JP2001513644A - ウイルス分離のための濾過法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は異なる大きさのウイルスを分離する濾過法であって、好ましくはウイルスを含有する溶液１またはいくつかの濾過膜により濾過する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス分離のための濾過法 本発明は、異なる大きさのウイルスを分離する方法であって、好ましくはウイ ルス含有溶液を１以上の濾過膜を通して濾過する方法に関する。 遺伝子治療の本来の目的は、好適な方法で体細胞を遺伝学的に改変することに より遺伝病を治療することであった。現在では、遺伝子治療という語は、例えば ウイルス病などの遺伝子起源ではない疾病を治療するために治療上使用すること もできる遺伝学的に改変された細胞を含めるまでに拡張されている。 治療上有効な細胞の遺伝子改変には、細胞の遺伝子改変を引き起こす核酸、す なわちＤＮＡまたはＲＮＡを導入する好適な方法が必要とされる。導入される核 酸はまた、それらが遺伝子の機能を果たさない場合、例えばそれらがアンチセン ス核酸である場合でさえ、しばしばいわゆる導入遺伝子であるとして記載されて いる。いわゆる裸の核酸の直接遺伝子導入に加え、遺伝学的に改変されたウイル スもまた遺伝子導入を果たすために適していることが判っている。現在、特に、 レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）を遺伝 学的に改変し、それらを各々遺伝子導入用の導入遺伝子の担体（ウイルスベクタ ー）として使用することが可能である。好適なウイルスベクターを開発する場合 に考慮すべき重要なことは、それらのベクターを遺伝子治療に使用する際の安全 面に関することである。従って一般に、複製欠陥ウイルスが開発され、これは細 胞に感染し、細胞中へ導入遺伝子を導入することはできるが、それ自身はこの細 胞内では複製できないというウイルスである。これは例えば、ウイルスの複製に 重要な遺伝子、例えば構造タンパク質をコードする遺伝子を欠失させ、次いで適 当であればそれらの代わりに導入遺伝子を組み込むことにより達成される。遺伝 子治療での使用に好適な比較的多量な複製不能ウイルスを調製するには、細胞内 で複製不能ウイルスの欠損を補償するいわゆるヘルパーウイルスが必要である。 以下のレトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターの例は、通則 を明確にすることを意図したものである： 複製欠陥レトロウイルスベクターは野生型レトロウイルスに由来し、これはそ の遺伝物質（構造遺伝子および調節遺伝子）が一本鎖ＲＮＡからなる真核ウイル スの独立したファミリーから構成される。ウイルスは、直径約８０〜１２０ｎｍ で内部キャプシドを有する球形の包膜ウイルス粒子からなり、リボヌクレオタン パク質の形態で２コピーのゲノムＲＮＡを含んでいる。レトロウイルスベクター を調製するには、１以上の構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ） を導入遺伝子で置き換える。５’および３’末端になお存在しているＬＴＲ（長 い末端反復配列）領域は、シス作用エレメントとして、プロモーター、ポリアデ ニル化シグナルなどの調節配列およびゲノムへの組込みに必要とされる配列を含 んでいる。従って、レトロウイルスベクターだけが導入遺伝子をフランクするＬ ＴＲ領域を含むことが可能である。従って、複製欠陥レトロウイルスベクターの 複製には、例えば１以上の前記のレトロウイルス構造遺伝子を含み、かくして欠 失した構造遺伝子を相補するヘルパーウイルスが必要である(Whartenby，K．A． et al．(1995)Pharmac．Ther.，66，175-190)。 複製欠陥アデノ随伴ウイルスベクターは野生型ＡＡＶに由来し、これは非自己 複製型の代表的なパルボウイルスであり、直径約２５ｎｍの一本鎖ＤＮＡウイル スである。今日、血清学的に識別可能な種、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ− ３、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−５間で区別が可能である。ＡＡＶウイルスは宿主 細胞のゲノムに組み込まれるか、またはヘルパーウイルスの存在下、宿主細胞内 で複製できるかのいずれかである。まず第一に、アデノウイルスは可能性のある ヘルパーウイルスとして発見された。脊椎動物では、例えば、アデノウイルスは 血清学的に識別可能な８０を超える血清型の群をなし、外部の正二十面体タンパ ク質外被（キャプシド）と内部の中枢ＤＮＡ−タンパク質ボディー（コア）を含 んでいる。次ぎにキャプシドは２５２のサブユニット、いわゆるキャプソマーか らなっている。一般にアデノウイルスは、約７０〜９０ｎｍの直径を有し、遺伝 物質として、その５’および３’末端にＩＴＲ領域（逆方向末端反復配列）が存 在する二本鎖、直鎖ＤＮＡを含んでいる。今、ＡＡＶの複製（溶菌期）には、特 に、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよびＥ４遺伝子などのアデノウイルス初期 遺伝子およびＶＡ ＲＮＡの発現が必要である(Kotin，R.M．(1994)Human Gene Therapy，5，793-801)。しかしながら、ヒトおよび動物に病原性があり、約１２ ０〜２００ｎｍの直径を有し、正二十面体構造および１６２のキャプソマーから なるキャプシドを有する二本鎖ＤＮＡウイルス群であるヘルペスウイルスなどの 他のヘルパーウイルスもまた好適である。ヘルペスウイルスは３つのサブファミ リーに分類でき、例えば１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ア ルファーヘルペスウイリナエ(Alphaherpesvirinae)、サイトメガロウイルス（Ｃ ＭＶ）に属し、例えば、ベータヘルペスウイリナエ(Betaherpesvirinae)、およ びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に属し、例えば、ガンマヘルペスウイ リナエ(Gammaherpesvirinae)に属する。 レトロウイルスベクター同様、アデノ随伴ウイルスベクターを調製する際には 、例えば、複製に必要とされる１以上のｒｅｐ遺伝子（例えば、ｒｅｐ４０、ｒ ｅｐ５２、ｒｅｐ６８および／もしくはｒｅｐ７８）またはキャプシド構造に必 要とされるｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ−１、ＶＰ−２および／もしくはＶＰ− ３）を導入遺伝子で置換することができる。感染力のある組換えＡＡＶ粒子に導 入遺伝子を封入するためには、また組換えＡＡＶゲノムのＤＮＡの複製のために は、シス作用エレメントとして、５’および３’末端になお存在するＩＴＲ領域 が必要である(Kotin，R.M．(1994)，loc．sit)。 真核細胞の２種の組換えＡＡＶプラスミドおよびヘルペスウイルスとの同時ト ランスフェクション(Chiorini，J．A．et al．(1995)Human Gene Therapy，6，1 531-1541)は、比較的大量の組換えＡＡＶ粒子を製造するための有利な方法であ る。第１の組換えＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲ領域によってフランクされた 導入遺伝子を含む。第２の組換えＡＡＶプラスミドは、粒子を製造するために必 要とされるＡＡＶ遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含む。第２のベクター 中に機能的ＩＴＲ領域が存在しないことは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がＡＡＶ 粒子中に封入され、かくして望ましくない野生型ＡＡＶが形成されるのを防ぐ。 次いで、哺乳類細胞、例えば、組換えＡＡＶベクターおよびヘルパーウイルス、 例えばアデノウイルスの双方の複製を許容する、すなわち感染および複製に関す る必要条件を与えるＣＯＳ−７細胞を２種の組換えＡＡＶベクターおよびヘルパ ーウイルスでトランスフェクトする。アデノウイルスは、広いスペクトルの標的 細胞に感染でき、かつ、それら自身細胞内で複製できるので、ヘルパーウイルス としての使用に特に適している。トランスフェクト細胞を培養すると、ＡＡＶ非 構造タンパク質遺伝子およびＡＡＶ構造タンパク質遺伝子が発現し、導入遺伝子 のＤＮＡが複製し、組換えＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶ粒子）が封入および組み立てら れる。ｒＡＡＶ粒子は、ＩＴＲ領域により両末端でフランクされた、一本鎖ＤＮ Ａの形態の導入遺伝子を含む。同時に、これらの細胞ではヘルパーウイルスが複 製し、アデノウイルスをヘルパーウイルスとして用いる場合は、一般にいく分か 数日後に感染細胞が溶菌し、死滅するという結果になる。得られたウイルス（ア デノウイルスおよびｒＡＡＶ粒子）はいくらかは細胞培養上清に放出され、そう でなければ溶菌細胞に留まっている。このため、一般に、ウイルスの実質的に完 全な放出を達成するために、凍結と解凍を交互に行うことによるなど当業者に公 知の細胞破壊法を用いて、または例えばトリプシンによる酵素的加水分解により (Chiorini，J．A．et al．(1995)，loc．sit.)、細胞を破壊する。 ヘルパーウイルスを用いるウイルスベクターの製造に付随する重大な不利益は 、組換えウイルス粒子とヘルパーウイルスの混在集団が形成し、この集団をさら なる精製にかけなければならないということである。特に遺伝子治療にウイルス ベクターを使用する場合は、その病原性の可能性のためアデノウイルスの夾雑は 避ける、または最少にすべきである。 例えばＡＡＶ粒子を含有する混在集団においてアデノウイルスを涸渇させる、 または除去する慣例法としては、例えば密度勾配遠心分離もしくは熱不活性化、 またはこの２つの方法の組み合わせがある。この場合、密度勾配遠心分離の作用 様式は、アデノウイルス（１．３５ｇ／ｃｍ³）とＡＡＶ粒子（１．４１ｇ／ｃ ｍ³）の密度の微小な差に基づくものであり、例えばＣｓＣｌ密度勾配遠心分離 でこれを活用することができる。これらウイルス密度の差が小さく、かつ、アデ ノウイルスの量がＡＡＶ粒子の量より約１０〜１００倍多いため、ＣｓＣｌ密度 勾配遠心分離の後にＡＡＶ粒子とアデノウイルスが位置する領域は互いに極めて 近く、従って、１回以上の密度勾配を行うことによってもこれら２種のウイルス を定量的に分離することはできない。さらに、密度勾配遠心分離は比較的少量を 用いて行えるに過ぎないので、混在集団は比較的少量で存在していなければなら ない。従って、産業規模の慣例使用は技術的あるいは財政的に実行の可能性がな い。加えて、混在集団からアデノウイルスを定量的に分離することはできない。 熱不活性化の作用様式は、例えば異なる熱安定性を有するアデノウイルスおよ びＡＡＶ粒子に基づくものである。アデノウイルスとＡＡＶ粒子の混在集団を５ ６〜６５℃に加熱することで、ＡＡＶ粒子の活性にわずかの損失しか伴わずに、 アデノウイルスの多少選択的な熱不活性化がもたらされる。しかしながら、この 方法の不利な点は、この調製法を遺伝子治療に用いた場合、なお存在する変性し たアデノウイルスタンパク質が患者において強力な細胞性免疫応答を引き起こす 可能性があるということである(Smith，C．A．et al．(1996)J．Virol.，70，6 733-6740)。 また、ウイルスフリーでなければならない医薬品からウイルスの夾雑を分離す るためには、ナノメーター範囲で粒子が確実に除去される細孔径を有する濾過膜 が使用できることも知られている(Scheiblauer，H．et al．(1996)，Jahrestagu ng der Gesellschaft fur Virologie[Annual Conference of the Virology Soci ety]，Abstract No．P54)。Scheiblauer et al．(1996，loc．sit)はウイルスが それらの大きさに基づいて保持されることを指摘しているが、異なるウイルスが 定量的に分離されたという報告はなかった。 従って、本発明の目的は、混在集団中に存在する異なるウイルスが互いから分 離でき、かつ、比較的大量の場合でも使用できる方法を提供することにある。 今、意外にも、ウイルス含有溶液を１回以上の濾過にかけることにより、簡便 かつ産業規模に適用可能な様式で、異なる大きさのウイルスの、実質的に定量的 な、または遺伝子治療における使用に十分な分離が達成されることが判った。 従って本発明の主題のある部分は、異なる大きさのウイルスを分離する方法で あって、好ましくはウイルス含有溶液を１以上の濾過膜で濾過する方法である。 濾過膜はポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロメチレン、ポリプロピレ ン、変性もしくは非変性ポリエーテルスルホン、セルロースアセテート、セルロ ースニトレート、ポリアミドまたは再生セルロース、例えば銅アンモニア再生セ ルロース、好ましくはポリビニリデンフルオリドで構成されることが有利である 。約４０〜４００ｎｍの大きさの粒子の除去を可能にする細孔径を有するかかる 膜の例としては、約５０ｎｍもしくは約１００ｎｍの細孔径を有するPall GmbH 、63303 Dreieich製のUltipor膜、約１５ｎｍ、約３５ｎｍもしくは約７２ｎｍ の細孔径を有するAsahi Chemical Industry Ltd.，Tokyo Japan製のAsahi Chemi cal's Bemberg微孔質膜、またはSartorius AG，37075 GottingenもしくはSchlei cher and Schuell GmbH，37582 Dassel製のこれに相当する膜が挙げられる。一 般に、 本発明の濾過膜は約１２０ｎｍまで、特に約６０ｎｍまで、特別には約５０ｎｍ まで、好ましくは約２５〜６０ｎｍの粒子の除去を可能にする細孔径を有する。 好適な細孔径を有するフィルターの選択は、第１にまた主要には、分離するウイ ルスの大きさに依存し、そのウイルスは一般に約２５０ｎｍまで、好ましくは約 １２０ｎｍまで、特に約６０ｎｍまでの直径を有している。好適な細孔径を有す るフィルターを選択する場合のさらなる選択基準は、分離するウイルスの大きさ の差異であり、一般にその差異は少なくとも約５ｎｍ、好ましくは少なくとも約 １０ｎｍ、特に少なくとも約２０ｎｍ、特別には少なくとも約３０ｎｍ、最も好 ましくは約４０ｎｍになるべきである。当業者は分離するウイルスの大きさおよ びこれに起因する大きさの差異を基準として用い、次いで分離すべきウイルスを 分離するのに好適な細孔径を有するフィルターを選択することができる。選択し たフィルターの効力は、次いで慣例的に簡易濾過実験により容易に試験できる。 このように、ｒＡＡＶ粒子とアデノウイルスを分離するための特に有利な様式 では、約５０ｎｍを超える直径を有するウイルスの力価を減じることができる細 孔径を有するフィルター、好ましくはすでに前記にしたPall-Ultipor VE DV50膜 またはAsahi-Planova 35膜が好適である。特に、これらのフィルターにより、混 在集団から感染力のあるアデノウイルスの本質的な定量的除去を達成することが 可能となるばかりでなく、ｒＡＡＶ粒子の約７０〜９０％という高い収率を達成 することも可能となる。 本発明の意味の範囲内で、「細孔径」、「除去率」、「有効径」または「ある 最少サイズを有する粒子の除去を可能とする細孔径」が、様々なフィルター製造 業者により用いられているが、これらは同等の言葉である。 本発明の意味の範囲内で、ウイルスとは、天然に存在するウイルス、遺伝子操 作により改変されたウイルス、すなわちいわゆる組換えウイルスだけでなく、ウ イルス粒子、すなわち感染性および非感染性ウイルス、ＷＯ９６／１１２７２の パピローマウイルス様粒子のようなウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）、および核酸 を含有する、しかし中空、およびそれらの一部、特に１以上の、好ましくはいく つかのサブユニットまたはキャプソマー、特別にはいくつかのキャプソマーが会 合または結合した場合には、それらが少なくとも約５０％、好ましくは少なくと も８０％、特別には約９０％のキャプシドからなるキャプシドも包含する。特に ウイルスは、特に正二十面体対称を有する実質的球形を有する。 本発明によれば、ウイルスはそれらの大きさによって以下の３群に分類できる ： 第１群は、約６０ｎｍまでの直径を有するウイルスを表し、これらは一般に、 例えばフラビウイルスもしくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などの、約４０〜６ ０ｎｍの直径を有するフラビビリダエ(Flaviviridae)に、ヒトパピローマウイル ス１６もしくは１８（ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８）などの、約５５ｎｍの直径 を有するパピローマウイルス(papillomavirus)に、ポリオーマウイルス(polyoma virus)などの、約４５ｎｍの直径を有するパポバウイルス(papovavirus)に、Ｂ 型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの、約２２〜４２ｎｍの直径を有するヘパドナウ イルス(hepadnavirus)に、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）もしくはポリオウイルス などの、約２２〜３０ｎｍの直径を有するピコルナウイルス(picornavirus)、ま たはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの、約１８〜２６ｎｍの直径を有するパ ルボウイルス(parvovirus)、もしくは約２５ｎｍの直径を有するｒＡＡＶ粒子に 由来する。 第２群は、約６０ｎｍ〜１２０ｎｍまでの直径を有するウイルスを表し、これ らは一般に、例えば、約８０〜１２０ｎｍの直径を有するインフルエンザウイル スに、オンコウイルス(oncovirus)、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２などのレン チウイルス(lentivirus)、泡沫ウイルスもしくはＨＴＬＶウイルスなどの、約８ ０〜１２０ｎｍの直径を有するレトロウイルスに、約６５〜９０ｎｍの直径を有 するアデノウイルスに、コルチウイルス(coltivirus)もしくはロタウイルス(rot avirus)などの、約６０〜８０ｎｍの直径を有するレオウイルス(reovirus)に、 または約６０〜７０ｎｍの直径を有するトガウイルス(togavirus)に由来する。 第３群は、約１２０ｎｍ〜約２５０ｎｍのまでの直径を有するウイルスを表し 、これらは一般に、例えば、約１５０〜２５０ｎｍの直径を有するパラミクソウ イルス(paramyxovirus)に、またはＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２、ＣＭＶ、も しくはＥＢＶなどの、約１２０〜２００ｎｍの直径を有するヘルペスウイルスに 由来する。 本発明によれば、前記の群のうち１つのウイルスを特に有利に他の群のウイル スから分離することができる。しかしながら、前記の群のうち１つのおよび同一 の群に属する異なるウイルスもまた、好ましくはすでに前記で詳細に記載したよ うに、それらの大きさに十分な差異があれば互いから分離できる。特に、第１群 のウイルスは、第２群および／または第３群のウイルスから分離でき；特にＡＡ Ｖ粒子は特に有利にアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルスから分離で きる。 例えば、本発明の方法により、例えば１以上の密度勾配により精製した材料の 場合、および未精製の材料の場合のいずれの場合でも、特に有利な様式で、例え ばアデノウイルスを保持物中に残留させて、ｒＡＡＶ粒子を濾液中に存在させる ことで、ｒＡＡＶ培養物の上清からアデノウイルスを除去することが可能となる 。下記で詳細に記載するように、所望のウイルスの実際の分離に先立ち予備濾過 を行うことが有利である。 従って本発明の方法のもう１つの好まし具体例は、例えば１以上の密度勾配に よる、および／または１以上の予備濾過によるウイルス含有溶液の予備精製へと 拡張する。分離すべきウイルスは通過させるにもかかわらず、より大きな夾雑物 は保持する１以上の膜フィルターを用いる予備精製が特に好ましい。一般に予備 精製は、低速での遠心分離によってでさえ除去されない、または十分に除去され ないウイルス培養物の成分により、次の所望のウイルスの分離を行うフィルター の目詰まりを防ぐ、またはより起こりにくくする。これに関して、例えば、前記 の第１群のウイルスを予備精製するための膜フィルターは少なくとも約６０ｎｍ の細孔径を有し、一方、第１および／または第２群のウイルスを予備精製するた めの膜フィルターは少なくとも約１２０ｎｍの細孔径を有し、さらに第１、第２ および／または第３の群のウイルスを予備精製するための膜フィルターは少なく とも約２５０ｎｍの細孔径を有する。例えば、ｒＡＡＶ粒子とアデノウイルスの 混在集団を予備精製するためには、約１００ｎｍの細孔径を有する、Ｕｌｔｉｐ ｏｒＮ₆₆フィルター(Pall GmbH，63303 Dreieich)などの膜フィルターが特によ く適する。 もう１つの好ましい具体例では、ウイルス含有溶液のｐＨを好適な緩衝液、例 えばトリスＣｌ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）で約６〜１ ０に、好ましくは約７．０〜８．５に、特に約８．０に調整し、それにより例え ば収率、好ましくはＡＡＶの収率を高めることが可能となる。また、ウイルス含 有溶液がさらに、例えばウシ胎児血清（ＦＣＳ）または血清アルブミンの形態で タンパク質またはポリペプチドを含むならば特に好ましく、これに関しては、タ ンパク質の性質または起源は重要ではない。一般にタンパク質の割合は、例えば ＦＣＳの形態においては、約３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１５％（ｖ／ｖ） 、特に約１０％（ｖ／ｖ）以下である。 本発明の方法のもう１つの好ましい具体例では、約１ｃｍ²のフィルター面当 たり、少なくとも約１〜１０ｍｌ、好ましくは約２〜５ｍｌ、特に約３ｍｌのウ イルス含有溶液を、特別には約１ｃｍ²のフィルター面当たり約２〜２．５ｍｌ 以下の溶液を濾過する。一般に、これにより、例えばアデノウイルスの除去を達 成すると同時に例えばｒＡＡＶ粒子の高収率が達成される。例えば約１０００倍 の重力加速度（１０００ｇ）まで、好ましくは約５００ｇまで、特に約３００ｇ までの低速遠心分離による実際の分離に先立ち、ウイルス培養物中の細胞成分を 分離除去することが特に好ましい。これに関しては、次いですでに詳細に前記し たような予備濾過を行うことが有利である。このようにして、例えば、約３００ ｇで細胞成分を分離除去し、約１００ｎｍの細孔径を有する膜フィルターで混在 集団を予備濾過した後、２ｍｌ／ｃｍ²のフィルター面に対する約５０ｎｍの細 孔径を有するフィルターの能力を決定することが可能であった。本発明の意味の 範囲内で、能力とは、単位面積のフィルター面当たり、高収率の所望のウイルス が確実に得られる用量と理解される。 本発明の方法の有利な点は、特に簡便で費用がかからず、ゆえにまた工業規模 に適用できる、特に穏和な条件下での異なる大きさのウイルスの分離であり、こ の分離の結果、特に有利な様式で高収率の精製ウイルスが得られる。本発明のさ らに有利な点は、本発明に従い精製したウイルスは、他のウイルス、例えば病原 性ウイルスに対して十分フリーであるので、例えば遺伝子治療用のウイルスベク ターとして直接使用できるということである。このように、例えば、対応する溶 液との同時インキュベーション１４日後の期間内に複製が可能な細胞内で細胞病 理学的影響の進展が感染力のあるアデノウイルスの存在を示す複製試験を用いて 、本発明の方法に従い精製したｒＡＡＶ含有溶液ではいずれのアデノウイルスも 検出できなかった。さらに、ＰＣＲ反応およびＤＮＡハイブリダイゼーションの 使用により、アデノウイルスの核酸が少なくとも約３ｘ１０³倍、好ましくは約 １０³〜１０⁴倍の倍率まで低下したことが実証された。しかしながら、濾液中に 残存しているアデノウイルスＤＮＡの小さな残留断片は複製能のあるアデノウイ ルスとは関連がなく、従って無害である。アデノウイルス成分、例えば遊離して いるアデノウイルスタンパク質および部分ウイルス粒子の減少は、これらの成分 は、このウイルスベクターを患者における遺伝子治療に用いた場合には、完全に 非特 異的免疫応答を誘導でき、結局、遺伝子治療は疑わしいものと考えられたので、 特に驚くべきことであった。本発明の方法によれば、アデノウイルスの場合、例 えば力価の低下、すなわちそれにより除去すべきウイルスの力価が低下した倍率 は９ログを超え、すなわち、ｒＡＡＶ粒子と１０⁹のアデノウイルスの混在集団 を本発明に従い濾過した後には、濾液中ではアデノウイルスは検出されなかった 。 以下の実施例は本発明を明確にすることを意図するものであり、それに限定す るものではない。実施例 実施例 １ ｒＡＡＶ粒子とアデノウイルスの混在集団の濾過 １．１ Ｔ細胞同時刺激タンパク質Ｂ７−２をコードする遺伝子を導入遺伝子 として含むｒＡＡＶ２型粒子と野生型アデノウイルス５型の混在集団を、Chiori ni，J.A．et al(1995，loc．sit.)の方法に従い調製した。なおこれらの細胞は すでに顕著な細胞病理学的影響を示し、アデノウイルスの感染後３日で上清とと もに回収した。次いで、この細胞を上清とともに凍結と解凍を３回繰り返すこと により破壊した。不溶性細胞成分を３００ｇで１０分の遠心分離により除去した 。次いで、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含量を１０％に調整し、この調製物にトリス Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて最終濃度１００ｍＭとした。不溶性細胞成分 を除去し、調整した調製物を、予備フィルターとして０．１μｍの細孔径を有す るPall-Ultipor N₆₆膜（Pall GmbH，63303 Dreieich製）と２種のウイルスを分 離するためのPall-Ultipor VF DV50膜を含む濾過系に２．５バールにて送り込ん だ。このようにして、フィルター面１ｃｍ²当たり２ｍｌ以下の調製物を濾過し た。 １．２ Chiorini，J.A．et al(1995，loc．sit.)により作り上げられたプロ トコールに従い、出発物質はｒＡＡＶ粒子の細胞培養上清とした。細胞にアデノ ウイルスを感染させ３〜４日後に上清とともに細胞を合した。この調製物にトリ スＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて最終濃度３０ｍＭとした。細胞を破壊する ために、この懸濁物の凍結と解凍を３回繰り返した。濾過後、ＣｓＣｌ密度勾配 遠心分離によりウイルスを濃縮する工程を行った。 この調製物を、予備フィルターおよび３５ｎｍの細孔径を有するPlanova35中 空繊維濾過装置を有してなる濾過系に送り込んだ。予備フィルターには１．５バ ールの圧力をかけ、Planova35フィルターには０．５バールの圧力をかけた。濾 過容量としては、予備フィルターの場合には、多くともフィルター面ｃｍ²当た り２．５ｍｌとし、Planova35フィルターの場合には、多くともフィルター面ｃ ｍ²当たり７ｍｌとした。実施例２ 複製試験 Ｉ．ｒＡＡＶ調製物の一部を、実施例１のように、５ｃｍ²のフィルター面を 有する濾過系を用いて濾過した。濾液はいくつかの１．５ｍｌアリコートとして 回収した。対照アリコートは濾過をせずに残した。各々の場合において、濾過し たアリコートから、また濾過していない対照から７つの１：１０希釈段階を調製 した。複製試験については、４８ウェルプレートでＨｅＬａ細胞を密集細胞層と して増殖させた。これらのウェルから残容量１００μｌになるまで上清を抜き取 った。各々の場合において、濾過したアリコートの各々から、また濾過していな い対照から調製した１００μｌの希釈シリーズを、それぞれ１つのウェルに移し た。３時間ウイルスを細胞に吸収させた後、５００μｌの完全培地を加えた。１ 週間にわたり、毎日、細胞病理学的影響（ＣＰＥ）が見られるかどうかを調べる ために監視を行った。必要であれば培地を交換した。ＣＰＥはＨｅＬａ細胞中で 複製するウイルスにより生じると考えられる。複製は最後には感染細胞の死滅、 および後代ウイルスの放出という結果になる。 表１は典型的な結果を示す。濾過していない対照の場合には、第４希釈段階ま ではＣＰＥは検出できたが、実験した総ての濾過アリコートの場合には、細胞層 は７日後も完全であった。このことは、濾過していない材料における感染力のあ るアデノウイルスの力価は１０⁵／ｍｌの大きさのオーダーであったが、濾過材 料においてはもはや感染力のあるアデノウイルスは存在しなかったということを 意味する。保持物中、すなわち直接膜上に存在する、またそこに集められた材料 中には匹敵する力価が検出できた。 表１ ＨｅＬａ細胞を濾過した、また濾過していないひとまとめにした上清とともに 同時インキュベート後７日の細胞病理学的影響の進展 II．前記のように、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって濃縮したアデノウ イルス調製物のアデノウイルス力価を求めた。この力価の決定によれば、１０％ ＦＣＳおよび５０ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ８．０）を含有するＭＥＭ培地において 、ｍｌ当たり１０⁸のアデノウイルスが採取された。このアデノウイルス懸濁液 １０ｍｌを濾過系で実施例１に記載したように処理し、すなわち、総数１０⁹の 感染力のあるアデノウイルスを適用した。得られた濾液１０ｍｌを、８０％密集 ＨｅＬａ細胞を含有する培養表面１７５ｃｍ²に塗布した。このフラスコを５日 間インキュベートした。この期間の後、ＣＰＥは認められなかった。その後細胞 は密集し、長期の実験が望まれるので、この細胞を１：５に分割した。その後得 られた５つのＨｅＬａ培養物をさらに５日間にわたって観察した。依然としてＣ ＰＥは認められなかった。このことは濾液には感染力のあるアデノウイルスが全 く存在しないうことを示した。実施例３ アデノウイルス核酸の検出 ａ）ＲＴ−ＰＣＲ反応 実施例１に記載したようにｒＡＡＶ調製物の一部を濾過し、一部分を濾過せず に残して対照とした。各々場合において、メラノーマ細胞系統Ｍ３ＨＫ由来の３ ｘ１０⁶細胞を７５ｃｍ²細胞培養フラスコで増殖させた。このように４フラスコ を準備し、５０ＧｙのＸ線照射を行った。Ｘ線は外来遺伝子のｒＡＡＶ介在発現 の誘導に極めて強力な作用を有した。各々の場合において培地を抜き取り、各フ ラスコに血清を含まない完全培地１．５ｍｌを加えた。さらに次いで、０．５ｍ ｌの濾過していない対照上清をフラスコの１つに加え、２つの濾過アリコートの 各々から０．５ｍｌを２つのフラスコに加え、さらに負の対照として１つのフラ スコに培地を加えた。３７℃、１０％ＣＯ₂でのインキュベーション３日後、各 フラスコ中の細胞材料からＲＮＡを調製した(Chomchinski，P．and Sacchi，N. ，Anal．Biochem，162，156-159，1987)。ＲＮＡ調製物を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ 反応にかけた。アデノウイルス転写物および偏在するβ−アクチン転写物の検出 には、Cottenおよび共同研究者(Cotten，M.，Virology，205，254-261，1994)に より記載されたプライマー対を用いた。 濾過していない対照の場合には、５つの希釈段階のうち４つでアデノウイルス Ｅ１Ａ転写物が検出できたが、濾過アリコートを用いた希釈段階では、または負 の対照ではこの転写物を検出できなかった。これに対し、β−アクチン転写物は 並行して処理したサンプルの総てで検出できた。 ｂ）ＤＮＡハイブリダイゼーション 出発物質は実施例１に記載のような濾過したｒＡＡＶ調製物、ならびに濾過せ ずに残し、対照として用いるこの調製物の一部であった。濾過アリコートに、ま たは濾過していない対照にトリスＣｌ（ｐＨ７．８）を加えて最終濃度０．０１ Ｍとし、ＥＤＴＡについては最終濃度０．００５Ｍとし、ＳＤＳについては最終 濃度０．５％とし、ならびにプロテナーゼＫについては最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ とし、その後この混合物を５６℃で２０分間インキュベートした。 ５０μｌのプロテアーゼＫ処理サンプルを、変性させるために２００μｌの０ ．５Ｎ ＮａＯＨ中に取った。この混合物から０．５Ｎ ＮａＯＨ中の８つの１ ：１０希釈を調製した。さらに、同様の方法で、検出するＤＮＡ配列を有する既 知量のプラスミドから希釈シリーズを調製し、この希釈シリーズを次いで標準と して用いた。希釈シリーズをナイロン膜に点として施した。この膜をＤＮＡと共 有結合させるため８０℃でインキュベートし、次いでアデノウイルスＤＮＡに特 異的な標識サンプルを用いるサザンハイブリダイゼーションにかけた(Chiorini ，J．A．et al．(1995)，loc．sit.)。アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含有する ジゴキシゲニン標識制限断片をサンプルとして用いた。ナイロン膜上のアデノウ イルスＥ１Ａ ＤＮＡは、ジゴキシゲニンの免疫学的検出により視覚化した(Boe hringer Mannheim GmbH，Mannheim)。Ｅ１Ａ対照プラスミドに関する最少希釈段 階においては、２ｘ１０⁸の一本鎖ＤＮＡ分子が含まれていた。濾過していない 対照の 場合では、材料が検出可能であった最少希釈段階は、アデノウイルスゲノムの絶 対量が約５ｘ１０⁹であることを示した。これはＡＡＶ調製物中、約１ｘ１０¹⁰ ゲノム／ｍｌに相当すると考えられる。濾過アリコートの場合、ほとんどの場合 で最少希釈段階に弱いシグナルが検出でき、このシグナルは濾過していない対照 のそれより約３ｘ１０³〜１ｘ１０⁴倍弱く、これは１ｘ１０⁷〜３ｘ１０⁷ゲノム ／ＡＡＶ調製物ｍｌを表すと考えられる。しかしながら、実施例２に記載の試験 では、濾過アリコート中のこれらのゲノムは感染力のある粒子と結びついてはい ないが、非感染性形態で存在していることが示された。本濾過技術は、３ｘ１０³ 〜１ｘ１０⁴倍のこれらアデノウイルスゲノムの除去を達成した。実施例４ ウエスタンブロットにおけるアデノウイルス構造タンパク質IXの検出 アデノウイルス構造タンパク質IXが濾液中に存在しないことは、特異的抗体を 用いるウエスタンブロットで証明した。各々の場合において濾過アリコートから 、また濾過していない対照から、さらにアデノウイルス調製物から２μｌをゲル ロード緩衝液とともにタンパク質ゲルの１つのレーンに載せた。この材料を電気 泳動によって分離し(Laemmli，U.K.，Nature 227，680-685，1970)、ニトロセル ロース膜上に電気的にブロットした。このウエスタンブロットをアデノウイルス 構造タンパク質IXに特異的なウサギ抗血清とともにインキュベートした。標準的 な技術を用いて特異的バンドを視覚化した。構造タンパク質IXは濾過により除去 されたことが判った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 約１ｃｍ²のフィルター面につき、約１〜１０ｍｌのウイルス含有溶液を 濾過することを含んでなる、異なる大きさのウイルスを分離する方法。 ２． ウイルス含有溶液が１以上の濾過膜を通して濾過する、請求項１記載の方 法。 ３． 濾過膜が、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロメチレン、ポリプ ロピレン、変性もしくは非変性ポリエーテルスルホン、セルロースアセテー ト、セルロースニトレート、ポリアミドまたは再生セルロース、例えば銅ア ンモニア再生セルロース、好ましくはポリフッ化ビニリデン、で構成される 、請求項２記載の方法。 ４． 濾過膜が、最大約１２０ｎｍまで、特に最大約６０ｎｍまで、特別には最 大約５０ｎｍまで、好ましくは約２５〜６０ｎｍの細孔径を有する、請求項 ２または３のいずれかに記載の方法。 ５． ウイルスが、約２５０ｎｍまで、好ましくは約１２０ｎｍまで、特に約７ ０ｎｍまで、特別には約６０ｎｍまでの大きさのものである、請求項１〜４ のいずれか１項に記載の方法。 ６． 分離されるウイルスの大きさの差が、少なくとも約５ｎｍ、特別には少な くとも約３０ｎｍ、最も好ましくは約４０ｎｍである、請求項１〜５のいず れか１項に記載の方法。 ７． ウイルスが、特に正二十面体対称を有する実質的球形である、請求項１〜 ６のいずれか１項に記載の方法。 ８． ウイルスが、約６０ｎｍまでの直径を有する第１群のウイルスから、約６ ０ｎｍ〜約１２０ｎｍまでの直径を有する第２群のウイルスから、および／ または約１２０ｎｍ〜約２５０ｎｍまでの直径を有する第３群のウイルスか ら選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 ９． 第１群のウイルスが、フラビビリダエ(Flaviviridae)、パピローマウイル ス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、ピコルナウイルス、またはパル ボウイルスに、特にＡＡＶに、由来する、請求項８記載の方法。 １０． 第２群のウイルスが、インフルエンザウイルス、レトロウイルス、アデ ノウイルス、レオウイルス、またはトガウイルスに、特にアデノウイルスに 、由来する、請求項８または９記載の方法。 １１． 第３群のウイルスが、パラミクソウイルス、またはヘルペスウイルスに 、特にヘルペスウイルスに、由来する、請求項８〜１０のいずれか１項に記 載の方法。 １２． ウイルス含有溶液を予備精製する、請求項１〜１１のいずれか１項に記 載の方法。 １３． 予備精製を１以上の密度勾配の手段により、および／または１以上の予 備濾過の手段により達成する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法 。 １４． 予備濾過に１以上の膜フィルターを用いる、請求項１３記載の方法。 １５． 請求項８または９記載の第１群のウイルスを予備精製するための膜フィ ルターが少なくとも約６０ｎｍの細孔径を有し、一方、請求項８〜１０のい ずれか１項に記載の第１および／または第２群のウイルスを予備精製するた めの膜フィルターが少なくとも約１２０ｎｍの細孔径を有し、かつ、請求項 ８〜１１のいずれか１項に記載の第１群、第２群および／または第３群のウ イルスを予備精製するための膜フィルターが少なくとも約２５０ｎｍの細孔 径を有する、請求項１４記載の方法。 １６． ウイルス含有溶液のｐＨが、約６〜１０、好ましくは約７．０〜８．５ 、特に約８．０である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。 １７． ウイルス含有溶液がさらにタンパク質を含有する、請求項１〜１６のい ずれか１項に記載の方法。 １８． 溶液が、ウシ胎児血清または血清アルブミンの形態のタンパク質を含有 する、請求項１７記載の方法。 １９． タンパク質の割合が、約３０％(v/v)以下、好ましくは約１５％(v/v)、 特に約１０％(v/v)である、請求項１７または１８記載の方法。 ２０． 約１ｃｍ²のフィルター面につき、約２〜５ｍｌの溶液、特に約１ｃｍ² のフィルター面につき、約２〜２．５ｍｌ以下の溶液を濾過する、請求項１ 〜１９のいずれか１項に記載の方法。