DE69010910T2 - Polypeptidhemmer für virale replikation. - Google Patents

Polypeptidhemmer für virale replikation.

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Description

    Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Polypeptid, das die Nachbildung von Herpes Simplex Virus (HSV) und ähnlicher Viren verhindert, sowie seine therapeutische Verwendung gegen Infektionen durch solche Viren.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • HSV existiert in Form von einigen Serotypen, von denen HSV-1 einer ist, der klinische Bedeutung hinsichtlich Erkältungskrankheit und Schmerzen besitzt. HSV-1 ist ein DNA-Virus, der kopiert und innerhalb des Zellkerns nachgebildet wird. Wieviele andere Viren werden die Gene in mRNA zu unterschiedlichen Zeiten kopiert. Einige wichtige Gene, die als erste kopiert werden, werden als "immediate-early (IE)" oder als "α" bezeichnet. Ihre Transkription wird durch promotorsequenzen ermöglicht, die am 5'-Ende oder oberstromig vom ATG-Startcodon (Nucleotid-Triplett) der Gene liegen. Weiter oberstromig vom promotor besitzen die IE-Gene eine bestimmte Nucleotid-Sequenz, die eine (gemeinsame) Consensus-Sequenz TAATGARAT besitzt (worin R = Purin, d.h. G oder A sein kann).
  • Die IE-Gene des HSV werden durch eine Komponente des Virions eingeleitet, der zuerst durch M.E.M. campbell, J.W. palfreyman und C.M. Preston, Journal of Molecular Biology 180, 1-19 (1984) als "Vmw 65" identifiziert wurde. Vmw 65, das ebenfalls als VP16 bezeichnet wurde, ist ein Membranprotein, das zwischen der viralen Membran und dem Capsid (Schutzhülle) liegt. Vmw 65 soll "trans-acting" oder "trans-aktivierend" sein. Diese Sprache deutet lediglich an, daß es etwas wie ein Lösungsfaktor ist, der auf die virale DNA wirkt, um sie zu regulieren. Ein noch weiterer Name für Vmw 65 ist der α-Trans Inducing Factor oder α- TIF, was bedeutet, daß es auf die virale DNA wirkt, um die Transkription der IE (α) Gene zu induzieren.
  • M.E.M. Campbell et al., loc. cit. spekulierten, daß Vmw 65 die DNA im TAATGARAT-Bereich anbindet, entweder direkt oder indirekt, indem ein Gastzellenpolypeptid modifiziert wird. Spätere Arbeiten, die mit der von T.M. Kristie und B. Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 71-75 (1987), haben gezeigt, daß der TAATGARAT-Bereich, der als "cis-wirkende Stelle" oder als die α-transinduzierende cis-wirkende (α-TIC)-Stelle bezeichnet wird, sich nicht direkt mit dem Vmw 65 verbindet, sondern ein oder mehrere Gastzellenproteine bindet. Verschiedene Arbeitsgruppen haben die Gastzellenproteine identifiziert, die sowohl den TAATGARAT-Bereich, als auch das Vmw 65 binden. Sie sind verschiedenartig als "α-H1", "HC3", "Octamer-bindendes Protein", "OTF-1" und "TAATGARAT erkennender Faktor" (TRF), bezeichnet worden, die wahrscheinlich alle identisch sind. In dieser Beschreibung wird die TRF-Nomenklatur verwendet.
  • Die gegenwärtige Kenntnis wird durch C.I. Ace et al., J. Virology 63, 2260-2269 (Mai 1989) zusammengefaßt. Vmw 65 deutet die Einführung der IE-Gene durch Verbindung mit zellförmigen Proteinen an, unter Ausbildung eines Komplexes, der als IEC oder TRF.C, bekannt ist, der dazu in der Lage ist, sich insbesondere an DNA-Sequenzen anzuhängen, die TAATGARAT umfassen. In anderen Worden, die IE-Gen-Einführung umfaßt einen Komplex, der zumindest ternär zwischen zumindest Vmw 65, TRF und einer TAATGARAT-Bereichssequenz liegt.
  • Es ist wünschenswert, die Bildung dieses Komplexes zu blockieren und dadurch die Einführung der IE-Gen-Transkription von HSV zu blockieren. C.I. Ace et al., s.o., haben demonstriert, daß ein Virusmutant, dem die Fähigkeit fehlt, einen solchen Komplex mit Vmw 65 und TRF zu bilden, sich sehr schlecht mit niedriger Vervielfachung der Infektion (MOI) nachbildet. Niedrige Vervielfachung der Infektion (low multiplicity of infection) würde klinisch anzutreffen sein. Versuche sind deshalb durchgeführt wurden, die Bereiche von Vmw 65 als verantwortlich zur Komplexbildung zu identifizieren. Es könnte dann möglich sein, ein kurzes Polypeptid zu synthetisieren, das mit Vmw 65 zur Bildung des Komplexes konkurriert.
  • S.J. Triezenberg, R.C. Kingsbury und S.L. McKnight, Genes & Development 2, 718-729 (1988), haben die Vmw 65-Struktur/Funktion mit einem Assay zur IE-Gen-transkriptionellen Einführung und zur Fähigkeit von Vmw 65 erforscht, Mutanten zu entfernen, um die IE-transkriptionelle Einführung durch normales Vmw 65 zu unterbinden. Sie haben gezeigt, daß, falls das Carboxy-Ende vo Vmw 65 weggelassen wurde, das Protein nicht mehr die IE-Transkription einleitet. Sie berichteten jedoch, daß dieses geänderte Protein die IE-Einführung durch normales Vmw 65 verhindern könnte. Bei Verwendung verschiedenartig abgeänderter (deleted) Formen von Vmw 65 zeigten sie, daß die Grenzen für diese inhibierende Aktivität (d.h. Hemmung bzw. Inhibition von normalem Vmw 65, wenn die beiden zusammen sind, beim N-Terminus bzw. N-Ende, irgendwo zwischen den Aminosäuren 56 und 74 und beim C-Terminus bzw. C-Ende irgendwo zwischen 380 und 393 liegt. Da ihr Vorschlag besagt, daß die konkurrierende, inhibierende Aktivität auf die Wechselwirkung mit einem zellulären Zwischenprodukt zurückzuführen ist, beanspruchen sie, daß diese Grenzen die Grenzen für die Wechselwirkung mit diesem zellulären Zwischenprodukt sein können. Zu beachten ist, daß der Assay für Gentranskription war, d.h. im wesentlichen für ein "Endprodukt". Die Inhibitionswirkung könnte tatsächlich deshalb bei irgendeinem breiteren Bereich von Stufen stattfinden, z.B. durch gesättigte Stellen für den Transport des Virus in den Zellenkern.
  • G. Werstuck und J.P. Capone, Gene 75, 213-224 (1989), haben ebenfalls die Vmw 65 Struktur und Funktion erforscht, unter Verwendung von Messungen des Ausdrucks eines cat-Gens, das an einen IE-Promotor-Bereich als ein Assay zur Transkriptionseinleitung der Funktion von Vmw 65 angebunden ist. Sie haben herausgefunden, daß ein vollständiger Verlust der IE-Einführungsaktivität auftritt, wenn vier oder fünf Aminosäuren in die Vmw 65-Codierungssequenz bei den Aminosäuren 178,215, 335, 369 oder 471 eingeführt wurden, oder wenn das Vmw 65 in irgendeinem der folgenden Bereiche geändert oder gestrichen wurde: Aminosäuren 26-140, 26-177, 26-240, 142-177, 174-240, 179-412, 242-412, 331-412 und 331-470. In einem änlichen Assay, der durch Triezenberg et al verwendet worden ist, untersuchten sie zusätzlich die Fähigkeit der geänderten Mutanten von Vmw 65, ob sie konkurrenzmäßig die IE-Einführungsfunktion des normalen Vmw 65 verhindern können. Die konkurrenzmäßige Inhibition oder Verhinderung wurde mit Mutanten erreicht, denen 331-470, 331-412, 242-412 oder 186-490 fehlten, was andeutet, daß die Grenze dieser konkurrenzmäßigen Inhibitionsaktivität bei einer Aminosäure niedriger als 186 liegt. Es ist beachtenswert und zeigt die Komplikationen auf, die unter Verwendung dieser Sorte von Assay resultiert, um zu versuchen, die Struktur von Vmw 65 mit der Funktion in Bezug zu setzen, das die Grenze, die für die konkurrenzmäßige Inhibitionsaktivität durch Werstuck und Capone dargelegt, sich wesentlich von der durch Triezenberg et al, siehe oben, dargestellten, unterscheidet.
  • R. Greaves und P. O'Hare, Journal of Virology 63, 1641-1650 (April 1989), demonstrierten in direkter Weise, daß der saure C-Endbereich von Vmw 65 (von den Aminosäuren 403 bis zum C-Terminus) nicht für die Komplexbildung erforderlich ist, sondern daß innerhalb der Sequenz der Aminosäuren 317-403 ein Bereich vorliegt, der für diese Komplexbildung erforderlich ist.
  • C.I. Ace et al, J. Gen. Virology 69, 2595-2605 (1988) und Journal of Virology 63, 2260-2269 (Mai 1989) haben biochemische Studien der DNA-Proteinkomplexbildung durchgeführt. Diese Gruppe hat gezeigt, daß der Einsatz eines Linkers oder Verbinders, der eine geringe Anzahl von Aminosäuren (normalerweise 4), an jeglicher von einigen Positionen in der Vmw 65-Sequenz codiert, direkt die Fähigkeit dieses geänderten Proteins verhindert, einen Komplex mit TRF bilden. Unter diesen verhinderte der Einsatz bei Aminosäure 379 die Fähigkeit, den Komplex zu bilden. Parallel dazu bestätigten sie, daß diejenigen Mutanten, die nicht in der Lage waren, den Komplex mit TRF zu bilden, nicht dazu in der Lage waren, den IE-Ausdruck zu induzieren.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es hat sich nunmehr herausgestellt, daß die TRF.C (Komplex)-Bildung durch ein Polypeptid inhibiert wird, das in etwa aus dem Bereich der Aminosäuren 366 oder 367 bis 373 des Vmw 65 besteht oder diese umfaßt. Die Grenzen des kritischen Bereiches sind bisher noch nicht mit absoluter Genauigkeit festgelegt worden, so daß nicht ausgeschlossen werden kann, daß man auf ein oder zwei Aminosäuren an jedem Ende dieser Kette verzichten kann. Wahrscheinlich müsste das Polypeptid jedoch länger gemacht werden, um die beste Inhibition zu erzielen, insbesondere am C-Ende (373). Insbesondere bevorzugt ist ein Polypeptid, das aus den Aminosäuren 360 bis 390, insbesondere 366 oder 367 bis 388, 389 oder 390 besteht oder diese umfaßt.
  • Die relevante Aminosäuresequenz ist wie folgt (identifiziert als SEQ ID Nr: 1):
  • Arg Glu His Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr 360
  • Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly 370
  • Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro 380.
  • Für zusätzliche Sequenz, siehe S.J. Triezenberg et al, Genes & Development 2, 718-719 (1988) auf Seite 719.
  • Um einigermaßen positive Grenzen hinsichtlich der Erfindung zu ziehen, daß man sie leicht zwischen den kurzkettigen Polypeptiden, die hier betrachtet werden und den langen Sequenzen unterscheiden kann, die Gegenstand der Experimente des oben erwähnten Standes der Technik sind, ist es beabsichtigt, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide nicht länger als 40 Aminosäuren lang sein sollten, insbesondere nicht länger als 30. Dieses sind jedoch willkürlich gewählte Zahlen.
  • Die Erfindung umfaßt das Polypeptld per se und seine Verwendung als Inhibitor jeglichen Virus, der bezüglich seiner Wirkung von einem Vmw 65-ähnlichen Protein abhängt, jedoch natürlich insbesondere für Herpes simplex-Viren und insbesondere des HSV Typ 1.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen:
  • Das erfindungsgemäße Konzept ist in seinem Kern eine experimentelle Untersuchung, die zeigt, daß das Polypeptid aus den Aminosäuren 360 bis 373 besteht und als Inhibitor der IE-Gen-Einführung in HSV wirkt. Die Ansicht, daß diese Sequenz an ihrem terminalen Ende zurückgeschnitten und/oder an ihrem C-terminalen Ende verlängert werden könnte, stammt aus einer anderen Aussage/Beweis. Kurz gesagt, sind Experimente bzw. Versuche mit geänderten Mutanten von Vmw 65 durchgeführt worden, die durch Beseitigungen entstanden, die am C-Terminus anfangen und sich progressiv in Richtung zum N-Terminus erstrecken. Diese Mutanten wurden im Vmw 65- Gen hergestellt, indem das Gen von seinen 3'-Ende mit Ba131 zurückgeschnitten wird, ein Stopcodon in alle drei Leserahmen eingesetzt wird, das Gen ausgedrückt und die Ausdruckprodukte durch Western blotting mit einem Antikörper an einem N-terminalen Epitop von Vmw 65, um die Vmw 65-Mutanten zu ermitteln. Die Mutanten wurden danach im Hinblick auf ihre Fähigkeit der TRF.C.-Bildung untersucht, durch einen DNA-Bindungsassay, wie er von R. Greaves und P. O'Hare. siehe oben, beschrieben worden ist, mit den folgenden Ergebnissen : -entfernter Teil Bildet Komplex (TRF.C) C-Terminus ja nur sehr schwach nein
  • Darüberhinaus hat sich herausgestellt, daß die 21-Aminosäuresequenz von etwa 367 bis 387 eine bedeutsame Homologie (etwa 50%) mit dem terminalen Protein des B. subtilis bacteriophage φ 29 besitzt. Dieses Protein ist bei Bildung eines Anfangskomplexes zur Initierung der φ 29 DNA-Replikation in vivo über Protein-Protein und Protein-DNA-Wechselwirkungen involviert. Für eine kürzliche Zusammenfassung der Arbeitsergebnisse dieser Bacteriophage und für weitere Bezugnahmen siehe A. Zaballos et al. Gene 63, 113-121 (1988).
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch Routinesyntheseverfahren hergestellt werden, die denjenigen im Peptidgebiet gut bekannt sind. Zur Verwendung als Inhibitoren der HSV-Replikation im Menschen können die Polypeptide parenteral in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel in einer Dosis gegeben werden, die typischerweise innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 15 mg pro Tag liegt. Die lokale Administration als Salbe oder Creme wird ebenfalls mit einbezogen.
  • Die Erfindung ist insbesondere anwendbar beim menschlichen Herpes simplex-Virus Typ 1 und 2 und bei anderen Herpes-Viren, die vom Vmw 65 oder einem Protein abhängen, das eng homolog im relevanten Aminosäurebereich zum Binden eines cellulären Faktors unter Bildung eines Komplexes ist, der den IE-Gen-Ausdruck einleitet.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
    • BEISPIEL
  • Der Versuch zur Demonstration der Peptidinhibierung der TRF-Vmw 65-Komplexanordnung lief wie folgt ab.
  • Ein Kernextrakt von Hela-Zellen wurde genauso zubereitet, wie es durch Dignam et al, Nucl. Acids Res. 11 1475-1489 (1983). (Dieses ist ein Standardprotokoll zur Herstellung von Extrakten, die zelluläre DNA-bindende Proteine enthalten. Polypeptide von Vmw 65-Aminosäuren wurden durch Cambridge Research Biochemicals Ltd., Cambridge, UK, unter Vertrag, nach der oben erwähnten Sequenz synthetisiert. Ein ul-Volumen an phosphatgepufferter Saline, die zunehmende Mengen (100 ng. 500 ng. 1 ug; 2.5 ug, 5 ug (dreier unterschiedlicher Polypeptide (Aminosäuren 119 bis 134; 160 bis 176; 360 bis 373) enthielten, wurden zur Standardmenge des Hela-Zellenkernextraktes (1 ul Extrakt pro 2 ug Polypeptid) hinzugegeben. Nach Inkubation bei 20ºC für 30 Minuten wurde eine 1 ul-Probe des Vmw 65-Proteins, gereinigt, wie es durch P. O'Hare et al, EMBO J. 7: 4231-4238 (1988) gereinigt und den Extraktpolypeptidmischungen hinzugefügt und die Inkubation wurde für weitere 5 Minuten in einem Puffer durchgeführt, der 25 mM HEPES, pH 7,9, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 100 mM DTT, 100 mM KC1, 0,05% NP4= 10% Glyzerin sowie 2 ug einer Lachssperma-DNA enthielt. Eine ³²p radioaktiv markierte Sonde, vorliegend im Überschuß und umfassend die nukleotide -171 bis -149 (die Numerierung beginnt oberstromig von der Stelle der mRNA-Transkription: die TAATGARAT-Sequenz liegt bei -162 bis -154) des unmittelbar-frühen IE11OK-Gens des HSV-1 wurde danach hinzugefügt, und die Inkubation wurde für weitere 25 Minuten fortgeführt. Die Produkte wurden anschließend auf 4 % nicht-denaturierten Polyacrylamidgelen bei 200 Volt für 2 Stunden durchgeführt. Diese Verfahrensweisen sind im wesentlichen beschrieben bei O'Hare und Goding, Cell 52: 435-445 (1988). Bei der Autoradiografie zeigten die Gele höhermolekulare Gewichtsbänder aufgrund der radiomarkierten TRF und TRF/Vmw 65 Komplexe, wenn dort eine Nullkonzentration an jeglichem Polypeptid vorlag. Die Zugabe von 199-134 und 160-176 Polypeptiden besaß keine Wirkung auf das Erscheinen jeglicher dieser Bänder. In der Gegenwart von 360-373 Polypeptid wurde das radiomarkierte TRF/Vmw 65-Band mit steigender Konzentration schwächer und war bei Konzentrationen zwischen 500ng und 1ug nicht mehr feststellbar. Das radiomarkierte Band, das TRF allein darstellt, veränderte sich in der Intensität nicht.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • Dieses Sequenzprotokoll wird in dieser internationalen (deutschen) Patentanmeldung vorgesehen, um die Erfordernisse oder Wünsche gewisser Vertragsstaaten (EPC-Länder, US, JP) zu erfüllen. Der Abschnitt über die "Allgemeinen Informationen" ist lediglich für US anwendbar.
    • (1) Allgemeine Information
  • (I) Anmelder: O'Hare, P. F. J. Greaves, R. F.
  • (II) Titel der Erfindung: Polypeptid-Inhibitor viraler Replication
  • (III) Anzahl der Sequenzen: 2
  • (IV) Korrespondenzadresse:
  • (A) Adressat: Nixon & Vanderhye P.C.
  • (B) Straße : 14th Floor 2200 Clarendon Boulevard
  • (C) Stadt : Arlington
  • (D) Staat : Virginia
  • (E) Land : U.S.A.
  • (F) Code : 22201
  • (V) Computer-lesbare Form
  • (A) Medium Art:
  • (B) Computer:
  • (C) Betriebssystem:
  • (D) Software:
  • (VI) Gegenwärtige Anmeldungs-Daten
  • (A) Anmeldung Nr.: noch nicht bekannt
  • (B) Anmeldedatum:
  • (C) Klassifikation:
  • (VII) Prioritätsanmeldung Datum:
  • (A) Anmeldung Nr: GB 8917029.4
  • Anmeldedatum : 25. Juli 1989
  • (VIII) Anwalt Information:
  • (A)
  • (B)
  • (C)
  • (IX) Telekommunikations-Daten:
  • (A) Telefon: (703) 875-0400
  • (B) Telefax: (703) 525-3468
  • (C) Telex : (200797 NIXN UR
    • (2) Information zur SEQ Nr. 1:
  • (I) Sequenz-Eigenschaften:
  • (A) Länge: 30 Amino-Säuren
  • (B) Art : Aminosäuren
  • (II) Molekül-Typ: Protein
  • (V) Fragment Art: inneres Fragment
  • (XI) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 1:
  • Arg Glu His Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser
  • 360 365 370 375
  • Thr Ile Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro
  • 380 385 389
    • (3) Information zur SEQ Nr. 2:
  • (I) Sequenz-Eigenschaften:
  • (A) Länge: 7 Aminosäuren
  • (B) Type : Aminosäuren
  • (II) Molekül-Typ: Protein
  • (V) Fragment Art: inneres Fragment
  • (XI) Sequenz Beschreibung: SEQ ID Nr. 2:
  • Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr
  • 367 371 373

Claims (8)

1. Polypeptid mit bis zu 40 aufeinanderfolgenden Aminosäuren des Herpes Simplex Virus Protein Vmw 65, das aus der Sequenz (N-endständig bis C-endständig) Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr (identifiziert als SEQ ID No: 2) besteht oder diese umfaßt.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, das ferner aus flankierenden Aminosäuren innerhalb der 360 - 390 Sequenz besteht oder diese umfaßt:
Arg Glu His Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr 360
Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly 370
Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro 380
(identifiziert als SEQ ID No: 1).
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als Inhibitor von Viren, die ein Vmw 65-Protein besitzen, das einen Komplex mit einem Zellfaktor zur Einleitung einer Gen-Kopie (Transkription) bildet.
4. Polypeptid nach Anspruch 3 zur Verwendung als Inhibitor des Herpes Simplex Virus Typ 1.
5. Verfahren zum Zubereiten einer Zusammensetzung zum Hemmen der Nachbildung von Viren, die ein Vmw 65-artiges Protein besitzen, einschließlich den Herpes Simplex Virus, das das Bilden eines Polypeptids von bis zu 40 aufeinanderfolgenden Aminosäuren des Herpes Simplexs Virus Protein Vmw 65 umfaßt, das die Sequenz (N-endständig bis C-endständig) Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr (identifiziert als SEQ ID No: 2) in einem geeigneten inerten Verdünner umfaßt oder daraus besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Polypeptid ferner aus flankierenden Aminosäuren innerhalb der 360 bis 390 Sequenz besteht oder diese umfaßt:
Arg Glu His Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr 360
Lys Asn Asn Tyr Gly ser Thr Ile Glu Gly 370
Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro 380
(identifiziert als SEQ 10 No: 1).
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, das zur parenteralen oder lokalen Administration geeignet ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, bei dem die Formulierung eine Dosis von 0,1 bis 15 mg pro Tag vorsieht.
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