EP0951538A2 - TEILSEQUENZEN VON GENEN DER PURINBIOSYNTHESE AUS $i(ASHBYA GOSSYPII) UND DEREN VERWENDUNG IN DER MIKROBIELLEN RIBOFLAVINSYNTHESE - Google Patents

TEILSEQUENZEN VON GENEN DER PURINBIOSYNTHESE AUS $i(ASHBYA GOSSYPII) UND DEREN VERWENDUNG IN DER MIKROBIELLEN RIBOFLAVINSYNTHESE

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EP0951538A2
EP0951538A2 EP97953928A EP97953928A EP0951538A2 EP 0951538 A2 EP0951538 A2 EP 0951538A2 EP 97953928 A EP97953928 A EP 97953928A EP 97953928 A EP97953928 A EP 97953928A EP 0951538 A2 EP0951538 A2 EP 0951538A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
microorganism
ashbya gossypii
particularly preferably
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97953928A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Philippsen
Markus Pompejus
Harald Seulberger
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP0951538A2 publication Critical patent/EP0951538A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin

Definitions

  • the present invention relates to partial sequences of genes of purine biosynthesis from Ashbya gossypii and their use in riboflavin synthesis.
  • Vitamin B2 also called riboflavin, is essential for humans and animals.
  • Vitamin B2 deficiency inflammation of the mucous membranes of the mouth and throat, itching and inflammation in the skin folds and similar skin damage, conjunctivitis, reduced visual acuity and clouding of the cornea occur. Growth and weight loss may occur in infants and children.
  • Vitamin B2 is therefore of economic importance, especially as a vitamin supplement in the case of a vitamin deficiency and as a feed additive. It is also used as a food coloring, for example in mayonnaise, ice cream, pudding, etc.
  • Vitamin B2 is produced either chemically or microbially (see e.g. Kurth et al. (1996) Riboflavin, in: Ulimann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim).
  • riboflavin is usually obtained as a pure end product in multi-stage processes, with relatively expensive starting products, such as D-Ribose, must be used.
  • An alternative to the chemical synthesis of riboflavin is the production of this substance by microorganisms. Renewable raw materials such as sugar or vegetable oils are used as starting materials.
  • riboflavin by fermentation of fungi such as Eremothecium ashbyii or Ashbya gossypii is known (The Merck Index, Windholz et al., Eds. Merck & Co., page 1183, 1983), but also yeasts, e.g. Candida, Pichia and Saccharomyces or bacteria, e.g.
  • Bacillus, clostridia or corynebacteria are described as riboflavin producers.
  • EP 405370 describes riboflavin-overproducing bacterial strains obtained by transforming the riboflavin biosynthesis genes from Bacillus subtilis.
  • the genes described there and other genes from prokaryotes involved in vitamin B2 biosynthesis are unsuitable for a recombinant riboflavin production process with eukaryotes, such as, for example, Saccharomyces cerevisiae or Ashbya gossypii.
  • DE4420785 describes six riboflavin biosynthesis genes from Ashbya gossypii, as well as microorganisms which have been transformed with these genes and the use of such microorganisms for riboflavin synthesis.
  • the invention relates to new partial sequences for new genes of
  • the invention relates to a gene fragment which contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence obtainable from SEQ ID NO: 1 by substitution, insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
  • Another object of the invention is a gene fragment which contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence obtainable from SEQ ID NO: 2 by substitution, insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
  • Another object of the invention is a gene fragment which contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence obtainable from SEQ ID NO: 3 by substitution, insertion or deletion of up to 15% of the nucleotides.
  • Another object of the invention is a gene fragment which contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence obtainable from SEQ ID NO: 4 by substitution, insertion or deletion of up to 20% of the nucleotides.
  • Another object of the invention is the use of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 for the construction of genetically modified microorganisms.
  • microorganisms can be any bacteria, but preferably bacteria of the genera Bacillus and Corynebacterium.
  • These microorganisms can be any eukaryotic microorganisms, preferably fungi of the genera Ashbya or Eremothecium, in particular Ashbya gossypii or yeasts, but preferably yeasts of the genera Candida, Pichia and Saccharomyces.
  • Another object of the invention is the use of such genetically modified microorganisms for the production of riboflavin.
  • Genomic DNA from Ashbya gossypii ATCC10895 can be prepared by conventional methods, for example as described in EP9703208.
  • the genomic library, based on this DNA can be prepared using conventional methods (e.g. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, FM et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and sons) in any plasmids, such as, for example, in pRS316 and other plasmids of the pRS series (Sikorski and Hieter (1989) Genetics, 19-27).
  • the size of the fragment of the Ashbya gossypii genomic DNA used is arbitrary, but Sau3A fragments between 2 and 9 kb in length are preferred, which can be cloned into a BamHI site.
  • Individual clones can be selected from E. coli clones which carry the library described in Example 1.
  • the cells can be cultured in suitable media (for example LB with 100 mg / 1 ampicillin) using conventional methods and plasmid DNA can be isolated from these cells.
  • suitable media for example LB with 100 mg / 1 ampicillin
  • the fragments of the genomic DNA from Ashbya gossypii are cloned into an interface of the polylinker of pRS plasmids (described in Example 1)
  • the nucleotide sequence of partial regions of the inserts can then be determined using suitable oligonucleotides and standard methods.
  • Sequence comparisons of newly identified sequences with existing DNA and protein databases can e.g. with BLAST algorithms (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410) or the Clustal algorithm with the help of the PAM250 weighting table or the Wilbur-Lipman DNA alignment algorithm (as for example in the program package MegAlign 3.06 from the company DNAstar implemented).
  • BLAST algorithms Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410
  • the Clustal algorithm with the help of the PAM250 weighting table or the Wilbur-Lipman DNA alignment algorithm (as for example in the program package MegAlign 3.06 from the company DNAstar implemented).
  • Example 3 If one examines clones as described in Example 2 and the sequences obtained as analyzed in Example 3, one finds sequences as described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • these sequences show the following similarities to partial regions of ADE4 genes, in particular to partial regions of the ADE4 gene from Saccharomyces kluyveri (gene bank entry SKU32992) and to partial regions of the ADE4 gene from Saccharomyces cerevisiae (gene bank entry YSCADE4) ): Nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1: 74% or 69% similarity, nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 2: 78% or 73% Similarity and nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 3: 81% and 75%
  • Glamin aminophosphosylpyrophosphate amidotransferase AgADE4
  • inosine 5 'monophosphate dehydrogenase AgGUAl
  • the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 can be used as probes to clone the complete gene for glutamine-phosphoribosylpyrophosphate-amidotransferase (AgADE4) from Ashbya gossypii.
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: can be used as a probe to clone the complete gene for inosine 5i monophosphate dehydrogenase (AgGUAl) from Ashbya gossypii.
  • AgGUAl inosine 5i monophosphate dehydrogenase
  • AgADE4 glutamine phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase
  • AgGUAl inosine 5i monophosphate dehydrogenase
  • microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae or other yeasts, as shown in WO9703208 or DE4420785.
  • genetically modified microorganisms can be constructed which differ from the natural situation in terms of the activity of genes or the number of copies of genes.
  • the microorganisms constructed in this way can be used for the biosynthesis of riboflavin.
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • GAGTGTGCCA ACCATTTAAA CAAACCTTAT CGCGAAGGAT TTGTCAAGAA CAGATATGTT 120
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • GAGTGTGCCA ACCATTTAAA CAAACCTTAT CGCGAAGGAT TTGTCAAGAA CAGATATGTT 120
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)

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Abstract

Teilsequenzen von Genen der Purinbiosynthese aus Ashbya gossypii, deren Herstellung und Verwendung.

Description

Teilsequenzen von Genen der Purinbiosynthese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mi robiellen Riboflavinsynthese
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Teilsequenzen von Genen der Purinbiosynthese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der Riboflavinsynthese.
Vitamin B2, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Seh- schärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme eintreten. Vitamin B2 hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminzusatz bei Vitaminmangel und als Futtermittelzusatz. Daneben wird es als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eis- creme, Pudding etc. eingesetzt.
Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z.B. Kurth et al. (1996) Riboflavin, in: Ulimann' s Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Hersteil erfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z.B. D-Ribose, eingesetzt werden müssen. Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganis - men. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z.B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z.B.
Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin- Produzenten beschrieben.
In der EP 405370 sind Riboflavin-überproduzierende Bakerienstämme beschrieben, die durch Transformation der Riboflavin-Biosynthese- Gene aus Bacillus subtilis erhalten wurden. Diese dort beschriebenen Gene und andere, an der Vitamin B2-Biosynthese beteiligten Gene aus Prokaryonten sind für ein rekombinantes Riboflavin-Her- stellverfahren mit Eukaryonten, wie z.B. Saccharomyces cerevisiae oder Ashbya gossypii ungeeignet. In der DE4420785 sind sechs Riboflavin-Biosynthesegene aus Ashbya gossypii beschrieben, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden und die Verwendung solcher Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese.
Mit diesen Verfahren ist es mΛglich, Produktionsstämme für die mikrobielle Riboflavinsynthese zu erzeugen. Diese Produktions- stamme besitzen jedoch häufig Stoffwechsellimitierungen, die durch die insertierten Biosynthesegene nicht beseitigt werden können oder manchmal erst dadurch entstehen. Daher ist es wünschenswert, weitere Teilbereiche von Stoffwechselwegen zu verstärken, dadurch Stoffwechselengpässe zu beseitigen und dadurch die für die mikrobielle Riboflavinsynthese eingesetzten Mikroorganismen bezüglich ihrer Fähigkeit zur Riboflavinsynthese weiter zu optimieren. Solche Optimierungen können durch genetische Veränderung von Mikroorganismen vorgenommen werden. Unter genetisch veränderten Mikroorganismen sind solche zu verstehen, die gegenüber der natürlichen genetischen Situation Unterschiede hinsichtlich der Aktivität von Genen oder der Genkopienzahl aufweisen.
Die Erfindung betrifft neue Teilsequenzen für neue Gene der
Purinbiosynthese und deren Verwendung für die mikrobielle
Riboflavinsynthese.
Der Purinstoffwechsel (für eine Übersicht siehe z.B. Voet, D. und Voet, J.G., 1994, Biochemie, VCH Weinheim, Seite 743-771;
Zalkin, H. und Dixon, J.E., 1992, De novo purine nucletotide biosynthesis, in: Progress in nucleic acid research and molecular biology, Vol. 42, Seite 259-287, Academic Press) ist ein für alle
Lebewesen essentieller Teil des Stoffwechsels.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Genfragment, welches die in SEQ ID NO:l dargestellte Nukleotidsequenz oder einer aus SEQ ID NO:l durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Genfragment, welches die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Nukleotidsequenz oder einer aus SEQ ID NO: 2 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Genfragment, welches die in SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleotidsequenz oder einer aus SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 15% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Genfragment, welches die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Nukleotidsequenz oder einer aus SEQ ID NO: 4 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der in SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO:4 dargestellten Nukleinsäuresequenzen zur Konstruktion genetisch veränderter Mikroorganismen.
Diese Mikroorganismen können beliebige Bakterien, bevorzugt aber Bakterien der Gattungen Bacillus und Corynebacterium sein. Diese Mikroorganismen können beliebige eukaryontische Mikroorganismen sein, bevorzugt Pilze der Gattungen Ashbya oder Eremothecium, insbesondere Ashbya gossypii oder auch Hefen, bevorzugt aber Hefen der Gattungen Candida, Pichia und Saccharomyces.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung derart genetisch veränderter Mikroorganismen für die Produktion von Riboflavin.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sowie deren Verwendung zur Herstellung von Mikroorganismen mit gesteigerter Riboflavin- synthese.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii ATCC10895
Genomische DNA aus Ashbya gossypii ATCC10895 kann nach üblichen Verfahren präpariert werden, z.B. wie beschrieben in EP9703208. Die genomische Genbank, ausgehend von dieser DNA, kann nach üblichen Methoden (z.B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and sons) in beliebigen Plasmiden, wie z.B. in pRS316 und anderen Plasmiden der pRS-Reihe (Sikorski und Hieter (1989) Genetics, 19-27) erstellt werden. Die Größe der verwendeten Fragment der genomischen DNA von Ashbya gossypii ist beliebig, bevorzugt sind aber Sau3A-Fragmente zwischen 2 und 9 kb Länge, die in eine BamHI Schnittstelle kloniert werden können. Beispiel 2
Analyse von Nukleinsäuresequenzen der genomischen Genbank Von E.coli Klonen, die die in Beispiel 1 beschriebene Genbank tragen, kann man Einzelklone selektieren. Man kann nach üblichen Methoden die Zellen in geeigneten Medien (z.B. LB mit 100 mg/1 Ampicillin) kultivieren und Plasmid-DNA aus diesem Zellen isolieren. Bei Klonierung der Fragmente der genomischen DNA aus Ashbya gossypii (Inserts) in eine Schnittstelle des Poly- linkers von pRS-Plasmiden (in Bsp. 1 beschrieben) kann dann mit geeigneten Oligonukleotiden und Standardmethoden die Nukleotidsequenz von Teilbereichen der Inserts bestimmt werden. Für diesen Zweck besonders geeignet sind die Oligonukleotide 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' und 5 ' -GGAAACAGCTATGACCATG-3 '
Beispiel 3
Computer-unterstützte Analyse gefundener Nukleotidsequenzen
Sequenzvergleiche neu identifizierter Sequenzen mit bestehenden DNA und Proteindatenbanken können z.B. mit BLAST Algorithmen (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410) oder dem Clustal Algorithmus mit Hilfe der PAM250 Gewichtungstabelle oder dem Wilbur-Lipman DNA alignment Algorithmus (wie z.B. in dem Programmpaket MegAlign 3.06 der Firma DNAstar implementiert) durchgeführt werden. Auf diesem Weg können Ähnlichkeiten der neu entdeckten Sequenzen mit bereits bekannten Sequenzen entdeckt und die neuen Teilsequenzen von neuen Genen in ihrer Funktion beschrieben werden.
Beispiel 4
Identifikation von E. coli Klonen, die Fragmente des Gens für Glutamin-Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase aus Ashbya gossypii (AgADE4) tragen.
Wenn man Klone wie in Bsp. 2 beschrieben untersucht und die erhaltenen Sequenzen wie in Bsp.3 analysiert findet man Sequenzen, wie in SEQ ID NO:l und SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO:3 beschrieben. Bei Verwendung des BLASTN Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigen diese Sequenzen folgende Ähnlichkeiten zu Teilbereichen von ADE4 Genen, insbesondere zu Teilbereichen des ADE4 Gens aus Saccharomyces kluyveri (Genbank entry SKU32992) und zu Teilbereichen des ADE4 Gen aus Saccharomyces cerevisiae (Gen- bank entry YSCADE4) : Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO:l: 74% bzw. 69% Ähnlichkeit, Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 2 : 78% bzw. 73% Ähnlichkeit und Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 3: 81% bzw. 75%
Ähnlichkeit.
Beispiel 5
Identifikation von E. coli Klonen, die Fragmente des Gens für Inosin-5i-Monophosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii (AgGUAl) tragen.
Wenn man Klone wie in Bsp. 2 beschrieben untersucht und die erhaltenen Sequenzen wie in Bsp.3 analysiert, findet man eine Sequenz, wie in SEQ ID NO: 4 beschrieben. Bei Verwendung des BLASTN Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigt diese Sequenzen 67% Ähnlichkeit zu Teilbereichen der Sequenz des Chromosoms XII und 65% Ähnlichkeit zu Teilbereichen der Sequenz des Chromosoms VIII aus Saccharomyces cerevisiae (Genbank entries YSCL9753 bzw. YSCH9177) . Es konnten Ähnlichkeiten zu verschiedenen Genen für Inosin-5' -Monophosphat-Dehydrogenasen gefunden werden, insbesondere 67% Ähnlichkeit zu Teilbereichen der Sequenz einer humanen Inosin-5i-Monophosphat-Dehydrogenaεe (Genbank entry HUMIMPH) .
Beispiel 6
Klonierung der kompletten Gene für Gl tamin-Phosphoribosylpyro- phosphat-Amidotransferase (AgADE4) und Inosin-5' -Monophosphat- Dehydrogenase (AgGUAl) aus Ashbya gossypii
Die in SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 dargestell- ten Nukleinsäuresequenzen kann man als Sonden dazu verwenden, das vollständige Gen für Glutamin-Phosphoribosylpyrophosphat-Amido- transferase (AgADE4) aus Ashbya gossypii zu klonieren. Die in SEQ ID NO: dargestellte Nukleinsäuresequenz kann man als Sonde dazu verwenden, das vollständige Gen für Inosin-5i-Monophosphat- Dehydrogenase (AgGUAl) aus Ashbya gossypii zu klonieren. Dazu kann man z.B. eine genomische Genbank von Ashbya gossypii, wie in Beispiel 1 beschrieben verwenden. Mit üblichen Methoden (siehe z.B. Sambrook, J. et al . (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) der Southern-Blot- Analyse und der Koloniehybridisierung kann man E. coli Klone identifizieren, die die vollständigen AgADE4 und AgGUAl Gene tragen. Beispiel 8
Verwendung der Gene für Glutamin-Phosphoribosylpyrophosphat- Amidotransferase (AgADE4) und Inosin-5' -Monophosphat-Dehydro- genäse (AgGUAl) aus Ashbya gossypii für die Verstärkung der Riboflavin Produktion
Man kann die Gene für Glutamin-Phosphoribosylpyrophosphat-Amido- transferase (AgADE4) und Inosin-5i-Monophosphat-Dehydrogenase (AgGUAl) aus Ashbya gossypii in Ashbya gossypii oder andere
Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae oder andere Hefen einbringen, wie in der WO9703208 oder der DE4420785 dargestellt. Auf diese Weise können genetisch veränderte Mikroorganismen konstruiert werden, die gegenüber der natürlichen Situation Unterschiede hinsichtlich der Aktivität von Genen oder der Genkopienzahl aufweisen. Die derart konstruierten Mikroorganismen kann man verwenden zur Biosynthese von Riboflavin.
SEQUENZPROTOKOLL (1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-67056
(G) TELEPHON: 0621/6048526 (H) TELEFAX: 0621/6043123 (I) TELEX: 1762175170
(ii) ANMELDETITEL: Teilsequenzen von Genen der Purinbiosynthese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mikrobiellen Riboflavinsynthese
(Üi) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 747 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(xi) SEQUENZBΞSCHREIBUNG : SEQ ID NO: 1:
GATCAGGCCG CTATTGTTTG GTGAGCGCGT CAACGATGAC GGCACCATGG GACTACATGC 60
TAGCGTCCGA AAGTGTCGTT CTTAAGGCCC ACCGCTTCCA AAACATACGT GATATTCTTC 120
CCGGCCAAGC CGTCATTATC CCTAAAACGT GCGGCTCCAG TCCACCAGAG TTCCGGCAGG 180
TAGTGCCAAT TGAGGCCTAC AAACCGGACT TGTTTGAGTA CGTGTATTTC GCTCGTGCTG 240
ACAGCGTTCT GGACGGTATT TCCGTTTACC ATACACGCCT GTTGATGGGT ATCAAACTTG 300 CCGAGAACAT CAAAAAACAG ATCGATCTGG ACGAAATTGA CGTTGTTGTA TCTGTTCCTG 360
ACACTGCACG TACCTGTGCA TTGGAGTGTG CCAACCATTT AAACAAACCT TATCGCGAAG 420
GATTTGTCAA GAACAGATAT GTTGGAAGAA CATTTATCAT GCCAAACCAA AAAGAGCGAG 480
TATCTTCTGT GCGCCGCAAG TTGAACCCAA TGAACTCAGA ATTTAAAGAC AAGCGCGTGC 540
TGATTGTCGA TGATTCCATT GTGCGAGGTA CCACTTCCAA AGAGATTGTT AACATGGCGA 600
AGGAATCCGG TGCTGCCAAG GTCTACTTTG CCTCTGCAGC GCCAGCAATT CGTTTCAATC 660
ACATCTACGG GATTGACCTA GCAGATACTA AGCAGCTTGT CGCCTACAAC AGAACTGTTG 720
AAGAAATCAC TGCGGAGCTG GGCTGTG 747 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 488 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GATCTGGACG AAATTGACGT TGTTGTATCT GTTCCTGACA CTGCACGTAC CTGTGCATTG 60
GAGTGTGCCA ACCATTTAAA CAAACCTTAT CGCGAAGGAT TTGTCAAGAA CAGATATGTT 120
GGAAGAACAT TTATCATGCC AAACCAAAAA GAGCGAGTAT CTTCTGTGCG CCGCAAGTTG 180
AACCCAATGA ACTCAGAATT TAAAGACAAG CGCGTGCTGA TTGTCGATGA TTCCATTGTG 240
CGAGGTACCA CTTCCAAAGA GATTGTTAAC ATGGCGAAGG AATCCGGTGC TGCCAAGGTC 300
TACTTTGCCT CTGCAGCGCC AGCAATTCGT TTCAATCACA TCTACGGGAT TGACCTAGCA 360
GATACTAAGC AGCTTGTCGC CTACAACAGA ACTGTTGAAG AAATCACTGC GGAGCTGGGC 420
TGTGACCGCG TCATCTATCA ATCTTTGGAT GACCTCATCG ACTGTTGCAA GACAGACATC 480
ATCTCAGA 488
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 447 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GATCTGGACG AAATTGACGT TGTTGTATCT GTTCCTGACA CTGCACGTAC CTGTGCATTG 60
GAGTGTGCCA ACCATTTAAA CAAACCTTAT CGCGAAGGAT TTGTCAAGAA CAGATATGTT 120
GGAAGAACAT TTATCATGCC AAACCAAAAA GAGCGAGTAT CTTCTGTGCG CCGCAAGTTG 180
AACCCAATGA ACTCAGAATT TAAAGACAAG CGCGTGCTGA TTGTCGATGA TTCCATTGTG 240
CGAGGTACCA CTTCCAAAGA GATTGTTAAC ATGGCGAAGG AATCCGGTGC TGCCAAGGTC 300
TACTTTGCCT CTGCAGCGCC AGCAATTCGT TTCAATCACA TCTACGGGAT TGACCCTAGC 360
AGGATACTTA AGCAGCTTGT CGCCCTACAA CAGAACTGTT GAAGAAATCA CTGCTGCAGC 420
TGGGCTGTGA CCCGCGTCAT CTATCAA 447
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 656 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISΞNSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Ashbya gossypii
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GATCTCAGAC ACAAGCAGGG TCTCGTCCTC GACAAACTGG ATGTCACGGG ACGTGATGAT 60
CCCCTGCAGC TTCCCGGTCG GCTTGCCATC ATCTGCTGAT GTGTTAGTAC ATGTTCCTGC 120 CAAAAAGGCG CTGCACGTCT GCGGTCAGAG TAAAAGGTGT CTACACGATC GTTTGATCGC 180
AGTCAGTAGA ACGAAAGTTA TTGATTTATG ATCATCATCC CAGCGTGCAG CCCCGCGTGC 240
CACTCTAACA TACCTGTCAC AGGAAATCCT GCAAACCCAA ACTCGTTCTT CATCCGGCGC 300
ACGTCCGCCA CCGTCGCGTC CGGCCCCACG ACCACGGGGG CGTTGATGAA CCCGTTTTCG 360
TACTTCTTGA CCCGGCGCAC CATCTCCGCC TGCTCCTCCG CAGTGCAGTT GTGGTGGATG 420
ATCCCGATGC CGCCCAGGAG CGCCATGTGG ATCGCCATGT CGGCCTCCGT CACCGTGTCC 480
ATCGGCGACG ACACAAACGG CGCGTTCAAG GTGATCTTCT TGGTCAGGCG CGACGACAGC 540
ACCACCTCCG ACGATGGGAA GTCGATCTTG CCCGGCAAGA ACARGAAGTC GTTGTACGTC 600
AACCCGCCCC GCGTCTTGGA GTTCATCAAC TGCTCCACGG ACAGCCCGTC CTTCTC 656

Claims

Patentansprüche
1. Genfragment, welches die in SEQ ID NO:l dargestellte
Nukleotidsequenz oder eine aus SEQ ID N0:1 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20%, bevorzugt bis zu 15%, besonders bevorzugt bis zu 10%, insbesondere bevorzugt bis zu 5% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
2. Genfragment, welches die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine aus SEQ ID NO: 2 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20%, bevorzugt bis zu 15%, besonders bevorzugt bis zu 10%, insbesondere bevor- zugt bis zu 5% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
3. Genfragment, welches die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine aus SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 15%, bevorzugt bis zu 10%, besonders bevorzugt bis zu 5% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
4. Genfragment, welches die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine aus SEQ ID NO: 4 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20%, bevorzugt bis zu 15%, besonders bevorzugt bis zu 10%, insbesondere bevorzugt bis zu 5% der Nukleotide erhältlichen Nukleotidsequenz enthält.
5. Verwendung einer oder mehrerer der Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur gentechnischen Konstruktion von Mikroorganismen, die zur Herstellung von Riboflavin in der Lage sind.
6. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Kultivierung von Mikroorganismen, die genetisch verändert worden sind, derart, daß mindestens ein Gen verändert wurde, welches Nukleotidsequenzen gemäß Anspruch 1 bis 4 enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium der Gattung
Bacillus oder Corynebacterium handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um einen eukaryontisehen Mikroorganismus handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um einen filamentösen Pilz handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei.dem Mikroorganismus um einen filamentösen Pilz der
Gattungen Ashbya oder Eremothecium handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um Ashbya gossypii handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um eine Hefe handelt.
14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um eine Hefe der Gattung
Candida, Pichia oder Saccharomyces handelt.
15. Verwendung einer oder mehrerer der Nukleinsäuresequenzen gemäß Anspruch 1-3 zur Isolierung des kompletten Gens für Glut- amin-Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase (ADE4) .
16. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 4 zur Isolierung des kompletten Gens für Inosin-5' -Monophosphat- Dehydrogenase (GUA1) .
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