JP2002534111A - Ｈｂｖコアタンパク質阻害用ペプチド - Google Patents

Ｈｂｖコアタンパク質阻害用ペプチド

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JP2002534111A JP2000593630A JP2000593630A JP2002534111A JP 2002534111 A JP2002534111 A JP 2002534111A JP 2000593630 A JP2000593630 A JP 2000593630A JP 2000593630 A JP2000593630 A JP 2000593630A JP 2002534111 A JP2002534111 A JP 2002534111A
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ブッツ，カーリン
ホッペ−セイラー，フェーリクス
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ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＢＶコアタンパク質を阻害するのに適するペプチド、それらをコードするＤＮＡならびに特にＨＢＶ複製を阻害するための両者の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はＨＢＶコアタンパク質を阻害するのに適するペプチド、それらのペプ
チドをコードするＤＮＡおよびその両者の使用、特にＨＢＶ複製を阻害するため
の使用に関する。
【０００２】 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染は主要な健康問題である。このことは
、特にＨＢＶ感染が慢性的である場合、すなわち、しばしば直接的に致命的であ
る慢性肝炎である場合に当てはまる。肝細胞癌の発達はまた、しばしば慢性的な
ＨＢＶ感染により生ずる。後者は肝細胞におけるＨＢＶの連続的な複製により識
別される。かかる場合、ＨＢＶ複製はコアタンパク質からなるウイルスのカプシ
ド内で生ずる。当該コアタンパク質はウイルスの核酸と接触するようになる。Ｈ
ＢＶ複製を阻害するための多くの試みがなされている。しかしながら、これらの
試みはこれまで満足するには至っていない。
【０００３】 したがって、ＨＢＶ複製を阻害できる産物を提供することが本発明の目的であ
る。
【０００４】 本発明によれば特許請求の範囲に規定されている主題によってこの目的が達成
される。
【０００５】 出願人はＨＢＶコアタンパク質が短いペプチドに結合することを明らかにした
。出願人は、ＨＢＶコアタンパク質をスクリーニング試料として使用する「ペプ
チドアプタマーシステム」を使って、ランダムに作製したペプチド配列を含むラ
ンダムオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングした。これに関連して、出
願人は、短いペプチド（特に表１に記載のペプチド）がＨＢＶコアタンパク質に
結合することを見出した。また出願人は、これらのペプチドがＨＢＶコアタンパ
ク質（例えばＨＢＶ複製についての、それらの活性に関して）を阻害するのに適
していることを明らかにした。さらに出願人はこの阻害によってＨＢＶが複製す
るのを防ぐことができることを発見した。
【０００６】 出願人はその洞察により、本発明に従って、表１に記載のペプチドから選択さ
れるペプチド（当該ペプチドは４０％まで、特には２０％まで、さらには１０％
までの配列における変更を有してもよい）を提供する。
【０００７】
【表１】
【０００８】 本発明のペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質を結合し、それらの活性（例えば
ＨＢＶ複製についての、それらの活性）を阻害するのに適している。
【０００９】 「ＨＢＶコアタンパク質」という表現は任意のＨＢＶタイプ（特にＨＢＶサブ
タイプ ＨＢＶ ａｄｒおよびＨＢＶ ａｙｗ）のコアタンパク質を包含する。
ＨＢＶコアタンパク質は野生型配列または１もしくは複数のアミノ酸が野生型と
は異なる配列を持ちうる。また、当該タンパク質は短縮型で存在してもよい。す
なわち、ＨＢＶ複製、特にウイルスの核酸への結合またはカプシド合成に必要な
断片の形でのみ利用できる。この断片は複数コピーで１つのポリペプチド分子に
存在することもできる。ＨＢＶコアタンパク質またはその断片は融合タンパク質
の形で利用することもできる。
【００１０】 本発明のペプチドは、ペプチドをＨＢＶコアタンパク質への結合に関して試験
する一般的な方法によって得ることができる。そのような方法は、例えば「ペプ
チドアプタマー」法や「バクテリオファージディスプレイ」法である。実施例に
記載の「ペプチドアプタマー」法を使用するのが好ましい。この方法は上記の方
法の変法である。
【００１１】 本発明のペプチドは単独で利用可能であるし、他の物質〔例えば（ポリ）ペプ
チド〕と結合した状態でも利用可能である。この結合はリンカー（例えばジスル
フィド架橋）を介して本発明のペプチドを（ポリ）ペプチドに結合させることに
よりなしうる。また本発明のペプチドは、本発明のペプチドが融合（ポリ）ペプ
チドの形で得られるように、（ポリ）ペプチドと融合することができる。たとえ
ば、「リーダー」ペプチド〔たとえば、ショウジョウバエ アンテナペディア（
Drosophila Antennapedia）のペネトラチン（Penetratin）やＨＳＶ１のＶＰ２
２など〕は、融合（ポリ）ペプチド用の（ポリ）ペプチドになる。それらは本発
明のペプチドの細胞への取込みを補助する。一方、リンカーを介して本発明のペ
プチドと結合させるポリペプチドは、例えば身体において異物とみなされないト
ランスフェリンなどの担体タンパク質であってよい。複数の本発明のペプチドを
上記の物質と結合した状態で同時に存在させてもよい。
【００１２】 本発明のさらにもう一つの主題は核酸、特に本発明のペプチドをコードするＤ
ＮＡに関する。このようなＤＮＡはベクター（特に発現ベクター）中に存在させ
ることができる。発現ベクターの例は当業者にはよく知られている。大腸菌用発
現ベクターの場合は、例えばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐ
ＥＴ３ｂおよびｐＱＥ−８などがある。酵母での発現には、例えばｐＹ１００と
Ｙｃｐａｄ１などを挙げる必要があり、一方、動物細胞での発現には例えばｐＫ
ＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８またはｐＣＥＶ４などを示す必要がある。バキュ
ロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは昆虫細胞での発現に特に適
している。また動物細胞での発現には例えばアデノウイルス、ワクシニアウイル
ス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレトロウイルス（例えばＭｏＭｕＬＶ
、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶまたはＧａＩＶ）などのウイルスを使用す
ることも可能である。
【００１３】 発現ベクター中に存在する本発明のＤＮＡを発現させるのに適した細胞は当業
者にはよく知られている。そのような細胞の例には大腸菌ＨＢ１０１、ＤＨ１、
ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９株、酵母
サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）株、動物細胞Ｌ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ
およびＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓｆ９などが含まれる。
【００１４】 どのようにして本発明のＤＮＡを発現ベクターに挿入するかは当業者には知ら
れている。また、本発明のＤＮＡを融合ポリペプチドの形で発現させることがで
きるように、このＤＮＡを別のペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ
と結合して挿入できるということも当業者には知られている。
【００１５】 さらに形質転換細胞またはトランスフェクト細胞の培養条件も当業者には知ら
れている。また、本発明のＤＮＡによって発現されるペプチドまたは融合ポリペ
プチドの単離法および精製法も当業者には知られている。
【００１６】 本発明のさらにもう一つの主題は上記のペプチドまたは融合ポリペプチドに対
する抗体に関する。そのような抗体は一般的方法によって製造できる。この抗体
はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。抗体を製造するには、
動物（ポリクローナル抗体の場合は特にウサギまたはニワトリ、モノクローナル
抗体の場合はマウス）を上記（融合）ポリペプチドまたはその断片で免疫するこ
とが好ましい。さらに、同じ（融合）ポリペプチドまたはその断片を使って、そ
の動物の「追加免疫」を行なうことができる。次いで、その動物の血清または卵
からポリクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を製造するに
は動物の脾細胞を単離し骨髄腫細胞と融合させる。
【００１７】 本発明のさらにもう一つの主題は１または複数の本発明のペプチドおよび／ま
たはそれらをコードするＤＮＡならびに慣用の補助剤を含有する医薬組成物に関
する。使用される補助剤としては、例えば薬物担体、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、
溶剤、溶解助剤、放出促進剤、放出遅延剤、乳化剤、安定剤などを挙げることが
できる。そのような組成物は通常どおり例えば経口的または非経口的に使用でき
る。適切な投与量は通常どおり個々の事例で決定される。
【００１８】 本発明のさらにもう一つの主題は１または複数の本発明のペプチドを含有する
診断用組成物に関する。ＨＢＶコアタンパク質はこのような組成物によって検出
できる。この事実はたとえば慢性ＨＢＶ感染等のＨＢＶ感染症、特に慢性肝炎お
よび肝細胞癌等のＨＢＶ関連疾患を検出するために利用できる。そのような検出
は、例えば（ａ）患者から細胞試料を収集し、（ｂ）その細胞試料を本発明のペ
プチドと、ＨＢＶコアタンパク質への当該ペプチドの特異的結合が可能な条件で
接触させ、ならびに（ｃ）そのペプチドを検出することからなる。この検出は標
準的方法で行うことができる。例えば本発明のペプチドは液相に存在させるか、
固形担体に結合することができ、様々な方法で標識できる。適切なマーカーと標
識法は当業者にはよく知られている。これらのペプチドは本発明の抗体によって
検出することもできる。これらの抗体は本発明のペプチドを使って処置されるＨ
ＢＶ関連疾患の治療の進行を制御するのにも適している。
【００１９】 本発明を利用することにより、ＨＢＶコアタンパク質を結合し、それらの活性
（特にＨＢＶ複製についての、それらの活性）を阻害することができる。ＨＢＶ
の複製はこれにより阻害することができる。また、ＨＢＶ関連疾患、たとえば、
慢性ＨＢＶ感染症等のＨＢＶ感染症、特に慢性肝炎および肝細胞癌に対する診断
的処置および治療的処置をとることができる。さらに、本発明のペプチドおよび
それらをコードするＤＮＡは、上記の疾患に対する全く新しい活性物質の開発の
基礎にもなる。
【００２０】 以下の実施例で本発明を説明する。
【００２１】 実施例１：ＨＢＶコアタンパク質を結合するペプチドのスクリーニング 既知の「ペプチドアプタマー」システムから導かれる方法を使用する。この方
法を図１に模式的に示す。
【００２２】 ＨＢＶコアタンパク質を結合するペプチドのスクリーニングを行なうために、
ランダムな配列を持つ２０アミノ酸長のペプチドについて、ランダムオリゴペプ
チド発現ライブラリーを作成する（複雑度は約２×１０8 種類のペプチド）。コ
ドンは配列ＮＮＫ（Ｎ＝Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＣ）によって定義さ
れる。これらのコドンは２０種類のアミノ酸すべてをコードするが、これによっ
て生じる停止コドンは１つだけである。酵母発現ベクターｐＡＤＴｒｘを発現ベ
クターとして使用する。このベクターはｐＴｒｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）由
来の大腸菌ＴｒｘＡ（チオレドキシンタンパク質）とＧＡＬ４ＡＤならびにｐＡ
Ｓ２またはｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）由来のＡＤＨプロモーターを
含有する。ペプチドはＴｒｘの活性ループ上に発現される。これには次のような
利点がある： ・Ｔｒｘループ上でペプチドの外部提示が保証される、 ・立体配座（konformell）により制限されたペプチドは、柔軟なペプチドの場合
、細胞内環境において内向きに折りたたまれるかもしれないアミノ酸を外向きに
露出することができる、 ・立体配座により制限されたペプチドは、インビボでも効率のよいタンパク質阻
害物質として作用する可能性を持つ高親和性ペプチドでありうる。
【００２３】 酵母ＫＦ−１株も使用する。これは酵母ＰＪ６９−４Ａ株（Ｊａｍｅｓら，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ １４４（１９９６）１４２５参照）から派生した株であり、こ
の株では３種類の選択マーカー：ＡＤＥ２、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３の解析が可
能である。これら３種類の選択マーカーはそれぞれ様々なプロモーター上のＧＡ
Ｌ４結合部位による転写により制御されている。ＵＲＡ３選択マーカーは、負の
調節要素を含有し、強いタンパク質−タンパク質相互作用によって活性化されう
る、酵母ＭａＶ１０３株由来のＳＰＯ１３プロモーター（Ｖｉｄａｌら，Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（９３）１０３１５〜１０３
２０参照）によって調節される。この酵母株は、さらなるマーカーとして大腸菌
β−ガラクトシダーゼ（−Ｇａｌ）遺伝子も含有している。その活性は容易に定
量でき、ＨＢＶコアタンパク質に対するペプチドのインビボ結合活性を評価する
ことができる。ＨＩＳ３遺伝子の活性化は３’ＡＴ−（３−アミノ− −１，２
，４−トリアゾール）を使った滴定によっても定量できる。
【００２４】 ＨＢＶコアタンパク質を上記のシステムを使ったスクリーニングにかける。そ
のために、同タンパク質をコードする発現ベクターの形でＨＢＶコアタンパク質
を用意する。ｐＰＣ９７〔Ｖｉｄａｌら（前掲）参照〕はＨＢＶコアタンパク質
（ＨＢＶサブタイプａｄｒ）のコード配列を挿入する基本ベクターとして役立つ
。約２×１０6 個の酵母クローンから９個のクローンを単離する。それらはＡＤ
Ｅ２選択下に増殖を示す。レプリカ平板法と上記３種類の選択マーカーの解析に
より、９個のクローン中８個がＨＩＳ３選択下でも増殖を示すことを示す（図２
）。また、単離したクローンのうち３個はさらにＵＲＡ３選択下でも増殖を示す
ことから、ここで使用した条件下に、ＨＢＶコアタンパク質についての、対応す
るペプチドのとりわけ高いインビボ親和性を示す。
【００２５】 さらなる対照として、対応するペプチド発現プラスミドを上記の９個のクロー
ンから単離し、酵母での新たな形質転換後に再スクリーニングにかける。再スク
リーニングは上記レプリカ平板法で得られる結果と完全な一致を示す（図２）。
示されるように、酵母の増殖はＨＢＶコアタンパク質に対するペプチドの結合に
依存する。
【００２６】 上記９個のクローンのペプチドをそれらのアミノ酸配列について決定する。こ
れを表１に示す。
【００２７】 実施例２：本発明のペプチドによるＨＢＶコアタンパク質の阻害 「ＶＰ２２シャトルシステム」を使用する。これはＨＳＶ１−ＶＰ２２タンパ
ク質が細胞によって吸収される、すなわち担体として使用できるという事実に基
づいている。ＶＰ２２と本発明のペプチド、たとえば、表１のペプチドＣ１−１
から融合ポリペプチドを作成する。この目的には、発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用する。この発現ベクターに上記ペプチドのＤＮＡ
配列を、ＶＰ２２のＤＮＡ配列と読み枠を合わせて挿入し、ペプチドを大腸菌Ｔ
ｒｘＡタンパク質上に発現させる。発現プラスミド、たとえばｐＣＥＰ４−Ｃ１
−１を得る。
【００２８】 ＨｅｐＧ２肝細胞も使用する。それらを上記発現プラスミド、たとえば、ｐＣ
ＥＰ４−Ｃ１−１およびＨＢＶをコードする発現プラスミド、ＲＣ−ＣＭＶ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ＨＢＶでコトランスフェクトする。ＨＢＶ複製の解析を
行う（Ｓｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１９８７），１００５−１００９を参照）。この目的のため
に、細胞および／または上清を単離し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供する。ＨＢＶウイルス粒子および／または核酸はサザンブロットまたはウエ
スタンブロットにおいて測定される。
【００２９】 ＨＢＶウイルス粒子および／または核酸の合成は本発明のペプチドにより強く
阻害されることがわかる。ＨＢＶコアタンパク質に特異的なペプチドを使用して
いない対照はこの阻害を示さない。このように、本発明のペプチドはＨＢＶ複製
を阻害するのに適している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｓ．セレビシェでの改変「ペプチドアプタマー」システムを示す模式
図である。このシステムは以下の３成分を含む：（１）異種ＤＮＡ結合ドメイン
（ＧＡＬ４ＢＤ）と融合された標的タンパク質（ＨＢＶコアタンパク質ｉＣ）、
（２）ランダムなアミノ酸配列を持つ、転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＡＤ）に
融合されたペプチド、ならびに（３）安定的に組み込まれた選択遺伝子（ＡＤＥ
２などの原栄養性選択マーカー）であって、そのプロモーター中に上記ＤＮＡ結
合ドメインの認識配列を持つもの。ペプチドと標的タンパク質の間の相互作用に
より合成転写因子が形成される。これはトランス活性化ドメインによって上記選
択遺伝子のプロモーター領域中の認識配列に結合し、トランス活性化ドメインに
よって選択遺伝子の転写を刺激する。選択条件下（例えばアデニン陰性培地）で
は標的タンパク質に対して親和性を持つペプチドを発現させる酵母細胞だけがコ
ロニーを形成する（ＴｒｘＡ＝大腸菌チオレドキシンＡ；ＴＡＧ＝Ｈｉｓ−タグ
；ＮＬＳ＝核局在化シグナル）。
【図２】 図２は、上記「ペプチドアプタマー」システムでのＨＢＶコアタンパク質を結
合するペプチドの解析を示す図である。約２×１０6 個の酵母細胞をスクリーニ
ングすることにより、９個の陽性クローンを単離する。酵母コロニー（マスター
プレート（上）：１〜９＝陽性クローン；Ｋ＝ランダムに選択した対照クローン
）のレプリカ平板培養を、ＡＤＥ２（ＧＡＬ２プロモーター中のＧＡＬ４−ＢＳ
）、ＨＩＳ３（ＧＡＬ１プロモーター上のＧＡＬ４ＢＳ）およびＵＲＡ３（ＳＰ
Ｏ１３プロモーター上のＧＡＬ４−ＢＳ）についての選択下で行う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 16/44 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ホッペ−セイラー，フェーリクス ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69118 ヒルテナウエ 38 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 CA07 GA11 4C084 AA02 AA07 DC50 NA14 ZB262 ZB332 4C087 AA01 BC83 CA16 NA14 ZB26 ZB33 4H045 AA10 AA11 AA30 BA15 EA29 FA74

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ４０％までの配列変更を含んでもよい、以下のペプチド より選ばれるペプチド。
  2. 【請求項２】 該ペプチドが融合ポリペプチドとして存在するものである請
    求項１記載のペプチド。
  3. 【請求項３】 該融合ポリペプチドがリーダー配列を含んでなるものである
    請求項２記載のペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３いずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ
    。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
  6. 【請求項６】 請求項１〜３いずれかに記載のペプチドに対する抗体。
  7. 【請求項７】 １または複数の請求項１〜３いずれかに記載のペプチド、１
    または複数の請求項５に記載の発現ベクターおよび／または１または複数の請求
    項６に記載の抗体ならびに慣用の補助剤を含んでなる組成物。
  8. 【請求項８】 該ペプチドが融合ポリペプチドとして存在するものである請
    求項７記載の組成物。
  9. 【請求項９】 該融合ポリペプチドがリーダー配列を含んでなるものである
    請求項８記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 ＨＢＶコアタンパク質を阻害するための、請求項１〜３い
    ずれかに記載のペプチド、請求項５に記載の発現ベクターまたは請求項７〜９い
    ずれかに記載の組成物の使用。
  11. 【請求項１１】 該阻害がＨＢＶ複製の阻害を含む請求項１０記載の使用。
  12. 【請求項１２】 該ＨＢＶ複製がＨＢＶ関連疾患において存在するものであ
    る請求項１１記載の使用。
  13. 【請求項１３】 該ＨＢＶコアタンパク質を阻害してＨＢＶ関連疾患を治療
    する請求項１０〜１２いずれか記載の使用。
  14. 【請求項１４】 該ＨＢＶ関連疾患が慢性ＨＢＶ感染症、慢性肝炎および肝
    細胞癌を含むものである請求項１２または１３記載の使用。
JP2000593630A 1999-01-13 2000-01-12 Ｈｂｖコアタンパク質阻害用ペプチド Pending JP2002534111A (ja)

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DE19901009A DE19901009A1 (de) 1999-01-13 1999-01-13 Peptide zur Inhibierung von HBV-Core-Proteinen
DE19901009.9 1999-01-13
PCT/DE2000/000140 WO2000042063A2 (de) 1999-01-13 2000-01-12 Peptide zur inhibierung von hbv-core-proteinen

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JP2000593630A Pending JP2002534111A (ja) 1999-01-13 2000-01-12 Ｈｂｖコアタンパク質阻害用ペプチド

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