EP1071941A1 - Verfahren für differenzspektroskopische messungen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur differenz spektroskopischen und -fluorimetrischen Bestimmung der Wechselwirkung von Stoffen mittels einer eine Vielzahl von Näpfchen umfassenden Vorrichtung.

Description

Verfahren für differenzspektroskopische Messungen

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur differenzspektroskopischen und -fluorimetrischen Bestimmung der Wechselwirkung von Stoffen mittels einer Mikrotiterplatte sowie die Verwendung einer Mikrotiterplatte zur differenzspektoskopi- schen und -fluorimetrischen Bestimmung der Wechselwirkung von Stoffen.

Die spektrophotometrische Bestimmung von Substanzen in homogenen Lösungen spielt in einer Vielzahl von Bereichen eine Rolle, beispielsweise in der Umweltanalytik, der Grundlagenforschung, der medizinischen Diagnostik, der Forensik etc.. Im Rahmen dieser Bestimmungen werden Substanzen wie Nukleinsäuren, Proteine, Enzyme, deren Substrate etc. bestimmt, das heißt nachgewiesen und/oder quantifiziert. Häufig ist es dabei von Interesse, die Wechselwirkung verschiedener Stoffe miteinander zu bestimmen. Mittels der Differenzspektrophotometrie beziehungsweise -fluorimetrie können die Interaktionen von Stoffen miteinander aufgrund der geänderten spektralen beziehungsweise fluorimetrischen Eigenschaften erfaßt werden. Die spektralen beziehungsweise fluorimetrischen Änderungen werden entweder durch direkte Wechselwirkung der Stoffe untereinander oder durch bindungsinduzierte Konformationsänderungen verursacht. Ebenso können lösungs- mittelabhängige Konformationsänderungen erfaßt werden oder auch Aggregationsgleichgewichte in Abhängigkeit des Mediums und der Stoffkonzentration verfolgt werden.

Differenzspektrophotometrisehe beziehungsweise -fluorimetrische Messungen werden im allgemeinen mit Hilfe zweier Tandemküvetten, nämlich einer Proben- und einer Referenzküvette, durchgeführt. Eine Tande küvette enthält zwei durch ein vertikal angeordnetes Septum getrennte Kammern. Für differenz- spektrophoto etrische beziehungsweise -fluorimetrische Messungen wird die Lösung eines ersten Stoffes in gleicher Konzentration in je eine Kammer der Proben- und Referenzküvette gegeben. Die beiden anderen Kammern werden mit Pufferlösung gefüllt. Bei der anschließenden, mit einem horizontal ausgerichteten beide Kammern durchdringenden Lichtstrahl durchgeführten Messung müssen sich gleiche spektrophotometrische und fluorimetrische Eigenschaften bei beiden Tandemküvetten ergeben. Anschließend wird eine definierte Menge eines zweiten Stoffes in die Probenküvette zur Lösung des ersten Stoffes und die gleiche Menge in die mit Puffer gefüllte Kammer der Referenzküvette gegeben, damit die Ligandenab- sorption beziehungsweise Ligandenfluoreszenz kompensiert wird. Um Konzentrationsdifferenzen zu vermeiden, muß die gleiche Menge an Pufferlösung zur Lösung des ersten Stoffes in der Referenzküvette gegeben werden. Anschließend wird wie vorstehend beschrieben ein zweites Mal gemessen und die Werte verglichen. Aufgrund der zumeist geringen spektralen und fluorimetrischen Veränderungen ist diese Methode sehr empfindlich gegenüber Konzentrations- differenzen, weshalb die jeweiligen Zugaben des zweiten Stoffes bezüglich des Volumens gering zu wählen sind. Die Bestimmungsgrenze wird durch die Löslichkeit des Stoffes im Puffer vorgegeben. Schließlich muß beim Durchmischen der Stoffe darauf geachtet werden, daß keine Lösungen aus den Kammern entfernt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die vorgenannten Nachteile überwindet, insbesondere Konzentrationseffekte minimiert, um die Bestimmungsempfindlichkeit zu erhöhen, in der Lage ist, Stoffe mit geringer Löslichkeit zu untersuchen und Mischungsfehler zu verringern sowie ein schnelles, universell einsetzbares, parallelisier- tes und damit kostengünstiges Bestimmen von Wechselwirkungen von Stoffen ermöglicht.

Die vorliegende Erfindung löst das technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der differenzspektroskopischen und flu- orimetrischen Wechselwirkung von mindestens zwei unterschiedlichen Stoffen mittels einer eine Vielzahl von Näpfchen aufweisenden Mikrotiterplatte, wobei der Mikrotiterplatte ein Deckel mit mindestens einer einem Näpfchen zugeordneten Vertiefung zugeordnet ist, und wobei eine erste Lösung eines ersten Stoffes in ein Näpfchen, eine zweite Lösung eines zweiten Stoffes in die dem Näpfchen zugeordnete Vertiefung und eine dritte Lösung enthaltend ein Gemisch des ersten und zweiten Stoffes in eine weitere Vertiefung und/oder ein weiteres Näpfchen gegeben wird, so daß anschließend mittels vertika- ler Einstrahlung elektromagnetischer Wellen durch die befüllten Vertiefungen und Näpfchen die diffe- renzspektroskopische und/oder -fluorimetrische Bestimmung durchgeführt werden kann. Für diese Bestimmungen können herkömmliche Photometer und Flu- orimeter, das heißt ELISA beziehungsweise MTP- Reader, verwendet werden. Die Erfindung sieht also vor, daß in einem als Referenzbereich bezeichneten Bereich einer Mikrotiterplatte zwei unterschiedliche Stoffe getrennt voneinander vertikal übereinander angeordnet sind, während in einem Probenbereich der Mikrotiterplatte die Mischung der Stoffe lokalisiert ist und gleichzeitig gemessen werden kann.

Findet eine Wechselwirkung des ersten Stoffes mit dem zweiten Stoff statt, wobei es zur Änderung der spektralen und/oder fluorimetrischen Eigenschaften kommt, ändern sich die Extinktionskoeffizienten beziehungsweise das Fluoszenzverhalten zumindest eines Stoffes in der dritten Lösung, das heißt dem Gemisch der beiden Lösungen im Vergleich zur Messung der beiden getrennt vorliegenden Lösungen. Diese Änderungen des Extinktionskoeffizienten erlauben Rückschlüsse auf Stoff-Wechselwirkungen sowie Stoffeigenschaften und -Strukturen. Ohne Wechselwirkungen beziehungsweise beim Nullabgleich sind die Extinktionskoeffizienten beziehungsweise das Fluoreszenzverhalten konstant.

Bei erfindungsgemäß bevorzugten gleichen geometrischen Gegebenheiten der Näpfchen der Mikrotiterplatte und der Vertiefungen des Deckels sind, sofern keine Lösungen eingefüllt sind, die Absorptionen im Probenbereich, das heißt in dem Bereich der Mikrotiterplatte, in dem die das Gemisch der ersten und zweiten Lösung aufnehmende Vertiefung gelegen ist, und dem Referenzbereich, das heißt in dem Bereich der Mikrotiterplatte, in dem die erste und die zweite Lösung getrennt voneinander und übereinander in Vertiefung und Näpfchen angeordnet werden, gleich. Sollte die Geometrie der jeweiligen Näpfchen und/oder Vertiefungen unterschiedlich sein, muß also ein Geometriefaktor in die Bestimmung der Absorptionen mit einbezogen werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei die dritte Lösung hergestellt wird, indem eine Lösung des ersten Stoffes mit einer Lösung des zweiten Stoffes gemischt wird und dabei die Volumina und/oder Stoffkonzentrationen der für die Herstellung der dritten Lösung verwendeten beiden Lösungen jeweils gleich denen der ersten und zweiten Lösung sind.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein vorgenanntes Verfahren, wobei die Schichthöhe der dritten Lösung in dem Näpfchen oder der Vertiefung, in der sie sich befindet, gleich der Summe der Schichthöhen der ersten und zweiten Lösung in dem Näpfchen und der Vertiefung sind, in denen sie sich befinden.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, daß die Schichthöhen der eingefüllten ersten, zweiten und/oder dritten Lösung standardisiert sind, das heißt daß die Bildung von Menisken oder Meßfehler aufgrund unterschiedlicher Einfüllhöhen der Lösungen vermieden werden, durch die erfindungsgemäß vorgesehene Verwendung eines Deckels mit mindestens einer Vertiefung, wobei das Bodenteil dieser Vertiefung eine definierte Distanz des Lichtweges in dem Näpfchen von Bodenteil des Näpfchens zum Bodenteil der darüber angeordneten Vertiefung bereitstellt.

Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung einer Mikrotiterplatte vor, die eine Vielzahl von Näpfchen aufweist, wobei die Mikrotiterplatte zumindest teilweise von einem Deckel abgedeckt ist, der mindestens eine einem Näpfchen zugeordnete Vertiefung aufweist. Derartige Probenträgersysteme werden in ihren wesentlichen Merkmalen beispielsweise in der DE 44 05 375 AI beschrieben, die hinsichtlich der Herstellung und des Aufbaus solcher Probenträgersysteme in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen wird.

Die Erfindung verwendet also ein Probenträgersystem, das zwei Elemente, nämlich eine Mikrotiterplatte und einen dieser Mikrotiterplatte zugeordneten Deckel umfaßt.

Der Deckel umfaßt mindestens eine eine oder mehrere Seitenwände und ein Bodenteil aufweisende Vertiefung, vorzugsweise eine Vielzahl von Vertiefungen, die jeweils aus Seitenwänden und einem Bodenteil aufgebaut sind und über eine Grundplatte und/oder ein Rahmenteil miteinander verbunden sind. Der Dek- kel kann die Mikrotiterplatte teilweise oder vollständig abdecken, wobei vorgesehen sein kann, daß nur Bereiche des Deckels Vertiefungen enthalten, denen Näpfchen zugeordnet sind, wobei andere Bereiche des Deckels eben sind. Der Deckel ist der Mikrotiterplatte derart zugeordnet, daß er beispielsweise auf diese gesteckt oder gelegt werden kann, wobei die Vertiefungen des Deckels von oben in die Öffnungen der Näpfchen der Mikrotiterplatte hineinragen oder in diese eingreifen, also diesen zugeordnet sind. Der Deckel kann aber auch auf- und zuklappbar, beispielsweise mittels Scharnieren, an der Mikrotiterplatte angebracht sein, mit dieser einstückig ausgebildet oder ihr sonstwie fest zugeordnet sein, wobei in letzteren beiden Ausführungsformen jeweils eine Einfüllöffnung zum Beschicken der Näpfchen vorzusehen ist.

In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß der Deckel nur eine einzige Vertiefung aus Bodenteil, Seitenwänden und gegebenenfalls umlaufendem umgebogenem Rand oder Kragen aufweist, wobei die Grundplatte des Deckels planar vollständig oder teilweise die restliche Mikrotiterplatte überdeckt. Dieser Deckel mit nur einer einzelnen Vertiefung kann in Kombination mit verschiedenen Mikrotiter- platten zum Einsatz kommen. Bei Verwendung von Mi- krotiterplatten mit herkömmlicher Näpfchenform oder entsprechend geformter Näpfchen neuartiger Mikroti- terplatten dient der obere Rand beziehungsweise Kragen des Deckels als Auflagefläche auf der Mikrotiterplatte. Auch der Boden des Deckels der vorliegenden Erfindung kann, bei angepaßter Näpfchenform der Mikrotiterplatte, als Auflagefläche auf der Mikrotiterplatte ausgenutzt werden. Die Grundplatte des Deckels kann als Steg ausgeführt sein und/oder vorteilhafterweise ein die Mikrotiterplatte ganz oder teilweise umfassendes Rahmenteil umfassen, das dem Aufstecken des Deckels auf eine Mikrotiterplatte dient und den Deckel ortsfest auf der Mikrotiterplatte hält. Der Deckel kann die Vertiefungen in Form einer Reihe enthalten, das heißt aus hintereinander angeordneten Vertiefungen aufgebaut sein. Es kann aber auch vorgesehen sein, daß der Deckel Vertiefungen in Form einer Matrix enthält. Die Erfindung sieht selbstverständlich auch vor, daß ein derartiger Deckel nur Bereiche, beispielsweise eine Reihe einer Mikrotiterplatte bedeckt, das heißt dieser zugeordnet ist. Demgemäß kann einer Näpfchen-Reihe einer Mikrotiterplatte ein Deckel, der in Reihenform ausgeführt ist, zugeordnet sein. Es kann aber auch vorgesehen sein, einer beispielsweise als Matrix ausgeführten Mikrotiterplatte einen als Matrix ausgeführten Dek- kel zuzuordnen, der sämtliche Näpfchen der Mikrotiterplatte bedeckt. Die konkrete Ausbildung des Dek- kels richtet sich nach der Gestaltung der eingesetzten, herkömmlichen oder neu konstruierten, Mikrotiterplatte .

Insbesondere ist es bevorzugt, das Verfahren mit einem Deckel für die Mikrotiterplatte auszuführen, der einen Teil der Näpfchen der Mikrotiterplatte planar, das heißt ohne Vertiefungen überdeckt, und so einen Probenbereich der darunter liegenden Mikrotiterplatte bildet, wobei ein anderer Teil des Deckels einzelnen Näpfchen zugeordnete Vertiefungen umfaßt und den Referenzbereich der Mikrotiterplatte abdeckt. In den Probenbereich der Mikrotiterplatte, der also keine übereinander angeordnete Lokalisation von Proben zuläßt, wird die dritte Lösung, also das Gemisch des ersten und zweiten Stoffes eingefüllt, während in die Näpfchen des Referenzbereichs, in die jeweils die Vertiefungen hineinragen, übereinander angeordnet die erste und die zweite Lösung getrennt voneinander eingefüllt werden können.

Selbstverständlich ist es jedoch auch möglich, einen Deckel vorzusehen, der im Probenbereich einer Mikrotiterplatte Vertiefungen aufweist. Dabei kann es erfindungsgemäß auch vorgesehen sein, die dritte Lösung ausschließlich in die Vertiefung des Deckels und nicht in das Näpfchen selbst oder aber in beide, das heißt das Näpfchen und die ihm zugeordnete Vertiefung einzufüllen.

Ein Merkmal der erfindungsgemäß eingesetzten Deckel ist es, daß diese jeweils eine Vertiefung für jeweils ein dieser Vertiefung zugeordnetes Näpfchen dergestalt bereitgestellt, daß das Bodenteil der Vertiefung in oder auf der Öffnung des Näpfchens angeordnet ist und eine definierte lichte Weite beziehungsweise Distanz zwischen Bodenteil des Näpfchens und Bodenteil der Vertiefung bereitstellt, die teilweise oder vollständig durch Probenflüssigkeit aufgefüllt wird. Demgemäß wird in vorteilhafter Weise eine definierte Schichtdicke beziehungsweise Schichthöhe der zu untersuchenden Probe bereitgestellt, da der Lichtstrahl unabhängig von Einfüllhöhe und Meniskenbildung einen definierten Weg vertikal innerhalb der Probe zurücklegt. Daher muß die Vertiefung so ausgebildet sein, daß keiner- lei Probenflüssigkeit aus dem Näpfchen in diese gelangen kann, das heißt die Vertiefung muß nach unten und zur Seite hin flüssigkeitsdicht und demgemäß von, beispielsweise einstückig miteinander ausgebildeten, Seitenwänden und einem Bodenteil umschlossen sein, wobei vorteilhafterweise nach oben eine Öffnung bleibt. Die Abmessung und Geometrie der Vertiefungen sind beliebig und hängen besonders von der Abmessung und Geometrie der Näpfchen ab. Es kann erfindungsgemäß auch vorgesehen sein, die Vertiefung des Deckels beispielsweise als eine Beschickungsöffnung aufweisenden allseits umschlossenen Hohlkörper auszuführen.

Die lichte Höhe der Näpfchen der Mikrotiterplatte, das heißt die Distanz vom Boden des Näpfchens bis zu dessen oberer Kante, wird durch das in die Näpfchen eingreifende Bodenteil der Vertiefung reduziert. Da in vorteilhafter Weise vorgesehen sein kann, daß sämtliche oder viele Vertiefungen des Deckels ebenso wie die Näpfchen die gleichen Abmessungen und Geometrien aufweisen, werden sämtliche durch die Bodenteile der Vertiefungen teilweise abgedeckten Näpfchen im Hinblick auf die Weglänge des die Näpfchen vertikal durchdringenden Lichtstrahls standardisiert, das heißt die Schichtdicke beziehungsweise Schichthöhe, also die vom vertikal durchdringenden Lichtstrahl durchmessene Distanz in dem vollständig gefüllten Näpfchen beziehungsweise der Vertiefung in allen abgedeckten Näpfchen wird auf eine identische Größe gebracht, wodurch eventuell vorhandene Unterschiede in der Einfüllhöhe oder der Meniskenbildung nivelliert werden. Dabei kann in besonders vorteilhafter Weise vorgesehen sein, daß die Querschnittsfläche des Näpfchens, das heißt die Fläche quer zur Einfüllhöhe, auf der Höhe des Näpfchens, auf der das Bodenteil der Vertiefung angeordnet ist, größer als die Fläche des Bodenteils der Vertiefung ist. Die Folge davon ist, daß das Bodenteil nicht die gesamte lichte Weite des Näpfchens in seiner Öffnung abdeckt, sondern nur einen Teil davon, so daß in dem Näpfchen vorhandene Probenflüssigkeit nach oben verdrängt werden kann, wobei trotzdem ein bezüglich seiner Länge standardisierter Strahlenweg gewährleistet ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Mikrotiterplatte eine eine Vielzahl von Näpfchen aufweisende Platte verstanden, wobei die Näpfchen zur Aufnahme von Proben dienen, die einer spektrophotometrischen oder fluorimetrischen Bestimmung unterzogen werden sollen. Die Platte und die Näpfchen können einstückig miteinander ausgebildet sein, es kann aber auch vorgesehen sein, die Näpfchen als separate Einheiten oder als zusammengefaßte Einheiten in einer Platte und/oder einem Rahmenteil herausnehmbar oder nicht herausnehmbar anzuordnen. Demgemäß wären Platten und/oder Rahmen als Halterung für Küvetten beziehungsweise Näpfchen oder Küvetteneinheiten beziehungsweise -verbünde ausgeführt. Die Näpfchen können in Form von einfachen Vertiefungen, wells, Mulden, Küvetten, Röhrchen oder ähnlichem ausgeführt sein, wobei deren Querschnitt ebenfalls beliebig ist und demgemäß beispielsweise kreisförmig, polygonal, quadratisch, rechteckig oder oval ausgeführt ist. Die Anzahl der Näpfchen pro Mikrotiterplatte kann beliebig sein, wobei üblicherweise die Näpfchen in Form einer Ma- trix, beispielsweise mit 96, 384 oder 1536 Näpfchen, ausgebildet sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Mikrotiterplatte aber auch die Anordnung von Näpfchen in Reihe, das heißt nicht in Form einer Matrix, verstanden, wobei demgemäß beispielsweise 8 Näpfchen aufweisende Platten oder 8 Näpfchen aufweisende jeweils über Stege miteinander verbundene Platten ebenfalls als Mikrotiterplatten bezeichnet werden. Die Näpfchen der Mikrotiterplatte weisen im allgemeinen nach oben hin eine Öffnung auf, so daß die Proben eingefüllt werden können. Die Näpfchen werden zur Seite hin durch Seitenwände und nach unten hin durch ein Bodenteil gebildet, wobei diese Elemente einstückig miteinander ausgeführt sein können.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Stoff ein Analyt verstanden, der mittels spektrophotometrischer oder fluorimetrischer Verfahren bestimmbar, also nachweisbar und/oder quantifizierbar, ist, das heißt als Chromophor wirkt. Ein derartiger Analyt kann beispielsweise ein Protein, ein Peptid, ein Protein- oder Peptin- derivat, ein Metallkomplex, ein Ligand, ein Farbstoff, eine Nukleinsäure oder eine sonstige nieder- oder makromolekulare Verbindung sein. Die erfindungsgemäß einzusetzenden Mikrotiterplatten können aus beliebigem Material sein, beispielsweise aus Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polypropylen, Quarzglas oder ähnlichem. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, Mikrotiterplatten mit beschichteten Näpfchen einzusetzen. Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren zur Verfügung, das eine universell einsetzbare, schnelle, parallele und damit kostengünstige Untersuchung von Wechselwirkungen unterschiedlicher Stoffe ermöglicht. Es wird damit vorteilhaft möglich, Eigenschaften von Stoffen mit geringen Halbwertzeiten zu erfassen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß Konzentrationseffekte, die die Empfindlichkeit herabsetzen, minimiert werden und zudem Stoffe mit geringer Löslichkeit besser untersucht werden können. Schließlich werden Mischungsfehler, die bei der herkömmlichen Verfahrensweise auftreten, verringert.

Die Erfindung betrifft auch eine der vorstehend beschriebenen Mikrotiterplatten, also eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfchen, wobei der Mikrotiterplatte ein Deckel mit mindestens einer einem Näpfchen zugeordneten Vertiefung zugeordnet ist und wobei der Deckel eine die mindestens eine Vertiefung aufweisenden Deckelgrundplatte und eine, vorzugsweise im wesentlichen ebene, Dek- keloberplatte umfaßt und wobei die Deckeloberplatte vertikal zu der Deckelgrundplatte bewegbar ist und der Abdeckung der Vertiefung in der Deckelgrundplatte dient. Eine derartige Vorrichtung ist vorteilhaft insofern, als daß definierte Schichthöhen sowohl in den Näpfchen der Mikrotiterplatte als auch in der Vertiefung des Deckels ermöglicht werden kann.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer eine Vielzahl von Näpfchen aufweisenden Mikrotiterplatte mit einem Deckel, wobei der Deckel minde- stens eine einem Näpfchen zugeordnete Vertiefung aufweist, zur Durchführung eines Verfahrens zur differenzspektroskopischen oder -fluorimetrischen Bestimmung der Wechselwirkung von Stoffen, wobei in bevorzugter Weise der Deckel aus zwei vertikal zueinander beweglichen Platten besteht, wovon die untere Platte die Vertiefungen ausbildet.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausfüh- rungsbeispiele und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.

Die Figuren zeigen:

Figur 1 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer erfindungsgemäß verwendeten Mikrotiterplatte mit Deckel,

Figur 2 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäß verwendeten Mikrotiterplatte mit Deckel,

Figur 3 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer weiteren Ausführungsform einer erfindungsgemäß verwendeten Mikrotiterplatte mit Deckel,

Figur 4 einen vertikalen Schnitt durch einen Teil einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäß verwendeten Mikrotiterplatte mit Deckel in geöffnetem und geschlossenem Zustand. Im folgenden werden bau- oder funktionsgleiche Teile mit denselben Bezugszeichen versehen.

Die Figur 1 zeigt eine Mikrotiterplatte 2 mit einem Deckel 1. Die Mikrotiterplatte 2 weist zylindrische nach oben offene Näpfchen 11 auf, die aus jeweils einem Bodenteil 13 und Seitenwänden 15 aufgebaut sind. Der Deckel 1 weist zumindest eine einem Näpfchen 11 zugeordnete zylindrische, nach oben offene Vertiefung 17 auf, wobei die Vertiefung 17 ein Bodenteil 21 und Seitenwände 19 aufweist. Dargestellt ist auch die Grundplatte 23 des Deckels 1 der weitere nicht dargestellte Vertiefungen 17 miteinander verbindet und eine exakte Positionierung beziehungsweise Zuordnung der Vertiefungen 17 in den Näpfchen 11 gewährleistet. Der Deckel 1 ist so ausgebildet, daß zumindest ein Näpfchen 11 von einer ebenen, keine Vertiefung aufweisenden Fläche 25 überdeckt ist, während ein weiteres Näpfchen 11 die Vertiefung 17 des Deckels aufnimmt. Bei auf die Mikrotiterplatte 2 aufgesetztem Deckel 1 bilden sich in dem in der Figur 1 linken Näpfchen 4 also zwei vertikal übereinander angeordnete Kammern, nämlich das untere Lumen des Näpfchens 11 sowie das Lumen der Vertiefung 17. Diese Anordnung der Vertiefung 17 im Lumen des Näpfchens 11 kann der getrennten Aufnahme der Lösungen dienen und wird als Referenzbereich 6 bezeichnet. In den Bereichen der Mikrotiterplatte 2, in denen der Deckel 1 eben ausgeführt ist und keine Vertiefung in das Lumen eines darunter befindlichen Näpfchens 11 hineinragt, bildet sich im Lumen des Näpfchens 11 keine getrennte Ko - partimentierung aus. Dieser Bereich wird als Probenbereich 7 bezeichnet. Das Lumen des Näpfchens 11 im Probenbereich 7 ist über seine gesamte Höhe und Innenumfang mit einer Seitenwandverdickung 28 versehen. Diese Wandverdik- kung reduziert die Querschnittsfläche des Lumens auf die im unteren Bereich des Lumens im Näpfchen 11 des Referenzbereichs 6.

Dargestellt ist auch eine um den gesamten Näpfchen- innenumfang verlaufende Seitenwandverdickung 27 im unteren Bereich des Lumens des Näpfchens 11 im Referenzbereich 6. Diese Verdickung dient dazu, die Querschnittsfläche im unteren Bereich des Lumens des Näpfchens 11 genauso groß auszuführen wie die Querschnittsfläche der darüber angeordneten Vertiefung 17.

Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Bestimmung der Wechselwirkung zweier Stoffe A und B eine Lösung 3 von Stoff A in die Vertiefung 17 des Deckels 1 gegeben und eine Lösung 4 des Stoffes B in das Lumen des Näpfchen 11 unterhalb der Vertiefung 17, wobei das Volumen der Lösung 4 so gewählt ist, daß die Flüssigkeitsoberkante unterhalb des Bodenteils 21 der Vertiefung 17 liegt. In den Probenbereich 7, das heißt in das Näpfchen 11, dem keine Vertiefung 17 zugeordnet ist, wird eine dritte Lösung 5 enthaltend ein Gemisch von Lösungen der Stoffe A und B eingefüllt, wobei jeweils gleiche Volumina, Konzentrationen und sonstige Parameter gewählt werden, wie sie bereits für die Lösungen im Referenzbereich 6 verwendet wurden. Es ergibt sich aufgrund gleicher Vertiefungs- und Näpfchengeome- trie im Probenbereich eine Schichthöhe, die den ad- dierten Schichthöhen der Lösungen 3 und 4 im Referenzbereich 6 gleicht. Die Anzahl und Dicke der vom Lichtstrahl zu durchdringenden Glas- oder Kunststoffböden sowie der außerhalb der Lösungen durchmessene Lichtweg ist im Proben- und Referenzbereich identisch. Nach gegebenenfalls notwendiger Durchmischung der Lösung im Probenbereich 7 können nun mittels eines Spektrophotometers, zum Beispiel eines MTP-Readers, oder eines Fluoreszenzmeßgerätes die Wechselwirkung der Stoffe A und B analysiert werden, indem eine vertikale von unten nach oben oder von oben nach unten erfolgende Analyse der spektralen oder fluorimetrischen Eigenschaften vergleichend den Referenzbereich 6 mit dem Probenbereich 7 durchgeführt wird (siehe Doppelpfeile) . Sind die fluorimetrischen oder spektrophotometri- schen Eigenschaften der vertikal im Referenzbereich 6 bestimmten getrennten ersten und zweiten Lösungen 3 und 4 gleich denen der im Probenbereich 7 befindlichen dritten Lösung 5, liegt keine Wechselwirkung vor, andernfalls wirken die Substanzen A und B miteinander Wechsel.

Die in Figur 2 für das erfindungsgemäße Verfahren dargestellte Mikrotiterplatte 2 mit dazugehörigem Deckel 1 entspricht im wesentlichen der Vorrichtung nach Figur 1. Anders als in Figur 1 unterscheidet sich hier jedoch der Probenbereich nicht von dem Referenzbereich 6, das heißt, der Deckel 1 ist in seinem gesamten Bereich gleich aufgebaut, so daß jedem Näpfchen 11 eine Vertiefung 17 so zugeordnet ist, daß diese in das Lumen des Näpfchens 11 hineinragt. Referenzbereich 6 und Probenbereich 7 werden lediglich durch die Art der Befüllung der Napf- chen 11 und Vertiefungen 17 definiert. Der Referenzbereich 6 der Mikrotiterplatte 2 liegt dort vor, wo die Lösungen 3, 4 der Proben A und B getrennt und übereinander vertikal bestimmt werden, nämlich im unteren Bereich des Lumens eines Näpfchen 11 und im darüberliegenden Lumen der Vertiefung 17. Der Probenbereich 7 der Mikrotiterplatte 2 befindet sich dort, wo die dritte Lösung 5 als Gemisch der Lösungen 3 und 4 eingefüllt wird. Dies kann der untere Bereich des Lumens 11 ebenso wie die Vertiefung 17 sein, die diesem Näpfchen 11 zugeordnet ist. Möglich ist es auch, die dritte Lösung 5 auf Vertiefung 17 und Näpfchen 11 zu verteilen. Auch hier ist die vertikal zur Mikrotiterplat- tengrundflache erfolgende Einstrahlung des Lichtes durch einen Doppelpfeil angedeutet.

In der Figur 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäß zu verwendende Mikrotiterplatte 2 und deren Deckel 1 angegeben, wobei im Unterschied zu der Vorrichtung der Figuren 1 und 2 Näpfchen 11 und Vertiefungen 17 verwendet werden, die sich von oben nach unten verjüngen, das heißt, daß ihre jeweiligen Bodenteile 21 und 13 eine geringere Querschnittsfläche als im oberen Bereich ihrer Lumen aufweisen.

Die Figur 4 stellt ebenfalls eine Mikrotiterplatte 2 mit einem Deckel 1 dar, wobei die linke Abbildung der Figur 4 diese Vorrichtung in einem Zustand zeigt, in dem der Deckel 1 noch nicht auf die Mikrotiterplatte 2 gesetzt wurde, während die rechte Abbildung den auf die Mikrotiterplatte 2 aufgesetz- ten Deckel 1 zeigt. Diese Mikrotiterplatte weist einen zweigeteilten Deckel 1 auf.

Das zylindrische Näpfchen 11 im Referenzbereich 6 der Mikrotiterplatte 2 weist in seinem unteren Bereich um seinen Umfang in das Lumen nach innen reichend eine Seitenwandverdickung 29 auf, die sich nach oben bis in etwa die Hälfte der Höhe des Näpfchens 11 erstreckt. Im Probenbereich 7 der Mikrotiterplatte 2 ist ebenfalls eine derartige Seitenwandverdickung 31 eines zylindrischen Näpfchens 11 vorgesehen, die sich allerdings nach oben bis knapp über den oberen Rand 55 der Mikrotiterplatte 2 fortsetzt. In beiden Fällen dient die Wandverdik- kung 29 beziehungsweise 31 der Lumenverkleinerung. In ihren oberen Begrenzungsbereichen weisen beide Wandverdickungen 29 und 31 ringförmige Pufferkanäle oder -betten 39 und 41 auf.

Der Deckel 1 ist zweiteilig aus einer Deckelgrundplatte lb und einer darüber angeordneten, zumindest in vertikaler Richtung bewegbaren ebenen Dek- keloberplatte la ausgeführt. Die Platten la und lb können über Schraub- oder Klemmverbindungen, Scharniere oder ähnliches miteinander verbunden sein. Die Platte la kann auch nur auf die Deckelgrundplatte lb aufgelegt sein. Die Deckelgrundplatte lb formt die zylindrische Vertiefung 17, also deren Seitenwände 19 und den Bodenteil 21, aus. Die Ver- tefung 17 ist ringförmig von einem durch eine ringförmige Wand 42 von der Vertiefung getrenntes Pufferbett 35 umgeben. Die Querschnittsfläche des Bodenteils 21 entspricht der Querschnittsfläche des lichten Lumens des Bodenteils 13 der Näpfchen 11. In einem anderen Bereich der Deckelgrundplatte lb ist keine Vertiefung 17, sondern statt dessen eine ebene Fläche 37 vorgesehen.

Der Deckel 1 wird so auf die Mikrotiterplatte 2 gesetzt, daß die Vertiefung 17 in das Lumen eines im Referenzbereich 6 befindlichen Näpfchens 11 ragt, also in ein Näpfchen 11, dessen Wandverdickung 29 nur bis etwa zur Hälfte seiner Höhe reicht. Der ebene Bereich 17 der Deckelgrundplatte lb schließt im geschlossenen beziehungsweise aufgelegten Zustand im Probenbereich 7 das Lumen des Näpfchens 11 nach oben ab, dessen Wandverdickung 31 bis knapp über den oberen Rand 55 der Grundplatte 23 der Mikrotiterplatte 2 reicht.

Wird nun eine Lösung 3 in die Vertiefung 17 im Referenzbereich 6, eine Lösung 4 in den unteren Bereich des Lumens von Näpfchen 11 im Referenzbereich 6 und die dritte Lösung 5 in den Probenbereich 7 eines anderen Näpfchens 11 gefüllt und der Deckel aufgesetzt, setzt das Bodenteil 21 der Vertiefung 17 direkt auf der Oberkante 57 der Wandverdickung 29 im unteren Bereich des Näpfchens 11 auf oder schließt mit diesem ab und verhindert, sofern genügend Probenflüssigkeit 4 eingefüllt ist, eine störende Meniskenbildung und unterschiedliche Füllhöhen. So wird eine definierte Schichthöhe bereitgestellt. Eine baugleiche Anordnung in weiteren, nicht dargestellten Näpfchen 11 ermöglicht eine Standardisierung der Schichthöhen und so eine Verringerung von Meßfehlern. Möglicherweise beim Probeneinfüllen oder Deckelaufsetzen herausgedrückte Probenflüssigkeit 4 wird in das ringförmig in den oberen Bereich der Wandverdickung 29 eingeformte Pufferbett 39 abgeleitet. Ebenso liegt im geschlossenen Zustand die ebene Fläche 37 der Deckelgrundplatte lb auf der Oberkante 59 der Wandverdickung 31 des Näpfchens 11 im Probenbereich 7, um so bei geeigneter Füllhöhe eine Meniskenbildung und unterschiedliche Füllhöhen zu verhindern und eine definierte Schichthöhe zu gewährleisten. Gegebenenfalls herausgedrückte dritte Lösung 5 wird in das ringförmig ausgeführte Pufferbett 41 im oberen Bereich der Verdickung 31 abgeleitet. In geschlossenem Zustand ist das Deckeloberteil la auf die Deckelgrundplatte lb gelegt und gegebenenfalls fixiert, wobei das Deckeloberteil la mit der Oberkante 43 der Wand 42 abschließt und bei voller Befüllung störende Meniskenbildung und unterschiedliche Füllhöhen verhindert. Eventuell herausgedrückte Probenflüssigkeit 3 wird in das in der Deckelgrundplatte lb ringförmig um die Vertiefung 17 ausgeführte Pufferbett 35 abgeleitet. Auf diese Weise wird erreicht, daß das Licht ohne Fehlerquellen wie unterschiedliche Füllhöhen oder Meniskenbildung sowohl die getrennten Lösungen 3 und 4 als auch die dritte Lösung 5 durchdringen kann.

Die Vorrichtung nach Figur 4 ermöglicht also das Durchführen erfindungsgemäßer Verfahren mit standardisierten Schichthöhen sowohl im Referenz- als auch im Probenbereich 6, 7 und eignet sich daher besonders für eine parallelisierte effiziente und genaue differenzspektroskopische oder -fluorimetrische Messung. Als besonders vorteilhaft erweist sich die durch den zweigeteilten Deckel 1 ermöglichte Standardisierung der Schichthöhen auch in der Vertiefungen 17 des Deckels 1. Erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung dieser Vorrichtung, also einer Vorrichtung mit einer Einrichtung, zum Beispiel einer ebenen Platte la, zur Standardisierung der Schichthöhe in einer Vertiefung 17 des Deckels 1, sind also vorteilhaft und für automatisierte Bestimmungen besonders geeignet.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur differenzspektroskopischen oder -fluorimetrischen Bestimmung der Wechselwirkung von mindestens zwei unterschiedlichen Stoffen mittels einer eine Vielzahl von Näpfchen aufweisenden Mikrotiterplatte, wobei der Mikrotiterplatte ein Dek- kel mit mindestens einer einem Näpfchen zugeordneten Vertiefung zugeordnet ist und wobei eine erste Lösung eines ersten Stoffes in ein Näpfchen, eine zweite Lösung eines zweiten Stoffes in die dem Näpfchen zugeordnete Vertiefung und eine dritte Lösung enthaltend ein Gemisch des ersten und zweiten Stoffes in eine weitere Vertiefung und/oder ein Näpfchen gegeben und anschließend die differenz- spektroskopische oder -fluorimetrische Bestimmung mittels vertikaler Einstrahlung elektromagnetischer Wellen durch die Näpfchen und Vertiefungen durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die dritte Lösung hergestellt wird, indem eine Lösung des ersten Stoffes mit einer Lösung des zweiten Stoffes gemischt wird und dabei die Volumina und/oder Stoffkonzentrationen der beiden Lösungen jeweils gleich denen der ersten und zweiten Lösung sind.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schichthöhe der dritten Lösung in dem Näpfchen und/oder der Vertiefung gleich der Summe der Schichthöhen der ersten und zweiten Lösung in Näpfchen und Vertiefung ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schichthöhen der eingefüllten ersten, zweiten und/oder dritten Lösung standardisiert sind.

5. Vorrichtung, insbesondere für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend eine eine Vielzahl von Näpfchen 11 aufweisende Mikrotiterplatte 2, wobei der Mikrotiterplatte 2 ein Deckel 1 mit mindestens einer einem Näpfchen 11 zugeordneten Vertiefung 17 zugeordnet ist, wobei der Deckel 1 eine die mindestens eine Vertiefung umfassende Dek- kelgrundplatte lb und eine Deckeloberplatte la aufweist und wobei die Deckeloberplatte la vertikal zu der Deckelgrundplatte lb bewegbar ist.