EA030017B1

EA030017B1 - Композиция для наружной обработки ран, способ ее получения, применение переносчика кислорода для наружной обработки ран и способ очистки переносчика кислорода

Info

Publication number: EA030017B1
Application number: EA201490319A
Authority: EA
Inventors: Михаэль Зандер; Харальд Пецшке
Original assignee: Састомед Гмбх
Priority date: 2011-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2018-06-29
Also published as: PL2550973T3; CN108752468B; EP2550973A1; CA2842487C; BR112014001309B1; EP2734223B1; KR20140045498A; CN103781488A; BR112014001309A2; AU2012289237A1; US10471175B2; WO2013013799A1; IL230160A; MY165035A; ES2432075T3; US11116868B2; PE20141577A1; US20160228602A1; NZ619177A; JP5995970B2

Abstract

Изобретение относится к композиции для наружной обработки ран распылением в форме мелко распыляемого аэрозоля, где композиция содержит: (а) переносчик кислорода, выбранный из гемоглобина и миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода участок связывания кислорода загружен не-Oлигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, и (b) по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролита(ов), консерванта(ов), стабилизатора(ов), антифлоккулянта(ов), антикоагулянта(ов), буферирующего(их) pH агента(ов), растворителя(ей), антиоксиданта(ов), образующего(их) пленку агента(ов) и поперечно сшивающего(их) агента(ов), где композиция является стерильной. Изобретение также относится к способу получения данной композиции, применению переносчика кислорода для наружной обработки ран и способу очистки переносчика кислорода. Таким образом, изобретение предоставляет продукт для наружного лечения ран, который ускоряет заживление ран, легок в обращении и пригоден для хранения.

Description

Изобретение относится к композиции для наружной обработки ран распылением в форме мелко распыляемого аэрозоля, где композиция содержит: (а) переносчик кислорода, выбранный из гемоглобина и миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода участок связывания кислорода загружен не-О₂ лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, и (Ь) по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролита(ов), консерванта(ов), стабилизатора(ов), антифлоккулянта(ов), антикоагулянта(ов), буферирующего(их) рН агента(ов), растворителя(ей), антиоксиданта(ов), образующего(их) пленку агента(ов) и поперечно сшивающего(их) агента(ов), где композиция является стерильной. Изобретение также относится к способу получения данной композиции, применению переносчика кислорода для наружной обработки ран и способу очистки переносчика кислорода. Таким образом, изобретение предоставляет продукт для наружного лечения ран, который ускоряет заживление ран, легок в обращении и пригоден для хранения.

030017

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей гемоглобин или миоглобин, где по меньшей мере в 40% указанного гемоглобина или миоглобина участок связывания кислорода загружен не-О₂ лигандом, и по меньшей мере один дополнительный ингредиент, к способу получения указанной композиции и к применению гемоглобина или миоглобина, загруженного некислородным лигандом, для наружной обработки ран.

Применяются различные способы лечения ран, в зависимости от их состояния. Сначала рана, которая еще является открытой, предпочтительно должна быть дезинфицирована и посредством этого защищена от неблагоприятных внешних влияний. Это может быть осуществлено посредством пригодных дезинфицирующих растворов или повязок с нанесенными на них аэрозольными средствами или также нанесением раствора йода.

Действительное заживление раны должно затем происходить изнутри. Это значит, что сохранившиеся кровеносные сосуды должны снабжать разрушенную ткань достаточным количеством субстратов с тем, чтобы мог запуститься механизм репарации ткани.

Раны могут быть вызваны различными факторами, такими как, например, повреждения, оперативные вмешательства или травматические воздействия.

С другой стороны, известно, что образование ран, в частности, также хронических ран, может быть также вызвано заболеваниями, при которых происходит дегенерация и/или сокращение крупных и/или мелких кровеносных сосудов. Это может происходить, например, у пожилых пациентов, при длительном постельном режиме (пролежни) или при сахарном диабете, который может привести к дегенерации и артериосклерозу (Р. Сатрейет, А. Ргаисо, АНак бет КарШатоккор1е [АИак о£ СарШатоксору], 1983, АЬЬой, Мах-Р1аиск-1и8к 2, Э-^екЬайеи) крупных и мелких кровеносных сосудов (макроангиопатии и микроангиопатии артерий). Было также показано, что в зоне раны присутствует кислородная недостаточность (гипоксия). Критической величиной считается 40 мм рт. ст. (С. Ό. Ми11ет е1 а1., Найтаии \Уипй |\Уоипй| Рогит 1 (1999), 17-25).

Кровь течет к тканям, включая кожу, через артерии и снабжает клетки субстратами, требуемыми для жизни. Любая дегенерация кровеносных сосудов приводит к недостаточному снабжению субстратами клеток, приводящему к их гибели. Субстраты должны проходить последний, кажущийся незначительным зазор размером приблизительно 20 мкм от самых мелких кровеносных сосудов (капилляров) до клеток путем диффузии; в связи с этим кислород играет особую роль, потому что организму трудно манипулировать этим субстратом.

Существуют три основные релевантные проблемы:

(1) Кислород действительно абсолютно незаменим для жизни (если мозг человека не получает кислород, то он умирает уже приблизительно через пять минут), но в то же самое время кислород является высокотоксичным (новорожденный, который получает лечение в виде искусственной вентиляции легких чистым кислородом, умрет уже через несколько дней).

(2) Кислород обладает очень низкой растворимостью в водной среде. В соответствии с первым законом Фика это приводит к низкой скорости диффузии кислорода. Кроме того, существует фундаментальный закон диффузии, а именно закон Смолучовского и Эйнштейна, который указывает, что скорость диффузии (кислорода) уменьшается с увеличением расстояния диффузии. Теперь константа диффузии кислорода настолько низка, что скорость диффузии при расстоянии диффузии уже 20 мкм составляет только 5% первоначальной величины. Водный слой толщиной, например, 50 мкм создает почти полную кислородную изоляцию клеток. Кислород транспортируется в организме с кровотоком по каналам от легких до кончиков пальцев стоп в связанном гемоглобином состоянии, и только таким образом способен преодолевать длинные расстояния подходящим для организма образом.

(3) Для кислорода, например, в отличие от глюкозы, в организме нет области хранения, и поэтому данный субстрат должен быть доступен для клеток постоянно и быстро, в достаточном количестве; кислород представляет собой субстрат, непосредственно необходимый для жизни.

В интактном организме эти проблемы решаются путем использования нескольких механизмов. Токсические эффекты кислорода устраняются тем, что последний связывается во время транспорта с гемоглобином и, таким образом, остается безвредным. В то же самое время свободный кислород находится в растворенном виде и благодаря этому дополнительно утрачивает свой повреждающий окислительный потенциал. Тем не менее, он мгновенно доступен в достаточном количестве, потому что связывание с гемоглобином является обратимым. Проблема низкого диффузионного диапазона решается тем, что в организме развита сеть очень мелко разветвленных кровеносных сосудов (капиллярная сеть), которая обеспечивает то, что в среднем, каждая клетка находится на расстоянии не более чем 25 мкм от капилляра; таким образом, канал диффузии кислорода в организме остается ниже критической длины 50 мкм. Кроме того, клетка может за счет диффузии снабжаться кислородом с нескольких сторон; это представляет механизм безопасности. В организме достигается немедленная доступность кислорода в соответствии с потребностью (у кислорода нет возможности быть доступным в избытке, иначе это будет оказывать вредное влияние) посредством сосудистой регуляции потока в кровеносных сосудах, который регулирует перфузию и, таким образом, оптимизирует снабжение кислородом.

Если имеется открытая поверхность раны, то снабжение клеток кислородом прерывается. Снабже- 1 030017

ние кислородом из наружного воздуха является недостаточным, поскольку на (тканевом) слое клеток лежит пленка водной жидкости, и, как выясняется, эта пленка образует барьер для диффузии кислорода. Свежие раны в нормальной ткани могут заживать за несколько дней, если снабжение кислородом из нижележащих структур, другими словами, изнутри, является достаточным. Однако в экспериментах на животных было показано, что даже свежие раны заживают лучше, если увеличивается концентрация кислорода в окружающем воздухе (М. Р. Ра1 е! а1., Зигд. Суп. ОЪйеГ 135 (1972), 756-758). Известно, что более старые, в частности, хронические раны заживают очень медленно, если вообще заживают, вследствие их кислородной недостаточности.

Для лучшего заживления хронических ран использовали так называемую гипербарическую оксигенотерапию (НВО). При этом лечении пациентов помещают в находящиеся под избыточным давлением камеры, где их подвергают воздействию чистого кислорода под избыточным давлением примерно 3 бар в течение определенного периода времени (С. Ό. Ми11ег е! а1., Иайтапп Аипб Рогит 1 (1999), 17-25). Заживление ран действительно можно увеличить этим способом. Однако эффект уменьшается по мере повышения числа лечебных воздействий.

В патенте США 2527210 описан раствор гемоглобина, который, как утверждают, можно использовать для лечения ран, как внутривенно, так и местно, например, аэрозольным распылением. В данном описании гемоглобин получают из свежих эритроцитов, которые подвергают шоку замораживания после центрифугирования и отсасывания плазменной фракции. Это приводит к лизису клеток и высвобождается гемоглобин. В продукте также присутствуют разрушенные клеточные стенки. Этот состав представляет собой концентрированный клеточный детрит (клеточные фрагменты). Таким образом, предполагается эффект антисептического покрытия, такой как иначе достигается йодным раствором, после добавления 5% сульфида натрия. Другими словами, рана просто закрывается. Транспорт кислорода в этом случае не приводится.

В АО 97/15313 описано лечебное применение гемоглобина для улучшения заживления ран. С этой целью пациентам внутривенно вводят лишенный стромы и пирогенов гемоглобин, в частности, после операций и травматических повреждений, для повышения артериального давления. В частности, с этой целью используют гемоглобин, поперечно-сшитый с диаспирином.

В АО 2003/077941 речь идет о лечении открытых ран раствором гемоглобина, содержащим изолированный и необязательно поперечно-сшитый гемоглобин. Растворы были свежеприготовленными с гемоглобином из свиной крови, и их наносили на хронические раны.

Во время получения и хранения переносчиков кислорода на основе гемоглобина или миоглобина, они могут частично или полностью утратить свою функциональную способность. Для предотвращения этого желательно стабилизировать переносчики кислорода, чтобы они оставались применимыми и способными транспортировать кислород.

Как правило, существуют различные подходы к получению искусственных переносчиков кислорода; один из них состоит в получении подходящих растворов нативных или химически модифицированных гемоглобинов (см. "Пкиек &от УЬ 1п1егиайопа1 Зутрокшт оп В1ооб ЗиЪ8Й1и1е8, 8ап Игедо, СаШ/, ИЗЛ, МагеЬ 1993", Лгййе1а1 СеШ, В1ооб ЗиЪНПШеь апб 1ттоЫП/а0оп Вю1ееЬпо1оду 22 (1994), уо1. 2-4). Одна проблема при манипулировании такими фармацевтическими препаратами в качестве искусственных переносчиков кислорода заключается в их увеличивающейся инактивации спонтанным окислением в метгемоглобин, который больше не способен транспортировать кислород. Это обычно происходит во время производства и последующего хранения.

Описано несколько подходов для решения этой проблемы. Предпринимаются попытки или минимизировать степень окисления гемоглобина, или снова восстановить окисленный гемоглобин.

Одной возможностью предотвращения спонтанного окисления является деоксигенация гемоглобина (т.е. полное удаление кислорода из препарата), поскольку деоксигемоглобин гораздо медленнее окисляется в метгемоглобин, чем оксигемоглобин.

Кроме того, можно минимизировать количество окисления хранением и/или получением при насколько возможно низкой температуре (для водных растворов, примерно при 4°С).

Кроме того, скорость окисления гемоглобина зависит от концентрации иона водорода, т.е. рН. Например, для нативного человеческого гемоглобина существует минимум в интервале рН от 7,5 до 9,5.

Добавление определенных спиртов также может уменьшить окисление гемоглобина. Некоторые из них работают даже при низкой концентрации. Одной проблемой является токсичность этих спиртов.

Ионы определенных металлов (Сть/ Ре₃+ и т.д.) катализируют спонтанное окисление гемоглобина. Им может быть придана неэффективность путем образования комплексов с ΕΌΤΆ (этилендиаминтетрауксусной кислотой), хотя сама ΕΌΤΆ содействует спонтанному окислению гемоглобина.

Защита искусственных переносчиков кислорода против окисления может быть дополнительно достигнута добавлением восстанавливающих веществ. В определенных условиях они даже приводят к реактивации окисленного гемоглобина.

В Европейском патенте ЕР 0857733 указано, что гемоглобин может быть стабилизирован связыванием лиганда, в частности монооксида углерода, с участком связывания кислорода. Было обнаружено, что такой карбонилгемоглобин можно вводить в организм без делигандирования, и он пригоден в каче- 2 030017

стве переносчика кислорода внутри потока крови.

Задачей настоящего изобретения является получение продукта для наружного лечения ран, который ускоряет заживление ран, легок в обращении и пригоден для хранения.

Эта задача решается согласно изобретению композицией для наружной обработки ран распылением в форме мелко распыляемого аэрозоля, где композиция содержит:

(a) переносчик кислорода, выбранный из гемоглобина и миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода участок связывания кислорода загружен не-О₂ лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, и

(b) по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролита(ов), консерванта(ов), стабилизатора(ов), антифлоккулянта(ов), антикоагулянта(ов), буферирующего(их) рН агента(ов), растворителя(ей), антиоксиданта(ов), образующего(их) пленку агента(ов) и поперечно сшивающего(их) агента(ов), где композиция является стерильной.

Предпочтительно композиция представляет собой водный или органический раствор.

В соответствии с изобретением по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, в частности, предпочтительно по меньшей мере 90% переносчика кислорода находится в загруженной указанным лигандом форме.

Указанный переносчик кислорода может быть выбран из природно встречающегося гемоглобина или миоглобина человеческого или животного происхождения, или представляет собой модифицированный гемоглобин или миоглобин человеческого или животного происхождения, где модификация выбрана из внутримолекулярной поперечной сшивки, полимеризации (межмолекулярной поперечной сшивки), пэгилирования (ковалентного связывания с полиалкиленоксидами), модификации химически реакционноспособными эффекторами, выбранными из пиридоксаль-5'-фосфата и 2-нор-2-формилпиридоксаль-5'фосфата, и/или модификации химически нереакционноспособными эффекторами кислородной связи, выбранными из 2,3-бисфосфоглицерата, инозитгексафосфата, инозитгексасульфата или меллитовой кислоты, или их комбинации.

Раны, подлежащие лечению, могут представлять собой хронические раны, операционные раны, раны вследствие повреждений, раны после травмы, открытые раны, раны с неудовлетворительным заживлением или гипоксические раны, раны, вызванные дегенеративными изменениями или стенозом артериальных кровеносных сосудов, раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности, или связанные с пролежнями язвенные раны, или ожоговые раны, вызванные термическим воздействием, химическими веществами или обморожением, или кипящей жидкостью, или паром.

Предпочтительно композиция по изобретению применяется для наружной обработки ран.

Далее изобретение относится к способу получения указанной композиции, где: (ί) переносчик кислорода загружают защитным не-О₂ лигандом во время или после выделения из его природной среды, (ΐΐ) добавляют по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролита(ов), консерванта(ов), стабилизатора(ов), антифлоккулянта(ов), антикоагулянта(ов), буферирующего(их) рН агента(ов), растворителя(ей), антиоксиданта(ов), образующего(их) пленку агента(ов) и поперечно сшивающего(их) агента(ов), (ίίί) композицию стерилизуют и (ίν) композицию упаковывают в стерильный контейнер, позволяющий осуществлять распыление композиции в форме мелко распыленного аэрозоля.

Дополнительно композиция может быть упакована в аэрозольный баллончик.

Предпочтительно, композицию стерилизуют на стадии (ίίί) нагреванием, фильтрацией, центрифугированием, добавлением консервантов, применением пара, применением газа или применением УФоблучения, или комбинацией по меньшей мере двух из них.

Изобретение также включает применение переносчика кислорода, выбранного из гемоглобина или миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода связывающий кислород участок загружен не-О2 лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, для получения средства или композиции для наружной обработки ран.

Раны, подлежащие лечению в соответствии с указанным применением, представляют собой хронические раны, операционные раны, раны вследствие повреждений, раны после травмы, открытые раны, раны с неудовлетворительным заживлением или гипоксические раны, раны, вызванные дегенеративными изменениями или стенозом артериальных кровеносных сосудов, раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности, или связанные с пролежнями язвенные раны, или ожоговые раны, вызванные термическим воздействием, химическими веществами или обморожением, или кипящей жидкостью, или паром.

Кроме того, изобретение включает применение переносчика кислорода, выбранного из гемоглобина и миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного гемоглобина или миоглобина связывающий кислород участок загружен не-О2 лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, в способе наружной обработки ран.

Дополнительно, изобретение относится к способу очистки переносчика кислорода с получением переносчика, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода участок связывания кислорода загружен не-О2 лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, где переносчик

- 3 030017

выбран из гемоглобина и миоглобина из цельной крови, и способ включает стадии:

a) отделение плазмы цельной крови,

b) лизис эритроцитов,

c) загрузка переносчика кислорода не-О₂ лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота,

ά) нагревание суспензии или раствора, содержащих переносчик кислорода, до температуры в диапазоне от 40 до 85°С,

е) отделение переносчика кислорода от любых нежелательных компонентов крови,

где стадия (е) включает по меньшей мере одну стадию фильтрации, с получением гемоглобина или

миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного гемоглобина или миоглобина связывающий кислород участок загружен не-02 лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота.

В одном из вариантов осуществления изобретения фильтрация на стадии (е) включает применение стерильного фильтра и/или вирусного фильтра.

Согласно изобретению предпочтительно используют природный (нативный) переносчик кислорода, в частности гемоглобин или миоглобин или их модифицированное производное. Гемоглобин или миоглобина человеческого или животного происхождения, в частности, лошадиного, бычьего или предпочтительно свиного происхождения, в частности, пригодны для настоящего изобретения. Человеческий или свиной гемоглобин, который является природным или модифицированным, как описано ниже, является, в частности, предпочтительным в качестве переносчика кислорода. Переносчик кислорода может быть свежевыделенным из крови человека или животных или может быть получен искусственно.

Можно также использовать смеси природных и модифицированных переносчиков кислорода, такие как, например, с соотношением от 20:1 до 1:20 в пересчете на массу. Кроме того, смеси гемоглобина и миоглобина или их модифицированные производные можно использовать в указанных выше соотношениях от 20:1 до 1:20.

В дополнительном варианте осуществления переносчик кислорода может быть модифицирован. Модификация может представлять собой внутримолекулярную поперечную сшивку, полимеризацию (межмолекулярную поперечную сшивку), пэгилирование (ковалентное связывание с полиалкиленоксидами), модификацию химически реакционноспособными эффекторами, такими как пиридоксаль-5'фосфат или 2-нор-2-формилпиридоксаль-5'-фосфат, или также с химически нереакционноспособными эффекторами кислородной связи, такими как 2,3-бисфосфоглицерат, инозитгексафосфат, инозитгексасульфат или меллитовая кислота, или их комбинация. Такие модификации известны и описаны, например, в ΌΕ-Ά 10031744, ΌΕ-Ά 10031742 и ΌΕ-Ά 10031740. Поперечная сшивка переносчиков кислорода также описана в ΌΕ 1970137, ЕР 971000790, ΌΕ 4418937, ΌΕ 3841105, ΌΕ 3714351, ΌΕ 3576651.

Примерами модифицированных переносчиков кислорода являются гемоглобины, имеющие молекулярную массу от 65000 до 15000000, такие как внутримолекулярно поперечно-сшитые молекулы в соответствии с \УО 97/15313, в частности полимерные продукты, а также межмолекулярно поперечносшитые продукты, имеющие среднюю молекулярную массу от 80000 до 10000000 г/моль, в частности, от 100000 до 5000000, или аналогично полученные миоглобины, имеющие молекулярную массу от 16000 до 5000000, в частности, от 100000 до 3000000, предпочтительно 1000000 г/моль. Могут использоваться такие переносчики кислорода, которые полимеризированы, например, с использованием поперечносшивающих агентов, известных для межмолекулярной модификации, таких как бифункциональные поперечно-сшивающие агенты, подобно диэпоксибутадиену, дивинилсульфону, диизоцианату, в частности гексаметилендиизиоцианату, циклогексилдиизиоцианату и 2,5-бисизоцианатбензолсульфоновой кислоте, сложному ди-Ы-гидроксисукцинимидиловому эфиру, сложному диимидоэфиру или диальдегиду, в частности, глиоксалю, гликольальдегиду, который реагирует аналогичным образом, или глутаральдегиду.

Кроме того, можно использовать продукты, которые полимеризированы таким образом и пэгилированы полиэтиленгликолем, или подходящие его производные. Они включают, например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид или сополимер этиленоксида и пропиленоксида, или их сложный эфир, простой эфир или сложный эфирамид. Может быть пригодным, если ковалентно связанный полиалкиленоксид имеет молярную массу от 200 до 5000 г/моль.

Для ковалентного связывания полиалкиленоксидов могут быть пригодны такие производные полиалкиленоксида, которые содержат связывающий агент, уже ковалентно связанный с функциональной группой, благодаря чему обеспечивается возможность непосредственного химического взаимодействия с амино-, спиртовыми или сульфгидрильными группами гемоглобинов, причем образование ковалентных связей полиалкиленоксидов может быть пригодно, например, для полиалкиленоксидов с реакционноспособным сложным Ν-гидроксисукцинимидиловым эфиром, простым эпокси(глицидиловым эфиром), альдегидом, изоцианатом, винилсульфоном, йодацетамидом, имидазолилформиатом, тресилатными группами и другими. Многие такие монофункционально активированные полиэтиленгликоли коммерчески доступны.

Если используют модифицированные переносчики кислорода, то предпочтительны модифицированные поперечно-сшитые (внутримолекулярные или межмолекулярные) или поперечно-сшитые и пэгилированные продукты гемоглобина, имеющие среднюю молекулярную массу от 250000 до 750000

- 4 030017

г/моль, или продукты миоглобина, имеющие среднюю молекулярную массу от 50000 до 750000 г/моль.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления для получения композиции по изобретению используют свежевыделенный гемоглобин или миоглобин человеческого или животного происхождения, в частности, свиного происхождения.

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере 40% участков связывания кислорода переносчика кислорода загружены не-О₂ лигандом. Предпочтительно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, в частности предпочтительно по меньшей мере 90 или 95% гемоглобина или миоглобина представлено в загруженной лигандом форме. Эта загрузка может быть уже применена во время выделения носителя или после его дополнительной очистки, однако, особенно предпочтительно выделение переносчика кислорода в его защищенной форме, что означает обеспечение лиганда или контакта его с переносчиком кислорода во время выделения или очистки.

Не-О₂ лиганд предпочтительно представляет собой монооксид углерода (СО) или моноксид азота (N0), или их смесь. Оба лиганда имеют высокую аффинность в отношении участка(ов) связывания О₂гемоглобина/миоглобина и случат в качестве защитного агента против окисления центрального иона Ре³⁺тема.

Загруженные переносчики кислорода предпочтительно растворены в водной или органической среде, где предпочтителен водный раствор в количестве от 0,1 до 35 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 20 мас.%, более предпочтительно от 0,1 до 15 мас.%, для готовности к применению.

Композиция согласно настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одну дополнительную добавку, предпочтительно, выбранную из группы, включающей электролиты, стабилизаторы, антифлоккулянты, консерванты, буферирующие рН агенты, растворители, антиоксиданты и образующие пленку агенты, более предпочтительно, выбранную из электролитов, стабилизаторов, антифлоккулянтов, консервантов, буферирующих рН агентов. Наиболее предпочтительная композиция представлена в форме раствора и содержит по меньшей один электролит и необязательно стабилизатор.

Раствор может содержать физиологически совместимые электролиты, такие как соли, в подходящих или желаемых количествах. Электролиты могут присутствовать в количествах от 0,1 до 30 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 10%, но предпочтительно присутствуют соответственно в физиологической концентрации. Предпочтительно композиция содержит соль в указанных выше количествах, подобно, например, ΝαΟ, КС1, ΝΗ₄Ο1, СаСО₃, №-ьСО₃. К₂СО₃, Мд§О₄, №ЦО., СаС1₂, МдС1₂, цитрату натрия, лактату натрия или смеси указанных или подобных солей, но без ограничения этими примерами. Наиболее предпочтительной солью является №С1, в частности, в концентрации 0,9% (изотонический раствор).

Согласно изобретению, в частности, предпочтительно, чтобы композиция содержала соединение, действующее в качестве стабилизатора и/или антифлоккулянта для белков, в частности, для гемоглобина/миоглобина, такое как Ν-ацетилцистеин, цистеин, Ν-ацетилметионин, метионин, нехаотропные соли, полиолы, подобное сахарам, предпочтительно, дисахариды, и аминокислоты, предпочтительно, каждые в количестве от 0,001 до 20 мас.%.

Полиолы, которые могут быть использованы, представляют собой предпочтительно полиолы с низкой молекулярной массой, хотя могут использоваться полимерные производные. Такие полиолы включают этиленгликоль, глицерин, эритрит и маннит. Циклические полиолы, которые могут быть использованы, включают одно или более алициклических колец и могут иметь по меньшей мере одну боковую цепь. Предпочтительные полиолы включают дисахариды и сахарные спирты, например, лактит, сорбит и инозит. Предпочтительны соединения, имеющие 2-10 гидроксильных групп. Количество полиола может находиться в предпочтительном диапазоне от 0,001 до 20%, более предпочтительно от 1 до 15%, наиболее предпочтительно от 2 до 10% мас./об.

Дополнительно добавка белкового стабилизатора может быть выбрана из трис(гидроксиметил)метилового соединения формулы 1: (НОСН₂)₃С-К (1), где К представляет собой С₁С₄алкил, замещенный Ц-С₄алкил, ΝΗ₂, ΝΗ^^^Η)^ С1-С₄гидроксиалкил, С1-С₄алкилкарбоксилат, ΝΚ?Κ² (где К и К² могут независимо представлять собой Н, С₃-С₄алкил, С₃-С₄алкилсульфонат, С₃С₄гидроксиалкилсульфонат). Примеры предпочтительных соединений формулы (1) включают: трис(гидроксиметил)этан; 1,1',1''-трис(гидроксиметил)пропан; трис(гидроксиметил)аминометан или их соли, например, хлорид, малеат, фосфат, сукцинат; 1,3 бис[трис(гидроксиметил)метиламино]пропан; бис(2-гидроксиэтил)аминотрис(гидроксиметил)метан; №[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфонат; ^[трис(гидроксиметил)метил]-3-аминопропансульфонат; ^[трис(гидроксиметил)метил]-3амино-2-гидроксипропансульфонат; ^[трис(гидроксиметил)метил]глицин. Указанные соединения также могут добавляться в предпочтительном диапазоне от 0,001 до 20%, более предпочтительно от 1 до 15%, наиболее предпочтительно от 2 до 10% мас./об.

Дополнительный белковый стабилизатор может быть выбран из полиэлектролита. Полиэлектролит может представлять собой катионный или анионный полиэлектролит. Также могут быть использованы амфотерные полиэлектролиты. Катионный полиэлектролит представляет собой предпочтительно полимер с катионными группами, распределенными вдоль молекулярной цепи.

Катионные группы, которые представляют собой предпочтительно функциональные группы, про- 5 030017

исходящие из четвертичного аммония, могут быть расположены в боковых группах, свисающих с цепи, или могут быть включены в нее. Примеры катионных полиэлектролитов включают: сополимеры винилпирролидона и четвертичного метилметакрилата, например, серии ОаГциа! (755Ν, 734, Н8-100), полученные от компании 18Р; замещенные полиакриламиды; полиэтиленимин, полипропиленимин и замещенные производные; гомополимеры полиаминов (Оо1сНст СЬ118); сополимеры полиаминов (например, конденсаты эпихлоргидрина и моно- или диметиламина); полидиаллилдиметиламмонийхлорид (ро1уПАОМАС); замещенные декстраны; модифицированный кизельгур (замещенный гидроксипропиламмонийхлоридом); замещенные белки (например, четвертичные группы, замещенные на соевом белке, и гидролизованный коллаген); полиаминокислоты (например, полилизин); полиаминосоединения с низкой молекулярной массой (например, спермин и спермидин). Могут использоваться природные или искусственные полимеры.

Могут быть использованы катионные полиэлектролиты с молекулярной массой от 150 до 5000000, предпочтительно, от 5000 до 500000, более предпочтительно, от 5000 до 100000. Предпочтительно количество от 0,01 до 10%, более предпочтительно от 0,1 до 2%, в частности от 0,05 до 5% мас./об.

Анионный полиэлектролит представляет собой предпочтительно полимер с анионными группами, распределенными вдоль молекулярной цепи. Анионные группы, которые могут включать карбоксилат, сульфонат, сульфат или другие отрицательно заряженные ионизируемые группы, могут быть расположены на группах, свисающих с цепи, или непосредственно связанных с основной цепью полимера. Могут использоваться природные или искусственные полимеры.

Примеры анионных полиэлектролитов включают: СаШгс/ (85спс5. АЛ-кепек); альгиновую кислоту и соли; карбоксиметилцеллюлозу и соли; замещенные полиакриламиды (например, замещенные группами карбоновой кислоты); полиакриловые кислоты и соли; полистиролсульфоновые кислоты и соли; декстрансульфаты; замещенные сахариды, например, октосульфат сахарозы; гепарин. Могут использоваться анионные полиэлектролиты с молекулярной массой от 150 до 500 0000, предпочтительно, от 5000 до 500000, более предпочтительно, от 5000 до 100000. Предпочтительно количество от 0,01 до 10%, в частности от 0,05 до 5%, более конкретно от 0,1 до 2% мас./об.

Особенно предпочтительным стабилизатором является Ν-ацетилцистеин в количестве от 0 до 10%, предпочтительно 0,01-5%.

Дополнительно, композиция может содержать любой консервант, такой как, например, феноксиэтанол, изотиазолин, сорбиновая кислота или другой пригодный консервант, известный специалистам в данной области техники.

Композиция может дополнительно предпочтительно содержать любой буферирующий агент. Могут быть использованы любые из общеизвестных буферирующих агентов, таких как Трис/НС1, К₂НРО₄/КН₂РО₄, №₂НРО₄/ЛаН₂РО₄, МОР8 (З-Щ-морфолино)пропансульфоновая кислота), НЕРЕ8 (4-2гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), ТАР8 (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота), бицин ЩП-бис(2-гидроксиэтил)глицин), трицин (Νтрис(гидроксиметил)метилглицин), ТЕ8 (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), Р1РЕ8 (пиперазин-Л,№бис(2-этансульфоновая кислота)), 88С (солевой цитрат натрия), МЕ8 (2-(Νморфолино)этансульфоновая кислота), но, не ограничиваясь ими.

Подходящими растворителями в композиции согласно изобретению предпочтительно являются вода или водные растворы, органические растворители, такие как спирт, предпочтительно, этанол или полиэтиленгликоль (РЕО). Также могут использоваться смеси указанных растворителей. Дополнительные природные масла могут быть использованы в качестве растворителя для некоторых из ингредиентов, и композиция может быть представлена в виде эмульсии. Особенно предпочтительным растворителем является вода или водный растворитель.

Антиоксиданты, полезные для композиции по настоящему изобретению, могут представлять собой, например, витамин С, витамин Е, флавоноиды, каротиноиды или их соли или производные.

Предпочтительные, образующие пленку агенты представляют собой такие агенты, которые обычно используются в косметологии, такие как, например, акриламид/натрий, акрилатный сополимер, сополимер акрилатов/акриламида, сложный бутиловый эфир сополимера РУМ/МА, карбоксиметилхитин, хитозан, гидроксипропилцеллюлоза, поликватерний-36, РУР, сополимер РУР/УА, сополимер УА/кротонатов или сополимер винилкапролактама/РСР/диметиламиноктилметакрилата.

Если не указано иное, то все указанные выше добавки могут присутствовать в количестве от 0 до 20, предпочтительно, от 0,001, 0,01, 0,05 или 0,1-10, более предпочтительно, от 0,5 до 5% (мас./об.).

Если желательно, то могут присутствовать дополнительные добавки, в частности, в количество от 0 до 20, предпочтительно, от 0,1 до 20, предпочтительно от 0,2 до 15, в частности, от 0,5 до 10 мас.%. Предпочтительные добавки представляют собой питательные вещества для клеток. Они могут быть выбраны из глюкозы, например, в количествах от 0,1 до 5 мас.%, инсулина в количествах до 25 МЕ/мл, природных аминокислот, в частности, цистеина, например, от 0,1 до 5 мас.%, или тканевые факторы, такие как интерлейкины в физиологических количествах вплоть до 10-кратных.

Предпочтительно, композиция представляет водный раствор, содержащий:

(а) переносчик кислорода, предпочтительно гемоглобин или миоглобин, где по меньшей мере в 40%

- 6 030017

указанного переносчика кислорода связывающий кислород участок загружены не-О₂ лигандом, и

(Ь) по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролитов, консервантов, стабилизаторов, антифлоккулянтов, антикоагулянтов, буферирующих рН агентов, антиоксидантов, органического растворителя, образующих пленку агентов и поперечно-сшивающих агентов.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит переносчик кислорода, который выделен из цельной крови человека или животного, предпочтительно свиней.

Соответственно дополнительный аспект изобретения относится к способу очистки из цельной крови переносчика кислорода, применимого для композиции по настоящему изобретению.

Для получения композиции в предпочтительном варианте осуществления переносчик кислорода выделяют из цельной крови человека или животного и дополнительно очищают для, по существу, полного удаления плазмы и компонентов клеточных мембран.

Под термином "по существу полного удаления" означает, что рассматриваемое соединение или композиция не содержит более чем 20%, предпочтительно не более чем 10%, еще более предпочтительно не более чем 5% и, в частности, предпочтительно не более чем 2% или менее чем 1% указанных нежелательных соединений.

Очистка может включать любые пригодные средства или стадии способа, такие как, например, селективный лизис или осаждение, центрифугирование, ультрацентрифугирование, фракционированное центрифугирование, способы хроматографии, такие как анионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, аффинная или адсорбционная хроматография, гельфильтрующая или молекулярноситовая хроматография, или диализ, но без ограничения этими примерами, пока применяемые способы насколько возможно мало денатурируют переносчик кислорода.

Предпочтительно во время выделения и очистки переносчик кислорода остается по существу в растворе.

Когда переносчик кислорода выделяют из цельной крови, то предпочтительно, чтобы или клетки, содержащие переносчик кислорода, отделялись от других компонентов крови, или указанные клетки были селективно лизированы для доставки (растворимого) переносчика кислорода в раствор и затем отделены нерастворимые компоненты. Подходит также комбинация двух способов. Лизис клеток, содержащих переносчик кислорода, можно проводить любым пригодным способом лизиса, например химическим лизисом, осмотическим лизисом, механическим лизисом, термическим лизисом или подобным.

Клеточные осколки можно отделить любым пригодным средством или способом. Это включает, например, центрифугирование, фильтрацию, осаждение и декантацию, диализ или любой подобный способ.

Для отделения нелизированных клеток или клеточных осколков от растворенного переносчика кислорода обычный способ представляет собой гранулирование твердого материала. Например, можно провести стадию центрифугирования. Центрифугирование при 2-5000/д обычно достаточно для гранулирования клеток и клеточных осколков.

Для гранулирования дополнительных нерастворенных компонентов, например любого осадка, образовавшегося во время процесса очистки, в любое время во время процесса очистки, можно провести стадии центрифугирования, в частности стадии центрифугирования с использованием более высоких сил до ультрацентрифугирования в режиме до 10⁶/д.

Очитка раствора, содержащего переносчик кислорода, дополнительно или альтернативно, любой стадии центрифугирования, может включать по меньшей мере одну стадию фильтрации, предпочтительно по меньшей мере две, три или более стадий фильтрации. Это можно проводить или при использовании по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех фильтров (если в настоящем применении используется несколько фильтров, то авторы используют термин "каскад фильтров"), или одной, двух, трех или более отдельных стадий фильтрации.

Указанный каскад фильтров или различные стадии фильтрации могут включать два, три, четыре, пять или более фильтров различного типа, из различного материала и/или с различным размером пор. Кроме того, можно использовать глубокослойный фильтр, такой как, например, стекловата или подобный, предпочтительно в качестве материала первого фильтра, для задержки крупных клеточных осколков. При использовании нескольких фильтров предпочтительно применение фильтров, обеспечивающих различные диаметры пор в порядке уменьшения. Например, если используют три различных фильтра, то первый фильтр (после глубокослойного фильтра) может иметь размер пор от 1 до 0,5 мкм, второй фильтр может иметь размер пор от 0,7 до 0,3 мкм и третий может иметь размер пор от 0,4 до 0,1 мкм, где независимо от перекрывающихся диапазонов, указанных выше, следующий фильтр, в любом случае, имеет меньший размер пор, чем фильтр перед ним. С помощью указанных стадий фильтрации по существу удаляется твердый и осажденный материал, имеющий больший размер, чем размер пор используемых фильтров.

Кроме того, стадия ультрафильтрации может быть включена в способ очистки для очистки переносчиков кислорода. С помощью такой стадии ультрафильтрации можно отделить нежелательные растворенные макромолекулы. Предпочтительно предел исключения по размеру выбирают для отделения

- 7 030017

макромолекул, которые больше (крупнее, имеют более высокую молекулярную массу), чем желаемые переносчики кислорода, соответственно указанные макромолекулы задерживаются фильтром. Ввиду молекулярной массы гемоглобина, составляющей примерно 64000 Да, предел исключения по размеру ультрафильтрационного фильтра должен быть выше. Для того чтобы удостовериться в том, что выход гемоглобина не уменьшается стадией ультрафильтрации, предпочтительно выбрать исключение размера фильтра на уровне примерно 100000 Да, предпочтительно на уровне примерно 200000 Да, более предпочтительно на уровне примерно 300000 Да, но без ограничения этими величинами.

Дополнительно или в качестве альтернативы, можно осуществлять любую подходящую стадию хроматографии. Особенно предпочтительным типом хроматографии является ионообменная или эксклюзионная хроматография.

Такой же результат может быть получен стадией диализа с использованием диализной мембраны, обеспечивающей указанные выше пределы исключения по размеру Т, позволяющие проходить переносчику кислорода, но задерживающие макромолекулы, имеющие больший молекулярный размер.

Для снижения количества соединений с небольшой молекулярной массой в растворе дополнительную стадию диализа можно проводить с использованием диализной мембраны, имеющей предел исключения по размеру примерно 50000 Да, обеспечивающей возможность прохождения меньших молекул, но задерживающей переносчик кислорода.

Для уменьшения заражения композиции вирусами и/или микроорганизмами особенно предпочтительно включение стадии снижения содержания вируса в способ очистки. Содержание вируса уменьшается этой стадией, предпочтительно до вирусного груза менее чем 10, предпочтительно менее чем 5, более предпочтительно менее чем 2 вирусных частиц на 1 мл и еще более предпочтительно до 0. На этой стадии предпочтительно, чтобы раствор, содержащий переносчик кислорода, проходил через фильтр, снижающий содержание вируса ("вирусный фильтр"). Такие фильтры общеизвестны и коммерчески доступны. Примерами являются §агЮгш8 Укокай® СРУ, Р1аиоуа® 15Ν,20Ν, Мййроге Уйеюке® ΝΡΡ или РЛЬЬ Редакик® Огабе ЬУ6, но, не ограничиваясь ими. Альтернативно или дополнительно, предпочтительно после прохождения через фильтр можно применять обработку УФ-светом, в частности УФсветом с длиной волн 245 нм, для уничтожения любых остающихся вирусов.

Необязательно, на любой стадии в течение процесса выделения переносчика кислорода можно проводить по меньшей мере одну стадию нагревания. Эта стадия включает нагревание содержащей переносчик кислорода суспензии или раствора во время процедуры выделения до температуры в диапазоне от 40 до 85°С, предпочтительно от 60 до 80°С, более предпочтительно в диапазоне от 65 до 75°С. Стадию нагревания предпочтительно проводят в течение периода от 10 мин до 6 ч, предпочтительно в течение от 20 мин до 4 ч и наиболее предпочтительно в течение от 30 мин до 3 ч, и может включать несколько различных температур в пределах указанного выше диапазона.

Согласно способу по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы переносчик кислорода оставался в растворе в течение всего процесса очистки. Кроме того, предпочтительно, чтобы переносчик кислорода оставался в растворе в течение всего процесса очистки и в течение получения композиции по настоящему изобретению. Это значит, что переносчик кислорода предпочтительно не осаждается в способе по настоящему изобретению и соответственно остается в своей природной трехмерной структуре, в которой он присутствует в природной среде.

В особенно предпочтительном способе согласно настоящему изобретению, способ очистки переносчика кислорода из цельной крови включает, по меньшей мере, стадии:

(a) отделение плазмы цельной крови,

(b) лизис эритроцитов,

(c) загрузка переносчика кислорода лигандом,

(б) нагревание образца до температуры в диапазоне от 40 до 85°С,

(е) отделение переносчика кислорода от любых нежелательных компонентов крови.

С помощью этих стадий можно получить содержащий переносчик кислорода раствор, который можно использовать для получения композиции по настоящему изобретению. В частности, содержащий переносчик кислорода раствор, который можно получить с помощью этих стадий, может быть концентрирован до желаемого количества переносчика кислорода, и к этому раствору добавлен по меньшей мере один дополнительный ингредиент(ы) с получением композиции по настоящему изобретению.

Стадию (а) настоящего способа можно осуществлять любым из обычно используемых способов для отделения плазмы от цельной крови, предпочтительно центрифугированием или фильтрацией. Путем центрифугирования в течение примерно 30 мин при скорости примерно от 2000 до 5000 об/мин, например 4000 об/мин, эритроциты осаждаются, в то время как растворимые соединения и лейкоциты преимущественно остаются в супернатанте. Путем ресуспендирования и осаждения эритроцитов, например, от 2 до 5 раз, можно улучшить отделение эритроцитов от нежелательных соединений крови.

Стадию (Ь) предпочтительно осуществляют добавлением воды, предпочтительно, дистиллированной воды или подходящего субизотонического буфера, предпочтительно, фосфатного буфера к загущенной крови стадии (а). После лизиса эритроцитов водой или субизотоническим буфером к раство- 8 030017

ру/суспензии предпочтительно добавляют соль с получением физиологической концентрации указанной соли в растворе. Предпочтительно ЫаС1 добавляют в количестве 0,9% в растворе.

Стадию (с) можно осуществлять после стадии (а), после стадии (Ь), после стадии (й) или после стадии (е), но предпочтительно ее проводят по меньшей мере после стадии (Ь). В частности, следует отметить, что стадию (с) не обязательно осуществлять сразу в качестве следующей стадии после стадии (Ь), но ее можно также осуществлять или повторять после стадии (й), после стадии (е) или любых следующих стадий обработки. Загрузку переносчика кислорода в раствор/суспензию можно проводить введением газа в раствор/суспензию, предпочтительно, газа СО или N0, или их смеси. В предпочтительном варианте осуществления газ СО вводят в раствор/суспензию в течение периода времени, достаточно длительного для получения насыщения в растворе/суспензии >90%, предпочтительно, насыщение >95%.

Стадия (й) может быть осуществлена после стадии (а), после стадии (Ь), после стадии (с) или после стадии (е), но предпочтительно ее проводят после стадии (с). Дополнительно нагревание можно повторять во время процедуры выделения. Эта стадия включает нагревание содержащей переносчик кислорода суспензии или раствора во время процедуры выделения до температуры в диапазоне от 40 до 85°С, предпочтительно, от 60 до 80°С, более предпочтительно, в диапазоне от 65 до 75°С. Стадию нагревания осуществляют предпочтительно в течение периода от 10 мин до 6 ч, предпочтительно в течение периода от 20 мин до 4 ч и наиболее предпочтительно в течение периода от 30 мин до 3 ч, и может включать несколько различных температур в пределах указанного выше диапазона.

На стадии (е) переносчик кислорода очищают от других нежелательных ингредиентов, еще содержащихся в растворе, таких как нелизированные клетки, клеточные осколки, любой осадок или другие нерастворимые ингредиенты. Дополнительный переносчик кислорода может быть дополнительно очищен по меньшей мере частичным отделением нежелательных растворимых соединений, подобно, например, растворимым макромолекулам или растворимым соединениям, имеющим низкую молекулярную массу.

Соответственно указанная стадия (е) может включать несколько одиночных стадий, таких как фильтрация, ультрафильтрация, центрифугирование, ультрацентрифугирование, хроматография, диализ с использованием различных типов диализных мембран, обеспечивающих различные пределы исключения по размеру, стадии промывания, концентрации содержания переносчика кислорода и т.д. Любой из указанных выше способов может быть включен в данную стадию очистки.

Предпочтительно по меньшей мере одна стадия центрифугирования и/или по меньшей мере одна стадия фильтрации включена в стадию (е). Например, лизат может быть прокручен в центрифуге для отделения оставшихся клеток и клеточных осколков или профильтрован, например, каскадом фильтров, как описано выше. Лизат также может быть сначала центрифугирован и затем профильтрован, или он может быть профильтрован на первой стадии через глубокослойный фильтр и затем по меньшей мере через один фильтр или каскад фильтров. Путем центрифугирования или фильтрования через глубокослойный фильтр облегчается манипулирование во время любых следующих стадий фильтрации вследствие меньшего осаждения материала на фильтрах и предотвращения их закупорки. Если используется не каскад фильтров, то предпочтительно использовать по меньшей мере один фильтр, обеспечивающий возможность задержки, по существу, всех твердых материалов, содержащихся в суспензии, и позволяющий проходить всем растворенным компонентам. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один из используемых фильтров способен задерживать также микроорганизмы, действуя в качестве стерилизующего фильтра. Дополнительно можно проводить предпочтительную стадию ультрафильтрации и/или стадию уменьшения содержания вирусов и/или микроорганизмов в растворе. Соответственно, предпочтительно, чтобы после стадии (е) содержащий переносчик кислорода раствор по существу не содержал каких-либо нерастворенных частиц, сгустков или осадка.

На стадии (е) в дополнение к любым из указанных выше стадий/способов содержащий переносчик кислорода раствор может быть промыт и/или концентрирован. Под "промыванием" подразумевается, что молекулы меньше, чем желаемый переносчик кислорода (имеющий более низкую молекулярную массу), отделяют предпочтительно добавлением такого же или многократно большего (например, в 5-10 раз) количества изотонического раствора в содержащий переносчик кислорода раствор и затем фильтруют полученный (разведенный) раствор через фильтр, задерживающий переносчик кислорода и обеспечивающий возможность прохождения более мелких молекул. Для промывного раствора предпочтительно используют 0,9% раствор №С1. Стадию промывания можно повторять 2 или 3, или 4, или 5, или до 10 раз. Предпочтительный вариант осуществления проиллюстрирован использованием фильтра, имеющего предел исключения по размеру 5000, 10000 или 20000 Да, обеспечивающего возможность прохождения более мелких молекул. На данной стадии содержащий переносчик кислорода раствор (предпочтительно, после промывания) может быть концентрирован до желаемой концентрации переносчика кислорода, например до концентрации 50, 100 или 200 г/л, но без ограничения этими количествами. Любая желаемая концентрация может быть получена или концентрированием с помощью фильтрации, или добавлением 0,9% ΝαΟ или подобного изотонического раствора.

Полученный таким образом содержащий переносчик кислорода раствор может быть использован для получения композиции по настоящему изобретению добавлением по меньшей мере одного дополни- 9 030017

тельного ингредиента, описанного выше, к раствору в желаемом количестве.

В предпочтительном варианте осуществления композицию по настоящему изобретению получают добавлением к содержащему переносчик кислорода раствору по меньшей мере консерванта, предпочтительно фармацевтически приемлемого консерванта, такого как, например, феноксиэтанол, парабены, бензоат натрия, бензиловый спирт, гексахлорофен, и антиоксиданта и/или стабилизатора, такого как, например, Ν-ацетилцистеин, октаноат натрия, Ы-ацетил-1-триптофанат, Ν-ацетилметионинат, витамин Е, витамин С, метилпреднизолон или маннит. Дополнительно, можно добавлять любой из дополнительных ингредиентов, описанных выше.

При желании, готовая композиция может быть снова стерилизована, например, нагреванием, фильтрацией, центрифугированием, добавлением консервантов, применением пара, применением газа или применением УФ-света или комбинацией по меньшей мере двух из них, предпочтительно дополнительной стадией стерильной фильтрации, и предпочтительно ею наполняют стерильные контейнеры или стерильные мешки для хранения.

Согласно предпочтительному варианту осуществления стерильные мешки помещают в аэрозольный контейнер для последующего применения. Одним примером может быть устройство "мешок с клапаном", включающее мешок, например ламинированный алюминиевый мешок или жестяной аэрозольный контейнер. Ввиду разделения продукта и пропеллента можно использовать мешок с клапаном со сжатым воздухом при давлении, например, от 2 до 9 бар.

Согласно изобретению композицию предпочтительно используют для обработки открытых ран, предпочтительно хронических ран людей и животных, причем предпочтительно использование для лечения людей. Предпочтительное использование осуществляют местной обработкой ран описанными загруженными переносчиками кислорода носителями.

К удивлению, было обнаружено, что можно эффективно лечить открытые раны указанными загруженными переносчиками кислорода. Как описано выше, заживление хронических ран часто замедляется вследствие уменьшенной доставки кислорода. Поэтому представляется логичным, что лечение ран требует загруженных кислородом переносчиков кислорода для обработки. Однако согласно настоящему изобретению, было обнаружено, что возможно получение положительного заживления наружных ран нанесением переносчика кислорода, загруженного СО или N0. Без связи с теорией, это вызвано тем, что благодаря парциальному давлению кислорода в воздухе лиганд может заменяться кислородом при нанесении на рану и вследствие этого поддерживается заживление ран.

Композиция по настоящему изобретению имеет явное преимущество повышенной стабильности переносчика кислорода ввиду его неокисленного состояния на основании загрузки лигандом СО или N0, приводящей к лучшему получению и стабильности при хранении. Кроме того, композицию легко наносить и манипулировать ею, и она обеспечивает безопасный и эффективный подход к повышенному заживлению ран облегченной диффузией, опосредованной переносчиком кислорода.

Композицию по настоящему изобретению наносят наружно. В зависимости от состояния раны, ее наносят предпочтительно распылением на область раны в форме мелко распыленного аэрозоля.

Согласно изобретению, было показано, что можно лечить открытые раны, в частности, также хронические раны, имеющие самые различные причины. Это могут быть раны после операций, после травмы, после повреждений, плохо заживающие раны или гипоксические раны, или также раны, вызванные дегенеративными изменениями в ткани. В этой связи, они могут представлять собой раны, вызванные дегенеративными изменениями артериальных кровеносных сосудов, и раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности. Они, в частности, включают пролежни, а также хронические раны, в частности, раны, развившиеся в результате сахарного диабета. Кроме того, можно эффективно лечить раны, вызванные ожогами (или термическим воздействием, химическими веществами или при обморожении) или кипящей жидкостью или паром.

Фигуры

На чертеже показана кривая насыщения 0₂ гемоглобина, зависимого от окружающего парциального давления 0₂.

Примеры

Пример 1.

Гемоглобин выделяли из цельной крови свиней отделением эритроцитов от сыворотки, лизисом собранных эритроцитов, осаждением клеточных осколков, загрузкой гемоглобина СО введением газа СО до насыщения жидкого образца, нагреванием раствора, проведением нескольких стадий фильтрации, включая стадию фильтрации вирусов, и промыванием полученного раствора гемоглобина добавлением дважды двукратного объема 0,9% солевого раствора и фильтрацией раствора.

Получали готовую к применению композицию для обработки ран, содержащую 10% очищенного и стабилизированного гемоглобина, 0,05% Ν-ацетилцистеина и 0,7% феноксиэтанола в 0,9% ЫаС1. Композицию снова загружали газом СО, разделяли на 10 порций и упаковывали в аэрозольный баллончик соответственно.

Пример 2.

Первую порцию композиции примера 1 использовали сразу после получения для лечения пациент- 10 030017

ки (диагноз: сахарный диабет, гипертоническая болезнь) с хронической раной правой стопы (7x2 см). Рану обрабатывали один раз в день распылением композиции на поверхность раны. После 3 недель обработки были видны первые признаки заживления. В следующие недели процесс заживления был выражен, и полное закрытие раны было получено после 18 недель лечения.

Пример 3.

Вторую порцию композиции примера 1 хранили при 4°С в течение 2 лет после получения и затем использовали для лечения хронической раны у мужчины, страдающего сахарным диабетом II типа. Композицию наносили на хроническую поверхностную язву (4x3 см) на левой голени пациента в области болыпеберцовой кости. Рану обрабатывали один раз в день. После двух недель лечения появлялись признаки заживления, после 4 недель рана зажила более чем на 50% по сравнению с исходным состоянием. На следующих неделях наблюдали быстрое заживление, и полное заживление раны было достигнуто после 8 недель лечения.

Пример 4.

Третью часть композиции примера 1 хранили при 10°С в течение 2 лет. Затем ее использовали для лечения хронической поверхностной язвы (4x2 см) на правой нижней конечности мужчины, страдающего сахарным диабетом II типа. Рану обрабатывали один раз в день. После 2,5 недель обработки были видны признаки заживления. На следующей неделе наблюдали быстрое заживление, и полное закрытие раны было получено после 12 недель лечения.

Пример 5.

Часть композиции примера 1 использовали для лечения мужчины, получившего ожог кипящей водой и паром. У него были диагностированы ожоги лица 1-ой и 2-ой степени.

Первоначальное лечение прохладным гелем и неоспорином в течение одной недели не проявило улучшения, и лечащий врач предложил наложение на нос и другие части лица, подобно глазным векам, кожных трансплантатов.

Вместо этого, пациента лечили композицией примера 1 в течение 7 недель. Композицию наносили на кожу распылением три или четыре раза в день. Наблюдали быстрое улучшение и заживление кожи, и пациента выписали из стационара после семи недель лечения. Трансплантаты кожи не потребовались.

Пример 6. Сравнение загруженного/незагруженного гемоглобина

A) Аэрозоль загруженного гемоглобина получали согласно примеру 1

Получали готовую к применению композицию для лечения ран, содержащую 10% очищенного и стабилизированного гемоглобина, 0,05% Ν-ацетилцистеина и 0,7% феноксиэтанола в 0,9% ЫаС1. Композицию снова загружали газом СО, разделяли на 20 порций и упаковывали в аэрозольный баллончик соответственно.

Композицию можно было хранить при температуре от 4°С до комнатной температуры в течение периода от нескольких месяцев до нескольких лет.

B) Вторую порцию свиной цельной крови обрабатывали как в примере 1, за исключением того, что не проводили загрузку СО. Во время стадии нагревания происходило осаждение значительного количества гемоглобина. Следующие стадии фильтрации проводить было трудно. Выход очищенного гемоглобина на литр цельной крови уменьшился до уровня менее чем 30% выхода, когда перед нагреванием проводили загрузку СО. Это показывает, что загрузка образцов СО во время получения стабилизирует гемоглобин таким образом, что во время стадии нагревания осаждается значительно меньше гемоглобина.

Получали готовую к применению композицию для лечения ран, содержащую 10% очищенного гемоглобина, 0,05% Ν-ацетилцистеина и 0,7% феноксиэтанола в 0,9% №С1. Композицию разделяли на порции и упаковывали в аэрозольные баллончики, соответственно.

C) Дополнительную порцию гемоглобина выделяли из цельной крови свиней способом, описанным в примере 1 АО 2003/077941, без загрузки гемоглобина во время получения: гемоглобин освобождали от плазмы и компонентов клеточных мембран без нагревания посредством центрифугирования и ультрафильтрации и очищали.

Получали готовую к применению композицию для лечения ран, содержащую 10% очищенного гемоглобина, 0,05% Ν-ацетилцистеина и 0,7% феноксиэтанола в 0,9% №С1. Композицию разделяли на порции и упаковывали в аэрозольные баллончики соответственно.

Полученный таким образом свежий аэрозоль незагруженного гемоглобина получали в течение периода лечения с требуемой частотой (все три дня) и хранили при 4°С максимум в течение одного дня перед применением.

Лечение пациентов

Нескольких пациентов-мужчин (в возрасте от 65 до 75 лет) с диабетической язвой стоп лечили в течение трех месяцев аэрозолем гемоглобина в соответствии с А) (хранившемся при 10°С в течение периода до 6 месяцев) или свежеприготовленным аэрозолем гемоглобина в соответствии с С) (хранение при 4°С в течение максимум 3 дней, т.е. все три дня использовали свежую композицию) до получения полного заживления ран у всех пациентов. По наблюдениям лечащих дерматологов заживление ран, получен- 11 030017

ное при применении композиций в соответствии с А), проходило с меньшей секрецией, меньшим образованием струпа и/или меньшим нагноением, по сравнению с ранами, обработанными аэрозолем гемоглобина в соответствии с С), и, в частности, по сравнению с ранами, которые лечили обычными способами. Ввиду незначительных проблем при лечении ран композицией загруженного гемоглобина в соответствии с А), наблюдали более быстрое заживление на см² поверхности раны, чем ран, обработанных аэрозолем незагруженного гемоглобина по С), и гораздо более быстрое заживление, чем ран, обработанных обычным способом. Кроме того, пациенты, получавшие лечение композицией А), отмечали меньший дискомфорт.

Пример 7.

Образцы композиций, полученных по примеру 6А), примеру 6В) или примеру 6С), исследовали относительно загрузки образцов О₂, а также продукции метгемоглобина, вида, который неспособен связывать О₂. Кроме того, метгемоглобин воздействует на молекулы гемоглобина в непосредственной близости таким образом, что они еще могут связывать О₂, но больше не могут высвобождать его.

Все образцы, представленные в табл. 1, разводили 1:1 0,9% раствором ПаС1 для имитации условий обработки раны. Образцы 7.1-7.8 измеряли непосредственно после разбавления (перед разведением образцы 7.5-7.8 хранили при комнатной температуре). Обработку газом проводили следующим образом: 6 мл каждого из указанных разведенных растворов переносили в стеклянную колбу емкостью 30 мл. Обработку газом проводили полным заполнением стеклянной колбы соответствующим газом, закрывали колбу и смешивали образец вращением в течение 30 с. Все образцы хранили в течение указанного периода времени при 30°С. Образцы обрабатывали согласно условиям, описанным в табл. 1, и измеряли общее количество гемоглобина (гемоглобин+метгемоглобин), содержание кислорода, содержание метгемоглобина и, необязательно, содержание СО.

Таблица 1

Пример	Образец	Обработка	Общий НЬ г/дл	О₂ %	СО %	<х> £ 4-> 2
7.1	Свежеприготовленная композиция в соответствии с примером 6А)	Нет	5, 5	1,7	96, 3	3, 9
7.2	Свежеприготовленная композиция в соответствии с примером 6В)	Нет	5, 7	26,8		5, 1
7.3	Свежеприготовленная композиция в соответствии с примером 6С)	Нет	5, 6	27,0		4,7

- 12 030017

7.4	Композиция примера 6А, хранившаяся в течение 3 месяцев (10°С)	Нет	5, 9	1, 8	96, 5	3, 8
7.5	Композиция примера 7.2	Хранение в течение 24 часов	5, б	26,9		11,2
7 . б 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 7.14 7.15 7.16 7.17 7.18 7.19 7.20 7.21 7.22 7.23 7.24 7.25 7.26 7.27	Композиция примера 7.2 Композиция примера 7.3 Композиция примера 7.3 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4 Композиция примера 7.4	Хранение в течение 48 часов Хранение в течение 24 часов Хранение в течение 48 часов 0,5 час О₂ 1 час Ог 2 час Ог 3 час Ог 24 час Ог 4 8 час Ог 72 час Ог 0,5 час О₂ 1 час СОг 2 час СОг 3 час СОг 24 час СОг 48 час СОг 72 час СОг 0,5 час воздухом 1 час воздухом 2 час воздухом 3 час воздухом 24 час воздухом	5, 5 5, 7 5, б 5, 8 5, 7 5, 8 5, 9 5, 7 5, 8 5, 7 5, 8 5, 7 5, 9 5, 7 5, 6 5, 8 5, 7 5, 8 5, 7 5, 9 5, 6 5, 8	27,0 26.5 26.7 13.7 19, 6 25, 7 30.7 33.5 32.5 31.7 4, 0 6, 0 9, 2 9, б 4, 9 8,2 9, 4 9, 2 12,4 18,0 20.7 24,3	84.7 79, 1 73, 1 68,1 59, 6 55, 9 55, 8 91.8 90, 0 86,7 85, 1 77.5 68,2 65, 9 89, 0 85, 9 80.5 77.9 69, 3	17,0 10,5 16,2 4.4 4.2 4.3 4.2 9, 8 15, 5 16,0 5, 7 5, 7 5, 8 6, 9 19, 7 27,4 28,3 4.5 4.4 4.3 4,3 9, 1
7.28	Композиция примера 7.4	48 час воздухом	5, 7	25, 4	64,3	13, 9
7.29	Композиция примера 7.4	72 час воздухом	5, 7	26,8	62,2	14,3

Как видно из результатов, представленных в табл. 1, композиции по изобретению, где переносчик кислорода загружен СО, не только могут храниться в течение длительного времени без образования метгемоглобина, но, кроме того, способны заменить связанный СО О₂, когда он предоставлен загруженному переносчику кислорода. При воздействии 10 0% О₂ (примеры 7.9-7.15), насыщение гемоглобина О₂ увеличивается очень быстро.

Если композиция подвергается воздействию СО₂, что представляет ситуацию внутри ткани млекопитающего с активными путями обмена, то образуется увеличенное количество метгемоглобина (примеры 7.16-7.22).

Парциальное давление О₂ в воздухе составляет только примерно 21%, таким образом, в соответствии с кривой насыщения гемоглобина О₂, показанной на фиг. 1, максимальное возможное насыщение гемоглобина кислородом (О₂) в воздушной атмосфере составляет примерно 29%. При рассмотрении примеров 7.23-7.29 можно утверждать, что удивительный результат состоит в том, что в пределах 3 ч композиция, подверженная воздействию воздуха, загружается 20,7% кислорода, но все же имеет очень низкое содержание метгемоглобина. При лечении наружных ран композицию распыляют на (очищенную) поверхность раны и оставляют в контакте с воздухом.

Эти результаты показывают, что композиция согласно изобретению содержит стабилизированный переносчик кислорода, который после нескольких месяцев хранения обеспечивает высокий транспорт кислорода, когда он контактирует с воздухом.

- 13 030017

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Композиция для наружной обработки ран распылением в форме мелко распыляемого аэрозоля, где композиция содержит:

(a) переносчик кислорода, выбранный из гемоглобина и миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода участок связывания кислорода загружен не-О₂ лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, и

(b) по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролита(ов), консерванта(ов), стабилизатора(ов), антифлоккулянта(ов), антикоагулянта(ов), буферирующего(их) рН агента(ов), растворителя(ей), антиоксиданта(ов), образующего(их) пленку агента(ов) и поперечно сшивающего(их) агента(ов),

где композиция является стерильной.
2. Композиция по п.1, характеризующаяся тем, что композиция представляет собой водный или органический раствор.
3. Композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, в частности, предпочтительно по меньшей мере 90% переносчика кислорода находится в загруженной указанным лигандом форме.
4. Композиция по любому из пп.1-3, характеризующаяся тем, что переносчик кислорода выбран из природно встречающегося гемоглобина или миоглобина человеческого или животного происхождения, или представляет собой модифицированный гемоглобин или миоглобин человеческого или животного происхождения, где модификация выбрана из внутримолекулярной поперечной сшивки, полимеризации (межмолекулярной поперечной сшивки), пэгилирования (ковалентного связывания с полиалкиленоксидами), модификации химически реакционноспособными эффекторами, выбранными из пиридоксаль-5'фосфата и 2-нор-2-формилпиридоксаль-5'-фосфата, и/или модификации химически нереакционноспособными эффекторами кислородной связи, выбранными из 2,3-бисфосфоглицерата, инозитгексафосфата, инозитгексасульфата или меллитовой кислоты, или их комбинации.
5. Композиция по любому из пп.1-4, характеризующаяся тем, что раны, подлежащие лечению, представляют собой хронические раны, операционные раны, раны вследствие повреждений, раны после травмы, открытые раны, раны с неудовлетворительным заживлением или гипоксические раны, раны, вызванные дегенеративными изменениями или стенозом артериальных кровеносных сосудов, раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности, или связанные с пролежнями язвенные раны, или ожоговые раны, вызванные термическим воздействием, химическими веществами или обморожением, или кипящей жидкостью, или паром.
6. Применение композиции по любому из пп.1-4 для наружной обработки ран.
7. Применение по п.6, характеризующееся тем, что раны, подлежащие лечению, представляют собой хронические раны, операционные раны, раны вследствие повреждений, раны после травмы, открытые раны, раны с неудовлетворительным заживлением или гипоксические раны, раны, вызванные дегенеративными изменениями или стенозом артериальных кровеносных сосудов, раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности, или связанные с пролежнями язвенные раны, или ожоговые раны, вызванные термическим воздействием, химическими веществами или обморожением, или кипящей жидкостью, или паром.
8. Способ получения композиции по любому из пп.1-4, где (ί) переносчик кислорода загружают защитным не-О₂ лигандом во время или после выделения из его природной среды, (ΐΐ) добавляют по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из электролита(ов), консерванта(ов), стабилизатора(ов), антифлоккулянта(ов), антикоагулянта(ов), буферирующего(их) рН агента(ов), растворителя(ей), антиоксиданта(ов), образующего(их) пленку агента(ов) и поперечно сшивающего(их) агента(ов), (ίίί) композицию стерилизуют и (ΐν) композицию упаковывают в стерильный контейнер, позволяющий осуществлять распыление композиции в форме мелко распыленного аэрозоля.
9. Способ по п.8, где композицию упаковывают в аэрозольный баллончик.
10. Способ по п.8, где композицию стерилизуют на стадии (ίίί) нагреванием, фильтрацией, центрифугированием, добавлением консервантов, применением пара, применением газа или применением УФоблучения, или комбинацией по меньшей мере двух из них.
11. Применение переносчика кислорода, выбранного из гемоглобина или миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода связывающий кислород участок загружен не-О₂ лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, для получения средства или композиции для наружной обработки ран.
12. Применение по п.11, характеризующееся тем, что раны, подлежащие лечению, представляют собой хронические раны, операционные раны, раны вследствие повреждений, раны после травмы, открытые раны, раны с неудовлетворительным заживлением или гипоксические раны, раны, вызванные дегенеративными изменениями или стенозом артериальных кровеносных сосудов, раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности, или связанные с пролежнями язвенные раны, или

- 14 030017

ожоговые раны, вызванные термическим воздействием, химическими веществами или обморожением, или кипящей жидкостью, или паром.
13. Применение переносчика кислорода, выбранного из гемоглобина и миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного гемоглобина или миоглобина связывающий кислород участок загружен не-О₂лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, в способе наружной обработки ран.
14. Применение по п.13, характеризующееся тем, что раны, подлежащие лечению, представляют собой хронические раны, операционные раны, раны вследствие повреждений, раны после травмы, открытые раны, раны с неудовлетворительным заживлением или гипоксические раны, раны, вызванные дегенеративными изменениями или стенозом артериальных кровеносных сосудов, раны, возникшие в результате хронической венозной недостаточности, или связанные с пролежнями язвенные раны, или ожоговые раны, вызванные термическим воздействием, химическими веществами или обморожением, или кипящей жидкостью, или паром.
15. Способ очистки переносчика кислорода с получением переносчика, где по меньшей мере в 40% указанного переносчика кислорода участок связывания кислорода загружен не-О2 лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота, где переносчик выбран из гемоглобина и миоглобина из цельной крови, включающий стадии:

a) отделение плазмы цельной крови,

b) лизис эритроцитов,

c) загрузка переносчика кислорода не-О₂ лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота,

ά) нагревание суспензии или раствора, содержащих переносчик кислорода, до температуры в диапазоне от 40 до 85°С,

е) отделение переносчика кислорода от любых нежелательных компонентов крови, где стадия (е) включает по меньшей мере одну стадию фильтрации, с получением гемоглобина или миоглобина, где по меньшей мере в 40% указанного гемоглобина или миоглобина связывающий кислород участок загружен не-О2 лигандом, выбранным из монооксида углерода и монооксида азота.
16. Способ по п.15, где фильтрация на стадии (е) включает применение стерильного фильтра и/или вирусного фильтра.