EP1140995A2 - Peptide zur inhibierung von hbv-core-proteinen - Google Patents

Peptide zur inhibierung von hbv-core-proteinen

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EP1140995A2
EP1140995A2 EP00908930A EP00908930A EP1140995A2 EP 1140995 A2 EP1140995 A2 EP 1140995A2 EP 00908930 A EP00908930 A EP 00908930A EP 00908930 A EP00908930 A EP 00908930A EP 1140995 A2 EP1140995 A2 EP 1140995A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hbv
peptide
cooh
peptides
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00908930A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karin Butz
Felix Hoppe-Seyler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1140995A2 publication Critical patent/EP1140995A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to peptides which are suitable for inhibiting HBV core proteins, to DNAs encoding them and to the use of both, in particular for inhibiting HBV replication.
  • HBV infection is chronic, i.e. chronic hepatitis, which often leads directly to death.
  • chronic HBV infection i.e. chronic hepatitis
  • the development of hepatocellular carcinoma is often caused by a chronic HBV infection.
  • the latter is characterized by continuous replication of HBV in liver cells.
  • the HBV replication takes place within the viral capsid made up of core proteins, the core proteins coming into contact with the viral nucleic acids. Many attempts have been made to inhibit HBV replication. So far, however, these attempts have not been satisfactory.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which HBV replication can be inhibited.
  • HBV core proteins bind to short peptides. He has screened a randomized oligopeptide library comprising randomly generated peptide sequences with a "peptide aptamer system" in which an HBV core protein was used as a screening sample. He found that short peptides, especially those listed in Table 1, bind to HBV core proteins. He also has recognized that these peptides are suitable for inhibiting HBV core proteins, for example in their activity for HBV replication. He also recognized that this inhibition can inhibit HBV replication.
  • the knowledge of the applicant is used to provide a peptide which is selected from the peptides listed in Table 1, the peptide having a modification in the sequence of up to 40%, in particular 20% and very particularly 10%.
  • Peptides according to the invention are suitable for binding HBV core proteins and in their activities, e.g. in their activity for HBV replication.
  • HBV core proteins encompasses a core protein of any HBV type, in particular the HBV subtypes HBV adr and HBV ayw.
  • An HBV core protein can have a wild-type sequence or a sequence different therefrom by one or more amino acids. Furthermore, it can be in a shortened form, ie it is only in the form of the fragment which is necessary for HBV replication, in particular the binding to the viral nucleic acids or for the capsid structure. The fragment can also be made in multiple copies within one Polypeptide molecule are present.
  • an HBV core protein or a fragment thereof can be in the form of a fusion protein.
  • Peptides according to the invention can be provided by customary methods in which peptides are tested for their binding to HBV core proteins. Such methods are e.g. the “peptide aptamer” or “bacteriophage display” method. It is expedient to use the “peptide aptamer” method described in the examples, which is a modification of the above-mentioned method.
  • Peptides according to the invention can be used as such or in combination with other substances, e.g. (Poly) peptides.
  • the connection can consist in that the peptides according to the invention are linked via linkers, e.g. Disulfide bridges with which (poly) peptides are connected.
  • the peptides according to the invention can also be fused with the (poly) eptides, as a result of which the peptides according to the invention are in the form of fusion (poly) peptides.
  • the (poly) peptides for fusion (poly) peptides are e.g.
  • Leader peptides such as penetratin from Drosophila Antennapedia or VP22 from HSV1, which promote the uptake of the peptides according to the invention in cells.
  • polypeptides linked to the peptide according to the invention via linkers e.g. Carrier proteins, such as transferrin, that are not considered foreign in the body.
  • linkers e.g. Carrier proteins, such as transferrin, that are not considered foreign in the body.
  • linkers e.g. Carrier proteins, such as transferrin
  • the present invention furthermore relates to a nucleic acid, in particular a DNA, which codes for a peptide according to the invention.
  • DNA can be present in vectors, in particular expression vectors. Examples of such are known to the person skilled in the art.
  • expression vectors for E. coli, these are, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b or pQE-8.
  • yeast for example, pY100 or Ycpadl are to be named, while for expression in animal cells, for example, pKCR, pEFBOS, cDM8 or pCEV4 must be specified.
  • the bacculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • Viruses for example adenovirus, vaccinia virus, adeno-associated virus (AAV) or retroviruses such as MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GalV), can also be used for expression in animal cells.
  • AAV adeno-associated virus
  • retroviruses such as MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GalV
  • suitable cells in order to express the DNA according to the invention which is present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH1, xl776, JM101, JM109, BL21 and SG 13009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa as well the insect cells sf9.
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He also knows that this DNA can be inserted in connection with a DNA coding for another peptide or polypeptide, so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion polypeptide.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above peptide or fusion polypeptide.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) polypeptide or fragments thereof. Further “boosters" of the animals can be carried out with the same (fusion) polypeptide or fragments thereof. The polyclonal antibody can then from the serum or egg Animals are preserved. For the monoclonal antibody, spleen cells from the animals are isolated and fused with myeloma cells.
  • the present invention furthermore relates to a pharmaceutical composition which contains one or more of the peptides according to the invention and / or DNAs encoding them and customary auxiliaries.
  • auxiliary substances e.g. Medicament carriers, binders, disintegrants, lubricants, solvents, solvents 11 release agents, release accelerators, release retarders, emulsifiers, stabilizers, etc. can be used.
  • Such a composition can be used in a conventional manner, e.g. orally or parenterally. The appropriate dosage is determined in the usual way for the individual case.
  • Another object of the present invention is a diagnostic composition which contains one or more peptides according to the invention.
  • HBV core proteins can be detected.
  • This can be used to detect HBV-related diseases, eg HBV infections, such as chronic HBV infections, especially chronic hepatitis, and hepatacellular carcinoma.
  • HBV-related diseases eg HBV infections, such as chronic HBV infections, especially chronic hepatitis, and hepatacellular carcinoma.
  • HBV-related diseases eg HBV infections, such as chronic HBV infections, especially chronic hepatitis, and hepatacellular carcinoma.
  • detection includes, for example, (a) obtaining a cell sample from a patient, (b) contacting the cell sample with a peptide according to the invention under conditions which allow the specific binding of the peptide to an HBV core protein, and (c) detection of the peptide. This can be demonstrated using standard procedures.
  • the peptides according to the invention can be in the liquid phase or can be bound to a solid support and labeled in various ways. Suitable markers and marking methods are known to the person skilled in the art.
  • the peptides can also be detected by antibodies according to the invention. The latter are also suitable for controlling the course of therapy of an HBV-associated disease treated with peptides according to the invention.
  • HBV core proteins With the present invention it is possible to bind HBV core proteins and to inhibit their activities, in particular their activity for HBV replication. This can inhibit the replication of HBV.
  • HBV-associated diseases for example HBV infections, such as chronic HBV infections, in particular chronic hepatitis, and heptatocellular carcinoma can be carried out diagnostically and therapeutically.
  • the peptides according to the invention or DNAs encoding them form a basis for developing completely new active substances against the above diseases.
  • Fig. 1 shows schematically the modified "peptide aptamer" system in S. cerevisiae. This system consists of three
  • Components (1) the target protein (HBV core protein iC), which is fused with a heterologous DNA binding domain (GAL4BD), (2) a peptide with a randomized amino acid sequence that is linked to a transcriptional activation domain ( GAL4AD) is fused and (3) a stably integrated selection gene (prototrophic selection marker, such as ADE2), which has the recognition sequence for the DNA binding domain in its promoter.
  • GAL4BD heterologous DNA binding domain
  • GAL4AD transcriptional activation domain
  • a stably integrated selection gene prototrophic selection marker, such as ADE2
  • Fig. 2 shows the analysis of HBV core protein binding peptides in the "peptide aptamer" system.
  • HIS3 GAL4BS as part of the GAL1 promoter
  • URA3 GAL4-BS as part of the S PO 13 promoter
  • a method is used which is derived from the known "peptide aptamer" system. The method is shown schematically in FIG. 1.
  • a randomized oligopeptide expression bank for 20 amino acid long peptides with a random sequence is produced
  • a yeast expression vector, pADTrx G or C). They code for all 20 amino acids, but only result in a stop codon.
  • a yeast expression vector, pADTrx is used as the expression vector. This contains
  • E.coli Trx A (thioredoxin protein) from pTrx (Invitrogen) and
  • GAL4AD and the ADH promoter from pAS2 or pGAD424 (Clontech).
  • the peptides are within the active loop of
  • Trx expressed This has the following advantages:
  • conformally restricted peptides can expose amino acids to the outside, which may be folded inward in the case of flexible peptides in the intracellular environment, conformally restricted peptides can be high-affinity peptides that have the potential to also in vivo as to act efficient protein inhibitors.
  • a yeast strain, KF-1 is also used. This comes from the yeast strain PJ69-4A (cf. James et al., Genetics 144 (1996), 1425) and allows the analysis of three selection markers: ADE2, HIS3 and URA3. Each of the three selection markers is under the transcriptional control of GAL4 binding sites in the context of different prompters.
  • the selection marker URA3 is regulated by the SP013 promoter, which contains a negative regulatory element from the yeast strain MaV103 (cf. Vidal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (93), 10315-10320) and can be activated by strong protein-protein interactions.
  • the yeast strain also contains the E.
  • coli ⁇ -galactosidase (-Gal) gene as a further marker, the activity of which is easily quantifiable and enables the in vivo binding affinity of the peptide to the HBV core protein to be estimated.
  • the activation of the HIS3 gene can also be quantified by titration with 3 'AT- (3-amino-1, 2, 4-triazole).
  • the HBV core protein is screened with the above system. For this purpose, it is provided in the form of an expression vector encoding it.
  • PPC97 (cf. Vidal et al. Above) serves as the base vector, in which the coding sequence of an HBV core protein (HBV subtype adr) is inserted.
  • 9 clones are isolated from approx. 2 x 10 6 yeast clones, which show growth when selected with ADE2. Replica plating and analysis of the three selection markers show that 8 of the 9 clones show growth even when selected with HIS3 (FIG. 2).
  • 3 of the isolated clones show additional growth under URA3 selection, which under the conditions used here indicates a particularly high in vivo affinity of the corresponding peptide for the HBV core protein.
  • the corresponding peptide expression plasmids are isolated from the 9 clones and subjected to rescreening after renewed transformation in yeast.
  • the rescreening shows complete agreement with the results from the above replica plating (FIG. 2). It turns out that the growth of the yeast depends on the binding of the peptides to the HBV core protein.
  • the peptides of the 9 clones are determined in their amino acid sequence. This is shown in Table 1.
  • Example 2 Inhibition of HBV core proteins by peptides according to the invention.
  • the "VP 22 shuttle system” is used. This is due to the fact that the HSV1-VP 22 protein is taken up by cells, i.e. can be used as a carrier. Fusion polypeptides from VP 22 and peptides according to the invention, e.g. the peptide Cl-1 of Table 1.
  • the expression vector pCEP4 (Invitrogen) is used for this. In these, the DNA sequences of the peptides are inserted in phase with the DNA sequence of VP 22. The peptides are expressed in the context of the E. Coli TrxA protein. Expression plasmids, e.g. pCEP4-Cl-1.
  • HepG2 hepatoma lines are also used. These are mixed with the above expression plasmids, e.g. pCEP4-Cl-1, and an HBV-encoding expression plasmid, RC-CMV (Invitrogen) HBV.
  • An analysis for HBV replication is carried out (see Seils et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 1005-1009).
  • cells or supernatants are isolated and subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • HBV virus particles or nucleic acids are determined in a Southern or Western blot method.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die sich zur Inhibierung von HBV Core-Proteinen eignen, sie kodierende DNAs und die Verwendung beider, insbesondere zur Hemmung der HBV-Replikation.

Description

Peptidβ zur Inhibierung von HBV-Core-Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die sich zur Inhibierung von HBV-Core-Proteinen eignen, sie kodierende DNAs und die Verwendung beider, insbesondere zur Hemmung der HBV- Replikation.
Infektionen mit Hepatitis B-Virus (HBV) stellen ein großes gesundheitliches Problem dar. Dies gilt insbesondere, wenn die HBV-Infektion chronischer Natur ist, d.h. eine chronische Hepatitis vorliegt, was häufig direkt zum Tode führt. Auch ist die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms vielfach durch eine chronische HBV-Infektion bedingt. Letztere kennzeichnet sich durch eine kontinuierliche Replikation von HBV in Leberzellen. Die HBV-Replikation findet dabei innerhalb des viralen, aus Core-Proteinen aufgebauten Kapsids statt, wobei die Core-Proteine in Kontakt mit den viralen Nukleinsäuren treten. Viele Versuche wurden unternommen, die HBV-Replikation zu hemmen. Bisher waren diese Versuche aber nicht zufriedenstellend.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem die HBV-Replikation gehemmt werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Der Anmelder hat erkannt, daß HBV Core-Proteine an kurze Peptide binden. Er hat eine randomisierte Oligopeptid- Bibliothek, die zufallsgenerierte Peptid-Sequenzen umfaßt, mit einem "Peptid-Aptamer-System" gescreent, in dem ein HBV Core- Protein als Screening-Probe verwendet wurde. Hierbei hat er gefunden, daß kurze Peptide, insbesondere die in Tabelle 1 aufgeführten, an HBV Core-Proteine binden. Ferner hat er erkannt, daß sich diese Peptide eignen, HBV Core-Proteine, z.B. in ihrer Aktivität für die HBV-Replikation, zu inhibieren. Des weiteren hat er erkannt, daß durch diese Inhibierung eine Hemmung der HBV-Replikation erreicht werden kann.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Peptid bereitzustellen, das aus den in Tabelle 1 aufgelisteten Peptiden ausgewählt ist, wobei das Peptid eine Modifikation in der Sequenz von bis zu 40 %, insbesondere 20 % und ganz besonders 10 %, aufweisen kann.
Tabelle 1
Cl-1: NH2-SFYSVLFLWG TCGGFSHSWY-COOH
Cl-2c: NH2-LCETVRF PV CFCSLYVICS-COOH
Cl-3 NH2-SCAPAWSPAP TWFVALYW-COOH C2-1 NH2-QWGMDSLIRL YL ESLGLLS-COOH C2-2 NH2-IHPLSRGNFF PHVRLMGE R-COOH C2-3 NH2-GQALCAGVSL FAD LHESTL-COOH
C2-4 NH2-LKHFDPRWPL MSLMSSWACM-COOH C2-5 NH2-PPLRKAFCWR CFNWLSTKRL-COOH C2-6 NH2-LRKSMLKVGR DVCYVSLWVF-COOH
Erfindungsgemäße Peptide eignen sich HBV Core-Proteine zu binden und in ihren Aktivitäten, z.B. in ihrer Aktivität für die HBV-Replikation, zu inhibieren.
Der Ausdruck "HBV Core-Proteine" umfaßt ein Core-Protein jeglichen HBV-Typs, insbesondere der HBV-Subtypen HBV adr und HBV ayw. Ein HBV Core-Protein kann eine Wildtyp-Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Sequenz aufweisen. Ferner kann es in verkürzter Form vorliegen, d.h. es liegt nur in Form jenes Fragments vor, das für die HBV-Replikation, insbesondere die Bindung an die viralen Nukleinsäuren oder für den Kapsidaufbau, notwendig ist. Das Fragment kann auch in Mehrfachkopien innerhalb eines Polypeptid-Moleküls vorliegen. Des weiteren kann ein HBV Core- Protein bzw. ein Fragment davon in Form eines Fusionsproteins vorliegen.
Erfindungsgemäße Peptide können durch übliche Verfahren, in denen Peptide hinsichtlich ihrer Bindung an HBV Core-Proteine getestet werden, bereitgestellt werden. Solche Verfahren sind z.B. das "Peptid-Aptamer-" oder "Bakteriophagen-Display"- Verfahren. Günstig ist es, das in den Beispielen beschriebene "Peptid-Aptamer"-Verfahren zu verwenden, das eine Modifizierung des vorstehend erwähnten Verfahrens ist.
Erfindungsgemäße Peptide können als solche oder in Verbindung mit anderen Stoffen, z.B. (Poly)peptiden, vorliegen. Die Verbindung kann darin bestehen, daß die erfindungsgemäßen Peptide über Linker, z.B. Disulfidbrücken, mit den (Poly)peptiden verbunden sind. Auch können die erfindungsgemäßen Peptide mit den (Poly) eptiden fusioniert sein, wodurch die erfindungsgemäßen Peptide in Form von Fusions (poly)peptiden vorliegen. Als (Poly)peptide für Fusions (poly)peptide bieten sich z.B. "Leader" -Peptide, wie Penetratin von Drosophila Antennapedia oder VP22 von HSVl an, welche die Aufnahme der erfindungsgemäßen Peptide in Zellen fördern. Andererseits können Polypeptide, die über Linker mit dem erfindungsgemäßen Peptid verbunden sind, z.B. Trägerproteine, wie Transferrin sein, die im Körper als nicht fremd angesehen werden. Auch können mehrere erfindungsgemäße Peptide gleichzeitig in Verbindung mit einem vorstehenden Stoff vorliegen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure , insbesondere eine DNA, die für ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert. Eine solche DNA kann in Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC- Derivate, pGEX-2T, pET3b oder pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pYlOO oder Ycpadl zu nennnen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 oder pCEV4 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. Ferner können für die Expression in tierischen Zellen Viren, z.B. Adenovirus, Vaccinia-Virus , Adeno-assozi- ierter Virus (AAV) oder Retroviren, wie MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GalV) , verwendet werden.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E. coli-Stäümme HB101, DH1, xl776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3 , FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Peptid bzw. Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusions- polypeptids exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Peptid bzw. Fusionspolypeptid zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Peptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions) polypeptid oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) polypeptid oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Ei der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere isoliert und mit Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide und/oder sie kodierende DNAs sowie übliche Hilfsstoffe enthält. Als Hilfsstoffe können z.B. Arzneimittelträger, Bindemittel, Sprengmittel, Gleitmittel, Lösungsmittel, Lösungsmi 11 elvermi 111 er , Freigabe- Beschleuniger, Freigabe-Verzögerer, Emulgatoren, Stabilisatoren, etc. verwendet werden. Eine solche Zusammensetzung kann in üblicher Weise, z.B. oral oder parenteral, verwendet werden. Die geeignete Dosierung wird für den Einzelfall in üblicher Weise bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine diagnostische Zusammensetzung, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide enthält. Mit einer solchen Zusammensetzung können HBV Core-Proteine nachgewiesen werden. Dies kann genutzt werden, um HBV-assoziierte Erkrankungen, z.B. HBV-Inf ektionen, wie chronische HBV- Infektionen, insbesondere chronische Hepatitis, und hepatazelluläres Karzinom, nachzuweisen. Ein solcher Nachweis beinhaltet beispielsweise (a) Gewinnung einer Zellprobe von einem Patienten, (b) Inkontaktbringung der Zellprobe mit einem erfindungsgemäßen Peptid unter Bedingungen, welche die spezifische Bindung des Peptids an ein HBV Core-Protein erlauben, und (c) Nachweis des Peptids. Dieser Nachweis kann durch Standardverfahren erfolgen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Peptide in Flüssigphase vorliegen oder an einen festen Träger gebunden werden und auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungs verfahren sind dem Fachmann bekannt. Auch können die Peptide durch erfindungsgemäße Antikörper nachgewiesen werden. Letztere eignen sich ferner dazu, den Therapieverlauf einer mit erfindungsgemäßen Peptiden behandelten HBV- assoziierten Erkrankung zu kontrollieren. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich HBV Core- Proteine zu binden und in ihren Aktivitäten, insbesondere in ihrer Aktivität für die HBV-Replikation, zu inhibieren. Damit kann die Replikation von HBV gehemmt werden. Ferner kann gegen HBV-assoziierte Erkrankungen, z.B. HBV-Infektionen, wie chronische HBV-Infektionen, insbesondere chronische Hepatitis, und heptatozelluläres Karzinom, diagnostisch und therapeutisch vorgegangen werden. Desweiteren stellen die erfindungsgemäßen Peptide bzw. sie kodierende DNAs eine Basis dar, völlig neue Wirkstoffe gegen vorstehende Erkrankungen zu entwickeln.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt schematisch das modifizierte " Peptid-Aptamer"- System in S. cerevisiae. Dieses System umfaßt drei
Komponenten: (1) das Zielprotein (HBV Core-Protein iC) , das mit einer heterologen DNA-Bindungsdomäne (GAL4BD) fusioniert ist, (2) ein Peptid mit randomi- sierter Ami no s äur e s equenz , das an eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne (GAL4AD) fusioniert ist und (3) ein stabil integriertes Selektionsgen (prototrophe Selektionsmarker, wie ADE2) , das in seinem Promotor die Erkennungssequenz für die DNA-Bindungsdomäne besitzt. Durch Interaktion zwischen dem Peptid und dem Zielprotein entsteht ein synthetischer Transkriptionsfaktor, der durch die Transaktivierungsdomäne an die Erkennungssequenz im Promotorbereich des Selektionsgens bindet und durch die Transaktivierungsdomäne die Transkription des Selektionsgens stimuliert. Unter
Selektionsbedingungen (z.B. Adenin-negativen Nährböden) bilden nur jene Hefezellen Kolonien, die ein Peptid mit Affinität für das Zielprotein exprimieren (TrxA = E.coli Thioredoxin A; TAG = His- Tag; NLS = nukleares Lokalisationssignal) .
Fig. 2 zeigt die Analyse von HBV Core-Protein bindenden Peptiden im "Peptid-Aptamer" -System. Durch Screening von etwa 2 x 106 Hefezellen werden 9 positive Klone isoliert. Es werdenReplika-Plattierungen der Hefekolonien (Masterplatte oben: 1-9 = positive Klone; K = zufällig ausgewählter Kontroll-Klon) unter Selektion auf ADE2 (GAL4-BS im Kontext des GAL2-Promotors) ,
HIS3 (GAL4BS im Rahmen des GAL1-Promotors) und URA3 (GAL4-BS im Rahmen des S PO 13 - Promo t ors ) durchgeführt .
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Screening nach HBV Core-Protein bindenden Peptiden
Es wird ein Verfahren verwendet, das sich von dem bekannten "Peptid-Aptamer"-System ableitet. Das Verfahren ist in Fig. 1 schematisch dargestellt.
Für das Screening nach HBV Core-Protein bindenden Peptiden wird eine randomisierte Oligopeptid-Expressionsbank für 20 Aminosäuren-lange Peptide mit zufälliger Sequenz hergestellt
(Komplexität ca. 2 x 108 unterschiedliche Peptide) . Kodons werden durch die Sequenz NNK definiert (N = G, A, T oder C; K
= G oder C) . Sie kodieren für alle 20 Aminosäuren, resultieren aber nur in einem Stop-Kodon. Als Expressionsvektor wird ein Hefe-Expressionsvektor, pADTrx, verwendet. Dieser enthält
E.coli Trx A (Thioredoxin-Protein) aus pTrx (Invitrogen) und
GAL4AD sowie den ADH-Promotor aus pAS2 bzw. pGAD424 (Clon- tech) . Die Peptide werden im Rahmen der aktiven Schleife von
Trx exprimiert. Dies hat folgende Vorteile:
im Rahmen der Trx-Schleife ist die Präsentation der Peptide nach außen gewährleistet, konformell restringierte Peptide können Aminosäuren nach außen exponieren, die bei flexiblen Peptiden im intrazellulären Milieu möglicherweise nach innen gefaltet werden, konformell restringierte Peptide können hochaffine Peptide sein, die das Potential besitzen, auch in vivo als effiziente Proteininhibitoren zu wirken.
Ferner wird ein Hefestamm, KF-1, verwendet. Dieser stammt von dem Hefe- stamm PJ69-4A (vgl. James et al . , Genetics 144 (1996), 1425) und erlaubt die Analyse von drei Selektionsmarkern: ADE2 , HIS3 und URA3. Jeder der drei Selektionsmarker steht unter der transkriptioneilen Kontrolle von GAL4-Bindungsstellen im Rahmen unterschiedlicher Promptoren. Der Selektionsmarker URA3 wird durch den SP013-Promotor reguliert, der aus dem Hefestamm MaV103 (vgl. Vidal , et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. USA (93), 10315-10320) stammt, ein negativ-regulatorisches Element enthält und durch starke Protein-Protein-Interaktionen aktiviert werden kann. Ferner enthält der Hefestamm das E.coli ß-Galaktosidase- (-Gal) -Gen als weiteren Marker, dessen Aktivität leicht quantifizierbar ist und eine Abschätzung der in vivo Bindungsaffinität des Peptids an das HBV Core-Protein ermöglicht. Auch die Aktivierung des HIS3-Gen kann durch Titration mit 3 'AT- (3-Amino- -1, 2, 4-Triazol) quantifiziert werden.
Das HBV Core-Protein wird einem Screening mit vorstehendem System unterzogen. Hierzu wird es in Form eines es kodierenden Expressionsvektors bereitgestellt. Als Basisvektor dient pPC97 (vgl. Vidal et al . vorstehend), in dem die kodierende Sequenz eines HBV Core-Proteins (HBV Subtyp adr) inseriert ist. Aus ca. 2 x 106 Hefeklonen werden 9 Klone isoliert, die unter Selektion mit ADE2 ein Wachstum zeigen. Replika-Plattierungen und die Analyse der drei Selektionsmarker zeigen, daß 8 der 9 Klone auch unter Selektion mit HIS3 Wachstum zeigen (Fig. 2) . Desweiteren zeigen 3 der isolierten Klone zusätzlich Wachstum unter URA3-Selektion, was unter den hier eingesetzten Bedingungen auf eine besonders hohe in vivo Affinität des entsprechenden Peptids für das HBV Core-Protein hinweist.
Zur weiteren Kontrolle werden aus den 9 Klonen die entsprechenden Peptid-Expressionsplasmide isoliert und nach erneuter Transformation in Hefe einem Rescreening unterzogen. Das Rescreening zeigt eine komplette Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den vorstehenden Replika-Plattierungen (Fig. 2) . Es zeigt sich, daß das Wachstum der Hefe von der Bindung der Peptide an das HBV Core-Protein abhängt.
Die Peptide der 9 Klone werden in ihrer Aminosäuresequenz bestimmt. Diese ist in Tabelle 1 angegeben.
Beispiel 2: Inhibierung von HBV-Core-Proteinen durch erfindungsgemäße Peptide.
Es wird das "VP 22-Shuttle-System" verwendet. Dieses beruht darauf, daß das HSV1-VP 22-Protein von Zellen aufgenommen wird, d.h. als Träger verwendet werden kann. Es werden Fusionspolypeptide aus VP 22 und erfindungsgemäßen Peptiden, z.B. dem Peptid Cl-1 von Tabelle 1 hergestellt. Hierzu wird der Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) verwendet. In diesen werden die DNA-Sequenzen der Peptide in Phase mit der DNA- Sequenz von VP 22 inseriert. Die Peptide werden dabei im Rahmen des E.Coli TrxA-Proteins exprimiert. Es werden Expressionsplasmide, z.B. pCEP4-Cl-l, erhalten.
Ferner werden HepG2-Hepatomzeilen verwendet. Diese werden mit den vorstehenden Expressionsplasmiden, z.B. pCEP4-Cl-l, und einem für HBV kodierenden Expressionsplasmid, RC-CMV (Invitrogen) -HBV cotransfisziert . Es wird eine Analyse auf HBV-Replikation durchgeführt (vgl. Seils et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. USA 84 (1987), 1005-1009). Hierzu werden Zellen bzw. Überstände isoliert und einer SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen. In einem Southern- bzw. Western Blot-Verfahren werden HBV-Virus- partikel bzw. Nukleinsäuren bestimmt.
Es zeigt sich, daß durch die erfindungsgemäßen Peptide die Synthese von HBV-Viruspartikeln bzw. -Nukleinsäuren stark gehemmt wird. Kontrollen, in denen keine HBV Core-Protein spezifischen Peptide verwendet wurden, zeigen diese Hemmung nicht. Somit eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide zur Hemmung der HBV-Replikation.

Claims

Patentansprüche
1. Peptid, ausgewählt aus den folgenden Peptiden
NH2-SFYSVLFLWG TCGGFSHSWY-COOH NH2-LCETVRFWPV CFCSLYVICS-COOH NH2-SCAPAWSPAP TWFVALYW-COOH NH2-QWGMDSLIRL YLWESLGLLS-COOH NH2-IHPLSRGNFF PHVRLMGEWR-COOH
NH2-GQALCAGVSL FADWLHESTL-COOH NH2-LKHFDPRWPL MSLMSSWACM-COOH NH2-PPLRKAFCWR CFNWLSTKRL-COOH NH2-LRKSMLKVGR DVCYVSLWVF-COOH
wobei das Peptid eine Modifikation in der Sequenz von bis zu 40 % aufweisen kann.
2. Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid als Fusionspolypeptid vorliegt.
3. Peptid nach Anspruch 2, wobei das Fusionspolypeptid eine "Leader" -Sequenz umfaßt.
4. DNA, kodierend für das Peptid nach einem der Ansprüche 1 - 3.
5. Expressionsvektor, enthaltend die DNA nach Anspruch 4.
6. Antikörper, gerichtet gegen das Peptid nach einem der Ansprüche 1-3.
7. Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere Peptide nach einem der Ansprüche 1 - 3, ein oder mehrere Expressions- vektoren nach Anspruch 5 und/oder einen oder mehrere
Antikörper nach Anspruch 6 sowie übliche Hilfsstoffe.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Peptid als Fusionspolypeptid vorliegt.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Fusionspolypeptid eine "Leader" -Sequenz umfaßt.
10. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 - 3, des Expressionsvektors nach Anspruch 5 oder der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 - 9 zur Inhibierung eines HBV Core-Proteins .
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Inhibierung eine Hemmung der HBV-Replikation umfaßt.
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die HBV-Replikation bei einer HBV-assoziierten Erkrankung vorliegt.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-12, wobei die Inhibierung des HBV Core-Proteins zur Behandlung einer HBV-assoziierten Erkrankung erfolgt.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die HBV- assoziierte Erkrankung eine chronische HBV-Infektion, eine chronische Hepatitis und ein hepatozelluläres Karzinom umfaßt.
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