EP1240353A2 - Dünnschichtchromatographischer nachweis von antibiotika - Google Patents

Dünnschichtchromatographischer nachweis von antibiotika

Info

Publication number
EP1240353A2
EP1240353A2 EP00974526A EP00974526A EP1240353A2 EP 1240353 A2 EP1240353 A2 EP 1240353A2 EP 00974526 A EP00974526 A EP 00974526A EP 00974526 A EP00974526 A EP 00974526A EP 1240353 A2 EP1240353 A2 EP 1240353A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
antibiotics
tlc plate
plate
detection
bacterial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00974526A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rolf Eymann
Heinz-Emil Hauck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1240353A2 publication Critical patent/EP1240353A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9446—Antibacterials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G01N30/92—Construction of the plate

Definitions

  • the invention relates to a thin layer chromatography method for the detection of antibiotics.
  • the detection of the smallest amounts of antibiotics plays an important role in many areas. Examples are the examination of food and feed for prohibited antibiotics or performance enhancers, the detection of antibiotics in drinking and waste water, the search and research for new antibiotics or the testing of antibiotics in quality control.
  • Antibiotics are mostly detected directly or indirectly via their killing or growth-inhibiting effects on bacteria.
  • a prior chromatographic separation of the sample for example on a thin layer chromatography plate (TLC plate), is particularly suitable for the detection of antibiotics in complex samples. In this way, not only the antibiotic effect of the entire sample, but also the effect of individual antibiotics of possibly different concentrations can be determined.
  • Known methods therefore first describe the chromatographic separation of a sample.
  • the separated potential antibiotics are then scraped off the TLC plate, the antibiotic is removed and the solution is placed on an agar plate.
  • the agar plate was previously inoculated with a bacterium. After a longer incubation period, vacancies, so-called inhibitory zones, can be detected on the bacterial lawn where antibiotics have been applied.
  • Another method is the agar overlay method.
  • the developed DC plate is poured over without bubbles with an agar layer inoculated with bacteria. After a certain incubation period, the Agar layer with or without TLC plate and placed in a staining solution. In the presence of antibiotics, bright zones of inhibition are visible in the staining solution against a colored background.
  • the antibiotics Since the detection of the antibiotics is carried out by the death or inhibition of growth of bacteria, the antibiotics must be brought into contact with the bacteria after their separation. However, bacteria only show sufficiently stable and even growth under certain conditions. For example, they need a stable pH and must not dry out. For this reason, it is necessary to transfer the separated antibiotics into a growth medium suitable for bacteria by removing or diffusing them out of the TLC plate. During this process, as large a part of the antibiotics as possible must come into contact with the bacterial culture in order to achieve a good detection limit. In the overlay process, the DC plate is covered with an agar layer.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method for the thin-layer chromatographic detection of antibiotics which is simple to use and can be carried out entirely on the TLC plate. This enables faster, easier and more accurate verification.
  • the present invention therefore relates to a method for thin-layer chromatographic detection of antibiotics with the following reaction steps: a) carrying out a thin-layer chromatographic separation of a sample on a TLC plate; b) preparation of a bacterial suspension from a storable form of a bacterial test strain and a nutrient medium containing between 1 and 3% by weight, based on the dry matter, of a polysaccharide as a gelling agent; c) immersing or wetting the TLC plate with the bacterial suspension; d) incubation of the TLC plate e) staining of the TLC plate using a staining reagent.
  • Step a) and b) of the method according to the invention can be carried out in parallel or in succession.
  • step b) Gelrite ® as gelling agents or as a test strain, a Bacillus subtilis spore suspension.
  • Preferred embodiments of the process according to the invention include the use of MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) as a coloring reagent in step e).
  • the present invention also relates to a test kit for carrying out the method according to the invention which contains at least one nutrient medium which contains between 1 and 3% by weight, based on the dry matter, of a polysaccharide as a gelling agent, a storage-stable bacteria test strain and a coloring reagent.
  • FIGS 1 and 2 schematically show the result of two antibiotic tests and are explained in more detail in Examples 4 and 5.
  • Thin-layer chromatographic separation of a sample on a TLC plate is carried out under known conditions.
  • DC plates with a sorbent layer based on Si0 2 are mostly used for this.
  • Suitable flow agents for example acetonitrile, mixtures of acetonitrile and dichloromethane or mixtures of ethyl acetate, methanol and ammonia, are known to the person skilled in the art. The person skilled in the art is also able to adapt the flow agents to the particular separation problem.
  • the TLC plate is carefully dried to remove residues of the eluent.
  • the developed DC plate is then immersed in a bacterial suspension.
  • the bacteria are allowed to grow overnight and the bacterial lawn is then sprayed with a suitable coloring reagent. In this way, the inhibitory areas of the antibiotics on the bacterial lawn become visible.
  • the bacterial suspension is produced by mixing a storage-stable one Form of a suitable bacterial test strain with a special nutrient medium.
  • Buffered culture media pH range 7.0 - 7.5, are particularly suitable.
  • a nutrient medium suitable according to the invention contains, in addition to the usual constituents, such as salts, peptones, yeast extract, and preferably Mueller-Hinton-Boullion, additionally between 1 and 3
  • % By weight, preferably about 1.5%, based on the dry mass of a polysaccharide as a gelling agent.
  • This gelling linear heteropolysaccharides are preferred which typically bacterial origin, such as Gelrite ® from Roth, Germany. Such materials typically form stable gels in the presence of soluble salts.
  • Test strains suitable according to the invention are antibiotic-sensitive, preferably non-pathogenic, bacteria which are in a storable form. Selection criteria for suitable test strains are known to the person skilled in the art. Examples are Eche chia Coli or, particularly preferably, Bacillus subtilis. Forms that can be stored can be spore preparations or lyophilized vegetative bacteria.
  • the bacterial suspension for immersing the TLC plate can only be assembled a defined time before immersion. This is typically done by mixing the nutrient medium with a storable form of a test strain. When using spore preparations, this mixture is pre-incubated for a certain period, usually between 2 and 5 hours. Only then can the TLC plate be immersed in the mixture of nutrient medium and spore suspension, called bacterial suspension according to the invention.
  • Spore suspensions for the method according to the invention typically contain the test strain bacterium in a spore number between 10 6 and 10 7 .
  • the nutrient medium is mixed with a test strain lyophilisate. This mixture can typically shortly before
  • Dipping process are prepared, heated to 35 ° C and is then directly available for dipping after cooling to room temperature.
  • the developed DC plate can be immersed. To do this, the DC plate is briefly completely immersed in the bacterial suspension and excess suspension on the underside is removed. Alternatively, the DC plate can be sprayed with the bacterial suspension.
  • the coated DC plate is preferably incubated in a storage box which is designed to create a sufficiently humid atmosphere, for example with moist paper.
  • the incubation temperature is typically 23 to 35 ° C. After an incubation period of 15 to 25 hours, preferably 17 to 20 hours, the TLC plate is removed and stained.
  • Suitable staining reagents which enable a distinction to be made between living and growth-inhibited or preferably living and dead bacteria are known to the person skilled in the art. These are particularly preferably tetrazolium dyes, such as MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide). These reagents can be sprayed onto the TLC plate or immersed in a solution of the reagents. According to the invention, the TLC plate is particularly preferably sprayed with a solution of MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide). After an exposure time of approx.
  • MTT 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • the yellow-colored zones of inhibition then stand out clearly against a blue-violet background.
  • the coloring is preferably evaluated visually and can also be recorded in video documentary, photographic or graphic form.
  • the size of the inhibition zones enables statements to be made about the quantity applied and the specific effects of the substances.
  • the method according to the invention thus provides a simple, easy to carry out and sensitive test for the detection of antibiotics. Because of the simple handling, the method according to the invention can also be carried out by persons who have no specific training for the cultivation of bacteria. Furthermore, all essential steps of the process can be carried out in a simple chemical laboratory without special sterility requirements.
  • test kit is further provided according to the invention which can be carried out very easily in appropriately equipped laboratories.
  • the test kit contains nutrient medium, preferably in solid form for dissolving in water, a suitable test strain, either as lyophilisate or as spore preparation, and a coloring reagent, likewise preferably in solid form for dissolving in water.
  • HPTLC plates KG 60, WRF 254 S from Merck KGaA are particularly suitable for separating antibiotics.
  • the following mixtures can be used as flow agents for a separation distance between 40 and 60 mm:
  • a nutrient medium consisting of peptone, Mueller-Hinton broth and 1, 5 wt.% Gelrite ® is (water-VE) were added with 200 ml of deionized water in a 300 ml Erlenmeyer flask, about 10 min. heated to boiling until a clear solution forms.
  • the nutrient solution should be prepared with 0.5 M HEPES or 0.5 M Tris buffer (pH 7.2) instead of pure demineralized water.
  • the nutrient medium is cooled to room temperature (25 ° C ⁇ 3 ° C) and inoculated with the spore solution (10 6 - 10 7 spores Bacillus subtilis (BGA)). This should be done under low-germ or sterile conditions.
  • the suspension is then cultivated in an incubator at 35 ° C. for 2 hours.
  • the preculture is then cooled to 20 to 25 ° C immersion temperature.
  • the developed DC plate is briefly immersed (approx. 1 sec.) Over the entire area in the bacterial suspension. Then hold the DC plate horizontally and remove the excess bacterial suspension on the underside.
  • the DC plate is incubated in a storage box overnight (19 h) at 23-35 ° C.
  • the storage box is lined up 1 hour beforehand with moist chamber saturation paper (3 strips of 300x70 mm) or with 2 moist cellulose wipes.
  • moist chamber saturation paper 3 strips of 300x70 mm
  • 2 moist cellulose wipes To store the DC plate in the box, an additional box is placed on which the DC plate can be placed.
  • the TLC plate should be stored at a slight angle so that the excess bacterial suspension can flow off into the area above the solvent front at the upper edge.
  • the bacterial suspension is preincubated at 35 ° C for 3.5 h and then cooled to immersion temperature.
  • the DC plate After the immersion process, the DC plate is incubated at RT for 19 h. Staining is carried out with 3 mg / ml MTT in aqueous solution. After 30 minutes, the colored DC plate shown schematically in Figure 1 is obtained.
  • the inhibitory areas of the antibiotics are each visible as yellow spots on a blue / violet background.
  • the inhibitory areas of the antibiotics are each visible as yellow spots on a blue / violet background.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein dünnschichtchromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antibiotika. Durch die Verwendung einer Bakteriensuspension, die ein bakterielles Polysaccharid als Geliermittel enthält, kann eine entwickelte Dünnschichtchromatographie-Platte problemlos direkt in eine Bakteriensuspension getaucht werden. Die nachfolgende Inkubation und Färbung erfolgt ebenso auf der DC-Platte.

Description

Dünnschichtchromatographischer Nachweis von Antibiotika
Die Erfindung betrifft ein dünnschichtchromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antibiotika.
Der Nachweis geringster Mengen an Antibiotika spielt in vielen Bereichen eine wichtige Rolle. Beispiele sind die Untersuchung von Lebens- und Futtermitteln auf verbotene Antibiotika bzw. Leistungsförderer, der Nachweis von Antibiotika in Trink- und Abwasser, die Suche und Forschung nach neuen Antibiotika oder auch das Testen von Antibiotikapräparaten in der Qualitätskontrolle.
Antibiotika werden zumeist direkt oder indirekt über ihre abtötende oder wachstumshemmende Wirkung auf Bakterien nachgewiesen. Zum Nachweis von Antibiotika in komplexen Proben eignet sich besonders eine vorherige chromatographische Auftrennung der Probe beispielsweise auf einer Dünnschichtchromatographie-Platte (DC-Platte). Auf diese Weise kann nicht nur die antibiotische Wirkung der gesamten Probe, sondern die Wirkung einzelner Antibiotika eventuell unterschiedlicher Konzentration festgestellt werden.
Bekannte Methoden beschreiben daher zunächst die chromatographische Auftrennung einer Probe. Anschließend werden die abgetrennten potentiellen Antibiotika von der DC-Platte abgekratzt, das Antibiotikum herausgelöst und die Lösung auf eine Agarplatte gegeben. Die Agarplatte wurde vorher mit einem Bakterium angeimpft. Nach längerer Inkubationszeit können auf dem Bakterienrasen dort wo Antibiotika aufgegeben wurden freie Stellen, sogenannte Hemmhöfe, nachgewiesen werden.
Ein weiteres Verfahren ist das Agar-Overlay Verfahren. Hierbei wird die entwickelte DC-Platte mit einer mit Bakterien angeimpften Agarschicht blasenfrei Übergossen. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Agarschicht mit oder ohne DC-Platte und in eine Färbelösung gelegt. In der Färbelösung werden bei Anwesenheit von Antibiotika helle Hemmhöfe vor einem farbigen Hintergrund sichtbar.
Nachteil dieser bekannten Verfahren ist ihre mehrstufige, aufwendige
Durchführung. Da der Nachweis der Antibiotika über das Absterben oder die Wachstumshemmung von Bakterien erfolgt, müssen die Antibiotika nach ihrer Auftrennung mit den Bakterien in Kontakt gebracht werden. Bakterien zeigen jedoch nur unter bestimmten Bedingungen ein ausreichend stabiles und gleichmäßiges Wachstum. Beispielsweise benötigen sie einen stabilen pH-Wert und dürfen nicht austrocknen. Aus diesem Grund ist es notwendig, die aufgetrennten Antibiotika durch Herauslösen oder Herausdiffundieren aus der DC-Platte in ein für Bakterien geeignetes Wachstumsmedium zu überführen. Bei diesem Vorgang muß ein möglichst großer Teil der Antibiotika mit der Bakterienkultur in Kontakt kommen, um eine gute Nachweisgrenze zu erreichen. Bei dem Overlay- Verfahren wird die DC-Platte dazu mit einer Agar-Schicht übergössen. Dieser Schritt muß von Fachleuten durchgeführt werden, da Agarlösungen nur in einem bestimmten Temperaturbereich fließfähig sind, gleichzeitig aber nicht zu heiß sein dürfen, damit die darin enthaltenen Bakterien lebensfähig bleiben. Dadurch kommt es häufig zu Verklumpungen des Agars, Blasenbildung oder unregelmäßigem Ausgießen auf der DC-Platte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zum dünnschichtchromatographischen Nachweis von Antibiotika bereitzustellen, das einfach in der Handhabung ist und vollständig auf der DC-Platte durchgeführt werden kann. Dadurch wird ein schnellerer, einfacherer und genauerer Nachweis ermöglicht.
Es wurde gefunden, daß der Einsatz bestimmter Bakterien-Nährmedien, insbesondere bestimmter Geliermittel, die Versuchsdurchführung stark vereinfacht. Es ist möglich, den gesamten Nachweis auf der DC-Platte durchzuführen. Dazu wird eine entwickelte DC-Platte direkt in eine Suspension der Bakterien in einem solchen Nährmedium eingetaucht. Man läßt die Bakterien auf der DC-Platte wachsen und führt auch die abschließende Anfärbung direkt auf der DC-Platte durch. Auf diese Weise wird die Durchführung des Nachweises stark vereinfacht. Durch die besondere Konsistenz des Nährmediums bzw. der Bakteriensuspension kann die Suspension bei Raumtemperatur verwendet werden. Es kann weder zu Verklumpungen noch zum vorzeitigen Absterben von Bakterien durch zu hohe Temperaturen kommen. Zusätzlich können bessere Nachweisgrenzen erreicht werden, da die Bakteriensuspension durch ihre guten Fließeigenschaften auch in die Poren der DC-Platte eindringen kann und so der Kontakt zwischen Antibiotikum und Bakterien intensiviert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum dünnschichtchromatographischen Nachweis von Antibiotika mit folgenden Reaktionsschritten: a) Durchführung einer dünnschichtchromatographischen Trennung einer Probe auf einer DC-Platte; b) Herstellung einer Bakteriensuspension aus einer lagerfähigen Form eines Bakterien-Teststammes und einem Nährmedium enthaltend zwischen 1 und 3 Gewichts%, bezogen auf die Trockenmasse, eines Polysaccharides als Geliermittel; c) Eintauchen oder Benetzen der DC-Platte mit der Bakteriensuspension; d) Inkubation der DC-Platte e) Anfärben der DC-Platte mittels eines Färbereagenzes. Schritt a) und b) des erfindungsgemäßen Verfahrens können parallel oder nacheinander durchgeführt werden.
Für bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt b) Gelrite® als Geliermittel bzw. als Teststamm eine Bacillus Subtilis Sporensuspension verwendet. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen den Einsatz von MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazoliumbromid) als Färbereagenz in Schritt e).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der zumindest ein Nährmedium, das zwischen 1 und 3 Gewichts%, bezogen auf die Trockenmasse, eines Polysaccharides als Geliermittel enthält, einen lagerbeständigen Bakterien-Teststamm und ein Färbereagenz enthält.
Abbildung 1 und 2 zeigen schematisch das Ergebnis zweier Antibiotika- Nachweise und sind in Beispiel 4 und 5 näher erläutert.
Die Durchführung einer dünnschichtchromatographischen Trennung einer Probe auf einer DC-Platte, das heißt die Entwicklung der DC-Platte, erfolgt unter bekannten Bedingungen. Zumeist werden hierfür DC-Platten mit einer Sorbensschicht auf Basis von Si02 verwendet. Geeignete Fließmittel, beispielsweise Acetonitril, Gemische aus Acetonitril und Dichlormethan oder Gemische aus Ethylacetat, Methanol und Ammoniak, sind dem Fachmann bekannt. Der Fachmann ist weiterhin in der Lage, die Fließmittel dem jeweiligen Trennproblem anzupassen.
Nach der Entwicklung wird die DC-Platte sorgfältig getrocknet, um Rückstände des Fließmittels zu entfernen. Anschließend wird die entwickelte DC-Platte in eine Bakteriensuspension getaucht. Man läßt die Bakterien über Nacht wachsen und besprüht den Bakterienrasen dann mit einem geeigneten Färbereagenz. Auf diese Weise werden die Hemmhöfe der Antibiotika auf dem Bakterienrasen sichtbar.
Diese erfindungsgemäße Durchführung wird durch die spezielle Zusammensetzung der Bakteriensuspension ermöglicht. Die Bakteriensuspension wird hergestellt durch Mischung einer lagerstabilen Form eines geeigneten bakteriellen Teststamms mit einem speziellen Nährmedium. Besonders geeignet sind gepufferte Nährmedien, pH-Bereich 7,0 - 7,5. Ein erfindungsgemäß geeignetes Nährmedium enthält neben den üblichen Bestandteilen, wie Salzen, Peptonen, Hefeextrakt, sowie bevorzugterweise Mueller-Hinton-Boullion, zusätzlich zwischen 1 und 3
Gewichts%, bevorzugt ca. 1 ,5 %, bezogen auf die Trockenmasse eines Polysaccharides als Geliermittel. Bevorzugt sind dies gelierende lineare Heteropolysaccharide, die typischerweise bakteriellen Ursprungs sind, wie Gelrite® der Firma Roth, Deutschland. Derartige Materialien bilden typischerweise in Anwesenheit von löslichen Salzen stabile Gele.
Erfindungsgemäß geeignete Teststämme sind antibiotikaempfindliche, bevorzugterweise nicht pathogene, Bakterien, die in lagerfähiger Form vorliegen. Auswahlkriterien für geeignete Teststämme sind dem Fachmann bekannt. Beispiele sind Eche chia Coli oder, besonders bevorzugt, Bacillus subtilis. Lagerfähige Formen können Sporenpräparationen oder lyophilisierte vegetative Bakterien sein.
Natürlich kann die Bakteriensuspension zum Eintauchen der DC-Platte erst eine definierte Zeit vor dem Eintauchen zusammengestellt werden. Dies geschieht typischerweise durch Mischen des Nährmediums mit einer lagerfähigen Form eines Teststamms. Bei der Verwendung von Sporenpräparationen wird diese Mischung für einen bestimmten Zeitraum, zumeist zwischen 2 und 5 Stunden vorinkubiert. Erst dann kann die DC-Platte in die Mischung aus Nährmedium und Sporensuspension, erfindungsgemäß Bakteriensuspension genannt, getaucht werden.
Sporensuspensionen für das erfindungsgemäße Verfahren enthalten das Teststamm-Bakterium typischerweise in einer Sporenzahl zwischen 106 und 107. In einer zeitsparenden Version des erfindungsgemäßen Verfahrens wird statt der Kombination von Nährmedium und Sporensuspension, die zunächst zur Herstellung der Bakteriensuspension gemischt und vorinkubiert werden müssen, das Nährmedium mit einem Teststamm- Lyophilisat gemischt. Dieses Gemisch kann typischerweise kurz vor dem
Tauchvorgang hergestellt werden, auf 35 °C erwärmt werden und steht dann nach Abkühlen auf Raumtemperatur direkt zum Tauchvorgang zur Verfügung.
Nach dem Bereitstellen der Bakteriensuspension kann die entwickelte DC- Platte eingetaucht werden. Dazu wird die DC-Platte sehr kurz vollständig in die Bakteriensuspension getaucht und überschüssige Suspension an der Unterseite entfernt. Alternativ kann die DC-Platte mit der Bakteriensuspension besprüht werden.
Die Inkubation der beschichteten DC-Platte erfolgt bevorzugt in einer Aufbewahrungsbox, die zur Schaffung einer ausreichend feuchten Atmosphäre beispielsweise mit feuchtem Papier ausgelegt ist. Die Inkubationstemperatur beträgt typischerweise 23 bis 35 °C. Nach einer Inkubationszeit von 15 bis 25 Stunden, bevorzugt 17 bis 20 Stunden, wird die DC-Platte entnommen und angefärbt.
Geeignete Färbereagenzien, die eine Unterscheidung zwischen lebenden und wachstumsgehemmten oder bevorzugt lebenden und toten Bakterien ermöglichen, sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugt sind dies Tetrazolium-Farbstoffe, wie MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazoliumbromid). Die DC-Platte kann mit diesen Reagenzien besprüht werden oder in eine Lösung der Reagenzien getaucht werden. Besonders bevorzugt wird die DC-Platte erfindungsgemäß mit einer Lösung von MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) besprüht. Nach einer Einwirkzeit von ca. 5 bis 30 min. treten dann die gelb gefärbten Hemmhöfe vor einem blau-violetten Hintergrund deutlich hervor. Die Auswertung der Färbung erfolgt bevorzugt visuell und kann zusätzlich videodokumentarisch, fotographisch oder zeichnerisch festgehalten werden. Die Größe der Hemmhöfe ermöglicht Aussagen über die Auftragemenge und die Wirkungsspezifität der Substanzen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird somit ein einfacher, leicht durchführbarer und empfindlicher Test zum Nachweis von Antibiotika zur Verfügung gestellt. Durch die einfache Handhabung kann das erfindungsgemäße Verfahren auch von Personen durchgeführt werden, die keine spezifische Ausbildung für die Kultivierung von Bakterien besitzen. Weiterhin können alle wesentlichen Schritte des Verfahrens in einem einfachen chemischen Labor ohne besondere Sterilitätsanforderungen durchgeführt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können beispielsweise bis zu 1 ng von Penicillin V nachgewiesen werden.
Zur anwenderfreundlichen Durchführung des Verfahrens wird erfindungsgemäß weiterhin ein Testkit zur Verfügung gestellt, der in entsprechend ausgerüsteten Labors sehr leicht durchgeführt werden kann. Der Testkit enthält Nährmedium, bevorzugt in fester Form zum Lösen in Wasser, einen geeigneten Teststamm, entweder als Lyophilisat oder als Sporenpräparation, und ein Färbereagenz, ebenso bevorzugt in fester Form zum Auflösen in Wasser.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offen- barung aufzufassen. Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 199 57 368, eingereicht am 30.11.1999, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
1. Dünnschichtchromatoqraphische Trennung
Allgemeine Arbeitshinweise:
Zur Auftrennung von Antibiotika eignen sich insbesondere HPTLC-Platten KG 60, WRF254S der Firma Merck KGaA.
Als Fließmittel können je nach Art der Probe beispielsweise folgende Mischungen für eine Trennstrecke zwischen 40 und 60 mm eingesetzt werden:
a) Acetonitril b) Acetonitril / Dichlormethan, 98 / 2 (v/v) c) Ethylacetat / Methanol / Ammoniak 25%, 60 / 20 / 2 (v/v/v)
2. Vorkultur von Bacillus subtilis
Ein Nährmedium bestehend aus Peptonwasser, Mueller-Hinton-Boullion und 1 ,5 Gew.% Gelrite® wird mit 200 ml deionisiertem Wasser (VE-Wasser) in einen 300 ml Erlenmeyerkolben gegeben, ca. 10 min. zum Sieden erhitzt, bis sich eine klare Lösung bildet. Bei der Verwendung von sauren Fließmitteln bei der DC-T rennung sollte die Nährlösung statt mit reinem VE-Wasser mit 0,5 M HEPES oder 0,5 M Tris-Puffer (pH 7,2) angesetzt werden. Nach dem Aufkochen wird das Nährmedium auf Raumtemperatur abgekühlt (25°C ± 3°C) und mit der Sporenlösung (106 - 107 Sporen Bacillus subtilis (BGA)) angeimpft. Dies sollte unter keimarmen oder sterilen Bedingungen erfolgen. Anschließend wird die Suspension 2 h im Brutschrank bei 35°C kultiviert. Anschließend wird die Vorkultur auf 20 bis 25°C Tauchtemperatur abgekühlt.
3. Beschichtunq der DC-Platte und Anfärben
Die entwickelte DC-Platte wird kurz (ca. 1 sec.) ganzflächig in die Bakteriensuspension getaucht. Anschließend hält man die DC-Platte waagerecht und entfernt die überschüssige Bakteriensuspension an der Unterseite.
Sofort nach dem Tauchvorgang wird die DC-Platte in einer Aufbewahrungsbox über Nacht (19 h) bei 23-35°C inkubiert. Die Aufbewahrungsbox wird 1 h vorher am Rand mit feuchtem Kammersättigungspapier (3 Streifen a 300x70 mm) oder mit 2 feuchten Zellstofftüchern ausgelegt. Zur Lagerung der DC-Platte in der Box wird zusätzlich eine Dose hineingestellt, auf die die DC-Platte gelegt werden kann. Weiterhin sollte die DC-Platte leicht schräg gelagert werden, so daß die überschüssige Bakteriensuspension in den Bereich oberhalb der Lösungsmittelfront am oberen Rand abfließen kann.
Nach 19 h wird die überschüssige Suspension am oberen Rand mit einem Tuch abgetupft und die DC-Platte mit MTT-Lösung (3 mg/ml) aus einer Entfernung von ca. 10 cm besprüht, bis eine leichte Gelbfärbung der Oberfläche zu erkennen ist. Die DC-Platte wird erneut für ca. 5 bis 30 min. jn die Aufbewahrungsbox gelegt, anschließend bei Raumtemperatur getrocknet und ausgewertet. 4. Anwendunqsbeispiel A
20 ng Chloramphenicol, 1 ng Penicillin und 4 ng Oxatetracyclin (jeweils aus Lösungen von 10 mg in 100 ml Methanol) werden auf eine DC-Platte aufgetragen. Die Entwicklung erfolgt in Ethylacetat / Methanol / Ammoniak
25%, 60/20/2 (v/v/v). Die Bakteriensuspension wird 3,5 h bei 35°C vorinkubiert und dann auf Tauchtemperatur abgekühlt.
Nach dem Tauchvorgang wird die DC-Platte 19 h bei RT inkubiert. Die Anfärbung erfolgt mit 3 mg/ml MTT in wässriger Lösung. Nach 30 min erhält man die in Abbildung 1 schematisch dargestellte gefärbte DC-Platte.
Auf der DC-Platte sind aufgetragen:
Bahn 1 Gemisch aller 3 Antibiotika Bahn 2 Oxatetracyclin
Bahn 3 Penicillin
Bahn 4 Chloramphenicol
Die Entwicklung erfolgte von unten nach oben. Die Hemmhöfe der Antibiotika sind jeweils als gelbe Flecken auf blau/violettem Untergrund sichtbar.
5. Anwendunqsbeispiel B
5 ng Chlortetracyclin, 2 ng Penicillin G-Procain und (jeweils aus Lösungen von 10 mg in 100 ml Methanol) und 50 nl eines Extraktes aus Futtermittel werden auf eine DC-Platte aufgetragen. Die Entwicklung erfolgt in Acetonitril. Die Bakteriensuspension wird 4 h bei 25°C vorinkubiert und dann auf Tauchtemperatur abgekühlt. Nach dem Tauchvorgang wird die DC-Platte 19 h bei RT inkubiert. Die Anfärbung erfolgt mit 3 mg/ml MTT in wässriger Lösung. Nach 30 min erhält man die in Abbildung 2 schematisch dargestellte gefärbte DC-Platte. Auf der Platte sind aufgetragen: Bahn 1 : Extrakt
Bahn 2: Chlortetracyclin Bahn3: Penicillin G-Procain
Die Hemmhöfe der Antibiotika sind jeweils als gelbe Flecken auf blau/violettem Untergrund sichtbar.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum dünnschichtchromatographischen Nachweis von Antibiotika, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Durchführung einer dünnschichtchromatographischen Trennung einer Probe auf einer DC-Platte; b) Herstellung einer Bakteriensuspension aus einem Teststamm und einem Nährmedium enthaltend zwischen 1 und 3 Gewichts%, bezogen auf die Trockenmasse, eines bakteriellen Polysaccharides als Geliermittel; c) Eintauchen oder Besprühen der DC-Platte mit der Bakteriensuspension; d) Inkubation der DC-Platte; e) Anfärben der DC-Platte mittels eines Färbereagenzes.
2. Verfahren zum dünnschichtchromatographischen Nachweis von Antibiotika entsprechend Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Geliermittel in Schritt b) Gelrite® verwendet wird.
3. Verfahren zum dünnschichtchromatographischen Nachweis von
Antibiotika entsprechend Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Teststamm in Schritt b) eine Bacillus Subtilis Sporensuspension eingesetzt wird.
4. Verfahren zum dünnschichtchromatographischen Nachweis von
Antibiotika entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Färbereagenz in Schritt e) MTT (3-(4,5-
Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) verwendet wird. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zumindest enthaltend ein Nährmedium, das zwischen 1 und 3 Gewichts%, bezogen auf die Trockenmasse, eines bakteriellen Polysaccharides als Geliermittel enthält, einen lagerstabilen Teststamm und ein Färbereagenz.
EP00974526A 1999-11-30 2000-11-13 Dünnschichtchromatographischer nachweis von antibiotika Withdrawn EP1240353A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19957638 1999-11-30
DE19957638A DE19957638A1 (de) 1999-11-30 1999-11-30 Dünnschichtchromatographischer Nachweis von Antibiotika
PCT/EP2000/011201 WO2001040502A2 (de) 1999-11-30 2000-11-13 Dünnschichtchromatographischer nachweis von antibiotika

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1240353A2 true EP1240353A2 (de) 2002-09-18

Family

ID=7930883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP00974526A Withdrawn EP1240353A2 (de) 1999-11-30 2000-11-13 Dünnschichtchromatographischer nachweis von antibiotika

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1240353A2 (de)
JP (1) JP2003515348A (de)
DE (1) DE19957638A1 (de)
WO (1) WO2001040502A2 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10133273A1 (de) * 2001-07-09 2003-01-30 Bayer Cropscience Ag Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-Hemmung

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5882882A (en) * 1995-04-12 1999-03-16 Biolog, Inc. Gel matrix with redox purple for testing and characterizing microorganisms

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0140502A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001040502A2 (de) 2001-06-07
JP2003515348A (ja) 2003-05-07
DE19957638A1 (de) 2001-05-31
WO2001040502A3 (de) 2001-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lundgren Fluorescein diacetate as a stain of metabolically active bacteria in soil
DE69534301T3 (de) Verfahren zum nachweis und zur quantifizierung von enterobakteriaceae
DE69910667T2 (de) Zusammensetzung zum Nachweis eines Mikroorganismus in einer Probe
DE2334061A1 (de) Verfahren zum identifizieren von streptokokken
DE2833846A1 (de) Kulturmedium fuer fungi
Smith Inhibition of swarming in Proteus spp. by tannic acid
EP1240353A2 (de) Dünnschichtchromatographischer nachweis von antibiotika
DE2212092B2 (de) Verfahren zur Herstellung von 14 C-markierten Verbindungen
DE2019838C3 (de) 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner Herstellung
Flores et al. The nature and role of phytoalexin produced by aspen (Populus tremuloides Michx.)
DE2621690A1 (de) Neues antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung
EP0075215B1 (de) Vorrichtungen zum Nachweis von Mikroorganismen hemmenden Stoffen
DE2035812A1 (de) Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung
DE1795006A1 (de) Neue Derivate von Pyrrolnitrin,Verfahren zur Herstellung von Derivaten von Pyrrolnitrin und ihre Verwendung in Desinfektionsmitteln
DE2803358C2 (de)
DE1792819C2 (de) Tenebrimycin-Antibiotikum VI und ein Verfahren zu dessen Herstellung
DE1792817C2 (de) Tenebrimycin-Antibiotikum II und Verfahren zu dessen Herstellung
DE1792818C2 (de) Tenebrimycin-Antibiotikum IV und ein Verfahren zu dessen Herstellung
DE1009583B (de) Verfahren zur biochemischen Herstellung von 2-Keto-1-gulonsaeure
DE10123987A1 (de) Verfahren zur Detektion von Fungiziden
AT228389B (de) Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q-10
DE943311C (de) Verfahren zur Herstellung und Gewinnung eines Antibiotikums
DE4211056C1 (en) Spiran heterocyclic deriv. for controlling fungi and bacteria uncontrollable - prepd. by fermenting Sorangium e.g. Polyangium cellulosum in medium contg. carbon and nitrogen sources and mineral salts in adsorber resin, and eluting
DE4414793C1 (de) Verfahren zur Cytotoxizitäts-Bestimmung mit Hilfe in vitro-kultivierter Pollenschläuche (PTG-Test)
DE2637545A1 (de) Antibiotica bm123 und ihre herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20020515

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20050601