EP1054899A2 - Mittel zur therapie von menschlichen erkrankungen, ausgehend von beta-catenin, seine herstellung und seine verwendung - Google Patents

Mittel zur therapie von menschlichen erkrankungen, ausgehend von beta-catenin, seine herstellung und seine verwendung

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Publication number
EP1054899A2
EP1054899A2 EP99913097A EP99913097A EP1054899A2 EP 1054899 A2 EP1054899 A2 EP 1054899A2 EP 99913097 A EP99913097 A EP 99913097A EP 99913097 A EP99913097 A EP 99913097A EP 1054899 A2 EP1054899 A2 EP 1054899A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
catenin
lef
peptides
tcf
interaction
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99913097A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Walter Birchmeier
Jens-Peter Von Kries
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft filed Critical Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Publication of EP1054899A2 publication Critical patent/EP1054899A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to agents for the therapy of human diseases based on substances that interact with ß-catenin with transcription factors and
  • Affect tumor suppressor gene products are LEF-1- / TCF-4-
  • It also relates to a method for finding such substances and the use of the agent, preferably for the therapy of tumors such as colon cancer and
  • ⁇ -catenin is a cytoplasmic protein with various functions in the cell.
  • ß-catenin establishes the connection to the cytoskeleton (Hülsken, J. et al., E-cadherin and APC compete for the interaction with beta-catenin and the cytoskeleton. J-Cell-Biol. 127: 2061-9, 1994).
  • ß-catenin is a component of Wnt signal transduction that plays a major role in embryonic development.
  • the transcription factor LEF-1 was identified as an interaction partner of ⁇ -catenin in this signal cascade (Behrens, J.
  • a prerequisite for this ß-cateiiin-dependent signal transduction is the stabilization of the cytoplasmic pool of free, not cadherin-bound ß-catenin. This pool is negatively regulated by the glycogen synraetase kinase 3ß, by the tumor suppressor gene product APC and by Conductin / Axin.
  • APC mutations have been identified in the vast majority of colon cancers, while non-APC-deficient tumors have mutations in the ß-catenin gene.
  • the result of these mutations of APC or ß-catenin is the activation of signal transduction by the ß-catenin-LEF / TCF complex. It underlines the key role of ß-catenin in tumor development. Since APC mutations have been identified as an early event in the development of colon tumors, the activation of the ß-catenin-LEF / TCF complex is probably a key step in tumor development.
  • WO 98/42296 (Onyx Pharmaceuticals Inc. - Rubinfeld) relates to compositions and methods for the diagnosis and treatment of diseases which are triggered by ⁇ -catenin / transcription factor interactions.
  • the main claim relates to the isolated, stabilized ⁇ -catenin and its fragments, but such fragments have not been specified.
  • the aim of the invention described here is, firstly, to provide new agents for the treatment of carcinomas or aberrant tissue and organ development. It is based on the special task of influencing the interaction of ⁇ -catenin with LEF / TCF T ⁇ inscription factors as a prerequisite for the translocation and the activity of the complex in the cell nucleus. This modulation should be specific, ie it must not interfere with other interactions of ⁇ -catenin (eg with APC, Conductin or E-cadherin).
  • Another object of the invention is to develop ELISA methods for screening substance libraries to find molecules (inter alia peptides, organic compounds) which only influence one interaction of the ⁇ -catenin in a highly specific manner.
  • the binding domains of the LEF / TCF transcription factors for ⁇ -catenin were identified (Fig. 1). They are the starting point for the extraction of the peptides and similar molecules according to the invention. These peptides preferably consist of 10-20 amino acid long sequences from the N-terminal region of LEF-1 or TCF-4 (Fig. 2). The peptides are particularly preferred
  • peptides in which the acidic amino acids are arranged at a distance of 5 amino acids and flanked by hydrophobic and basic amino acids (Fig. 2).
  • these peptides can be used for tumor therapy, for which two basic ways are possible.
  • a direct use of the peptides for the treatment of tumors is generally out of the question because of their instability towards proteases and because of the lack of membrane permeability. Stabilization is achieved by coupling with a second peptide, for which the so-called Antennapedia peptide RQffilWFQNRRMEWEE is excellently suitable.
  • This peptide is able to transport peptides up to 100 amino acids long through cell membranes into the cytoplasm and the cell nucleus.
  • the coupled peptides can advantageously be used in tumor therapy.
  • the peptides according to the invention also serve as a basis for the design of substances which, through targeted modification, increase the stability and effectiveness in the cell (eptidomimetics). For example, this can be done by introducing reactive groups, exchanging amino acids or introducing non-hydrolyzable peptide-like bonds.
  • the stability of the molecules can also be increased by replacing the carbon skeleton of the peptides with synthetic carbon skeletons with the same arrangement of functional groups (non-peptidomimetics).
  • This molecular mimicry of the biological activity of the inhibitory peptides derived from the minimal binding domain of LEF-1 / TCF for ⁇ -catenin enables the production of more potent agents for tumor therapy.
  • ⁇ -catenin In a second step for realizing the invention, the regions of ⁇ -catenin were identified which are responsible for the specific bindings to LEF-I / TCF-4, APC (domains containing 20 and 15 amino acid repeats), conductin and E-cadherin . It was found that these regions partially overlap and relate to the A ⁇ nadillo domains 3-8 of ß-catenin (Fig. 5 and 6).
  • the key point of this step is that mutations of ⁇ -catenin have been generated which prevent specific interactions with individual partners. The following mutations are involved, based on the partial sequence of ß-catenin described in the Appendix (Tab. 1):
  • Wnt signal transduction and its components also play a role in the development and maintenance of tissues and organs, e.g. from certain regions of the brain, extremities, kidney and skin.
  • the tissue-specific elimination of the ß-catenin gene in the mouse shows that ß-catenin is important for the development of the skin and especially the hair.
  • the invention also extends to methods of promoting skin and hair development through increased expression of ⁇ -catenin (or of more stable ⁇ -catenin). This can be achieved, for example, by inhibiting the interaction with APC or Conductin.
  • inhibitors of the ⁇ -catenin / APC or the ⁇ -catenin / conductin interaction can be used in order to achieve increased ⁇ -catenin concentrations in cells and tissues.
  • Conductin which is a protein analogous to Axin, also requires the breakdown of ß-catenin.
  • Inhibitors of the ß-catenin / APC and ß-Catemn / Condin interaction can be used to intervene in organ development processes. For example, the hair development in humans could be demanded locally.
  • the 'yeast 2 hybrid system' was used to identify the minimal binding domain (Fig. 1).
  • the minimal binding domain could be limited to the N-terminal amino acids 11-27 of LEF-1, which corresponds to the amino acids 7-29 in TCF-4 (Fig.2).
  • the interaction of N-terminal LEF-1 fragments with ⁇ -catenin was determined on the basis of the activation of a lacZ reporter gene (see exemplary embodiment).
  • the amino acids essential for inhibition were identified by synthesis of mutant peptides (Fig.2).
  • a symmetrical arrangement of acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid) at a distance of 5 amino acids flanked by hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine) and a basic amino acid (Lys) is essential for the function of the peptides.
  • the replacement of phenylalanine or lysine by alanine also cancels the inhibition by the peptide.
  • the importance of the acidic and aromatic amino acid residues was confirmed in the context of the entire LEF-1 molecule by a nuclear translocation test (Fig.4) of endogenous ß-catenin and by a transactivation test in mammalian cells.
  • the Armadillo region of ⁇ -catenin was developed by Huber et al. Crystallized in 1997 and characterized by X-ray crystal structure analysis. A basic pit was identified that could be responsible for the interaction with the acidic amino acids of LEF-1 (see above). Basic (Lys, Arg, His) and some aromatic (Trp) amino acids were therefore mutated in the armadillo repeat units 3-9 of ß-catenin (Fig.5). Care was taken to ensure that free amino acid residues from Heikes 3, which form the base of the pit, and some amino acid residues from one edge (helix 1) were mutated.
  • the mutant ß-catenins were tested to see whether they still interact with the interaction partners LEF / TCF, APC, Conductin and E-Cadherin (Table 2). With this method, critical amino acid residues of ß-catenin could be identified which are important for specific interactions (Fig. 5 and 6). As a result, it was possible to identify specific regions of ß-catenin for the individual interaction partners (Fig.6). These regions are important for the identification of molecules which specifically influence the interaction of ⁇ -catenin for LEF-1, APC, conductin or E-cadherin.
  • the finding that the binding domains of ⁇ -catenin partially overlap with LEF-1 / TCF, APC, conductin and E-cadherin is essential for the selection of new therapeutic agents.
  • the selection is e.g. substance libraries are tested to determine whether they specifically interact with ß-catenin with LEF-1 / TCF, with ß-catenin with APC (20 or 15 amino acid repeats), with ß-qitenin with conductin or with ß-
  • LEF-1 / TCF-4 The interaction with LEF-1 / TCF-4 is oncogenic in nature, i.e. potentially promotes cancer development, the interactions with APC, Conductin and E-Cadherin are potentially anti-oncogenic, i.e. they inhibit the development of cancer. Every new substance that intervenes in the Wnt signaling pathway must therefore be carefully tested for its specific effect.
  • the characterization of the binding domain of ⁇ -catenin presented here provides the basis for this. Substances that specifically reduce the ⁇ -catenin / LEF-1 / TCF-4 interaction are therefore potential anti-cancer therapeutics. Substances that inhibit interaction with APC, Conductin or E-Cadherin potentially promote the Wnt signaling pathway and can be used for increased tissue development, e.g. can be used to promote hair growth.
  • LEF-1 The interaction of partial domains of LEF-1 with ß-catenin was analyzed in the yeast 2-hybrid system by determining the ß-galactosidase activity according to the manufacturer (Clontech) (Fig.l).
  • the DNA coding for the N-terminal partial domains of LEF-1 was inserted into the cloning site of the vector BTM116 containing the Lex-A DNA binding domain and checked by sequencing.
  • the DNA fragments of LEF-1 were analyzed by polymerase chain reaction (PCR ) and incubation with restriction endonucleases.
  • the DNA encoding ⁇ -catenin was cloned into the vector pGAD424 (Clontech) for the activation domain of GAL-4 (Behrens et al. 1996).
  • the ß-galactosidase activities of independent experiments were averaged to compare the interaction of the hybrids.
  • the specificity of the interaction of the LEF-1 hybrids with ß-catenin was checked on the basis of the ß-galactosidase activity of yeasts which produced the LEF hybrids and the GAL-4 activation domain without ß-catenin (Fig. 1).
  • the expression of the LEF-1 hybrids was checked in the immunoblot with yeast cell Ly sows by antibodies (Clontech) against the Lex A domain of the hybrids. The same amounts of yeast were used to prepare the lysates after determining the optical density of the cultures.
  • Point mutations in the binding domain of LEF-1 for ⁇ -catenin were carried out by in vitro mutagenesis of the cDNA of LEF-1.
  • the mutagenesis was carried out using the "Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit” from Clontech according to the manufacturer's instructions.
  • the following amino acids were substituted by alanine: Glu 14, Asp 19, Glu 20, Phe 24, Lys 25, Asp 26 and Glu 27.
  • the mutants were checked by sequencing and into the vector pCG-LEF-1 (Behrens et al. 1996) cloned. After transfection of MDCK cells with LEF-1 or its mutants, the translocation of endogenous ß-catenin into the cell nucleus was analyzed using immunocytological methods.
  • both proteins were produced recombinantly in bacteria with N-terminal histidine sequences and purified by nickel chromatography (Behrens et al. 1996).
  • the peptides were produced by the company Biosyntan with the PSSM-8 machine (Shimadzu, Japan) using the Fmoc / But strategy (E. Atherton and RC Sheppard. 1989 IRL Press, Oxford: “Solid phase peptide synthesis - a practical approach ").
  • Approximately 50 ng LEF-1 was adsorbed on the wells of ELISA plates for 90 minutes at room temperature.
  • PA2 was added for 10 minutes in a titer dilution of 1: 5000 in 3% skim milk powder in PBS. After washing the wells with PBS, the quantification by peroxidase-conjugated detection antibodies (1: 2500 in 3% skim milk powder in PBS, Dianova) and the conversion of o-phenylenediamine were determined by photometric measurement at 405 nm. The peptides were used in concentrations of 100 uM to 0.3 uM. To control the specificity of the inhibition of the interaction of LEF-1 / ß-catenin, ß-catenin was used in the
  • mutagenesis of ⁇ -catenin in the Armadillo repeats 3-8 was carried out using the "Mutagenese Kit” from Clontech according to the manufacturer's protocol and the mutants were checked by sequencing (Fig. 5). In all mutants, the original amino acid was substituted by alanine.
  • the cDNA coding for the amino acids Leu218-Leu781 from human ⁇ -catenin (A madillo repeat 3 to the C-terminal end of the protein) or its mutants was inserted into the fusion vector for the activation domain of Gal-4 (pGAD424 , Clontech).
  • the cDNA for the binding domains of the interaction partners was cloned into the LexA fusion vector BTM116.
  • the interaction of the Lex-A hybrids with ß-catenin and its mutants was quantified using the ß-galactosidase reporter activity in the yeast 2-hybrid system (protocol: "Matehmaker", Clontech) (Tab. 2 and Fig. 6).
  • the interaction of parts of the binding domain of LEF-1 with ß-catenin was analyzed using the ß-Gactosidase reporter activity in the yeast-2-hybrid system. Deletion of C-terminal amino acids from LEF-1 to Glu27 and N-terminal amino acids to GlylO leads to no loss of binding (11-27), while further deietions prevent the interaction (11-23, 17-34).
  • the minimal binding domain of LEF-1 for ß-catenin therefore consists of 17 amino acids (11-27) and has an acidic character.
  • the partial domain of LEF-1 from Met 21 to Val 56 shows no binding activity to ⁇ -catenin.
  • Synthetic peptides from the N-terminus of hTCF-4 with substitutions for the indicated amino acid residues were tested for their ability to inhibit the interaction of LEF-1 with ⁇ -catenin.
  • Substitution of the acidic amino acid residues of Asp 10, Aspl5 and Asp22 of TCF-4 by alanine leads to the cancellation of the inhibition by the corresponding peptides.
  • Substitution of Phe20 and Lys21 has the same effect.
  • An acidic, minimal binding domain of TCF-4 for ⁇ -catenin of 14 amino acids in length (Asp 10 to Glu23) was identified by deletion.
  • the synthetic peptide from the narrow binding domain of LEF-1 (10-34) inhibits the interaction of LEF-1 and ß-catenin in the ELISA. A reduction in complex formation to 50% is measured at a peptide concentration of 4 ⁇ M, while a peptide from LEF-1 with the amino acids Jle35-Val56 does not inhibit complex formation.
  • LEF-1 binding domain blocks the translocation of ⁇ -catenin into the cell nucleus.
  • the location of the mutations in relation to the structural context is shown.
  • the numbers above the amino acids in the sequence identify the mutants analyzed.
  • the mutants are color-coded with more than 70% reduction in the interaction for LEF-1 (red), APC (blue), Conductin (green) and E-Cadherin (yellow).
  • Amino acids highlighted in gray represent identical and chemically similar amino acids preserved in all repeats.
  • H aarrmm 4 4 ((226655-- -330066)) HQEGA MAVRLAGGLQKMVALLNKTNVKFLAITTDCLQI AY H arm 5 (307- -349) GNQESKLIILASGGPQALVNIMRTYTYEKLLWTTSRVLKVLSV
  • H is 260 3 53 37 - 1 -
  • the values indicate the percentage of the respective interaction with wild-type ⁇ -catenin. Interactions marked by - correspond to 60-100% of the wild-type interaction. The values were determined in yeast 2 hybrid assays.

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Abstract

beta -Catenin ist ein zentrales Molekül des Wnt-Signalweges. Erhöhung von beta -Catenin in der Zelle führt zur Translokation in den Zellkern und zur Interaktion mit Transkriptionsfaktoren der LEF-1/TCF-Familie. Dies kann zu Kolonkarzinomen und Melanomen führen (onkogener Signalweg). beta -Catenin interagiert aber auch mit den Tumorsuppressorgenen APC, Conductin und E-Cadherin, die eine gegenteilige Wirkung auf die Zelle ausüben (anti-onkogene Wirkung). Die Erfindung betrifft von LEF-1-/TCF-4-Transkriptionsfaktoren abgeleitete Peptide und analoge Moleküle in der Tumortherapie, insbesondere zur Behandlung von Kolonkarzinomen und Melanomen. Diese Peptide und analogen Moleküle beeinflussen die Interaktion zwischen beta -Catenin und LEF-1/TCF. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie und die Medizin. Wesentlicher Teil der Erfindung sind Peptide, die Teile der LEF-1-/TCF-4-Transkriptionsfaktoren umfassen, und ihre Varianten und Mutanten. Sie bestehen vorzugsweise aus 10-40 Aminosäuren aus dem N-terminalen Bereich von LEF-1 bzw. TCF-4. Im weiteren umfasst die Erfindung Peptide oder analoge Moleküle, abgeleitet aus der Armadillo-Region von beta -Catenin, die als Interaktionsdomänen zu LEF-1/TCF, APC, Conductin und E-Cadherin identifiziert wurden. Diese Peptide oder analogen Moleküle können ebenso die Interaktion zwischen beta -Catenin und LEF-1/TCF hemmen, oder, wie im Falle von APC oder Conductin, die Konzentration von beta -Catenin in der Zelle erhöhen. Diese letzteren Moleküle können zur Beeinflussung von Gewebe- und Organbildung, z.B. zur Förderung des Haarwuchses eingesetzt werden.

Description

MITTEL ZUR THERAPIE VON MENSCHLICHEN ERKRANKUNGEN, AUSGEHEND VON ß-CATENIN, SEINE HERSTELLUNG UND SEINE VERWENDUNG
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Mittel zur Therapie von menschlichen Erkrankungen auf der Basis von Substanzen, die die Interaktion von ß-Catenin mit Transkriptionsfaktoren und
Tumorsuppressor-Genprodukten beeinflussen. Darunter befinden sich von LEF-1-/TCF-4-
Transkriptionsfaktoren und von ß-Catenin abgeleitete Peptide und ähnliche Moleküle.
Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Auffindung solcher Substanzen sowie die Anwendung des Mittels, bevorzugt für die Therapie von Tumoren wie Kolonkarzinomen und
Melanomen.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind demzufolge die pharmazeutische Industrie und die
Medizin.
ß-Catenin ist ein zytoplasmisches Protein mit verschiedenen Funktionen in der Zelle. Im Komplex mit den Zeiladhäsionsmolekülen der Cadherm-Familie stellt ß-Catenin die Verbindung zum Zytoskelett her (Hülsken, J. et al., E-cadherin and APC compete for the interaction with beta-catenin and the cytoskeleton. J-Cell-Biol. 127: 2061-9, 1994). Zusätzlich ist ß-Catenin eine Komponente der Wnt-Signaltransduktion, die in der Embryonalentwicklung eine große Rolle spielt. Der Transkriptionsfaktor LEF-1 wurde als Interaktionspartner von ß-Catenin in dieser Signalkaskade indentifiziert (Behrens, J. et al., Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1. Nature, 382: 638-42, 1996). Der Mechanismus der Signaltransduktion durch ß-Catenin und LEF-1 ist geklärt: Er besteht in dem durch LEF-1 vermittelten Transport von ß-Catenin in den Zellkern. Im Zellkern reguliert dieser Komplex die Genexpression durch die im Komplex veränderte, LEF-1 induzierte DNA-Biegung und durch die carboxy-terminale Transaktivierungsdomäne von ß-Catenin. Inzwischen wurde gezeigt, daß auch andere Mitglieder der LEF-1/TCF-Familie von Transkriptionsfaktoren, z.B. TCF-4 diese Signaltransduktion vermitteln können (Korinek, V. et al., Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma. Science, 275: 1784- 87, 1997).
Voraussetzung für diese ß-Cateiiin-abhängige Signaltransduktion ist die Stabilisierung des zytoplasmatischen Pools von freiem, nicht Cadherin-gebundenem ß-Catenin. Dieser Pool wird durch die Glykogen-Synraetase-Kinase 3ß, durch das Tumorsuppressor-Genprodukt APC sowie durch Conductin/ Axin negativ reguliert.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP Für Karzinome und Melanome wurde gezeigt, daß Mutationen im N-Terminus von ß- Catenin oder in der ß-Catenin-Bindungsdomäne von APC diese Regulation aufheben (Marin, P.J. et al., Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science, 275: 1787-90, 1997). Als Konsequenz wird der ß- Catenin-Pool stabilisiert. In Melanomen fuhrt diese Stabilisierung zur LEF-1 vermittelten Translokation von ß-Catenin in den Zellkern, während in Kolonkarzinomen vor allem TCF-4 diese Funktion erfüllt. Die transkriptioneile Aktivität des Komplexes in Karzinom- Zellinien wurde durch die Aktivierung eines Reportergens belegt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß diese Aktivität in APC-defϊzienten Kolonkarzmom-Zellinien nach Wiederemfuhnmg von APC inhibiert wurde.
APC-Mutationen wurden in der überwiegenden Mehrheit von Kolonkarzinomen identifiziert, während nicht APC-defiziente Tumore Mutationen im ß-Catenin-Gen aufweisen. Das Resultat dieser Mutationen von APC oder ß-Catenin ist die Aktivierung der Signaltransduktion durch den ß-Catenin-LEF/TCF-Komplex. Es unterstreicht die Schlüsselrolle von ß-Catenin in der Tumorentstehung. Da APC-Mutationen als ein frühes Ereignis in der Enstehung von Kolontumoren identifiziert wurden, ist die Aktivierung des ß-Catenin-LEF/TCF-Komplexes wahrscheinlich ein zentraler Schritt in der Tumorentstehung.
Es wurde bereits versucht, die Schlüsselrolle von ß-Catenin in der Tumorentstehung für die Entwicklung von Tumortherapeutika auszunutzen. Nahezu zeitgleich wurden in den USA zwei Patentanmeldungen vorgenommen, die inzwischen als WO-Schriften veröffentlicht wurden. In WO 98/41631 (John Hopkins Universität - B. Vogelstein) wird die Beeinflussung von Interaktionen von ß-Catenin, TCF-4 und dem Tumorsuppressor-Protein APC mit dem Ziel der Verhinderung von Krebsentstehung beansprucht. Dabei wurde gezeigt, daß Produkte von mutierten APC-Genen, die in Kolorektal-Tumoren nachgewiesen wurden, die ß-Catenin/TCF-4-Transkriptionsaktivierung nicht mehr regulieren können. W terhin weisen Kolorektal-Tumore mit intakten APC-Genen Aktivierungsmutationen von ß-Catenin im N-Terminus auf, was die Funktion der wichtigen Phosphorylierungsorte beeinflußt. Daraus wird abgeleitet, daß die Regulierung von ß-Catenin für den Tumorsuppressorwirkung von APC kritisch ist und daß diese Regulierung durch Mutationen in APC oder in ß-Catenin umgangen werden kann. Der Hauptanspruch betrifft das intronfreie DNA-Molekül, welches für TCF-4 kodiert.
WO 98/42296 (Onyx Pharmaceuticals Inc. - Rubinfeld) betrifft Zusammensetzungen und Methoden zur Diagnose und zur Behandlung von Krankheiten, die durch ß- Catenin/Transkriptionsfaktor-mteraktionen ausgelöst werden. Der Hauptanspruch betrifft das isolierte, stabilisierte ß-Catenin und seine Fragmente, solche Fragmente sind allerdings nicht angegeben worden.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) I Die hier beschriebene Erfindung hat zum einen das Ziel, neue Mittel zur Behandlung von Karzinomen bzw. aberranter Gewebs- und Organentwicklung zur Verfügung zu stellen. Ihr liegt die spezielle Aufgabe zugrunde, die Interaktion von ß-Catenin mit LEF/TCF- Tπinskriptionsfaktoren als Voraussetzung der Translokation und der Aktivität des Komplexes im Zellkern zu beeinflussen. Diese Modulation soll spezifisch sein, d.h. darf mit anderen Interaktionen von ß-Catenin (z.B. mit APC, Conductin oder E-cadherin) nicht interferieren. Ein Ziel der Erfindung besteht außerdem darin, ELISA-Verfahren zur Durchmusterung von Substanzbibliotheken zur Auffindung von Molekülen (u. a. Peptiden, organischen Verbindungen) zu entwickeln, die hochspezifisch nur jeweils eine Interaktion des ß-Catenin beeinflussen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
In der ersten Realisierung der Erfindung wurden die Bindungsdomänen der LEF/TCF- Transkriptionsfaktoren für ß-Catenin identifiziert (Abb.l). Sie sind Ausgangspunkt für die Gewinnung der erfindungsgemäßen Peptide und ähnlicher Moleküle. Diese Peptide bestehen bevorzugt aus 10-20 Aminosäuren langen Sequenzen aus dem N-teπninalen Bereich von LEF-1 bzw. TCF-4 (Abb.2). Besonders bevorzugt sind es die Peptide
- bestehend aus den N-teπninalen Aminosäuren 11-34 von LEF-1 (Abb.l) folgender Sequenz
GDPELCATDEMIPFKDEGDPQKEK
- bestehend aus den N-teπninalen Aminosäuren 14-27 von LEF-1 folgender Sequenz ELCATDEMIPFKDE
- bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 7-29 von TCF-4 (Abb.2) folgender Sequenz
GGDDLGANDELISFKDEGEQEEK
- bestehend aus den N-teπninalen Aminosäuren 10-23 von TCF-4 folgender Sequenz DLGANDELISFKDE
Bevorzugt sind ferner Peptide, in denen die sauren Aminosäuren im Abstand von 5 Aminosäuren angeordnet und durch hydrophobe und basische Aminosäuren flankiert sind (Abb.2).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91)
ISA Diese Peptide können gemäß der Erfindung für die Tumortherapie eingesetzt werden, wofür zwei prinzipielle Wege möglich sind.
a) Verwendung der Peptide als solche
Ein direkter Einsatz der Peptide für die Behandlung von Tumoren kommt wegen ihrer Instabilität gegenüber Proteasen und wegen des Mangels an Membranpermeabilität im allgemeinen nicht in Betracht. Eine Stabilisierung erfolgt durch Kopplung mit einem zweiten Peptid, wofür das sog. Antennapedia-Peptid RQffilWFQNRRMEWEE hervorragend geeignet ist Dieses Peptid ist in der Lage, bis zu 100 Aminosäuren lange angekoppelte Peptide durch Zellmembranen in das Zytoplasma und den Zellkern zu transportieren. Die gekoppelten Peptide können vorteilhaft in der Tumortherapie eingesetzt werden.
b) Verwendung der Peptide zum Drugdesign (Peptidmimikry).
Die erfindungsgemäßen Peptide dienen auch als Grundlage zum Design von Substanzen, die durch gezielte Modifikation die Stabilität und Wirksamkeit in der Zelle erhöhen ( eptidomimetics ). Beispielsweise kann das durch Einführen reaktiver Gruppen, Austausch von Aminosäuren oder Einführung nichthydrolysierbarer peptidähnlicher Bindungen erfolgen.
Durch den Austausch des Kohlenstoffgerüstes der Peptide gegen synthetische Kohlenstoffgerüste mit gleicher Anordnung von funktioneilen Gruppen kann die Stabilität der Moleküle ebenfalls erhöht werden (Non-Peptidomimetics). Dieses molekulare Mimikry der biologischen Aktivität der von der minimalen Bindungsdomäne von LEF-1/TCF für ß- Catenin abgeleiteten inhibitorischen Peptide (Abb.3 und 4) ermöglicht die Produktion potenterer Wirkstoffe für die Tumortherapie.
In einem zweiten Schritt zur Realisierung der Erfindung wurden die Regionen von ß- Catenin identifiziert, die für die spezifischen Bindungen zu LEF-l/TCF-4, APC (20 und 15 Aπnnosäuren-Repeats enthaltende Domänen), Conductin und E-Cadherin verantwortlich sind. Es wurde gefunden, daß diese Regionen zum Teil überlappen und die Aπnadillo- Domänen 3-8 von ß-Catenin betreffen (Abb.5 und 6). Der Kernpunkt dieses Schritts besteht darin, daß Mutationen von ß-Catenin erzeugt wurden, welche spezifische Interaktionen zu einzelnen Partnern verhindern. Es handelt sich im einzelnen um folgende Mutationen, bezogen auf die in der Anlage beschriebene Teilsequenz von ß-Catenin (Tab.l):
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91)
ISA / EP His 470, Arg 469 Keine Interaktion mit LEF- l/TCF-4
Trp 383 Keine Interaktion mit APC 20aa
Arg 386 Keine Interaktion mit APC 15aa
Phe 253, Arg 274, Trp 338 Keine Interaktion mit Conductin
Damit ist die Möglichkeit gegeben, Peptide und analoge Moleküle zu generieren, die spezifisch die Interaktionen von ß-Catenin mit APC, ß-Catenin mit Conductin oder ß- Catenin mit E-Cadherin hemmen. Diese Moleküle eignen sich ebenso zur Generierung neuer Pharmaka. Dazu werden potentielle Kandidaten für eine cancerostatische Wirksamkeit mit ß-Catenin und z. B. LEF-1 unter Bedingungen in Kontakt gebracht (z.B. in einem ELISA), bei denen diese Proteine eine Bindung eingehen. Es wird dann gemessen, in welchem Maße diese Bindung durch die zugesetzte Substanz gehemmt wird.
Die Wnt-Signaltransduktion und ihre Komponenten spielen ebenfalls eine Rolle bei der Entwicklung und Erhaltung von Geweben und Organen, z.B. von bestimmten Regionen des Gehirns, der Extremitäten, der Niere sowie der Haut. Die gewebsspezifische Ausschaltung des ß-Catenin-Gens in der Maus zeigt, daß ß-Catenin für die Entwicklung der Haut und insbesondere der Haare von Bedeutung ist. Dadurch erstreckt sich die Erfindung auch auf Verfahren der Förderung der Haut- und Haarentwicklung durch erhöhte Expression von ß- Catenin (oder von stabilerem ß-Catenin ). Das kann man beispielsweise durch Inhibition der Interaktion mit APC oder Conductin erreichen.
So können erfindungsgemäß spezifische Inhibitoren der ß-Catenin /APC- oder der ß- Catenin /Conductin-Interaktion genutzt werden, um in Zellen und Geweben erhöhte ß- Catenin-Konzentrationen zu erreichen. Ebenso fordert Conductin, das ein analoges Protein zu Axin ist, den Abbau von ß-Catenin. Inhibitoren der ß-Catenin/APC-und ß- Catemn/Conductin-Interaktion kann eingesetzt werden, um in Organentwicklungsvorgänge einzugreifen. Z.B. könnte so die Haarentwicklung beim Menschen lokal gefordert werden.
Im Einzelnen wurden folgende Untersuchungen durchgeführt.
1. Charakterisierung des minimalen Bmdungsdomäne von LEF/TCF für ß-Catenin:
Zur Identifizierung der minimalen Bindungsdomäne wurde das 'Hefe-2-Hybrid-System' eingesetzt (Abb.l). Die minimale Bindungsdomäne konnte auf die N-terminalen Aminosäuren 11-27 von LEF-1 begrenzt werden, welches den Aminosäuren 7-29 in TCF-4 entspricht (Abb.2). Die Interaktion von N-terminalen LEF-1 Fragmenten mit ß-Catenin wurde anhand der Aktivierung eines lacZ-Reportergens bestimmt (s. Ausführungsbeispiel).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP Im ELISA mit synthetischen Peptiden wurde gezeigt, daß ensprechende Peptide (11-34, 14- 27) die ß-Catenin/LEF-1-Komplexbildung spezifisch inhibieren. Analoges gilt für die TCF4 Peptide 7-29 und 10-23 bezüglich der ß-Catenin/TCF-4-Komplexbildung (Abb.2).
Die für die Inhibition essentiellen Aminosäuren wurden durch Synthese mutanter Peptide identifiziert (Abb.2). Für die Funktion der Peptide ist eine symmetrische Anordnung von sauren Aminosäuren (Asparaginsäure und Glutaminsäure) im Abstand von 5 Aminosäuren flankiert durch hydrophobe Aminosäuren (Leucin, Isoleucin) und eine basische Aminosäure (Lys) wesentlich. Der Austausch von Phenylalanin oder Lysin durch Alanin hebt die Inhibition durch das Peptid ebenfalls auf. Die Bedeutung der sauren und aromatischen Aminosäurereste wurde im Kontext des gesamten LEF-1 Moleküls durch einen Kern- Translokationstest (Abb.4) von endogenem ß-Catenin und durch einen Transaktivierungstest in Säugerzellen bestätigt.
2) Charakterisierung der Interaktionsdomäne von ß-Catenin für LEF-1, APC, Conductin und E-Cadherin.
Die Armadillo-Region von ß-Catenin wurde von Huber et al. 1997 kristallisiert und durch Rδntgen-KristaU-Strukturanalyse charakterisiert. Eine basische Grube konnte identifiziert werden, die für die Interaktion mit den sauren Aminosäuren von LEF-1 (siehe oben) verantwortlich sein könnte. Es wurden deshalb basische (Lys, Arg, His) sowie einige aromatische (Trp) Aminosäuren in den Armadillo- Wiederholungseinheiten 3-9 von ß- Catenin mutiert (Abb.5). Es wurde darauf geachtet, daß vor allem freie Aminosäurereste der Heikes 3, die die Basis der Grube bilden, sowie einige Aminosäurereste des einen Randes (Helix 1) mutiert wurden. Die mutanten ß-Catenine wurden darauf getestet, ob sie noch mit den Interaktionspartnern LEF/TCF, APC, Conductin und E-Cadherin interagieren (Tab.2). Durch dieses Verfahren konnten kritische Aminosäurereste von ß-Catenin identifiziert werden, die für spezifische Interaktionen von Bedeutung sind (Abb.5 und 6). Es ist dadurch gelungen, spezifische Regionen von ß-Catenin für die einzelnen Interaktionspartner zu identifizieren (Abb.6). Diese Regionen sind für die Identifizierung von Molekülen wichtig, welche spezifisch die Interaktion von ß-Catenin für LEF-1, APC, Conductin oder E-cadherin beeinflussen.
Der Befund, daß die Binduπgsdomänen von ß-Catenin mit LEF-1/TCF, APC, Conductin und E-Cadherin partiell überlappen, ist essentiell für die Selektion neuer Therapeutika. Die Selektion wird z.B. folgendermaßen durchgeführt: Es werden Substanzbibliotheken darauf getestet, ob sie spezifisch die Interaktion von ß-Catenin mit LEF-1/TCF, von ß-Catenin mit APC (20 oder 15 Aminosäure-Repeats), von ß-Qitenin mit Conductin oder von ß-
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP Catenin mit E-Cadherin beeinflussen. Im weiteren werden Peptide oder ähnliche Oberflächenstrukturen der Armadillo-Region 3-8 von ß-Catenin generiert, die durch Mutation von ß-Catenin identifiziert wurden, und diese werden anschließend auf ihre Wirkung auf die Bindung der verschiedenen Interaktionspartner getestet.
Die Interaktion mit LEF-l/TCF-4 ist onkogener Natur, d.h. fördert potentiell die Krebsentstehung, die Interaktionen mit APC, Conductin und E-Cadherin sind potentiell anti-onkogen, d.h. sie inhibieren die Krebsentstehung. Jede neue Substanz, die in den Wnt- Signalweg eingreift, muß deshalb sorgfältig auf ihre spezifische Wirkung getestet werden. Die hier vorgestellte Charakterisierung der Bindungsdomäne von ß-Catenin stellt dafür die Grundlage dar. Substanzen, die spezifisch die ß-Catenin/LEF-l/TCF-4-Interaktion vermindern, sind deshalb potentielle Anti-Krebs-Therapeutika. Substanzen, die die Interaktion zu APC, Conductin oder E-Cadherin hemmen, fördern potentiell den Wnt- Signalweg und können zur verstärkten Gewebeentwicklung, z.B. zur Förderung des Haarwuchses eingesetzt werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausfuhrungsbeispiele näher erläutert werden.
1. Identifizierung der mmimalen Bindungsdomäne von LEF-1 für ß-Catenin:
Die Interaktion von Teildomänen von LEF-1 mit ß-Catenin wurde im Hefe-2-Hybrid System durch Bestimmung der ß-Galaktosidase-Aktivität nach Angaben des Herstellers (Clontech) analysiert (Abb.l). Für diesen Zweck wurde die für die N-terminalen Teildomänen von LEF-1 kodierende DNA in die Klonierungsstelle des Lex-A DNA- Bindungsdomäne enthaltenden Vektors BTM116 inseriert und durch Sequenzierung überprüft Die DNA-Fragmente von LEF-1 wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Inkubation mit Restriktionsendonukleasen hergestellt. Die ß-Catenin kodierende DNA wurde in den Vektor pGAD424 (Clontech) für die Aktivierungsdomäne von GAL-4 kloniert (Behrens et al. 1996). Für den Vergleich der Interaktion der Hybride wurden die ß-Galaktosidase-Aktivitäten unabhängiger Experimente gemittelt.
Die Speziδtät der Interaktion der LEF-1-Hybride mit ß-Catenin wurde anhand der ß- Galaktosidase-Aktivität von Hefen, die die LEF-Hybride und die GAL-4 Aktivierungsdomäne ohne ß-Catenin herstellten, kontrolliert (Abb.l). Die Expression der LEF-1 Hybride wurde im Immunoblot mit Hefezell-Ly säten durch Antikörper (Clontech) gegen die Lex-A-Domäne der Hybride kontrolliert. Für die Herstellung der Lysate wurden gleiche Hefemengen nach Bestimmung der optischen Dichte der Kulturen eingesetzt.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP 2. Charakterisierung der ß-Catenin Bindungsdomäne von LEF-1 im Test auf den Kerntransport.
Durch in vitro Mutagenese der cDNA von LEF-1 wurden Punktmutationen in der Bindungsdomäne von LEF-1 für ß-Catenin emgeführt. Die Mutagenese erfolgte mit dem "Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit" der Firma Clontech nach Angaben des Herstellers. Folgende Aminosäuren wurden durch Alanin substituiert: Glu 14, Asp 19, Glu 20, Phe 24, Lys 25, Asp 26 und Glu 27. Die Mutatanten wurden durch Sequenzierung überprüft und in den Vektor pCG-LEF-1 (Behrens et al. 1996) kloniert. Nach Transfektion von MDCK-Zeüen mit LEF-1 oder seinen Mutanten, wurde die Translokation von endogenem ß-Catenin in den Zellkern mit immuncytologischen Methoden analysiert. Hierfür wurden je 2.5 x 105 MDCK-Zellen mit pCG-LEF-1 transfiziert. Die Immunodetektion von LEF-1 erfolgte mit Anti LEF-1 Serum aus Kaninchen und Cy2- konjugierten Anti-Kaninchen Antikörpern, die Detektion von ß-Catenin erfolgte mit monoklonalen Antikörpern und Cy3-konjugierten Anti-Maus Antikörpern (Abb.4A).
3. Charakterisierung und Quantifizierung inhibitorischer Peptide im ELISA:
Für die Quantifizierung der Inhibition der LEF-1/ß-Catenin Interaktion durch synthetische Peptide wurden beide Proteine in Bakterien rekombinant mit N-terminalen Histidin- Sequenzen hergestellt und durch Nickel-Chromatographie gereinigt (Behrens et al. 1996). Die Peptide wurden von der Firma Biosyntan mit dem PSSM-8 Automaten (Shimadzu, Japan) unter Verwendung der Fmoc/But-Strategie hergestellt (E. Atherton und R.C. Sheppard. 1989 IRL Press, Oxford: "Solid phase peptide synthesis - a practical approach"). Ca. 50 ng LEF-1 wurde an den Näpfen von ELISA-Platten für 90 Minuten bei Raumtemperatur adsorbiert. Anschließend wurden die Näpfe mit 5% Magermilch-Pulver in PBS für 16 Stunden bei 4° C abgedeckt. Alle weiteren Schritte erfolgten bei Raumtemperatur in PBS mit 50 mM Tris HCl (pH 7.5). Nach dem Waschen der Näpfe mit PBS wurden die Peptidverdünnungen zugegeben. Die Inkubation mit 50-100 ng ß-Catenin wurden für 10 Minuten in Gegenwart von 200 mg/ml BSA durchgeführt. Die Komplexbildung von LEF-1 und ß-Catenin wurde durch den Antikörper PA2 gegen den Qufcoxy-Teπninus von ß-Catenin nachgewiesen (Hülsken et al. 1994). PA2 wurde für 10 Minuten in einer Titerverdünnung von 1:5000 in 3% Magermilchpulver in PBS zugegeben. Nach dem Waschen der Näpfe mit PBS erfolgte die Quantifizierung durch Peroxidase konjugierte Nachweisantikörper (1:2500 in 3% Magermilchpulver in PBS, Dianova) und den Umsatz von o-Phenylendiamin durch photometrische Messung bei 405 nm bestimmt. Die Peptide wurden in Konzentrationen von 100 uM bis 0.3 uM eingesetzt. Zur Kontrolle der Spezifität der Inhibition der Interaktion von LEF-1 /ß-Catenin wurde ß-Catenin in den
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP Näpfen adsorbiert und mit den gleichen Antikörpern in Gegenwart und Abwesenheit der Peptide nachgewiesen (Abb.2 und 3).
Für die Mutationsanalyse der Peptide wurden bei der Synthese die angegebenen Aminosäuren durch Alanin ersetzt. Die Quantifizierung der Inhibition der Komplexbildung von b-Catenin und LEF-1 erfolgte wie bereits beschrieben (Abb.2).
4) Herstellung und Testen von Mutanten von ß-Catenin, die die Interaktion zu LEF-1, APC, Conductin oder E-Cadherin modulieren.
Die Mutagenese von ß-Catenin in den Armadillo-Repeats 3-8 wurde mit dem "Mutagenese Kit" der Firma Clontech nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt und die Mutanten durch Sequenzierung überprüft (Abb.5). In allen Mutanten wurde die ursprüngliche Aminosäure durch Alanin substituiert. Für die Analyse der Interaktionen wurde die für die Aminosäuren Leu218-Leu781 kodierende cDNA von humanen ß-Catenin (A madillo-Repeat 3 bis zum C-teπninalen Ende des Proteins) oder seinen Mutanten in den Fusionsvektor für die Aktivierungsdomäne von Gal-4 (pGAD424, Clontech) kloniert. Die cDNA für die Bindungsdomänen der Interaktionspartner wurde in den LexA-Fusionsvektor BTM116 kloniert. Hierfür wurde die cDNA von LEF-1 für die Aminosäuren 1-99, von Conductin für die Aminosäuren Ala342-Arg465, von humanen APC für die Aminosäuren Hisl012-Glul215 (APC 15 Aminosäure-Repeats) und für die Aminosäuren Serl259- Aspl400 (APC 20 Aminosäure-Repeats) und von E-Cadherin für die Aminosäuren Gln773- Asp884 (cytoplasmatische Domäne) mit entsprechenden Primern PCR amplifiziert. Die Interaktion der Lex-A-Hybride mit ß-Catenin und seinen Mutanten wurde anhand der ß- Galaktosidase- Reporteraktivität im Hefe 2-Hybrid System (Protokoll: "Matehmaker", Clontech) quantifiziert (Tab.2 und Abb.6).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91)
ISA / EP Legenden zu den Abbildungen und Tabellen:
Abb.l:
Identifizierung der minimalen Bindungsdomäne von LEF-1 für ß-Catenin.
Die Interaktion von Teilen der Bindungsdomäne von LEF-1 mit ß-Catenin wurde anhand der ß-Ga ktosidase-Reporteraktivität im Hefe-2-Hybrid System analysiert. Deletion C- terminaler Aminosäuren von LEF-1 bis zum Glu27 und N-terminaler Aminosäuren bis zum GlylO führt zu keinem Verlust der Bindung (11-27), während weitere Deietionen die Interaktion verhindern (11-23, 17-34). Die minimale Bindungsdomäne von LEF-1 für ß- Catenin besteht demnach aus 17 Aminosäuren (11-27) und weist einen sauren Charakter auf. Die Teildomäne von LEF-1 aus Met 21 bis Val 56 zeigt keine Bindungsaktivität zu ß- Catenin.
Abb. 2:
Charakterisierung der minimalen Bindungsdomäne von TCF-4 durch Inhibition der
Bindung von ß-Catenin an LEF-1 im ELISA.
Synthetische Peptide aus dem N-Terminus von hTCF-4 mit Substitutionen für die angegebenen Aminosäurereste wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Interaktion von LEF- 1 mit ß-Catenin zu inhibieren. Substitution der sauren Aminosäurereste von Asp 10, Aspl5 und Asp22 von TCF-4 durch Alanin führt zur Aufhebung der Inhibition durch die entsprechen Peptide. Substitution von Phe20 und Lys21 hat die gleiche Wirkung. Durch Deletion wurde eine saure, minimale Bindungsdomäne von TCF-4 für ß-Catenin von 14 Aminosäuren Länge (Asp 10 bis Glu23) identifiziert .
Abb. 3:
Inhibition der Interaktion von LEF-1 und ß-Catenin durch synthetische Peptide aus der minimalen Bindungsdomäne von LEF-1 im ELISA
Das synthetische Peptid aus der nünimalen Bindungsdomäne von LEF-1 (10-34) hemmt die Interaktion von LEF-1 und ß-Catenin im ELISA. Eine Reduktion der Komplexbildung auf 50% wird bei einer Peptid-Konzentration von 4 μM gemessen,, während ein Peptid von LEF-1 mit den Aminosäuren Jle35-Val56 die Komplexbildung nicht hemmt.
Abb. 4:
Substitution saurer Aminosäure-Reste und von Phenylalanin in der minimalen
Bindungsdomäne von LEF-1 blockiert die Translokation von ß-Catenin in den Zellkern.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP A. MDCK-Zellen wurden mit Wildtyp- und Mutanten von LEF-1 transfiziert und die Translokation von endogenem ß-Catenin in den Zellkern durch Lmmunfluoreszensnachweis überprüft. Substitution der sauren Aminosäure-Reste von Aspl9, Glu20, Asp26 und Glu27 durch Alanin blockiert die Translokation von ß-Catenin in den Zellkern; die Substitution der aromatischen Aminosäure Phe24 hat den gleichen Effekt. Die Substitution von Glul4 und Lys25 verhindert die Translokation nicht. Pfeile markieren die LEF-1 transfizierten Zellen in der Immunodetektion für endogenes ß-Catenin.
B. Vergleich der minimalen Bindungs-Domänen von LEF-1 und TCF-4 mit den entsprechenden Positionen der Aminosäuren.
Abb. 5:
Mutationen zu Alanin in der Armadillo-Domäne von ß-Catenin, die zu einer Reduktion von mehr als 70%- der Interaktion mit LEF-1, APC, Conductin und E-Cadherin führen.
Die Lokalisation der Mutationen in Bezug zum strukturellen Kontext (Helix 1-3, in Rahmen) ist dargestellt. Die Zahlen über den Aminosäuren in der Sequenz kennzeichnen die analysierten Mutanten. Farblich markiert sind die Mutanten mit mehr als 70%- Reduktion in der Interaktion für LEF-1 (rot), APC (blau), Conductin (grün) und E- Cadherin (gelb). Grau unterlegte Aminosäuren stellen in allen Repeats konservierte identische und chemisch ähnliche Aminosäuren dar.
Abb.6:
Mutationen in der Armadillo-Domäne von ß-Catenin, die spezifisch nur die Bindung von
LEF-1, APC, Conductin oder E-Cadherin verhindern.
Darstellung der Armadillo-Domäne Repeats 3-8 mit Mutationen, die eine Reduktion der jeweiligen Interaktion auf weniger als 30% (rot) oder auf 30-60% (gelb) aufweisen. Mit Pfeilen gekennzeichnet sind die Mutanten, die für die jeweilige Interaktion spezifisch sind: Arg469 und His470 für die Bindung von LEF-1, Trp383 für APC (20 Aminosäure- Repeats), Arg386 für APC (15 Aminosäure-Repeats), Phe253,Arg274 und Trp338 für Conductin. Die Interaktionen wurden im Hefe 2-Hybrid System anhand der ß- Galaktosidase-Reporteraktivität bestimmt
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) Tab.l:
Aminosäuresequenz der Armadülo-Repeats 3-8 von humanen ß-Catenin
Tab.2:
Zusammenstellung aller ß-Catenin-Mutanten mit weniger als 60% Bindungsaktivität zu den angegebenen Bindungsdomänen von LEF-1, APC, Conductin und E-Cadherin.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP
Aminosäuresequenz des humanen ß-Catenin (Armadülo-Repeats 3-8)
aarrmm 3 3 ( (222244-- -226644)) HREGLLAIFKSGGIPALVKMLGSPVDSVLFYAITTLHNLLL
H aarrmm 4 4 ( (226655-- -330066)) HQEGA MAVRLAGGLQKMVALLNKTNVKFLAITTDCLQI AY H arm 5 (307- -349) GNQESKLIILASGGPQALVNIMRTYTYEKLLWTTSRVLKVLSV
|3 aarrmm 66 ((335500-- -339900)) CSSNKPAIVEAGGMQALGLHLTDPSQRLVQNCLWTLRNLSD O arm 7 (391- -429) AATKQEGMEGLLGT VQLLGSDDINWTCAAGI SNLTC arm 8 (430- -473) NNYKNKMMVCQVGGIEALVRTVLRAGDREDITEPAICALRHLTS
Tab.2
Interaktion von ß-Catenin-Mutanten mit LEF-1 , APC (20 und 15 Aminosäure -Repeats), Conductin und E-Cadherin
Interaktion mit ß-Catenin arm.
Lbr-1 APC-20 APC-15 Conductin E-Cadherin Mutanten Einh.
Phe 253 3 « 40 - 17 -
H is 260 3 53 37 - 1 -
Arg 274 4 - 40 - 29 50
Lys 292 4 - 28 - 5 -
Trp 338 5 - 55 - 20 -
Arg 342 5 - 29 - 20 41
Lys 345 5 38 0 - 22 27
Lys 354 6 38 - 54 43 40
Trp 383 6 - 0 59 - -
Arg 386 6 35 12 45 -
Lys 394 7 - - - 42 -
Lys 435 8 - - 30 42 -
Arg 457 8 - - - 36 -
Arg 469 8 1 7 - - - 50
His 470 8 2 47 60 - -
Die Werte geben den prozentualen Anteil der jeweiligen Interaktion mit Wildtyp-ß-Catenin an. Durch - gekennzeichnete Interaktionen entsprechen 60 -100 % der Wildtyp-Interaktion. Die Werte wurden in Hefe 2-Hybrid-Assays ermittelt.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91)
ISA / EP

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Therapie von menschlichen Erkrankungen auf der Basis von Substanzen, die die Interaktion von ß-Catenin mit Transkriptionsfaktoren und Tumorsuppressor- Genprodukten beeinflussen.
2. Mittel zur Therapie von menschlichen Erkrankungen auf der Basis von Substanzen, die die Interaktion von ß-Catenin mit Transkriptionsfaktoren und Tumorsuppressor- Genprodukten hemmen.
3. Mittel zur Therapie von menschlichen Erkrankungen auf der Basis von Substanzen, die die Interaktion von ß-Catenin mit Transkriptionsfaktoren und Tumorsuppressor- Genprodukten fordern.
4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Interaktion von ß-Catenin mit LEF-1 beeinflußt.
5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Interaktion von ß-Catenin mit TCF-4 beeinflußt
6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Interaktion von ß-Catenin mit APC 15 bzw. AP 20 Aininosäure-Repeats beeinflußt.
7. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Interaktion von ß-Catenin mit Conductin beeinflußt.
8. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Interaktion von ß-Catenin mit E-Cadherin beeinflußt.
9. Peptide, die Teile der LEF-l-/TCF-4-Transkriptionsfaktoren umfassen, und ihre Varianten und Mutanten.
10. Peptid nach Anspruch 9, bestehend aus 10-40 Aminosäuren langen Sequenzen aus dem N-terrninalen Bereich von LEF-1 bzw. TCF-4.
11. Peptid nach Anspruch 9-10, bestehend aus den N-teιτninalen Aminosäuren 11-34 von LEF-1 folgender Sequenz
GDPELCATDEMIPFKDEGDPQKEK
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP
12. Peptid nach Anspruch 9-10, bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 14-27 von LEF-1 folgender Sequenz
ELCATDEMIPFKDE
13. Peptid nach Anspruch 9-10, bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 7-29 von TCF-4 folgender Sequenz
GGDDLGANDELISFKDEGEQEEK
14. Peptid nach Anspruch 9-10, bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 10-23 von TCF-4 folgender Sequenz DLGANDEUSFKDE
15. Peptid nach Anspruch 9-14, dadurch gekennzeichnet, daß sie saure Aminosäuren im Abstand von 5 Aminosäuren, die durch hydrophobe Aminosäuren flankiert sind, und eine basische Aminosäure enthalten.
16. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 9-15 zur Tumortherapie, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide mit einem zweiten Peptid gekoppelt und danach in geeigneter Form appliziert werden.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als zweites Peptid das Antennapediapeptid RQIEIWFQNRRMEWEE eingesetzt wird.
18. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide und Bindungsregionen zur Erhöhung der Stabilität modifiziert werden (Peptidomimetics)
19. Verwendung der Peptide und Bindungsregionen gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß ihr Kohlenstoffgerüst gegen Kohlenstoffgerüste mit gleicher Anordnung von funktionellen Gruppen ausgetauscht wird (Non Peptidomimetics).
20. Peptide und ähnliche Moleküle aus der Armadillo-Domäne (arm-Einheiten 3-8) von ß- Catenin (Sequenz gemäß Anlage: Tabelle 1) und die Mutanten im Kontext des gesammten ß-Catenin-Moieküls , die mindestens eine der spezifischen Interaktionsdomänen zu LEF-1, TCF-4, APC, Conductin oder E-Cadherin umfassen.
21. Peptide und Bindungsregionen von ß-Catenin nach Anspruch 20, die den Bereich von His 470 und/oder Arg 469 sowie Fragmente davon umfassen (LEF-1/TCF-Bindungsstelle).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91)
ISA / EP
22. ß-Catenin Mutanten nach Anspruch 20 mit der Mutation His 470 und/oder Arg 469.
23. Peptide und Bindungsregionen von ß-Catenin, die den Bereich von Trp 383 sowie Fragmente davon umfassen (APC-Bindungsstelle, 20 Aminosäure-Repeat).
24. ß-Catenin Mutanten nach Anspruch 20 mit der Mutation Trp 383.
25. Peptide und Bindungsregionen von ß-Catenin nach Anspruch 20, die den Bereich von Arg 386 sowie Fragmente davon umfassen (APC-Bindungsstelle, 15 Aminosäure-Repeat).
26. ß-Catenin Mutanten nach Anspruch 20 mit der Mutation Arg 386.
27. Peptide und Bindungsregionen von ß-Catenin nach Anspruch 20, die den Bereich von Arg 386, Phe 253, Arg 274, Trp 338 sowie Fragmente davon umfassen (Conductin- Bindungsstelle)
28. ß-Catenin Mutanten nach Anspruch 20 mit einer oder Kombinationen von folgenden Mutationen: Arg 386, Phe 253, Arg 274, Trp 338
29. Verwendung von Substanzen, die durch Peptidomimetics oder Non-Peptidomimetics aus den Ansprüchen 20-28 gewonnen werden.
30. Verwendung der Peptide und ähnlicher Moleküle nach Anspruch 20-28 zum Aufbau von Mitteln zur Behandlung von Tumoren, Gewebe und Organschäden, z.B. von Haarausfall.
31. Verwendung der Peptide und ähnlicher Moleküle nach Anspruch 20-28 zum Screening von Substanzen, die hochspezifisch eine der Interaktionen von ß-Catenin mit LEF/TCF, APC, Conductin oder E-Cadherin hemmen oder verstärken.
32. Verwendung der Peptide und ähnlicher Moleküle nach Anspruch 20-28, die die Interaktion von ß-Catenin mit LEF/TCF, APC, Conductin oder E-Cadherin hemmen, zur Tumortherapie.
33. Verwendung der Peptide und ähnlicher Moleküle nach Anspruch 20-28, die die Interaktion von ß-Catenin mit LEF TCF, APC, Conductin oder E-Cadherin fördern, zur Gewebe- und Organ-Regeneration (z.B. Haarwuchsförderung).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91)
ISA / EP
34. ELISA zur Durchmusterung von Substanzbibliotheken, auf Komponenten hin, die die Interaktion von ß-Catenin mit LEF-1/TCF, APC, Conductin und E-Cadherin beeinflussen.
35. ELISA nach Anspruch 35, enhaltend Peptide und Mutanten sowie ähnliche Moleküle nach den Ansprüchen 9-15, 20-28 zur Identifizierung von Substanzen zur Tumortherapie, Gewebe- und Organregeneration.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP
EP99913097A 1998-02-21 1999-02-22 Mittel zur therapie von menschlichen erkrankungen, ausgehend von beta-catenin, seine herstellung und seine verwendung Withdrawn EP1054899A2 (de)

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