  • regulatory nucleic acid sequence also leads to the fact that the expression of the MLP is stress-inducible.
  • the regulatory nucleic acid sequence thus represents a tissue-specific promoter structure which can also be induced by stress.
  • the above-mentioned tissue specificity of the regulatory nucleic acid results from the fact that the MLP gene only occurs in muscle tissue (i.e. striated and smooth muscles); it is therefore a muscle-specific promoter.
  • the gene product or the mRNA is relatively easy to detect using various techniques (eg Northern blot, PCR), which suggests a strong promoter.
  • the first exon encodes only about 30 base pairs of the 5 'untranslated region. About 20-30 base pairs before the first exon there are several TATA box elements, i.e. exactly the areas to which the DNA-dependent RNA polymerase II must bind in order to copy the gene. In addition, there are several transcription initiation sequences about 10 to 20 base pairs before the first exon.
  • AP-1 sequences are present immediately before the first exon. These sequences bind the so-called "leucine zipper” transcription factors, which have important functions, including in the stress inducibility of genes. The presence of these sequences underpins the stress inducibility of the MLP gene found by the inventor.
  • a whole series of AP-1 sequences are found "upstream" in the first 1000 base pairs.
  • a CAAT box is found around 500 base pairs upstream.
  • these elements are found 80-120 base pairs in front of the gene, but an important function of this element in the promoter discovered by the inventor cannot be ruled out.
  • up to about 1000 base pairs before the first exon AP-1 and CAAT sequences are found.
  • the region of approximately 1000 base pairs before the first exon thus appears to be of considerable importance for the expression of the gene.
  • the core region will be the area of around 500 base pairs (i.e. starting from the CAAT box) before the first exon.
  • FIG. 2 The various elements of the regulatory nucleic acid disclosed herein are shown in FIG. 2.
  • the regulatory sequence according to the invention can also be determined by the sequence according to SEQ ID No. 8 are shown.
  • the regulatory sequence or promoter structure according to the invention can also be represented by amplifying the corresponding sequence from human genomic DNA with the aid of the polymerase chain reaction with two primers.
  • the primer gP1 with the sequence is used as an upstream (“upstream”) primer
  • the primer gP2 As a downstream primer, the primer gP2 with the sequence
  • the regulatory sequence according to the invention can also be integrated in a vector.
  • Such vectors can be both plasmid and viral vectors.
  • vectors are nucleic acid molecules that serve as a recipient or carrier for — preferably foreign — nucleic acids.
  • Vectors generally have an origin of replication ("origin") and genetic markers which allow the vector to be detected in host cells.
  • the vector can comprise further elements which control the translation and / or transcription of the recorded or in the vector contained nucleic acid serve.
  • Both the regulatory sequence according to the invention and the vector according to the invention can be contained in one cell.
  • any cell or cell line can be used for this.
  • the cell can be selected from the group comprising prokaryotic and eukaryotic cells.
  • the cell can in turn be selected from the group which in particular comprises yeast cells, insect cells and mammalian cells.
  • yeast cells yeast cells
  • insect cells insect cells
  • mammalian cells it can be provided that they are primary cells, primary cell cultures or established cell cultures.
  • regulatory sequences there are a multitude of possible uses for the regulatory sequences and the various biological systems containing them, which are based on the following considerations and the fact that the regulatory nucleic acid disclosed herein is a tissue-specific and in particular muscle-specific expression of nucleic acid sequences under the control of said regulatory sequence allowed.
  • a variety of human diseases can be attributed to genetic defects. Much of these clinical pictures, in turn, will triggered by monogenic diseases, ie mutations in a single gene. With knowledge of these molecular changes, gene therapy can repair the molecular defect.
  • a number of diseases are known in the cardiovascular system in which point mutations in a single gene lead to serious clinical pictures. These include mutations in the genes that encode sarcomere proteins and lead to hypertrophic cardiomyopathy (Towbin. The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies. 10, 131-139 (1998)), long QT syndrome (Jerve Lange Nielson syndrome and Romano Ward syndrome) (Neyround, N. et al .; Circ Res 84, 290-297 (1999)) and mutations in dystrophin (Muntni F. et al .; N Engl J Med 329, 921 -5 (1993)) or cardiac actin gene (Olsen, T. et al .; Science 280, 750 - 752 (1998)), which lead to dilated cardiomyopathy. In principle, these diseases can be treated causally by applying the correct gene.
  • the clinical pictures listed above only affect cardiomyocytes.
  • Expression of the gene to be transferred into cells other than cardiomyocytes makes no sense and only increases the dangers of gene therapy, namely the occurrence of further mutations or undesirable interactions in the sense of immune reactions.
  • the regulatory nucleic acid according to the invention is only expressed in muscle tissue and therefore, and because of its strength, it is ideal for gene therapy in or of muscle tissue.
  • the procedure can be such that from the shuttle vector pAdCMVssTnl, as described in Westfall et al. (Westfall, M. et al .; Proc Natl Acad Sei USA 94, 5444-5449 (1997)), with the corresponding enzyme, cut out the CMV promoter and the MLP promoter (ie a regulatory nucleic acid according to the invention) into the shuttle plasmid pAdCMVssTnl is installed.
  • the resulting plasmid pAdMLPssTnl can together pJM17 via the calcium phosphate method, as in Westfall et al. (Westfall, M.
  • any desired gene product can be cloned in a known manner in front of the MLP promoter in a suitable vector, for example a shuttle vector, and brought to expression.
  • a suitable vector for example a shuttle vector, and brought to expression.
  • the hsp70 gene which has protective functions on the myocardium, could be connected upstream (Yellon, D.
  • the promoter according to the invention can be cloned in front of any desired gene product and the promoter according to the invention can thus express the nucleic acid under the control of the promoter in a tissue-specific manner with any desired virus or vector system.
  • the promoter disclosed herein can be used in particular in the diseases mentioned above and disclosed herein, including in the gene therapy treatment of DCM.
  • FIG 2 shows the sequence of the regulatory nucleic acid according to the invention with the promoter-specific elements.
  • the human MLP cDNA was produced using the polymerase chain reaction ( : PCR) using the two primers KMLP1 and KLMP2.
  • the sequence of KMLP1 is shown as SEQ ID No.11 and is as follows:
  • KMLP2 The sequence of KMLP2 is shown as SEQ ID No.12 and is as follows:
  • the cDNA thus obtained as the product of the PCR has a length of approximately 650 bp and contains the entire coding region of the mRNA.
  • the human genomic MLP sequence was shown by screening a human genomic library using the cDNA.
  • the cDNA used as a probe was radioactively marked (Feinberg, A. et al .; Anal Biochem 132, 6-13 (1983)) and hybridized with a gene bank cloned into the bacteriophage P1 (loannou, PA et al .; Nature Genetics 6 , 84-89 (1994)).
  • the screening was carried out using the usual procedures known to those skilled in the art, e.g. are described in Maniatis, Fritsch & Sambrook. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, (1989).
  • the MLP gene itself is located on chromosome 11 p15.1 (Fung, Y.W. et al .; Genomics 28, 602-603 (1995)).
  • the clone of the human genomic MLP sequence thus obtained was then sequenced using an automatic DNA sequencer.
  • the positive clone comprised a total of 80,000 base pairs and contains the entire human MLP gene, which is organized into a total of six exons, as already disclosed above.
  • the two mutations found by the inventor in the MLP sequence are those at base 10 of exon 2 of the translated human genomic MLP sequence, with an exchange from T to C, and one at the third position of codon 112 of exon 4 of the translated sequence, with an exchange from A to G.
  • Both mutations find their correspondence in the mRNA or the cDNA derived therefrom, the position of the mutation in base 67 corresponding to the mRNA or cDNA in the case of the mutation in exon 2 and the position of the mutation in the case of the mutation in exon 4 base 393 of the mRNA or cDNA, as also shown in SEQ ID No. 1, corresponds.
  • genomic DNA was isolated using a "Qiagen Blood Kit” from 1997 and a standard “Eppendorf benchtop centrifuge” as follows:
  • the PCR for the amplification of exon 2 results in a PCR product with a size of 308 base pairs. If a base pair exchange from T to C has occurred in position 1 in codon 4, the restriction enzyme Nci I cuts and 2 fragments with a size of 103 base pairs and 205 base pairs are formed.
  • FIG. 1 shows in more detail the result of a restriction digest of amplified exon 2 of the human genomic MLP sequence, which was applied to an agarose gel and separated.
  • the two outer traces of the agarose gel each show a molecular weight standard.
  • the lane labeled "wt” shows exon 2 in its wild type, with no restriction enzyme being added to the applied restriction approach.
  • the lane labeled "wt + E” shows exon 2 in its wild type, with the restriction enzyme Nci I being added to the applied restriction approach has been.
  • PCR products obtained were separated on an agarose gel and analyzed for their correct size. With correct sizes, which was usually the case, another part was digested with the restriction enzyme Cvi Rl at 37 ° C. overnight and separated again on an agarose gel the next morning. Regarding the incubation, it should be noted that the restriction batch could have been incubated for 30 to 60 minutes at room temperature. The overnight incubation was only for reasons of care.
  • the variants or mutations in exon 2 and exon 4 of the genomic human MLP sequence or the corresponding cDNA probes can be produced.
  • ASO allele-specific oligonucleotides
  • SEQ ID No. 6 corresponds to:
  • the melting temperature when detecting the mutation using the sequence according to SEQ ID No. 4 is 60 ° C
  • the melting temperature when detecting the wild type using the sequence according to SEQ ID No. 6 is approx. 58 ° C.
  • SEQ ID No. 5 corresponds to:
  • SEQ ID No. 7 corresponds to:
  • the melting temperature when detecting the mutation using the sequence according to SEQ ID No. 5 is 52 ° C
  • the melting temperature when detecting the wild type using the sequence according to SEQ ID No. 7 is approx. 50 ° C. - o-
  • exons 2 and 4 of all carriers of the mutation (s) determined by means of the restriction analysis and the probe analysis were also sequenced using standard techniques. The sequence analysis confirmed the result of the restriction and probe analysis in all cases.
  • the sequencing of exons 2 or 4 or the corresponding cDNA or the corresponding cDNA of the genomic human MLP gene or the genomic MLP gene, in particular using the probes described herein can also be used as a method according to the invention for the detection of and / or screening for myocardial diseases, in particular dilated cardiomyopathy, can be used.
  • the in SEQ ID No. The specified regulatory nucleic acid is shown in FIG. 2 together with the labeled promoter-specific elements. This regulatory nucleic acid is isolated using the primers gP1 and gP2 described above, corresponding to SEQ ID No. 9 and SEQ ID No. 10, possible.
  • the regulatory nucleic acid sequence or the corresponding MLP promoter (1000 bp) can be amplified using the two primers mentioned.
  • the AP-1 sequences are marked by underlining, with a maximum of two mismatches being accepted from the consensus sequence TGAG / CTCA.
  • CAAT sequences are marked in bold, it should be noted in this regard that at the beginning of the promoter an AP-1 and a CAAT sequence overlap.
  • TATA boxes are marked in bold and underlined.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft mutierte MLP-Sequenzen, wobei die Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz oder an der dritten Position von Kodon 112 in Exon 4 der translatierten Sequenz erfolgt. Weiterhin betrifft die Erfindung einen muskelspezifischen Promotor und dessen Verwendungen.

Description

MLP-Gen, Nukleinsäuren, Polypeptide und deren Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft für MLP codierende Nukleinsäuren, ein dadurch codiertes Polypeptid, Sonden für diese Nukleinsäuren, Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, Kits zum Nachweis der Nukleinsäuren und des Polypeptids, regulatorische Nukleinsäuren, diese umfassende Vektoren, diese umfassende Zellen und diese umfassende Medikamente.
Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine Myokarderkrankung unklarer Genese, die mit verminderter Kontraktionskraft (systolische Ventrikelfunktionsstörung) und begleitender gestörter Relaxation des linken und/oder rechten Ventrikels (diastolische Ventrikelfunktionsstörung) einhergeht. Typisch ist eine Kardiomegalie mit Dilatation beider Ventrikel, erniedrigter Auswurffraktion und hohem enddiastolischen Volumen. Das Herzzeitvolumen ist vermindert (Vorwärtsversagen) und es kommt zum Rückstau des Blutes vor dem Herzen (Rückwärtsversagen) (Isselbacher K. et al; Haπ son's Principles of Intemal Medicine (McGraw Hill, New York, 1994)).
Die Inzidenz der DCM beträgt in den westlichen Industriestaaten etwa 5/100.000 Einwohner/Jahr. Sie stellt damit die am häufigsten auftretende primäre Kardiomyopathie dar. In neueren Untersuchungen wurde in etwa 30% eine familiäre Häufung beschrieben (Towbin, The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies 10, 13-139 (1998)). Die durch diese Erkrankung anfallenden Kosten betragen beispielsweise in den Vereinigten Staaten von Amerika 10-40 Milliarden US Dollar, d.h. extrapoliert dürften in Deutschland 5 bis 20 Milliarden DM anfallen.
Die Ätiologie der Erkrankung ist jedoch nach wie vor unklar. In etwa 30% der Fälle können enterovirale (Pauschinger M. et al.; Circulation 99(7), 889-895 (1999)) oder adenovirale (Pauschinger, M. et al.; Circulation 99(10), 1348- 1354 (1999)) DNAs und RNAs im Myokard nachgewiesen werden. Ein möglicher Pathomechanismus wurde von Badorff (Badorff, C. et al.; Nature medicine 5, 320 - 326 (1999)) nahegelegt. Eine virale Genese kann deshalb als wahrscheinlich gelten. Darüber hinaus wurden Antikörper zum Beispiel gegen Betarezeptoren und den Adeninnunkleotid- Translokator (ANT) nachgewiesen, weshalb auch Autoimmunmechanismen als ein pathogenetisches Prinzip diskutiert werden (Schultheiss, H.P. et al; Circ Res. 76, 64 - 72 (1995)). Zunehmend wird aber auch bei der DCM, nicht zuletzt aufgrund der familiären Häufungen, eine genetische Ursache als wahrscheinlich erachtet. Am besten dokumentiert sind Mutationen im Dystrophin-Gen, z.B. bei der Duchenneschen und der Beckerschen Muskeldystrophie (Muntoni, F. et al.; N Engl J Med 329, 921-5 (1993)), die neben einer Muskeldystrophie auch zu einer DCM führen. Darüberhinaus wurden zwei Mutationen im kardialen Aktin-Gen beschrieben, die in den entsprechenden Familien zu einer DCM führen (Olsen, T. et al.; Science 280, 750 - 752 (1998)). Auch im Metavinculin-Gen wurde eine Mutation gefunden, die sehr wahrscheinlich bei dem betroffenen Patienten zu einer Kardiomyopathie führte (Maedam, M. et al.; Circulation 95, 17 - 20 (1997)). Zusätzlich konnte bei der Kardiomyopathie des syrischen Hamsters eine Mutation im delta Sarkoglykan-Gen als ursächlich nachgewiesen werden (Nigro, V. et al.; Hum Mol Genet 6, 601 -607 (1997)). Diese Gene kodieren allesamt für Proteine des Zytoskeletts, weshalb angenommen wird, daß Mutationen in zytoskelettären Proteinen zu einer DCM führen, ganz im Gegensatz zu den Proteinen des Sarkomers, bei denen Mutationen offensichtlich zu einer hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) führen (Towbin, J. et al.; Nature Medicine 5, 266-267 (1999) und Chen, J. et al.; J Clin Invest 103, 1483-1485 (1999)).
Da das MLP zu den zytoskelettären Proteinen gezählt wird, fügt sich der MLP knock out, der mit einer DCM einhergeht, gut in das oben angeführte Gedankenmodell ein (Arber et al.; Cell 88, 393-403 (1997) ). Das MLP wurde 1994 unter Anwendung einer subtraktiven Klonierungstechnik erstmals als positiver Regulator der Myogenese beschrieben (Arber S. et al.; Cell 79, 221-31 (1994)) und gewann 1997 für die Kardiologie erheblich an Bedeutung, als bekannt wurde (Arber et al.; Cell 88, 393-403 (1997)), daß der MLP-knock out in einem Maus-Modell mit einer DCM einhergeht. Dies war gleichzeitig der erste gentechnisch hergestellte Organismus, der dieses Krankheitsbild ausprägte. Allerdings ist im Stand der Technik bislang vollkommen unklar, ob auch beim Menschen Mutationen in diesem Gen zu einer DCM führen.
Das MLP selbst gehört, wie der Name schon zum Ausdruck bringt, zur Gruppe der LIM-Proteine. Diese Gruppe wurde vor etwa 10 Jahren nach den Anfangsbuchstaben ihrer ersten 3 Mitglieder benannt (lin 11 , islet 1 , mec3) und hat im wesentlichen drei Subgruppen: 1. Die LIM-Kinasen, d. h. Proteine mit dem LIM-Motiv und Kinaseaktivität, 2. LIM-Homeobox-Gene, d. h. LIM- Proteine, die als Transkriptionsfaktoren fungieren, sowie 3. „LIM only"- Proteine, d.h. LIM-Proteine, die ausschließlich LIM-Motive tragen. Das MLP gehört zur Gruppe der „LIM only"- Proteine (Morgan, M. et al.; Biochem Biophys Res Com 212, 840-846 (1995)).
Das Protein selbst besteht aus 194 Aminosäuren und bildet zwei LIM- Doppelzinkfinger aus, gefolgt von jeweils einer Glycin-reichen Aminosäuresequenz. Das Protein fungiert wahrscheinlich aufgrund seiner Lokalisation an der Z-Bande als zytoskelettäres Protein, wo es an f-Aktin- Strukturen bindet (Arber, S. et al.; Genes Dev 10, 289-300 (1996)).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, das eine präventive Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie erlaubt. Das Mittel soll auch den Nachweis der Disposition eines Individuums zur Entwicklung des Krankheitsbildes der dilatativen Kardiomyopathie erlauben. Schließlich soll das bereitzustellende Mittel die Diagnose von dilatativer Kardiomyopathie ermöglichen.
Weiterhin ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Myokarderkrankungen, zum Screenen auf Myokarderkrankungen und zum Nachweis der Disposition zur Entwicklung einer Myokarderkankung, jeweils insbesondere der dilatativen Kardiomyopathie, bereitzustellen.
Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Kit bereitzustellen, welcher im Rahmen der vorstehend genannten Verfahren verwendet werden kann.
In einem weiteren Aspekt liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde eine regulatorische Nukleinsäure bereitzustellen, die die gewebespezifische, insbesondere die muskelspezifische, Expression von Nukleinsäuren erlaubt.
Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen bereitzustellen, die durch gewebespezifische Expression behandelbar bzw. verhinderbar sind.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Sequenz eine Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation ein Austausch von T zu C ist.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Sequenz eine Mutation an der dritten Position von Codon 112 im Exon 4 der translatierten Sequenz aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation ein Austausch von A zu G.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfaßt die Nukleinsäure lediglich die für eine Aminosäuresequenz codierenden Sequenzen.
Weiterhin wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei an Position 67 eine Mutation vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Mutation von T zu C.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei an Position 393 eine Mutation vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Mutation von A zu G.
Es ist anzumerken, daß im Zusammenhang mit den vorstehende gemachten Positionsangaben sich diese auf die Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 beziehen.
Weiterhin wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure codierend für MLP, wobei die Sequenz ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure entsprechen würde. Schließlich wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine für MLP codierende Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisiert.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Aminosäuresequenz, die von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon codiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz von der Sequenz/den Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon codiert, die eine oder die beiden der vorstehend genannten Mutationen, d.h. an Base No. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz bzw. an der dritten Position von Codon 112 in Exon 4 der translatierten Sequenz, umfaßt/umfassen.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein MLP umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem Teil davon codiert ist, oder dadurch, daß das MLP eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz umfaßt.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Sonde für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wobei die Sonde eine Sequenz nach SEQ ID NO: 4 umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde für den Nachweis und/oder Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Sonde für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wobei die Sonde die Sequenz nach SEQ ID NO: 5 umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde für den Nachweis und/oder die Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet.
In einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Sonden, einzeln oder in Kombination, zur Diagnose von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei die Myokard-Erkrankung die dilatative Kardiomyopathie.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder eine erfindungsgemäße Sonde verwendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß die Myokard-Erkrankung dilatative Kardiomyopathie ist.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine Probe umfassend eine für MLP codierende Sequenz mit einem Restriktionsenzym verdaut wird und das Vorliegen einer für MLP codierenden mutierten Sequenz durch das Auftreten eines gegenüber dem Restriktionsenzym-Verdaumuster einer für MLP codierenden nicht-mutierten Sequenz geänderten Restriktionsenzym-Verdaumusters nachgewiesen wird.
Dabei ist in einer Ausführungsform vorgesehen, daß es sich bei der Myokard- Erkrankung um dilatative Kardiomyopathie handelt.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Verfahren eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder eine erfindungsgemäße Sonde verwendet wird.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die für MLP codierende Sequenz vor dem Verdau mittels PCR amplifiziert.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Nachweis bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gerichtet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Amplifikation mit einem Primer, wobei der Primer eine Sequenz nach SEQ ID NO: 13 und/oder SEQ ID NO: 14 umfaßt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß der Restriktionsenzym-Verdau durch Nci I erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß im Falle einer nicht-mutierten Sequenz das PCR-Produkt eine Länge von etwa 308 bp und im Falle einer Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 bzw. einer Mutation an Position 67 der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 , wobei die Mutation in einem Austausch von T zu C besteht, zwei PCR-Produkte mit etwa 205 und etwa 103 bp auftreten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann vorgesehen sein, daß der Nachweis bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gerichtet ist, bevorzugterweise auf eine Nukleinsäure, die eine Mutation an der dritten Position von Codon Nr. 112 in Exon 4 der translatierten Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist in einer Ausführungsform vorgesehen, daß die Amplifikation mit einem Primer erfolgt, wobei der Primer die Sequenz nach SEQ ID NO: 15 und/oder SEQ ID NO: 16 umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Restriktionsenzymverdau durch Cvi Rl.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, bei dem eine erfindungsgemäße Sonde verwendet wird, kann vorgesehen sein, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine Hybridisierung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde erfolgt, wobei die Sonde eine Sequenz nach SEQ ID NO: 4 umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, daß die Hybridisierung bei 60°C erfolgt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, wobei eine erfindungsgemäße Sonde verwendet wird, kann vorgesehen sein, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine Hybridisierung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde erfolgt, wobei die Sonde eine Sequenz nach SEQ ID NO: 5 umfaßt.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der Erfindung gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, wobei eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz oder ein erfindungsgemäßes MLP nachgewiesen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Myokard-Erkrankung dilatative Kardiomyopathie. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Aminosäuresequenz oder das MLP mittels eines Antikörpers nachgewiesen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch einen Kit zum Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, wobei vorgesehen ist, daß der Kit mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder mindestens eine erfindungsgemäße Sonde umfaßt.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit zum Nachweis eines erfindungsgemäßen MLP oder zum Nachweis einer für ein MLP codierenden erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz, wobei der Kit mindestens einen Antikörper gegen das erfindungsgemäße MLP oder gegen eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz umfaßt.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine regulatorische Nukleinsäuresequenz, die etwa 500 Basenpaare umfaßt, wobei die 500 Basenpaare jene sind, die stromaufwärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomischen Sequenz angeordnet sind.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure ist vorgesehen, daß die regulatorische Nukleinsäure etwa 1000 Basenpaare umfaßt, wobei die 1000 Basenpaare jene sind, die stromaufwärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomischen Sequenz angeordnet sind.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine regulatorische Nukleinsäure, die ausgehend von humaner genomischer DANN darstellbar ist unter Verwendung von zwei Primern in einer PCR-Reaktion, wobei der stromaufwärtige Primer die SEQ ID NO: 9 und der stromabwärtige Primer die SEQ ID NO: 10 umfaßt.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine regulatorische Nukleinsäuresequenz umfassend eine Sequenz nach SEQ ID NO: 8.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure ist vorgesehen, daß die regulatorische Nukleinsäure ein Promotor ist.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Vektor umfassend eine erfindungsgemäße regulatorische Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die regulatorische SEquenz in dem Vektor pAdCMVssTnl enthalten ist, wobei bei diesem Vektor der CMV-Promotor durch die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz ersetzt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor ein adenoviraler Vektor.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß der erfindungsgemäße Vektor eine codierende Sequenz umfaßt, die unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure ist.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß die codierende Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die hsp70 und das „slow skeletal troponin I" umfaßt. In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Zelle umfassend eine erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist die Zelle eine eukaryontische Zelle.
In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Zelle eine Säugetierzelle.
In einer ganz bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine humane Zelle.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Medikament umfassend eine erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäure, einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder eine erfindungsgemäße Zelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Medikament im Rahmen einer Gentherapie verwendet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Medikaments ist vorgesehen, daß das Medikament ein solches ist zur Behandlung und/oder Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die kardiovaskulären Erkrankungen solche sind, bei denen eine Punktmutation in einem Gen zu einem Krankheitsbild führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Medikamentes ist vorgesehen, daß die Punktmutation in Genen liegt, die für Proteine des Sarkomers, des Dystrophins und kardialen Aktins codieren.
In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Medikamentes ist vorgesehen, daß die kardiovaskuläre Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die hypertrophe Kardiomyopathie, long QT- Syndrom und dilatative Kardiomyopathie umfaßt.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß genetische Ursachen für die Entwicklung bzw. Disposition zur Entwicklung von dilatativer Kardiomyopahtie beim Menschen von entscheidender Bedeutung sind. Diese Erkenntnis gründet sich auf der Entdeckung des Erfinders, daß sich in verschiedenen Exons des humanen MLP-Gens Varianten finden, die mit dilatativer Kardiomyopathie einhergehen.
Die nun vorliegende genomische humane Sequenz des MLP-Gens ist in sechs Exons organisiert, wobei alle Exons die klassischen Intron-Exon- Übergänge aufweisen und am 5'-Ende Elemente gefunden wurden, die charakteristisch für einen Promotor sind. Die Lage der einzelnen Exons in der humanen genomischen Sequenz des MLP-Gens kann wie folgt beschrieben werden:
Exon 1 von 12983 - 1301 1 (insgesamt 28 bp) Exon 2 von 22480 - 22620 (insgesamt 140 bp) Exon 3 von 26653 - 26823 (insgesamt 170 bp)
Exon 4 von 2861 1 - 28746 (insgesamt 135 bp) Exon 5 von 29912 - 30005 (insgesamt 93 bp) Exon 6 von 3221 1 - 32923 (insgesamt 712 bp)
Das ganze Gen erstreckt sich somit auf etwa 20000 bp.
Das Exon 1 des Gens codiert nur für einen 5'-nicht-translatierten Bereich; die translatierten Bereiche sind auf den Exons 2 bis 6 codiert. Eine rechnergestützte Promotoranalyse ergab, daß sich vor dem 1. Exon eine klassische TATA-Box befindet. Es wurde eine Vielzahl von Patienten mit familiärer DCM analysiert und dabei überraschenderweise gefunden, daß Punktmutationen in der codierenden Sequenz der genomischen humanen Sequenz des MLP-Gens, und damit auch in der hierzu korrespondierenden mRNA bzw. der abgeleiteten cDNA auftreten.
Ein Patient aus einer solchen Familie zeigte im Exon 2 einen Basenpaaraustausch (T->C) der an Position 4 zu einem Aminosäureaustausch von Tryptophan zu Arginin führt (W4R). Die diesen Austausch verursachende Mutation erfolgt genauer an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten humanen genomischen Sequenz für MLP. Die Position entspricht Position 67 der Sequenz gemäß SEQ ID No. 1. Die mutierte Sequenz findet sich hierin als SEQ ID No. 2
Die von dem Erfinder entdeckte Variante im MLP-Gen führt zu einer neuen Restriktionsschnittstelle, weshalb schnell große Patientenkollektive analysiert werden können. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde ein weiteres Patientenkollektiv, dessen Mitglieder unter DCM leiden, untersucht, wobei von genomischer DNA von Patienten mit DCM das Exon 2 amplifiziert und mit dem entsprechenden Enzym verdaut wurde. Auf diese Weise konnte aus einem Kollektiv von 500 Patienten sechs weitere Patienten mit der Variante detektiert werden. Es wurden daraufhin Familienstammbäume erstellt und, soweit möglich, die Familienangehörigen zur Blutentnahme einbestellt. Auf der Grundlage dieser Untersuchungen wurden bislang zwei Familien gefunden, bei denen die Erkrankung mit dem Genotyp kosegregiert.
Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, sollen die folgenden Überlegungen betreffend die vorstehend beschriebene Variante (Mutante) der für MLP codierenden Nukleinsäuresequenz angestellt werden.
Die im Wildtyp vorhandene Aminosäure Tryptophan gehört zu den heterozyklischen Aminosäuren, das hierfür eingetauschte, d.h. in der O 01/57208 _-j e>_ PCT/EP01/01042
mutierten Nukleinsäure vorhandene Arginin ist die am stärksten basische Aminosäure. Es handelt sich also um einen strukturbrechenden Austausch. Der Aminosäurenaustausch liegt in einem hochkonservierten Bereich des Proteins, wobei nicht nur das Tryptophan an dieser Stelle zwischen den MLPs verschiendener Spezies (Mensch, Schwein, Ratte, Maus) hochkonserviert ist, sondern gleichzeitig auch die benachbarten Aminosäuren am aminoterminalen Ende des Proteins. Dies gilt nicht nur für das MLP selbst, sondern auch für die am nächsten verwandten Proteine (CRPI und CRP2). Daraus kann gefolgert werden, daß der aminoterminale Bereich des Proteins benötigt wird, um das MLP an seinen Bestimmungsort in der Myozyte zu transportieren („andocken", solche Sequenzen sind bei vielen Proteinen gleich und kommen deshalb ubiquitär vor). Wenn dem so ist, könnte das veränderte MLP nicht mehr an seinen Bestimmungsort transportiert werden und hätte biologisch möglicherweise keinen Effekt. Eine rechnergestützte Analyse ergab, daß die aminoterminalen 10 Aminosäuren nur zum MLP, CRP1 und CRP2 eine signifikante Homologie aufweisen. Nach dem Austausch W4R zeigte sich keine signifikante Homologie mehr zu einem bekannten Protein. Bei dem aminoterminalen Ende des Proteins kann es sich somit nicht um eine häufig vorkommende, typische Transporter-Sequenz handeln, darüberhinaus ergibt die Variante W4R ebenfalls keine Homologie zu bekannten Proteinen.
Aus dem oben Ausgeführten läßt sich schlußfolgern, daß der Variante im Exon 2 mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit eine pathogenetisch wichtige Funktion bei der Genese einer DCM bei den entsprechenden Patienten zukommt.
Neben der vorstehend beschriebenen Punktmutation wurde noch eine weitere gefunden, die mit DCM in Beziehung steht. Dabei handelt es sich um eine Mutation im Exon 4 des genomischen humanen MLP-Gens, genauer um einen Basenaustausch an der dritten Position von Codon 112, wobei ein Austausch von G zu A erfolgt. Dieser Austausch geht mit keiner Veränderung der Primärsequenz des dadurch codierten MLP-Genproduktes einher. Die zu der besagten genomischen Position korresponierende Position in der translatierten Sequenz, wie sie dargestellt ist in SEQ. ID. No1, ist Position 393. Die mutierte Sequenz findet sich hierin als SEQ ID No. 3
Diese mutierte Form des MLP-Gens bzw. seines Genproduktes wurde bei einem Patienten gefunden, der an schwerer dilatativer Kardiomyopathie erkrankt war und sich einer Herztransplantation unterziehen mußte. Die Genese der Erkrankung war unklar. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß bei diesem Patienten eine deutlich verminderte MLP-mRNA vorlag und daß dieser Patient im Exon 4 im Kodon 112 an Position 3 einen homozygoten Basenpaaraustausch von A zu G aufwies. Es scheint so zu sein, daß diese Variante zu einer verminderten Halbwertszeit der mRNA oder z. B. über ein verändertes differentielles Prozessieren zu einer mRNA mit anderen Eigenschaften führt. Es ist daher davon auszugehen, daß der homozygote Basenpaaraustausch im Codon 112 ebenfalls einen pathogenetisch wichtigen Effekt hat.
Die hierin offenbarten Nukleinsäuren sind in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Durch die Korrelation der offenbarten mutierten MRL-Sequenzen mit Herzerkrankungen, insbesondere der dialatativen Kardiomyopathie, können somit Untersuchungen an biologischem Material vorgenommen werden, um zu überprüfen, ob die Probe und damit die Person, von der die Probe stammt, an einer Herzerkrankung leidet oder zumindest infolge der genetisch Ausstattung das Risiko in sich trägt, an dieser Herzerkrankung zu erkranken. Somit kann die Verwendung der offenbarten Nukleinsäuren sowohl zu Zwecken der Prävention als auch der Diagnose erfolgen. Dabei kann neben einer auf die Einzelperson abgestellten Untersuchung auch ein Patientenkollektiv Gegenstand von Untersuchungen sein, die die offenbarten Nukleinsäuren verwenden oder auf diese zurückgreifen. Die hierin beanspruchten Sequenzen sollen dabei nicht nur die Sequenzen gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 umfassen, sondern auch alle anderen davon ableitbaren Sequenzen, solange die hierin speziell offenbarten Mutationen noch vorhanden sind. Insbesondere sind solche abgeleiteten Sequenzen hierin darunter zu verstehen, die über die offenbarten beiden speziellen Mutationen hinaus noch weitere Mutationen aufweisen, insbesondere auch solche Sequenzen, die trotz dieser Mutationen noch für ein MLP codieren. Derartige Mutationen können weitere Punktmutationen, aber auch eine Deletion oder Addition eines Nukleotids oder einer ganzen Nukleotidfolge sein. Denkbar ist auch, daß mehrere Deletionen oder Additionen in einer derartigen Sequenz vorhanden sind. Diese Additionen und Deletionen können. an verschiedenen Stellen der Sequenz erfolgen. Von den hierin offenbarten Nukleinsäuren sind auch solche umfaßt, die die Sequenzen nach SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 umfassen, wobei Teile einer jeder der beiden Sequenzen durch ein Nukleotid oder eine Abfolge mehrerer Nukleotide getrennt sind. Ein Beispiel für eine derartige Sequenz ist die genomische MLP-Sequenz, die die besagten Mutationen aufweist, und deren codierenden Bereiche durch Introns voneinander getrennt sind.
Die Darstellung der genomischen humanen MLP-Sequenz ist in den Beispielen hierin beschrieben.
Die hierin offenbarten Sonden sind Allel-spezifische Oligonucleotide, die komplementär zu denjenigen Bereichen der Nukleinsäuren sind, die die offenbarten Mutationen tragen. Diese Sonden können insbesondere bei der Polymerase-Ketten-Reaktion als Primer für die Amplifikation der Nukleinsäure verwendet werden und erlauben den Nachweis selbst bei geringen Probenmengen. Die Sonden können entweder nach der Polymerase-Reaktion oder direkt zum Nachweis der die Mutationen aufweisenden Nukleinsäuren verwendet werden. Zu diesem Zweck können die Sonden in markierter Form vorliegen. Derartige Markierungen können, u.a., radioaktive oder fluoreszierende Marker sein. O 01/57208 _η g_ PCT/EP01/01042
Die Sequenzen der Sonden oder Primer zum Nachweis der Mutation in Exon 2 lauten:
AGA TGC CAA ACC GGG GCG
und ist als SEQ ID No. 4 hierin beschrieben, und
für den Nachweis der Mutation in Exon 4:
TTC ACT GCG AAG TTT GGA
und ist hierin als SEQ ID No. 5 beschrieben.
Die Sequenz der Sonden oder Primer zum Nachweis der zu den jeweiligen Mutationen entsprechenden Wildtyp-Sequenz lautet im Falle von Exon 2:
AGA TGC CAA ACT GGG GCG
und ist hierin als SEQ ID No. 6 beschrieben, und
im Falle von Exon 4:
TTC ACT GCA AAG TTT GGA
und ist hierin als SEQ ID No. 7 beschrieben.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden die für den Nachweis von Nukleinsäuren oder Genprodukten üblichen Probenaufarbeitungsschritte durchgeführt, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Als Ausgangsmaterial kann, bspw., Blut oder Biopsiematerial verwendet werden.
Stellt das erfindungsgemäße Verfahren auf den Nachweis der Mutation über die Erzeugung einer zusätzlichen Schnittstelle für ein Restriktionsenzym ab, die in der Wildtyp-Sequenz, sei es nun in der genomischen Sequenz, der mRNA oder einer cDNA, nicht vorhanden ist, werden die erhaltenen Nukleinsäure-Fragmente in der Regel auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Es sind jedoch auch andere Trenntechniken denkbar, so z.B. Kapillarelektrophorese. Im Falle der Verwendung eines Agarose-Gels können die verschiedenen Nukleinsäurefragmente durch Färbung mit bspw. Ethidiumbromid oder infolge eines radioaktiven Markers sichtbar gemacht werden.
Wird bei einem der erfindungsgemäßen Verfahren das Genprodukt eines der hierin offenbarten Nukleinsäuren nachgewiesen, können hierzu alle für den Nachweis von Peptiden oder Proteinen geeigneten Verfahrensweisen herangezogen werde. Ein Möglichkeit besteht in der Verwendung von Antikörpern, insbesondere monoklonaler Antikörper.
Es ist für die Fachleute offensichtlich, daß beim Nachweis des durch eine Nukleinsäure, die die Mutation im Exon 4 aufweist, bei der es zu einem Austausch an der Position 3 von Codon 112 von A zu G kommt, codierten Peptids oder Proteins auf andere Nachweisverfahren ausgewichen werden muß, die nicht auf die infolge der Mutation Andersartigkeit des Genproduktes abstellen, da es sich bei dieser Mutation um eine stille Mutation handelt, die sich auf der Ebene der Primärsequenz, d.h. auf der Aminosäuresequenz nicht äußert. Wie oben festgestellt kommt es jedoch bei dieser Mutation, insbesondere bei Vorliegen eines homozygoten Basenpaaraustausches, d.h. beide Allele weisen diese Mutation auf, zu einer deutlich verminderten MLP- mRNA, so daß auf der Ebene des Genproduktes der Nachweis der Mutation durch Quantifizieren der mRNA bzw. des Genproduktes erfolgen kann. Die erfindungsgemäßen Kits umfassen zumindest eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Sonden oder ein Genprodukt der besagten Nukleinsäuren. Besonders bevorzugt umfaßt der erfindungsgemäße Kit zumindest eine für eine der beiden beschriebenen Mutationen spezifische Sonde. Dabei kann die zum Wildtyp korrespondierende Sonde als Negativkontrolle enthalten sein. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können als Positiv- und/oder Negativkontrolle in dem Kit enthalten sein. Alternativ oder ergänzend zu der Sonde kann ein Restriktionsenzym in dem Kit enthalten sein, das an der durch die Mutation neu erzeugten Schnittstelle schneidet und somit einen Restriktionsverdau an der mutierten Sequenz gegenüber der nicht-mutierten Sequenz erlaubt und damit zu einem anderen Muster der - geschnittenen - Nukleinsäure, d.h. zu einem Restriktionslängenpolymorphismus, führt. Die Nukleinsäuren, Sonden oder Genprodukte können in dem Kit dabei in einem geeigenten Puffer vorliegen. Der Kit kann erfindungsgemäß auch einen Träger umfassen, auf eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid bzw. Protein immobilisiert werden können.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine regulatorische Nukleinsäure, insbesondere einen Promotor.
Hierin werden die Begriffe regulatorische Nukleinsäure, Promotorstruktur und Promotor synonym verwendet.
Bei den vom Erfinder durchgeführten Untersuchungen wurde erkannt, daß eine vor dem 1. Exon der genomischen humanen MLP-Sequenz angeordnete Sequenz mit einer Länge von ca. 2000 bp für die muskelspezifische Expression von erheblicher Bedeutung zu sein scheint. Insbesondere wird vor dem ersten Exon sowohl eine TATA-Box als auch eine CAAT-Box gefunden, die beide für die Expression des Gens von Bedeutung sind. Darüberhinaus wurden AP-1 cis-regulatorische Elemente gefunden, von denen man weiß, daß sie für muskelspezifische Gene von Bedeutung sind. Die beschriebene WO 01/57208 _2<| _ PCT/EP01/01042
regulatorische Nukleinsäuresequenz führt im übrigen dazu, daß die Expression des MLP stressinduzierbar ist. Somit stellt die regulatorische Nukleinsäuresequenz eine gewebespezifische Promotorstruktur dar, die darüber hinaus noch durch Stress induzierbar ist.
Die vorstehend genannte Gewebespezifität der regulatorischen Nukleinsäure ergibt sich daraus, daß das MLP-Gen nur in Muskelgewebe (d.h. quergestreifte und glatte Muskulatur) vorkommt; es handelt sich somit um einen muskelspezifischen Promotor. Das Genprodukt bzw. die mRNA, ist relativ einfach mit verschiedenen Techniken nachweisbar (z. B. Northern Blot, PCR), was auf einen starken Promotor schließen läßt. Das erste Exon kodiert nur etwa 30 Basenpaare des 5' nicht translatierten Bereiches. Etwa 20-30 Basenpaare vor dem ersten Exon liegen mehrere TATA-Box-Elemente, also genau die Bereiche, an die die DNA-abhängige RNA-Polymerase II binden muß, um das Gen abzuschreiben. Darüber hinaus liegen etwa 10 bis 20 Basenpaare vor dem ersten Exon mehrere Transkriptionsinitiations- Sequenzen. Zusätzlich sind unmittelbar vor dem ersten Exon mehrere AP-1 Sequenzen vorhanden. Diese Sequenzen binden die sogenannten"leucine zipper"-Transkriptionsfaktoren, die wichtige Funktionen, unter anderem bei der Stressinduzierbarkeit von Genen, einnehmen. Das Vorhandensein dieser Sequenzen untermauert die vom Erfinder gefundene Stressinduzierbarkeit des MLP-Gens.
Eine ganze Reihe von AP-1 Sequenzen werden "upstream" in den ersten 1000 Basenpaaren gefunden. Etwa 500 Basenpaare upstream wird eine CAAT Box gefunden. In der Regel werden diese Elemente 80 -120 Basenpaare vor dem Gen gefunden, eine wichtige Funktion dieses Elementes in dem vom Erfinder entdeckten Promotor ist jedoch nicht auszuschließen. Allerdings muß angemerkt werden, daß es auch Promotoren, vor allem gewebespezifische, ohne CAAT-Boxen gibt, es sich somit nicht um ein zwingend notwendiges Element handelt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß bis etwa 1000 Basenpaare vor dem ersten Exon AP-1- und CAAT-Sequenzen gefunden werden. Der Bereich von etwa 1000 Basenpaaren vor dem ersten Exon erscheint somit von erheblicher Bedeutung für die Expression des Gens zu sein. Als Kern-Region wird auf jeden Fall der Bereich von etwa 500 Basenpaaren (also von der CAAT Box ausgehend) vor dem ersten Exon zu bezeichnen sein.
Die verschiedenen Elemente der hierin offenbarten regulatorischen Nukleinsäure sind in Fig. 2 dargestellt.
Die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz kann in einer weiteren Ausführungsform auch durch die Sequenz gemäß SEQ ID No. 8 dargestellt werden.
Die Darstellung der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenz oder Promotorstruktur kann auch dadurch erfolgen, daß die entsprechende Sequenz aus humaner, genomischer DNA mit Hilfe der Polymerasen-Ketten- Reaktion mit zwei Primern amplifiziert wird. Dazu wird als stromaufwärtiger („upstream") Primer der Primer gP1 mit der Sequenz
ATC TGATGT GAA GGC TGG
verwendet, wie sie auch im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 9 angegeben ist.
Als stromabwärtiger („downstream") Primer wird der Primer gP2 mit der Sequenz
CCT GCC TGT GTG GAC TCC
verwendet, wie sie auch im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 10 angegeben ist. Die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz kann auch in einem Vektor integriert vorliegen. Derartige Vektoren können sowohl Plasmid- als auch virale Vektoren sein. Typischerweise sind Vektoren Nukleinsäuremoleküle, die für - bevorzugt fremde - Nukleinsäuren als Rezipient oder Träger dienen. Vektoren tragen im allgemeinen einen Replikationsursprung („origin") und genetische Marker, die erlauben, daß der Vektor in Wirtszellen nachgewiesen werden kann. Darüberhinaus kann der Vektor weitere Elemente umfassen, die der Steuerung der Translation und/oder Transkription der aufgenommenen bzw. im Vektor enthaltenen Nukleinsäure dienen.
Sowohl die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz als auch der erfindungsgemäße Vektor kann in einer Zelle enthalten sein. Grundsätzlich kann hierzu eine jegliche Zelle oder Zellinie herangezogen werden. Die Zelle kann ausgewählt sein aus der Gruppe, die prokaryontische und eukaryontische Zellen umfaßt. Innerhalb der Gruppe der eukaryontischen Zellen kann die Zelle wiederum ausgewählt werden aus der Gruppe, die insbesondere Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen umfaßt. Insbesondere bei den Säugetierzellen kann vorgesehen sein, daß es sich um primäre Zellen, Primärzellkulturen oder etablierte Zellkulturen handelt.
Für die regulatorischen Sequenzen und die verschiedenen diese enthaltenden biologischen Systeme ergeben sich eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten, die auf den folgenden Überlegungen sowie der Tatsache basieren, daß die hierin offenbarte regulatorische Nukleinsäure eine gewebespezifische und insbesondere muskelspezifische Expression von unter der Kontrolle der besagten regulatorischen Sequenz stehenden Nukleinsäuresequenzen erlaubt.
Eine Vielzahl von Erkrankungen des Menschen lassen sich auf genetische Defekte zurückführen. Ein Großteil dieser Krankheitsbilder wiederum wird durch monogene Erkrankungen, d. h. Mutationen in einem einzigen Gen, ausgelöst. Bei Kenntnis dieser molekularen Veränderungen läßt sich durch Gentherapie eine Reparatur des molekularen Defektes durchführen.
Im kardiovaskulären System sind eine Reihe von Erkrankungen bekannt, bei denen Punktmutationen in einem einzigen Gen zu schweren Krankheitsbildern führen. Dazu zählen Mutationen in den Genen, die Proteine des Sarkomers codieren und zur hypertrophen Kardiomyopathie führen (Towbin. The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies. 10, 131 - 139 (1998)), das long QT Syndrom (Jerve Lange Nielson-Syndrom und Romano Ward-Syndrom) (Neyround, N. et al.; Circ Res 84, 290-297 (1999)) sowie Mutationen im Dystrophin (Muntni F. et al.; N Engl J Med 329, 921 -5 (1993)) oder kardialen Aktin-Gen (Olsen, T. et al.; Science 280, 750 - 752 (1998)), die zur dilatativen Kardiomyopathie führen. Diese Erkrankungen sind prinzipiell durch Applikation des korrekten Gens kausal therapierbar.
Erst kürzlich wurde von verschiedenen Autoren über die erfolgreiche Applikation von Adenoviren in Kardiomyozyten in vitro und in vivo berichtet (Hajjar, R. et al.; Proc Natl Acad Sei USA 95, 5251-5256 (1998); Donahue J. et al.; Proc Natl Acad Sei USA 94, 4664 - 4668 (1997) und Westfall, M. et al.; Proc Natl Acad Sei USA 94, 5444 - 5449 (1997)). Allerdings haben die bislang verwendeten Vektoren den Nachteil, daß sie über einen Cytomegalie- Virus (CMV)-Promotor gesteuert werden. Sie werden deshalb nicht nur im Myokard oder dem Muskelgewebe exprimiert, sondern in jeder anderen Körperzelle auch. Die oben aufgeführten Krankheitsbilder betreffen allerdings nur Kardiomyozyten. Eine Expression des zu übertragenden Gens in andere Zellen als in Kardiomyozyten macht keinen Sinn und erhöht nur die Gefahren einer Gentherapie, nämlich das Auftreten von weiteren Mutationen bzw. von unerwünschten Interaktionen im Sinne von Immunreaktionen. Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäure wird im Gegensatz zum ubiquitär exprimierten CMV-Promotor nur im Muskelgewebe exprimiert und eignet sich deshalb und aufgrund seiner Stärke hervorragend zur Gentherapie in bzw. von Muskelgewebe.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure können generell und besonders, wenn die Darstellung mittels der beiden oben beschriebenen Primer erfolgt, an deren Enden entsprechende, von einem Restriktionsenzym erkennbare Sequenzen angebaut sein (z.B. Eco Rl oder jedes andere beliebige Enzym, über dessen Schnittstellen die Einklonierung erfolgen soll).
Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Vektors kann dabei so vorgegangen werden, daß aus dem Shuttle-Vector pAdCMVssTnl, wie beschrieben in Westfall et al. (Westfall, M. et al.; Proc Natl Acad Sei USA 94, 5444 - 5449 (1997)), mit dem entsprechenden Enzym der CMV-Promotor ausgeschnitten und der MLP-Promotor (d.h. eine erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäure) in das Shuttle-Plasmid pAdCMVssTnl eingebaut wird. Das jetzt entstandene Plasmid pAdMLPssTnl kann zusammen pJM17 über die Kalziumphosphat-Methode, wie bei Westfall et al. (Westfall, M. et al.; Proc Natl Acad Sei USA 94, 5444 - 5449 (1997)) beschrieben, in HEK 293 Zellen kotransfiziert und über homologe Rekombination ein Adenovirus mit MLP-Promotor erhalten werden, der gewebespezifisch exprimiert wird. Dieser Virus würde als Spezialfall das sogenannte "slow skeletal troponin I" exprimieren. Es kann jedoch jedes gewünschte Genprodukt in bekannter Weise vor den MLP-Promotor in einem geeigneten Vektor, bspw. einem Shuttle-Vector, kloniert und zur Expression gebracht werden. Zum Beispiel könnte das hsp70-Gen, das am Myokard protektive Funktionen einnimmt, vorgeschaltet werden (Yellon, D.et al.; J Mol Cell Card 24, 113 - 124 (1992)). Dabei werden nur klassische Klonierungsmethoden erforderlich, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und bspw. beschrieben sind in Maniatis, Fritsch & Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratories, 1989. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß sich der erfindungsgemäße Promotor vor jedes gewünschte Genprodukt klonieren läßt und der erfindungsgemäße Promotor somit mit jedem gewünschten Virus oder Vektorsystem die unter der Kontrolle des Promotors befindliche Nukleinsäure gewebespezifisch zur Expression bringen kann. Insoweit kann der hierin offenbarte Promotor insbesondere bei den vorstehend genannten und hierin offenbarten Erkrankungen verwendet werden, einschließlich bei der gentherapeutischen Behandlung der DCM. Neben den explizit hierin genannten Erkrankungen sind des weiteren all jene Erkrankungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenz therapierbar, bei denen es der gewebespezifischen und insbesondere der muskelspezifischen Expression einer Nukleinsäure bedarf.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, der Figuren und des Sequenzprotokolls weiter erläutert, woraus sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben können.
Dabei zeigt
Fig. 1 eine Restriktionsanalyse von Exon 2 des genomischen humanen MLP- Gens; und
Fig. 2 die Sequenz der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäure mit den promotorspezifischen Elementen.
BEISPIELE
1. Darstellung der humanen MLP-cDNA
Die humane MLP-cDNA wurde mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (: PCR) unter Verwendung der beiden Primer KMLP1 und KLMP2 hergestellt. ie Sequenz von KMLP1 ist dargestellt als SEQ ID No.11 und lautet wie folgt:
GGC AGA CTT GAC CTT GAC CA
Die Sequenz von KMLP2 ist dargestellt als SEQ ID No.12 und lautet wie folgt:
GAG GTG CGC CGT TTC TCA GA
Die solchermaßen als Produkt der PCR erhaltene cDNA weist eine Länge von etwa 650 bp auf und enthält den gesamten codierenden Bereich der mRNA.
2. Darstellung der humanen genomischen MLP-Sequenz
Ausgehend von der in Beispiel 1 beschriebenen cDNA wurde die humane genomische MLP-Sequenz dadurch dargestellt, daß eine humane genomische Genbank unter Verwendung der cDNA gescreent wurde. Hierzu wurde die als Sonde eingesetzte cDNA radioaktiv markiert (Feinberg, A. et al.; Anal Biochem 132, 6-13 (1983)) und mit einer in den Bakteriophagen P1 einklonierten Genbank hybridisiert (loannou, P.A. et al.; Nature Genetics 6, 84-89 (1994)). Das Screening erfolgte unter Anwendung der üblichen, den Fachleuten bekannten Verfahrensweisen, wie sie z.B. beschrieben sind in Maniatis, Fritsch & Sambrook. Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratories, (1989).
Das MLP-Gen selbst ist auf dem Chromosom 11 p15.1 lokalisiert (Fung, Y.W. et al.; Genomics 28, 602 - 603 (1995)).
Der solchermaßen erhaltene Klon der humanen genomischen MLP-Sequenz wurde anschließend mittels eines automatischen DNA-Sequenzierers sequenziert. Der positive Klon umfaßte insgesamt 80 000 Basenpaare und enthält das gesamte humane MLP-Gen, das in insgesamt sechs Exons organisiert ist, wie bereits oben offenbart.
3. Nachweis der Mutationen in Exon 2 und in Exon 4 der humanen genomischen MLP-Sequenz
Wie oben festgehalten, handelt es sich bei den beiden durch den Erfinder gefundenen Mutationen in der MLP-Sequenz um eine solche an Base 10 von Exon 2 der translatierten humanen genomischen MLP-Sequenz, wobei ein Austausch von T zu C erfolgt, und um eine solche an der dritten Position von Codon 112 von Exon 4 der translatierten Sequenz, wobei ein Austausch von A zu G erfolgt. Beide Mutationen finden ihre Entsprechung in der mRNA bzw. der davon ableitbaren cDNA, wobei im Falle der Mutation im Exon 2 die Position der Mutation der Base 67 der mRNA bzw. der cDNA entspricht, und im Falle der Mutation im Exon 4 die Position der Mutation der Base 393 der mRNA bzw. der cDNA, wie auch dargestellt in SEQ ID No. 1 , entspricht.
3.1 Isolieren der genomischen DNA
Herstellung des"buffv coats"
Gesamtblut wird für etwa 10 Minuten bei 3300 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Zentrifugation erhält man drei Phasen, die obere klare Phase entspricht dem Plasma, die dünne weiße Phase entspricht den Leukozyten und die untere rote Phase den Erythrozyten. Die Leukozyten können jetzt leicht mit einer Pipette abgenommen werden. Sie entsprechen dem "buffy coat".
Isolierung der genomischen DNA Die Isolierung der genomischen DNA wurde mit Hilfe eines "Qiagen Blood Kits" von 1997 und einer Standard "Eppendorf-Tischzentrifuge" wie folgt vorgenommen:
a.) Etwa 200 μl des buffy coats wurden in ein 1 ,5 m1 Eppendorf-Gefäß gegeben. Dazu wurden 25 μl Proteinase K und 200μl eines Puffers AL gegeben und für 15 Sekunden gevortext (heftig geschüttelt, gemischt), b.) Diese Mischung wurde für 10 Minuten in einem Wasserbad bei 70 °C erhitzt. c.) Zu diesem Gemisch wurden 210 μl Ethanol (100 %ig) gegeben und erneut kräftig gemischt. d.) Eine Qiagen-Säule wurde in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß gegeben und die
Mischung aus c) auf die Säule aufgetragen. Es erfolgte eine Zentrifugation für 1 Minute bei 6000 g und die Säule wurde auf ein neues 2 ml Eppendorf-Gefäß gegeben. Die abzentrifugierte Flüssigkeit wurde verworfen, die genomische DNA hatte an die Säule gebunden, e.) Auf die Säule wurden 500 μl Puffer AW gegeben und erneut bei 6000 g für 1 Minute zentrifugiert. Die abzentrifugierte Flüssigkeit wurde erneut verworfen und die Säule auf ein neues 2ml Eppendorf-Gefäß gegeben. f.) Es wurden erneut 500 μl Puffer AW auf die Säule gegeben und mit höchster Geschwindigkeit (etwa 15.000 Umdrehungen bei einer
Eppendorf-Tischzentrifuge) für 3 Minuten zentrifugiert. Die abzentrifugierte
Flüssigkeit wurde erneut verworfen. g.) Die Säule wurde jetzt auf ein 1 ,5 ml Eppendorf-Gefäß gesetzt und es wurden 200 μl reines Wasser, vorher auf 70 °C erhitzt, auf die Säule gegeben. Es erfolgte eine Inkubation für eine Minute bei Raumtemperatur und eine Zentrifugation bei 6000 g für eine Minute. In der abzentrifugierten Flüssigkeit, dem Eluat, befand sich die genomische DNA, die für die weiteren Zwecke Verwendung fand. Die Konzentration wurde in einem weiteren Schritt photometrisch bestimmt. Für die Polymerase-Ketten-Reaktion wurden etwa 50 ng der genomischen DNA eingesetzt.
Amplifikation von Exon 2 der humanen genomischen MLP-Seouenz
Zur Amplifikation des Exons 2 wurden die Primer GMLP 3 mit der Sequenz
ACT CTTAGA GAT TGG TTC ACT CC
entsprechend SEQ ID No. 13 und
GMLP 4 mit der Sequenz
ACC ACA CTATGA GAA CCA CTG GC
entsprechend SEQ ID No. 14 verwendet.
Dabei wurden die folgenden Amplifikationsbedingungen angewandt:
1. 94 °C für 4 Minuten
Dann beginnen insgesamt 36 Zyklen mit
2. 94 °C für 45 Sekunden 3. 62 °C für 45 Sekunden
4. 72 °C für 1 Minute
Im Anschluß an die 36 Zyklen dann:
5. 72 °C für 5 Minuten
3.2 Restriktionsverdau von Exon 2 der humanen genomischen MLP- Seguenz O 01/57208 - ,3, ,1- PCT/EP01/01
Von den unter 3.1 beschriebenen und erhaltenen PCR-Produkten wurde ein Teil auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ihre korrekte Größe hin analysiert. Bei korrekten Größen, was in der Regel der Fall war, wurde ein anderer Teil über Nacht bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym Nci I verdaut und am nächsten Morgen erneut auf einem Agarose-Gel aufgetrennt.
Die PCR zur Amplifikation von Exon 2 ergibt ein PCR Produkt mit einer Größe von 308 Basenpaaren. Sollte sich im Codon 4 an Position 1 ein Basenpaaraustausch von T zu C ereignet haben, schneidet das Restriktionsenzym Nci I und es entstehen 2 Bruchstücke mit einer Größe von 103 Basenpaaren und 205 Basenpaaren.
Im homozygoten Fall würde man kein PCR-Produkt mit einer Größe von 308 Basenpaaren, sondern nur noch die beiden Bruchstücke vorfinden. Im heterozygoten Fall, d.h. es liegt ein gesundes, d.h. bezüglich der speziellen Base nicht mutiertes Allel, und ein bezüglich der speziellen Base mutiertes Allel vor, findet man das PCR Produkt mit 308 Basenpaaren zusätzlich zu den beiden kleineren Bruchstücke.
Das Ergebnis dieser Restriktionsanalyse ist in Fig. 1 dargestellt, wobei Fig. 1 genauer das Ergebnis eines Restriktionsverdaus von amplifiziertem Exon 2 der humanen genomischen MLP-Sequenz zeigt, das auf ein Agarose-Gel aufgetragen und aufgetrennt wurde. Die beiden jeweils äußeren Spuren des Agarose-Gels zeigen einen Molekulargewichtsstandard. Die mit „wt" übschriebene Spur zeigt Exon 2 in seinem Wildtyp, wobei zu dem aufgetragenen Restriktionsansatz kein Restriktionsenzym hinzugesetzt wurde. Die mit „wt + E" überschriebene Spur zeigt Exon 2 in seinem Wildtyp, wobei zu dem aufgetragenen Restriktionsansatz das Restrktionsenzym Nci I hinzugegeben wurde. Infolge des Fehlens der hierin offenbarten Mutation an Base 10 von Exon 2 bei der humanen genomischen Wildtyp-MLP-Sequenz ist in Exon 2 keine Schnittstelle für Nci I vorhanden, so daß sich gegenüber dem Restriktionsansatz mit der Wildtyp-Sequenz ohne Restriktionsenzym kein geändertes Schnittmuster ergibt. Die mit „M" überschriebene Spur zeigt einen Restriktionsansatz, der mit der mutierten Form von Exon 2 der humanen genomischen MLP-Sequenz ohne Restriktionsenzym durchgeführt wurde. Es finden sich ohne Zusatz des Restriktionsenzyms keine zusätzlichen Banden im Gel, so daß, wie auch aus dem Vergleich mit dem mit „wt" bezeichneten Ansatz hervorgeht, die Größe des Exon 2 umfassenden Nukleinsäurefragment infolge der Mutation nicht geändert ist. Führt man einen Restriktionsansatz mit dem an Base 10 mutierten Exon 2 durch und setzt das Restriktionsenzym Nci I zu, so kommt es infolge der mutationsbedingten Ausbildung einer Schnittstelle für das besage Retriktionsenzym zu einem Schneiden der Nukleinsäure von Exon 2 und Ausbildung der beiden vorhergesagten Nukleinsäurefragmente, wie dies auch in Fig 1 in der mit „M+E" übersch ebenen Spur gezeigt ist.
Unter Anwendung dieser Technik wurden bislang etwa 500 Patienten auf das Vorkommen der von dem Erfinder entdeckten Variante untersucht. Es wurden sechs Patienten mit der Variante gefunden.
3.3 Restriktionsverdau von Exon 4 der humanen genomischen MLP- Seguenz
Zur Analyse des Exons 4 wurde im Prinzip genauso wie bei Exon 2 vorgegangen. Es wurden jedoch dabei die Primer gMLP7.2 mit der Sequenz
CAA CAA CGC TAT gAg AAA gAC ACC
entsprechend SEQ ID No. 15 und
gMLP8.2 mit der Sequenz
ggA gCT AgA gAg AAT gAC AgC TgC entsprechend SEQ ID No. 16 unter den folgenden PCR -Bedingungen benutzt:
1. 94 °C für 4 Minuten
Dann beginnen insgesamt 36 Zyklen mit
2. 94 °C für 45 Sekunden
3. 60 °C für 45 Sekunden
4. 72 °C für 1 Minute Im Anschluß an die 36 Zyklen dann:
5. 72 °C für 5 Minuten
Von den erhaltenen PCR-Produkten wurde ein Teil auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ihre korrekte Größe hin analysiert. Bei korrekten Größen, was in der Regel der Fall war, wurde ein anderer Teil über Nacht bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym Cvi Rl verdaut und am nächsten Morgen erneut auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Betreffend die Inkubation ist anzumerken, daß eine Inkubation des Restriktionsansatzes auch für 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur hätte erfolgen können. Die Inkubation über Nacht erfolgte nur aus Gründen der Sorgfalt.
3.4 Nachweis der Mutationen in Exon 2 bzw. Exon 4 mittels Allel- spezifischer Oligonucleotide
Neben der Durchführung von Restriktionsanalysen lassen sich zum Auffinden der hierin offenbarten Varianten bzw. Mutationen in Exon 2 und Exon 4 der genomischen humanen MLP-Sequenz bzw. der korrespondierenden cDNA Sonden (sogenannte Allel-spezifische Oligonucleotide, ASO) herstellen. Für den Nachweis der Variante oder Mutation im Exon 2 kann dabei eine Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 4 entspricht:
AGA TGC CAAACC GGG GCG
Zum Nachweis der Wildtyp-Form von Exon 2 kann eine Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 6 entspricht:
AGA TGC CAAACT GGG GCG
Die Schmelztemperatur beim Nachweis der Mutation unter Verwendung der Sequenz nach SEQ ID No. 4 beträgt 60 °C, die Schmelztemperatur beim Nachweis des Wildtyps unter Verwendung der Sequenz nach SEQ ID No. 6 beträgt ca. 58 °C.
Für den Nachweis der Variante oder Mutation im Exon 4 kann dabei eine Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 5 entspricht:
TTC ACT GCG AAG TTT GGA
Zum Nachweis der Wildtyp-Form von Exon 4 kann eine Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet werden, die SEQ ID No. 7 entspricht:
TTC ACT GCA AAG TTT GGA
Die Schmelztemperatur beim Nachweis der Mutation unter Verwendung der Sequenz nach SEQ ID No. 5 beträgt 52 °C, die Schmelztemperatur beim Nachweis des Wildtyps unter Verwendung der Sequenz nach SEQ ID No. 7 beträgt ca. 50 °C. - o-
Mit den angeführten Primern wurden die Exons 2 und 4 aller mittels der Restriktionsanalyse und der Sondenanalyse ermittelten Träger der Mutation(en) unter Verwendung von Standard-Techniken auch sequenziert. Die Sequenzanalyse bestätigte in allen Fällen das Ergebnis der Restriktions- und der Sondenanalyse. Somit kann auch die Sequenzierung der Exons 2 bzw. 4 bzw. der korresondierenden cDNA bzw. der korrespondierenden cDNA des genomischen humanen MLP-Gens bzw. des genomischen MLP-Gens, insbesondere unter Verwendung der hierin beschriebenen Sonden, als ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, verwendet werden.
3.5 Struktur der regulatorischen Nukleinsäure(seguenz)
Die in SEQ ID No. 8 angegebene regulatorische Nukleinsäure ist in Fig. 2 zusammen mit den markierten promotorspezifischen Elementen dargestellt. Die Isolierung dieser regulatorischen Nukleinsäure ist unter Verwendung der oben beschriebenen Primer gP1 und gP2, entsprechend SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10, möglich. Unter Verwendung der beiden genannten Primer kann die regulatorische Nukleinsäuresequenz bzw. der hierzu korrespondierende MLP-Promotor (1000 bp) amplifiziert werden.
Unter Bezugnahme auf Fig. 2 sei hierin noch folgendes angemerkt:
Die letzte am 3'-Ende unterstrichene Sequenz entspricht dem ersten Exon.
Die AP-1 -Sequenzen sind durch Unterstreichung markiert, wobei von der Konsensus-Sequenz TGAG/CTCA maximal zwei Fehlpaarungen akzeptiert wurden.
CAAT-Sequenzen sind durch Fettdruck markiert, wobei diesbezüglich festzuhalten ist, daß zu Beginn des Promotors sich eine AP-1 und eine CAAT-Sequenz überschneiden.
TATA-Boxen sind durch Fettdruck und Unterstreichung markiert.
Die Offenbarung der verschiedenen hierin zitierten Literaturstellen wird hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Sequenz eine Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 der translatierten Sequenz aufweist.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation ein Austausch von T zu C ist.
3. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt, wobei die Sequenz eine Mutation an der dritten Position von Codon 112 im Exon 4 der translatierten Sequenz aufweist.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation ein Austausch von A zu G ist.
5. Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie lediglich die für eine Aminosäuresequenz codierenden Sequenzen umfaßt.
6. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 67 eine Mutation vorhanden ist, insbesondere eine Mutation von T zu C.
7. Nukleinsäure, die für ein MLP codiert und die Sequenz von Position 58 bis 639 der SEQ ID NO: 1 umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 393 eine Mutation vorhanden ist, insbesondere eine Mutation von A zu G.
8. Nukleinsäure codierend für MLP, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 entsprechen würde.
9. Nukleinsäure codierend für MLP, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hybridisiert.
10. Aminosäuresequenz, codiert von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Teilen davon, insbesondere die Sequenzen oder Teile davon, die die Mutation(en) tragen.
11. MLP umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einem Teil davon codiert ist oder eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 10.
12. Sonde für eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbesondere für deren Nachweis oder Amplifikation, umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 4.
13. Sonde für eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbesondere für deren Nachweis oder Amplifikation, umfassend die Sequenzen nach SEQ ID NO: 5.
14. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einer Sonde nach Anspruch 12 oder 13 zur Diagnose von und/oder Screenen auf Myokard-Erkrankungen, insbesondere dilatative Kardiomyopathie.
15. Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard- Erkrankungen, insbesondere dilatative Kardiomyopathie, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eine Sonde nach Anspruch 12 oder 13 verwendet wird.
16. Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard- Erkrankungen, insbesondere dilatative Kardiomyopathie, insbesondere nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Probe umfassend eine für MLP codierende Sequenz mit einem Restriktionsenzym verdaut wird und
das Vorliegen einer für MLP codierenden mutierten Sequenz durch das Auftreten eines gegenüber dem Restriktionsenzym-Verdaumuster einer für MLP codierenden nicht-mutierten Sequenz geänderten Restriktionsenzym-Verdaumusters nachgewiesen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die für MLP codierende Sequenz vor dem Verdau mittels PCR amplifiziert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 gerichtet ist.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mit einem Primer erfolgt, wobei der Primer eine Sequenz nach SEQ ID NO: 13 und/oder SEQ ID NO: 14 umfaßt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Restriktionsenzym-Verdau durch Nci I erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle einer nicht-mutierten Sequenz das PCR-Produkt eine Länge von etwa 308 bp und im Falle einer Mutation an Base Nr. 10 von Exon 2 bzw. einer Mutation an Position 67 der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 , wobei die Mutation in einem Austausch von T zu C besteht, zwei PCR-Produkte mit etwa 205 und etwa 103 bp auftritt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 9 gerichtet ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mit einem Primer erfolgt, wobei der Primer die Sequenz nach SEQ ID NO: 15 und/oder SEQ ID NO: 16 umfaßt.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Restriktionsenzymverdau durch Cvi Rl erfolgt.
25. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 eine Hybridisierung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde umfassend eine Sequenz nach SEQ ID NO: 4 erfolgt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung bei 60°C erfolgt.
27. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis der bzw. das Screenen auf eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 9 eine Hybridisierung einer zu untersuchenden Probe mit einer Sonde umfassend eine Sequenz nach SEQ ID NO: 5 erfolgt.
28. Verfahren zum Nachweis von und/oder Screenen auf Myokard- Erkrankungen, insbesondere dilatativer Kardiomyopathie, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 10 oder ein MLP nach Anspruch 11 nachgewiesen wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz oder das MLP mittels eines Antikörpers, bevorzugterweise eines monoklonalen Antikörpers, nachgewiesen wird.
30. Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder mindestens eine Sonde nach Anspruch 12 oder 13 umfaßt.
31. Kit zum Nachweis eines MLP nach Anspruch 11 oder einer für ein MLP codierenden Aminosäuresequenz nach Anspruch 10 umfassend mindestens einen Antikörper gegen ein MLP nach Anspruch 11 oder gegen eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 10.
32. Regulatorische Nukleinsäure umfassend etwa 500 Basenpaare stromaufwärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomischen Sequenz.
33. Regulatorische Nukleinsäure nach Anspruch 32 umfassend etwa 1000 Basenpaare stromaufwärts von der ersten Base des ersten Exons der für MLP codierenden humanen genomischen Sequenz.
34. Regulatorische Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von humaner genomischer DNA unter Verwendung von zwei Primern in einer PCR-Reaktion die regulatorische Nukleinsäure darstellbar ist, wobei der stromaufwärtige Primer die SEQ ID NO: 9 und der stromabwärtige Primer die SEQ ID NO: 10 umfaßt.
35. Regulatorische Nukleinsäure umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8.
36. Regulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Nukleinsäure ein Promotor ist.
37. Vektor umfassend eine regulatorische Sequenz nach einem der Ansprüche 32 bis 36.
38. Vektor nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Sequenz in dem Vektor pAdCMVssTnl enthalten ist, wobei bei diesem Vektor der CMV-Promotor durch die regulatorische Sequenz nach einem der Ansprüche 32 bis 36 ersetzt ist.
39. Vektor nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen adenoviralen Vektor handelt.
40. Vektor nach einem der Ansprüche 37 bis 39 umfassend eine codierende Sequenz, die unter der Kontrolle der regulatorischen Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 36 ist.
41. Vektor nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die codierende Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die hsp70 und das „slow skeletal troponin I" umfaßt.
42. Zelle umfassend eine regulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 36 und/oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 37 bis 40.
43. Zelle nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine eukaryontische Zelle, bevorzugterweise eine Säugetierzelle und bevorzugtesterweise eine humane Zelle ist.
44. Medikament umfassend eine regulatorische Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 32 bis 36, einen Vektor nach Anspruch 37 bis 41 oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 42 oder 43.
45. Medikament nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament im Rahmen einer Gentherapie verwendet wird.
46. Medikament nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament ein solches ist zur Behandlung und/oder Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen, insbesondere kardiovaskuläre Erkrankungen, bei denen eine Punktmutation in einem Gen zu einem Krankheitsbild führt.
47. Medikament nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktmutation in Genen liegen, die für Proteine des Sarkomers, des Dystrophins und kardialen Aktins codieren.
48. Medikament nach Anspruch 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, daß die kardiovaskuläre Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die hypertrophe Kardiomyopathie, long QT-Syndrom und dilatative Kardiomyopathie umfaßt.
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