EP0689432A1 - Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren konzentraten mit pharmakologisch wirksamen estern von apocarotinolen - Google Patents

Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren konzentraten mit pharmakologisch wirksamen estern von apocarotinolen

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EP0689432A1
EP0689432A1 EP95902021A EP95902021A EP0689432A1 EP 0689432 A1 EP0689432 A1 EP 0689432A1 EP 95902021 A EP95902021 A EP 95902021A EP 95902021 A EP95902021 A EP 95902021A EP 0689432 A1 EP0689432 A1 EP 0689432A1
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EP
European Patent Office
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weight
esters
formulas
apo
surfactant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95902021A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Carl Eugster
Conrad Hans Eugster
Walter Haldemann
Giorgio Rivara
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Marigen SA
Original Assignee
Marigen SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated

Definitions

  • the present invention relates to ultramicroemulsions from spontaneously dispersible concentrates with esters of apocarotenols, new esters with apocarotenols, processes for their preparation and their use for the treatment of tumors, psoriasis and eczema.
  • Selected esters of apocarotenols surprisingly have a very good activity against tumors, psoriasis and eczema, especially when they have been incorporated into spontaneously dispersible concentrates which, when diluted with water, give rise to thermodynamically stable ultramicroemulsions with micelles with a hydrodynamic radius of 1. Have 5 to 3 nm. Measurements were carried out with (dynamic) quasi-elastic light scattering at the Institute for Polymers at E.T.H., Zurich (Prof. Dr. Pier Luigi LUISI and Prof. Dr. Peter SCHURTENBERGER).
  • esters with apocarotenols selected for the present invention have the formulas (I) to (IX):
  • n denotes the numbers 1, 2, 3, 4 or 5 and R2 for one of the radii of the formulas stands.
  • alkyl, alkenyl or alkapolyene groups i.e. the corresponding alkadienes, alkatrienes, alkatetraenes, alkapentaenes, alkahexaenes or alkapentaenes
  • alkynyl groups in R 1 can be straight-chain or branched.
  • R 1 is a C1 to Ci ⁇ -alkyl, a C2 to C18 alkenyl or alkapolyene, a C2 to Ci8 alkynyl group or a radical of the formulas (XII) and (XIII) denote:
  • Ri is a C4- to Ci ⁇ -alkyl, a C2- to C-
  • the compounds of the formulas (I) to (IX) can exist in various stereoisomeric or rotational forms. Examples of compounds of the formulas (I) to (IX) include:
  • the new compounds of the formulas (I) to (IX) can generally be prepared by the following known processes a) or b): a) reaction of a compound of formula (XIV)
  • R3 is a C- to C32-alkyl, a C2 to C32-alkenyl or alkapolyene, a C2 to C32-alkynyl group or a radical of the formulas (X) or (XI) stands with a chlorinating or brominating agent, such as Thionyl chloride, oxalyl chloride, and subsequent reaction with a compound of the formulas (XV) to (XXIII) at a temperature of 0 to 50 ° C with the supply of protective gas, in an inert solvent, such as e.g. Toluene or tetrahydrofuran, and in the presence of a catalyst, e.g. Pyridine, dimethylformamide or p-dimethylaminopyridine.
  • a catalyst e.g. Pyridine, dimethylformamide or p-dimethylaminopyridine.
  • the C30 alcohol was characterized as follows: unstable orange crystals with mp 148-149 ° C; ⁇ ma ⁇ (Petroleum ether): 426, 453 nm; O-acetyl compound: orange leaflets, mp 130-132 ° C, ⁇ a ⁇ (petroleum ether): 426, 452 nm; easy elimination reaction in chromatography experiments on Al2O3. No other, especially higher, esters have been described so far.
  • DIBAH diisobutylaluminium hydride
  • esters are prepared in an analogous manner with lauric acid, palmitic acid and stearic acid chloride. See technical supplement 1/2.
  • azafrinol can be isolated as a well-crystallized compound and then also characterized in detail. Azafrinol is thus obtained by crystallization from benzene / hexane in bright light orange-yellow needles.
  • the compound is particularly sensitive to acids and loses water as a result of ring splitting. This reaction already occurs during chromatography on silica gel.
  • the mixture is cooled again to -30 ° C and a corresponding amount of DIBAH solution is added.
  • a small excess of DIBAH does not have a significant impact on the yield, but a larger excess must be avoided.
  • small pieces of ice are added to the solution very carefully until foaming no longer occurs and the precipitation of aluminum hydroxide has ended.
  • the product is filtered off with suction and the filter cake is washed with a mixture of ether / isopropyl alcohol 5: 1 dye-free.
  • the yellow-orange colored filtrate is then evaporated in vacuo and the crystalline residue is dissolved hot in toluene / isopropyl alcohol 99: 1 and, in the event of turbidity, the solution is rapidly passed through a small, wide column filtered from CaCO3. The filtrate is evaporated again and the residue is recrystallized from hot benzene / hexane or ethyl acetate / hexane. After drying at 40 ° C / 0.01 Torr, 2.2 g of bright orange needles are obtained. Mp 133-134 ° C (vacuum tube). For the analytical details cf. the technical supplement 2/2.
  • UV / VIS (Et2 ⁇ , tormented): sharp three-band spectrum with ⁇ m ax 375, 394.5, 419 nm; (Tormented benzene): 377, 402, 428 nm.
  • UV / VIS (Et2 ⁇ , tormented): sharp three-band spectrum with ⁇ m ax 375, 394.5, 419 nm; (Tormented benzene): 377, 402, 428 nm.
  • analytical data cf. the technical Supplement 2/2.
  • the apocarotenes of the formulas (I) to (IX) surprisingly have an excellent antitumor effect, especially when they have been incorporated into spontaneously dispersible concentrates which are diluted with water and thermodynamically stable ultramicroemulsions with a hydrodynamic radius of 1.5 to 3 nm. (Measurements with dynamic, quasi-elastic light scattering QLS).
  • the present invention therefore essentially also relates to spontaneously dispersible concentrates with the apocarotenes esters of the formulas (I) to (IX).
  • the apocarotenes of the formulas (I) to (IX) are almost water-insoluble and polymer agglomerated compounds. However, in order that the molecules of these compounds diffuse through the membrane barrier of the tumor cells and become effective inside the cell, such compounds first have to be solubilized in a suitable manner in the aqueous medium.
  • the formation of thermodynamically stable oil-in-water ultramicroemulsions with the aid of specially selected cosurfactants or solubilizers on the one hand and suitable surfactants on the other hand enables an optimal degree of solubilization of the apocarotenes esters to be achieved.
  • the micelles of the ultramicroemulsions according to the invention with the active substance-containing inner phase are provided with a surfactant coat on their boundary layer, which makes them easy to diffuse through the cell membrane into the interior of the cell.
  • the diffusion through the plasma membrane of the cells takes place exclusively on the basis of thermal
  • the direction which a specific diffusion process takes is determined by the difference in concentration which exists on the plasma membrane between outside and inside the individual cell. The diffusion runs along the concentration gradient until it is broken down.
  • concentration of active substance or of the active substance system (“multiple drug system") is balanced between the extracellular zone and the interior of the individual cell, and delayed release effects ("slow release effects”) can also occur.
  • Such diffusion processes take place independently of any energy supply. They have no relation to cellular metabolic energy.
  • dm is the amount in moles of the active substance molecules penetrating a cell membrane surface q (in cm2) per time dt (in seconds) .
  • D is the diffusion coefficient and the difference in concentration over the distance dx.
  • the diffusion coefficient depends on the absolute temperature and the frictional resistance f
  • x is for a specific cell membrane a constant size, which is why they can be combined with the diffusion coefficient to form a new constant, the permeability coefficient P.
  • the expression - in the diffusion equation the flux is called J dt q and has the dimension mol per second per cm ?.
  • the negative sign on the right side of the diffusion equation indicates that the transport of the active substance molecules or the active substance system takes place in the direction of the decreasing concentration.
  • the concentrates which are dispersible spontaneously according to the invention contain:
  • flux enhancer a penetration enhancer
  • the surfactants or surfactant mixtures to be used according to the invention can be anionic, cationic, amphoteric or non-ionic. They are preferably photic or non-ionic and have an HLB ratio (ie a "hydrophilic-lipophilic ic balance") between 2 and 1 8; it is preferably between 2 and 6 on the one hand and 10 and 15 on the other. HLB values provide information about the hydrophilic and lipophilic properties of an emulsifier. See also "Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments" by Pau l Becher in the Journal of Dispersion Science and Technology 5 (1), 81-96 (1 984).
  • Suitable ionic surfactants can be so-called water-soluble soaps as well as water-soluble synthetic compounds.
  • Suitable as soaps are the alkali metal, alkaline earth metal or, if appropriate, substituted ammonium salts of higher fatty acids (C-10 to C22). such as. the natural Na or K salts of oleic or stearic acid, or of natural fatty acid mixtures, which among other things Made from coconut or tallow oil.
  • the surfactants also include the fatty acid methyl taurine salts and modified and unmodified phospholipids.
  • the fatty sulfonates and sulfates are generally in the form of alkali, alkaline earth or optionally substituted ammonium salts and generally have an alkyl radical having 8 to 22 carbon atoms, alkyl also including the alkyl part of acyl radicals. Examples of these are the Na or Ca salt of Liginsulfokla re. of dodecylsulfuric acid ester and sulfonic acids from Fatty alcohol-ethylene oxide add u cts.
  • the sulfonated benzimidazole derivatives preferably contain two sulfonic acid groups and a fatty acid residue with about 8 to 22 carbon atoms.
  • Alkylaryl sulfonates are, for example, the sodium, calcium or triethanolamine salts of dodecylbenzenesulfonic acid, dibutylnaphthalenesulfonic acid or a naphthainsulfonic acid-formaldehyde
  • nonionic surfactants available are primarily the polyglycol ether derivatives of aliphatic or cycloaliphatic alcohols, saturated or unsaturated fatty acids and alkylphenols, which groups 3 to 30 glycol ethers and 8 to 20 carbon atoms in the (aliphatic) hydrocarbon radical and 6 can contain up to 1 8 carbon atoms in the alkyl radical.
  • nonionic surfactants are the water-soluble polyethylene oxide adducts containing 20 to 250 ethylene glycol ether groups and 10 to 100 propylene ether groups on polypropylene glycol and alkylpolypropylene glycol having 1 to 10 carbon atoms in the alkyl chain.
  • the compounds mentioned usually contain 1 to 5 ethylene glycol units per propylene glycol unit.
  • non-ionic surfactants examples include:
  • fatty acid esters of polyoxyethylene sorbitan such as polyoxyethylene sorbitan trioleate, are also suitable.
  • the cationic surfactants are primarily quaternary ammonium salts which contain at least one alkyl radical having 8 to 22 carbon atoms as N substituents and, as further substituents, low, optionally halogenated alkyl, benzyl or low hydroxyl groups. have alkyl radicals.
  • the salts are previously in the form of halides, methyl sulfates or ethyl sulfates, e.g. the stearyltrinethylammonium chloride or the benzyldi (2-chloroethyl) ethylammonium bromide.
  • phosphoric acid ester surfactants such as, for example, tristyrylphenol polyoxyethylene-18-mono / d imethylphosphoric acid ester
  • Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), a hydroxybiphenyl-10-ethoxy
  • Butyl-mono-4-ethoxy-phosphoric acid ester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), or CH 3 - ⁇ CH 2 ) 3-CH-CH 2 -O (-CH 2 - CH 2 - O) 5 - -OCH,
  • betaine compounds i.e. amphoteric, salt and water-free imidazole derivatives, such as:
  • multi-functional glucose derivatives are also used, e.g. Glucate® SS (methyl glucose sesquistearate) and Glucamate® SSE-20 (PEG-20 methyl glucose sesquistearate) from Amerchol, Edison, N.J.
  • compositions that can be used as hydrotropes or as co-emulsifiers can be used, e.g .:
  • Polymethylbutenes may serve as examples.
  • Carboxylic acid (C ⁇ to C22). such as propylene glycol monolaurate and propylene glycol monomyristate.
  • Esters of an aliphatic alcohol (C12 to C22) with lactic acid e.g.
  • Cß to C22 aliphatic carboxylic acid
  • Glyceryl caprylate or Mig lyol® 812 neutral oil (oleum neutral).
  • an al iphatician carboxylic acid such as. aliphatic alcohols (C1 2 to C22). som it and others Dodecanol,
  • Tetradecanol Tetradecanol, oleyl alcohol, 2-hexyldecanol and 2-octyldecanol.
  • Esters with at least one free hydroxyl group from poly (2-10) glycol with an aliphatic carboxylic acid (C ⁇ to C22).
  • Heterocyclic compounds e.g. 1-methyl-2-pyrrolidone.
  • R4 denotes citronellyl, geranyl, farnesyl, phytyl or isophytyl and R5 denotes a C 1 -C 8 -acyl or C 2 -C 32 -alkenyl or alkapolyene group,
  • Suitable additives in the spontaneously dispersible concentrates according to the invention are vitamins and provitamins (such as vitamin A, retinol, tocopherols), as well as selected penetration enhancers (“flux enhaners”) and radial scavengers.
  • vitamins and provitamins such as vitamin A, retinol, tocopherols
  • fluorenhaners selected penetration enhancers
  • radial scavengers radial scavengers.
  • the daily dose required for pharmaceutical use is 0.001 to 25 mg / kg body weight, if possible divided into 2 to 3 individual doses.
  • the new esters with apocarotenols or the spontaneously dispersible concentrates can be combined with these compounds in the common pharmaceutical preparations and dosage forms such as dragées, tablets, capsules, powders, granules, pellets, solutions, ampoules, emulsions, creams or suppositories work in with the usual carriers and / or diluents and stabilizers.
  • the active substances or active substance mixtures forming the subject of the invention, and the spontaneously dispersible concentrates which contain these active substances or active substance mixtures, can be administered to humans orally, by injection (intravenously, subcutaneously or intramuscularly) or in another way. If they are prepared as solid dosage forms for oral use, this can take the form of tablets, granules, pellets, powders or capsules, etc.
  • the preparations can contain additives, for example a medicament carrier such as a saccharide or cellulose base, a binder such as starch paste or methyl cellulose, a filler or a disintegrant, etc. - additives being used as are customary in the production of medical or paramedical Formulations are used.
  • the active substances or active substance mixtures according to the invention reach oral administration as liquid dosage forms, they can have any form selected from aqueous preparations for internal use, from suspensions, emulsions and syrups etc. and they can also be in the form of vacuum-dried preparations which are put into solution or emulsion before being used.
  • the active substances or active substance mixtures according to the invention are prepared in the form of aqueous solutions, suspensions or oily or aqueous emulsions, preferably as microemulsions from the spontaneously dispersible concentrates conforming to the invention, they can also be injected.
  • the injection solutions are usually prepared shortly before use by dissolving or suspending the extracts or concentrates in aqueous, liquid media such as sterile water, glucose solution or physiological saline.
  • solvents, stabilizing agents, preservatives and additives for the production of isotonic solutions which are usually used can be added to an injection preparation.
  • the injection preparations obtained in this way are administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously or in another suitable manner.
  • the present invention also relates to pharmaceutical preparations which contain the active substances or mixtures of substances and / or the described, spontaneously dispersible concentrates for combating the growth of tumor cells.
  • Medicinal preparations are those for enteral (such as oral or rectal) as well as for parenteral or topical administration to warm-blooded animals, which contain the spontaneously dispersible concentrate alone or together with a pharmaceutically usable carrier material.
  • the dosage of the concentrates according to the invention depends on the warm-blooded species, the age and the individual condition, and on the mode of administration. For example, to achieve a killing effect of tumor cells on warm-blooded animals with low body weight, such as Mice, rats and hamsters, doses in the range of about 0.1 to 50 mg / kg of body weight when administered by successive administration, and doses in the range of 0.05 to 5 mg / kg of body weight by intraperitoneal administration.
  • the oral and rectal forms of the new pharmaceutical preparations contain between 1 - 95%, preferably between 1 0 - 95%, in particular between 20 - 95% of the spontaneously dispersible concentrate according to the invention.
  • Suitable pharmaceutically usable carriers for the oral forms are mainly fillers such as sugar (eg lactose, sucrose, mannitol or sorbitol), cellulose preparations and / or calcium phosphates (eg tri-calcium or calcium hydrogen phosphate), and also binders such as starch paste and use of ao Corn, wheat, rice or potato starch, gelatin, tragacanth, methyl cellulose, hydroxyl methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and / or polyvinyl pyrrolidone and / or disintegrants (if desired), such as the above-mentioned starches, furthermore carboxymethyl starch, cross-linked Poly ⁇ vinyl pyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof, such as Sodium alginate.
  • sugar eg lactose, sucrose, mannitol or sorbitol
  • cellulose preparations and / or calcium phosphates
  • the flow regulating agents are e.g. the polyethylene glycols No. 200 to 600 and higher are suitable.
  • the gelatin capsules preferred as a dosage form in humans are provided with suitable coatings, with, inter alia, concentrated sugar solutions (which may contain Arabian gum, talc, Pc. Yvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and / or titanium dioxide), lacquer solutions (aqueous or those that have been prepared using organic solvents) or enteric-resistant trains from solutions of suitable cellulose preparations, such as microcrystalline cellulose (Avicel®), acetylcellulose phthalate, hydroxylmethylcellulose phthalate (Metolose®), hydroxylpropylmethylcellulose acetate succinate (AQOAT®) or a copolymer such as Eudragit® L30D.
  • suitable cellulose preparations such as microcrystalline cellulose (Avicel®), acetylcellulose phthalate, hydroxylmethylcellulose phthalate (Metolose®), hydroxylpropylmethylcellulose acetate succinate (AQOAT®) or a copolymer such as Eudragit® L30D.
  • Plug-in capsules made of gelatin and a plasticizer, such as glycerol or sorbitol, are suitable as a pharmaceutical dosage form which is particularly suitable according to the invention and can be used orally.
  • the soft or hard gelatin capsules, as well as those made from AQOAT® (hydroxypropyl methyl cellulose acetate succinate), can be the spontaneously dispersible concentrate according to the invention in a mixture with fillers such as lactose, binders such as starch and / or lubricants such as talc or Magnesium stearate and optionally with stabilizers and antioxidants such as Contain ⁇ -, ß- or ⁇ -tocopherol.
  • suitable liquids such as liquid polyethylene glycols No. 200 to 600 can be recommended as a diluent, but stabilizers and antioxidants can also be added.
  • the concentrates according to the invention are mixed with distilled water.
  • Viscosity-increasing substances such as Na carboxymethyl cellulose, sorbitol, mannitol and / or dextran, and optionally also stabilizers and antioxidants can be added to the resulting aqueous injection microemulsion.
  • the pharmaceutical preparations for parenteral use preferably contain between 0.1 to 60%, and mainly between 1 to 40% of the spontaneously dispersible concentrate according to the invention.
  • topically applicable preparations which are primarily suitable for the prophylaxis and therapy of skin cancers, are for example creams, ointments, pastes, pomades, foams, tinctures and solutions which contain between 0.01 to 70% of the concentrate according to the invention.
  • creams and oil-in-water emulsions that contain more than 50% water old oil bases are used primarily as fatty alcohols, e.g. lauryl, cetyl or stearyl alcohol, liquid to solid waxes, e.g. isopropyl myristate, wool or beeswax and / or hydrocarbons such as petroleum jelly (petrolatum) or paraffinoel.
  • Suitable for emulsifying these oily bases are primarily surface-active, pharmaceutically compatible substances with predominantly hydrophilic properties, such as, for example, nonionic emulsifiers, and in advance fatty acid esters of polyalcohols or ethylene oxide adducts (such as polyglycerol fatty acid esters or polyethylene sorbitan fatty acid esters) with an H LB value of below 8.
  • Additives to the water phase include agents which reduce the drying of the creams, for example polyalcohols such as glycerin, sorbitol, propylene glycol and / or polyethylene glycols No. 200 to 600, also preservatives, fragrances, etc.
  • Ointments are water-in-oil emulsions that contain up to 70%, but preferably between 20 and 50% water or aqueous phases. Hydrogen primarily comes as the fat phase, e.g. Vaseline, paraffinoel and / or hard paraffins in question, which suitable hydroxide compounds to improve water retention, such as Fatty alcohols or esters, including cetyl alcohol or wool wax alcohols, are included.
  • suitable hydroxide compounds to improve water retention such as Fatty alcohols or esters, including cetyl alcohol or wool wax alcohols, are included.
  • emulsifiers with an HLB value of 8 to 16, e.g. Sorbitan fatty acid esters (such as sorbitan isostearol) are added.
  • Additions to the water phase include Humectants, such as polyalcohols (glycerin, propylene glycol, sorbitol and / or polyethylene glycols No. 200, 400, 600); also preservatives, fragrances, etc.
  • Fatty ointments are anhydrous and contain mainly hydrocarbons, e.g. Paraffin, petroleum jelly and / or liquid paraffins; natural or partially synthetic fats such as e.g. Coconut fatty acid triglyceride, further: fatty acid partial esters of glycerin, such as e.g. the fatty alcohols, emulsifiers and / or additives mentioned in connection with the ointments which increase the water absorption capacity.
  • hydrocarbons e.g. Paraffin, petroleum jelly and / or liquid paraffins
  • natural or partially synthetic fats such as e.g. Coconut fatty acid triglyceride
  • fatty acid partial esters of glycerin such as e.g. the fatty alcohols, emulsifiers and / or additives mentioned in connection with the ointments which increase the water absorption capacity.
  • Pastes are creams and ointments with secretion-absorbing powder components, such as metal oxides (for example titanium oxide or zinc oxide), talc and / or aluminum silicates, which have the task of forming existing moisture or secretions.
  • metal oxides for example titanium oxide or zinc oxide
  • talc for example titanium oxide or zinc oxide
  • aluminum silicates which have the task of forming existing moisture or secretions.
  • Foams are administered from pressure containers and are oil-in-water emulsions of the spontaneously dispersible concentrates according to the invention, in the form of aerosols, halogenated hydrocarbons (such as chlorofluoro-low-alkane: for example dichlorodifluoromethane and dichlorotetrafluoroethane) being used as blowing agents.
  • halogenated hydrocarbons such as chlorofluoro-low-alkane: for example dichlorodifluoromethane and dichlorotetrafluoroethane
  • there may be the usual additives such as preservatives, etc.
  • the ⁇ -apo-8'-carotenol-10-undecenoate is obtained with a melting point of 76-77 ° C, according to S internally from 75 "C; UV ⁇ max. 425 nm (in methylene chloride); Rf value in TLC with hexane / ethyl acetate (80:20) 0.92.
  • azafrinyl-10-undecenoate is also prepared in an analogous manner:
  • the main zone is eluted with toluene / isopropyl alcohol (99: 1), the filtrate is brought to dryness in vacuo. After recrystallization from benzene / hexane and AcOEt / hexane, bright yellow, very acid sensitive needles with an mp of 135 ° C. are obtained. Formation of azafrin-10'-ol [undec-10-enoyl] ester.
  • a phosphoric acid re-surfactant e.g. Diphasol® 3873 (CIBA-G EIGY), surfactant 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA-G EIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (Rhône-Poulenc) 5 to 90% by weight Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY).
  • a phosphoric acid re-surfactant e.g. Diphasol® 3873 (CIBA-G EIGY), surfactant 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA-G EIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (Rhône-Poulenc) 5 to 90% by weight Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY).
  • a penetration enhancer or a stabilizer and carriers and / or diluents 0 to 10% by weight of a penetration enhancer or a stabilizer and carriers and / or diluents.
  • Soprophor® FL 35 to 45% by weight of Soprophor® FL.
  • R4 is citronellyl, geranyl, farnesyl, phytyl or isophytyl and R5 is a C 1 -C 8 -acyl or C 2 to C32 alkenyl or alkapolyene group,
  • Invadin® JFC 800% 35 to 45% by weight Diphasol 3873 or Soprophor® FL.
  • Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g
  • MSR gastric juice resistance.
  • the pellets / granules according to a) can also be filled directly into capsules, which are made from AQOAT® (HPMC-AS-M or HPMC-AS-N), and sealed with acetone / ethanol 1: 1, and so the functions appropriately control the MSR and the delayed release (retard).
  • a biological assay system has been developed that works with micro titer plates and dilution series.
  • Each 1 ⁇ 4 / ml tumor cells are inactivated in culture medium RPMI 1640 with 10% fetal calf serum (GIBCO); they are sown so leaky that they can grow during the assay in so-called non-confluent monolayers.
  • the sample is added after 6 to 24 hours, with 100 ⁇ l per row, which is mixed with 100 ⁇ l medium in the 1st hole. Half of this is removed and placed in the following hole, again mixed with 100 ⁇ l of medium, etc.
  • a geometric dilution series n 1 / s is formed.
  • the samples are incubated in the plaque assay for 3 to 5 days at 37 ° C with 3 ⁇ % CO2. Then dye / fix with 0.1% crystal violet (Fluka, Buchs) in a solution of 70% methanol, 1% formaldehyde, 29% water. The evaluation is carried out on a microscope, magnification 300 times. The greatest cytotoxic dilution is determined. The quantitative evaluation can also be carried out by means of scanning and absorption measurement on the spectrophotomer.
  • CYTOTOXICITY TEST with Py6 cells virus transformed mouse fibroblasts
  • AOT Fluka 86139
  • AOT bis-2-ethylhexyl sulfosuccinate Na salt.
  • CYTOTOXICITY TEST with Py6 cells virus transformed mouse fibroblasts
  • 8'-APOCAROTIN-10- 1 640 * 000 32 million UNDECENOAT
  • AZAFRINYL-10- 1 256 * 000 25.6 million UNDECENOAT VITALITY TEST with human tumor cell lines A HL 60 promyeolytic LEUK ⁇ MIE 1 x 104 cells per well
  • the morphological differences between the transformed and the non-transformed cells can still be determined in the in-vitro test even at the end of the test on the surviving populations.
  • the transformed cells have longer filopodia and retain this characteristic.
  • the active substance peak appears after approx. 4 minutes. Resolution up to 0.5 ppm.
  • UV / VIS (Et2 ⁇ , tormented): sharp three-band spectrum with ⁇ m ax 375, 394.5, 419 nm; (Tormented benzene): 377, 402, 428 nm.
  • the apocarotenes esters used in accordance with the invention extinguish the fluorescence in the long-wave UV light range caused by the marker Uvitex CF conc, or Uvitex EBF, or Tinopal GS; a blue color develops on the thin-layer plate. UV scanning at 366 nm. Control using micellar capillary zone electrophoresis, (Beckman Instruments, P / ACE System 2100).
  • M monocytes (macrophages)
  • N neutrophil granulocytes
  • E eosinophilic granulocytes

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Abstract

Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren Konzentraten mit pharmakologisch wirksamen Estern von Apocarotinolen, deren Verwendung als Arzneimittel mit Wirksamkeit gegen Tumore, Psoriasis und Ekzeme, neue Ester mit diesen Apocarotinolen, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung werden beschrieben.

Description

ULTRAMIKROEMULSIONEN AUS SPONTAN DISPERGIERBAREN KONZENTRATEN MIT PHARMAKOLOGISCH WIRKSAMEN ESTERN VON
APOCAROTINOLEN
EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Ultramikroemulsionen aus spontan dis- pergierbaren Konzentraten mit Estern von Apocarotinolen, neue Ester mit Apocarotinolen, Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie ihre Verwendung zur Behandlung von Tumoren, Psoriasis und Ekzemen.
Ausgewählte Ester von Apocarotinolen haben überraschenderweise eine sehr gute Wirkung gegen Tumore, Psoriasis und Ekzeme, insbesondere dann, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit Wasser verdünnt thermodynamisch stabile Ultramikro¬ emulsionen ergeben mit Mizellen, die einen hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm aufweisen. Messungen wurden durchgeführt mit (dynamischer) quasielastischer Lichtstreuung am Institut für Polymere an der E.T.H., Zürich (Prof.Dr. Pier Luigi LUISI und Prof.Dr. Peter SCHURTENBERGER).
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die für die vorliegende Erfindung ausgewählten Ester mit Apocarotinolen haben die Formeln (I) bis (IX) :
(I)
(II)
(III)
(IV)
(V)
(VI)
CH,
(VII)
(VIII)
(IX)
wobei in den Formeln (I) bis (IX) Ri eine C-|- bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C32-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formeln (X), bzw. (XI) darstellt:
R2— (-C H=C H- ϊ H, C=C H-) n
(X)
(XI) worin n die Zahlen 1, 2, 3, 4 oder 5 bezeichnet und R2 für eines der Radi¬ kale der Formeln steht.
Die Alkyl-, Alkenyl-, bzw. Alkapolyengruppen (d.h. die entsprechenden Alka- diene, Alkatriene, Alkatetraene, Alkapentaene, Alkahexaene oder Alka¬ pentaene), sowie die Alkinylgruppen bei Ri können geradkettig oder ver¬ zweigt sein.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bis (IX), worin Ri eine C1- bis Ciβ-Alkyl-, eine C2- bis C18-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis Ci8-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formeln (XII) und (XIII) bezeichnet :
(XIII)
Besonders wichtig sind Verbindungen der Formeln (I) bis (IX), worin Ri eine C4- bis Ciβ-Alkyl-, eine C2- bis C-| 8-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C18-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formel (XII) darstellt.
Die Verbindungen der Formeln (I) bis (IX) können in verschiedenen stereo¬ isomeren oder Drehformen vorliegen. Beispiele von Verbindungen der For¬ meln (I) bis (IX) sind u.a.:
8'-Apo-ß-carotin-3-ol-10-undecenoat
8'-Apo-ß-carotin-3,8'-ol-di-10-undecenoat
3,,4'-Dihydro-2'-apo-ß-carotin-2-ol-10-undecenoat ß-Apo-12'-carotin-12'-ol-10-undecenoat ß-Apo-10'-carotin-10'-ol-10-undecenoat ß-Apo-8'-carotin-8'-ol-10-undecenoat ß-Apo-δ'-carotin-δ'-ol-laurat ß-Apo-8'-carotin-8'-ol-pa Imitat ß-Apo-8'-carotin-8'-ol-10-stearat ß-Apo-6'-carotin-6'-ol-10-undecenoat
Azafrinyl-10-undecenoat
Azafrinyl-Iaurat
Azafrinyl-pa Imitat
Azafrinyl-stearat
Die neuen Verbindungen der Formeln (I) bis (IX) lassen sich allgemein nach folgenden, an sich bekannten Verfahren a) oder b) herstellen: a) Umsetzung einer Verbindung der Formel (XIV)
R3 COOH (χ,V) worin R3 für eine C1- bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C32-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formeln (X), oder (XI) steht, mit N.N'-Carbonyidiimidazol bei 0 bis 50 °C unter Schutzgaszuleitung und Zusatz einer katalytischen Menge eines Alkoho- lates in einem indifferenten Lösungsmittel und anschliessender Alkoholyse der gebildeten Imidazolide mit einer Verbindung der Formeln (XV) bis (XXIII):
(XV) ß-Apo-12'-carotin-12'-ol Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv.Chim.Acta 42., 847-864 (1959)
(XVI) ß-Apo-10'-carotin-10'-ol Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv.Chim.Acta 42, 847-864 (1959)
(XVII) ß-Apo-8'-carotin-8'-ol Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv.Chim.Acta 42., 847-864 (1959)
(XVIII) ß-Apo-6'-carotin-6'-ol Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv.Chim.Acta 42, 847-864 (1 959)
(XIX) ß-Apo-4'-carotin-4'-ol Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv.Chim.Acta 4_2, 847-864 (1959)
(XX) ß-Apo-2'-carotin-2'-ol Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv.Chim.Acta 42., 847-864 (1959)
(XXI) Azafrinol; (5R,6R)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydro-10'-apo-carotin-10'-ol Totalsynthese: W. Eschenmoser und CH. Eugster, Helv.Chim.Acta 6_1_, 822 (1978). Merck-Index 11.911
(XXII) ß-Citraurol; ß-Citraurinol Synthese: H. Pfander et al., Helv.Chim.Acta 63., 716-727, (1980)
(XXIII) ß-Citraurin; ß-Citraurinin, Apo-2-Zeaxanthinal, (3R)-3-Hydroxy-8'-apo-ß- carotin-δ'-al
Synthese: H. Pfander et al., Helv.Chim.Acta ü, 716, 1377 (1980). Merck-Index 11.2326.
b) Bildung des Chlorides, bzw. Bromides einer Verbindung der Formel (XIV)
R3 COOH
(XIV) worin R3 für eine C-|- bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C32-Alkinylgruppe oder für ein Radikal der For¬ meln (X) oder (XI) steht, mit einem Chlorierungs- oder Bromierungsmittel, wie z.B. Thionylchlorid, Oxalylchlorid, und anschliessende Umsetzung mit einer Verbindung der Formeln (XV) bis (XXIII) bei einer Temperatur von 0 bis 50 °C unter Schutzgaszuleitung, in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, und in Gegenwart eines Kata-lysatoren, wie z.B. Pyridin, Dimethylformamid oder p-Dimethylaminopyridin.
c) Herstellung von Fettsäureestern von 8'-Apo-ß-carotin-8'-ol im Wege des
DIBAH-Verfahrens.
Die Verbindung (XVII), d.h. der C3Q-Alkohol:
(XVII) wurde bislang hergestellt durch Reduktion von 8'-Apo-ß-carotin-8'-al mit LiAIH4 in Ether. [R. Rüegg, M. Montavon, G. Ryser, G. Saucy, G. Schwieter und O. Isler, Helv.Chim.Acta 1959, 42., 854]. Der C30-Alkohol wurde wie folgt charakterisiert: instabile orange Kristalle mit Smp. 148-149 °C; λmaχ (Petrolether): 426, 453 nm; O-Acetylverbindung: orange Blättchen, Smp.130- 132 °C, λ aχ (Petrolether): 426, 452 nm; leicht erfolgende Eliminations¬ reaktion bei Chromatographieversuchen an AI2O3. Andere, insbes. höhere Ester sind bisher nicht beschrieben worden.
Das neue, ergiebige Herstellverfahren für den C30-Alkohol führt über die Reduktion des 8'-Apo-ß-carotin-8'-säuremethylesters
COOCH,
mittels DIBAH (Diisobutylaluminiumhydrid).
C.3Q-Alkohol.8'-Apo-ß-carotin-8'-ol
In einem trockenen 1 liter Dreihalskolben mit Einleitrohr für Schutzgas, Kühler, Magnetrührer und Septum werden 3.0 g Methyl-8'-Apo-ß-carotin-8'- oat und 300 ml absoluter Diethylether vorgelegt. Hierauf wird unter 2 auf -30°C gekühlt und dann 3,0 ml einer ca. 4,5 molaren Lösung von DIBAH in Hexan mithilfe einer Spritze langsam zugetropft. Es tritt keine sichtbare Reaktion ein. Nun lässt man das Gemisch Ingsam auf RT kommen und kontrolliert die Vollständigkeit der Reduktion mit UV/VIS-Spektren und DC. Wenn noch nicht aller Ester reduziert ist, wird erneut auf -30 °C gekühlt und die benötigte Menge DIBAH zugefügt; etc. Ein Überschuss an DIBAH ver¬ ringert die erreichbare Ausbeute an Cßo-Alkohol beträchtlich. Zur Aufarbeitung wird der Ansatz auf 0 CC gekühlt, dann mit 5 ml Essigester versetzt und schliesslich vorsichtig solange mit kleinen Eisstückchen versetzt, bis kein Aufschäumen mehr eintritt. Hierauf wird das KUhlbad entfernt, das Gemisch mit Celite versetzt und dann abgenutscht. Der Filterkuchen wird mit Et2θ/AcOEt/lsopropanol 10:4:1 farbstofffrei gewa¬ schen und das klare, rote Filtrat i.V. zur Trockene eingedampft. Der bereits kristalline, rote Rückstand lässt sich entweder aus heissem Toluol/Hexan oder Essigester/Hexan Umkristallisieren.
Ausbeute an C3o-Alkohol 2,2 bis 2,4 g (80-90%). Orangerote Nadeln, Smp. 148-149 °C; UV/VIS (Et2θ, qualitativ): λ a : 416, 425, 452 nm; IR (KBr): 2,77 (3603 cm-1, OH frei), keine Banden im Carbonylbereich; CI-MS (NH3): 419 [M + 1,(16)] 401 [M + I-H2O, (100)], 402 [M + 2-H20, (30)], 309 [M + 1-Tθluol, (5%)] Herstellung und Charakterisierung von Uπdec-10-ensäure -r8'-Apo-ß-carotin- 8'-yl-ester1
Eine Lösung von 400 mg C30-Alkohol in 20 ml abs. Et2θ und 1,5 ml abs. Pyridin wird in einem Dreihalskolben mit Magnetrührer, N2-Einleitrohr, Rückflusskühler und Septum unter 2 auf -30 CC gekühlt und hierauf unter Rühren mit 200 ml Undec-10-enoylchlorid tröpfchenweise versetzt. Nach beendeter Zugabe lässt man die Temperatur langsam auf 20 °C steigen und kontrolliert die Vollständigkeit der Veresterung durch DC auf Kiesel¬ gelplatten mit dem Fliessmittel Benzol/Petrolether 1:1. Der Ester weist einen bedeutend höheren Rf.-Wert als der Alkohol auf. Nun wird das Gemisch i.V. eingedampft, der Rückstand in Benzol aufgenommen und das Gelöste rasch durch eine kurze Säule von CaC03 (Merck Art.2066) filtriert. Das Filtrat wird eingedampft und der Rückstand an 40 g Kieselgel (Merck, 15-40 μm) mit Benzol chromatographiert. Die Substanz aus der roten Zone wird aufgefangen, i.V. eingedampft und der erhaltene Ester aus t-Butylmethyl- ether/Pentan bei -20 °C kristallisiert. Man erhält 450 mg hellrote Kristalle, nach Trocknen bei 40 CC/0,01 Torr; Ausbeute 80%. Smp. 76-77 °C, nach Sintern ab 75 °C. Analytische Details vgl. die technische Beilage 1/2.
In analoger Weise werden die Ester mit Laurinsäure-, Palmitinsäure- und Stearinsäurechlorid hergestellt. Vgl. die technische Beilage 1/2.
d) Herstellung von Azafrinol und von Azafrinylestern Azafrinol
Die Verbindung
(XXI) Azafrinol; (5R,6R)-5,6-Dihydro-10'-apo-8-ß-carotin-5,6,10'-triol) wurde erstmals von W. Eschenmoser und CH. Eugster durch Reduktion von Azafrinmethylester hergestellt und als labiles Oel besc hrieben ; s. Helv.Ch im.Acta 1975, 58. 1722.
Durch eine modifizierte Reduktion und Aufarbeitung kann Azafrinol als wohlkristallisierte Verbindung isoliert und anschliessend auch eingehend charakterisiert werden. Azafrinol wird so durch Kristallisation aus Benzol/ Hexan in leu chtend hellorangegelben Nadeln erhalten. Die Verbindung ist besonders gegen Säuren sehr empfindlich und verliert dabei unter Ring¬ aufspaltung Wasser. Diese Reaktion tritt be reits bei einer Chromatographie an Kieselgel ein.
Herstellung und Charakterisierung
In einem sorgfältig getrockneten Dreihalskol ben, versehen mit Rück¬ flusskü hler, Gaseinleitrohr, Septum und Mag netrü hrer werden 3 g Azafrin- methylester mit 300 ml absolutem Ether überg össen und hierauf unter Schutzgas und g utem Rühren auf -30 °C gekü hlt. Dan n werden d urch das Septum 3 ,5 m l einer ca. 4,5 molaren Lösu ng von DIBAH (Diisobutyl- alumiumhydrid) in Hexan mittels eine r S pritze tropfenweise zugegeben ; es tritt keine sichtbare Reaktion ein. Während einer langsamen Temperatur¬ erhöhung bis auf 0 °C wird der Verlauf der Reaktion mithilfe von UV/VIS- S pektren und DC überprüft.
Zeigt sich, dass d ie Red uktion noch unvollständig ist, wird erneut auf -30 °C gekühlt und eine entsprechende Menge von DIBAH-Lösu ng zugegeben. Ein geringer Überschuss an DIBAH wirkt sich auf die Ausbeute nicht wesentlich aus, doch muss ein grösserer Überschuss unbedingt vermieden werden. Nach Beendig ung der Reaktion wird die Lösung sehr vorsichtig solange mit kleinen Eisstückchen versetzt, bis kein Aufschäumen mehr eintritt und das Ausfallen von Alumium hydroxid beendet ist. Nach Zugabe von genügend Celite und von 0,2 ml Ethyldiisopropylamin wird abgenutscht und der Fi lterkuchen mit einem Gem isch von Ether/Isopropylal kohol 5: 1 farbstoffrei gewaschen. Das gelborange gefärbte Filtrat wird hierauf i.V. eingedampft und der kristalli ne Rückstand in Tol uol/Isopropylal kohol 99 : 1 heiss gelöst und im Falle einer Trübung die Lösung rasch durch eine kleine, breite Säule von CaCθ3 filtriert. Es folgt ein erneutes Eindampfen des Filtrates und die Umkristallisation des Rückstandes aus heissem Bezol/Hexan oder Essig¬ ester/Hexan. Nach Trocknen bei 40 °C/0,01 Torr erhält man 2,2 g leuchtend hellorange Nadeln. Smp. 133-134 °C (Vakuumröhrchen). Für die analytischen Einzelheiten vgl. die technische Beilage 2/2.
Herstellung von Undec-10-ensäure[azafrinyl]ester
In einer geeigneten, gut getrockneten Schliffapparatur mit Magnetrührer, Schutzgaseinleitrohr, Kühler und Septum werden 180 mg frisch um¬ kristallisiertes Azafrinol unter N2 in 15 ml Et2θ und 0,5 ml abs. Pyridin gelöst und hierauf auf - 30 °C gekühlt. Dann werden mit einer Spritze 100 ml 10-Undenoylchlorid tröpfchenweise zugegeben. Nach einer h Rühren bei einer Temperatur von -30 °C lässt man auf RT kommen. Anschliessend wird das Gemisch i.V. eingedampft, der Rückstand in Hexan/Ether 3:1 auf¬ genommen und das Lösliche durch eine kurze und breite Säule aus CaCOß (Merck, Art. 2066) filtriert. Das zitronengelbe Eluat wird erneut eingedampft und mit Et2θ/Hexan/lsopropanol 50:49:1 + einer Spur Ethyldiisopropylamin an einer Säule aus Sephadex LH-20 (im selben Lösungsmittel gequollen) chromatographiert. Aus der orangen Hauptzone wurden 161 mg vakuum¬ trockenes, zähes Oel erhalten, das allmählich durchkristallisierte. Es konnte kein signifikanter Smp. erhalten werden. UV/VIS (Et2θ, quäl.): scharfes Dreibandenspektrum mit λmax 375, 394,5, 419 nm; (Benzol quäl.): 377, 402, 428 nm. Für die übrigen analytischen Daten vgl. die technische Beilage 2/2.
In analoger Weise wurden die Ester
n = 9 ; n = 13 ; n = 15 , bzw. Azafrinyl-Laurat, Azafrinyl-Palmitat und Azafrinyl-Oleat hergestellt. Für die analytischen Daten vgl. die techn. Beilage 2/2.
Die Apocarotinester der Formeln (I) bis (IX) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumorale Wirkung, insbesondere dann, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit Wasser verdünnt thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen mit einem hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm ergeben. (Messungen mit dynamischer, quasi-elastischer Lichtstreuung QLS). Gegenstand der vor¬ liegenden Erfindung sind deshalb wesentlich auch spontan dispergierbare Konzentrate mit den Apocarotinestern der Formeln (I) bis (IX).
Die Apocarotinester der Formeln (I) bis (IX) sind nahezu wasserunlösliche und polymer agglomerierte Verbindungen. Damit die Moleküle dieser Ver¬ bindungen aber durch die Membranbarriere der Tumorzellen diffundieren und im Innern der Zelle wirksam werden können, müssen derartige Ver¬ bindungen vorerst in geeigneter Weise im wässrigen Medium solubilisiert werden. Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen Oel-in-Wasser Ultramikroemulsionen mithilfe von besonders ausgewählten Cotensiden oder Lösungsvermittlern einerseits und geeigneten Tensiden anderseits gelingt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der Apocarotin-Ester zu erzielen.
Alle experimentellen Beobachtungen an dergestalt ausgebildeten Ultra¬ mikroemulsionen lassen sich einheitlich durch die Annahme deuten, dass die ausgewählten Tenside und Cotenside als ausgewogenes System genommen in der wässrigen Phase organisierte Aggregate, sog. Mizellen bilden. Sie besitzen mehr oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm. Die Tenside und Hydrotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusseren, wässrigen Phase und der inneren, öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die pharmazeutischen Wirksubstanzen gelöst im biotensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung dieser beiden Phasen unterbleibt. In der öligen, inneren Phase liegen die Wirksubstanz-Moleküle in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor.
Die Mizellen der erfindungsgemässen Ultramikroemulsionen mit der Wirksubstanz-haltigen inneren Phase sind an ihrer Grenzschicht mit einem Tensidmantel versehen, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran ins Innere der Zelle zu diffundieren. Die Diffusion durch die Plasmamembran der Zellen erfolgt ausschliesslich aufgrund thermischer
Molekularbewegungen.
Die Richtung, die ein konkreter Diffusionsvorgang einschlägt, wird vom Konzentrationsunterschied bestimmt, welcher an der Plasmamembran zwi¬ schen ausserhalb und innerhalb der einzelen Zelle besteht. Die Diffusion verläuft solange entlang dem Konze ntrationsgefäl le , bis es abgebaut ist. Zwischen der extrazellulären Zone und dem Innere n der einzelnen Zelle wird die Konzentration an Wirksubstanz, bzw. am Wirkstoffsystem ("multiple drug system") ausgeglichen, wobei auch verzögerte Abgabeeffekte ("slow release effects") auftreten können. Derartige Diffusionsvorgänge verlaufen unab¬ hängig von jeglicher Energiezufuhr. S ie haben keinen Bezug auf die zelluläre Stoffwechselenergie.
Die Diffusiongeschwindigkeit gehorcht dem Fick'schen Gesetz für
Diffusions-vorgänge in Richtung eines Konzentrationsgefälles : dm 1 ^ de - = -D G LEICHUNG (A) dt q dx wobei dm die Menge in Mol der eine Zel lmembranoberfläche q (in cm2) d urchd ringenden Wirkstoffmoleküle pro Zeit dt (i n Sekunden) ist. D ist der Diffusionskoeffizient und de der Konzentrationsu nterschied über d ie Distanz dx.
Nach Nernst ist der Diffusionskoeffizient abhängig von der absoluten Tem¬ peratur u nd dem Reibungswiderstand f
R T kT
D = — — = GLEICHUNG (B)
N f f
Der Reibungswiderstand hangt gemäss dem Stoke'schen Gesetz
f = 6 π η r GLEICHUNG (C)
von der Viskosität der diffu ndierenden Lösung und vom Radius der diffun¬ dierenden Partikel ab. Durch Substitution von f mit 6 π η r in der Nernst- Gleichung erhält man die Sutherland-Einstein G leichung für den Diffusions¬ koeffizienten
RT 1 kT
D = = G LEICH UNG (D)
N 6 π η r 6 π η r
worin k d ie Boltzmann-Konstante darstellt.
Wird bei einem Diffusionsvorgang ein g leichmässiger Konzentrationsabfall de in der Membran der Tumorzelle angenommen , so kann der Ausd ruck im dx
Δ c
Diffusionsgesetz d u rch ersetzt werden. (Konzentrationsunterschied Δc
X über der Zellmembran der Dicke x). x ist für eine bestimmte Zellmembran eine konstante Grosse, weshalb man sie zusammen mit dem Diffusions¬ koeffizienten zu einer neuen Konstanten, dem Permeabilitätskoeffizienten P, vereinigen kann
D
P = — GLEICHUNG (E)
X
dm 1
Der Ausdruck — in der Diffusionsgleichung wird der Flux J dt q genannt und hat die Dimension Mol pro Sekunde pro cm?. Das negative Vorzeichen auf der rechten Seite der Diffusionsgleichung deutet an, dass der Transport der Wirkstoffmoleküle oder des Wirkstoffsystems in Richtung der abnehmenden Konzentration abläuft.
Es ist somit ι CΛ RT 1 A kT 1
J = -FΔc = Δc = — -Δc
Nx ό π η r x ό π η r
GLEICHUNG (F)
Aus dieser Gleichung folgt, dass die Geschwindigkeit des Diffusions¬ vorganges, bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Tumorzelle bestimmt wird:
1. vom Konzentrationsunterschied Δc in den beiden
Kompartimenten
2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wirkstoffmoleküls oder Wirkstoffsystems
3. von der Viskosität der diffundierenden wässrigen Lösung
(Emulsion)
4. von der Temperatur.
Die erfindungsgemäss spontan d ispergierbaren Konzentrate enthalten :
0,001 bis 30 Gewic hts-% einzel ner Ester von Apocaroti nolen der Formeln (I) bis (IX), bzw. Kombinationen solcher Ester, sowie
0 bis 40 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Em ulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches
0,001 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträg lichen Tensides oder Tensid- gemisches
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins
0 bis 10 Gewichts-% eines Penetrationsverbesserers ("flux enhancer"), eines
Stabilisators oder Radikalfängers und übliche Trägerstoffe und/oder
Verdünnungsmittel.
Die erfindungsgemäss einzusetzenden Tenside oder Tensid gemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sei n. Bevorzugt sind sie am photer oder nicht-ionogen u nd haben ein HLB-Verhältnis (d.h. eine "hydrophilic-lipophil ic-balance") zwischen 2 und 1 8 ; vorzugsweise liegt er zwischen 2 und 6 einerseits und 1 0 und 15 anderseits . HLB-Werte geben Ausku nft über die hydrophi len und lipophiler Eigenschaften eines Emul- gators. Vgl. dazu "Hydrophile-Lipophile Balance : History and recent De¬ velopments" von Pau l Becher im Journal of Dispersion S cience and Techno¬ logy 5 (1 ), 81 -96 (1 984).
Geeignete an ionische Tenside kön nen sowoh l sog. wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische Verbindungen sein .
Als Seifen eig nen sich die Al kali-, Erdalkali- oder gegebenenfal ls sub¬ stituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäu ren (C-i o bis C22) . wie z.B. die natürlichen Na- oder K-Salze der Oel- oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuregemischen, welche sich u.a. aus Kokosnuss- oder Talgöl gewinnen lassen. Ferner sind als Tenside auch die Fettsäure-Methyl- taurinsalze, sowie modifizierte und nicht-modifizierte Phospholipide zu erwähnen.
Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Tenside verwendet, ins¬ besondere Fettsu lfonate, Fettsu lfate, su lfonierte Benzimidazol-Derivate oder Alkylarylsulfonate.
Die Fettsulfonate und -sulfate liegen in der Regel als Al kali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls su bstituierte Ammoniumsalze vor u nd weisen im al lgemeinen einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen auf, wobei Alkyl auch den Alkylteil von Acylresten einschliesst. Beispiele hiefür sind das Na- oder Ca-Salz der Lig ninsulfosäu re,. des Dodecylschwefelsäureesters und Sulfonsäuren von Fettalkohol-Äthylenoxyd-Add u kten . Die su lfon ierten Benzimidazol-Derivate enthalten vorzugsweise zwei S u lfonsäuregru ppen und einen Fettsäurerest m it etwa 8 bis 22 C-Atomen. Alkylaryl-S ulfonate sind z.B. die Na-, Ca- oder Triäthanolaminsalze der Dodecyl-benzolsulfonsäure, der Dibutylnaphtha- linsulfonsäure oder eines Naphtha-Iinsulfonsäure-Formaldehyd-
Kondensationsprodu ktes.
Als nichtionische Tenside stehen in erster Linie zur Wahl die Polygly- kolätherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen, gesät-tigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, welche 3 bis 30 Glykolätherg ruppen und 8 bis 20 C-Atome im (aliphatischen) Kohlen¬ wasserstoffrest und 6 bis 1 8 C-Atome im Alkylrest enthalten können. Weiterhin kommen als nichtionisc he Tenside in Frage die wasserlöslichen, 20 bis 250 Äthylenglykoläthergruppen und 1 0 bis 1 00 Propylenäthergru ppen enthaltenden Polyäthylenoxydadd ukte an Polypropylenglykol und Alkyl- polypropylenglykol mit 1 bis 10 C-Atomen in der Alkylkette. Die genannten Verbindungen enthalten üblicherweise pro Propyleng lykoleinheit 1 bis 5 Äthyleng lykoleinheiten.
Als Beispiele nicht-ionischer Tenside seien erwähnt:
Nonyl phenolpolyäthoxyäthanole, Ricinusöl polyglykoläther, Polypropylen- polyäthylenoxyd-Addukte, Tributylphenoxypolyäthoxyäthanol, Polyäthylen- g lykol u nd Octyl phenoxypolyäthoxyäthanol. Ueberdies kommen auch Fett¬ säu reester von Polyoxyäthylensorbitan, wie das Polyoxyäthylensorbitan- Trioleat, in Betracht.
Bei den kationischen Tensiden handelt es sich vor allem um quaternäre Ammoni umsalze, welche als N-Substituenten mindestens einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen enthalten u nd als weitere Substituenten niedrige, gege¬ benenfalls halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder niedrige Hydroxy-alkylreste aufweisen. Die Salze liegen vorab als Halogenide, Methylsulfate oder Äthylsulfate vor, z.B. das Stearyltrinethylammoniumchlorid oder das Benzyl- di(2-chloräthyl)äthylammoniumbromid.
In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfind ungsgemässen, spontan disperg ierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsäure- estertenside, wie z.B. Tristyrylphenolpolyoxyäthylen-18-mono/d imethylphosphorsäureester
(Soprophor® FL, Rhόne-Poulenc); Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50 % der beiden Verbin¬ dungen mit den Formeln:
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY)
Tensid 508 (CIBA-GEIGY)
(Tensid 508, CIBA-GEIGY);
Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Äthoxy-
Phosphorsäureester
Butyl-mono-4-Äthoxy-Phosphorsäureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw. CH3-{ CH2 )3-CH-CH2-O (-CH2— CH2— O )5— -OCH,
C2H5
OCH,
(Zerostat ® AN , CIBA-GEIGY) und anderseits Betainverbindungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B.:
CH, CH, OH
COO Me worin Met+] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und Rx für C-|- bis C32-Alkyl oder C2- bis C32-Alkenylgruppen stehen.
Verwendung finden auch sog. "multi-functional Glucose Derivatives", wie z.B. Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesquistearat) und Glucamate® SSE-20 (PEG-20 Methyl-Glucose-Sesquistearat) von Amerchol, Edison, N.J.
Als Hydrotrop, bzw. als Co-Emulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungs-mittel lassen sich einsetzen, z.B.:
Ester eines aliphatischen Alkohols (C3 bis C18) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C-|rj bis C22). wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat und Laurylmyristat; Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C12 bis C32), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppel¬ bindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und
Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen.
Mono-Ester aus Äthylenglykol oder Propylenglykol mit einer aliphatischen
Carbonsäure (Cβ bis C22). wie etwa Propylenglykolmonolaurat und Pro- pylenglykolmonomyristat.
Ester aus einem aliphatischen Alkohol (C12 bis C22) rnit Milchsäure, wie z.B.
Myristyl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Glycerins m it einer al iphatischen Carbonsäure (Cß bis C22). wie z.B.
Glyceryl-Caprylat, oder Mig lyol® 812 Neutralöl (Oleum neutrale).
Ester aus einem Poly(2-7)äthyleng lykolglyzerinäther mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer al iphatischen Carbonsäure (Cς bis C22). wie z.B. aliphatische Alkohole (C1 2 bis C22). som it u.a. Dodecanol,
Tetradecanol, Oleylalkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol.
Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (Cβ bis C22). Monoäther aus ei nem Poly- äthylenglykol mit einem aliphatischen Al kohol (C1 2 bis C1 8). wie z.B.
Polyoxyäthylen (Cι o)-octyläther.
Heterocyclische Verbindungen, wie z.B. 1 -Methyl-2-Pyrrolidon.
Biotenside Ester der allgemeinen Formel :
R4 COO— R5
(XXIV) wori n R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine C-j - bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe be¬ deuten,
Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan disper- gierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Chromatographie über neutralem Al um iniumoxyd mit einem inerten Lösungsmittel wie z.B. Tetra- hydrofuran, Äthylal kohol oder Methylench lorid gereinigt.
Als Zusätze in d ie erfindungsgemässen spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitamin A, Retinol, Tocopherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Flux enhan ers") und Radi kalfänger.
Die zur pharmazeutischen Anwendung erforderliche Tagesdosis beträgt 0,001 bis 25 mg/kg Körpergewicht, wenn möglich verteilt auf 2 bis 3 Einzeldosen. Hiefür lassen sich die neuen Ester mit Apocarotinolen oder die spontan dis-pergierbaren Konzentrate mit diesen Verbind ungen in die gängigen pharmazeutischen Zubereitungen und Darreichungsformen wie Dragees, Tabletten, Kapseln , Pulver, Granulate, Pellets , Lösungen, Ampullen, Emu lsionen, Cremes oder Zäpfchen zusammen mit den üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungs- und Stabilisierungsmitteln ein¬ arbeiten. Die Gegenstand der Erfind ung bildende n Wirkstoffe oder Wirkstoffmi¬ schungen , sowie die spontan dispergierbaren Konzentrate, welche diese Wirkstoffe oder Wi rkstoffm ischungen enthalten, können dem Menschen oral, durch Injektion (intravenös, su bkutan oder intramuskulär) oder in anderer Weise verabreicht werden. Wenn sie als feste Darreichungsformen für die orale Verwendu ng aufbereitet werden, kan n dies in Form von Tabletten, G ranulaten, Pellets, Pulvern oder Kapseln, usw. geschehen. Die Auf¬ bereitungen können Zusatzstoffe enthalten, z.B. einen Arzneimittelträger wie eine Saccharid- oder Cellulose-Grundlage, ein Bindemittel wie Stärkepaste oder Methylcellulose, ein Füllmittel oder ein Desintegriermittel, usw. - wobei Zusatzstoffe eingesetzt werden , wie sie üblicherweise bei der Herstellung medizinischer oder paramedizinischer Formulierungen verwendet werden. Wenn die erfind ungsgetreuen Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen als fl üssige Darreic h u ngsformen zu oraler Ver-abreic hung gelangen, so können sie irgend ei ne aus wässrigen Zu bereitungen für i nnere Verwendung, aus S uspensionen, Emulsionen und S irups usw. ausgewählte Form haben, und sie können ausserdem in der Form Vacu um-getrockneter Präparate vorliegen, welc he vor ih rer Ver-wendung in Lösung oder Em ulsion gebracht werden.
Wenn die erfind u ngsgemässen Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen in der Form wässriger Lösu ngen , S uspensionen oder öliger, bzw. wässriger Emul¬ sionen, vorzugsweise als Mikroemulsionen aus den erfindungskonformen, spontan disperg ierbaren Konzentraten aufbereitet sind , können sie auch injiziert werden . Die Injektionslösungen werden jedoch üblicherweise kurz vor der Anwend ung hergestellt, indem man d ie Extrakte oder Konzentrate in wässrigen, flüssigen Medien wie sterilem Wasser, Glucoselösung oder physiolog ischer Kochsalzlösung auflöst oder suspendiert. Falls erforderl ic h, kön nen zu einem Injektionspräparat üblicherweise ver¬ wendete Lösungsmittel, Stabi lisierungsm ittel, Konservierungsmittel und Zu¬ sätze für die Herstellu ng isotonischer Lösungen hinzugegeben werden. Die auf diese Weise erhaltenen Injektions-Präparate werden intravenös, intramus-ku lär, subkutan oder in einer anderen geeigneten Weise ver¬ abreicht.
Die vorliegen de Erfi nd ung betrifft ebenfalls pharmazeutische Präparate, welche die Wirkstoffe, bzw. Wi rkstoffgemische, und/oder die beschriebenen , spontan disperg ierbaren Konzentrate zur Bekämpfung des Wachstums von Tumorzellen enthalte n. Bei den der Erfindung entsprechenden pharma- zeutischen Präparaten handelt es sic h um solche zur enteralen (wie oralen oder rektalen), sowie zur parenteralen oder topischen Verabreichung an Warmblüter, welche das spontan disperg ierbare Konzentrat allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch anwend bare n Trägermaterial enthalten.
Die Dosierung der erfindungsgemässen Konzentrate hangt von der Warm¬ blüterspezies, dem Alter und dem ind ividuellen Zustand, sowie von der Verabreichungsart ab. So werden z.B. zur Erzielung eines Abtötungseffektes von Tumorzellen an Warmblütern mit geringem Körpergewicht, wie z.B. Mäusen, Ratten und Hamstern, bei sukutaner Verabreichung Dosen im Bereich von ca. 0,1 bis 50 mg/kg Körpergewicht, und bei intraperitonealer Verabreichu ng Dosen im Bereich von 0,05 bis 5 mg/kg Körpergewicht angewandt.
Die oralen u nd rektalen Formen der neuen pharmazeutischen Präparate enthalten zwischen 1 - 95 %, vorzugsweise zwischen 1 0 - 95 %, insbesondere zwisc hen 20 - 95 % des erfind ungsgemässen , spontan dispergierbaren Konzentrates. Sie können z.B. in Dosis-Einheitsform vorl iegen, also als Dragees, Micropellets, Tabletten, S uppositorien oder Am pullen und vor allem als Kapsel n.
Geeignete pharmazeutisch anwe nd bare Trägerstoffe für d ie oralen Formen sind hauptsäch lich Füllstoffe, wie Zucker (z.B. Lactose , Saccharose, Mannit oder Sorbit), Cellulosepräparate und/ode r Calciumphosphate (z.B. Tri- calcium- oder Calciumhydrogenphosphat), ferner Bindemittel wie Stärke¬ kleister u nter Verwend ung von u.a. Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffel¬ stärke , Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Hydroxylmethylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon u nd/ oder Sprengmittel (wenn erwünscht), wie die obgenannten Stärken, ferner Carboxymethylstärke, q uervernetztes Poly¬ vinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie z.B. Natrium- alginat.
Als Fliessreguliermittel sind z.B. die Polyäthylenglykole Nr. 200 bis 600 und höher geeignet.
Die beim Menschen als Darreich ungsform bevorzugten Gelatinekapseln werden mit geeig neten Ueberzügen versehen , wobei man u.a. konzentrierte Zuckerlösungen - welche gegebenenfalls arabischen G ummi , Talk, P c .yvinyl- pyrrol idon , Polyäthylenglykol und/oder Titandioxid enthalten - Lack¬ lösungen (wässrige oder solche, die unter Verwend ung organischer Lösungsmittel aufbereitet worden si nd ) , oder magensaftresistente Ueber- züge aus Lösungen von geeigneten Cellulosepräparaten, wie mikro¬ kristalliner Cellulose (Avicel®), Acetylcellulosephthalat, Hydroxylmethyl- cellulosephthalat (Metolose®), Hydroxylpropylmethylcellulose-Acetat- succinat (AQOAT®) oder einem Copolymerisat wie Eudragit® L30D ver¬ wendet.
Als erfindungsgemäss besonders geeignete, oral anwendbare pharmazeu¬ tische Darreichungsform eignen sich Steckkapseln aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glyzerin oder Sorbitol. Die Weich- bzw. Hartgelatine- Kapseln, sowie solche aus AQOAT® (Hydroxypropyl-Methylcellulose-Acetat- Succinat) können das der Erfindung entsprechende, spontan dispergierbare Konzentrat im Gemisch mit Füllstoffen, wie Laktose, Bindemitteln wie Stärke und/oder Gleitmitteln wie Talk oder Magnesium-Stearat und gegebenenfalls mit Stabilisatoren und Antioxydantien wie z.B. α-, ß- oder γ-Tocopherol enthalten. Der Einsatz von geeigneten Flüssigkeiten wie flüssigen Poly- äthylenglykolen No. 200 bis 600 als Verdünnungsmittel kann sich empfehlen, wobei sich ebenfalls Stabilisatoren und Antioxydantien zufügen lassen.
Zur parenteralen Verabreichung werden die erfindungsgemässen Konzentrate mit destilliertem Wasser versetzt. Der entstehenden wässrigen Injektions-Mikroemulsion können Viskositätserhöhende Stoffe, wie z.B. Na- Carboxymethylcellulose, Sorbit, Mannit und/oder Dextran, und gegebenen¬ falls auch Stabilisatoren und Antioxydantien zugefügt werden. Die pharmazeutischen Präparate für die parenterale Anwendung enthalten vorzugsweise zwischen 0,1 bis 60 %, und hauptsächlich zwischen 1 bis 40 % des erfindungskonformen, spontan dispergierbaren Konzentrates. Als topisch anwendbare Präparate, welche sich vornehmlich zur Prophylaxe und Therapie von Hautkrebsarten eignen, kommen z.B. Cremen, Salben, Pasten, Pomaden, Schäume, Tinkturen und Lösungen in Betracht, welche zwischen 0,01 bis 70 % des erfindungsgemässen Konzentrates enthalten. Für Cremen und Oel-in-Wasser-Emulsionen, welche mehr als 50 % Wasser aufweisen, verwendet man alt oelige Grundlage in erster Linie Fettalkohole, z.B. Lauryl-, Cetyl- oder Stearylalkohol, flüssige bis feste Wachse, z.B. Isopropylmyristat, Woll- oder Bienenwachs und/oder Kohlenwasserstoffe wie z.B. Vaseline (Petrolatum) oder Paraffinoel. Zur Emulgierung dieser öligen Grundlagen eignen sich in erster Linie oberflächenaktive, pharma- verträgliche Substanzen mit vorwiegend hydrophilen Eigenschaften, wie z.B. nicht-ionogene Emulgatoren, vorab Fettsäureester von Polyalkoholen oder Äthylenoxydaddukten (etwa Polyglycerinfettsäureester oder Polyäthylen- sorbitan-Fettsäureester) mit einem H LB-Wert von u nter 8. Zusätze zur Wasserphase sind u.a. Mittel, welche die Austrockn ung der Cremen ver¬ mindern, z.B. Polyalkohole wie G lyzerin , Sorbit, Propylenglykol und/oder Polyäthylenglykole No. 200 bis 600, ferner Konservierungsmittel, Riechstoffe, etc.
Salben sind Wasser-in-Oel Em ulsionen , die bis zu 70 %, vorzugsweise jedoch zwischen 20 und 50 % Wasser oder wässrige Phasen enthalten. Als Fettphase kommen in erster Linie Koh lenwasserstoffe, z.B. Vaselin, Paraffinoel und/oder Hartparaffine in Frage, welche zur Verbesserung des Wasserbindungsvermögens geeignete Hydroxydverbindungen, wie z.B. Fett¬ alkohole oder Ester, davon etwa Cetylal kohol oder Wollwachsalkohole, ent¬ halten .
Fal lweise werden noch Emu lgatoren m it einem HLB-Wert von 8 bis 16, wie z.B. Sorbitan-Fettsäureester (etwa Sorbitanisostearol) zugesetzt. Zusätze zur Wasserphase sind u.a. Feuchthaltungsmittel, wie Polyalkohole (G lycerin, Propylenglykol, Sorbit und/oder Polyäthylenglykole No. 200, 400, 600); ferner Konservierungsmittel , Riechstoffe, etc.
Fettsalben sind wasserfrei und enthalten als G rund lage vornehmlich Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Vaseli n und/oder flüssige Paraffine ; über¬ dies natürliche oder partial synthetische Fette wie z.B. Kokosfettsäure- triglycerid, ferner: Fettsäurepartialester des Glycerins, wie z.B. die im Zusammen hang mit den Sal ben erwähnten, die Wasser-Aufnahmefähigkeit steigernden Fettal kohole, Emulgatoren und/oder Zusätze.
Pasten sind Cremen und Salben mit sekretabsorbierenden Puderbe¬ standteilen , wie beispielsweise Metalloxide (etwa Titanoxid oder Zinkoxid), ferner Talk und/oder Aluminiumsilikate, welche die Aufgabe haben , vorhan¬ dene Feuchtigkeit oder Sekrete zu bi nden.
Schäume werden aus Druckbehältern verabreicht und sind in Aerosolform vorliegende Oel-in-Wasser Emulsionen der erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentrate, wobei halogenierte Kohlenwasserstoffe (wie z.B. Chlorfluorniederaikane : etwa Dichlordifluormethan und Dichlortetra- fluoräthan) als Treibmittel verwendet werden. Dazu kommen gegebenenfalls die üblichen Zusätze wie Konservieru ngsm ittel, usw. VERFAHRENSBEISPIELE zur Herstellung von Estern mit Apocarotinolen der Formeln (I) bis (IX) :
a) Herstel lung von ß-Apo-8'-carotinol-10-undecenoat
Zu 85 mg ß-Apo-8'-carotinol (Synthese vgl. R. Rüegg et al., Helv.Chim Acta 42,847-864 )1959), 100 mg Pyridin und 100 mg Dimethylformamid in 20 ml Chloroform werden bei 0 °C und unter Schutzgaszuleitung 100 mg 10- Undecenoylchlorid in 10 ml Chloroform zugetropft. Nach einstündigem Rühren bei 0 CC und zweistündigem Rühren bei 20 bis 40 °C wird mit Wasser verd ünnt und ausgeschüttelt. Der Rückstand wird schonend getrocknet und anschliessend auf einer S ilicagelsäule m it Hexan/Essigester (90 : 1 0) als Eluiermittel chromatog raph iert.
Man erhält das ß-Apo-8'-Carotinol-1 0-undecenoat mit einem S c hmelzpunkt von 76-77 °C, nach S intern ab 75 "C; UV λmax. 425 nm (in Methylenchlorid); Rf-Wert im DC mit Hexan/Essigester (80 : 20) 0,92.
IR 3054 cm-1 δ (Olefin.CH)
2855 ' v (CH)
1724 ' v (C=0) Ester
1 639 ' v (C-C)
1465 ' δ (CH)
1 374 ' δ (CH3)
1 185 ' v (C-O) Ester
1032 ' v (C-O)
914 ' δ (CH) von Olefin trans d isubst. C=C
Auf analoge Weise wird auch das Azafrinyl-1 0-undecenoat hergestellt:
20
Brechungsin dex n - von 1 .44210; UV λmax. 420,0 nm (in Methylenchlorid); Rf-Wert im DC mit Hexan/Essigester (80:20): 0,94.
b) Herstell ung von ß-Apo-8'-carotinol-10-undecenoat
Ausgangsmaterial : 8'-Apo-ß-caroti n-8'-säure-äthyl u n d/oder -methylester. In einer geeigneten Apparatur mit Mag netrührer, N2-Einleitrohr, Rück¬ flusskühler u nd Septum werden 2 g 8'-Apo-ß-carotin-8'-säu remethylester zu 25 ml Et2θ gegeben, das Gemisch unter N2 und Rühren auf -35 °C gekühlt und m it der berechneten Menge DIBAH (Diisobutylalumin ium hydrid) in He¬ xan tropfenweise versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Kühlbad entfernt. Man lässt auf RT kommen. Nac h vollständ iger Red uktion wird sehr vorsichtig wen ig Eis zugegeben und damit solange fortgefahren, bis eine Trübung eintritt. Jetzt kühlen. AI(OH)3 fällt langsam aus. Nach Beendigung der Fällung wird über genügend Celite filtriert, mit MeOH nachgewaschen und das Filtrat eingedampft. Wenn der Rückstand zu kristallisieren beginnt, kann ohne weitere Rei nig ung aus heissem Benzol und unter Zugabe von Hexan umkristallisiert werden. Ausbeute 1 ,2 g braunrote Kristalle; UV/VIS λmax. 425, 452 nm (in Et2θ)
Veresterung von 8'-Apo-ß-carotin-8'-ol mit Undecenoylchlorid.
400 mg C30-Al kohol, sowie 20 ml Et2θ und 1 ml Pyrid in werden unter Rühren u nd unter 2 bei -30 °C tropfenweise mit 0,22 ml Undecenoylchlorid ver¬ setzt.
Man lässt langsam auf RT kommen, verdü nnt mit Petroläther und sch üttelt nacheinander m it Wasser und Sole aus. Dann Trocknen über MgS04, Eindampfen un d Chromatographie an 40 g Kieselgel (Merck, 15 bis 40 μm Korngrösse) mit Benzol/Hexan 2: 1 . Nach dem Verwerfen einer gelben Vorzone wird die rote Hauptzone aufgefangen , eingedampft und bei 0,01 Torr bei 40 °C getrocknet. Dabei kristallisiert das Produkt vollständig durch. Smp. 76-77 °C nach Sintern ab 75 "C UV/VIS λmax. 425,5, 452,5 nm (in Et20). CI-MS (mit seh r schonender chem ischer Ion isation ) mit peaks bei 575 und
401 nm; m/z. Mw. (M+ +1 ); IR-Spektrum Ester-peak bei 1724 cm-1. 1 H-NMR Spektrum entspricht.
c) Herstellu ng von Azafrinyl-10-U ndecenoat
Ausgangsmaterial Azafrin , isoliert aus Rhizomen von Escobedia scrabifolia. Herstellung des Methylesters aus der C27-Säure mit Diazomethan/Ether, vgl. W. Eschenmoser und CH. Eugster, Helv.Chim.Acta, 58., 1722 (1975), Reduktion mit DIBAH analog dem Verfahren b); kein Ausschütteln, sondern direkte Filtration unter Zugabe von 0,5 % Hünig base. Das Filtrat eindampfen, den Rückstand aufnehmen in Et2θH u nd vorhandenes Wasser abscheiden, trocknen über MgSθ4, filtieren, eindampfen, den Rückstand mit Toluol/Hexan an einer CaCθ3-Säule 4,3 x 20 cm Chromatographieren. Die Hauptzone wird mit Toluol/Isopropylalkohol (99 : 1 ) eluiert, das Filtrat i.V. zur Trockene gebracht. Nach dem Um kristallisieren aus Benzol/Hexan und AcOEt/Hexan erhält man leuchtend gelbe, sehr säureem pfind liche Nädelchen mit einem Smp. von 135 °C. Bildung von Azafrin-10'-ol[undec-10-enoyl]ester.
Apparatur wie beim Verfahren b). Ansatz von 450 mg der Verbindung mit
Formel
AZAFRINOL
1,5 ml Pyridin, 2 ml DMF, 20 ml Et2θ; N2, Rührer, Septum, Temperatur -40 bis -50 °C, Zugabe von 0,20 ml Undecenoylchlorid. Auf 0 °C kommen lassen, dann nochmals 0,20 ml Undecenoylchlorid zugeben und 3'Λ h bei RT rühren. Verdünnen mit Et2θ und H2O, Phasentrennung im Scheidetrichter, nochmals H2O zufügen, dann Sole, Trocknen über MgSθ4; eindampfen. Den Rückstand in wenig CH2Cl2/Hexan (10:15) + 0,25 % Hünigbase (N,N-Diisopropyl- äthylamin) lösen und auf einer Sephadex LH-20-Säule 3,6 x 34,5 cm chro- matographieren. Die breite, gelborange Zone auffangen und eindampfen. Zweite Chromatographie-Passage auf einer Kieselgelsäule 3,3 x 17,5 cm mit Toluol/Isopropylalkohol (99:1 bis 98:2), was eine gute Trennung ergibt. Die hellorange Fraktion auffangen, eindampfen, trocknen 0,002 Torr bei 42 °C. Man erhält das Produkt: 376 mg als ein viskoses, hellorangerotes Öl.
OH AZAFRINYL-10-UNDECENOAT Charakterisierung: UV/VIS (Et2θ): scharfes Dreibandenspektrum λmax. 374, 394,5, 419 nm.
IR-Spektrum (CH2CI2): Carbonylbande ausgeprägt bei 1723 cm-1 CI-MS : m/z 579 (M+ +1 schwach), 395 (M+ +1- Undecenylsäure, sehr stark), 561 (M+ +I-H2O), 593 (M+ +I-H2O-H2O). ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren KONZENTRATEN, welche die Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX) enthalten und welche, wenn sie mit Wasser verd ünnt werden, thermodynamisch stabile ULTRAM IKROEMULSIONEN mit einem hydro¬ dynamischen Radius von 1 ,5 bis 3,0 nm ergeben
a) 0,5 bis 30 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX)
0 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Mig lyol® 812 (Dynamit Nobel)
0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsäu reester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CIBA-G EIGY), Tensid 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA- G EIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (Rhöne-Poulenc) 5 bis 90 Gewichts-% Invadin JFC 800 % (CIBA-GEIGY).
b) 0,001 bis 30 Gewichts-% eines oder mehrerer antitumoraler Wi rkstoffe der Formeln (I) bis (IX)
0,001 bis 50 Gewichts-% ei nes oder meh rerer biotensider Ester der allge¬ meinen Formel
R4 COO— R5
(XXIV) wori n R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine C-| - bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alke nyl- oder Al kapolyengruppe bedeuten,
0,001 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensid- gemiscnes
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins
0 bis 10 Gewichts-% eines Penetrationsverbesserers oder eines Stabili¬ sators und Trägerstoffe und/oder Verdünn ungsmittel.
c) 10 Gewichts-% eines öligen antitumoralen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX)
0 bis 20 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 oder eines, bzw. meh rerer der biotensiden Ester der al lgemeinen Formel :
R4 COO— R5
(XXIV) worin R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine
C-|- bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten,
35 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800%
35 bis 45 Gewichts-% Soprophor® FL.
d) 2 bis 5 Gewichts-% eines kristallinen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX) 10 bis 20 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 oder eines, bzw. mehrerer der biotensiden Ester der allgemeinen Formel:
R4 COO— R5
(XXIV) worin R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine C-\- bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten,
35 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% 35 bis 45 Gewichts-% Diphasol 3873 oder Soprophor® FL.
BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von "multiple units". a) Granulierung
Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g
Avicel® PH-101 80.3 g
Erfindungsgemässes KONZENTRAT 139.4 g
Aerosil® 200 80.3 g
Σ 390.0 g
Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Etπanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40 °C
b) MSR- und RETARD-Ausrüstung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets Kernmaterial 44 % Erfindungsgemässes KONZENTRAT 25 % MSR-Beschichtung 31 %
Σ 100 % N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemäss a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1:1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzö¬ gerten Abgabe (Retard) angemessen steuern.
Biologische Prüfungen.
Die antitumorale Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wirkstoffen gemäss den Herstellungsbeispielen a) bis d), sowie den Auf¬ arbeitungsbeispielen a) bis d) wird anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt:
1. In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien
Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikro- titerplatten und Verdünnungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 1θ4/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10 % fötalem Kalbserum inak¬ tiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, dass sie während des Assays wachsen können, in sog. nichtkonfluenten Monolayers. Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden, mit 100 μl pro Reihe, die man im 1. Loch mit 100 μl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch eingebracht, wieder mit 100 μl Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdünnungsreihe n1/s.
Die Proben werden im Plaque Assay während 3 bis 5 Tagen bei 37° C mit 3Λ % CO2 inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0,1 % Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70 % Methanol, 1 % Formaldehyd, 29 % Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen, Vergrösserung 300-fach. Man bestimmt die grösste zytotoxische Verdünnung. Die quanti¬ tative Auswertung lässt sich auch mittels Scanning und Absorptions¬ messung am Spektrophotomerer vornehmen.
ZYTOTOXIZITÄTSTEST mit Py6-Zellen (Virus transformierten Maus-Fibroblasten)
Prüfung eines 2 %-Konzentrates verschiedener Zusammensetzung mit C 11:1- AZAFRINYLESTER-WIRKSUBSTANZ
Nach 24 h Nach 48 h Nach 72 h
KONZENTRAT Zelltoxisch bis: Zelltoxisch bis: Zelltoxisch bis:
No.1 mit IPM 1 : 800O00 1 : 3*200'000 1 : 6'400'000
No 2 mit C 11-1-
CITRONELLYL- 1 : 800O00 1 : 6'400*000 1 : 6'400*000
ESTER
No.3 mit IPM 1 : 800*000 1 : 3*200*000 1 : 6*400*000 und AOT
No.4 mit C 11:1- 1 : 1*600*000 1 : 12*800*000 1 : 25*600*000 CITRO und CAA
No.1 2 Gewichts-% Wirksubstanz C 11 -AZAFRINYLESTER
12 Gewichts-% I P M
86 Gewichts-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL, 50:50 No.2 mit 12 Gewichts-% C 11 :1-Citronellylester statt IPM, sonst gleiche Zusammensetzung wie No.1 No.3 mit 86 Gewichts-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL/AOT,
40:40:20 No.4 mit 12 Gewichts-% C 11 :1-Citronellylester statt IPM und mit 86 Gewichts-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL/Amphonyl CAA 40:40:20 Mikroemulsionen 1:10'000 (100 ppm W.S.), bzw. 6 mg W.S. in 60 ml dest. Wasser
N.B.: AOT (Fluka 86139) = Sulfobernsteinsäure-bis-2-äthyl-hexylester Na- Salz. ZYTOTOXIZITÄTSTEST mit Py6-Zellen (Virus transformierten Maus-Fibroblasten)
Prüfung verschiedener Konzentrate gleicher Zusammensetzung, aber mit unterschiedlichen APOCAROTIN-/AZAFRINYL-Estern
(auf 2%-Konzentrat berechnet)
PRÄPARAT 48 h 72 h 96 h In Verdünnung In Verdünnung In Verdünnung wirksam bis 1 : wirksam bis 1 : wirksam bis 1 :
8*-APOCAROTIN- 160O00 160*000 320O00 10-UNDECENOAT
C 11:1-AZA- 320O00 320O00 640*000 FRINYLESTER
ZYTOTOXIZITÄTSTEST mit Py6-Zellen (Virus transformierten Maus-Fibroblasten)
PRÄPARAT ZELLTOXISCH bis: ZELLTOXISCH bis: EXPOSITION 72 h, auf EXPOSITION 72 h auf Konzentrat berechnet Wirksubst. berechnet
C3o-Stearat 1:160*000 16 Mio.
8'-APOCAROTIN-10- 1:640*000 32 Mio. UNDECENOAT
8*-APOCAROTIN- 1:512'000 51 Mio. LAURAT
8*-APOCAROTIN- 1:128*000 12,8 Mio. PALMITAT
AZAFRINYL-10- 1:256*000 25,6 Mio. UNDECENOAT VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien A HL 60 promyeolytische LEUKÄMIE 1 x 104 Zellen pro Well
Proliferationstest (Tritium: 1μCi/well H + )
PRÄPARAT 10-5 10-4 10-3 0,2 ppm W.S. 2 ppm W.S. 20 ppm W.S.
8*-APOCAROTIN- 11,8 % 3.5 % 3,7 % 10-UNDECENOAT
C 11:1-AZA- 32,4 % 12,7 % 2,7 % FRINYLESTER
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZEN- TRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion (in Verdünnung 1:100'000, 1:10*000, 1:1*000) dem Medium einmal beigegeben. Bei der Beurteilung be¬ achte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 76*589 cpm.
Test durchgeführt von Dottoressa Anna Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica.24.-27.1. und 14.-17.2.1994
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien B K 562 LEUKÄMIE 2 x 1θ Zellen pro Well
Proliferationstest (Tritium: 1μCi/well H + )
PRÄPARAT 10-5 10-4 10-3 0,2 ppm W.S. 2 ppm W.S. 20 ppm W.S.
8*-APOCAROTIN- 28,5 % 1,1 % 0 % 10-UNDECENOAT
C 11:1-AZA- 68,6 % 8,2 % 0 % FRINYLESTER
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®- KONZENTRATEN,. als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 247'125 cpm.
Tests durchgeführt von Dottoressa Anna Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica.
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien C TOM MELANOM 1 x 1θ4 Zellen pro Well
Proliferationstest (Tritium: 1μCi/well H + ) 2 x 104 Zellen pro Well
PRÄPARAT 10-5 10-4 10-3 0,2 ppm W.S. 2 ppm W.S. 20 ppm W.S.
8*-APOCAROTIN- 69,1 % 65,5 % 17,2 % 10-UNDECENOAT
C 11:1-AZA- 57,9 % 56,8 % 9,2 % FRINYLESTER
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZEN- TRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion (in Verdünnung 1:100*000, 1:10*000 und 1:1*000) dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 57'816 cpm.
Tests durchgeführt von Dottoressa Anna Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica.
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien D ADK: Humanes pulmonares Adenocarcinom 2 x 104 Zellen pro Well
Proliferationstest (Tritium: 1μCi/well H + )
PRÄPARAT 10-5 10-4 10-3 0,2 ppm W.S. 2 ppm W.S. 20 ppm W.S.
8*-APOCAROTIN- 11.7 % 6.7 % 0 % 10-UNDECENOAT
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZEN- TRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigege¬ ben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Exposi¬ tionszeit von 48 h. Kontrollen: 57'816 cpm.
Tests durchgeführt von Dottoressa Anna Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica.
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien
HL 60 promyeolytische LEUKÄMIE 2 x 104 Zellen pro Well Proliferationstest (Tritium: 1μCi/well H + ) cpm = 82*667
PRÄPARAT 10-4 10-3
(2 %-MARIGENOL®- 2 ppm W.S. 20 ppm W.S.
KONZENTRAT)
C-30-ALKOHOL 2,3 0,99
C 30-SÄURE 1,7 0,75
C 11:1-8*-APOCAROTINYL- 1,7 1,5 ESTER
ZEAXANTHIN-di-UNDE- 3,5 1,2 CENOAT ß-CAROTIN 3,2 1,1 AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZEN- TRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigege¬ ben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Exposi¬ tionszeit von 48 h. Kontrollen: 82'667 cpm.
Tests durchgeführt am 7.-10.6.1994 von Dottoressa Anna Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica.
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien F K 562 Chronische LEUKÄMIE
(Leucemia mieloide cronica, crisi blastica) 2 x 1θ4 Zellen pro Well
Proliferationstest (Tritium: 1μCi/well H+) cpm = 138'833
PRÄPARAT 10-4 10-3
(2 %-MARIGENOL®- 2 ppm W.S. 20 ppm W.S.
KONZENTRAT)
C-30-ALKOHOL 37,1 0,7
C 30-SÄURE 18,6 0,5
C 11:1-8*-AP0CAR0TINYL- 17,4 0,4 ESTER
ZEAXANTHIN-di-UNDE- 38,6 1.0 CENOAT ß-CAROTIN 18,5 0,6
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZEN- TRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigege¬ ben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Exposi¬ tionszeit von 48 h. Kontrollen: 138'833 cpm.
Tests durchgeführt am 7.-10.6.1994 von Dottoressa Anna Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica.
LANGZEITVERSUCH
Um herauszufinden, ob bei längerer Exposition signifikante Veränderungen an der Tumorzelle - sei es in Richtung Regression oder Redifferenzierung - festzustellen seien, wurde mit Py6-Zellen auch ein Langzeitversuch an¬ gestellt, der über 41 Tage geführt wurde. (Experiment vom 24.05.1994 bis zum 29.06.1994). Eingesetzt wurden als Kontrollen nicht transformierte 3T3 Mausfibroblasten, sowie die Polyomavirus-transformierten 3T3 MT 18 Zellen. Als Leitpräparate wurden geprüft: ein 2%-PHYSALIEN-Konzentrat (Zea- xanthin-di-Palmitat) und ein 2 % C11:1-8'-APOCAROTINYLESTER-Konzen- trat. Einzelheiten zum Prüfprotokoll: Nach der Aussaat ist das Zellwachstum anfäng lich langsam. Nach 12 Tagen treten, Dosis-abhängig , viele nekro- tische Zel len auf. Auswaschen de r Ku lturen mit EDTA. Neuzusatz von Medi um und wirkstoffhaltiger Mikroemulsion in je 3 verschiedenen Konzen¬ trationen (wie zu Beginn des Versuches) nach 1 3 und 20 Tagen. Wiedereinsetzen des Zellwachstums bei allen überlebenden Gruppen. Nach 34 Tagen erneutes Auswaschen , sowie Zugabe von frischem Medium und Konzentrat. Abbruch des Versuchs nach 41 Tagen.
Ergebnis: Die morphologischen Unterschiede zwischen den transformierten und den nicht-transformierten Zellen sind im in-vitro Test selbst bei Versuchsende an den überlebenden Populationen immer noch feststellbar. Die transformierten Zellen besitzen längere Filopodien und behalten diese Charakteristik bei.
Analytischer Nachweis
1 ) Identifikation der APOCAROTIN-ESTER
Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerät von Beckman Instruments, bzw. von BIORAD.
Bed ing ungen : DL-α-Tocopherol 50 mM ; Puffer pH = 9,5 Na-tetra-Borat
Run 15 kV, Messung bei 195 nm
Der Wirksubstanz-Peak erscheint nach ca. 4 Minuten. Auflösung bis 0,5 ppm.
2) Identifikation der Konzentrat-M izel len in der wässrigen Mikro- em u lsion/bzw. im Zellplasma der Tumorzellen .
G leiche Methodik wie 1 ). Der charakteristische Peak für die Apocarotin-Ester erscheint nach ca. 8 Minuten ; die Verzögerung gegenüber der reinen W.S. -Messung ist eine Folge der Ummantelung der inneren Phase der Konzentrate mit Tensiden. Sie gibt einen wichtigen Hinweis auf das Diffusionsverhalten der Ultramikro¬ emulsion.
3) Nachweis de r Membran-Penetration an der Tumorzelle
Am Lichtmikroskop (wie auc h am Elektronenmi kroskop) lässt sich aufzeigen, dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel 3T3 Py6-Zellen der Maus; d ü nn ausgesät, mittlere Verdün n u ng der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern herum ausbildet. 4) APOCAROTIN-PALMITAT, n = 13
Orange Kristalle aus t-Butylmethylester/Pentan bei - 20 °C. Smp. 73,5-75,5 °C, nach Sintern ab 70 CC; Wiedererstarren und endgültiger Smp. 87-91 eC UV/VIS (CH2CI2, quantitativ): λmax sh 410 nm (44O00), 432 nm (59'400) 457 nm (50'δOO). IR (CHCI3, Auswahl von Banden); frei von OH-Banden, 1728 cm- 1 (vs., Estercarbonyl); 1H-NMR (CDCI3), 300 MHz : 0,888 (t, CD-CH3); 1,038 [CH3 (16,17)]; 1,264 [(CH2)16]; 1,725 [CH3 (18)]; 1,846 [CH3 (19')]; 1,956 [CH3 (19,20)]; 2,344 [t, α-CH2); 4,565 [s, CH2(8')]; 6,1 - 6,7 ppm (Vinylprotonen).
5) APOCAROTIN-STEARAT, n = 15
Orange Kristalle aus t-Butylmethylester/Pentan bei - 20 °C. Smp. 80-81 °C, nach Wiedererstarren 80-89 °C; IR (CHCI3, Auswahl von Banden); frei von OH-Banden, 1728 cm- (vs., Estercarbonyl); UV/VIS (CHCI2), quantitativ): λmax sh 410 nm (61*700), 433 nm (87*900) 458 nm (76*400). 1H-NMR (CDCI3), 300 MHz : 0,88δ (t, ω-CH3); 1,039 [CH3 (16,17)]; 1,264 [(CH2)16]; 1,726 [CH3 (18)]; 1,848 [CH3 (19')]; 1,957 [CH3 (20*)]; 1,982 [CH3 (19,20)] 2,345 [t, ω- CH2); 4,566 [s, CH2(8')]; 6,1 - 6,7 ppm (Vinylprotonen).
ß. DATEN zu AZAFRINOL und AZAFRINYL-ESTERN
1) Eigenschaften von Azafrinol:
Smp. 133-134 °C (Vakuumröhrchen). Verbrennungsanalyse für C27H40O3 (412,6): Ber. C 78,59 H 9,77 % ; gefunden C 78,30 H 9,56 %. UV/VIS (EtOH, log ε): 432,4 (4,514), 375,2 (4,805), 396,0 (5,011), 420,0 (5,005); [α] — = 85,1 ° (c = 21,80 mg in 2,00 ml EtOH):
CD ((EtOH.c = 1,192.10-5 M, Δε, Hauptbanden) : 237,2 (-2,5), 370,4 (-1,4),
386,0 (-1,2), 420,4 (-1,6). IR (KBr): sehr breite OH-Banden um 3450 cm-1, keine Banden im Carbonylbereich; IR (CH2CI2): 3600 cm-1, keine
Cabonylbanden;
CI-MS (NH3): 413 [M + 1 (13)], 396 [M + 2-H2O (30)], 395 [M + 1-18 (100)].
2) Eigenschaften von AZAFRINYL-ESTERN 2.1) AZAFRINYL-10-UNDECENOAT
UV/VIS (Et2θ, quäl.): scharfes Dreibandenspektrum mit λmax 375, 394,5, 419 nm; (Benzol quäl.): 377, 402, 428 nm. IR (CH2CI2, Auswahl von Banden): 2,78 μ, (= OH-frei), ca. 2,9 μ = OH intermolekular gebunden), 5,8 μ (1723 cm-1), vs. Estercarbonyl; 1H-NMR (CDCI3), 300 MHz. Auswahl von Banden): für den Azafrinolteil*): 0,85, (CH3(16)); 1,15 (CH3(17)); 1,19 (CH3(18)); 1,91 (CH3(20*)); 1,98 (CH3(19,20)); für den Säureteil: 1,30 ((CH2)7); 2,33 (t, α- CH2); 4,9 (m, ω-CH∑); 5,8 (m, ψ-CH).
*) Neuere NMR-Spektren von Azafrin und Derivaten, vgl. P. Uebelhart und CH. Eugster, Helv.Chim.Acta 1982, 65, 353.
2.2) Andere Ester:
n = 9 ; n = 13 ; n = 15 bzw.
Azafrinyl-Laurat UV/VIS 376, 402, 428 nm,
Azafrinyl-Pa Imitat UV/VIS 372, 402, 428 nm
Azafrinyl-Oleat UV/VIS 379, 402, 428 nm.
C) Chromatographische Identifikation der APOCAROTIN-ESTER Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerät von Beckman Instruments, bzw. von BIORAD. Bedingungen: DL-α-Tocopherol 50 mM; Puffer pH = 9,5 Nd-tetra-Borat
Run 15 kV, Messung bei 195 nm
Der Wirksubstanz-Peak erscheint nach ca.4 Minuten.
Auflösung bis 0,5 ppm.
D) Chromatographische Identifikation der Konzentrat-Mizellen in der wässrigen Mikroemulsion/bzw. im Zellplasma der Tumorzellen.
Gleiche Methodik wie C). Der charakteristische Peak für die Apocarotin-Ester erscheint nach ca. 8 Minuten; die Verzögerung gegenüber der reinen W.S. -Messung ist eine Folge der Ummantelung der inneren Phase der Konzentrate mit Tensiden. Sie gibt einen wichtigen Hinweis auf das Diffusionsverhalten der Ultra¬ mikroemulsion. E) Nachweis der Membran-Penetration an der Tumorzelle
Am Lichtmikroskop (wie auch am Elektronenmikroskop) lässt sich aufzeigen, dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel 3T3 Py6-Zellen der Maus, d.h. transformierte Fibroblasten; dünn ausgesät, mittlere Verdün¬ nung der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern herum ausbildet.
Der analytische Nachweis, dass diese Vakuolen die Apocarotinester- Wirksubstanzen enthalten, kann sehr deutlich dadurch erbracht werden, dass man den gereinigten inkubierten Tumorzellen das Zellplasma entnimmt, es zentrifugiert und mit einer 0,05 %-Lösung von Uvitex® CF conc. (CIBA- GEIGY) in Aceton/Wasser (85:15) oder von Uvitex® EBF (CIBA-GEIGY) oder von Tinopal® GS (CIBA-GEIGY) versetzt.
Die eingesetzten erfindungsgetreuen Apocarotinester löschen die durch den Marker Uvitex CF conc, bzw. Uvitex EBF, bzw. Tinopal GS hervorgerufene Fluoreszenz im langwelligen UV-Lichtbereich aus; auf der Dünnschicht- Platte entsteht eine blaue Färbung. UV-Scanning bei 366 nm. Kontrolle mithilfe von mizellarer Kapillar-Zonen-Electrophorese, (Beckman Instru¬ ments, P/ACE System 2100).
AUSWIRKUNG auf das BLUTBILD (Verträglichkeit der MARIGENOL®-PRÄPARATE)
TOXIZITÄT von MARIGENOL®-KONZENTRATEN an der BALB/c-Maus
%-Anteil der Blutkörperchen
Präparat L M N E B
G 17 10-7 70 ± 6 11 ± 3 13 ± 4 6 ± 4 0 10-5 77 ± 6 6 ± 3 11 ± 4 5 ± 4 1 ± 1 10-3 69 ± 10 7 ± 5 22 ± 8 2 ± 2 0
G 41 10-7 77 ± 6 6 ± 3 13 ± 5 3 ± 3 0 10-5 78 ± 4 10 ± 2 10 ± 4 1 ± 1 1 ± 1 10-3 80 ± 6 8 ± 2 10 ± 6 12 ± 1 0
G 44 10-7 74 ± 17 10 ± 1 20 ± 9 1 ± 1 0 10-5 74 ± 6 9 ± 4 14 ± 7 4 ± 3 0 10-3 76 ± 5 6 ± 4 16 ± 8 2 ± 1 0
G 55 10-7 78 ± 4 10 ± 4 10 ± 4 2 ± 1 0 10-5 69 ± 10 11 ± 3 18 ± 4 1 ± 1 0 10-3 77 ± 5 6 ± 4 14 ± 2 2 ± 1 1 ± 1
KONTROLLEN 76 ± 5 8 ± 2 15 ± 4 1 ± 1 0 (Phys.Puffer)
G 17 2 %-Konzentrat mit C 5:0-iso-CHOLESTERYLESTER
(Cholesteryl-iso-Valerat)
G 41 2 %-Konzentrat mit C 11 :1-ERGOSTERYLESTER
(Ergosteryl-10-Undecenoat)
G 44 2 %-Konzentrat mit C 18:2-CHOLECALCIFERYLESTER
(C 18:2-D3 ; Vitamin-D3-Linolat)
G 55 2 %-Konzentrat mit C 4:1-CHOLECALCIFERYLESTER
(C 4:1-D3 ; Vitamin-D3-Crotonat)
Verdünnungen: 10-7 = o,1 ppm Konzentrat; 0,002 ppm Wirksubstanz
10-5 = 10 ppm Konzentrat; 0,200 ppm Wirksubstanz
10-3 = rooo ppm Konzentrat; 20,000 ppm Wirksubstanz
(auf die wässrige Mikroemulsion berechnet) Legende:
L = Lymphocyten
M = Monocyten (Makrophagen)
N = Neutrophile Granulocyten
E = Eosinophile Granulocyten
B = Basophile Granulocyten
Durchführung der Proben: Prof. Dott. Guido FORNI, Dotta Stefanie VAI, Universitä di Torino, Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche, Ospe- dale San Luigi Gonzaga, 1-10*043 ORBASSANO (TO), August/September 1993.
Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mäusen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Während 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i.v. von je 0,250 ml wässriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiolgischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grünwald-Giemsa.
Zeit der Behandlung: 28 Tg.
Blutanalyse nach der letzten Injektion
Anzahl Tiere: 13 Gruppen zu 5 je Tieren
RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede auf zu den Kontrollen. Es konnte keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten- Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche.

Claims

PA TE N TA N S P R Ü C H E
1) Spontan dispergierbare Konzentrate, welche mit Wasser oder 5%-
Glucoselösung verdünnt, thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergeben mit Mizellen, die einen hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem
System zusammengefügt sind:
0,001 bis 30 Gewichts-% einzelner Ester mit Apocarotinolen der Formeln (I) bis (IX), bzw. eine Kombination solcher Ester
(I)
(N)
(III)
(IV)
(V)
(VI)
(VW)
(VIII)
(IX) 0 bis 40 Gewichts-% eines als Hydrotrop oder Co-Emulgator dienenden pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, 0,001 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensid- gemisches,
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins,
0 bis 10 Gewichts-% eines Stabilisators oder eines Penetrationsverbes- serers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.
2) Spontan dispergierbares Konzentrat, enthaltend Apocarotinylester der Formeln (I) bis (IX) gemäss Anspruch 1, zur Verwendung als Arzneimittel mit Wirksamkeit gegen Tumore, Psoriasis und Ekzeme.
3) Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 1, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass folgende Komponenten zusammengefügt sind:
0,5 bis 30 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis
(IX),
1 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Oleum neutrale,
0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsäureester-Tensides,
5 bis 90 Gewichts-% des wasserfreien Octylphenylpolyoxyäthylenäther- Tensids mit 9 bis 10 Oxyäthylengruppen.
4) Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 1, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass folgende Komponenten zusammengefügt sind:
0,5 bis 30 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis
(IX),
1 bis 40 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XXIV),
R4 COO— R5
(XXIV) worin R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine C1- bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten,
5 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidge- misches,
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins,
0 bis 10 Gewichts-% eines Stabilisators oder eines Penetrationsver- besserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel. 5) Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 1 , dadurch ge¬ kennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem Systempräparat zusam¬ menfügt sind:
10 Gewichts-% eines öligen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX), 0 bis 20 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Oleum neutrale oder eines/bzw. mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XXIV)
R4 COO R5 (XXIV) worin R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine
C1 - bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten,
35 bis 45 Gewichts-% des wasserfreien Octylphenylpolyoxyäthylenäther-
Tensids mit 9 bis 10 Oxyäthylengruppen,
35 bis 45 Gewichts-% des Mischemulgators, bestehend aus je 50 % der beiden Verbindungen mit Formeln:
(-CH2-CH2-O 7T?J-P— OCH3
OCH3 oder des Tristyrylphenolpolyoxyäthylen-18-mono/dimethyl-phophorsäure- ester Tensids.
6) Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 1 , dadurch ge¬ kennzeichnet, dass folgende Komponenten <.u einem Systempräparat zusammenfügt sind:
2 bis 5 Gewichts-% eines kristallinen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX), 10 bis 20 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Neutralöl oder eines/bzw. mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XXIV)
R4 C OO R5 (XXIV) worin R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und R5 eine C1 - bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten, 35 bis 45 Gewichts-% des wasserfreien Octylphenylpolyoxyäthylenäther- Tensids mit 9 bis 10 Oxyäthylengruppen,
35 bis 45 Gewichts-% des Mischemulgators, bestehend aus je 50 % der beiden Verbindungen mit Formeln:
O
oder des Tristyrylphenolpolyoxyäthylen-18-mono/dimethyl-phophorsäure- ester Tensids.
7) Neue Ester mit Apocarotinolen der Formeln (I) bis (IX)
O
(III)
(VII)
(IX) worin R für eine C4- bis C β-Alkyl-, eine C2- bis Cis-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C-| 8-Alkinylgruppe oder für ein Radikal der Formel
steht.
8) Das ß-Apo-8'-carotinyl-10-undecenoat, ß-Apo-8'-carotinyl-laurat, ß-Apo-8'- carotinyl-palmitat, ß-Apo-8'-carotinyl-stearat, sowie das Azafrinyl-10-unde- cenoat, Azafrinyl-Iaurat, Azafrinyl-palmitat und das Azafrinyl-stearat gemäss Anspruch 7.
9) Verfahren zur Herstellung von Estern mit Apocarotinolen gemäss An¬ spruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Apocarotin der Formeln (XV) bis (XXXIII) :
(XVII)
(XXIII)
mit dem Chlorid, bzw. Bromid einer Säure der Formel (XIV)
:00H (XIV) wobei R3 für eine C1 - bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C32-Alkinylgruppe oder für ein Radikal der Formeln (X) oder (XI) steht
(XI) worin n die Zahlen 1 , 2, 3, 4 oder 5 bezeichnet und R2 eines der Radikale der Formeln
OCOCH
wiedergibt, bei einer Temperatur von 0 bis 60 °C unter Schutzgaszuleitung in einem indifferenten Lösungsmittel und in Gegenwart eines Katalysatoren umsetzt.
10) Verfahren zur Herstel lung von ß-Apo-δ'-carotinylestern, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass man den δ'-Apo-ß-carotin-δ'-säuremethylester bei -30 °C mit DIBAH (Diisobutylaluminiumhydrid) red uziert, um den C30-Alkohol als Zwischenstufe zu gewinne n , der sodann mit einem aliphatischen Säure¬ ch lorid in Et2θ und Pyridin bei - 30 °C and anschl iessend bei Raum¬ tem peratur verestert wird.
1 1 ) Verfahren zur Herstel l ung von Azafrinylestern, dadurch gekennzeichnet, dass man zu nächst Azafrinol aus Azafrinmethylester m ittels DIBAH-Reaktion herstellt und diese Verbind ung unmittelbar anschl iessend mit einem ali phatischen Säurechlorid i n Et2θ und Pyridin bei - 30 °C and anschlies¬ send bei Raumtemperatur verestert.
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