ES2328093T3 - Procedimiento de filtracion para la separacion de virus. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la separación cuantitativa de virus de diferentes tamaños, caracterizado porque 1-10 ml por 1 cm 2 de superficie filtrante de una solución que contiene virus es filtrada a través de una o más membranas de filtro, la diferencia de tamaño de los virus a separar asciende a al menos 40 nm, los virus poseen esencialmente forma esférica, especialmente con simetría icosaedra, y porque se logra una reducción de título de los virus a separar de más de 9 log.

Description

Procedimiento de filtración para la separación de virus.

La presente invención hace referencia a un procedimiento para la separación cuantitativa de virus de diferentes tamaños, para lo cual 1-10 ml por 1 cm^{2} de superficie filtrante de una solución que contiene virus es filtrada a través de una o más membranas de filtro, la diferencia de tamaño de los virus a separar asciende a al menos 40 nm, los virus poseen esencialmente forma esférica, especialmente con simetría icosaedra, y se logra una reducción de título de los virus a separar de más de 9 log.

El objetivo inicial de la terapia génica era sanar enfermedades genéticas a través de la modificación apropiada de células corporales. Hoy en día el concepto terapia génica se extiende a células modificadas genéticamente, que también se pueden utilizar terapéuticamente para la sanación de enfermedades no condicionadas genéticamente, como por ejemplo enfermedades virales.

Para la modificación genética de células terapéuticamente efectivas se necesitan procedimientos adecuados para la transferencia del ácido nucleico, ADN o ARN, que ocasionan la modificación genética de la célula. Los ácidos nucleicos a transferir a menudo son denominados también, incluso si no cumplen las funciones de un gen, por ejemplo, ácidos nucleicos antisentido. Además de la transferencia directa de genes de los, así llamados, ácidos nucleicos desnudos, también han demostrado ser adecuados para la transferencia genética los virus modificados genéticamente. Actualmente se modifican genéticamente, entre otros, retrovirus, adenovirus o virus adenoasociados (AAV) para que puedan ser utilizados como portadores (vector viral) del o de los transgenes para la transferencia genética. Un punto de vista esencial en el desarrollo de vectores virales adecuados son los aspectos de seguridad en la aplicación de estos vectores en la terapia génica. Por ello en general se desarrollan virus de replicación deficiente, es decir virus, que a pesar de que pueden invadir una célula y pueden transferir el o los transgenes a la célula no se pueden multiplicar dentro de la misma. Esto se logra, por ejemplo, si se suprimen genes importantes para la multiplicación de los virus, por ejemplo los genes codificadores para las proteínas estructurales y eventualmente se inserta en su lugar el o los transgenes. En el caso de la fabricación de mayores cantidades de virus adecuados para la utilización genoterapeutica y no capaces de multiplicarse, son necesarios los, así llamados, virus auxiliares, que compensan el defecto en la célula en el caso de virus no capaces de multiplicarse. Los siguientes ejemplos de vectores retrovirales y vectores adenoasociados sirven para describir más detalladamente el principio general:

Vectores retrovirales de replicación deficiente se derivan de retrovirus de forma normal, los cuales representan una familia propia de virus eucarióticos, cuyo material genético (genes estructurales y genes reguladores) se compone de ARN de cadena sencilla. Los virus se componen de partículas de virus esféricas, recubiertas con un diámetro de aprox. 80-120 nm y una cápsula interior, que contiene dos copias del ARN genómico en forma de una proteína ribonucleica. Para la fabricación de vectores retrovirales se reemplazan, por ejemplo, uno o varios genes estructurales (gag, pol y/o env) por el o los transgenes. Las regiones LTR ("long terminal repeats") aún contenidas en el extremos 5' y 3' contienen elementos cis activos como elementos reguladores, como por ejemplo un promotor, señales de poliadenilización y secuencias necesarias para la integración genómica. Por ello el vector retroviral sólo puede contener las regiones LTR, que limitan el o los transgenes. Por ello, para la multiplicación de un vector retroviral de replicación deficiente se necesita, por ejemplo, un virus auxiliar que contenga uno o más de los genes estructurales retrovirales arriba mencionados y que de esa manera complemente el o los genes estructurales suprimidos (Whartenby, K. A. et al. (1995) Pharmac. Ther., 66, 175-190).

Vectores de virus adenoasociados de replicación deficiente se derivan de la forma normal AAV, que es un representante sin replicación autónoma de los parvovirus y representa un virus de ADN de cadena sencilla de aprox. 25 nm de diámetro. Al día de hoy se pueden distinguir los tipos AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4 y AAV-5, que presentan una serología diferente. Los virus AAV se pueden integrar al genoma de la célula huésped o, en presencia de un virus auxiliar, replicar en las células huésped. Como posibles virus auxiliares se encontraron primero adenovirus. Los adenovirus forman en vertebrados, por ejemplo, un grupo de más de 80 serotipos que se pueden diferenciar serológicamente y poseen una cubierta proteica exterior en forma de icosaedro (cápsida) y un cuerpo central interior de proteína de ADN (núcleo). La cápsida se encuentra compuesta, a su vez, de 252 subunidades, llamadas capsómeros. Los adenovirus poseen en general un diámetro de aprox. 70-90 nm y contienen un ADN de cadena doble, lineal como material genético, en cuyos extremos 5' y 3' se encuentran regiones ITR ("inverted terminal repeats"). La replicación de AAV (fase lítica) necesita especialmente la expresión de genes adenovirales anteriores, como por ejemplo el gen E1a, E1b, E2a y E4 y el VA-ARN (Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy, 5, 793-801). Sin embargo son adecuados también otros virus auxiliares, como por ejemplo el virus herpes, un grupo de virus de ADN de cadena doble de patógenos humanos y animales, con un diámetro de aprox. 120-200 nm, con lo cual la cápside presenta una estructura icosaedra y se encuentra conformada por 162 capsómeros. Los virus herpes se pueden dividir en tres subfamilias, con lo cual a los alphaherpesvirinae pertenecen, por ejemplo, virus herpes simples (HSV) del tipo 1 y tipo 2, a los betaherpesvirinae por ejemplo el citomegalovirus (CMV) y a los gammaherpesvirinae por ejemplo el virus Epstein-Barr
(EBV).

De manera análoga a los vectores virales, para la fabricación de vectores adenoasociados, por ejemplo uno o varios genes rep necesarios para la replicación (por ejemplo rep 40, rep 52. rep 68 y/o rep 78) o genes cap necesarios para la estructura de la cápside (por ejemplo VP-1, VP-2 y/o VP-3) se pueden reemplazar por el o los transgenes. Las regiones ITR aún existentes en el extremo 5' y 3' son necesarias como elementos cis activos para el empaquetamiento del transgen en partículas AAV recombinantes infecciosas, así como para la replicación de ADN del genoma recombinante AAV (Kotin, R. M. (1994), supra).

Un procedimiento ventajoso para la fabricación de grandes cantidades de partículas recombinantes AAV es la cotransfección de una célula eucariota con dos plásmidos recombinantes AAV y un virus auxiliar (Chiorini, J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy, 6. 1531-1541). El primer vector recombinante AAV contiene el o los transgenes, que son limitados por las dos regiones ITR. El segundo plásmido recombinante AAV contiene los genes AAV, que son necesarios para la fabricación de las partículas (genes rep y cap). La falta de regiones ITR funcionales en el segundo vector impide el empaquetamiento de los genes rep y cap en partículas AAV y con ello la generación del tipo no deseado de AAV en forma normal. A continuación se transfectan células de mamíferos, por ejemplo células COS-7 que son permisivas tanto para los vectores recombinantes AAV como también para el virus auxiliar, por ejemplo adenovirus, es decir que ofrecen la condición para la infección y la replicación, con los dos vectores recombinantes AAV y el virus auxiliar. Como virus auxiliar es apropiado especialmente el adenovirus, ya que puede infectar a un amplio espectro de células de destino y puede replicar en las células mismas. Durante el cultivo de las células transfectadas tiene lugar la expresión de los genes proteicos no estructurales AAV, de los genes proteicos estructurales AAV, la replicación de ADN transgénico y el empaquetamiento y la estructuración de las partículas recombinantes AAV (partículas rAAV). Las partículas rAAV contienen el o los transgenes, flanqueados a ambos lados por las regiones ITR, en forma de ADN de cadena sencilla. Simultáneamente, el virus auxiliar replica en estas células, lo que en el caso de adenovirus como virus auxiliares generalmente termina, después de algunos días, con la lisis y la muerte de las células infectadas. Los virus generados (adenovirus y partículas rAAV) se liberan parcialmente en el residuo de cultivo celular o permanecen en las células lisadas. Por ello en general, para una liberación esencialmente completa de los virus, las células son disgregadas con métodos de disgregación de células conocidos por los especialistas, como por ejemplo congelamiento y descongela-
miento alterno o con ayuda de una hidrólisis enzimática, por ejemplo con tripsina (Chiorini, J. A. et al. (1995), supra).

Una desventaja considerable en la fabricación de vectores virales con ayuda de virus auxiliares es el origen de una población mixta de partículas de virus recombinantes y virus auxiliares, que debe ser purificada. En el caso de la utilización de vectores virales en la terapia génica se debe evitar o minimizar especialmente la contaminación con adenovirus debido a la potencial patogenicidad.

Procedimientos usuales para el empobrecimiento o la separación de, por ejemplo, adenovirus de poblaciones mixtas con, por ejemplo, partículas AAV son el centrifugado de gradiente de densidad, la activación de calor o una combinación de ambos métodos. La forma de acción del centrifugado de gradiente de densidad se basa, en este caso, en una diferencia menor en la densidad de los adenovirus (1,35 g/cm^{3}) y de las partículas AAV (1,41 g/cm^{3}), que se puede aprovechar, por ejemplo, en el centrifugado de gradiente de densidad CsCl. Debido a la poca diferencia de densidad de los virus y de la cantidad aprox. 10 a 100 veces mayor de adenovirus que de partículas AAV, las áreas en las que se encuentran las partículas AAV y los adenovirus después del centrifugado de gradiente de densidad están muy próximas, de manera que no es posible una separación cuantitativa de ambos virus mediante una o varias gradientes de densidad. Además, la población mixta se debe encontrar en un volumen relativamente pequeño, ya que el centrifugado de gradiente de densidad se puede realizar sólo con relativamente poco volumen. Por ello, técnica y financieramente, no es posible una aplicación rutinaria a escala industrial. Además no se puede lograr una separación cuantitativa de adenovirus de la población mixta.

La forma de acción de la activación de calor se basa en una termoestabilidad diferente de, por ejemplo, adenovirus y partículas AAV. El calentamiento de una población mixta de adenovirus y partículas AAV a 56-65ºC conduce a una activación de calor más o menos selectiva de los adenovirus con una baja pérdida de actividad de las partículas AAV. La desventaja de este método es, sin embargo, que en el caso de la aplicación en la terapia génica las proteínas desnaturalizadas de adenovirus que aún se encuentran presentes en la preparación, pueden provocar en el paciente una fuerte respuesta celular inmune (Smith, C. A. et al. (1996) J. Virol., 70, 6733-6740).

También se conoce, que para la separación de contaminaciones virales de productos biofarmacéuticos, que deben estar libres de virus, se pueden implementar membranas de filtros con un tamaño de poros que garantice una tasa de separación de partículas en el rango nanométrico (Scheiblauer, H. et al. (1996), Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Abstract Nr. P54). Scheiblauer et al. (1996, supra) hace referencia a que los virus son retenidos debido a su tamaño, pero sin embargo no informa acerca de una separación cuantitativa de diferentes virus.

El documento DE 1951800 A (Zander Helmut, abril 1971) revela un procedimiento de limpieza de preparación en el modo de fabricación de vacunas como enfermedades virales, en el que en el modo de preparación de vacunas se introducen una o varias etapas de purificación con ayuda de vidrio de poro controlado (CPG).

Por ello es tarea de la presente invención, poner a disposición un procedimiento en el que diferentes virus contenidos en una población mixta se puedan separar, y que pueda ser utilizado también en grandes volúmenes.

Ahora, sorpresivamente se ha descubierto, que una separación de virus de diferentes tamaños esencialmente cuantitativa o suficiente para la utilización en la terapia génica mediante una o varias filtraciones de una solución que contenga virus se logra de una manera sencilla y que también puede ser aplicada a escala industrial.

Es por ello que un objeto de la presente invención es un procedimiento para la separación cuantitativa de virus de diferentes tamaños, para lo cual 1-10 ml por 1 cm^{2} de superficie filtrante de una solución que contiene virus es filtrada a través de una o más membranas de filtro, la diferencia de tamaño de los virus a separar asciende a al menos 40 nm, los virus poseen esencialmente forma esférica, especialmente con simetría icosaedra, y se logra una reducción de título de los virus a separar de más de 9 log.

De manera ventajosa las membranas de filtro se componen de polivinilidenofluoruro, politetrafluormetileno, polipropileno, poliétersulfona modificada o no modificada, acetato de celulosa, nitrato de celulosa, poliamia, especialmente celulosa regenerada de cupramonio, preferentemente polivinilidenofluoruro. Membranas de ese tipo con un tamaño de poros que permiten la separación de partículas con un tamaño de aprox. 40-400 nm, son por ejemplo las membranas Ultipor de la empresa Pall GmbH, 63303 Dreieich, con un tamaño de poros de aprox. 50 nm o aprox. 100 nm, las membranas Asahi Chemical's Bemberg Microporous de la empresa Asahi Chemical Industry Ltd., Tokio, Japón, con un tamaño de poros de aprox. 15 nm, aprox. 35 nm o aprox. 72 nm, o membranas correspondientes de la empresa Sartorius AG, 37075 Göttingen o Schleicher und Schuell GmbH, 37582 Dassel. En general, las membranas de filtros conforme a la presente invención poseen un tamaño de poros de aprox. 25-60 nm. La elección de un filtro con un tamaño de poro apropiado se ajusta principalmente al tamaño de los virus a separar, que en general poseen un diámetro de hasta aprox. 250 nm, preferentemente hasta aprox. 120 nm, especialmente hasta aprox. 60 nm. Otro criterio de selección para la elección de un filtro con un tamaño de poro apropiado es la diferencia de tamaño de los virus a separar, que en general debe ascender al menos a aprox. 5 nm, preferentemente al menos a aprox. 10 nm, especialmente al menos a aprox. 20 nm, sobre todo al menos a aprox. 30 nm y de manera especialmente preferida al menos a aprox. 40 nm. En base al tamaño de los virus a separar y a la diferencia de tamaño que resulta del mismo, el especialista puede escoger un filtro con un tamaño de poro apropiado para la separación de los virus a separar. La efectividad del filtro o de los filtros seleccionados puede ser probada rutinariamente de manera sencilla en base a sencillos experimentos de filtración.

Así, por ejemplo, un filtro con un tamaño de poro, que posibilita la reducción de título de virus con un diámetro mayor a aprox. 50 nm, preferentemente la membrana anteriormente mencionada Pall-Ultipor VF DV50 o la Asahi-Planova 35, se adecua de manera especialmente ventajosa para la separación de partículas rAAV y adenovirus. Especialmente estos filtros posibilitan, no sólo la separación esencialmente cuantitativa de adenovirus infecciosos de la población mixta, sino también una mayor ganancia de partículas rAAV de aprox. 70-90%.

Los conceptos "tamaño de poro", "tasa de separación", "tamaño efectivo" o "tamaño de poros que posibilita una separación de partículas con un determinado tamaño mínimo", que son utilizados por diferentes fabricantes de filtros, son conceptos equivalentes en el sentido de la presente invención.

El concepto virus comprende, en el sentido de la presente invención, no sólo virus en estado natural o técnicamente modificados, los así llamados virus recombinantes, sino también partículas de virus, es decir virus infecciosos como también no infecciosos, partículas semejantes a virus ("VLP"), como por ejemplo partículas semejantes a papillomavirus conforme a WO 96/11272. y cápsidas, que contienen ácidos nucleicos pero también pueden estar vacías y partes de ellas, especialmente una o varias, preferentemente varias subunidades o capsómeros, sobre todo cuando varios capsómeros se encuentran asociados o unidos de manera tal, que comprenden al menos aprox. 50%, preferentemente al menos aprox. 80%, sobre todo al menos aprox. 90% de la cápsida. Los virus poseen sobre todo una forma esencialmente esférica, especialmente con una simetría icosaedra.

Conforme a la presente invención los virus pueden ser divididos en los siguientes tres grupos según su tamaño:

El primer grupo representa virus con un diámetro de hasta aprox. 60 nm, que generalmente se derivan por ejemplo de flaviviridae con un diámetro de aprox. 40-60 nm, como por ejemplo flavivirus o virus de hepatitis C (HCV), de papillomavirus con un diámetro de aprox. 55 nm, como por ejemplo los virus papillomavirus humano 16 o 18 (HPV 16, HPV 18), de papovavirus con un diámetro de aprox. 45 nm, como por ejemplo el poliomavirus, de hepadnavirus con un diámetro de aprox. 22-42 nm, como por ejemplo el virus hepatits B (HBV), de picornavirus con un diámetro de aprox. 22-30 nm, como por ejemplo el virus hepatits A (HAV) o poliovirus, o de parvovirus con un diámetro de aprox. 18-26 nm, como por ejemplo virus adenoasociados (AAV) o partículas rAAV con un diámetro de aprox. 25 nm.

El segundo grupo representa virus con un diámetro de aprox. 60 nm hasta aprox. 120 nm, que generalmente se derivan por ejemplo de virus influenza con un diámetro de aprox. 80-120 nm, de retrovirus con un diámetro de aprox. 80-120 nm, como por ejemplo oncovirus, lentivirus, como por ejemplo HIV-1 o HIV-2, spumavirus o virus HTLV, de adenovirus con un diámetro de aprox. 65-90 nm, de reovirus con un diámetro de aprox. 60-80 nm, como por ejemplo coltivirus o rotavirus, o de togavirus con un diámetro de aprox. 60-70 nm.

El tercer grupo representa virus con un diámetro de aprox. 120 nm hasta aprox. 250 nm, que generalmente se derivan por ejemplo de paramixovirus con un diámetro de aprox. 150-250 nm, o de virus herpes con un diámetro de aprox. 120-200 nm, como por ejemplo HSV-1 o HSV-2, CMV o EBV.

Conforme a la presente invención los virus de uno de los grupos arriba mencionados se pueden separar de manera especialmente ventajosa de virus de los otros grupos. Pero también se pueden separar virus diferentes, que pertenecen a un mismo grupo de los arriba mencionados, siempre que exista una diferencia de tamaño suficiente, preferentemente como ya se ha descrito anteriormente. Especialmente, se pueden separar los virus del primer grupo de los virus del segundo y el tercer grupo, sobre todo se pueden separar partículas AAV de manera especialmente ventajosa de adenovirus y/o virus herpes.

El procedimiento conforme a la invención posibilita por ejemplo de manera especialmente ventajosa la separación de adenovirus, tanto en el caso de por ejemplo material purificado previamente mediante una a varias gradientes de densidades como también de materiales no purificados de los residuos de, por ejemplo, un cultivo rAAV, con lo cual los adenovirus permanecen en el retentato y las partículas rAAV se encuentran en la materia filtrada. Preferentemente, antes de la separación real de los virus deseados se lleva a cabo una filtración previa, como se detalla más
abajo.

Por ello, otra forma de ejecución preferida del procedimiento conforme a la invención se extiende a una purificación previa de la solución que contiene los virus, por ejemplo mediante una o varias gradientes de densidad y/o mediante una a varias filtraciones previas. Especialmente preferida es una purificación previa con ayuda de uno o varios filtros de membrana, que dejan pasar los virus a separar pero retienen impurezas más grandes. Mediante la purificación previa se impide o dificulta en general una obstrucción del filtro, que provoca la separación subsiguiente de los virus deseados, a través de componentes del cultivo de virus, que no se pueden eliminar o no se pueden eliminar de manera suficiente mediante centrifugado con bajo número de revoluciones. Para ello el filtro de membrana para la purificación previa, por ejemplo de virus del primer grupo arriba mencionado, posee un tamaño de poro de al menos aprox. 60 nm, para la purificación previa de virus del primer y/o el segundo grupo un tamaño de poro de al menos aprox. 120 nm o para la purificación previa de virus del primer, segundo y/o tercer grupo un tamaño de poro de al menos aprox. 250 nm. Por ejemplo un filtro de membrana con un tamaño de poro de aprox. 100 nm, como por ejemplo el filtro Ultipor N66 (Pall GmbH, 63303 Dreieich), es especialmente apropiado para la purificación previa de una población mixta de partículas rAAV y adenovirus.

En otra forma de ejecución preferida, el valor de pH de la solución que contiene los virus es ajustada, con ayuda de un tampón adecuado, por ejemplo tampón Tris-Cl-(tris(hidroximetil)aminometano), en aprox. 6-10, preferentemente en aprox. 7,0-8,5, especialmente en aprox. 8,0, con lo que por ejemplo se pueden aumentar ventajosamente las ganancias de AAV. También se prefiere especialmente si la solución que contiene los virus contiene adicionalmente proteína o polipeptido, por ejemplo en forma de suero de ternero fetal (FCS) o seroalbúmina, con lo que el tipo o la procedencia de la proteína no son esenciales. La proporción de proteína, por ejemplo en forma de FCS, en general no asciende a más del aprox. 30% (v/v), preferentemente aprox. 15% (v/v), especialmente aprox. 10% (v/v).

En otra forma de ejecución preferida del procedimiento conforme a la invención se filtran aprox. 2-5 ml, especialmente aprox. 3 ml de la solución que contiene virus por aprox. 1 cm^{2} de superficie filtrante, sobre todo no más de aprox. 2-2,5 ml de solución por aprox. 1 cm^{2} de superficie filtrante. De esta manera se logra en general una alta ganancia de, por ejemplo, las partículas rAAV, simultáneamente con una separación de, por ejemplo, los adenovirus. Especialmente se prefiere, separar los componentes de la célula en el cultivo de virus mediante centrifugado con bajo número de revoluciones, por ejemplo hasta aprox. la multiplicación por 1000 de la aceleración de la tierra (1000 g), preferentemente hasta aprox. 500 g, especialmente hasta aprox. 300 g, antes de la separación real. Además es ventajoso realizar a continuación una filtración previa, descrita más detalladamente arriba. De esta manera se pudo determinar, por ejemplo, la capacidad de un filtro con un tamaño de poro de aprox. 50 nm respecto 2 ml/cm^{2} de superficie filtrante después de la separación de los componentes de la célula con aprox. 300 g y filtración previa de la población mixta a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de aprox. 100 nm. Con capacidad en el sentido de la presente invención se hace referencia al volumen que garantiza una alta ganancia de los virus deseados por unidad de superficie superficie filtrante.

Las ventajas del procedimiento conforme a la invención son sobre todo una separación sencilla, económica y por ello también aplicable a escala industrial de virus de diferentes tamaños bajo condiciones especialmente cuidadosas, con lo que se obtiene, de manera especialmente ventajosa, una alta ganancia de virus purificados. Otra ventaja de la presente invención es que los virus purificados conforme a la invención se pueden implementar, por ejemplo, directamente como vectores virales para la terapia génica, ya que se encuentran suficientemente libres de otros virus, por ejemplo patógenos. Así, por ejemplo, en una solución que contiene rAAV purificada conforme a la invención no se pudieron comprobar adenovirus en base a una prueba de replicación, en la que la aparición de un efecto citopático en células permisivas dentro de un periodo de tiempo de, por ejemplo, 14 días después de la coincubación con una solución correspondiente indicaría la presencia de adenovirus infecciosos. Con ayuda de la reacción PCR y de hibridización de ADN se pudo comprobar, además, una reducción de ácidos nucleicos adenovirales en un factor de al menos aprox. 3 x 103, preferentemente aprox. 103-104 veces más. Sin embargo, la reducida proporción de ADN adenoviral que permanece en la materia filtrada no se encuentra asociada a adenovirus competentes para replicación, y de esta manera es inofensiva. La disminución de componentes adenovirales, como por ejemplo proteínas libras de adenovirus y partículas subvirales, ha sido especialmente sorpresiva, ya que estos componentes pueden provocar una respuesta inmune no específica en el paciente en el caso de la aplicación de vectores virales en la terapia génica y en consecuencia podrían poner en duda el tratamiento. La reducción de título, es decir el factor de la disminución del título de los virus a separar ascendió, por ejemplo en adenovirus conforme al procedimiento conforme a la invención, a más de 9 log, es decir que después de la filtración conforme a la invención de una población mixta de partículas rAAV y 109 adenovirus no se pudieron comprobar adenovirus en la materia filtrada.

Los siguientes ejemplos deben explicar más detalladamente la invención, sin limitar esta a los mismos:

Ejemplos Ejemplo 1 Filtración de una población mixta de partículas rAAV y adenovirus

1.1 Se elaboró una población mixta de partículas rAAV tipo 2, que contienen como transgen el gen codificador que coestimula la proteína B7-2 para las células T, y adenovirus tipo 5 en forma normal de acuerdo a la prescripción de Chiorini, J. A. et al. (1995, supra), con lo que 3 días después de la infección con los adenovirus se juntaron las células, que ya mostraban un fuerte efecto citopático, incluido el residuo. A continuación las células con residuo se disgregaron a través de congelamiento y descongelamiento, realizado tres veces. Los componentes celulares insolubles se separaron a través de un centrifugado de 10 minutos a 300 g. A continuación la proporción de suero de ternero fetal (FCS) se ajustó en un 10% y se añadió tampón Tris-Cl (pH 8,0) hasta una concentración final de 100 mM. La preparación separada de componentes celulares insolubles y ajustada fue admitida en un sistema de filtros a 2,5 bar, que contiene una membrana Pall-Ultipor N_{66} (empresa Pall GmbH. 63303 Dreieich) con un tamaño efectivo de 0,1 \mum como filtro previo, así como una membrana Pall-Ultipor VF DV50 para la separación de ambos virus. De esta manera no se filtraron más de 2 ml de la preparación por 1 cm^{2} de superficie filtrante.

1.2 El material de partida fue el residuo de cultivo celular de partículas rAAV de acuerdo al protocolo de Chiorini, J. A. et al. (1995, supra). Tres a cuatro días después de la infección con el adenovirus las células fueron purificadas junto con el residuo. A la preparación se añadió tampón Tris-Cl (pH 8,0) con una concentración final de 30 mM. La suspensión fue congelada y descongelada tres veces para la disgregación de las células. La etapa de la concentración de los virus a través de una concentración de gradiente de densidad CsCl fue agitada luego de la filtra-
ción.

La preparación fue pasada por un sistema de filtración, compuesto por un filtro previo y un elemento de filtración de 35 fibras huecas Planova, con un tamaño efectivo de 35 nm. El filtro previo fue cargado con una presión de 1,5 bar, el filtro 35 con una presión de 0,5 bar. La cantidad de volumen filtrado ascendió, en el caso del filtro previo, como máximo a 2,5 ml por cm^{2} de superficie filtrante y, en el caso del filtro Planova 35, como máximo a 7 ml por cm^{2} de superficie filtrante.

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Ejemplo 2 Prueba de replicación

I. Una parte de la preparación rAAV fue filtrada, como en el ejemplo 1, con un sistema de filtro que posee 5 cm^{2} de superficie filtrante. Las materias filtradas fueron recogidas en varias alícuotas de 1,5 ml. Una alícuota de control no fue filtrada. De las alícuotas filtradas, así como del control no filtrado se elaboraron, en cada caso, siete etapas de dilución 1:10. Para la prueba de replicación se cultivaron células HeLa en 48 cubetas como capa de célula confluente. El residuo fue decantado de las cubetas hasta un volumen restante de 100 \mul. De la serie de dilución de cada alícuota filtrada, así como del control no filtrado, se transpusieron en cada caso 100 \mul a cada uno de las cubetas. Después de 3 h de adsorción de los virus a las células se añadieron 500 \mul de medio íntegro. Durante una semana se controló diariamente, si aparecía un efecto citopático (CPE). En caso necesario se cambió el medio. El CPE sería provocado por la replicación de los virus en las células HeLa. Finalmente, la replicación concluye con la muerte de la célula infectada y con la liberación de los virus descendientes.

La tabla 1 muestra un resultado típico. Mientras que en el control no filtrado se pudo comprobar un CPE hasta la 4º etapa de dilución, la capa celular en todas las alícuotas filtradas examinadas se mostró intacta después de 7 días. Esto significa en el caso del material no filtrado un título de adenovirus infectados de 105/ml conforme a la magnitud, mientras que en el material filtrado ya no se encuentran adenovirus infectados. Un título similar se pudo comprobar en el retentato, es decir en el material existente y que se recogió directamente sobre la membrana.

TABLA 1

1

II. De una preparación adenovirus, que se concentró con un centrifugado de gradiente de densidad de cloruro de cesio, se determinó el título adenovirus en la forma arriba descrita. Conforme a esta determinación de título se registraron 108 adenovirus/ml en medio MEM con un 10% de FCS y 50 mM Tris-Cl (pH 8,0). De esta suspensión de adenovirus se trataron 10 ml con un sistema de filtro descrito en el ejemplo 1, es decir que en total se aplicaron 109 adenovirus infecciosos. Los filtrados de 10 ml resultantes se colocaron en una superficie de cultivo de 175 cm^{2} con un 80% de células confluentes HeLa. La botella fue incubada por 5 días. Después de este periodo de tiempo no se mostró CPE. Ya que en este momento las células eran confluentes y ya que se perseguía un tiempo de ensayo más prolongado, se dividieron 1:5. Los cinco cultivos HeLa resultantes fueron observados por otros 5 días. Al igual que antes no se produjo CPE. En consecuencia se dedujo una ausencia completa de adenovirus infecciosos en la materia filtrada.

Ejemplo 3 Comprobación de ácidos nucleicos adenovirales a) Reacción RT-PCR

Una preparación parcial rAAV se filtró como se explica en el ejemplo 1; una porción permaneció sin filtrar para el control. En cada caso se cultivaron 3 x 106 células de la célula melanoma M3HK en una botella de cultivo celular de 75 cm^{2}. Cuatro botellas de este tipo fueron preparadas y sometidas a una radiación de rayos X de 50 Gy. Los rayos X fomentaron fuertemente la expresión de genes extraños mediada por rAAV. En cada caso se decantó el medio y a cada botella se agregaron 1.5 ml de medio completo sin suero. Adicionalmente, a una botella se añadieron 0,5 ml del residuo de control no filtrado, a dos botellas 0,5 ml, en cada una, de dos alícuotas filtradas y a una botella medio como control negativo. Después de 3 de incubación a 37ºC y un 10% de CO_{2} se realizó a partir del material celular de cada botella, una preparación ARN (Chomchinski, P. und Sacchi, N., Anal. Biochem. 162, 156-159, 1937). La preparación ARN fue sometida a una reacción RT-PCR semicuantitativa. Para la comprobación de transcripciones adenovirales, así como de la transcripción omnipresente \beta-actina se utilizaron los pares primarios descritos por Cotten y colaboradores (Cotten, M., Virology, 205, 254-261, 1994).

Mientras que en el control no filtrado se pudo comprobar la transcripción adenoviral E1A en cuatro de las 5 etapas de dilución, esta trascripción no pudo ser demostrada en las alícuotas filtradas así como en el control negativo; transcripciones \beta-actina, en cambio, se pudieron comprobar en todos los paralelos.

b) Hibridización de ADN

El material de partida fue una preparación rAAV filtrada como se describe en el ejemplo 1, así como una parte no filtrada para el control. A las alícuotas filtradas, así como al control no filtrado, se añadió Tris-Cl (pH 7,8) hasta una concentración final de 0,01 M, EDTA hasta una concentración final de 0,005 M y SDS hasta una concentración final de 0,5%, así como proteinasa K hasta una concentración final de 20 mg/ml y se incubó 20 min a 56ºC.

50 \mul de las muestras tratadas con proteinasa K fueron absorbidas en 200 \mul 0,5 N NaOH para la desnaturalización. Con esto se elaboraron ocho diluciones 1:10 en 0,5 N NaOH. Adicionalmente se elaboró, como estándar, de manera análoga una serie de dilución de una cantidad de un plásmido con la secuencia de ADN a detectar. Las series de dilución se puntearon sobre una membrana de nylon. La membrana fue incubada a 80ºC para la unión covalente del ADN y luego fue sometida a una hibridización Southern con una muestra marcada específicamente para ADN adenovirus (Chiorini, J. A. et al. (1995), supra). Como muestra se utilizó un fragmento de restricción marcado con digoxigenin con el gen E1A del adenovirus. Los ADN adenovirus E1A en la membrana de nylon se hicieron visibles mediante comprobación digoxigenin inmunológica (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim). En la etapa de dilución más pequeña del plásmido de control E1A se colocaron 2 x 108 moléculas de ADN de cadena sencilla. La etapa de dilución más pequeña del control no filtrado, en la que se puede comprobar el material, mostró, de manera absoluta, aprox. 5 x 109 genomas adenovirus. A esto corresponderían aprox. 1 x 1010 genomas/ml en la preparación AAV. En las alícuotas filtradas, en la mayoría de los casos, se puede reconocer una señal débil en las etapas más pequeñas de dilución, que frente al control no filtrado es más débil en un factor aprox. de 3 x 103 a 1 x 104 y que representaría 1 x 107 a 3 x 107 genomas/ml de la preparación AAV. Los ensayos descritos en el ejemplo 2 mostraron, sin embargo, que en las alícuotas estos genomas no se presentan asociados a partículas infecciosas, sino que se encuentran en forma no infecciosa. Con la técnica de filtración se logró un empobrecimiento de estos genomas de adenovirus en un factor de 3 x 103 a 1 x 104.

Ejemplo 4 Demostración de la proteína estructural adenoviral IX en el Western-Blot

La falta de la proteína estructural adenoviral IX en la materia filtrada fue demostrada con anticuerpos específicos en el Western-Blot. En cada caso se cargaron en una huella de un gel de proteína 2 \mul de alícuota filtrada así como también de preparaciones adenovirus, junto con gel tampón de aplicación. El material se separó mediante electroforesis (Laemmli, U. K., Nature 227, 680-685, 1970) y sobre una membrana de nitrocelulosa se realizó electroblot. El Western-Blot se incubó con el antisuero de conejo específico para la proteína estructural adenoviral IX. Con técnicas estándar se pudieron observar bandas específicas. Se comprobó, que la proteína estructural IX fue separada por la filtración.

Claims (13)

1. Procedimiento para la separación cuantitativa de virus de diferentes tamaños, caracterizado porque 1-10 ml por 1 cm^{2} de superficie filtrante de una solución que contiene virus es filtrada a través de una o más membranas de filtro, la diferencia de tamaño de los virus a separar asciende a al menos 40 nm, los virus poseen esencialmente forma esférica, especialmente con simetría icosaedra, y porque se logra una reducción de título de los virus a separar de más de 9 log.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana de filtro se compone de polivinilidenofluoruro, politetrafluormetileno, polipropileno, poliétersulfona modificada o no modificada, acetato de celulosa, nitrato de celulosa, poliamia, especialmente celulosa regenerada de cupramonio, preferentemente polivinilidenofluoruro.

3. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la(s) membrana(s) de filtro poseen un tamaño de poros de 25-60 nm.

4. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los virus son seleccionados entre virus AAV, adenovirus o virus herpes.

5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la solución que contiene los virus es purificada previamente.

6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la purificación previa se realiza mediante uno o varios gradientes de densidad y/o mediante una o varias filtraciones previas.

7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6, caracterizado porque en el caso de la filtración previa mencionada se utiliza una o varias membranas.

8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7, caracterizado porque el o los filtros de membranas para la purificación previa posee un tamaño de poros de al menos 250 nm.

9. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el valor de pH de la solución que contiene los virus asciende a 6-10, preferentemente 7,0-8,5, especialmente 8,0.

10. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la solución que contiene los virus adicionalmente contiene proteína.

11. Procedimiento conforme a la reivindicación 10, caracterizado porque la solución mencionada contiene proteína en forma de suero de ternero fetal o seroalbúmina.

12. Procedimiento conforme a la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque la proporción de proteína no asciende a más del 30% (v/v), preferentemente 15% (v/v), especialmente 10% (v/v).

13. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se filtran aprox. 2-5 ml de solución por 1 cm^{2} de superficie filtrante, especialmente no más de 2-2,5 ml de solución por 1 cm^{2}.