JP2001509012A - アデニル酸シクラーゼ遺伝子及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列番号１のヌクレオチド６７１からヌクレオチド６２９５までに記載されたヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列からヌクレオチドの３０％まで、有利に２０％まで、特に１０％まで、特に有利に５％までの置換、挿入又は欠失により得られ、かつこの遺伝子産物がアデニル酸シクラーゼの酵素的活性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子及びその使用。

Description

【発明の詳細な説明】 アデニル酸シクラーゼ遺伝子及びその使用 本発明は、中心的細胞代謝における変更を引き起こし、かつ発酵プロセスにお けるファインケミカルのための産生率を増大させるために活用される、細胞ｃＡ ＭＰシグナル変換経路の活性の変更に関する。 酵素アデニル酸シクラーゼは、ＡＴＰからのｃＡＭＰの産生を触媒し、真核生 物においては、ｃＡＭＰを用いて酵素プロテインキナーゼＡによってシグナル変 換が制御される。ｃＡＭＰはプロテインキナーゼＡの調節サブユニットと結合し 、これがプロテインキナーゼＡを活性化させる（Taylor et al.，1990，Annual Rev Biochem:971-1005）。このキナーゼは、標的タンパク質の特定のセリンのヒ ドロキシル基をホスフェート基でエステル化することにより標的タンパク質の活 性を変更する。プロテインキナーゼＡは多様な細胞調節プロセスに関与している 。一方で、このキナーゼは若干の転写因子、例えば代謝酵素の合成速度の変更を 引き起こすＣＲＥＢ(Brindle and Montminy，1992，Curr Opin Genet & Dev，2 ，199-204)の活性を調節する。さらに、アデニル酸シクラーゼの産物（ｃＡＭＰ ）は解糖経路、糖新生経路及びグリオキシル酸経路の酵素の合成及び活性の両方 を制御するこ とにより中心的細胞代謝に関与する。このように、ｃＡＭＰは糖新生経路及びグ リオキサル酸経路の重要な酵素、例えばフルクトースビスホスファターゼ、ホス ホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ及びイソクエン酸リアーゼの合成を阻 害する（Boy-Marcotte et al.，1996，Microbiology，142:459-467)。他方で、 解糖経路の酵素、例えばホスホフルクトキナーゼの活性はｃＡＭＰにより媒介さ れるプロテインキナーゼＡ活性を高める（Kessler and Eschrich，1996，FEBS L ett.，395:225-227)。さらに、ｃＡＭＰにより活性化されたプロテインキナーゼ Ａは酵母中の炭水化物貯蔵の形成を失活させ、菌類（fungi）中の炭水化物貯蔵 の低下を刺激する（Pall and Robertson，1988，Biochem Biophys Res Commun， 150:365-370;Toda et al.，1985，Cell，40:27-36）。このように、アデニル酸 シクラーゼ活性により開始されるシグナルカスケードは細胞中での物質流動の調 節において決定的に関与している。特に、ｃＡＭＰシグナル変換は中心代謝にお ける物質流動の方向を変更し、ｃＡＭＰシグナル変換連鎖が二次代謝産物の合成 のための基質の提供においてさらに重要な役割を演じる。特定の二次代謝産物は 商業的に重要なファインケミカルである。これらのファインケミカルは例えばビ タミン、カロチノイド、アミノ酸、香料及び抗生物質である。 ファインケミカルは動物及びヒトの栄養素、化粧品工業及び医薬晶において広 範囲な工業的用途がある。さらに、カロチノイドは天然着色剤として使用される 。ファインケミカルは化学合成によるか、又はさらに発酵により工業的に製造さ れている。 酵母及び菌類中のアデニル酸シクラーゼの活性はＲＡＳ Ｇタンパク質により 制御される。ＲＡＳ Ｇタンパク質は例えば培地中のグルコース濃度のためのセ ンサーとして作用する（Field et al.，1990，Science，247;464-467）。培地中 のグルコースは、結合したＧＤＰとＧＴＰとの交換によりＲＡＳを活性化させる 。このプロセスはＲＡＳに対して特異的な交換因子により可能となる。ＧＴＰ結 合により活性化されたＲＡＳが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化し、次い でｃＡＭＰを形成する。このシグナル経路はｃＡＭＰに対して特異的なホスホジ エステラーゼにより遮断され、このホスホジエステラーゼはｃＡＭＰをＡＭＰへ 変換する（Ishikawa et al.，1988，Methods Enzymol.，159，27-42）。このよ うにアデニル酸シクラーゼは細胞の栄養摂取環境における変化に適応するための 中心的スイッチポイントである。より高度な真核生物において、アデニル酸シク ラーゼはヘテロトリマー（heterotrimeric）のＧタンパク質により調節される（ Federmann et al.，1992，Nature，356:159-161）。 また、原核生物においても、アデニル酸シクラーゼは代謝プロセスの調節に関 与している。ここでは、ｃＡＭＰは転写因子（ＣＲＰ）と結合することによりい くつかのカタボリックオペロンの発現を調節する（Tagami et al.，1995 Mol Mi crobiol，17，251-258）。 ファインケミカルの発酵による製造方法を最適化するために、所望の生成物を 製造する物質流動を増大させなければならない。 このことは多様な手段において達成することができる： − 所望の生成物を生じる代謝経路の負の調節機構の遮断、 − 所望の生成物を生じる代謝経路の酵素と競合する酵素の失活化、 - 所望の生成物を生じる代謝経路の酵素の量又は活性度の細胞中での増大。 細胞プロセスがより高度な調節機構に基づいて強調して進行しているため、こ のような調節機構が細胞中の物質流動を変更するための標的である。 従って、所望の生成物を生じる物質流動を増大させるように細胞中の調節メカ ニズムを変更することが課題である。 前記の課題は本発明により、細胞中の大多数の代謝経路の中心的レギュレータ ーを構成するｃＡＭＰ依存 性シグナル変換経路の活性を変更することで、物質流動を所望の生成物を生じる ような方向に向かわせることにより解決される。ｃＡＭＰ依存性シグナル変換経 路の活性を変更するように微生物を操作する多様な可能性が生じる。しかしなが ら、微生物中でのファインケミカルの産生を向上させるためにｃＡＭＰシグナル 変換経路の活性を変更することは、記載されていなかった。 ｃＡＭＰシグナル変換経路の活性を変更することにより微生物中でファインケ ミカルの産生率を高めるという一つの可能性は、実施すべき合成に依存して、ア デニル酸シクラーゼの酵素活性を細胞中で増大させるか又は低下させることにあ る。 酵素の量を増大させ、ひいては酵素活性を増大させることは、アデニル酸シク ラーゼをコードする遺伝子を高い反復頻度で変更すべき微生物中に導入するする か、又は酵素の合成を抑制する因子を取り除くことにより達成することができる 。また、アデニル酸シクラーゼの発現を制御する配列を、遺伝子の発現を増加さ せる配列と交換することもできる。さらに、酵素活性を増大することは、例えば 基質の転換を増大させるように酵素を突然変異させるか又は酵素インヒビターの 作用を破壊することにより達成することもできる。 また、プロテインキナーゼＡの活性化を行うｃＡＭＰ又は化学的ｃＡＭＰ誘導 体を培地中に添加すること もできる。 細胞中のアデニル酸シクラーゼの酵素活性を減少させるために、コード化され た遺伝子を撹乱させるか、又はアデニル酸シクラーゼ合成アクティヴェータの活 性を減少させることもできる。活性が減少したアデニル酸シクラーゼ突然変異誘 発を適用することもできる。このような突然変異誘発は、慣用の方法、例えばＵ Ｖ照射又は突然変異誘発性薬品により達成されるか、又は遺伝子工学による方法 、例えば欠失、挿入又は置換により行うことができる。 アデニル酸シクラーゼの遺伝子活性を変更することができるだけでなく、前記 したようなプロテインキナーゼＡ（触媒及び調節ドメイン）のホスホジエステラ ーゼ及びＲＡＳタンパク質（ＲＡＳ活性に影響を及ぼすタンパク質を含める）の 酵素活性を変更することも同様に可能である。 アデニル酸シクラーゼの酵素活性を変更するのが有利である。酵素活性を低下 させるために、アデニル酸シクラーゼ遺伝子を撹乱する。アデニル酸シクラーゼ 遺伝子を撹乱するために、アデニル酸シクラーゼをコードするＤＮＡ配列中に選 択マーカーを挿入する。次に、ＤＮＡ構造物を細胞中へ形質転換し、その際、ア デニル酸シクラーゼ遺伝子座は相同組換えによって撹乱される。こうして、この 細胞は官能性のアデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰを合成不能となる。 本発明の対象は、配列番号１中のヌクレオチド６７１からヌクレオチド６２９ ５までに示されたヌクレオチド配列を有する遺伝子、又は前記のヌクレオチド配 列からヌクレオチドの３０％まで、有利に２０％まで、特に有利に１０％まで、 さらに得に有利に５％までが置換、挿入又は欠失されることにより得られたヌク レオチド配列（その際前記の遺伝子産物はアデニル酸シクラーゼの酵素活性を有 する）を有する遺伝子である。 本発明は、さらに、出発生物と比較してファインケミカルの増大された産生を 行うことができる微生物を遺伝子工学により構築するための前記の１種以上の核 酸配列の使用に関する。出発生物とは、以後の記載において、所望のファインケ ミカルを産生することができるがしかし本発明により核酸配列に関して遺伝学的 変性は行われていない微生物の意味と解釈される。 本発明は、有利にリボフラビンの製造に適用される。 使用される有利な核酸配列は、アデニル酸シクラーゼ遺伝子である。アデニル 酸シクラーゼ遺伝子は有利に当該ファインケミカルを合成する微生物から単離さ れる。本発明による方法において使用される有利な微生物は、菌類及び酵母であ る。 しかしながら、他の微生物、例えば細菌を使用することもできる。リボフラビ ンを製造するために特に適 当な微生物はBacillus属の細菌及びCorynebacteria属又はBrevibacteria属のコ リネ型細菌、Candida属及びSaccharomyces属の酵母及びAshbya属及びEremotheci um属の菌類である。リボフラビンの製造のために得に適しているのは、Bacillus subtilis、Corynebacterium ammoniagenes、Candida flareri、Candida famata 及びAshbya gossypiiである。 アデニル酸シクラーゼ遺伝子は、プラスミド遺伝子ライブラリーをシークエン ジングにより、アデニル酸シクラーゼ遺伝子中での欠失を有する突然変異体の相 同又は非相同的補完により、又は非相同的プロービング又は非相同的プライマー を用いたＰＣＲにより単離することができる。サブクローニングのために、相補 的プラスミドの挿入は引き続き制限酵素を用いて適切に切断することによりサイ ズを最小にすることができる。推定遺伝子のシークエンジング及び同定の後に、 これを分子生物学的技術により選択マーカーのＤＮＡ配列に融合させる。アデニ ル酸シクラーゼ遺伝子の配列を有するこのプラスミドをアデニル酸シクラーゼ遺 伝子に切断し、この選択マーカーをその切断部位中へクローニングする。選択マ ーカーＤＮＡを組み立てるアデニル酸シクラーゼＤＮＡは、引き続き細胞内へ導 入される。 Ashbya gossypiiの遺伝子プラスミドライブラリーからのプラスミドの単離及 びシークエンジングは、 配列番号１で示されたヌクレオチド配列を有しかつヌクレオチド６７１からヌク レオチド６２９５までは配列番号２に示されたアミノ酸配列又はその対立遺伝子 変異体をコード化するアデニル酸シクラーゼ遺伝子を提供する。この対立遺伝子 変異体は特に、配列番号１中に示された配列から、ヌクレオチドの３０％までの 、有利に２０％までの、特に１０％までの、さらに有利に５％までの欠失、挿入 又は置換により得られた誘導体を包含する。 アデニル酸シクラーゼ遺伝子の上流に配置された配列は、特に配列番号１に示 されたようなヌクレオチド１〜６７０のヌクレオチド配列のプロモータ又はほぼ 同じ作用を有する配列である。このように、例えば、１個以上のヌクレオチドの 置換、挿入及び／又は欠失によって前記したヌクレオチド配列のプロモータとは 異なるが、プロモータの機能又は効果が損なわれていないプロモータを遺伝子の 上流に配置することができる。さらに、このプロモータはその配列を変更するこ とでその効果に関して変更することができるか、又は他のプロモータに完全に置 き換えることができる。 １種以上のＤＮＡ配列を、上流に配置されたプロモータを有しているか又は有 していないか又はターミネータ配列を有しているか又は有していないアデニル酸 シクラーゼ遺伝子の上流及び／又は下流に配置することができ、この遺伝子はそ の遺伝子構造体中に保持さ れる。 ｃＡＭＰシグナル変換経路を変更することによりファインケミカルのリボフラ ビン（ビタミンＢ２）の製造を増大させるのが有利である。しかしながら、他の ファインケミカルを製造するための他の発酵方法をこのような変更によって最適 化することもできる。リボフラビンは菌類、酵母又は細菌中で、有利に菌類のAs hbya gossypii中で製造される。 Ashbya gossypiiのリボフラビンを製造する微生物系統中でアデニル酸シクラ ーゼ遺伝子が撹乱されている場合、意外にも、グルコース含有培地上でのインキ ュベーションがリボフラビン形成を増大させることになることが明らかとなった 。特に、これは培養プレート上でリボフラビンにより生じる強い黄色を示す培養 を視覚的外観により確認され、この強い黄色は培地にｃＡＭＰを添加することに より弱められる。 図面の説明 図１は、Ashbya gossypiiのアデニル酸シクラーゼ遺伝子座を記載しており、 ベクターのｐＡＧ １０８０、１６９７及び１６１２によりカバーされたこのサ ブシークエンスが確認される。ベクターｐＡＧ １０８０及びベクターｐＡＧ １６１２は、アデニル酸シクラーゼ遺伝子座の全配列（ヌクレオチド６７１〜６ ２９５の配列をコードする）を含む。 図２は、プラスミドｐＡＧ １０８０のアデニル酸 シクラーゼ遺伝子断片中の重要な制限酵素用の切断部位を示す。例３中にも記載 されたＢｇＩＩＩ切断部位も示されている。 図３は、ベクターｐＡＧ−３３３ｂのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を示す。この 断片はアデニル酸シクラーゼ遺伝子座を撹乱するために用いることができる。 実施例 例１ Ashbya gossypiiのゲノム遺伝子ライブラリーの製造 Ashbya gossypiiのゲノムＤＮＡライブラリーを製造するために、染色体ＤＮ ＡをWright及びPhilippsen(1991，Gene 109:99-105)及びMohr(1995，PhD thesis ，Center for Biolgical Studies，Basle University，Switzerland)の方法によ り単離した。このゲノムＤＮＡを部分的にＳａｕ３Ａで消化し、ショ糖濃度勾配 中で分画した。最も長い断片を、ＢａｍＨＩを用いて切断したベクターｐＲＳ４ １６と連結させた（Sikorski and Hieter，1988，Genetics，122;19-27）。Ｅ． ｃｏｌｉ実験系統ＸＬ−１ブルーをこの連結したバッチを用いて形質転換し、生 じたクローンをアデニル酸シクラーゼ遺伝子を同定するために使用した。 例２ アデニル酸シクラーゼ遺伝子をコード化する断片の 選択 プラスミドを例１に記載されたいくつかのクローンから精製し、挿入物のＤＮ Ａを配列決定した。Wisconsin大学のＧＣＧプログラムに基づくコンピュータに よる相同検索により、ＤＮＡ配列がSaccharomyces cerevisiae及びSaccharomyce s kluyveriのアデニル酸シクラーゼと相同性を示すと確認された。プラスミドｐ ＡＧ１０８０（図１に示した挿入物）は、例えばアデニル酸シクラーゼの大部分 を含有し、これを配列決定した。プラスミドｐＡＧ１０８０と相補的なハイブリ ダイジングプローブを用いた他のプラスミドライブラリーのスクリーニングによ り、プラスミドｐＡＧ１０８０と一緒にAshbya gossypiiからのアデニル酸シク ラーゼ遺伝子（図１）の全ＤＮＡを含有するプラスミドｐＡＧ１６８７及びｐＡ Ｇ１６１２が検出された。この配列を配列番号１で示した。アデニル酸シクラー ゼをコードする部分はヌクレオチド６７１で始まり、ヌクレオチド６２９５で終 わる。ヌクレオチドレベルでAshbya gossypiiからのこのコード化された核酸配 列は、Saccharomyces kluyveriのアデニル酸シクラーゼと６６％の相同性を示し た。コード化領域から誘導されたAshbya gossypiiのアデニル酸シクラーゼのこ のアミノ酸配列は、Klyveromyces lactisのアデニル酸シクラーゼアミノ酸配列 と６３．５％の相同性を示した。 例３ Ashbya gossypii中のアデニル酸シクラーゼ遺伝子の撹乱のための構造体の製 造 ベクターｐＡＧ １０８０中に得られたアデニル酸シクラーゼ遺伝子断片を、 Ｂｇｌ ＩＩＩ（図２）で切断した。得られた末端を次にクレノウポリメラーゼ で補 r et al.，1996，Nucleic Acids Research，24:2519-2524）の１．６ｋｂのＥｃ ｏＲＶ−ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ断片と連結させた。ｐＡＧ １０８０のアデニル酸 シクラーゼ断片はカナマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ配列を含有し、かつＴＥＦ遺 伝子のプロモータ及びターミネータの配列（wach et al.，1994，Yeast，10:179 3-1808）はプラスミドｐＵＧ６からのｌｏｘＰを隣接している。このベクター構 造体から、特にアデニル酸シクラーゼサブシークエンスを含有するＮｏｔＩ−Ｅ ｃｏＲＩ断片を、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたベクターｐＢＳＩＩ−Ｓ Ｋ（以後ベクターｐＡＧ−３３３ｂと呼ぶ、図３）内へクローニングした。 例５ アデニル酸シクラーゼ遺伝子撹乱構造体のAshbya gossypii内への形質転換 ６．２ｋｂのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＡＧ−３３３ｂから切断し、発芽 したての芽胞の電気穿孔に より野生型Ashbya gossypii菌株内へ形質転換した。この野生型菌株はＡＴＣＣ 菌株１０８９５を意味すると解釈される。この形質転換体はアミノグリコシドＧ ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を成長培地（カゼイン ペプトン１％、酵母抽出物 １％、グルコース２％及びミオイノシトール０．１％）に添加することにより選 択することができる。この形質転換体を次にマイクロマニピユレーシヨンにより クローン的に精製し（steiner and Philipsen，1995，Genetics，140:973-987） 及びサザン分析によるアデニル酸シクラーゼ遺伝子の撹乱を試験した。例えば、 アデニル酸シクラーゼ遺伝子において所望の撹乱を示す菌株（ＡＧΔ１−Ｔ３３ ３ｂ）が見出された。 例６ Ashbya gossypiiのリボフラビン形成に関するアデニル酸シクラーゼ遺伝子の 撹乱作用 ｃＡＭＰ量によるリボフラビン産生に関する作用の意外な兆候が菌株ＡＧΔ１ −Ｔ３３３ｂにおいて得られた。菌類Ashbya gossypiiのアデニル酸シクラーゼ 撹乱物質において、３６ｍｇ／ｌのリボフラビン濃度が達成された。しかしなが ら、ｃＡＭＰ １ｍＭを培地（例５参照）に添加するとリボフラビン濃度は２３ ｍｇ／ｌに低下する。この値を測定するために、選択された形質転換体（例５） の液体培地を遠心分離し、上澄液のＯＤ₄₄₅が測定された（ε（リボフラビン） ＝１２５００リットルｍｏｌ^-1ｃｍ^-1）。 固体培地（寒天を添加した例５の培地を参照）上に成長したときの菌株ＡＧΔ １−Ｔ３３３ｂの視覚的外観を観察した場合、ｃＡＭＰをこの培地に添加するこ とがAshbya gossypiiコロニーの黄色の呈色（つまりリボフラビン形成）を減少 させる。つまり、野生型菌株と比較した場合、菌株ＡＧΔ１−Ｔ３３３ｂは、固 体培地上に成長したときに、黄色の呈色の増大が観察された。 これらの試験は、選択された試験条件下でリボフラビン産生に関するｃＡＭＰ の効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ヘニング アルトヘーファー ドイツ連邦共和国 Ｄ―67117 リンブル ガーホーフ マインシュトラーセ 12 (72)発明者 ハラルト ゾイルベルガー ドイツ連邦共和国 Ｄ―69221 ドーセン ハイム アダルベルト―シュティフター― シュトラーセ ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ｃＡＭＰ依存性シグナル変換経路の少なくとも１種の遺伝子に遺伝子的変 更を加えた微生物を培養することによる、ビタミン、カロチノイド、アミノ酸、 香料又は抗生物質の中から選択されたファインケミカルの製造方法。 ２． ｃＡＭＰ依存性シグナル変換経路の少なくとも１種の遺伝子に遺伝子的変 更を加えた微生物を培養することによるリボフラビンの製造方法。 ３． 配列番号１のヌクレオチド６７１からヌクレオチド６２９５までに示され たヌクレオチド配列又は前記のヌクレオチド配列からヌクレオチドの３０％まで 、有利に２０％まで、特に１０％まで、特に有利に５％までの置換、挿入又は欠 失により得ることができ、かつその遺伝子産物がアデニル酸シクラーゼの酵素活 性を有するヌクレオチド配列を含む遺伝子。 ４． 出発生物と比較して、ビタミン、カロチノイド、アミノ酸、香料又は抗生 物質の中から選択されたファインケミカルの産生を向上することができる微生物 を遺伝子工学により構築するための請求項１記載の１種以上の核酸配列の使用。 ５． 出発生物と比較して、リボフラビン（ビタミンＢ２）の産生を向上するこ とができる微生物を遺伝 子工学により構築するための請求項１記載の１種以上の核酸配列の使用。 ６． ｃＡＭＰ依存性シグナル変換経路の遺伝子がアデニル酸シクラーゼである 、請求項１又は２記載の方法。 ７． ｃＡＭＰ依存性シグナル変換経路の遺伝子が相応する微生物に対して相同 性のアデニル酸シクラーゼである、請求項１又は２記載の方法。 ８． 微生物が細菌である、請求項１から２及び６から７のいずれか１項記載の 方法。 ９． 微生物がBacillus属又はcorynebacterium属の細菌である、請求項１から ２及び６から７のいずれか１項記載の方法。 １０． 微生物が真核徴生物である、請求項１から２及び６から７のいずれか１ 項記載の方法。 １１． 微生物が糸状菌である、請求項１から２及び６から７のいずれか１項記 載の方法。 １２． 微生物がAshbya属又はEremothecium属の糸状菌である、請求項１から２ 及び６から７のいずれか１項記載の方法。 １３． 微生物がAshbya gossypiiである、請求項１から２及び６から７のいず れか１項記載の方法。 １４． 微生物が酵母である、請求項１から２及び６から７のいずれか１項記載 の方法。 １５． 微生物が、Candida属、Pichia属又はSacch aromyces属の酵母である、請求項１から２及び６から７のいずれか１項記載の方 法。