BR112014001309B1

BR112014001309B1 - Composição para pulverização de ferimento, seu processo de preparação, processo para purificação um veículo de oxigênio, e uso de hemoglobina ou mioglobina

Info

Publication number: BR112014001309B1
Application number: BR112014001309-8A
Authority: BR
Inventors: Michael Sander; Harald Pötzschke
Original assignee: Sastomed Gmbh
Priority date: 2011-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2020-02-18
Also published as: PL2550973T3; CN108752468B; EP2550973A1; CA2842487C; EP2734223B1; KR20140045498A; CN103781488A; BR112014001309A2; AU2012289237A1; US10471175B2; WO2013013799A1; IL230160A; MY165035A; ES2432075T3; US11116868B2; PE20141577A1; US20160228602A1; NZ619177A; JP5995970B2; EA030017B1

Abstract

resumo patente de invenção: "pulverização do ferimento". a presente invenção refere-se a uma composição, compreendendo hemoglobina ou mioglobina, em que em pelo menos 40% da referida hemoglobina ou mioglobina o sítio de ligação de oxigênio é carregado por um ligante de não o2, e pelo menos um outro ingrediente, um método para a preparação da referida composição e o uso de hemoglobina ou mioglobina carregada com um ligante de não oxigênio para o tratamento externo de ferimentos. 20282558v1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO PARA PULVERIZAÇÃO DE FERIMENTO, SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO, PROCESSO PARA PURIFICAÇÃO UM VEÍCULO DE OXIGÊNIO, E USO DE HEMOGLOBINA OU MIOGLOBINA.

[0001] A presente invenção se refere a uma composição, compreendendo hemoglobina ou mioglobin a, em que em pelo menos 40% da referida hemoglobina ou mioglobina do sítio de ligação de oxigênio é carregado por um ligante de não O2, e pelo menos um outro ingrediente, um método para a preparação da referida composição e o uso de hemoglobina ou mioglobina carregada com um ligante de não oxigênio para o tratamento externo de ferimentos.

[0002] Diferentes métodos são empregados para o tratamento de ferimentos, dependendo de seu estado. Em primeiro lugar, um ferimento que ainda está aberto, de preferência, deve ser desinfetado e desse modo protegido contra influências externas negativas. Isto pode ser feito por meio de soluções desinfetantes adequadas ou bandagens em spray ou também por meio da aplicação de solução de iodo. A cicatrização do ferimento atual deve em seguida ocorrer a partir de dentro. Isto significa que os vasos sanguíneos ainda no lugar devem servir como substituto do tecido destruído com quantidades suficientes de substratos, a fim de que a mecanismo de reparação de tecido possa se iniciar.

[0003] Os ferimentos podem ser causados por meio de vários fatores, tipo, por exemplo, lesões ou também após as operações ou eventos traumáticos.

[0004] Por outro lado, é conhecido que a formação do ferimento, particularmente também ferimentos crônicos, também pode ser provocada por doenças, em que a degeneração e/ou constrição de grandes e/ou pequenos vasos sanguíneos ocorre. Este pode ser o resultado,

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2/34 por exemplo, no caso de pacientes mais velhos, de estadias prolongadas no leito (decúbito) ou de diabetes melito que pode levar a degeneração e arteriosclerose (P. Carpenter, A. Franco, Atlas der Kapillaroskopie [Atlas of Capillaroscopy], 1983, Abbott, Max-Planck-Inst. 2, DWiesbaden) dos grandes e pequenos vasos sanguíneos (macroangiopatia e microangiopatia das artérias). Também foi mostrado que uma deficiência de oxigênio (hipoxia) está presente na área do ferimento. 40 mm de Hg é considerado ser um valor critíco (C. D. Muller e outros, Hartmann Wund [Wound] Forum 1 (1999), 17-25).

[0005] O sangue flui para os tecidos, incluindo a pele, através das artérias e abastece as células com os substratos necessários para a vida. Qualquer degeneração dos vasos sanguíneos resulta em um fornecimento deficiente para as células, levando a sua morte. Os substratos deve passer a última, abertura aparentemente insignificante de aproximadamente 20 pm a partir dos vasos sanguíneos menores (vasos capilares) para as células por meio de difusão; nesta ligação, o oxigêncio desempenha um papel especial, porque é difícil para o organismo tratar deste substrato.

Existem três principais problemas envolvidos:

[0006] (1) É verdade que o oxigênio é absolutamente essential para a vida (um ser humano está com morte cerebral após apenas aproximadamente cinco minutos se seu/ seu cérebro não recebe oxigênio), mas ao mesmo tempo, o oxigênio está altamente tóxico (um recémnascido que recebe tratamento de respiração com oxigênio puro vai morrer após apenas alguns dias).

[0007] (2) O oxigênio tem muito pouca solubilidade em um meio aquoso. Isto resulta, de acordo com a primeira lei de FICK, em uma baixa taxa de difusão de oxigênio. Além disso, existe uma lei fundamental de difusão, em outras palavras lei de SMOLUCHOWSKI e de EINSTEIN, que afirma que a velocidade da difusão (de oxigênio) di

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3/34 minui com um aumento da distância de difusão. Agora a constante de difusão de oxigênio é tão abaixo que a velocidade de difusão em uma distância de difusão de tão pouco quanto 20 pm e de apenas 5% do valor inicial. Uma camada de água de, por exemplo, 50 pm representa um isolamento de oxigênio quase completo para as células. O oxigênio é transportado ao longo dos longos caminhos no organismo dos pulmões para as extremidades dos dedos dos pés com a circulação sanguínea, ligada a hemoglobina, e apenas deste modo é capaz de superar as longas distâncias de um modo que é adequado para o organismo.

[0008] (3) Para o oxigênio, em contraste a glicose, por exemplo, não existe área de armazenamento no corpo, por esse motivo este substrato deve estar disponível para as células em todos os momentos e rapidamente, em uma quantidade suficiente; o oxigênio é um substrato imediado assim chamado necessário para a vida.

[0009] Um organismo intacto resolveu estes problemas através da utilização de vários mecanismos. Os efeitos tóxicos do oxigênio são evitados na medida em que este último se liga durante o transporte para a hemoglobina e, assim, continua a ser inofensiva. Ao mesmo tempo, o oxigênio livre é diluído e perde assim o seu potencial oxidativo prejudicial. No entanto, é instantaneamente disponível em quantidade suficiente, porque a ligação com a hemoglobina é reversível. O problema da baixa gama difusora é resolvido na medida em que o organismo desenvolveu uma rede muito finamente ramificada vaso sanguíneo (rede capilar), a qual assegura que, em média, cada célula está a uma distância de, no máximo, de 25 pm a partir de um capilar, em desta maneira, o caminho de difusão de oxigênio no organismo permanece abaixo do comprimento crítico de 50 um. Além disso, uma célula pode ser difusivamente de oxigênio a partir de diversos lados, o que representa um mecanismo de segurança. A disponibilidade imedi

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4/34 ata, de acordo com a exigência (oxigênio não é permitido para estar disponível em excesso, caso contrário, teria um efeito nocivo) é obtido, no organismo, por meio da regulação do fluxo vascular de vasos sanguíneos, que controla e perfusão assim, otimiza o fornecimento de oxigênio.

[00010] Se houver uma superfície ferida aberta, o fornecimento de oxigênio para as células é interrompido. O suprimento de oxigênio do ar exterior é pobre porque um filme de líquido aquoso está colocando na (tecido) camada de células, que filme, como explicado, forma uma barreira ao oxigênio difuso. As feridas frescas em tecidos normais podem se curar em poucos dias, se o fornecimento de oxigênio a partir de baixo, por outras palavras, a partir do interior, é suficiente. No entanto, foi demonstrado em experiências com animais, que mesmo feridas cicatrizam frescos melhor se a concentração de oxigênio do ar circundante aumenta (MP Pai e outros, Sug. Gyn. Obstet. 135 (1972), 756-758). Mais velhas, feridas crônicas são conhecidos especialmente para curar-se muito lentamente, em sua totalidade, devido à sua deficiência de oxigênio.

[00011] Para cicatrizar feridas crônicas melhor, bem como, os chamados oxigenoterapia hiperbárica (OHB) foi usado. Neste tratamento, os pacientes são colocados em câmaras pressurizadas, onde são submetidos a um excesso de pressão de oxigênio puro, de cerca de 3 bar, durante um determinado período de tempo (CD Muller e outros Hartmann Wund Fórum 1 (1999), 17-25). Na verdade, a cicatrização de feridas pode ser aumentada por este método. No entanto, o efeito diminui com o número de tratamentos.

[00012] Patente dos Estados Unidos N°. 2.527.210 descreve uma solução de hemoglobina que podem ser supostamente usados para o tratamento de feridas, quer por via intravenosa e por via tópica, por exemplo, por pulverização. Nesta descrição, a hemoglobina é obtida a

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5/34 partir de eritrócitos frescos que estão sujeitas ao congelamento de choque, após a centrifugação e a tiragem de a fração de plasma sanguíneo. Isso resulta em lise celular e hemoglobina é liberada. As paredes celulares partidos também estão presentes no produto. Esta formulação é um detrito celular concentrado (fragmentos de células). Deste modo, um efeito antisséptico tal como cobertura de outro modo obtido com uma solução de iodo, após ter adicionado sulfeto de sódio a 5%, é suposto. Em outras palavras, a ferida é meramente fechada. Transporte de oxigênio não é mencionado lá.

[00013] WO 97/15313 descreve o uso terapêutico de hemoglobina para melhorar a cicatrização de feridas. Para este fim, a hemoglobina livre de estroma e pirogênios é administrada intravenosamente a pacientes, particularmente depois de operações e acontecimentos traumáticos para aumentar a pressão sanguínea. Em particular, uma hemoglobina reticulada com diaspirina é utilizada para esta finalidade.

[00014] O documento WO 2003/ 077941 ensina o tratamento de feridas abertas, com uma solução de hemoglobina compreendendo isolado e opcionalmente reticulado hemoglobina. As soluções foram preparadas na hora com a hemoglobina do sangue de porco e aplicado a feridas crônicas.

[00015] Durante a preparação e armazenamento dos veículos de oxigênio em base de hemoglobina ou mioglobina podem perder sua funcionalidade parcial ou completamente. Para evitar isso, é desejável estabilizar os veículos de oxigênio que eles permanecem utilizável e capazes de transportar oxigênio.

[00016] Em geral, existem diferentes abordagens para a preparação de carreadores artificiais de oxigênio, um deles é a preparação de soluções adequadas de hemoglobinas nativos ou modificados quimicamente (consulte Problemas de Vth Simpósio Internacional de sangue Substitutos de San Diego, na Califórnia, EUA, em março de 1993, cé

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6/34 lulas artificiais, substitutos do sangue, e Imobilização Biotecnologia 22 (1994), vol. 2- vol. 4). Um problema no tratamento de tais preparações farmacêuticas como veículos artificiais de oxigênio é a sua inactivação por oxidação espontânea aumentando a metemoglobina, que não é capaz de transportar oxigênio. Isso ocorre geralmente durante a preparação pelo produtor e o armazenamento subsequente.

[00017] Várias abordagens para resolver este problema estão descritos. Ou tenta-se minimizar o grau de oxidação da hemoglobina, ou para reduzir a hemoglobina oxidada novamente.

[00018] Uma possibilidade para a para a prevenção da oxidação espontânea é a desoxigenação da hemoglobina (isto é, totalmente remoção de oxigênio a partir da preparação), desde desoxiemoglobina oxida muito mais lentamente do que a oxiemoglobina a metemoglobina.

[00019] Além disso, é possível minimizar a quantidade de oxidação de armazenamento e/ou a preparação à temperatura mais baixa possível (para soluções aquosas, a cerca de 4°C).

[00020] Além disso, a taxa de oxidação de hemoglobina depende da concentração de íon de hidrogênio, isto é, o pH. Por exemplo, para a hemoglobina humana nativa existe um mínimo no intervalo de pH entre 7,5 e 9,5.

[00021] Além disso, a adição de certos álcoois pode diminuir a oxidação da hemoglobina. Alguns deles trabalham mesmo em baixa concentração. Um problema é a toxicidade destes álcoois.

[00022] Certos íons metálicos (Cu2+, Fe3+ etc.) catalisam a oxidação espontânea de hemoglobina. Eles podem ser inutilizados por complexação com EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), embora em si EDTA promove a oxidação espontânea de hemoglobina.

[00023] Proteção dos veículos de oxigênio artificiais contra a oxidação pode ser melhorado através da adição de substâncias redutoras.

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Sob certas circunstâncias, até mesmo resultar em uma reativação da hemoglobina oxidada.

[00024] EP 0 857 733 descreve que a hemoglobina pode ser estabilizada através da ligação de um ligante, em particular o monóxido de carbono, ao sítio de ligação do oxigênio. Verificou-se que tal carbonilhemoglobina pode ser aplicada a um organismo sem ligação (deligandation) e é adequada como um veículo de oxigênio para dentro da corrente sanguínea.

[00025] O objetivo da presente invenção é proporcionar um produto para o tratamento externo de feridas, o que aumenta a cicatrização de feridas, é fácil na manipulação e armazenáveis.

[00026] Este objetivo é atingido, de acordo com a invenção, por meio de uma composição, compreendendo (a) Um veículo de oxigênio, de preferência hemoglobina ou mioglobina, em que em pelo menos 40% do referido veículo de oxigênio o sítio de ligação de oxigênio é carregado por um ligante de não O2, e (b) pelo menos um outro ingrediente, selecionado a partir de eletrólito (s) conservante (s), estabilizante (s), antifloculante (s), anticoagulante (s), agente (s) de tamponamento de pH, solvente (s), antioxidante (s), agente (s) de formação de película e agente (s) de reticulação [00027] e o uso de um veículo de oxigênio, de preferência hemoglobina ou mioglobina carregada em seu sítio de ligação de oxigênio com um ligante de não O2 para a preparação de um agente ou composição para o tratamento externo de ferimentos.

[00028] De acordo com a invenção de preferência um veículo de oxigênio natural (nativo), particularmente hemoglobina ou mioglobina ou um derivado modificado seu, ou suas misturas, é/são empregados. A hemoglobina ou mioglobina de origem humana ou animal, em parti

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8/34 cular de equino, bovino ou de preferência de origem de porcino, é particularmente adequada para a presente invenção. A hemoglobina humana ou de porcino, que é natural ou modificada como descrito acima, é particularmente preferida como um veículo de oxigênio. O veículo de oxigênio pode ser recentemente isolado do sangue humano ou de animal ou pode ser artificialmente preparado.

[00029] As misturas de veículo de oxigênio natural e modificado também podem ser empregads, tais como, por exemplo, em uma relação de 20:1 a 1:20, com referência ao peso. Além disso, as misturas de hemoglobina e mioglobina, ou seus derivados modificados podem ser empregados na relação acima mencionada de 20:1 a 1:20.

[00030] Em uma outra modalidade o veículo de oxigênio pode ser modificado. A modificação pode ser uma reticulação intramolecular, polimerização (reticulação intermolecular), pegilação (ligação covalente com óxidos de polialquileno), modificação com efetores quimicamente reativos, tais como, piridoxal-5'-fosfato ou 2-nor-2-formilpiridoxal-5'-fosfato, ou também com efetores quimicamente não reativos da ligação de oxigênio, tal como, 2,3-bisfosfoglicerato, hexafosfato de inositol, hexassulfato de inositol, or ácido melítico, ou uma combinação destes. Tais modificadores são conhecidos e descritos, por exemplo, em DE-A 100 31 744, DE-A 100 31 742, and DE-A 100 31 740. A reticulação dos veículos de oxigênio é também descrita em DE 197 01 37, EP 97 1000790, DE 44 18 937, DE 38 41 105, DE 37 14 351, DE 35 76 651.

[00031] Os Exemplos para os veículos de oxigênio modificados são as hemoglobinas tendo um peso molecular de 65,000 to 15,000,000, tais como moléculas reticuladas intramolecularmente de acordo com WO 97/ 15313, particularmente produtos poliméricos assim como produtos reticulados intramolecularmente tendo um peso molecular médio de 80.000 a 10.000.000 g/ mol, particularmente de 100.000 a

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5.000.000, ou mioglobinas analogamente produzidas tendo um peso molecular de 16.000 a 5.000.000, particularmente de 100.000 a 3.000.000, de preferência de 1.000.000 g/ mol. Estes veículos de oxigênio que são polimerizados, por exemplo, empregando agentes de reticulação conhecidos para a modificação intermolecular, tal como, agentes de reticulação bifuncionais tipo diepóxi de butadieno, sulfona de divinila, di-isocianato, particularmente di-isocianato de hexametileno, di-isocianato de cicloexila, e ácido 2,5-bisisocianatobenzol sulfônico, éster de di-N-hidróxi sucinimidila, di-imidoéster, ou dialdeído, particularmente glioxal, aldeído glicol que reagem analogamente, ou o glutardialdeído pode ser empregado.

[00032] Além disso, podem ser utilizados produtos que são polimerizados desta maneira e PEGiladas com um polietileno-glicol ou seus derivados adequados. Isto inclui, por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, ou um copolímero de óxido de etileno e óxido de propileno, ou um éster, éter, éster ou amida. Isso pode ser adequado se o óxido de polialquileno ligado covalentemente tem uma massa molar de 200-5000 g/mol.

[00033] Para ligação covalente dos óxidos de polialquileno, os derivados de óxido de polialquileno que contêm um agente de ligação já ligado covalentemente com um grupo funcional, permitindo, assim, uma reacção química directa com os grupos amino, álcool ou sulfidril das hemoglobinas, formando ligações covalentes do polialquileno óxidos podem ser adequados, por exemplo, óxidos de polialquileno com éster reactivo N - hidróxi succinimidil, epóxi (glicidil-éter), aldeído, isocianato, vinil-sulfona, iodacetamida, formiato de imidazolila, grupos tresilato, e outros. Muitos de tais polietilenos glicóis monofuncionalmente ativados estão disponíveis comercialmente.

[00034] Se forem utilizados veículos de oxigênio modificados, modificada reticulada (intramolecular ou intermolecular), ou reticulado e de

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10/34 produtos de hemoglobina peguilados com um peso molecular médio de 250.000 a 750.000 produtos g/mol, ou da mioglobina com um peso molecular médio de 50.000 a 750.000 g/mol, são os preferidos.

[00035] De acordo com a modalidade preferida particular, recentemente isoladas de hemoglobina ou mioglobina de origem humana ou animal, em particular, de origem porcino é utilizado para a preparação da composição da invenção.

[00036] De acordo com a presente invenção, pelo menos, 40% dos sítios do veículo de oxigênio de ligação de oxigênio, são carregadas com um ligante não O2. De preferência, pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, mais preferido pelo menos 70%, ainda mais preferido pelo menos 80%, particularmente preferido pelo menos 90% ou 95% da hemoglobina ou mioglobina é fornecido em forma carregada pelo ligante. Esta carga pode já ser aplicada durante o isolamento do veículo ou após a sua purificação, no entanto, é particularmente preferível levar a cabo o isolamento do veículo de oxigênio, na sua forma protegida, o que significa que durante o isolamento ou purificação do ligante é fornecido a/em contacto com o veículo de oxigênio.

[00037] O ligante não O2 é de preferência de monóxido de carbono (CO), ou o monóxido de azoto (NO) ou uma mistura dos mesmos. Ambos os ligantes têm uma afinidade elevada para o sítio de O2 ligação de hemoglobina/mioglobina (s) e servir como um protetor contra a oxidação do centro de Íon de Fe³⁺ do heme.

[00038] O veículo de oxigênio carregado(s) é/são de preferência dissolvidos em meio aquoso ou orgânico, em que uma solução aquosa pse refere, em uma quantidade de 0,1 a 35% em peso, de preferência de 0,1 a 20% em peso, mais preferida de 0,1 a 15% em peso, para estar pronto para aplicação.

[00039] A composição de acordo com o presente invento compreende ainda pelo menos um outro aditivo, de preferência escolhido de

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11/34 entre o grupo que compreende eletrólito (s), estabilizador (es), antifloculante (s), conservante (s), agente (s) de tamponamento do pH, solvente (s), antioxidante (s) e agente (s) formador de filme, mais preferido selecionado a partir de eletrólito (s), estabilizador (es), antifloculante (s), conservante (s) e agente de tamponamento de pH (s). O mais preferido a composição está na forma de uma solução e compreende pelo menos um eletrólito e, opcionalmente, um estabilizador.

[00040] A solução pode conter eletrólitos fisiologicamente compatíveis, tais como sais, em quantidades adequadas ou desejadas. Os eletrólitos podem estar presentes em quantidades de 0,1 a 30% em peso, De preferência de 0,1 a 10%, mas de preferência estão presentes em uma concentração fisiológica, respectivamente. De preferência, a composição compreende um sal nas quantidades anteriormente mencionadas, como por exemplo, NaCl, KCl, NH4Cl, CaCO3, Na2CO3, K2CO3, MgSO4, Na2SO4, CaCl2, MgCb, citrato de sódio, lactato de sódio ou misturas dos mencionados, ou semelhante, sem se limitar a estes exemplos. O sal mais preferido é o NaCl, em particular em uma concentração de 0,9% (solução isotônica).

[00041] De acordo com a invenção, é particularmente preferido que a composição compreende um composto actuando como um estabilizador e/ou antifloculante para proteínas, em particular, para a hemoglobina/mioglobina, tais como N - acetil- cisteína, cisteína, N - atil metionina, metionina, sais não caotrópicos, polióis, tais como açúcares, de preferência, dissacarídeos e aminoácidos de preferência cada um em quantidades de 0,001% em peso a 20% em peso.

[00042] Os polióis que podem ser utilizados são, de preferência polióis de baixo peso molecular, embora derivados poliméricos podem ser empregues. Tais polióis incluem etileno-glicol, glicerol, eritritol, manitol. Polióis cíclicos que podem ser empregues incorporar um ou mais anéis alicíclicos, e podem ter pelo menos uma cadeia lateral. Os po

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12/34 lióis preferidos incluem dissacarídeos e os álcoois de açúcar, por exemplo, lactitol, sorbitol e inositol. São preferidos os compostos que possuem de 2 a 10 grupos hidroxila. A quantidade de poliol pode estar na gama preferida 0,001 a 20%, mais preferivelmente de 1 a 15 %, o mais preferivelmente 2 a 10% p/ v.

[00043] Além disso, o aditivo estabilizador de proteína pode ser seleccionada a partir de uma de tris (hidroximetil) metil composto de Fórmula 1;

[00044] (HOCH2) 3C - R (1) em que R é : alquila Ci - C4, alquila C1 C4, NH2, NHC (CH2OH)3, hidroxialquila C1-C4, Ci - C4 alquil carboxilato, NR1R² (em que R¹ e R² pode ser independentemente: H, alquila C1 C4, sulfonato de C1 - C4-alquila, sulfonato de C1-C4-hidroxialquila).

Exemplos de compostos preferidos da Fórmula (1) incluem: tris (hidroximetil) etano, 1,1',1- tris (hidroximetil) propano, tris (hidroximetil) aminometano ou sais dos mesmos por exemplo, cloreto, fosfato, maleato, succinato, 1, 3-bis[tris (hidroximetil) metilamino]propano; bis (2hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano ; N[tris (hidroximetil) metil]-2- aminoetano; sulfonato N[tris (hidroximetil) metil]- 3 aminopropano sulfonato, N[tris (hidroximetil) metil]-3-amino-2 hidroxipropano sulfonato; N-[tris (hidroximetil) metil] -glicina. Os referidos compostos podem também ser adicionados na gama preferida de 0,001 a 20%, mais preferivelmente 1 a 15%, o mais preferivelmente 2 a 10% w/v.

[00045] Além disso, o aditivo estabilizador de proteína pode ser selecionado a partir de um polieletrólito. O polieletrólito pode ser um polieletrólito catiónico ou aniônico. Polieletrólitos anfotéricos podem também ser empregues. O polieletrólito catiônico é, preferivelmente, um polímero com grupos catiônico distribuídos ao longo da cadeia molecular.

[00046] Os grupos catiônico, os quais são, de preferência amônio

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13/34 quaternário funções derivadas, podem ser dispostos em grupos laterais pendentes da cadeia, ou pode ser incorporada na mesma. Exemplos de polieletrólitos catiônico incluem: Coplymers de pirrolidona de vinilo e metacrilato de metilo quaternário, por exemplo Gafquat série (755N, 734, HS - 100) obtido a partir de ISP; poliacrilamidas substituídas; polietilenoimina, polipropilenoimina e derivados substituídos; homopolímeros de poliamina (Golchem CL118); poliamina copolímeros (por exemplo, condensados de epicloridrina e dimetilamina ou mono), cloreto de polidialil dimetil amônio (poliDADMAC) ; dextranos substituídos ; goma de guar modificada (substituído com cloreto de hidroxipropiltrimônio) ; proteínas substituídas (por exemplo grupos quaternários substituídos na proteína de soja e hidrolisado de colágeno), ácidos poliamino (por exemplo, polilisina) ; compostos poliamino de baixo peso molecular (por exemplo, espermina e espermidina). Polímeros naturais ou artificiais podem ser empregues.

[00047] Os polieletrólitos catiônico com PM de 150 a 5.000.000, preferencialmente de 5000 a 500.000, mais preferivelmente de 5000 a 100.000 podem ser empregues. Uma quantidade de 0,01 a 10% é preferido, mais de preferência 0,1 a 2%, especialmente de 0,05 a 5% w/v. [00048] O polieletrólito aniônico é preferencialmente um polímero com grupos aniônicos distribuídos ao longo da cadeia molecular. Os grupos aniônicos que podem incluir, carboxilato, sulfonato, sulfato ou outros grupos ionizáveis de carga negativa, pode ser disposta em cima de grupos pendentes da cadeia ou ligado directamente ao esqueleto do polímero. Polímeros naturais ou artificiais podem ser empregues. [00049] Exemplos de polieletrólitos aniônicos incluem : Gantrez (Sseries, AN- série); ácido algínico e os seus sais ; celuloses de carboximetilo e sais; poliacrilamidas substituídos (por exemplo substituídos com grupos de ácido carboxílico), ácidos poliacrílicos e seus sais, outros ácidos sulfônicos de poliestireno e os seus sais ; sulfatos de

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14/34 dextrano ; sacarídeos substituídos por exemplo, sacarose octossulfato; heparina. Os polieletrólitos aniônicos com PM de 150 a 5.000.000 pode ser utilizado, de preferência, de 5000 a 500.000, mais preferivelmente de 5000 a 100.000. Uma quantidade de 0,01 % a 10% é especialmente preferida de 0,05 a 5 %, mais especialmente 0,1 a 2 % w/v.

[00050] Um estabilizador preferido particular, é N-acetilcisteína em uma quantidade de 0 a 10%, de preferência 0,01 a 5 %.

[00051] Além disso, a composição pode conter conservantes, como por exemplo, fenoxietanol, isotiazolina, ácido sórbico ou de qualquer outro conservante adequado conhecido das pessoas versadas.

[00052] A composição pode ainda compreender, de preferência qualquer agente de tamponamento. Todos os agentes tamponantes vulgarmente conhecidos podem ser utilizados, como Tris/HCl, K2HPO4/KH2PO4, Na2HPO4/NaH2PO4, MOPS (3-(N-morfolino) ácido propanossulfônico), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1piperazinoetanossulfônico), TAPS (3-{[tris (hidroximetil) metil] amino} ácido propanossulfônico), Bicina (N, N-bis (2-hidroxietil) glicina), tricina (N-tris (hidroximetil) metilglicina), TES (2 -{[tris (hidroximetil) metil] amino} etanossulfônico), PIPES (piperazina-N,N'-bis (ácido 2etanossulfônico)), SSC (citrato de sódio salino), MES (2-(N-morfolino) ácido etanossulfônico) sem estar limitado a estes.

[00053] Os solventes adequados na composição de acordo com a invenção são, de preferência água ou soluções aquosas, solventes orgânicos como o álcool, preferencialmente etanol, ou polietilenoglicol (PEG). As misturas dos referidos solventes podem ser igualmente utilizados. Outros óleos naturais podem ser utilizados como um solvente para alguns dos ingredientes e a composição pode ser fornecida como uma emulsão. Um solvente particularmente preferido é a água ou uma solução aquosa.

[00054] Os antioxidantes úteis para a presente composição pode

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15/34 ser, por exemplo vitamina C, vitamina E, flavonoides, carotenoides, ou sais ou seus derivados.

[00055] Os agentes formadores de filme preferidos são tais agentes comumente utilizados em aplicação cosmética, como por exemplo, acrilamida/sódio, acrilato de copolímero, acrilatos/copolímero de acrilamida, Butil éster de PVM/MA Copolímero, Carboximetil Quitina, Quitosana, Hydroxipropil Celulose, Polyquaternium -36, PVP, PVP/VA Copolímero, VA/crotonatos copolímero ou vinil caprolactama/PCP/Dimetilaminoctil Metilacrilato Copolímero.

[00056] Todos os aditivos acima mencionados podem estar presentes em uma quantidade de 0 a 20, de preferência de 0,001, 0,01, 0,05 ou 0,1 a 10, mais preferencialmente 0,5 a 5% (w/v), se não for de outro modo indicado acima.

[00057] Se desejado, outros aditivos podem estar presentes, em particular, em uma quantidade de 0 a 20, de preferência de 0,1 a 20, de preferência 0,2 a 15, particularmente de 0,5 a 10% em peso. Os aditivos preferidos são nutrientes para as células. Eles podem ser selecionados a partir de glicose, por exemplo, em quantidades de 0,1 a 5% em peso, insulina, em quantidades de até 25 IU/ml, os aminoácidos naturais, em particular da cisteína, por exemplo, 0,1 a 5% em peso, ou tecido fatores, tais como as interleucinas, em quantidades fisiológicas, até uma quantidade de 10 vezes do mesmo.

[00058] De preferência a composição representa uma solução aquosa compreendendo (a) um veículo de oxigênio, de preferência hemoglobina ou mioglobin a, em que em pelo menos 40% do referido veículo de oxigênio o sítio de ligação de oxigênio é carregado por um ligante de não O2, e (b) pelo menos um outro ingrediente, selecionado a partir de eletrólito (s) conservante (s), estabilizante (s), antifloculante (s), an

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16/34 ticoagulante (s), agente (s) de tamponamento de pH, antioxidante (s), solvente orgânico, agente (s) de formação de película e agente (s) de reticulação.

[00059] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a composição compreende um veículo de oxigênio, o qual é isolado a partir de sangue total de um ser humano ou animal, de preferência a partir de porcos.

[00060] Deste modo, é um aspecto adicional da invenção proporcionar um processo para a purificação de um veículo de oxigênio utilizável para a composição da presente invenção a partir de sangue total.

[00061] Para a preparação da composição na modalidade preferida, o veículo de oxigênio é isolado a partir de sangue de um ser humano ou animal, e é ainda mais purificada para ser essencialmente livre de constituintes do plasma e na membrana celular.

[00062] Com essencialmente livre significa que o composto ou composição considerada não compreendem mais do que 20%, de preferência não mais do que 10%, ainda mais preferido não mais do que 5 % e particularmente preferido não mais do que 2 % ou menos do que 1 % do composto indesejado mencionado (s).

[00063] A purificação pode compreender quaisquer meios apropriados ou etapas do processo, como por exemplo, lise selectiva ou de precipitação, centrifugação, ultracentifugation, centrifugação fracionado, métodos de cromatografia, como cromatografia de permuta aniônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade ou de adsorção, filtração em gel ou cromatografia de peneira molecular, diálise ou, sem ser restringida a estes exemplos, na medida em que pelos métodos aplicados ao veículo de oxigênio é desnaturado o menos possível. De preferência, durante o isolamento e purificação do veículo de oxigênio permanece essencialmente na solução.

[00064] Quando o veículo de oxigênio é isolado a partir de sangue

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17/34 total, é preferível que tanto as células que compreendem o veículo de oxigênio são separados de outros componentes do sangue, ou as referidas células são lisadas selectivamente para libertar o suporte (solúvel) de oxigênio em solução e, posteriormente, os componentes não solúveis são separados. Uma combinação dos dois métodos, como é bem apropriado. A lise do veículo de oxigênio contendo as células pode ser realizada por qualquer método de lise adequado, eg lise química, lise osmótico, a lise mecânica, lise térmica ou semelhante.

[00065] Os detritos celulares podem ser separadas por qualquer meio ou método adequado. Isto inclui, por exemplo, centrifugação, filtração, sedimentação e decantação, a diálise ou qualquer outro método semelhante.

[00066] Para a separação de células não lisadas e os detritos das células a partir do veículo de oxigênio resolvido um método comum é pelletation do material sólido. Por exemplo, uma etapa de centrifugação pode ser realizada. Centrifugação com 2 a 5000 xg é geralmente suficiente para a peletização de células e restos celulares.

[00067] Para peletização outros componentes não resolvidos, por exemplo, qualquer precipitado desenvolvido durante o processo de purificação, a qualquer momento durante o processo de purificação mais etapas de centrifugação pode ser efectuado, em particular, as etapas de centrifugação, utilizando as forças mais elevadas, até ultracentrifugação com até 10⁶ x g.

[00068] A purificação do veículo de oxigênio contendo solução, adicionalmente ou em alternativa a qualquer etapa de centrifugação pode compreender pelo menos uma etapa de filtração, de preferência, pelo menos duas, três ou mais etapas de filtração. Isto pode ser efectuado, quer por utilização de pelo menos um, de preferência pelo menos dois, mais preferencialmente pelo menos três filtros (se houver mais do que um filtro é utilizado no presente pedido, usamos o termo cascata do

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18/34 filtro), ou por um, dois, três ou mais etapas de filtração independentes. [00069] O referido filtro de cascata ou as diferentes etapas de filtragem pode incluir dois, três, quatro, cinco minério mais filtros de tipo diferente, ou material diferente e diferentes tamanhos de poros. Mais um filtro de leito profundo como, por exemplo lã de vidro ou similar pode ser utilizado, de preferência, como um primeiro material de filtro para reter os detritos de célula grosseira. Se mais do que um filtro é utilizado, é preferível a utilização de filtros proporcionando diferentes diâmetros de poros em ordem decrescente. Por exemplo, se três filtros são utilizados diferentes, o primeiro filtro (depois do filtro de leito profundo) pode ter um tamanho médio dos poros entre 1 e 0,5 pm, o segundo filtro pode ter um tamanho de poro de 0,7 a 0,3 pm e o terceiro uma poro tamanho de 0,4 a 0,1 pm, em que independente das gamas sobrepostas citados antes do filtro a seguir em qualquer caso, tem um tamanho de poro mais pequeno do que o do filtro antes que. Por o referida etapa (s) de filtragem e o material precipitado sólido tendo um tamanho superior ao tamanho de poro dos filtros utilizados é essencialmente removido.

[00070] Além disso, uma etapa de ultrafiltração pode ser incluído no processo de purificação para a purificação do veículo (s) de oxigênio. Por uma tal etapa de ultrafiltração macromoléculas resolvidos não desejados podem ser separados. De preferência, o limite de exclusão por tamanho é selecionado para macromoléculas separadas que são maiores (maior peso molecular, mais elevada) do que os veículos de oxigênio desejada, em conformidade disse macromoléculas são retidas pelo filtro. Devido ao peso molecular da hemoglobina de cerca de 64.000 Dálton o limite de exclusão de tamanho do filtro de ultrafiltração deve ser maior. Para ter a certeza de que o rendimento da hemoglobina não é diminuída pela etapa de ultrafiltração, é preferível seleccionar o tamanho de exclusão do filtro de cerca de 100.000 Dálton, de prefe

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19/34 rência a cerca de 200.000 Dálton, mais preferido de cerca de 300.000 Dálton, sem se limitar a estes valores.

[00071] Adicionalmente, ou como alternativa qualquer etapa de cromatografia adequada pode ser levada a cabo. Um tipo particularmente preferido de cromatografia de troca iónica é ou cromatografia de exclusão de tamanho.

[00072] O mesmo resultado pode ser obtido através de uma etapa de diálise com uma membrana de diálise, proporcionando os limites de exclusão de tamanhos acima mencionados, permitindo que o veículo de oxigênio para passar, mas retendo as macromoléculas que têm um peso molecular mais elevado.

[00073] Para reduzir a quantidade de compostos de baixo peso molecular em solução de uma etapa adicional de diálise pode ser levada a cabo utilizando uma membrana de diálise com um limite de exclusão de tamanho de cerca de 50.000 Dálton, permitindo que as moléculas mais pequenas para passar, mas reter o veículo de oxigênio.

[00074] Para diminuir o vírus e/ou a contaminação de microrganismos na composição que é especialmente preferido incluir uma etapa de degradação do teor de vírus no processo de purificação. O teor de vírus é reduzida por esta etapa, de preferência, a uma carga inferior a 10, de preferência menos do que 5, mais preferencialmente menos do que 2 partículas de vírus por ml, e ainda mais preferido a 0. Nesta etapa, é preferível que a solução que compreende o veículo de oxigênio é passado através de um filtro de vírus degradação conteúdo (filtro de vírus). Tais filtros são geralmente conhecidos e estão disponíveis no mercado. Exemplos são Sartorius Virosart® CPV, Planova® 15N, 20N, Millipore Viresolve® NFP ou PALL Pegasus® Grau LV6, sem estar limitado a estes. Alternativamente ou adicionalmente, de preferência, após a passagem através do filtro, de um tratamento com luz UV, em particular a luz UV de um comprimento de onda de 245 nm, pode ser apliPetição 870190083690, de 27/08/2019, pág. 25/47

20/34 cado a qualquer tipo de vírus é entregue restantes.

[00075] Opcionalmente, em qualquer fase durante o processo de isolamento do veículo de oxigênio, pelo menos, uma etapa de aquecimento pode ser realizado. Esta fase compreende o aquecimento do veículo de oxigênio contendo suspensão ou solução durante o processo de isolamento a uma temperatura na gama de 40 a 85°C, de preferência 60 a 80°C, mais preferivelmente na gama de 65 a 75°C. A etapa de aquecimento é realizado de preferência durante 10 minutos até 6 horas, preferencialmente durante 20 minutos a 4 horas, e o mais preferido durante 30 minutos a 3 horas, e pode incluir várias temperaturas diferentes dentro do intervalo mencionado antes.

[00076] De acordo com o processo da presente invenção, é preferível que o veículo de oxigênio permanece em solução durante todo o processo de purificação. Além disso, é preferível que o veículo de oxigênio permanece em solução durante todo o processo de purificação e, durante a preparação da composição da presente invenção. Isto significa que é preferível que o veículo de oxigênio não é precipitada no processo da presente invenção e, consequentemente, mantém-se na sua estrutura tridimensional natural, presente no seu ambiente natural.

[00077] Em um processo preferido específico de acordo com a presente invenção do processo para purificação uma veículo de oxigênio do sangue total compreende pelo menos as etapas de:

(a) separar o plasma do sangue total (b) lisar as células vermelhas do sangue (c) carregar os veículos de oxigênio com o ligante (d) aquecer a amostra para uma temperatura na faixa de 40 a 85°C (e) separar o veículo de oxigênio de quaisquer componentes não desejados do sangue.

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21/34 [00078] Por estas etapas um veículo de oxigênio contendo solução é obtida, que pode ser utilizado para a preparação da composição da presente invenção. Em particular, o veículo de oxigênio contendo solução pode ser obtida por estas etapas pode ser concentrada até uma quantidade desejada do veículo de oxigênio e a esta solução a pelo menos um outro ingrediente (s) é/são adicionados para se obter a composição da presente invenção.

[00079] A etapa (a) do presente método pode ser realizado por qualquer um dos métodos vulgarmente utilizados para a separação do plasma a partir de sangue total, de preferência por centrifugação ou filtração. Por centrifugação durante cerca de 30 min a cerca de 2000 a 5000 rpm, por exemplo, 4000 rpm glóbulos vermelhos são sedimentados, enquanto que os compostos solúveis e células brancas do sangue permanecem predominantemente no sobrenadante. Ao repetir ressuspensão e peletização das células vermelhas do sangue, por exemplo 2 a 5 vezes, a separação dos glóbulos vermelhos do sangue dos compostos indesejados pode ser aumentada.

[00080] A etapa (b) é realizada de preferência por adição de água, de preferência água destilada ou uma sub-tampão isotônica adequada, de preferência um tampão de fosfato, para o sangue engrossado da etapa (a). Após a lise das células vermelhas do sangue, com água ou um tampão de sub - isotônica, de preferência um sal é adicionado à solução/suspensão para obter uma concentração fisiológica do referido sal em solução. De preferência NaCl é adicionado a uma quantidade de 0,9% em solução.

[00081] Etapa (c) pode ser realizada após a etapa (a), após a etapa (b), após a etapa (d) ou após a etapa (e), mas é de preferência levada a cabo, pelo menos, após a etapa (b). É particularmente salientado que a etapa (c) não é necessariamente realizada imediatamente como uma etapa seguinte depois da etapa (b), mas também pode ser levada

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22/34 a cabo ou repetida após a etapa (d), depois da etapa (e), ou qualquer sequência de tratamenta etapas. A carga do veículo de oxigênio na solução/suspensão pode ser realizada mediante a introdução de gás na solução/suspensão, de preferência, CO ou nenhum gás ou uma mistura dos mesmos. Em uma modalidade preferida o gás CO é introduzido na solução/suspensão por um período de tempo longo o suficiente para obter uma saturação > 90% em solução/suspensão, de preferência uma saturação > 95%.

[00082] A etapa (d) pode ser realizada após a etapa (a), após a etapa (b), após a etapa (c) ou depois da etapa (e), mas é de preferência efectuada depois da etapa (c). Além disso, o aquecimento pode ser repetido durante o processo de isolamento. Esta fase compreende o aquecimento do veículo de oxigênio contendo suspensão ou solução durante o processo de isolamento a uma temperatura na gama de 40 a 85°C, de preferência 60 a 80°C, mais preferivelmente na gama de 65 a 75°C. A etapa de aquecimento é realizada de preferência durante 10 minutos até 6 horas, preferencialmente durante 20 minutos a 4 horas, e o mais preferido durante 30 minutos a 3 horas, e pode incluir várias temperaturas diferentes dentro do intervalo mencionado antes.

[00083] Na etapa (e), o veículo de oxigênio é purificado a partir de outros ingredientes não desejados ainda contidos na solução, como as células não lisadas, detritos celulares, qualquer precipitado ou outros ingredientes não solúveis. Além disso, o veículo de oxigênio podem ser ainda mais purificado por separação dos compostos solúveis, pelo menos, parcialmente não desejados, como por exemplo, macromoléculas solúveis ou compostos solúveis que possuem um baixo peso molecular.

[00084] Deste modo o referida etapa (e) pode incluir várias etapas individuais, como a filtração, a ultrafiltração, a centrifugação, ultracentrifugação, cromatografia, diálise, utilizando diferentes tipos de mem

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23/34 branas de diálise de fornecer diferentes limites de exclusão de tamanho, as etapas de lavagem, concentração do teor de veículo de oxigênio, etc. Qualquer um dos métodos citados acima, podem ser incluídos nesta etapa de purificação.

[00085] De preferência, pelo menos, uma centrifugação e/ou, pelo menos, uma etapa de filtração é formada na etapa (e). Por exemplo, o lisado pode ser spinned em uma centrífuga para separar as restantes células e os resíduos celulares, ou é filtrado, por exemplo por uma cascata de filtros tal como descrito acima. O ligado pode ser bem primeiro centrifugado e em seguida filtrado, ou pode ser filtrado, em uma primeira fase através de um filtro de leito profundo e, posteriormente, por meio de, pelo menos, um filtro ou um filtro de cascata. Pela centrifugação ou o leito profundo filtrar o manuseio durante quaisquer seguintes etapas de filtragem é simplificada devido a menos material se decidir por e entupimento do filtro (s). Se não for uma cascata de filtro é usado, é preferível que, pelo menos, um filtro é utilizado para permitir reter essencialmente todos os materiais sólidos contidos na suspensão e permitindo a passagem de todos os componentes resolvidos. Em uma modalidade mais preferida, pelo menos, uma do filtro utilizado (s) é capaz de reter bem microrganismos, actuando como um filtro estéril. Ainda preferido uma etapa de ultrafiltração e/ou uma etapa para diminuir o vírus e/ou o conteúdo de microrganismos da solução pode ser realizada. Por conseguinte, é preferível que após a etapa (e), o veículo de oxigênio contendo solução é essencialmente livre de quaisquer partículas não resolvidos, bandos ou precipitar.

[00086] Na etapa (e), adicionalmente a qualquer um das etapas/métodos citados acima à solução compreendendo o veículo de oxigênio desejada pode ser lavado e/ou concentrados. Por lavagem entenda-se que as moléculas mais pequenas do que o veículo de oxigênio desejada (com um peso molecular mais baixo), são separados,

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24/34 de preferência por adição do mesmo ou um múltiplo (por exemplo 5 a 10 vezes), quantidade de uma solução isotônica com o veículo de oxigênio contendo solução e em seguida filtrar a solução obtida (diluído), por um filtro de retenção do veículo de oxigênio e permitindo que as moléculas mais pequenas para passar. Por lavagem da solução, de preferência uma solução de NaCl a 0,9% são utilizados. A etapa de lavagem pode ser repetido 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou até 10 vezes. Um modelo de realização preferido é exemplificado pela utilização de um filtro que tem um limite de exclusão de tamanho de 5000 Dálton, 10.000 Dálton ou 20.000 Dálton, permitindo que as moléculas mais pequenas para passar. Nesta etapa, o veículo de oxigênio contendo solução (de preferência após lavagem), pode ser concentrada até uma concentração desejada do veículo de oxigênio, por exemplo, a uma concentração de 50 g, 100 g/l ou 200 g/l, sem estar restrito a esses valores. Qualquer concentração desejada pode ser obtida quer através da concentração por filtração ou por adição de NaCl a 0,9% ou uma solução isotônica semelhante.

[00087] O veículo assim obtido oxigênio contendo solução pode então ser utilizado para preparar a composição da presente invenção por adição a pelo menos um ingrediente adicional descrito acima à solução na quantidade desejada.

[00088] Em uma modalidade preferida, a composição da presente invenção é preparada por adição ao veículo de oxigênio contendo solução de pelo menos um conservante, de preferência, um conservante f armaceuticamente aceitável, como por exemplo, fenoxietanol, parabenos, benzoato de sódio, álcool benzílico, hexaclorofen e um antioxidante e/ou estabilizador, como por exemplo, N - acetilcisteína, octanoato de sódio, N - acetil - l - triptofanato, N - acetil - metionato, vitamina E, vitamina C, metil prednisolona ou manitol. Além disso, qualquer dos outros ingredientes descritos acima podem ser adicionados adicionalPetição 870190083690, de 27/08/2019, pág. 30/47

25/34 mente.

[00089] A composição final pode ser esterilizado de novo, se desejado, por exemplo, por aquecimento, filtração, centrifugação, adição de conservantes, de aplicação de vapor, a aplicação de gás ou UV - aplicação ou uma combinação de pelo menos dois deles, de preferência, por uma etapa de filtração adicional estéril e é de preferência colocada em recipientes estéreis ou sacos estéreis para armazenar.

[00090] De acordo com uma modalidade preferida, os sacos estéreis são posicionados em uma lata de aerossol para utilização posterior. Um exemplo pode ser um sistema saco - em - válvula, que compreende um saco, por exemplo, um saco de alumínio laminado e uma lata de alumínio ou folha de flandres lata de aerossol. Devido à separação de produto e o propulsor, saco - de - válvula pode ser usado com ar comprimido ou de azoto, a uma pressão de, por exemplo 2-9 bar.

[00091] De acordo com a invenção, a composição é de preferência usada para o tratamento de feridas abertas, feridas crônicas, de preferência de seres humanos e animais, em que é preferida a utilização para o tratamento de seres humanos. A utilização preferida é a tópica, por tratamento da ferida (s) com o veículo de oxigênio carregada (s) descrito.

[00092] Surpreendentemente, verificou-se que é possível tratar eficazmente as feridas abertas com os referidos veículos de oxigênio carregadas. Tal como descrito acima a cicatrização de feridas crônicas é frequentemente reduzida devido ao suplemento de oxigênio diminuiu. Parece, portanto, que a lógica de tratamento das feridas requer que os veículos de oxigênio carregado de oxigênio para o tratamento. No entanto, de acordo com a presente invenção, verificou-se que é possível obter uma cura externa positiva ferida através da aplicação de um veículo de oxigênio carregada com CO ou NO. Sem estar ligado a teoria

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26/34 é que, devido à pressão parcial de oxigênio no ar, o ligante pode ser substituído por oxigênio, quando aplicado sobre a ferida e, consequentemente, a cicatrização de feridas é suportado.

[00093] A composição da presente invenção tem a vantagem clara de aumento da estabilidade do veículo de oxigênio, devido ao seu estado de não oxidado com base na carga com a CO ou NO ligante resulta em boa preparação e armazenamento de estabilidade. Além disso, a composição é fácil de aplicar e boa de manejar e oferece uma abordagem segura e eficaz para melhorar a cicatrização de feridas por difusão facilitada mediado pelo veículo de oxigênio/agente.

[00094] A composição da presente invenção é aplicado externamente. Dependendo do estado da ferida, que é aplicada em, de preferência, pulverizados sobre a área da ferida em forma de um spray fino. [00095] De acordo com a invenção, demonstrou-se que as feridas abertas, em particular, também feridas crônicas têm diferentes causas, pode ser tratada de forma eficaz. Estes podem ser feridas após as operações, após trauma, após lesões, feridas com má cicatrização de feridas ou hipóxicos, ou também feridas causadas por alterações degenerativas do tecido. Neste contexto, eles podem ser feridas causadas por alterações degenerativas dos vasos sanguíneos arteriais e feridas resultantes de insuficiência venosa crônica. Estes incluem particularmente decúbito, bem como feridas crônicas, nomeadamente as que resultam da diabetes. Outras feridas provocadas por queimaduras (ou pelo calor, por produtos químicos ou por congelação) ou por escaldar pode ser tratada eficazmente.

Figuras [00096] A Figura 1 mostra a curva de saturação de O2 de hemoglobina dependente do O2 circundando a pressão parcial.

Exemplos Exemplo 1:

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27/34 [00097] A hemoglobina foi isolada do sangue total dos porcos por meio da separação das células vermelhas do sangue do soro, lisando as células vermelhas do sangue coletadas, resíduos da célula de peletização, carregamento da hemoglobina com CO por meio da introdução de gás de CO até que a saturação da amostra líquida ser obtida, aquecimento da solução, realizar várias etapas de filtragem, incluindo uma etapa de filtragem de vírus e lavagem da solução de hemoglobina obtida por meio da adição duas vezes de um volume de 2 vezes de 0,9% de salina e filtragem da solução.

[00098] Uma composição pronta para uso para o tratamento do ferimento foi preparada, compreendendo 10% de hemoglobina estabilizada e purificada, 0,05% de N-acetil cisteína e 0,7% de fenóxi etanol em 0,9% de NaCl. A composição foi carregada novamente com gás de CO, separada em 10 partes e embalada em uma lata de aerossol, respectivamente.

Exemplo 2:

[00099] Uma primeira parte da composição do Exemplo 1 foi empregada imediatamente após a preparação para tartar de um paciente fêmea (Diagnóstico: Diabetes, Hipertensão) com um ferimento crônico no pé direito (7 x 2cm). O ferimento foi tratado uma vez diariamente por meio de pulverização da composição no ferimento. Após 3 semanas os primeiros sinais de cicatrização foram visíveis. Nas semanas seguintes o processo de cicatrização foi acentuado e o completo fechamento do ferimento foi obtido após 18 semanas.

Exemplo 3:

[000100] Uma segunda parte da composição do Exemplo 1 foi armazenada a 4°C durante 2 anos após a preparação e depois disso empregada para tratar de um ferimento crônico de um paciente macho sofrendo de diabetes melito do tipo II. A composição foi aplicada a uma úlcera superficial crônica (4 x 3 cm) na tíbia esqueda do paciente.

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28/34

O ferimento foi tratado uma vez diariamente. Após duas semanas uma cicatrização foi aparecendo, após 4 semanas o ferimento foi curado mais do que 50% dos valores de referência. Nas semanas seguintes uma rápida cicatrização foi observada e o completo fechamento do ferimento foi obtido após 8 semanas.

Exemplo 4:

[000101] Uma terceira parte da composição do Exemplo 1 foi armazenada a 10°C durante 2 anos. Depois disso, foi empregada para o tratamento de uma úlcera superficial crônica (4 x 2 cm) na perna direita de um paciente macho sofrendo de diabetes melito do tipo II. O ferimento foi tratado uma vez diariamente. Após 2,5 semanas a cicatrização foi visível. Nas semanas seguintes uma rápida cicatrização foi observada e o completo fechamento do ferimento foi obtido após 12 semanas.

Exemplo 5:

[000102] Uma parte da composição do Exemplo 1 foi empregada para tratar de um paciente macho após o contato com água quente de ebulição e vapor. O diagnóstico foi de queimaduras de 1° e 2° grau em seu rosto.

[000103] O tratamento inicial com gel fresco e Neosporin durante uma semana não mostrou melhoria e pelo medico tendendo a aplicação de enxertos de pele no nariz e outras partes do rosto, como pálpebras foi proposto.

[000104] Ao invés disso, o paciente foi tratado com a composição do exemplo 1 durante 7 semanas. A composição foi aplicada à pele por meio de pulverização três ou quarto vezes por dia. Uma melhoria e cicatrização rápidas da pele foi observada e o paciente recebeu alta do hospital após sete semanas. Nenhum dos enxertos de pele foi exigido. Exemplo 6: Comparação da hemoglobina carregada/ não carregada [000105] A) Uma pulverização de carregado por hemoglobina foi

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29/34 preparada de acordo com Exemplo 1 [000106] Uma composição pronta para uso para o tratamento do ferimento foi preparada, compreendendo 10% de hemoglobina estabilizada e purificada, 0,05% de N-acetil cisteína e 0,7% de fenóxi etanol em 0,9% de NaCl. A composição foi carregado novamente com gás de CO, separada em 20 partes e embalada em uma lata de aerossol, respectivamente.

[000107] A composição pode ser armazenada entre 4°C e a temperatura ambiente durante meses e anos.

[000108] B) Uma segunda parte do sangue total do porco foi tratada como no Exemplo 1 com a exceção de que nenhum carregamento de CO foi realizado. Durante a etapa de aquecimento uma quantidade considerável de hemoglobina precipitada. As etapas de filtragem que seguem foram difíceis de realizar. A produção de hemoglobina purificada por litro de sangue total diminuiu para menos do que 30% da produção quando o carregamento de CO é realizado antes do aquecimento. Isto mostra que o carregamento das amostras com CO durante a preparação estabiliza a hemoglobina de certo modo que durante uma etapa de aquecimento consideravelmente menos hemoglobina se precipita.

[000109] Uma composição pronta para uso para o tratamento do ferimento foi preparada, compreendendo 10% de hemoglobina purificada, 0,05% de N-acetil cisteína e 0,7% de fenóxi etanol em 0,9% de NaCl. A composição foi repartida e embalada em latas de aerossol, respectivamente.

[000110] C) Uma outra parte de hemoglobina foi isolada do sangue total dos porcos por meio de um método como descrito no Exemplo 1 de WO 2003/077941 sem carregamento da hemoglobina durante a preparação: a hemoglobina foi liberada do plasma e os constituintes da membrana celular sem aquecimento por meio de centrifugação e

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30/34 ultrafiltragem, e foi purificada.

[000111] Uma composição pronta para uso para o tratamento do ferimento foi preparada, compreendendo 10% de hemoglobina purificada, 0,05% de N-acetil cisteína e 0,7% de fenóxi etanol em 0,9% de NaCl. A composição foi separada em 10 partes e embalada em uma lata de aerossol, respectivamente.

[000112] Uma tal pulverização de hemoglobina não carregada preparada foi recentemente preparada durante o período de tratamento como, muitas vezes, quanto necessário (todos os três dias) e armazenada a 4°C no máximo para um dia antes do uso.

Tratamento dos pacientes:

[000113] Vários pacientes machos (idade de 65 a 75) com Úlcera do pé diabético na parte inferior da perna foram tratados durante três meses com pulverização de hemoglobina de acordo com A) (armazenada a 10°C durante até 6 meses) ou uma pulverização de hemoglobina recentemente preparada de acordo com C) (armazenamenta a 4°C durante 3 dias no máximo, isto é, todos os três dias de uma composição fresca foi empregado) até que a cicatrização completa do ferimento foi obtida em todos os pacientes. De acordo com os dermatologistas atuais, a cicatrização do ferimento obtida com as composições de acordo com A) mostrada em todos os casos, menos secreção, menos incrustação e/ou menos supuração em comparação aos ferimentos tratados pela pulverização de hemoglobina de acordo com C) e em particular em comparação aos ferimentos tratados convencionalmente. Devido aos menos problemas os ferimentos tratados com a composição de hemoglobina carregada de acordo com A) mostrou uma cicatrização mais rápida por cm² do que os ferimentos tratados com a pulverização de hemoglobina não carregada C) e muito mais rápido do que os ferimentos convencionalmente tratados. Os pacientes tratados com a composição A), além disso, relataram menos desconforto.

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Exemplo 7:

[000114] As amostras das composições preparadas de acordo com Exemplo 6A), Exemplo 6B) ou Exemplo 6C), respectivamente, foram examinadas considerando a carga de O2 das amostras, assim como, a produção de metemoglobina, a espécie que é incapaz de se ligar ao O2. Além disso, a metemoglobina afeta as moléculas de hemoglobina nos arredores imediatos de certo modo que esta ainda pode ser ligar ao O2, mas não pode liberá-lo nunca mais.

[000115] Todas as amostras da Tabela 1 foram diluídas 1:1 com uma solução de NaCl a 0,9% para imitar as condições de um tratamento do ferimento. As amostras de 7.1 a 7.8 foram medidas imediatamente após a diluição (armazenamento das amostras de 7.5 a 7.8 foi em temperatura ambiente antes da diluição). O tratamento do gás foi como segue: 6 ml da referida solução diluída foram transferidos em um frasco de vidro de 30 ml cada. O tratamento do gás foi realizado por meio do enchimento do frasco de vidro completamente com o respectivo gás, o fechamento do frasco e rotação da amostra durante 30 segundos. Todas as amostras foram armazenadas durante o período de tempo mencionado a 30°C. As amostras foram tratadas de acordo com as condições descritas na Tabela 1 e a quantidade total de hemoglobina (hemoglobina + metemoglobina), o teor de oxigênio, o teor de metemoglobina e opcionalmente o teor de CO foi medido.

Tabela 1

Exemplo	Amostra	Tratamento	Hb total g/ dL	O2 %	CO %	MetHb %
7.1	Comp. recentemente preparada de acordo com Exemplo 6A)	nenhum	5,5	1,7	96,3	3,9
7.2	Comp. recentemente preparada De acordo com Exemplo 6B)	nenhum	5,7	26,8		5,1

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7.3	Comp. recentemente preparada de acordo com Exemplo 6C)	nenhum	5,6	27,0		4,7
7.4	Composição do Exemplo 6A), armazenada durante 3 mês (10°C)	nenhum	5,9	1,8	96,5	3,8
7.5	Composição do Exemplo 7.2	Armazenada durante 24 h	5,6	26,9		11,2
7.6	Composição do Exemplo 7.2	Armazenada durante 48 h	5,5	27,0		17,0
7.7	Composição do Exemplo 7.3	Armazenada durante 24 h	5,7	26,5		10,5
7.8	Composição do Exemplo 7.3	Armazenada durante 48 h	5,6	26,7		16,2
7.9	Composição do Exemplo 7.4	0,5 h de O2	5,8	13,7	84,7	4,4
7.10	Composição do Exemplo 7.4	1 h de O2	5,7	19,6	79,1	4,2
7.11	Composição do Exemplo 7.4	2 h de O2	5,8	25,7	73,1	4,3
7.12	Composição do Exemplo 7.4	3 h de O2	5,9	30,7	68,1	4,2
7.13	Composição do Exemplo 7.4	24 h de O2	5,7	33,5	59,6	9,8
7.14	Composição do Exemplo 7.4	48 h de O2	5,8	32,5	55,9	15,5
7.15	Composição do Exemplo 7.4	72 h de O2	5,7	31,7	55,8	16,0
7.16	Composição do Exemplo 7.4	0,5 h de CO2	5,8	4,0	91,8	5,7
7.17	Composição do Exemplo 7.4	1 h de CO2	5,7	6,0	90,0	5,7
7.18	Composição do Exemplo 7.4	2 h de CO2	5,9	9,2	86,7	5,8
7.19	Composição do Exemplo 7.4	3 h de CO2	5,7	9,6	85,1	6,9
7.20	Composição do Exemplo 7.4	24 h de CO2	5,6	4,9	77,5	19,7

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7.21	Composição do Exemplo 7.4	48 h de CO2	5,8	8,2	68,2	27,4
7.22	Composição do Exemplo 7.4	72 h de CO2	5,7	9,4	65,9	28,3
7.23	Composição do Exemplo 7.4	0,5 h de ar	5,8	9,2	89,0	4,5
7.24	Composição do Exemplo 7.4	1 h de ar	5,7	12,4	85,9	4,4
7.25	Composição do Exemplo 7.4	2 h de ar	5,9	18,0	80,5	4,3
7.26	Composição do Exemplo 7.4	3 h de ar	5,6	20,7	77,9	4,3
7.27	Composição do Exemplo 7.4	24 h de ar	5,8	24,3	69,3	9,1
7.28	Composição do Exemplo 7.4	48 h de ar	5,7	25,4	64,3	13,9
7.29	Composição do Exemplo 7.4	72 h de ar	5,7	26,8	62,2	14,3

[000116] Como pode ser visto a partir dos resultados na Tabela 1 as composições da invenção, em que o veículo de oxigênio é carregado com CO, não apenas pode ser armazenadas durante um londo tempo sem a formação de metemoglobina, mas ainda são capazes de substituir o CO de ligação por O2 quando é oferecido ao veículo de oxigênio carregado. Se exposto a 100% de O2 (exemplos de 7.9 a 7.15) a saturação de O2 das hemoglobina aumenta muito rápido.

[000117] Se a composição é exposta a CO2, representando a saturação no interior de tecido ativo via mamífero, uma quantidade aumentada de metemoglobina é formada (exemplos de 7.16 a 7.22).

[000118] A pressão parcial de O2 no ar é apenas de cerca de 21%, deste modo de acordo com a curva de saturação de O2 da hemoglobina mostrada na Figura 1, a saturação de O2 possível maxima de hemoglobina com oxigênio sob o ar é de cerca de 29%. Considerando os Exemplos de 7.23 a 7.29 o resultado surpreendente é que dentro de 3 horas a composição exposta ao ar é carregada com 20,7% de oxigê

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34/34 nio, mas ainda tem um teor muito baixo de metemoglobina. Quando os ferimentos externos são tratados, a composição é pulverizada à superfície do ferimento (limpa) e fica em contato com o ar.

[000119] Estes resultados mostram que uma composição de acordo com a Invenção compreende um veículo de oxigênio estabilizado que após vários meses de armazenamento permite o elevado transporte de oxigênio quando está em contato com o ar.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição contida em uma lata de aerossol, de preferência em uma lata de aerossol embalada por pressão, caracterizada pelo fato de que compreende:

(a) um veículo de oxigênio, que é hemoglobina ou mioglobina, sendo que em pelo menos 40% do referido veículo de oxigênio, o sítio de ligação de oxigênio é carregado com monóxido de carbono, e (b) pelo menos um outro ingrediente, selecionado dentre eletrólito(s), conservante(s), estabilizante(s), antifloculante(s), anticoagulante(s), agente(s) de tamponamento de pH, solvent (s), antioxidante(s), agente(s) de formação de película ou agente(s) de reticulação.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma solução orgânica ou aquosa.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais preferido pelo menos 70%, até menos mais preferido pelo menos 80%, particularmente preferido pelo menos 90%, do veículo de oxigênio é fornecido na forma carregada com monóxido.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o veículo de oxigênio é hemoglobina ou mioglobina de ocorrência natural de origem humana ou animal, ou é hemoglobina ou mioglobina artificialmente tratada, reticulada or modificada de origem humana ou animal.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é fornecida na forma esterilizada.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o teor de vírus da dita composição é inferior a 10, de preferência, inferior a 5, mais preferivelmente, inferior a 2, partículas de vírus por mL, e ainda mais preferi

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2/3 do, 0.
7. Processo para preparação de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que:

(i) o veículo de oxigênio é carregado com o ligante de proteção durante ou após o isolamento de seu ambiente natural;

(ii) pelo menos um outro ingrediente (b) é adicionado;

(iii) a composição é opcionalmente esterilizada; e (iv) a composição é embalada, de preferência em uma lata de aerossol.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é esterilizada na etapa (iii) por meio de aquecimento, filtragem, centrifugação, adição de conservantes, aplicação de vapor, aplicação de gás ou aplicação de UV, ou uma combinação de pelo menos dois deles.
9. Processo para purificação um veículo de oxigênio, que é hemoglobina ou mioglobina, para preparação de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, a partir do sangue total, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a. separar o plasma do sangue total;

b. lisar as células vermelhas do sangue;

c. carregar o veículo de oxigênio com monóxido de carbono;

d. aquecer a amostra a uma temperatura na faixa de 40 a 85°C;

e. separar o veículo de oxigênio de quaisquer componentes não desejados do sangue, sendo que a etapa (e) inclui pelo menos uma etapa de filtragem.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracteri

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3/3 zado pelo fato de que a filtragem, na etapa (e), compreende o uso de um filtro estéril e/ou um filtro de vírus.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o dito veículo de oxigênio é preparado de acordo com o processo, como definido na reivindicação 9 ou 10.
12. Uso de hemoglobina ou mioglobina, purificada por um processo, como definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um agente ou composição para o tratamento externo de ferimentos.