EA039639B1 - Способ экстракции и очистки гиалуроновой кислоты - Google Patents
Способ экстракции и очистки гиалуроновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- EA039639B1 EA039639B1 EA201992340A EA201992340A EA039639B1 EA 039639 B1 EA039639 B1 EA 039639B1 EA 201992340 A EA201992340 A EA 201992340A EA 201992340 A EA201992340 A EA 201992340A EA 039639 B1 EA039639 B1 EA 039639B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- broth
- volume
- fermentation broth
- hyaluronic acid
- recirculation
- Prior art date
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 108
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 107
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 29
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 19
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 10
- 239000012471 diafiltration solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 10
- -1 alkaline earth metal salt Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 241001339231 Streptococcus equi subsp. equi Species 0.000 claims description 6
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000005362 aryl sulfone group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 8
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 5
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 53
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 10
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 10
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 3
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 3
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- NEUSVAOJNUQRTM-UHFFFAOYSA-N cetylpyridinium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 NEUSVAOJNUQRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004830 cetylpyridinium Drugs 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-YXBJCWEESA-N (2s,4s,5r,6s)-6-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(3s,4r,5r,6r)-6-[(3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)C(O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)C(C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-YXBJCWEESA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287826 Gallus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001081176 Homo sapiens Hyaluronan mediated motility receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027735 Hyaluronan mediated motility receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710128038 Hyaluronan synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000005615 Interstitial Cystitis Diseases 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N cetyltrimethylammonium ion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940018991 hyalgan Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 229940023593 orthovisc Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000013396 workstream Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/728—Hyaluronic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
- A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
- A61L15/28—Polysaccharides or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/40—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. plant or animal extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L15/44—Medicaments
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3637—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the origin of the biological material other than human or animal, e.g. plant extracts, algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/60—Materials for use in artificial skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D11/00—Solvent extraction
- B01D11/04—Solvent extraction of solutions which are liquid
- B01D11/0492—Applications, solvents used
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
- B01D71/06—Organic material
- B01D71/66—Polymers having sulfur in the main chain, with or without nitrogen, oxygen or carbon only
- B01D71/68—Polysulfones; Polyethersulfones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
- A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/24—Materials or treatment for tissue regeneration for joint reconstruction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/34—Materials or treatment for tissue regeneration for soft tissue reconstruction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/25—Recirculation, recycling or bypass, e.g. recirculation of concentrate into the feed
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
- B01D2315/16—Diafiltration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2317/00—Membrane module arrangements within a plant or an apparatus
- B01D2317/02—Elements in series
- B01D2317/022—Reject series
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Botany (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Physiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области, касающейся способов экстракции и очистки гиалуроновой кислоты из ферментационного бульона, которые предусматривают следующие стадии: a) разбавление отфильтрованного ферментационного бульона очищенной водой; b) принудительная рециркуляция бульона, поступающего из стадии a), образованного объединением ретентата и пермеата, внутрь кассет фильтра тангенциального потока, содержащих ультрафильтрационные мембраны, где принудительную рециркуляцию повторяют в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, причем указанную рециркуляцию проводят с помощью однонаправленного потока и в замкнутой системе при постоянном объеме без введения жидкостей извне. С помощью указанных стадий способы в общем становятся более удобными с точки зрения промышленного производства, наряду с общим сохранением относительно технологического времени, применения материалов и подлежащих утилизации отходов. Способы по настоящему изобретению неожиданно повышают технологический выход в целом, что обеспечивает намного большее улучшение их эффективности.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Гиалуроновая кислота (HA) представляет собой линейный, анионный, высокомолекулярный полисахарид без сульфатных групп, состоящий из чередующихся остатков D-глюкуроновой кислоты и Nацетил-О-глюкозамина. Она присутствует в природе в перицеллюлярной жидкости, в основном веществе соединительной ткани позвоночных организмов (одним из основных компонентов которого она является), в синовиальной жидкости суставов, в стекловидном теле и в пуповине. В силу этого HA играет важную роль в биологическом организме, прежде всего как механическая опора для клеток многих тканей, таких как кожа, сухожилия, мышцы и хрящ.
Также известно, что HA через свои мембранные рецепторы, в частности CD44, CD54 и CD168, модулирует множество различных процессов, связанных с физиологией и биологией клетки, таких как, например, пролиферация, миграция, дифференцировка клеток и ангиогенез, и что она также выполняет другие функции, такие как увлажнение тканей и смазывание суставов. Она полностью биосовместима, и благодаря своим многочисленным особенностям в течение многих лет ее широко применяют в различных областях в диапазоне от восстановления тканей до вискосапплементарной терапии, от эстетической в отношении кожи медицины до эндоокулярной хирургии, от тканевой инженерии до клеточной терапии и гораздо больше.
Химико-физические и биологические характеристики HA тесно связаны с ее молекулярной массой (MW - относится к средневесовой MW, рассчитанной способом характеристической вязкости), которая является чрезвычайно изменчивой: в целом можно сказать, что средневесовая MW HA варьирует приблизительно от 20000 до 13x106 Да, и сопоставление являться обязательным требованием, поскольку масса полностью изменяется в зависимости от источника и способа получения и очистки, применяемых для ее выделения.
Собственно, существует два основных способа получения HA.
Получение из источников животного происхождения: исторически HA экстрагируют из тканей животных, таких как пуповина, стекловидное тело или бычья синовиальная жидкость и особенно куриных гребней. Получение из источников животного происхождения имеет многочисленные ограничения, например, оно является дорогостоящим, поскольку для удаления различных видов примесей требуются многочисленные стадии (начиная с большого количества органических остатков после расщепления исходной ткани), а также необходимы стадии для обеспечения инактивации и удаления любого загрязняющего вещества (такого как вирусы), возможно присутствующего в исходном материале, это требует наличия значительных количеств сырьевого материала и не дает больших выходов.
Ферментация микроорганизмов: некоторые микроорганизмы, в частности род Streptococcus или Pasteurella, при соответствующей стимуляции и/или модификации, способны продуцировать HA, которая секретируется в культуральный бульон, из которого ее выделяют различными способами, известными квалифицированным специалистам в данной области. Также в этом случае требуются многочисленные стадии для удаления присутствующих примесей, таких как, например, остатки клеточных стенок используемых микроорганизмов, ионы металлов, нуклеиновые кислоты и любой другой нежелательный белковый материал. Несмотря на эти ограничения, это все еще наиболее развитый и широко применяемый способ получения HA.
Также изучаются новые способы получения HA с помощью биотехнологии, посредством трансфекции генов, экспрессирующих фермент HA-синтазу, в подходящих клетках-хозяевах, таких как некоторые роды Bacillus (Megaterium и Subtilis) и Escherichia coli. Все процедуры, необходимые для удаления любых потенциально вредных остатков, однако также необходимы для этих способов получения.
В любом случае, независимо от применяемого способа, ключевой стадией получения HA, безусловно, является фаза экстракции и очистки полисахарида. Существует множество известных способов, все из которых чрезвьиайно четко сформулированы и, безусловно, модулированы в зависимости от исходных источников получения HA.
Прежде всего должны быть удалены остатки источника, вследствие этого, в отношении экстракции из ткани животного существуют фазы расщепления белков и последующие стадии фильтрации, центрифугирования и промывания; в отношении ферментации обычно проводят стадии центрифугирования и поэтапного промывания. В любом случае получают жидкую фракцию, из которой затем выделяют полисахарид. В этом отношении наиболее широко известным и, безусловно, наиболее часто применяемым способом, особенно в отношении HA, полученной из источников животного происхождения, является осаждение растворителем: для больших линий в вышеуказанной жидкой фракции применяют увеличивающиеся концентрации органических растворителей (этанол, ацетон), вызывая осаждение гиалуроновой кислоты, которую затем очищают путем последующих стадий солюбилизации и осаждения.
Альтернативная система предусматривает применение четвертичных солей, например цетилпиридиния или цетилтриметиламмония, с возможностью образования комплексов полисахарида и стимулирования его осаждения. Опять же последующие стадии солюбилизации и осаждения необходимы для получения конечного продукта.
Разработка методик также объединяет ключевые стадии, описанные выше, чтобы сделать способ продуктивным с точки зрения выхода и эффективным с точки зрения чистоты: однако до настоящего
- 1 039639 времени все еще имеется много, порядка нескольких сотен, побочных явлений, о которых сообщается ежегодно компетентными органами (например, FDA), которые произошли, в частности, после введения фармацевтических композиций на основе HA.
Гиалуроновую кислоту применяют в широком круге областей и при широком спектре патологий: от косметических средств (для местного или перорального введения) с увлажняющим действием до местных лечебно-косметических средств для кожи с успокаивающим действием, от инъекционных устройств для коррекции дефектов кожи (внутрикожных), будь-то морщины или шрамы, до более строгих фармакологических применений, таких как внутрисуставное применение при костно-суставных патологиях, внутриглазное в качестве замены стекловидного тела, интравезикальное против интерстициального цистита и так далее.
Принимая во внимание, что для косметических применений, которые не касаются поврежденных тканей, достаточно HA с косметической степенью чистоты (менее чистой), очевидно, что в случае фармацевтических применений, особенно применений инъекционных средств, в том числе особенно инъекционных средств в закрытых полостях (сустав и глаз), требуется степень абсолютной чистоты: из-за природы материалов, из которых экстрагируют гиалуроновую кислоту, фактически, в конечном продукте могут присутствовать, в остаточной форме, нуклеиновые кислоты, белки и/или остаточные бактериальные токсины клеточной стенки грамположительных бактерий (например, рода Bacillus, Streptococcus, Enterococcus и Staphylococcus), такие как липотейхоевая кислота (LTA), или грамотрицательных бактерий (таких как, например, Escherichia coli, Pasteurella и Salmonella), такие как липополисахарид (LPS). Эти различные виды загрязняющих веществ способны вызывать значительную воспалительную реакцию с последующим высвобождением, как на локальном, так и на системном уровне, цитокинов (в частности, TNF и IL-1), которые, в свою очередь, способны вызывать генерализованную воспалительную реакцию с последствиями для всего организма, в большинстве тяжелых случаев приводя к формам септического шока.
LTA и LPS на самом деле представляют собой полимеры, состоящие из липидной части и сахаридной части, способной вызывать сильные иммунные ответы и в наиболее серьезных ситуациях вызывать артрит, нефрит, менингит или вызывать лихорадку и шок с последствиями, которые также могут стать смертельными. Это объясняет большое количество зарегистрированных побочных явлений, которые указаны выше.
В дополнение к этому следует также учитывать, что, как упоминалось ранее, MW HA является изменчивой в зависимости от источника и способа получения и определяет ее область применения: например, HA с низкими значениями MW применяют в дерматологических препаратах или лечебнокосметических препаратах для кожи (приблизительно 200 кДа, Connettivina®), тогда как для внутрисуставных применений предпочтительными являются более высокие значения MW (обычно в диапазоне от 700 до 1800 кДа; Hyalgan®, Hyalubrix®, Orthovisc®), HA со значениями MW, достигающими значений выше 1500 кДа, применяют в косметической хирургии или для внутриглазных применений. Тем не менее, применительно к способу очистки важным является удаление фракций HA с MW менее 30000 Да, для которых широко показан сильный воспалительный эффект (EP 0138572), что абсолютно нежелательно, независимо от типа применения.
Это означает, что в процессе промышленной очистки HA необходимо оценивать и контролировать различные факторы:
технологический выход: необходимо экстрагировать максимально возможное количество HA из выбранного источника получения;
промышленное удобство: наилучший продукт должен быть получен с минимальными отходами используемых материалов (реагенты, растворители и т.д.), производя как можно меньшее количество отходов, подлежащих утилизации, и в кратчайшие сроки;
степень чистоты: полученный продукт не должен содержать каких-либо загрязняющих веществ, а также фракций HA с MW <30000 Да, известных как способные вызывать воспалительный каскад.
Степень чистоты, безусловно, зависит от точности стадий очистки.
В уровне техники известны многочисленные попытки обобщения этих требований. Среди множества схематично можно вспомнить приведенное ниже.
EP 0138572: очистка HA из петушиных гребней с использованием, среди прочего, стадий ультрафильтрации, добавление четвертичных солей (цетилпиридиния) и минеральных смол, осаждение этанолом и получение двух фракций с разной MW (50-100 кДа и 500-730 кДа), без вызывающей воспаление фракции; стадии ультрафильтрации в данном случае применяют для удаления всех воспалительных молекул с MW <30000 и для разделения двух необходимых фракций HA.
EP 535200: очистка HA из гребней петухов с помощью стадий засоления четвертичными аминами и последующих стадий осаждения растворителями (этанолом или ацетоном). HA получают с различными значениями MW в диапазоне от 750 до 1230 кДа, без вызывающих воспаление фракций, и они специально предназначены для офтальмологического применения.
US 6489467: очистка HA из Streptococcus путем ускоренного окисления с помощью HCl, после- 2 039639 дующих стадий изменения pH и диафильтрации с получением HA с MW, составляющей приблизительно
1700 кДа.
Choi et al., Biomaterials Research, 2014, 18, 1-10: очистка HA из Streptococcus zooepidemicus путем ультрафильтрации и осаждения ацетоном. Получают HA со значениями MW в диапазоне от 900 до 1100 кДа.
EP 2870255: очистка HA из Streptococcus zooepidemicus с помощью стадий фильтрации (для удаления примесей), ультрафильтрации (для концентрирования продукта внутри раствора, в котором он присутствует), изменения pH и, в заключение, осаждения этанолом с получением MW в диапазоне от 60 до 2400 кДа.
EP 1543103: очистка HA из культур Streptococcus путем добавления ароматических смол в предварительно отфильтрованный культуральный бульон, который адсорбирует большую часть примесей, с последующей ультрафильтрацией для концентрирования раствора HA и, в заключение, осаждение этанолом.
WO 2018/020458: очистка HA из культур микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, с разделением на фракции, имеющие точную молекулярную массу (92-230 кДа; 450-780 кДа; 920-1450 кДа) путем термической обработки. Очистка включает, помимо прочих фаз, стадии с ароматическими смолами с последующими повторными стадиями фильтрации и, в заключение, осаждение органическим растворителем и соответствующими стадиями промывания.
Хотя с помощью способов, изложенных в данном документе, и способов, обычно применяемых в большинстве случаев, можно получать высококачественную гиалуроновую кислоту и с приемлемыми значениями выхода, они являются чрезвычайно сложными и, следовательно, дорогостоящими с точки зрения применения реагентов, растворителей, фильтров и т.д., с точки зрения времени и, наконец, с точки зрения затрат, которые необходимо понести для удаления отходов переработки.
Настоящее изобретение преодолевает недостатки известного уровня техники благодаря чрезвычайно упрощенному способу очистки натриевой соли гиалуроновой кислоты, который позволяет получать продукт очень высокой чистоты, наряду с удивительной экономией материалов и времени и заметным увеличением значений выхода в промышленном масштабе, которые, как известно, достигают значений, очень близких к 100%.
Подробное описание изобретения
Объект настоящего изобретения относится к новому способу экстракции гиалуроновой кислоты и ее последующей очистки в форме соли щелочного и/или щелочно-земельного металла, предпочтительно в форме натриевой соли, который характеризуется очень высоким выходом;
промышленным удобством, благодаря удалению многочисленных промежуточных стадий;
очень высокой степенью чистоты конечного продукта, абсолютно без каких-либо загрязняющих веществ.
Способ экстракции гиалуроновой кислоты, разработанный заявителем, является чрезвычайно экономичным, поскольку он обеспечивает строго ограниченное количество рабочих стадий для достижения конечного продукта; это означает экономию не только с точки зрения используемых материалов (растворителей, реагентов, солей, минеральных смол, синтетических смол, фильтров и т.д.), но также и в отношении утилизации отходов переработки: известно, что материалы, используемые в химической промышленности, должны утилизироваться в соответствии с техникой безопасности, например, в случае органических растворителей. Наконец, меньшее количество стадий также соответствует, в этом случае, сокращению времени обработки; сочетание этих факторов приводит к лучшему промышленному удобству. Этот способ может быть применен для очистки HA, полученной в соответствии с любой из многочисленных методик, известных специалистам в данной области. Фактически HA может происходить из биологического источника, в частности из гребней птиц рода Gallus (EP 0138572), в результате ферментации Streptococcus, в результате молекулярной инженерии с помощью Bacillus subtilis и Bacillus megaterium (EP 2614088, EP 2614087); этот способ предпочтительно применим к HA, полученной в результате ферментации Streptococcus, в частности Streptococcus equi подвид equi, 68222, мутант H-1 (EP 0716688).
Способ, заявленный в данном документе, как показано заявителем далее, позволяет получать HA чрезвычайно высокой чистоты, не только в соответствии со всеми химическими/физическими характеристиками, требуемыми Европейской фармакопеей (Евр. фарм. 5.0 1472), но даже более чистой, в частности, с точки зрения содержания бактериальных эндотоксинов, белков, пирогенов.
Следует помнить собственно, что независимо от источника получения, если конечный продукт не был полностью очищен, он может содержать различные виды загрязняющих веществ, такие как пирогены, белки (происходящие из исходного биологического материала), нуклеиновые кислоты, токсины бактериального происхождения, происходящего либо от грамположительных бактерий (Streptococcus, или Bacillus, или от Enterococci и Staphylococci), либо от грамотрицательных бактерий, таких как, например, Escherichia coli или Pasteurella и Salmonella: присутствие этих токсинов, например липотейхоевой кислоты (LTA) или липополисахарида (LPS), в готовом продукте на основе гиалуроновой кислоты делает невозможным его применение из-за высокого риска продуцирования вызывающих сильную реакцию орга- 3 039639 низма провоспалительных факторов, что, в свою очередь, является причиной воспалений и/или инфекций суставов или тканей, подвергаемых обработке, и в наиболее тяжелых случаях вызывающих их полное разрушение или некроз.
В заключение, выход при осуществлении способа очистки в соответствии с настоящим изобретением чрезвычайно высокий и находится в диапазоне значений от 85 до 100%.
Гиалуроновую кислоту, полученную в соответствии с настоящим изобретением, можно применять с полной безопасностью, особенно во всех инъекционных фармацевтических композициях (внутрисуставных, внутрикожных и внутриглазных), поскольку она не содержит каких-либо провоспалительных и пирогенных компонентов. HA, очищенную с помощью нового способа, объекта настоящего изобретения, предпочтительно полученную в форме соли щелочного или щелочно-земельного металла и еще более предпочтительно в форме натриевой соли, также можно применять при получении всех производных, известных специалистам в данной области, таких как, например, соли HA с тяжелыми металлами (EP 0827514), сложные эфиры (EP 0216453), амиды (EP 1095064), сульфатированные продукты (EP 0940410) и продукты, полученные в результате сшивания, включая продукты, полученные в результате аутосшивания (EP 0341745), НА.
Как уже указывалось, способ в соответствии с настоящим изобретением можно применять для очистки HA, полученной в соответствии с различными известными методиками, поскольку, как правило, все способы предусматривают некоторые общие стадии, которые можно обобщить как указано далее.
Получение.
В зависимости от выбранного источника происходит расщепление биологического материала или ферментация соответствующим образом идентифицированных микроорганизмов или, опять же, в соответствии с новыми научными исследованиями с использованием биотехнологических процедур. То, что получают, является, по сути, бульоном, сильно загрязненным твердыми биологическими материалами (так называемой биомассой), содержащим в растворе гиалуроновую кислоту и многие другие совершенно нежелательные вещества различных типов. Каждый способ также предусматривает стадии удаления производственных остатков (как твердых, так и, насколько это возможно, растворенных), как правило, путем разделения биомассы с использованием различных способов, чтобы получить отфильтрованные бульоны, содержащие HA, для подвергания последующей стадии экстракции: именно на этой стадии HA выделяют и извлекают из ферментационного бульона. Это стадия, на которой различные известные способы отличаются наиболее сильно как с точки зрения рабочих способов (реагенты, растворители, фильтры, поверхностно-активные вещества и т.д.), так и с точки зрения количества стадий и, следовательно, с точки зрения затраченного времени. Это, безусловно, самая сложная и требующая осторожности часть способа, поскольку именно на стадии экстракции закладываются основы для степени чистоты готового продукта и выхода при осуществлении способа получения. Результатом осуществления стадии экстракции является, как правило, концентрированный раствор HA, который подвергают так называемой стадии очистки.
Хотя способы очистки также определяются в соответствии с источником происхождения гиалуроновой кислоты, в целом, они соответствуют общим линиям, которые известны специалистам в данной области:
жидкую фазу, содержащую гиалуроновую кислоту в растворе, обрабатывают таким образом, чтобы удалить возможно присутствующие нежелательные элементы (белки, токсины и т.д.);
затем осуществляют осаждение с помощью органических растворителей (таких как этанол, ацетон или их смеси), в которых HA нерастворима;
за этим следуют повторяющиеся стадии растворения осадка в водном носителе и последующие стадии осаждения, солюбилизации, фильтрации и промывания до тех пор, пока не будет получен конечный продукт, который затем высушивают.
Способ очистки в широком смысле (понимаемый как комбинация стадий, начиная с ферментационного бульона, приводящая к конечному продукту) согласно настоящему изобретению сосредоточен на стадии экстракции, которая, независимо от источника HA, в различных известных на сегодняшний день способах нацелена на многочисленные прогоны.
Именно на этой стадии фактически необходимо выделить из бульона максимально возможное количество необходимого продукта (НА), одновременно удаляя максимально возможное количество всех видов примесей, и это объясняет большое количество необходимых рабочих стадий.
Поэтому именно на этой стадии определяют основные параметры, по которым должен оцениваться способ очистки, т.е.
выход, т.е. количество полученного продукта; чистота полученного продукта;
промышленное удобство, т.е. растрата материалов и времени на получение необходимого продукта с необходимыми характеристиками.
Заявитель неожиданно обнаружил, что начиная с бульона, полученного на стадии получения (независимо от того, какой она может быть), посредством сокращенной серии стадий способ экстракции в соответствии с настоящим изобретением позволяет получить из бульона практически всю гиалуроновую кислоту, присутствующую в нем, и указанная HA после соответствующих стадий очистки в соответствии
- 4 039639 с известным уровнем техники оказывается чрезвычайно чистой в отношении содержания пирогенов, белков, бактериальных эндотоксинов.
Таким образом, объект настоящего изобретения относится к способу экстракции и очистки HA из ферментационного бульона, предпочтительно из ферментационного бульона микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, указанный способ отличается тем, что он включает стадию экстракции, включающую или состоящую из следующих стадий:
a) разбавление отфильтрованного ферментационного бульона очищенной водой в количестве от 1,1 до 3 объемов;
b) принудительная рециркуляция бульона, поступающего из стадии a), образованного объединением пермеата и ретентата внутри кассет фильтра тангенциального потока (TFF), содержащих ультрафильтрационные мембраны, изготовленные из арилсульфонового полимерного материала, с пористостью в диапазоне от 5000 до 300000 Да, где принудительную рециркуляцию повторяют в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, причем указанную рециркуляцию проводят с помощью однонаправленного потока и в замкнутой системе при постоянном объеме без введения жидкостей извне, при этом за стадией b) принудительной рециркуляции следуют нижеуказанные стадии:
c) I диафильтрация ретентата, содержащегося в TFF-кассетах из стадии b), раствором для диафильтрации, выбранным из очищенной воды и солевого раствора;
d) концентрирование объема, полученного на стадии c), до объема, равного объему исходного бульона;
e) II диафильтрация объема, полученного на стадии d), раствором для диафильтрации, выбранным из очищенной воды и солевого раствора, при этом повторяют указанную диафильтрацию от 5 до 15 раз;
f) конечного концентрирования объема, полученного на стадии e), до тех пор, пока не будет получен конечный объем, равный трети объема исходного бульона;
g) извлечение продукта, удерживаемого внутри TFF-кассет, путем циркуляции очищенной воды до получения общего объема, равного половине исходного бульона.
Еще один объект настоящего изобретения относится к способу экстракции HA из ферментационного бульона микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, причем указанный способ включает или состоит из следующих стадий:
a) разбавление отфильтрованного ферментационного бульона очищенной водой в количестве от 1,1 до 3 объемов;
b) принудительная рециркуляция бульона, поступающего из стадии a), образованного объединением пермеата и ретентата внутри кассет фильтра тангенциального потока (TFF), содержащих ультрафильтрационные мембраны, изготовленные из арилсульфонового полимерного материала с пористостью в диапазоне от 5000 до 300000 Да, где принудительную рециркуляцию повторяют в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, причем указанную рециркуляцию проводят с помощью однонаправленного потока и в замкнутой системе при постоянном объеме без введения жидкостей извне.
Разработанный заявителем способ экстракции позволяет практически полностью экстрагировать и, следовательно, извлекать гиалуроновую кислоту, присутствующую в исходном отфильтрованном бульоне, позволяя достичь значений выхода в диапазоне от 95 до 100%.
Таким образом, такие высокие значения выхода при экстракции приводят к гораздо более высоким значениям выхода конечного продукта, чем было известно до сих пор, поскольку на последующих стадиях осаждения и промывания, типичных для этих способов, единственными потерями HA в количественном выражении являются потери, связанные с технологическими операциями (например, минимальные количества HA остаются прикрепленным к используемому оборудованию); поэтому предполагается, что выход на стадии экстракции строго предсказывает выход всего способа очистки.
Способ экстракции в соответствии с настоящим изобретением имеет преимущество в отношении инновационного применения методики ультрафильтрации (UF). В целом, методика UF является известным способом, который позволяет выделить компонент из жидкой фазы, в которой указанный компонент содержится, и он имеет молекулярную массу выше, чем таковая, которая определяется порами фильтрующей мембраны (предел отсечения). Очень схематично, жидкую фазу (исходное сырье), содержащуюся в специальном резервуаре, проталкивают насосом к фильтрационной мембране, снабженной порами, имеющими точные размеры (предел отсечения). Жидкость, проходящую через мембрану фильтра, собирают ниже по потоку и получают фильтрат или пермеат, и его удаляют; извлекаемый компонент удерживается на поверхности мембраны и образует ретентат, который содержит представляющий интерес продукт. Чтобы извлечь максимально возможное количество продукта, ретентат подвергают множеству циклов UF, повторно вводят его в резервуар и перенаправляют как исходное сырье в UF-кассеты с удалением пермеата, получаемого каждый раз. Поэтапное удаление пермеата, несомненно, приводит к концентрированию из-за потери объема, который затем компенсируется добавлением подходящей жидкости в резервуар. Поэтапное удаление пермеата, несомненно, приводит к потере гиалуроновой кислоты, которую UF-фильтры не могут полностью удержать.
Чтобы получить как можно более чистый конечный продукт, за циклом следует, как известно специалистам в данной области, одна или более стадий диафильтрации, с введением подходящей жидкости
- 5 039639 (раствор для диафильтрации) извне, чтобы создать промывочный поток, который при прохождении через ретентат помогает удалить все еще присутствующие примеси. Когда, как и в случае настоящего изобретения, молекулы биологического происхождения должны быть разделены, при этом, как правило, имеющие значительные размеры с точки зрения молекулярной массы, принятой UF, является так называемая фильтрация тангенциального потока (TFF).
Поэтому заявитель разработал инновационный способ экстракции HA из ферментационного бульона, предпочтительно из ферментационного бульона микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, в частности S. equi, B. subtilis или B. megaterium, более предпочтительно S. equi, способ, который благодаря инновационному применению методики TFF позволяет практически полностью извлечь гиалуроновую кислоту из бульона, в котором она содержится.
Заявитель на самом деле неожиданно обнаружил, что с помощью предшествующей TFF стадии разбавления и последующей принудительной рециркуляции подлежащего обработке культурального бульона получают практически полное извлечение гиалуроновой кислоты, присутствующей в том же бульоне. Эту принудительную рециркуляцию осуществляют, как подробно объяснено ниже, путем отправки культурального бульона в соответствующие TFF-кассеты, сбора полученного пермеата (а не удаления его, как того требует существующий уровень техники) и после его транспортировки внутрь резервуара, из которого берут исходный бульон, перенаправления его снова на те же TFF-кассеты, внутри которых он будет вести себя как исходное сырье: таким образом, HA, все еще присутствующая в рециркулирующем исходном сырье, будет представлять собой дополнительный ретентат, и постепенно образующийся пермеат будут повторно использовать в цикле, описанном выше (принудительная рециркуляция). Таким образом, на этой стадии ретентат и пермеат объединяют в резервуаре, который содержал исходное сырье, и подвергают рециркуляции с помощью однонаправленного потока. Все это происходит без введения жидкостей извне, что позволяет поддерживать постоянный объем внутри системы, соответственно, в замкнутой системе. Вся система, естественно, оснащена комплектом клапанов, которые регулируют потоки и оттоки, насосами переменного давления для подачи жидкостей, манометрами для контроля значений давления.
Как уже упоминалось выше, описанный набор операций обуславливает практически полное извлечение HA из исходного бульона со значениями выхода в диапазоне от 95 до 100%.
Следовательно, очевидно, что обсуждаемое настоящее изобретение существенно изменяет уровень техники, значительно улучшая выход при осуществлении способа (извлекают большее количество гиалуроновой кислоты) и, каскадно, промышленное удобство (меньшее количество стадий означает меньшие количества используемых материалов, фильтров и т.д. и меньшее количество отходов, подлежащих утилизации).
Более конкретно, рабочий поток, посредством которого осуществляют способ, описанный в настоящем изобретении, начинается, как уже указывалось, с бульона, содержащего HA, и исходящий из любой начальной стадии получения, предпочтительно из ферментации из Streptococcus, в частности из ферментации Streptococcus equi подвид equi, 68222, мутант Н-1 (EP 0716688). В этом конкретном случае бульон доводят до pH в диапазоне от 4,0 до 5,0, предпочтительно до 4,5 с помощью раствора сильной кислоты, предпочтительно HCl, и затем отделяют от биомассы с помощью одной из методик разделения, известных специалистам в данной области (центрифугирование, и/или микрофильтрация, и/или фильтрация через подушки из кизельгура).
Объем отфильтрованного бульона, безусловно, варьирует в зависимости от мощности промышленного предприятия; в этом конкретном случае объем может варьировать от 2000 до 4000 л; способ предпочтительно применяют для партии объемом 3000 л. Затем следует стадия экстракции.
Полученный таким образом бульон последовательно подвергают нижеуказанным стадиям.
a) Разбавление: бульон, поступающий из стадии получения и обработанный, как описано выше, вводят в подходящий резервуар и разбавляют очищенной водой до общего объема в диапазоне от 1,1 до 3 объемов, предпочтительно до объема, который равняется 1,5 объема по сравнению с начальным объемом. Это совершенно инновационный подход, поскольку в соответствии с уровнем техники, исходный бульон концентрируют, поэтому необходимо обрабатывать меньшие объемы.
b) Принудительная рециркуляция: бульон, разбавленный таким образом (исходное сырье), циркулирует при помощи системы, содержащей насос, внутри TFF-кассет, содержащих UF-мембраны, изготовленные из арилсульфонового полимерного материала, предпочтительно полиэфирсульфона, с меняющейся пористостью (предел отсечения) в диапазоне от 5000 до 300000 Да, предпочтительно от 50000 до 200000 и еще более предпочтительно с пористостью, которая равняется 100000 Да, без введения раствора для ультрафильтрации и без отведения пермеата, а значит, внутри замкнутой системы. Таким образом, создают принудительную рециркуляцию бульона, при которой вместо того, чтобы удалить пермеат, как это обычно бывает, его повторно вводят в резервуар и объединяют с ретентатом, который постепенно образуется, и его направляют далее к мембране фильтра. Фактически, пермеат, по меньшей мере, для первых циклов содержит не только минеральные соли и различные типы примесей, но и HA в растворе. Принудительная рециркуляция бульона также создает желатиновый слой HA внутри UF-кассеты, который действует как дополнительный фильтр для HA, все еще присутствующей в пермеате, и в то же время
- 6 039639 предотвращает засорение системы. Следует отметить, что принудительная рециркуляция и вся система экстракции характеризуются однонаправленным потоком жидкой фазы (исходного сырья и других жидкостей). Принудительную рециркуляцию поддерживают в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, предпочтительно в течение времени, которое равняется 3 ч, и тестируют с равными промежутками времени, составляющими 30 мин, до тех пор, пока образец пермеата, доведенный с помощью NaCl в порошковой форме до конечной молярности 0,3М NaCl и с добавлением двух объемов этанола, не дает какоголибо осадка (как уже упоминалось, осаждение этанолом является одной из самых простых и самых быстрых методик выделения HA из жидкой фазы). Это означает, что практически вся HA, присутствующая в начальном бульоне, будет сохранена в TFF-кассете внутри ретентата: очевидно, что инновации практически исключают потери продукта, что приводит к огромному преимуществу в производстве.
Выход на стадии экстракции рассчитывали по способу с использованием карбазола (Евр. фарм. 5.0; 1472, 01/2011); вкратце, концентрацию HA, присутствующую в бульоне в конце ферментации, и концентрацию HA, полученную в конце стадии экстракции, определяли способом с использованием карбазола. Более конкретно, рассчитывали соотношение между количеством в граммах HA, экстрагированной в соответствии с тем, что описано, и начальными литрами бульона в конце ферментации; простая пропорция позволяет рассчитать значение выхода, выраженное в процентах экстрагированной HA против исходной HA в бульоне.
Выход на стадии экстракции, разработанной в рамках настоящего изобретения, рассчитанный таким образом, находится в диапазоне от 95 до 100%. Далее следует то, что известно специалистам в данной области; в частности, заявитель приступает к стадиям диафильтрации и предпочтительно, как указано далее.
c) I диафильтрация: пермеат, полученный на предыдущей стадии b), полностью без HA, удаляют через отверстие выпускного клапана. Подача раствора для диафильтрации открыта, и ее поддерживают непрерывной, чтобы создать постоянный поток раствора для диафильтрации через ретентат, в то время как объем, циркулирующий внутри резервуара, поддерживают постоянным за счет удаления постепенно образующегося пермеата. Используемый раствор для диафильтрации может представлять собой очищенную воду или физиологический раствор, предпочтительно очищенную воду. Эту процедуру продолжают в течение времени, необходимого для удаления объема пермеата, равного удвоенному объему, присутствующему в резервуаре в конце стадии принудительной рециркуляции.
d) Концентрирование: при сохранении открытым сбросного патрубка и блокировании подачи раствора для диафильтрации содержимое резервуара концентрируют до тех пор, пока оно не будет возвращено к объемам исходного бульона до первоначального разбавления (следовательно, перед стадией a).
e) II диафильтрация: стадию диафильтрации повторяют в отношении объема, полученного на стадии d), как описано на стадии с), 5-15 раз, предпочтительно 6-12 раз.
Наконец, извлечение HA выполняют в соответствии с известным уровнем техники и предпочтительно посредством конечного концентрирования: применяют ту же процедуру, которая описана в пункте d), до тех пор, пока не будет получен конечный объем, равный приблизительно трети начального объема (до стадии a).
И последующее извлечение: продукт, удерживаемый внутри кассет, извлекают путем циркуляции очищенной воды до тех пор, пока не будет получен объем, равный половине объема бульона до начального разбавления (следовательно, перед стадией a).
В этот момент HA, присутствующую в растворе, полученном в результате осуществления способа, описанного выше, переводят на стадию специфической очистки, которая соответствующим образом выбрана специалистом в данной области, так как это известная технология, и на последующую стадию высушивания.
Вкратце, объект настоящего изобретения относится к высокоэффективной процедуре экстракции HA с точки зрения выхода, чистоты продукта и промышленного удобства при применении в общем способе экстракции и очистки HA, полученной путем ферментации из микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, в частности S. equi.
Его совершенно инновационная особенность заключается в том, что TFF предшествует стадия разбавления и принудительная рециркуляция культурального бульона, подлежащего обработке; эта процедура может быть успешно применена в рамках любого известного общего способа получения и очистки HA, независимо от источника HA, способа обработки этого источника и способа, с помощью которого достигают конечного продукта в высушенном виде, готового для применения, для которого оно предназначено.
Более конкретно, заявитель утверждает, что процедура экстракции HA с высоким выходом, начиная с бульона, полученного в соответствии с известными методиками, в частности полученного путем ферментации из Streptococcus, более предпочтительно путем ферментации Streptococcus equi подвид equi, 68222, мутант Н-1 (ЕР 0716688), включает нижеуказанные стадии или состоит из них.
Экстракция:
a) разбавление: отфильтрованный полученный бульон разбавляют очищенной водой до объема в диапазоне от 1,1 до 3 объемов, предпочтительно до объема, который равняется 1,5 по отношению к на
- 7 039639 чальному объему;
b) принудительная рециркуляция: бульон, выходящий из стадии а), образованный объединением ретентата и пермеата, подвергают принудительной рециркуляции внутри кассет с фильтром тангенциального потока (TFF), содержащих ультрафильтрационные мембраны из арилсульфонового полимерного материала, предпочтительно полиэфирсульфона, с пористостью в диапазоне от 5000 до 300000 Да, предпочтительно от 50000 до 200000 и еще более предпочтительно с пористостью, которая равняется 100000 Да. Принудительную рециркуляцию повторяют в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, предпочтительно в течение времени, которое равняется 3 ч, до полного задержания HA внутри ретентата, причем указанную рециркуляцию проводят с помощью однонаправленного потока и в замкнутой системе при постоянном объеме без введения жидкостей извне.
Затем применяют процедуру в соответствии с тем, что известно специалистам в данной области, в частности, со стадиями диафильтрации, и предпочтительно, как указано далее:
c) I диафильтрация: выполняют с помощью раствора для диафильтрации, выбранного из очищенной воды и солевого раствора, предпочтительно из очищенной воды, и продолжают в течение времени, необходимого для удаления объема пермеата, равного удвоенному объему, присутствующему в резервуаре после предыдущей стадии b);
d) концентрирование: содержимое резервуара концентрируют до объема исходного бульона (до стадии a);
e) II диафильтрация: диафильтрацию в соответствии с тем, что описано на стадии с), повторяют 515 раз, предпочтительно 6-12 раз, для объема, полученного на стадии d);
f) конечное концентрирование: объем, полученный на стадии е) концентрируют до тех пор, пока не будет получен объем, равный трети начального объема (до стадии a);
g) извлечение: продукт, удерживаемый внутри кассет, извлекают циркуляцией очищенной воды до полного объема, равного половине бульона перед стадией a).
После того как все стадии, описанные в данном документе, выполнены, так называемые стадии очистки выполняют с применением методик, известных специалистам в данной области; только в качестве примера можно упомянуть обработку сильными щелочными или щелочно-земельными основаниями, предпочтительно щелочными, и в частности NaOH, чтобы исключить любые дополнительные возможные загрязнители, с последующими стадиями фильтрации (например, на каменном угле, и/или на фильтровальной ткани, и/или на полипропилене), стадиями осаждения в органических растворителях, таких как, например, этанол, с различными разбавлениями, и, в заключение, стадиями промывания в органических растворителях (предпочтительно в этаноле); среди различных способов очистки особенно предпочтительны те, которые описаны в примере 3 WO 2018/020458, составной части настоящего изобретения.
Независимо от выбранного способа очистки HA получают в виде соли, предпочтительно в форме натриевой соли.
Очищенную таким образом HA в виде соли затем подвергают высушиванию, что обеспечивает ее оптимальную сохранность, перед использованием для путей применения, для которых она предназначена.
Полученный таким образом продукт не только соответствует параметрам Европейской Фармакопеи (Евр. фарм. 5.0; 1472), но даже лучше с точки зрения содержания бактериальных эндотоксинов и белков.
Конечный выход при осуществлении способа, рассчитанный согласно ранее описанному способу с использованием карбазола (Евр. фарм. 5.0; 1472), подтверждает, что потеря продукта является минимальной на этой фазе и из-за эксплуатационных ограничений; фактически выход попадает в диапазон от 85 до 100%, предпочтительно от 95 до 100%.
Пр имер 1. Экстракция HA из ферментационного бульона Streptococcus equi.
3000 л ферментационного бульона Streptococcus equi подвид equi, 68222, мутант Н-1 доводили до pH 4,5 добавлением 1н. раствора HCl при перемешивании и затем отбирали биомассу путем фильтрации через подушки целита (диатомовый кизельгур).
Обработанный таким образом бульон затем разбавляли 1500 л очищенной воды до конечного объема 4500 л и помещали в реактор с подходящей емкостью (6000 л).
Полученный объем бульона подвергали стадии принудительной рециркуляции с использованием TFF-кассет (Pall, модель Omega), снабженных полиэфирсульфоновыми мембранами с пористостью (пределом отсечения), которая равняется 100000 Да. Исходное сырье подавали в кассеты с давлением на входе не выше 2,5 бар, создаваемым насосом. Принудительную рециркуляцию продолжали в течение 3 ч, с 30-минутными интервалами, проводили анализ для оценки присутствия HA в пермеате: 32 мл NaCl и два объема этанола добавляли к 2 мл пермеата. По истечении 3 ч принудительной рециркуляции проверка давала отрицательный результат, т.е. осадок не образовывался, а это означает, что HA полностью удерживалась в ретентате.
Принудительную рециркуляцию останавливали и выход рассчитывали согласно способу с использованием карбазола, описанному выше, который равняется 98%. Затем начинали первую стадию диафильтрации при постоянном объеме путем введения очищенной воды в сборный резервуар в течение
- 8 039639 времени, необходимого для прохождения через UF-кассеты количества воды, равного 9000 л, таким образом равного удвоенному объему, присутствующему в резервуаре. На этой стадии выпускной клапан открывали и удаляли 9000 л пермеата в специальный контейнер для утилизации.
Объем ретентата теперь концентрировали до исходного объема (3000 л), прекращая подачу очищенной воды, в то время как сбросный патрубок оставляли открытым.
Диафильтрацию повторяли с очищенной водой до удаления в целом 24000 л пермеата, таким образом, завершая 8 циклов диафильтрации.
Кроме того, на конечную концентрацию раствора влияла остановка подачи очищенной воды объемом до 1000 л. Затем продукт извлекали очищенной водой: при закрытом выпускном клапане 500 л воды добавляли в резервуар последовательными фракциями. Вода циркулировала внутри системы, при этом непрерывно извлекали ретентат и повторно вводили его как исходное сырье, чтобы отделить все количество HA, содержащееся в TFF-кассетах и прилипшее к стенкам системы; таким образом получали конечный объем 1500 л, который являлся оптимальным для последующих стадий очистки, причем указанную очистку проводили в соответствии с тем, что описано в примере 3 WO 2018/020458, до получения конечного продукта, гиалуроновой кислоты в форме натриевой соли в виде сухого порошка.
Более конкретно, 0,2М NaOH в воде добавляли к извлеченному продукту и всю смесь затем нейтрализовали 12н. HCl до тех пор, пока pH не дойдет до 8,5, и в заключение фильтровали через полипропиленовый фильтр. Раствор HA, теперь в форме натриевой соли, осаждали абсолютным этанолом и перемешивали в течение 30 мин. Продукту давали осесть в течение 10 мин и супернатант удаляли сифонированием. Продукт промывали смесью этанол:вода (80:20) при непрерывном перемешивании в течение 30 мин, а затем супернатант удаляли сифонированием. Последнее промывание выполняли абсолютным этанолом, который окончательно удаляли фильтрацией. Полученный продукт помещали в специальные лотки из нержавеющей стали и сушили в течение по меньшей мере 22 ч при температуре 25°C в вакууме.
Анализ конечного продукта:
содержание белка: <0,1%, соответствует Евр. фарм. 5.0, 1472, содержание бактериальных эндотоксинов: <0,05%, соответствует Евр. фарм. 5.0, 1472, выход: 96,2%.
Из данных, представленных в данном документе, ясно видно, что внедрение способа экстракции, цели настоящего изобретения в рамках способа получения, экстракции и очистки гиалуроновой кислоты путем ферментации микроорганизмов, известных из уровня техники, неожиданно увеличивает выход при осуществлении способа в целом, что позволяет значительно повысить его эффективность по сравнению с тем, что известно на современном уровне техники. В связи с этим следует помнить, что в целом выход при осуществлении известных способов, считающихся особенно эффективными, установлен между 60 и 80%.
Введение стадии или способа экстракции, разработанного заявителем, также делает весь способ более удобным в с промышленной точки зрения; стадии добавления комплексообразующих солей или адсорбирующих смол, стадии фильтрации на тканях или фильтрах, повторные фазы солюбилизации и осаждения органическими растворителями фактически исключены, что приводит к чистой экономии как с точки зрения времени обработки, так и использования материалов и, в заключение, также с точки зрения отходов, подлежащих утилизации.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (7)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ экстракции и очистки гиалуроновой кислоты из ферментационного бульона микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, отличающийся тем, что он включает стадию экстракции, включающую или состоящую из следующих стадий:a) разбавление отфильтрованного ферментационного бульона очищенной водой в количестве от 1,1 до 3 объемов;b) принудительная рециркуляция бульона, поступающего из стадии a), образованного объединением ретентата и пермеата, внутрь кассет фильтра тангенциального потока (TFF), содержащих ультрафильтрационные мембраны, изготовленные из арилсульфонового полимерного материала с пористостью в диапазоне от 5000 до 300000 Да, где принудительную рециркуляцию повторяют в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, причем указанную рециркуляцию проводят с помощью однонаправленного потока и в замкнутой системе при постоянном объеме без введения жидкостей извне, при этом за стадией b) принудительной рециркуляции следуют нижеуказанные стадии:c) I диафильтрация ретентата, содержащегося в TFF-кассетах из стадии b), раствором для диафильтрации, выбранным из очищенной воды и солевого раствора;d) концентрирование объема, полученного на стадии с), до объема, равного объему исходного бульона;e) II диафильтрация объема, полученного на стадии d), раствором для диафильтрации, выбранным из очищенной воды и солевого раствора, при этом повторяют указанную диафильтрапию от 5 до 15 раз;f) конечное концентрирование объема, полученного на стадии e), до тех пор, пока не будет получен- 9 039639 конечный объем, равный трети объема исходного бульона;g) извлечение продукта, удерживаемого внутри TFF-кассет, путем циркуляции очищенной воды до получения общего объема, равного половине исходного бульона.
- 2. Способ по п.1, где выход гиалуроновой кислоты при осуществлении способа находится в диапазоне от 85 до 100%.
- 3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где очищенная гиалуроновая кислота имеет общее содержание белка <0,1% и содержание бактериальных эндотоксинов <0,05%.
- 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ферментационный бульон представляет собой ферментационный бульон Streptococcus equi подвид equi 68222, мутант Н-1.
- 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где очищенная гиалуроновая кислота находится в форме соли щелочных или щелочно-земельных металлов.
- 6. Способ экстракции гиалуроновой кислоты из ферментационного бульона микроорганизмов рода Streptococcus или Bacillus, причем указанный способ включает или состоит из следующих стадий:а) разбавление отфильтрованного ферментационного бульона очищенной водой в количестве от 1,1 до 3 объемов;Ь) принудительная рециркуляция бульона, поступающего из стадии а), образованного объединением ретентата и пермеата, внутрь кассет фильтра тангенциального потока (TFF), содержащих ультрафильтрационные мембраны, изготовленные из арилсульфонового полимерного материала с пористостью в диапазоне от 5000 до 300000 Да, где принудительную рециркуляцию повторяют в течение времени в диапазоне от 1 до 6 ч, причем указанную рециркуляцию проводят с помощью однонаправленного потока и в замкнутой системе при постоянном объеме без введения жидкостей извне.
- 7. Способ по п.6, где ферментационный бульон представляет собой ферментационный бульон Streptococcus equi подвид equi, 68222, мутант Н-1.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762533798P | 2017-07-18 | 2017-07-18 | |
| IT102017000081449A IT201700081449A1 (it) | 2017-07-18 | 2017-07-18 | Procedimento di purificazione dell'acido ialuronico |
| PCT/IB2018/055291 WO2019016699A1 (en) | 2017-07-18 | 2018-07-17 | PROCESS FOR THE PURIFICATION OF HYALURONIC ACID |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201992340A1 EA201992340A1 (ru) | 2020-03-02 |
| EA039639B1 true EA039639B1 (ru) | 2022-02-21 |
Family
ID=60628042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201992340A EA039639B1 (ru) | 2017-07-18 | 2018-07-17 | Способ экстракции и очистки гиалуроновой кислоты |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11198742B2 (ru) |
| EP (1) | EP3655138B1 (ru) |
| JP (1) | JP7327748B2 (ru) |
| KR (1) | KR102611970B1 (ru) |
| CN (1) | CN110612153B (ru) |
| AU (1) | AU2018302492B2 (ru) |
| CA (1) | CA3062556A1 (ru) |
| EA (1) | EA039639B1 (ru) |
| ES (1) | ES2883110T3 (ru) |
| HU (1) | HUE055703T2 (ru) |
| IT (1) | IT201700081449A1 (ru) |
| MA (1) | MA49628B1 (ru) |
| MD (1) | MD3655138T2 (ru) |
| PL (1) | PL3655138T3 (ru) |
| PT (1) | PT3655138T (ru) |
| WO (1) | WO2019016699A1 (ru) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT201800009444A1 (it) | 2018-10-15 | 2020-04-15 | Fidia Farm Spa | Coniugati tra acido ialuronico e amminobisfosfonati e loro impiego terapeutico |
| EP3978103A4 (en) * | 2019-05-31 | 2022-07-20 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | RAW MATERIAL LIQUID CONCENTRATION SYSTEM |
| IT201900019762A1 (it) | 2019-10-24 | 2021-04-24 | Fidia Farm Spa | Composizione farmaceutica per uso nel trattamento della cistite di varia eziologia |
| IT202000005692A1 (it) | 2020-03-17 | 2021-09-17 | Fidia Farm Spa | Bio-inchiostro per stampa 3D, relativo coniugato e processo di preparazione di un intermedio costituito da un linker fotoreattivo |
| EP3895720A1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-10-20 | Euromed, S.A. | Method for obtaining a botanical extract |
| IT202000014017A1 (it) | 2020-06-11 | 2021-12-11 | Fidia Farm Spa | Nuovi derivati ottenuti da acido ialuronico e carnosina |
| IT202000032243A1 (it) | 2020-12-23 | 2022-06-23 | Fidia Farm Spa | Nuovi agenti antivirali |
| IT202100032111A1 (it) | 2021-12-22 | 2023-06-22 | Fidia Farm Spa | Nuovi sostituti biocompatibili dell’umor vitreo |
| TR2021022266A2 (tr) * | 2021-12-31 | 2022-01-21 | Irfan Turhan | Fermentasyon yoluyla üreti̇len hyaluroni̇k asi̇t?i̇n fermentasyon ortamindan çevri̇mi̇çi̇ geri̇ kazanimi i̇le üreti̇m veri̇mi̇ni̇n artirilmasi |
| KR20230166581A (ko) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | 엘지전자 주식회사 | 냉매회수기 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008035372A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-03-27 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Efficient process for purification of high molecular weight hyaluronic acid |
| WO2008062998A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-29 | Lg Life Sciences Ltd. | Method for purifying hyaluronic acid |
| WO2011114475A1 (ja) * | 2010-03-17 | 2011-09-22 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法 |
| WO2014005822A1 (en) * | 2012-07-05 | 2014-01-09 | Altergon Italia S.R.L. | Production of highly purified sodium hyaluronate (hana) with controlled molecular weight |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1263393B (it) * | 1993-07-30 | 1996-08-05 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Processo per la preparazione e purificazione di acido ialuronico ad alto peso molecolare |
| JPH0823992A (ja) * | 1994-07-13 | 1996-01-30 | Nissei Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸の製造方法 |
| US9493755B2 (en) * | 2012-02-21 | 2016-11-15 | Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd. | Bacillus, hyaluronidase, and uses thereof |
| CN102690847A (zh) * | 2012-04-13 | 2012-09-26 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | 酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用 |
| ES2742704T3 (es) | 2014-06-25 | 2020-02-17 | Emd Millipore Corp | Elementos, módulos y sistemas de filtro compactos, enrollados en espiral |
-
2017
- 2017-07-18 IT IT102017000081449A patent/IT201700081449A1/it unknown
-
2018
- 2018-07-17 JP JP2019563880A patent/JP7327748B2/ja active Active
- 2018-07-17 PT PT187491576T patent/PT3655138T/pt unknown
- 2018-07-17 WO PCT/IB2018/055291 patent/WO2019016699A1/en unknown
- 2018-07-17 EP EP18749157.6A patent/EP3655138B1/en active Active
- 2018-07-17 MD MDE20200555T patent/MD3655138T2/ro unknown
- 2018-07-17 PL PL18749157T patent/PL3655138T3/pl unknown
- 2018-07-17 ES ES18749157T patent/ES2883110T3/es active Active
- 2018-07-17 MA MA49628A patent/MA49628B1/fr unknown
- 2018-07-17 CN CN201880030814.6A patent/CN110612153B/zh active Active
- 2018-07-17 US US16/037,973 patent/US11198742B2/en active Active
- 2018-07-17 KR KR1020197033045A patent/KR102611970B1/ko active IP Right Grant
- 2018-07-17 EA EA201992340A patent/EA039639B1/ru unknown
- 2018-07-17 CA CA3062556A patent/CA3062556A1/en active Pending
- 2018-07-17 AU AU2018302492A patent/AU2018302492B2/en active Active
- 2018-07-17 HU HUE18749157A patent/HUE055703T2/hu unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008035372A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-03-27 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Efficient process for purification of high molecular weight hyaluronic acid |
| WO2008062998A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-29 | Lg Life Sciences Ltd. | Method for purifying hyaluronic acid |
| WO2011114475A1 (ja) * | 2010-03-17 | 2011-09-22 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法 |
| WO2014005822A1 (en) * | 2012-07-05 | 2014-01-09 | Altergon Italia S.R.L. | Production of highly purified sodium hyaluronate (hana) with controlled molecular weight |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SUNGCHUL CHOI;WONCHEOL CHOI;SEKWEON KIM;SU-YEON LEE;INSUP NOH;CHAN-WHA KIM: "Purification and biocompatibility of fermented hyaluronic acid for its applications to biomaterials", BIOMATERIALS RESEARCH, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 18, no. 1, 13 June 2014 (2014-06-13), London, UK , pages 6, XP021195320, ISSN: 2055-7124, DOI: 10.1186/2055-7124-18-6 * |
| ZHOU, H. ; NI, J. ; HUANG, W. ; ZHANG, J.: "Separation of hyaluronic acid from fermentation broth by tangential flow microfiltration and ultrafiltration", SEPARATION AND PURIFICATION TECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE, AMSTERDAM, NL, vol. 52, no. 1, 1 November 2006 (2006-11-01), NL , pages 29 - 38, XP028035496, ISSN: 1383-5866, DOI: 10.1016/j.seppur.2006.03.011 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2018302492B2 (en) | 2023-04-13 |
| KR20200033223A (ko) | 2020-03-27 |
| KR102611970B1 (ko) | 2023-12-11 |
| MA49628A (fr) | 2021-03-17 |
| CN110612153A (zh) | 2019-12-24 |
| EP3655138B1 (en) | 2021-06-23 |
| MD3655138T2 (ro) | 2021-10-31 |
| IT201700081449A1 (it) | 2019-01-18 |
| JP7327748B2 (ja) | 2023-08-16 |
| MA49628B1 (fr) | 2021-09-30 |
| HUE055703T2 (hu) | 2021-12-28 |
| PT3655138T (pt) | 2021-07-29 |
| CN110612153B (zh) | 2022-07-12 |
| EP3655138A1 (en) | 2020-05-27 |
| PL3655138T3 (pl) | 2021-11-22 |
| CA3062556A1 (en) | 2019-01-24 |
| ES2883110T3 (es) | 2021-12-07 |
| US11198742B2 (en) | 2021-12-14 |
| EA201992340A1 (ru) | 2020-03-02 |
| US20190023813A1 (en) | 2019-01-24 |
| AU2018302492A1 (en) | 2019-11-07 |
| JP2020528000A (ja) | 2020-09-17 |
| WO2019016699A1 (en) | 2019-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA039639B1 (ru) | Способ экстракции и очистки гиалуроновой кислоты | |
| AU2017304290B2 (en) | Process for the preparation and purification of the sodium salt of hyaluronic acid | |
| CN101914169A (zh) | 透明质酸的纯化方法 | |
| US20220112315A1 (en) | Method for Obtaining Low Molecular Weight Heparins by Tangential Flow Filtration | |
| KR101638662B1 (ko) | 히알루론산 및／또는 그의 염의 정제 방법 | |
| CN101089021A (zh) | 从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法 | |
| CN110577608B (zh) | 分离纯化透明质酸的方法 | |
| JP3372638B2 (ja) | ウイルスの通過を阻止する物質からなる濾過助剤およびそれを使用した濾過方法 | |
| KR101627014B1 (ko) | 히알루론산의 정제 방법 | |
| CN112673027A (zh) | 通过切向流过滤获得低分子量肝素的方法 | |
| ITMI20131654A1 (it) | Downstream di purificazione di acido ialuronico da brodi di coltura microbici | |
| JPS6040831B2 (ja) | 微生物培養液の処理方法 | |
| OA20550A (en) | Method for obtaining low molecular weight heparins by tangential flow filtration. | |
| RU2403285C1 (ru) | Способ получения трипсина | |
| CN108949703A (zh) | 一种半纤维小体类似物粗提纯方法 | |
| JP2011195608A (ja) | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法 |