EP0968277B1 - Filtrationsverfahren zur trennung von viren - Google Patents

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EP0968277B1
EP0968277B1 EP98913653A EP98913653A EP0968277B1 EP 0968277 B1 EP0968277 B1 EP 0968277B1 EP 98913653 A EP98913653 A EP 98913653A EP 98913653 A EP98913653 A EP 98913653A EP 0968277 B1 EP0968277 B1 EP 0968277B1
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viruses
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    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/145—Ultrafiltration
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative separation of viruses of different sizes, wherein 1-10 ml per 1 cm 2 filter surface of a virus-containing solution is filtered, the virus-containing solution is filtered through one or more filter membranes, the size difference of the virus to be separated is at least 40 nm, the viruses have a substantially spherical shape, in particular with icosahedral symmetry, and a titer reduction of the viruses to be separated of more than log9 is achieved.
  • the original goal of gene therapy was to cure genetic disorders through appropriate genetic modifications of body cells.
  • gene therapy is extended to genetically modified cells, which can also be used therapeutically for the healing of non-genetic disorders, such as viral diseases.
  • nucleic acid DNA or RNA
  • suitable methods are necessary for the transfer of the nucleic acid, DNA or RNA, which cause the genetic modification of the cell.
  • Nucleic acids are often referred to as so-called transgenes, even if they do not perform the functions of a gene, eg. B. anti-sense nucleic acids.
  • transgenes are often referred to as so-called transgenes, even if they do not perform the functions of a gene, eg. B. anti-sense nucleic acids.
  • genetically modified viruses have proved suitable for gene transfer.
  • retroviruses, adenoviruses or adeno-associated viruses (AAV) are genetically modified so that they can be used as carrier (viral vector) of the transgene (s) for gene transfer.
  • viral vectors An important aspect in the development of suitable viral vectors are safety aspects in the use of these vectors in gene therapy. Therefore, in general, replication-deficient viruses are being developed, ie viruses that infect a cell and that or the transgenes can transfer to the cell, but can not multiply in this cell itself. This is achieved, for example, by deleting important genes for virus replication, for example the genes coding for structural proteins, and optionally incorporating the transgene (s) in their place. In the production of larger amounts suitable for gene therapy use of non-replicable viruses so-called helper viruses are necessary to compensate for the defect in a non-replicable virus in the cell.
  • helper viruses are necessary to compensate for the defect in a non-replicable virus in the cell.
  • Retroviral vectors derive from wild-type retroviruses, which constitute a distinct family of eukaryotic viruses whose genetic material (structural and regulatory genes) consists of single-stranded RNA.
  • the viruses consist of spherical, enveloped virus particles with a diameter of about 80-120 nm and an inner capsule containing two copies of the genomic RNA in the form of a ribonucleoprotein.
  • one or more structural genes are replaced by the transgene or transgenes.
  • the LTR regions ("long terminal repeats") which are still present at the 5 'and at the 3' end contain regulatory sequences as cis-active elements, such as, for example, A promoter, polyadenylation signals and sequences necessary for genomic integration.
  • the retroviral vector may therefore contain only the LTR regions which limit the transgene (s).
  • a helper virus containing one or more of the abovementioned retroviral structural genes is required for the multiplication of a replication-deficient retroviral vector and thus complements the deleted structural gene or genes ( Whartenby, KA et al. (1995) Pharmac. Ther., 66, 175-190 ).
  • Replication-defective adeno-associated virus vectors are derived from wild-type AAV, which is a non-autonomously replicating member of the parvoviruses and is a single-stranded DNA virus about 25 nm in diameter. To date, one can distinguish the serologically different types AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4 and AAV-5.
  • AAV viruses can either integrate into the genome of the host cell or replicate in the host cells in the presence of a helper virus. Adenoviruses were first found as possible helper viruses.
  • Adenoviruses for example, in vertebrates form a group of more than 80 serologically distinguishable serotypes and contain an outer, idosaederförmige protein shell (capsid) and an inner DNA-protein central body (core).
  • the capsid is in turn composed of 252 subunits, so-called capsomers.
  • the adenoviruses generally have a diameter of about 70-90 nm and contain a double-stranded, linear DNA as a genetic material, at their 5 'and 3' ends ITR regions ("inverted terminal repeats") sit.
  • the replication of AAV (lytic phase) now requires in particular the expression of early adenoviral genes, such as. B.
  • Herpesviruses a group of human and animal pathogenic double-stranded DNA viruses having a diameter of about 120-200 nm, wherein the capsid has an icosahedral structure and is composed of 162 capsomers.
  • the herpesviruses can be subdivided into three subfamilies, with the Alphaherpesvirinae z.
  • herpes simplex virus (HSV) type 1 and type 2 belong to the betaherpesvirinae z.
  • CMV cytomegalovirus
  • Gammaherpesvirinae z As the Epstein-Barr virus (EBV).
  • one or more rep genes necessary for replication may be used for the production of adeno-associated vectors (eg rep 40, rep 52. rep 68 and / or rep 78) or those described for the capsid structure necessary cap genes (eg VP-1, VP-2 and / or VP-3) are replaced by the one or more transgenes.
  • the ITR regions still present at the 5 'and 3' ends are required as cis-active elements for packaging the transgene into infectious recombinant AAV particles as well as for DNA replication of the recombinant AAV genome (Kotin, RM (1994) ), supra).
  • An advantageous method for producing larger amounts of recombinant AAV particles is cotransfection of a eukaryotic cell with two recombinant AAV plasmids and one helper virus (Chiorini, JA et al., (1995) Human Gene Therapy, 6, 1531-1541).
  • the first recombinant AAV vector contains the transgene (s) bounded by the two ITR regions.
  • the second recombinant AAV plasmid contains the AAV genes needed to make the particles (rep and cap genes). The lack of functional ITR regions in the second vector prevents the packaging of the rep and cap genes in AAV particles and thus the emergence of unwanted wild-type AAV.
  • mammalian cells for example COS-7 cells
  • the helper virus for example adenovirus, ie which provide the prerequisites for infection and replication
  • Adenovirus is particularly suitable as a helper virus, since it can infect a broad spectrum of target cells and replicate them in the cells themselves.
  • the expression of the AAV nonstructural protein genes, the AAV structural protein genes, the replication of transgene DNA and the packaging and assembly of the recombinant AAV particles (rAAV particles) takes place.
  • the rAAV particles contain the transgene (s) flanked on both sides by the ITR regions in the form of single-stranded DNA.
  • the helper virus replicates in these cells, which in some adenovirus helper viruses Days generally ends with the lysis and death of infected cells.
  • the resulting viruses are partially released into the cell culture supernatant or remain in the lysed cells. Therefore, in general, for a substantially complete release of the viruses, the cells are known in the art cell disruption methods such. Alternating freezing and thawing, or by enzymatic hydrolysis with, for example, trypsin (Chiorini, JA et al., (1995), supra).
  • a major disadvantage in the production of viral vectors with the aid of helper viruses is the emergence of a mixed population of recombinant virus particles and helper viruses, which must be further purified.
  • adenovirus contaminations are to be avoided or minimized when using viral vectors in gene therapy because of the potential pathogenicity.
  • the areas in which the AAV particles and the adenoviruses are located after the CsCl density gradient centrifugation are very close, so that a quantitative separation of the two viruses by one or more density gradients is not possible.
  • the mixed population must be in a relatively small volume, since the density gradient centrifugation only with relatively little volume can be performed. A routine application on an industrial scale is therefore technically and financially impossible.
  • a quantitative separation of adenoviruses from the mixed population can not be achieved.
  • the mode of action of the heat inactivation is based on a different thermostability of, for example, adenoviruses and AAV particles.
  • the heating of a mixed population of adenoviruses and AAV particles to 56-65 ° C leads to a more or less selective heat inactivation of the adenoviruses with only a slight loss of activity of the AAV particles.
  • Disadvantage of this method is that in the gene therapy application still present in the preparation denatured adenovirus proteins can cause a strong cellular immune response in the patient ( Smith, CA et al. (1996) J. Virol., 70, 6733-6740 ).
  • the object of the present invention is therefore to provide a method in which different viruses contained in a mixed population can be separated from one another and which can also be used for larger volumes.
  • An object of the present invention is therefore a method for the quantitative separation of viruses of different sizes, wherein 1-10 ml per 1 cm 2 filter surface of a virus-containing solution is filtered, the virus-containing solution is filtered through one or more filter membranes, the size difference the virus to be separated is at least 40 nm, the viruses have a substantially spherical shape, in particular with icosahedral symmetry, and a titer reduction of the viruses to be separated of more than log9 is achieved.
  • the filter membranes consist of polyvinylidene fluoride, polytetrafluoromethylene, polypropylene, modified or unmodified polyethersulfone, cellulose acetate, cellulose nitrate, polyamide or regenerated cellulose, in particular cuprammonium-regenerated cellulose, preferably polyvinylidene fluoride.
  • Such membranes with a pore size which allow the deposition of particles having a size of about 40-400 nm, are, for example, the Ultipor membranes from Pall GmbH, 63303 Dreieich, with a pore size of about 50 nm or about 100 nm , Asahi Chemical's Bemberg Microporous membranes from Asahi Chemical Industry Ltd., Tokyo, Japan, with a pore size of about 15 nm, about 35 nm or about 72 nm, or corresponding membranes of the company. Sartorius AG, 37075 Göttingen or Schleicher and Schuell GmbH, 37582 Dassel.
  • the filter membranes according to the present invention have a pore size of about 25-60 nm.
  • the selection of a filter with a suitable pore size depends primarily on the size of the viruses to be separated, which are generally up to about 250 nm, preferably up to about 120 nm, in particular up to about 60 nm.
  • Another selection criterion when selecting a filter with suitable pore size is the size difference of the virus to be separated, which should generally be at least about 5 nm, preferably at least about 10 nm, in particular at least about 20 nm, especially at least about 30 nm and most preferably about 40 nm .
  • the skilled person can select a filter with a pore size suitable for the separation of viruses to be separated. The effectiveness of the selected filter (s) can then be easily tested by simple filtration experiments.
  • a filter with a pore size that allows a titre reduction of viruses with a diameter of about 50 nm, preferably the above-mentioned Pall-Ultipor VF DV50 membrane or the Asahi-Planova 35 membrane, particularly advantageous for separation of rAAV particles and adenoviruses.
  • these filters not only allow the substantially quantitative deposition of infectious adenoviruses from the mixed population, but also a high yield of rAAV particles of about 70-90%.
  • pore size pore size
  • deposition rate pore size permitting deposition of particles of a certain minimum size
  • virus or viruses for the purposes of the present invention includes not only naturally occurring viruses or genetically modified, so-called recombinant viruses, but also virus particles, ie infectious and non-infectious viruses, virus-like particles ("VLP"), such as B. papillomavirus-like particles according to WO 96/11272 , and capsids that contain nucleic acids, but may also be empty and parts thereof, in particular one or more, preferably more subunits or capsomers, especially if several capsomeres are associated or connected in such a way that they make up at least about 50%, preferably at least about 80%, especially about 90% of the capsid.
  • the viruses have a substantially spherical shape, in particular with icosahedral symmetry.
  • viruses can be classified according to their size into the following three groups:
  • the first group represents viruses with a diameter up to about 60 nm, which in general, for example, from Flaviviridae with a diameter of about 40-60 nm, such as. B. flavivirus or hepatitis C virus (HCV) derived from papillomavirus with a diameter of about 55 nm, such as.
  • B. flavivirus or hepatitis C virus (HCV) derived from papillomavirus with a diameter of about 55 nm, such as.
  • HCV hepatitis C virus
  • papillomaviruses 16 or 18 HPV 16, HPV 18
  • papovaviruses with a diameter of about 45 nm such as.
  • HBV hepatitis B virus
  • HAV hepatitis A virus
  • poliovirus poliovirus
  • parvoviruses with a diameter of about 18-26 nm, such as.
  • the second group represents viruses with a diameter of about 60 nm up to about 120 nm, which are generally derived, for example, from influenza viruses with a diameter of about 80-120 nm, of retroviruses with a diameter of about 80-120 nm, such as. Oncoviruses, lentiviruses such as HIV-1 or HIV-2. Spumaviruses or HTLV viruses, of adenoviruses with a diameter of about 65-90 nm, of reoviruses with a diameter of about 60-80 nm, such as. Coltivirus or rotavirus, or of togaviruses with a diameter of about 60-70 nm.
  • the third group represents viruses with a diameter of about 120 nm to about 250 nm, which are generally derived, for example, Paramyxoviruses with a diameter of about 150-250 nm or herpesviruses with a diameter of about 120-200 nm, such as. HSV-1 or HSV-2, CMV or EBV.
  • the viruses from one of the groups mentioned above can be separated particularly advantageously from viruses from the other groups.
  • the viruses from the first group can be separated from the viruses from the second and / or third group; above all, AAV particles can be separated particularly advantageously from adenoviruses and / or herpesviruses.
  • the inventive method allows, for example, in a particularly advantageous manner, the deposition of adenoviruses both in the case of z. B. by one or more density gradients pre-cleaned as well as non-purified material from the supernatants, for example, a rAAV culture, the adenoviruses remain in the retentate and the rAAV particles are in the filtrate.
  • a prefiltration as described in more detail below, carried out before the actual separation of the desired viruses.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention therefore extends to a pre-purification of the virus-containing solution, for example via one or more density gradients and / or via one or more prefilterings.
  • Preference is given to pre-cleaning with the aid of one or more membrane filters which allow the viruses to be separated to pass through but retain larger impurities.
  • pre-cleaning is generally a blockage of the filter, which causes the subsequent separation of the desired virus, by components of the virus culture, which are not or not sufficiently removed by centrifugation at low speed, or impeded.
  • the membrane filter for pre-cleaning example of viruses from the above first group has a pore size of at least about 60 nm, for pre-cleaning viruses from the first and / or second group, a pore size of at least about 120 nm or for pre-cleaning of viruses from the first, second and / or third group a pore width of at least about 250 nm.
  • Ultipor N 66 filter Pall GmbH, 63303 Dreieich
  • the pH of the virus-containing solution with the aid of suitable buffers for example Tris-Cl buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane), to about 6-10, preferably to about 7.0-8 , 5, in particular adjusted to about 8.0, whereby, for example, the yields can preferably be increased to AAV.
  • suitable buffers for example Tris-Cl buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane)
  • the virus-containing solution additionally contains protein or polypeptide, eg. In the form of fetal calf serum (FCS) or serum albumin, and the nature or origin of the protein is not essential.
  • the proportion of protein, eg in the form of FCS is generally not more than about 30% (v / v), preferably about 15% (v / v), especially about 10% (v / v).
  • a high yield of, for example, the rAAV particles is generally achieved with simultaneous deposition of, for example, the adenoviruses.
  • the capacity of a filter with a pore size of about 50 nm to 2 ml / cm 2 filter surface can be determined .
  • capacity in the sense of the present invention is meant the volume which ensures a high yield of the desired viruses per unit area of filter surface.
  • viruses purified according to the invention can be used, for example, directly as viral vectors for gene therapy, since they are sufficiently free of other, for example, pathogenic viruses.
  • adenoviruses could be detected on the basis of a Replication test, in which the emergence of a cytopathic effect in permissive cells within a period of, for example, 14 days after co-incubation with a corresponding solution would indicate the presence of infectious adenoviruses, can be demonstrated. Also, with the aid of the PCR reaction and DNA hybridization, a reduction of adenoviral nucleic acids by a factor of at least about 3 ⁇ 10 3 , preferably about 10 3 -10 4 times were detected.
  • adenoviral components such as. As free adenovirus proteins and subviral particles, was particularly surprising, since these components can quite trigger a nonspecific immune response in the application of viral vectors in gene therapy to the patient and consequently could put the therapy in question.
  • the titer reduction ie the factor of reduction of the titer of viruses to be separated, was for example more than log9 in adenoviruses according to the method of the invention, ie after the filtration according to the invention of a mixed population of rAAV particles and 10 9 adenoviruses, no adenovirus was detected in the filtrate.
  • a portion of a rAAV preparation was filtered as in Example 1 with a filter system having 5 cm 2 of filter surface. The filtrates were collected in several aliquots of 1.5 ml. A control aliquot remained unfiltered. Of the filtered aliquots and the unfiltered control, seven 1:10 dilution steps were made.
  • HeLa cells were grown in 48-well plates as a confluent cell layer. The supernatant was withdrawn from the wells to 100 ⁇ l residual volume. From the dilution series of each filtered aliquot and the unfiltered control, 100 .mu.l were transferred into one well each. After adsorption of the viruses to the cells for 3 h, 500 ⁇ l of complete medium were added.
  • CPE cytopathic effect
  • the adenovirus titer was determined as described above. 10 8 adenoviruses / ml were taken up in MEM medium with 10% FCS and 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) according to this titer determination. 10 ml of this adenovirus suspension were treated with a filter system described in Example 1, ie a total of 10 9 infectious adenoviruses were administered. The resulting 10 ml filtrates were placed on a 175 cm 2 culture surface with 80% confluent HeLa cells. The bottle was incubated for 5 days. There was no CPE after this period.
  • a rAAV partial preparation was filtered as described in Example 1; one part remained unfiltered for control.
  • 3 ⁇ 10 6 cells of the melanoma cell line M3HK were grown on a 75 cm 2 cell culture flask.
  • Four such bottles were prepared and exposed to X-ray radiation of 50 Gy. X-ray radiation strongly promoted rAAV-mediated foreign gene expression.
  • Each medium was withdrawn and 1.5 ml of complete medium without serum was added to each flask.
  • 0.5 ml of the unfiltered control supernatant in two of the bottles, each 0.5 ml of two filtered aliquots and placed in a bottle of medium as a negative control. After 3 days of incubation at 37 ° C.
  • RNA preparation was prepared from the cell material of each flask ( Chomchinski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. 162, 156-159, 1937 ) carried out. The RNA preparation was subjected to a semiquantitative RT-PCR reaction. To demonstrate adenoviral transcripts and the ubiquity ⁇ -actin transcript, the primer pairs described by Cotten and co-workers ( Cotten, M., Virology, 205, 254-261, 1994 ) used.
  • adenoviral E1A transcript While in the unfiltered control the adenoviral E1A transcript was detectable in four out of five dilution stages, this transcript could not be detected in the filtered aliquots and in the negative control. ⁇ -actin transcripts were detectable in all parallels.
  • the starting material was a filtered rAAV preparation as described in Example 1 and, as a control, an unfiltrated fraction thereof.
  • the filtered aliquots and the unfiltered control were Tris • Cl (pH 7.8) to a final concentration of 0.01 M, EDTA to a final concentration of 0.005 M and SDS to a final concentration of 0.5% and proteinase K added to a final concentration of 20 mg / ml and incubated at 56 ° C for 20 min.
  • a digoxigenin-labeled restriction fragment containing the adenovirus E1A gene was used as a probe.
  • the adenovirus E1A DNA on the nylon membrane was visualized by immunological digoxygenin detection (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim).
  • In the smallest dilution step of the E1A control plasmid 2 ⁇ 10 8 single-stranded DNA molecules were applied.
  • the smallest dilution step of the unfiltered control, where material is detectable, showed absolutely about 5 x 10 9 adenovirus genomes. This would correspond to about 1 x 10 10 genomes / ml in the AAV preparation.
  • the absence of the adenoviral structural protein IX in the filtrate was detected with specific antibodies in the Western Blot. From filtered Aliquots as well as unfiltered controls as well as adenovirus preparations were each loaded into a lane of protein gel together with gel application buffer. The material was separated electrophoretically ( Laemmli, UK, Nature 227, 680-685, 1970 ) and electroblotted onto a nitrocellulose membrane. The Western blot was incubated with the rabbit antiserum specific for the adenovirus structural protein IX. Specific bands were visualized using standard techniques. It was found that the structural protein IX was separated by the filtration.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Trennung von Viren unterschiedlicher Größe, wobei 1-10 ml pro 1 cm2 Filteroberfläche einer Virus-enthaltenden Lösung filtriert wird, die Virus-enthaltende Lösung über eine oder mehrere Filtermembranen filtriert wird, der Größenunterschied der zu trennenden Viren mindestens 40 nm beträgt, die Viren eine im wesentlichen kugelige Form, insbesondere mit Ikosaeder-Symmetrie besitzen, und eine Titerreduktion der abzutrennenden Viren von mehr als log9 erreicht wird.
  • Das ursprüngliche Ziel der Gentherapie war es, genetische Erkrankungen durch geeignete genetische Veränderungen von Körperzellen zu heilen. Heutzutage wird der Begriff Gentherapie auf genetisch veränderte Zellen ausgedehnt, die auch für die Heilung von nicht genetisch bedingten Erkrankungen, wie beispielsweise virale Erkrankungen, therapeutisch eingesetzt werden können.
  • Für die genetische Veränderung von therapeutisch wirksamen Zellen sind geeignete Verfahren zur Übertragung der Nukleinsäure, DNA oder RNA, notwendig, die die genetische Veränderung der Zelle verursachen. Die zu übertragenen. Nukleinsäuren werden häufig auch als sogenannte Transgene bezeichnet, selbst wenn sie nicht die Funktionen eines Gens ausüben, z. B. anti-sense Nukleinsäuren. Neben dem direkten Gentransfer von sogenannten nackten Nukleinsäuren haben sich auch genetisch veränderte Viren für den Gentransfer als geeignet erwiesen. Zur Zeit werden u. a. Retroviren, Adenoviren oder Adeno-assoziierte Viren (AAV) genetisch verändert, damit sie als Träger (viraler Vektor) des oder der Transgene für den Gentransfer verwendet werden können. Ein wesentlicher Gesichtspunkt bei der Entwicklung geeigneter viraler Vektoren sind Sicherheitsaspekte bei der Anwendung dieser Vektoren in der Gentherapie. Daher werden im allgemeinen replikationsdefiziente Viren entwickelt, also Viren, die zwar eine Zelle befallen und das oder die Transgene auf die Zelle übertragen können, sich in dieser Zelle jedoch nicht selbst vermehren können. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß man für die Virusvermehrung wichtige Gene, beispielsweise die für Strukturproteine kodierenden Gene, deletiert und gegebenenfalls an deren Stelle das oder die Transgene einbaut. Bei der Herstellung größerer für die gentherapeutische Verwendung geeigneter Mengen von nicht vermehrungsfähigen Viren sind sogenannte Helferviren notwendig, die den Defekt bei einem nicht vermehrungsfähigen Virus in der Zelle kompensieren. Die folgenden Beispiele zu retroviralen Vektoren und Adeno-assoziierten Vektroren sollen das allgemeine Prinzip näher erläutern:
  • Replikationsdefiziente retrovirale Vektoren leiten sich von Wildtyp-Retroviren ab, die eine eigene Familie von eukaryotischen Viren darstellen, deren genetisches Material (Strukturgene und regulatorische Gene) aus einzelsträngiger RNA besteht. Die Viren bestehen aus sphärischen, umhüllten Viruspartikeln mit einem Durchmesser von ca. 80-120 nm und einer inneren Kapsel, die zwei Kopien der genomischen RNA in Form eines Ribonucleoproteins enthält. Für die Herstellung retroviraler Vektoren werden beispielsweise ein oder mehrere Strukturgene (gag, pol und/oder env) durch das oder die Transgene ersetzt. Die am 5'- und am 3'-Ende noch vorhandenen LTR-Regionen ("long terminal repeats") enthalten als cis-aktive Elemente regulatorische Sequenzen, wie z. B. einen Promotor, Polyadenylierungssignale und für die genomische Integration notwendige Sequenzen. Der retrovirale Vektor kann daher lediglich die LTR-Regionen enthalten, die das oder die Transgene begrenzen. Für die Vermehrung eines replikationsdefizienten retroviralen Vektors wird daher beispielsweise ein Helfervirus, das ein oder mehrere der oben genannten retroviralen Strukturgene enthält, benötigt und so das oder die deletierten Strukturgene komplementiert (Whartenby, K. A. et al. (1995) Pharmac. Ther., 66, 175-190).
  • Replikationsdefiziente Adeno-assoziierte Virusvektoren leiten sich vom Wildtyp-AAV ab, das ein nicht-autonom replizierender Vertreter der Parvoviren ist und einen einzelsträngigen DNA Virus mit einem Durchmesser von ca. 25 nm darstellt. Bis heute kann man die serologisch unterschiedlichen Typen AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4 und AAV-5 unterscheiden. AAV-Viren können entweder in das Genom der Wirtszelle integrieren oder in Anwesenheit eines Helfervirus in den Wirtszellen replizieren. Als mögliche Helferviren wurden zuerst Adenoviren gefunden. Adenoviren bilden beispielsweise in Vertebraten eine Gruppe von mehr als 80 serologisch unterscheidbare Serotypen und enthalten eine äußere, idosaederförmige Proteinhülle (Capsid) und einen inneren DNA-Protein-Zentralkörper (Core). Das Capsid ist wiederum aus 252 Untereinheiten, sogenannte Capsomere, zusammengesetzt. Die Adenoviren besitzen im allgemeinen einen Durchmesser von ca. 70-90 nm und enthalten eine doppelsträngige, lineare DNA als genetisches Material, an deren 5'- und 3'-Enden ITR-Regionen ("inverted terminal repeats") sitzen. Die Replikation von AAV (lytische Phase) benötigt nun insbesondere die Expression früher adenoviraler Gene, wie z. B. das E1a-, E1b-, E2a- und E4-Gen und die VA-RNA (Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy, 5, 793-801). Es eignen sich jedoch auch andere Helferviren, wie z. B. Herpesviren, eine Gruppe human- und tierpathogener doppelsträngiger DNA-Viren mit einem Durchmesser von ca. 120-200 nm, wobei das Capsid eine Ikosaederstruktur aufweist und aus 162 Capsomeren aufgebaut ist. Die Herpesviren lassen sich in drei Unterfamilien unterteilen, wobei zu den Alphaherpesvirinae z. B. Herpes simplex-Viren (HSV) Typ 1 und Typ 2 gehören, zu den Betaherpesvirinae z. B. das Cytomegalievirus (CMV) und zu den Gammaherpesvirinae z. B. das Epstein-Barr-Virus (EBV).
  • Analog den retroviralen Vektoren können für die Herstellung Adeno-assoziierter Vektoren beispielsweise ein oder mehrere für die Replikation notwendige rep-Gene (z. B. rep 40, rep 52. rep 68 und/oder rep 78) oder die für die Capsidstruktur notwendigen cap-Gene (z. B. VP-1, VP-2 und/oder VP-3) durch das oder die Transgene ersetzt werden. Die am 5'- und am 3'-Ende noch vorhandenen ITR-Regionen sind als cis-aktive Elemente zur Verpackung des Transgens in infektiöse rekombinante AAV-Partikel sowie für die DNA-Replikation des rekombinanten AAV-Genoms erforderlich (Kotin, R. M. (1994), supra).
  • Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung größerer Mengen an rekombinanten AAV-Partikeln ist die Kotransfektion einer eukaryotischen Zelle mit zwei rekombinanten AAV-Plasmiden und einem Helfervirus (Chiorini, J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy, 6. 1531-1541). Der erste rekombinante AAV-Vektor enthält das oder die Transgene, welche von den beiden ITR-Regionen begrenzt werden. Das zweite rekombinante AAV-Plasmid enthält die AAV-Gene, die für die Herstellung der Partikel benötigt werden (rep- und cap-Gene). Das Fehlen funktioneller ITR-Regionen im zweiten Vektor verhindert die Verpackung der rep- und cap-Gene in AAV-Partikel und damit die Entstehung von unerwünschtem Wildtyp-AAV. Anschließend werden Säugerzellen, beispielsweise COS-7 Zellen, die sowohl für die rekombinanten AAV-Vektoren als auch für das Helfervirus, beispielsweise Adenovirus, permissiv sind, d.h. die Voraussetzungen zur Infektion und zur Replikation bieten, mit den beiden rekombinanten AAV-Vektoren und dem Helfervirus transfiziert. Als Helfervirus ist insbesondere das Adenovirus geeignet, da es ein breites Spektrum von Zielzellen infizieren und in den Zellen selbst replizieren kann. Bei der Kultivierung der transfizierten Zellen erfolgt die Expression der AAV-Nichtstrukturproteingene, der AAV-Strukturproteingene, die Replikation von Transgen-DNA und die Verpackung und der Zusammenbau der rekombinanten AAV-Partikel (rAAV-Partikel). Die rAAV-Partikel enthalten das oder die Transgene, beidseitig flankiert von den ITR-Regionen, in Form einzelsträngiger DNA. Gleichzeitig repliziert das Helfervirus in diesen Zellen, was bei Adenoviren als Helferviren nach einigen Tagen im allgemeinen mit der Lyse und dem Tod der infizierten Zellen endet. Die entstandenen Viren (Adenoviren und rAAV-Partikel) werden hierbei teilweise in den Zeltkulturüberstand freigesetzt oder verbleiben in den lysierten Zellen. Daher werden im allgemeinen für eine im wesentlichen vollständige Freisetzung der Viren die Zellen mit dem Fachmann bekannten Zellaufschlußmethoden, wie z. B. abwechselndes Einfrieren und Auftauen oder mit Hilfe einer enzymatischen Hydrolyse beispielsweise mit Trypsin (Chiorini, J. A. et al. (1995), supra), aufgeschlossen.
  • Ein wesentlicher Nachteil bei der Herstellung von viralen Vektoren mit Hilfe von Helferviren ist das Entstehen einer Mischpopulation aus rekombinanten Viruspartikeln und Helferviren, die weiter gereinigt werden muß. Insbesondere sind Adenovirus-Kontaminationen bei der Verwendung von viralen Vektoren in der Gentherapie wegen der potentiellen Pathogenität zu vermeiden bzw. zu minimieren.
  • Übliche Verfahren zur Abreicherung bzw. Abscheidung von beispielsweise Adenoviren aus Mischpopulationen mit beispielsweise AAV-Partikeln sind die Dichtegradientenzentrifugation. Hitzeinaktivierung oder eine Kombination beider Methoden. Die Wirkungsweise der Dichtegradientenzentrifugation beruht in diesem Fall auf einem geringfügigen Unterschied in der Dichte der Adenoviren (1,35 g/cm3) und der AAV-Partikel (1,41 g/cm3), der beispielsweise in der CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ausgenutzt werden kann. Aufgrund des geringen Dichteunterschiedes der Viren und der ca. 10- bis 100-fach höheren Menge an Adenoviren als an AAV-Partikeln, liegen die Bereiche, in denen sich die AAV-Partikel und die Adenoviren nach der CsCl-Dichtegradientenzentrifugation befinden, sehr nahe, so daß eine quantitative Trennung der beiden Viren durch einen oder mehrere Dichtegradienten nicht möglich ist. Zudem muß sich die Mischpopulation in einem relativ geringen Volumen befinden, da die Dichtegradientenzentrifugation nur mit relativ wenig Volumen durchgeführt werden kann. Eine routinemäßige Anwendung im industriellen Maßstab ist daher technisch und finanziell nicht möglich. Zudem kann eine quantitative Abscheidung von Adenoviren aus der Mischpopulation nicht erreicht werden.
  • Die Wirkungsweise der Hitzeinaktivierung beruht auf einer unterschiedlichen Thermostabilität von beispielsweise Adenoviren und AAV-Partikeln. Die Erwärmung einer Mischpopulation aus Adenoviren und AAV-Partikeln auf 56-65 °C führt zu einer mehr oder weniger selektiven Hitzeinaktivierung der Adenoviren unter nur geringem Aktivitätsverlust der AAV-Partikel. Nachteil dieser Methode ist jedoch, daß bei der gentherapeutischen Anwendung die noch in der Präparation vorhandenen denaturierten Adenovirus-Proteine eine starke zelluläre Immunantwort beim Patienten hervorrufen können (Smith, C. A. et al. (1996) J. Virol., 70, 6733-6740).
  • Es ist auch bekannt, daß zur Abtrennung viraler Kontaminationen aus biopharmazeutischen Produkten, die frei von Viren sein müssen, Filtermembranen mit einer Porengröße, die eine Abscheiderate von Partikeln im Nanometerbereich gewährleistet, eingesetzt werden können (Scheiblauer, H. et al. (1996), Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Abstract Nr. P54). Scheiblauer et al. (1996, supra) weist zwar darauf hin, daß die Viren aufgrund ihrer Größe zurückgehalten werden, von einer quantitativen Trennung verschiedener Viren wurde jedoch nicht berichtet.
  • Die Druckschrift DE 1951800 A (Zander Helmut, April 1971) offenbart ein präparatives Reinigungsverfahren im Herstellungsgang von Impfstoffen gegen Viruskrankheiten, bei dem ein oder mehrere Reinigungsschritte mit Hilfe von Controlliert Porösem Glas (CPG) in den Herstellungsgang von Impfstoffen eingeführt sind.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem unterschiedliche in einer Mischpopulation enthaltene Viren voneinander getrennt werden können und das auch bei größeren Volumen angewandt werden kann.
  • Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine im wesentlichen quantitative bzw. für die Verwendung in der Gentherapie ausreichende Trennung von Viren unterschiedlicher Größe durch eine oder mehrere Filtrationen einer Virus-enthaltenden Lösung auf eine einfache und auch im industriellen Maßstab anwendbare Weise erreicht wird.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur quantitativen Trennung von Viren unterschiedlicher Größe, wobei 1-10 ml pro 1 cm2 Filteroberfläche einer Virus-enthaltenden Lösung filtriert wird, die Virus-enthaltende Lösung über eine oder mehrere Filtermembranen filtriert wird, der Größenunterschied der zu trennenden Viren mindestens 40 nm beträgt, die Viren eine im wesentlichen kugelige Form, insbesondere mit Ikosaeder-Symmetrie besitzen, und eine Titerreduktion der abzutrennenden Viren von mehr als log9 erreicht wird.
  • Vorteilhafterweise bestehen die Filtermembranen aus Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluormethylen, Polypropylen, modifiziertes oder nicht-modifiziertes Polyethersulfon, Zelluloseacetat, Zellulosenitrat, Polyamid oder regenerierte Zellulose, insbesondere Cuprammonium-regenerierte Zellulose, vorzugsweise aus Polyvinylidenfluorid. Derartige Membranen mit einer Porengröße, welche die Abscheidung von Partikeln mit einer Größe von ca. 40-400 nm erlauben, sind beispielsweise die Ultipor Membranen der Fa. Pall GmbH, 63303 Dreieich, mit einer Porenweite von ca. 50 nm oder ca. 100 nm, die Asahi Chemical's Bemberg Microporous Membranen der Fa. Asahi Chemical Industry Ltd., Tokio, Japan, mit einer Porenweite von ca. 15 nm, ca. 35 nm oder ca. 72 nm, oder entsprechende Membranen der Fa. Sartorius AG, 37075 Göttingen oder Schleicher und Schuell GmbH, 37582 Dassel. Im allgemeinen haben die Filtermembranen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Porenweite, von ca. 25-60 nm. Die Auswahl eines Filters mit geeigneter Porenweite richtet sich in erster Linie nach der Größe der zu trennenden Viren, die im allgemeinen einen Durchmesser von bis zu ca. 250 nm, vorzugsweise bis zu ca. 120 nm, insbesondere bis zu ca. 60 nm besitzen. Ein weiteres Auswahlkriterium bei der Auswahl eines Filters mit geeigneter Porenweite ist der Größenunterschied der zu trennenden Viren, der im allgemeinen mindestens ca. 5 nm, vorzugsweise mindestens ca. 10 nm, insbesondere mindestens ca. 20 nm, vor allem mindestens ca. 30 nm und am meisten bevorzugt ca. 40 nm betragen soll. Anhand der Größe der zu trennenden Viren und dem daraus resultierenden Größenunterschied kann der Fachmann einen Filter mit einer zur Trennung der zu trennenden Viren geeigneten Porengröße auswählen. Die Wirksamkeit des oder der ausgewählten Filter kann dann leicht anhand von einfachen Filtrationsexperimenten routinemäßig getestet werden.
  • So eignet sich beispielsweise ein Filter mit einer Porenweite, die eine Titerreduktion von Viren mit einem Durchmesser von über ca. 50 nm ermöglicht, vorzugsweise die oben bereits erwähnte Pall-Ultipor VF DV50 Membran oder die Asahi-Planova 35-Membran, besonders vorteilhaft zur Trennung von rAAV-Partikeln und Adenoviren. Insbesondere diese Filter ermöglichen nicht nur die im wesentlichen quantitative Abscheidung infektiöser Adenoviren aus der Mischpopulation, sondern auch eine hohe Ausbeute an rAAV-Partikeln von ca. 70-90%.
  • Die Begriffe "Porenweite", "Abscheiderate", "Wirkgröße" oder "Porenweite, die eine Abscheidung von Partikeln mit einer bestimmten Mindestgröße erlauben", die von verschiedenen Filterherstellern verwendet werden, sind im Sinne der vorliegenden Erfindung äquivalente Begriffe.
  • Der Begriff Virus bzw. Viren umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur natürlich vorkommende Viren oder gentechnisch veränderte, sogenannte rekombinante Viren, sondern auch Virus-Partikel, d. h. infektiöse wie auch nicht-infektiöse Viren, virus-ähnliche Partikel ("VLP"), wie z. B. Papillomavirus-ähnliche Partikel gemäß WO 96/11272 . und Capside, die Nukleinsäuren enthalten, aber auch leer sein können und Teile davon, insbesondere eine oder mehrere, vorzugsweise mehrere Untereinheiten bzw. Capsomere, vor allem wenn mehrere Capsomere derart assoziiert bzw. verbunden sind, daß sie mindestens ca. 50%, vorzugsweise mindestens ca. 80%, vor allem ca. 90% des Capsids ausmachen. Die Viren haben vor allem eine im wesentlichen kugelige Form, insbesondere mit Ikosaeder-Symmetrie.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Viren nach ihrer Größe in folgende drei Gruppen eingeteilt werden:
  • Die erste Gruppe repräsentiert Viren mit einem Durchmesser bis zu ca. 60 nm, die sich im allgemeinen beispielsweise von Flaviviridae mit einem Durchmesser von ca. 40-60 nm, wie z. B. Flavivirus oder Hepatitis C Virus (HCV) ableiten, von Papillomaviren mit einem Durchmesser von ca. 55 nm, wie z. B. die humanen Papillomaviren 16 oder 18 (HPV 16, HPV 18), von Papovaviren mit einem Durchmesser von ca. 45 nm, wie z. B. das Polyomavirus, von Hepadnaviren mit einem Durchmesser von ca. 22-42 nm, wie z. B. das Hepatits B Virus (HBV), von Picornaviren mit einem Durchmesser von ca. 22-30 nm, wie z. B. Hepatits A Virus (HAV) oder Poliovirus, oder von Parvoviren mit einem Durchmesser von ca. 18-26 nm, wie z. B. Adenoassoziierter Virus (AAV) oder rAAV-Partikel mit einem Durchmesser von ca. 25 nm.
  • Die zweite Gruppe repräsentiert Viren mit einem Durchmesser von ca. 60 nm bis zu ca. 120 nm, die sich im allgemeinen beispielsweise von Influenzaviren mit einem Durchmesser von ca. 80-120 nm ableiten, von Retroviren mit einem Durchmesser von ca. 80-120 nm, wie z. B. Onkoviren, Lentiviren, wie beispielsweise HIV-1 oder HIV-2. Spumaviren oder HTLV-Viren, von Adenoviren mit einem Durchmesser von ca. 65-90 nm, von Reoviren mit einem Durchmesser von ca. 60-80 nm, wie z. B. Coltivirus oder Rotavirus, oder von Togaviren mit einem Durchmesser von ca. 60-70 nm.
  • Die dritte Gruppe repräsentiert Viren mit einem Durchmesser von ca. 120 nm bis zu ca. 250 nm, die sich im allgemeinen beispielsweise von Paramyxoviren mit einem Durchmesser von ca. 150-250 nm ableiten oder von Herpesviren mit einem Durchmesser von ca. 120-200 nm, wie z. B. HSV-1 oder HSV-2, CMV oder EBV.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung lassen sich die Viren aus einer der oben genannten Gruppen besonders vorteilhaft von Viren aus den anderen Gruppen trennen. Es lassen sich aber auch unterschiedliche Viren, die ein und derselben der oben genannten Gruppen angehören, voneinander trennen, sofern ein ausreichender Größenunterschied, vorzugsweise wie oben bereits näher beschrieben, vorhanden ist. Insbesondere lassen sich die Viren aus der ersten Gruppe von den Viren aus der zweiten und/oder dritten Gruppe trennen, vor allem lassen sich AAV-Partikel besonders vorteilhaft von Adenoviren und/oder Herpesviren trennen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht beispielsweise in besonders vorteilhafter Weise die Abscheidung von Adenoviren sowohl im Falle von z. B. durch eine oder mehrere Dichtegradienten vorgereinigtes als auch von nicht gereinigtem Material aus den Überständen beispielsweise einer rAAV Kultur, wobei die Adenoviren im Retentat verbleiben und die rAAV-Partikel sich im Filtrat befinden. Vorteilhafterweise wird vor der eigentlichen Trennung der gewünschten Viren eine Vorfiltration, wie unten näher beschrieben, durchgeführt.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erstreckt sich daher auf eine Vorreinigung der Virus-enthaltenden Lösung, beispielsweise über einen oder mehrere Dichtegradienten und/oder über eine oder mehrere Vorfiltrationen. Besonders bevorzugt ist eine Vorreinigung mit Hilfe eines oder mehrerer Membranfilter, die die zu trennenden Viren passieren lassen, größere Verunreinigungen jedoch zurückhalten. Durch die Vorreinigung wird im allgemeinen eine Verstopfung des Filters, der die anschließende Trennung der gewünschten Viren bewirkt, durch Bestandteile der Viruskultur, die auch durch Zentrifugation bei niedriger Drehzahl nicht bzw. nicht ausreichend zu entfernen sind, verhindert bzw. erschwert. Hierbei besitzt der Membranfilter zur Vorreinigung beispielsweise von Viren aus der oben genannten ersten Gruppe eine Porenweite von mindestens ca. 60 nm, zur Vorreinigung von Viren aus der ersten und/oder zweiten Gruppe eine Porenweite von mindestens ca. 120 nm bzw. zur Vorreinigung von Viren aus der ersten, zweiten und/oder dritten Gruppe eine Porenweite von mindestens ca. 250 nm. Beispielsweise ist ein Membranfilter mit einer Porenweite von ca. 100 nm, wie z. B. der Ultipor N66-Filter (Pall GmbH, 63303 Dreieich), besonders gut geeignet zur Vorreinigung einer Mischpopulation aus rAAV-Partikeln und Adenoviren.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Virus-enthaltenden Lösung mit Hilfe geeigneter Puffer, beispielsweise Tris-Cl-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), auf ca. 6-10, vorzugsweise auf ca. 7,0-8,5, insbesondere auf ca. 8,0 eingestellt, wodurch beispielsweise die Ausbeuten vorzugsweise an AAV erhöht werden können. Es ist auch besonders bevorzugt, wenn die Virus-enthaltende Lösung zusätzlich Protein bzw. Polypeptid, z. B. in Form von fötalem Kälberserum (FCS) oder Serumalbumin, enthält, wobei die Art bzw. Herkunft des Proteins nicht wesentlich ist. Der Anteil an Protein, z.B. in Form von FCS, beträgt im allgemeinen nicht mehr als ca. 30% (v/v), vorzugsweise ca. 15% (v/v), insbesondere ca. 10% (v/v).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ca. 2-5 ml. insbesondere ca. 3 ml der Virus-enthaltenden Lösung pro ca. 1 cm2 Filteroberfläche, vor allem nicht mehr als ca. 2-2,5 ml Lösung pro ca. 1 cm2 Filteroberfläche filtriert. Hierdurch wird im allgemeinen eine hohe Ausbeute beispielsweise der rAAV-Partikel bei gleichzeitiger Abscheidung beispielsweise der Adenoviren erreicht. Insbesondere ist es bevorzugt, vor der eigentlichen Trennung Zellbestandteile in der Viruskultur durch Zentrifugation bei niedriger Umdrehungszahl, beispielsweise bis zu ca. der 1000fachen Erdbeschleunigung (1000g), vorzugsweise bis zu ca. 500g, insbesondere bis zu ca. 300g, abzutrennen. Darüberhinaus ist es vorteilhaft, anschließend eine oben bereits näher beschriebene Vorfiltration durchzuführen. Auf diese Weise konnte beispielsweise nach Abtrennung der Zellbestandteile bei ca. 300g und Vorfiltration der Mischpopulation über einen, Membranfilter mit einer Porengröße von ca. 100 nm die Kapazität eines Filters mit einer Porengröße von ca. 50 nm zu 2 ml/cm2 Filteroberfläche bestimmt werden. Mit Kapazität im Sinne der vorliegenden Erfindung ist das Volumen gemeint, das pro Flächeneinheit Filteroberfläche eine hohe Ausbeute an den gewünschten Viren gewährleistet.
  • Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind vor allem eine einfache, kostengünstige und daher auch im industriellen Maßstab anwendbare Trennung von Viren unterschiedlicher Größe unter besonders schonenden Bedingungen, wodurch in besonders vorteilhafter Weise eine hohe Ausbeute von gereinigten Viren erhalten wird. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, daß die erfindungsgemäß gereinigten Viren beispielsweise direkt als virale Vektoren für die Gentherapie eingesetzt werden können, da sie ausreichend frei von anderen, beispielsweise pathogenen Viren sind. So konnte beispielsweise in einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigten rAAV-enthaltenden Lösung keine Adenoviren anhand eines Replikationstestes, bei dem die Entstehung eines zytopathischen Effekts bei permissiven Zellen innerhalb eines Zeitraumes von beispielsweise 14 Tagen nach Koinkubation mit einer entsprechenden Lösung auf die Anwesenheit von infektiösen Adenoviren hinweisen würde, nachgewiesen werden. Auch konnten mit Hilfe der PCR-Reaktion und DNA-Hybridisierung eine Reduktion adenoviraler Nukleinsäuren um einen Faktor von mindestens ca. 3 x 103, vorzugsweise um das ca. 103-104fache nachgewiesen werden. Der im Filtrat verbleibende geringe Restanteil adenoviraler DNA ist jedoch nicht mit replikationskompetenten Adenoviren assoziiert und somit unschädlich. Die Verringerung adenoviraler Bestandteile, wie z. B. freie Adenovirus-Proteine und subvirale Partikel, war besonders überraschend, da diese Bestandteile durchaus eine unspezifische Immunantwort bei der Anwendung viraler Vektoren in der Gentherapie am Patienten auslösen können und folglich die Therapie in Frage stellen könnten. Die Titerreduktion, d. h. der Faktor der Verminderung des Titers der abzutrennenden Viren, betrug beispielsweise bei Adenoviren gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mehr als log9, d. h. nach der erfindungsgemäßen Filtration einer Mischpopulation aus rAAV-Partikeln und 109 Adenoviren, wurde kein Adenovirus im Filtrat nachgewiesen.
  • Die folgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken:
    • Beispiele Beispiel 1
  • Filtration einer Mischpopulation aus rAAV-Partikeln und Adenoviren
    • 1.1 Es wurde eine Mischpopulation von rAAV Typ 2-Partikeln, die als Transgen das für T-Zellen kostimulierende Protein B7-2 kodierende Gen enthalten, und Wildtyp Adenovirus Typ 5 nach der Vorschrift von Chiorini, J. A. et al. (1995, supra) hergestellt, wobei 3 Tage nach der Infektion mit den Adenoviren, die Zellen, die bereits einen starken zytopatischen Effekt zeigen, einschließlich des Überstandes gesammelt wurden. Anschließend wurden die Zellen mit Überstand durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen. Unlösliche Zellbestandteile wurden durch eine 10minütige Zentrifugation bei 300 g abgetrennt. Anschließend wurde der Anteil an fötalem Kälberserum (FCS) auf 10% eingestellt und zu der Präparation Tris·Cl-Puffer (pH 8,0) bis zu einer Endkonzentration von 100mM gegeben. Die von unlöslichen Zellbestandteilen abgetrennte und eingestellte Präparation wurde mit 2,5 bar auf ein Filtersystem beaufschlagt, das eine Pall-Ultipor N66-Membran (Fa. Pall GmbH. 63303 Dreieich) mit einer Wirkgröße von 0,1 µm als Vorfilter sowie eine Pall-Ultipor VF DV50-Membran zur Trennung der beiden Viren enthält. Auf diese Weise wurden nicht mehr als 2 ml der Präparation pro 1 cm2 Filteroberfläche filtriert.
    • 1.2 Ausgangsmaterial war der Zellkulturüberstand von rAAV-Partikeln nach dem Protokoll von Chiorini, J. A. et al. (1995, supra). Drei bis vier Tage nach Infektion der Zellen mit dem Adenovirus wurden die Zellen mitsamt des Überstandes vereinigt. Zu der Präparation wurde Tris-Cl-Puffer (pH 8,0) zu einer Endkonzentration von 30 mM gegeben. Die Suspension wurde zum Aufbrechen der Zellen dreimal eingefroren und aufgetaut. Der Schritt der Aufkonzentration der Viren durch eine CsCl-Dichtegradientenkonzentration wurde im Anschluß an die Filtration durchgerührt.
      Die Präparation wurde auf ein Filtersystem beaufschlagt, das aus einem Vorfilter und aus einem Planova 35-Hohlfaser-Filtrationselement mit einer Wirkgröße von 35 nm besteht. Der Vorfilter wurde mit einem Druck von 1,5 bar, der Planova 35-Filter mit einem Druck von 0,5 bar beaufschlagt. Die Menge des filtrierten Volumens betrug beim Vorfilter höchstens 2,5 ml pro cm2 Filteroberfläche und beim Planova 35-Filter höchstens 7 ml pro cm2 Filteroberfläche.
    Beispiel 2 Replikationstest

  • I. Ein Teil einer rAAV-Präparation wurde wie in Beispiel 1 mit einem Filtersystem, das 5 cm2 Filteroberfläche hat, filtriert. Die Filtrate wurden in mehreren Aliquots zu 1,5 ml gesammelt. Ein Kontroll-Aliquot verblieb unfiltriert. Von den filtrierten Aliquots sowie von der unfiltrierten Kontrolle wurden jeweils sieben 1:10-Verdünnungsstufen hergestellt. Für den Replikationstest wurden HeLa-Zellen in 48-Napf-Platten als konfluente Zellschicht angewachsen. Der Überstand wurde aus den Näpfen bis auf 100 µl Restvolumen abgezogen. Von der Verdünnungsreihe eines jeden filtrierten Aliquots sowie von der unfiltrierten Kontrolle wurden jeweils 100 µl in je einen Napf überführt. Nach 3 h Adsorption der Viren an die Zellen wurden 500 µl Vollmedium zugegeben. Über einen Zeitraum von einer Woche wurde täglich kontrolliert, ob sich ein zytopathischer Effekt (CPE) zeigt. Bei Bedarf wurde das Medium gewechselt. Der CPE würde durch die Replikation der Viren in den HeLa-Zellen bewirkt. Letztlich endet die Replikation mit dem Tod der infizierten Zelle und mit der Freisetzung der Nachkommenviren.
    Tabelle 1 zeigt ein typisches Ergebnis. Während bei der unfiltrierten Kontrolle bis zur 4. Verdünnungsstufe ein CPE nachweisbar war, war die Zellschicht bei allen untersuchten filtrierten Aliquots nach 7 Tagen intakt. Dies bedeutet bei dem unfiltrierten Material einen Titer infektiöser Adenoviren von größenordnunssmäßig 105/ml, während sich in dem filtrierten Material kein infektiöses Adenovirus mehr befindet. Ein vergleichbarer Titer war im Retentat, also in dem Material, das sich direkt über der Membran befand und gesammelt wurde, nachweisbar. Tabelle 1
    Ausbildung eines zytopathischen Effekts 7 Tage nach Koinkubation von HeLa-Zellen mit filtrierten und unfiltrierten Verpackungsüberständen
    Probe Experiment Verdünnungsstufe
    0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
    Kontrolle 1 + + + + + - - -
    2 + + + + + - - -
    Aliquot 1 1 - - - - - - - -
    2 - - - - - - - -
    Aliquot 2 1 - - - - - - - -
    2 - - - - - - - -
    Aliquot 3 1 - - - - - - - -
    2 - - - - - - - -
    Retentat 1 + + + + + - - -
    2 + + + + + - - -

    II. Von einer Adenovirus-Präparation, die mit einer Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation aufkonzentriert wurde, wurde der Adenovirus-Titer, wie oben beschrieben, bestimmt. Es wurden gemäß dieser Titerbestimmung 108 Adenoviren/ml in MEM-Medium mit 10 % FCS und 50 mM Tris·Cl (pH 8,0) aufgenommen. Von dieser Adenovirus-Suspension wurden 10 ml mit einem in Beispiel 1 beschriebenen Filtersystem behandelt, d. h. es wurden insgesamt 109 infektiöse Adenoviren appliziert. Die resultierenden 10 ml Filtrate wurden auf eine 175 cm2-Kulturfläche mit 80 % konfluenten HeLa-Zellen verbracht. Die Flasche wurde 5 Tage inkubiert. Nach diesem Zeitraum zeigte sich kein CPE. Da die Zellen zu diesem Zeitpunkt konfluent waren und da eine längere Versuchsdauer angestrebt wurde, wurden sie 1:5 gesplittet. Die fünf resultierenden HeLa-Kulturen wurden dann über einen weiteren Zeitraum von 5 Tagen beobachtet. Es zeigte sich nach wie vor kein CPE. Daraus wurde auf eine vollständige Abwesenheit von infektiösen Adenoviren im Filtrat geschlossen.
    • Beispiel 3 Nachweis adenoviraler Nukleinsäuren a) RT-PCR-Reaktion
  • Eine rAAV-Teilpräparation wurde wie in Beispiel 1 geschildert filtriert; ein Teil verblieb zur Kontrolle unfiltriert. Es wurden jeweils 3 x 106 Zellen der Melanomzellinie M3HK auf einer 75 cm2-Zellkulturflasche angewachsen. Vier derartige Flaschen wurden vorbereitet und einer Röntgenstrahlung von 50 Gy ausgesetzt. Die Röntgenstrahlung förderte die rAAV-vermittelte Fremdgenexpression sehr stark. Das Medium wurde jeweils abgezogen und in jede Flasche wurden 1.5 ml Vollmedium ohne Serum gegeben. Zusätzlich wurden dann in eine der Flaschen 0,5 ml des unfiltrierten Kontroll-Überstandes, in zwei der Flaschen jeweils 0,5 ml von zwei filtrierten Aliquots und in eine Flasche Medium als Negativkontrolle gegeben. Nach 3 Tagen Inkubation bei 37°C und 10% CO2 wurden aus dem Zellmaterial jeder Flasche eine RNA-Präparation (Chomchinski, P. und Sacchi, N., Anal. Biochem. 162, 156-159, 1937) durchgeführt. Die RNA-Präparation wurde einer semiquantitativen RT-PCR-Reaktion unterzogen. Zum Nachweis adenoviraler Transkripte sowie des ubiquitäten ß-Aktin-Transkriptes wurden die von Cotten und Mitarbeitern beschriebenen Primerpaare (Cotten, M., Virology, 205, 254-261, 1994) verwendet.
  • Während bei der unfiltrierten Kontrolle das adenovirale E1A-Transkript in vier von 5 Verdünnungsstufen nachweisbar war, konnte dieses Transkript in den mit den filtrierten Aliquots sowie bei der Negativkontrolle nicht nachgewiesen werden ß-Aktin-Transkripte waren dagegen in allen Parallelen nachweisbar.
    • b) DNA-Hybridisierung
  • Ausgangsmaterial war eine wie in Beispiel 1 beschriebene filtrierte rAAV-Präparation sowie zur Kontrolle ein unfiltriert belassenener Anteil davon. Zu den filtrierten Aliquots sowie der unfiltrierten Kontrolle wurden Tris·Cl (pH 7,8) bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M, EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0,005 M und SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % sowie Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml zugegeben und 20 min bei 56°C inkubiert.
  • 50 µl der Proteinase K-behandelten Proben wurden zur Denaturierung in 200 µl 0,5 N NaOH aufgenommen. Hiervon wurden acht 1:10-Verdünnungen in 0,5 N NaOH hergestellt. Zusätzlich wurde als Standard von einer bekannte Menge eines Plasmides mit der zu detektierenden DNA-Sequenz in analoger Weise eine Verdünnungsreihe hergestellt. Die Verdünnungsreihen wurden auf eine Nylonmembran aufgedottet. Die Membran wurde bei 80°C zur kovalenten Bindung der DNA inkubiert und danach einer Southern-Hybridisierung mit einer für Adenovirus-DNA spezifischen markierten Probe unterzogen (Chiorini, J. A. et al. (1995), supra). Als Probe wurde ein Digoxygeninmarkiertes Restriktionsfragment mit dem E1A-Gen des Adenovirus verwendet. Die Adenovirus-E1A-DNA auf der Nylonmembran wurde mittels immunologischem Digoxygenin-Nachweis (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) sichtbar gemacht. In der kleinsten Verdünnungsstufe des E1A-Kontrollplasmides wurden 2 x 108 einzelsträngige DNA-Moleküle aufgetragen. Die kleinste Verdünnungsstufe der unfiltrierten Kontrolle, bei der Material nachweisbar ist, zeigte absolut etwa 5 x 109 Adenovirus-Genome. Dies würden etwa 1 x 1010 Genome/ml in der AAV-Präparation entsprechen. Bei den filtrierten Aliquots ist in den meisten Fällen in der kleinsten Verdünnungsstufe ein schwaches Signal zu erkennen, das gegenüber der unfiltrerten Kontrolle etwa um einen Faktor 3 x 103 bis 1 x 104 schwächer ist und 1 x 107 bis 3 x 107 Genome/ml der AAV-Präparation repräsentieren würde. Die in Beispiel 2 geschilderten Tests zeigten jedoch, daß diese Genome in den filtrierten Aliquots nicht mit infektiösen Partikeln assoziiert, sondern in nicht-infektiöser Form vorliegen. Durch die Filtrationstechnil: wurde eine Abreicherung dieser Adenovirus-Genome um einen Faktor 3 x 103 bis 1 x 104 erzielt.
    • Beispiel 4 Nachweis des adenoviralen Strukturproteins IX im Western-Blot
  • Das Fehlen des adenoviralen Strukturproteins IX im Filtrat wurde mit spezifischen Antikörpern im Western-Blot nachgewiesen. Von filtrierten Aliquots sowie von unfiltrierten Kontrollen wie auch von Adenovirus-Präparationen wurden jeweils 2 µl zusammen mit Gelauftragspuffer in eine Spur eines Proteingels geladen. Das Material wurde elektrophoretisch getrennt (Laemmli, U. K., Nature 227, 680-685, 1970) und auf eine Nitrozellulosemembran elektrogeblottet. Der Western-Blot wurde mit dem für das Adenovirus-Strukturprotein IX spezifischen Kaninchen-Antiserum inkubiert. Spezifische Banden wurden mit Standard-Techniken sichtbar gemacht. Es zeigte sich, daß das Strukturprotein IX durch die Filtration abgetrennt wurde.

Claims (13)

  1. Verfahren zur quantitativen Trennung von Viren unterschiedlicher Größe, dadurch gekennzeichnet, daß 1-10 ml pro 1 cm2 Filteroberfläche einer Virus-enthaltenden Lösung filtriert wird, die Virus-enthaltende Lösung über eine oder mehrere Filtermembranen filtriert wird, der Größenunterschied der zu trennenden Viren mindestens 40 nm beträgt, die Viren eine im wesentlichen kugelige Form, insbesondere mit Ikosaeder-Symmetrie besitzen, und eine Titerreduktion der abzutrennenden Viren von mehr als log9 erreicht wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermembran aus Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluormethylen, Polypropylen, modifiziertes oder nicht-modifiziertes Polyethersulfon, Zelluloseacetat, Zellulosenitrat, Polyamid, oder regenerierte Zellulose, insbesondere Cuprammonium-regenerierte Zellulose, vorzugsweise aus Polyvinylidenfluorid besteht.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermembran(en) eine Porenweite von 25-60 nm besitzt/besitzen.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Viren ausgewählt sind aus AAV, Adenoviren oder Herpesviren.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Virus-enthaltende Lösung vorgereinigt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Vorreinigung über einen oder mehrere Dichtegradienten und/oder über eine oder mehrere Vorfiltrationen erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der genannten Vorfiltration ein oder mehrere Membranfilter verwendet werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Membranfilter zur Vorreinigung einePorenweite von mindestens 250 nm besitzt/besitzen.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Virus-enthaltenden Lösung 6-10, vorzugsweise 7,0-8,5, insbesondere 8,0 beträgt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Virus-enthaltende Lösung zusätzlich Protein enthält.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Lösung Protein in Form von fötalem Kälberserum oder Serumalbumin enthält.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Protein nicht mehr als 30% (v/v), vorzugsweise 15% (v/v), insbesondere 10% (v/v) beträgt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß ca. 2-5 ml Lösung pro 1 cm2 Filteroberfläche, insbesondere nicht mehr als 2-2,5 ml Lösung pro 1 cm2 filtriert werden.
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