ES2593530T3

ES2593530T3 - Aerosol para heridas

Info

Publication number: ES2593530T3
Application number: ES12743076.7T
Authority: ES
Inventors: Michael Sander; Harald Pötzschke
Original assignee: SASTOMED GmbH
Current assignee: SASTOMED GmbH
Priority date: 2011-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2016-12-09
Anticipated expiration: 2032-07-23
Also published as: PL2550973T3; CN108752468B; EP2550973A1; CA2842487C; BR112014001309B1; EP2734223B1; KR20140045498A; CN103781488A; BR112014001309A2; AU2012289237A1; US10471175B2; WO2013013799A1; IL230160A; MY165035A; ES2432075T3; US11116868B2; PE20141577A1; US20160228602A1; NZ619177A; JP5995970B2

Abstract

Un contenedor de aerosol, preferiblemente un contenedor de aerosol envasado a presión, que contiene una composición que comprende (a) un portador de oxígeno, que es hemoglobina o mioglobina, en donde en al menos un 40 % de dicho portador de oxígeno el sitio de unión a oxígeno está cargado con monóxido de carbono y (b) al menos un ingrediente adicional, seleccionado de electrolito(s), conservante(s), estabilizador(es), antifloculante(s), anticoagulante(s), agente(s) de tamponador(es) del pH, disolvente(s), antioxidante(s), agente(s) formadores de película o agente(s) reticulante(s).

Description

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DESCRIPCION

Aerosol para heridas

La presente invencion se refiere a una composicion, que comprende hemoglobina o mioglobina en la que, en al menos el 40 % de dicha hemoglobina o mioglobina, el sitio de union de ox^geno esta cargado con un ligando que no es O2, y al menos un ingrediente adicional, un metodo para la preparacion de dicha composicion y hemoglobina o mioglobina cargada con un ligando que no es oxigeno para su uso en el tratamiento externo de heridas. Se utilizan diferentes metodos para el tratamiento de heridas, en funcion de su estado. En primer lugar, una herida que todavia esta abierta preferiblemente deberia ser desinfectada y de ese modo protegida frente a influencias externas negativas. Esto se puede hacer por medio de soluciones desinfectantes adecuadas o vendajes de aerosol o tambien mediante la aplicacion de una solucion de yodo. La verdadera curacion de las heridas debe entonces producirse desde el interior. Esto significa que los vasos sanguineos que todavia estan en el lugar deben suministrarle al tejido destruido suficientes cantidades de materiales, de manera que el mecanismo de reparation del tejido pueda empezar.

Las heridas pueden ser causadas por diversos factores, como por ejemplo, lesiones o tambien despues de operaciones o traumatismos.

Por otra parte se sabe que la formation de heridas, particularmente tambien heridas cronicas, pueden ser provocadas asimismo por enfermedades, en las que se produce la degeneration y/o la constriction de los vasos sanguineos grandes y/o pequenos. Esto puede ser el resultado, por ejemplo en el caso de pacientes de edad avanzada, de estancias prolongadas en cama (decubito) o de la diabetes mellitus que pueden dar lugar a degeneracion y arteriosclerosis (P. Carpenter, A. Franco, Atlas der Kapillaroskopie [Atlas de Capilaroscopia], 1983, Abbott, Max-Planck-Inst. 2, D-Wiesbaden) de los vasos sanguineos grandes y pequenos (macroangiopatia y microangiopatia de las arterias). Tambien se demostro que una deficiencia de oxigeno (hipoxia) esta presente en el area de la herida. Se considera que 40 mmHg es un valor critico (C.D. Muller y colaboradores, Hartmann Wund [Wound] Forum 1 (1999), 17-25).

La sangre fluye a los tejidos, incluyendo la piel, a traves de las arterias y suministra a las celulas materiales necesarios para la vida. Cualquier degeneracion de los vasos sanguineos resulta en un suministro deficiente de materiales a las celulas, que conduce a su muerte. Los materiales deben atravesar el ultimo espacio, aparentemente insignificante de aproximadamente 20 |jm, desde los vasos sanguineos mas pequenos (capilares) hasta las celulas por difusion; a este respecto, el oxigeno desempena un papel especial, ya que es dificil para el organismo manejar este material.

Hay tres problemas principales implicados:

(1) Es cierto que el oxigeno es absolutamente esencial para la vida (un ser humano experimenta muerte cerebral despues de solo aproximadamente cinco minutos sin que su cerebro reciba oxigeno), pero al mismo tiempo, el oxigeno es altamente toxico (un recien nacido que recibe tratamiento de respiration con oxigeno puro morira despues de solo unos pocos dias).

(2) El oxigeno tiene muy poca solubilidad en un medio acuoso. Esto da como resultado, segun la primera ley de FICK, una velocidad de difusion mas baja de oxigeno. Ademas, hay una ley fundamental de la difusion, esto es, la ley de SMOLUCHOWSKI y la ley de EINSTEIN, que indica que la velocidad de difusion (de oxigeno) disminuye con un aumento de la distancia de difusion. Ahora, la constante de difusion de oxigeno es tan baja que la velocidad de difusion a una distancia de difusion tan pequena como 20 jm, es solo el 5 % del valor inicial. Una capa de agua de por ejemplo 50 jm, representa un aislamiento de las celulas casi total frente al oxigeno. El oxigeno es transportado a lo largo de largas trayectorias en el organismo, desde los pulmones a las puntas de los dedos de los pies con el torrente sanguineo, unido a la hemoglobina, y solo de esta manera es capaz de superar las largas distancias de un modo que resulta adecuado para el organismo.

(3) Para el oxigeno, al contrario que con la glucosa, por ejemplo, no hay un area de almacenamiento en el cuerpo, por lo tanto, este material debe de estar a disposition de las celulas en todo momento y de forma rapida, en una cantidad suficiente; el oxigeno es un denominado material de uso inmediato necesario para la vida.

Un organismo intacto ha resuelto estos problemas mediante el uso de varios mecanismos. Los efectos toxicos del oxigeno se evitan de tal manera que, este ultimo se une a la hemoglobina durante el transporte y de este modo permanece inofensivo. Al mismo tiempo, el oxigeno libre se diluye y de este modo pierde ademas su potencial oxidativo perjudicial. Sin embargo, puesto que la union a la hemoglobina es reversible, esta disponible instantaneamente en una cantidad suficiente. El problema del rango de difusion bajo se soluciona de tal manera que el organismo ha desarrollado una red de vasos sanguineos muy finamente ramificada (red capilar), que asegura que como media, cada celula esta a una distancia de como maximo 25 jm de un capilar; de esta manera, la trayectoria de difusion de oxigeno en el organismo se mantiene por debajo de la longitud critica de 50 jm. Ademas, a una celula se le puede suministrar oxigeno mediante difusion desde varios lados; esto representa un mecanismo de

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seguridad. La disponibilidad inmediata, de conformidad con la demanda (al ox^geno no se le permite estar disponible en exceso, de lo contrario tendria un efecto perjudicial) se logra en el organismo por medio de la regulacion vascular del flujo de los vasos sanguineos, que controla la perfusion y con ello optimiza el suministro de oxigeno.

Si hay una superficie de herida abierta, el suministro de oxigeno a las celulas se interrumpe. El suministro de oxigeno desde el aire exterior es pobre porque sobre la superficie celular (de tejido) se encuentra una pelicula de liquido acuoso, el cual, como se explica, forma una barrera para la difusion del oxigeno. Heridas frescas en tejido normal se curan en pocos dias si el suministro de oxigeno desde abajo, es decir, desde el interior, es suficiente. Sin embargo, se ha demostrado en experimentos con animales que incluso heridas frescas curan mejor si la concentracion de oxigeno del aire circundante se incrementa (M.P. Pai y colaboradores, Sug. Gyn. Obstet. 135 (1972), 756-758). Heridas mas viejas, en particular heridas cronicas, se conoce que curan de una forma muy lenta, si acaso lo hacen, debido a su deficiencia en oxigeno.

Para curar mejor heridas cronicas, se ha utilizado tambien la denominada terapia de oxigeno hiperbarico (HBO). En este tratamiento, los pacientes se colocan en camaras presurizadas, donde son sometidos a un exceso de presion de oxigeno puro de aproximadamente 3 bar durante un cierto periodo de tiempo (C.D. Muller y colaboradores, Hartmann Wund Forum 1 (1999), 17-25). De hecho, la curacion de heridas puede mejorarse por este metodo. Sin embargo, el efecto disminuye con el numero de tratamientos.

La patente de EE.UU. No. 2,527,210 describe una solucion de hemoglobina que supuestamente se puede utilizar para el tratamiento de heridas, tanto por via intravenosa y por via topica, por ejemplo mediante pulverizacion. En esta descripcion, la hemoglobina se obtiene de los eritrocitos frescos que son sometidos a congelacion de choque despues de una centrifugacion y de extraer la fraccion de plasma de la sangre. Esto da como resultado la lisis celular, y la hemoglobina se libera. Las paredes celulares lisadas tambien estan presentes en el producto. Esta formulacion es un detrito celular concentrado (fragmentos de celulas). De esta manera, se supone un efecto antiseptico de recubrimiento, tal como se consigue con solucion de yodo, despues de haber anadido 5 % de sulfuro de sodio. En otras palabras, la herida se cierra simplemente. El transporte de oxigeno no se menciona alli.

El documento WO 97/15313 describe el uso terapeutico de la hemoglobina para la mejora de la curacion de heridas. Para este proposito, la hemoglobina libre de estroma y pirogenos se administra por via intravenosa a los pacientes, en particular despues de las operaciones y sucesos traumaticos para aumentar la presion de la sangre. En particular, para este proposito se utiliza una hemoglobina reticulada con diaspirina.

El documento WO 2003/077941 ensena el tratamiento de heridas abiertas con una solucion de hemoglobina que comprende hemoglobina aislada y, opcionalmente, reticulada. Las soluciones se preparan frescas con hemoglobina de sangre de cerdo y se aplican a heridas cronicas.

Durante la preparacion y el almacenamiento de portadores de oxigeno sobre la base de hemoglobina o mioglobina, estos pueden perder parcial o completamente su funcionalidad. Para evitar esto es deseable estabilizar los portadores de oxigeno para que permanezcan utilizables y capaces de transportar oxigeno.

En general, existen diferentes aproximaciones a la preparacion de portadores de oxigeno artificiales; uno de ellos es la preparacion de soluciones adecuadas de hemoglobinas naturales o quimicamente modificadas (ver "Cuestiones del V Simposio Internacional de Sustitutos de Sangre, San Diego, California, EE.UU., Marzo de 1993", Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnogy 22 (1994), vol.2 - vol.4). Un problema en el manejo de dichas preparaciones farmaceuticas como portadores de oxigeno artificiales, es su creciente inactivacion por oxidacion espontanea a metahemoglobina, la cual ya no es capaz de transportar oxigeno. Esto ocurre por lo general durante la preparacion por el fabricante y el posterior almacenamiento.

Se describen varias aproximaciones para resolver este problema. O bien se trata de minimizar el grado de oxidacion de la hemoglobina, o de reducir la hemoglobina oxidada a su estado anterior.

Una posibilidad para la prevencion de la oxidacion espontanea es la desoxigenacion de la hemoglobina (es decir, la eliminacion de todo el oxigeno de la preparacion), ya que la desoxihemoglobina se oxida de forma mucho mas lenta a metahemoglobina que la oxihemoglobina.

Ademas, es posible minimizar la cantidad de oxidacion por almacenamiento y/o preparacion a la menor temperatura posible (para soluciones acuosas, a aproximadamente 4 °C).

Ademas, la tasa de oxidacion de la hemoglobina depende de la concentracion de iones hidrogeno, es decir, del pH. Por ejemplo, para la hemoglobina humana nativa hay un minimo en el intervalo entre pH 7,5 y 9,5.

Tambien, la adicion de ciertos alcoholes puede disminuir la oxidacion de la hemoglobina. Algunos de ellos funcionan incluso en bajas concentraciones. Un problema es la toxicidad de estos alcoholes.

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Ciertos iones metalicos (Cu2+, Fe3+, etc.) catalizan la oxidacion espontanea de la hemoglobina. Pueden resultar ineficaces por formacion de complejos con EDTA (acido etilendiaminotetraacetico), aunque en s^ EDTA promueve la oxidacion espontanea de la hemoglobina.

La proteccion de los portadores de ox^geno artificiales frente a la oxidacion puede lograrse ademas mediante la adicion de sustancias reductoras. Bajo ciertas circunstancias, incluso dar lugar a una reactivacion de la hemoglobina oxidada.

El documento EP 0 857 733 describe que la hemoglobina puede ser estabilizada mediante la union de un ligando al sitio de union del oxigeno, en particular monoxido de carbono. Se ha encontrado que una carbonilhemoglobina de este tipo se puede aplicar a un organismo sin que se desuna el ligando y es adecuado como un portador de oxigeno en el interior de la corriente sanguinea.

El objetivo de la presente invencion es proporcionar un producto para el tratamiento externo de heridas, lo que aumenta la curacion de la herida, que sea de facil manejo y almacenable.

Este objetivo se alcanza, segun la invencion, mediante una composicion, que comprende

(a) un portador de oxigeno, que es hemoglobina o mioglobina, en el que en al menos el 40 % de dicho portador de oxigeno, el sitio de union de oxigeno esta cargado con monoxido de carbono, y

(b) al menos un ingrediente adicional, seleccionado de electrolito(s) conservante(s), estabilizante(s), anti- floculante(s), anticoagulante(s), agente(s) tamponadores del pH, disolvente(s), antioxidante(s), agente(s) formador(es) de pelicula y agente(s) de reticulacion, caracterizado por que la composicion se proporciona en un contenedor de aerosol, preferiblemente en un contenedor de aerosol envasado a presion:

y un portador de oxigeno, que es hemoglobina o mioglobina cargada en su sitio de union de oxigeno con monoxido de carbono para su uso para el tratamiento externo de heridas.

De acuerdo con la invencion, se utiliza un portador de oxigeno, que es hemoglobina o mioglobina o un derivado modificado de las mismas, o mezclas de las mismas. La hemoglobina de origen humano o animal, en particular de origen equino, bovino o porcino preferiblemente, es particularmente adecuada para la presente invencion. Como portador de oxigeno se prefiere particularmente la hemoglobina humana o porcina, que es natural o modificada como se describe a continuacion. El portador de oxigeno puede ser recien aislado de la sangre humana o animal o puede prepararse artificialmente.

Tambien se pueden utilizar las mezclas de portador de oxigeno natural y modificado, tal como, por ejemplo, en una proparte de 20:1 a 1:20, con referencia al peso. Ademas, las mezclas de hemoglobina y mioglobina, o sus derivados modificados pueden usarse en la proparte antes mencionada de 20:1 a 1:20.

En una realization particular adicional el portador de oxigeno puede ser modificado. La modification puede ser una reticulacion intramolecular, polimerizacion (reticulacion intermolecular), pegilacion (union covalente con oxidos de polialquileno), modificacion con efectores reactivos quimicamente, tal como piridoxal-5'-fosfato o 2-nor-2-formil- piridoxal-5'-fosfato, o tambien con efectores no reactivos quimicamente del enlace oxigeno, tal como 2,3- bisfosfoglicerato, hexafosfato de inositol, hexasulfato de inositol o acido melitico, o una combination de los mismos. Tales modificaciones son conocidas y se describen, por ejemplo, en DE-A 100 31 744, DE-A 100 31 742, y DE-A 100 31 740. La reticulacion de los portadores de oxigeno tambien se describe en DE 197 01 37, EP 97 1000790, DE 44 18 937, DE 38 41 105, DE 37 14 351, DE 35 76 651.

Ejemplos de portadores de oxigeno modificados son hemoglobinas que tienen un peso molecular de 65.000 a 15.000.000, tal como moleculas intramolecularmente reticuladas segun el documento WO 97/1531, en particular productos polimericos, asi como productos intermolecularmente reticulados que tienen un peso molecular medio de 80.000 a 10.000.000 g/mol, particularmente 100.000 a 5.000.000, o mioglobinas producidas analogamente que tiene un peso molecular de 16.000 a 5.000.000, particularmente de 100.000 a 3.000.000, preferiblemente de 1.000.000 g/mol. Se pueden utilizar aquellos portadores de oxigeno que son polimerizados, por ejemplo, usando agentes de reticulacion conocidos para modificacion intermolecular, tales como agentes de reticulacion bifuncionales como diepoxido de butadieno, divinilsulfona, diisocianato, en particular diisocianato de hexametileno, diisocianato de ciclohexilo, y acido 2,5-bisisocyianatobenzol sulfonico, ester de di-N-hidroxi succinimidilo, diimidoester, o dialdehido, especialmente glioxal, aldehido glicolico que reacciona de manera analoga, o glutardialdehido.

Ademas, se pueden utilizar productos que son polimerizados de esta manera y pegilados con un polietilenglicol o derivados adecuados del mismo. Esto incluye, por ejemplo, oxido de polietileno, oxido de polipropileno, o un copolimero de oxido de etileno y oxido de propileno, o un ester, eter, amida ester del mismo. Puede ser adecuado si el oxido de polialquileno unido covalentemente tiene una masa molar de 200 a 5000 g/mol.

Para la union covalente de los oxidos de polialquileno, pueden ser adecuados aquellos derivados de oxido de polialquileno que contienen un agente de union ya unido covalentemente con un grupo funcional, permitiendo de ese

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modo una reaccion quimica directa con amino, alcohol o grupos sulfihidrilo de las hemoglobinas, formando uniones covalentes de los oxidos de polialquileno, por ejemplo, oxidos de polialquileno con ester de N-hidroxi succinimidilo, epoxi (eter de glicidilo), Idehide, isocianato, vinilsulfona, iodoacetamida, formiato de imidazolilo, grupos tresilato, y otros, reactivos. Muchos de estos polietilenglicoles activados monofuncionalmente estan disponibles comercialmente.

Si se utilizan portadores de oxigeno modificados, se prefieren, modificados por reticulacion (intramolecular o intermolecular), o productos de hemoglobina reticulados y pegilados que tienen un peso molecular medio de 250.000 a 750.000 productos g/mol, o productos de mioglobina que tiene un peso molecular medio de 50.000 a 750.000 g/mol.

De acuerdo con la forma de realizacion preferida particular, la hemoglobina o mioglobina de origen humano o animal recien aislada, en particular, de origen porcino se utiliza para la preparacion de la composicion de la invencion.

Segun la presente invencion, al menos 40 % de los sitios de union de oxigeno del portador de oxigeno estan cargados con monoxido de carbono.

Preferiblemente, al menos 50 %, preferiblemente al menos 60 %, mas preferido al menos 70 %, incluso mas preferido al menos 80 %, particularmente preferido al menos 90 % o 95 % de la hemoglobina o mioglobina se proporciona en forma cargada con ligando. Esta carga puede aplicarse ya durante el aislamiento del portador o despues de su purificacion adicional, sin embargo, se prefiere en particular llevar a cabo el aislamiento del portador de oxigeno en su forma protegida, lo que significa que durante el aislamiento o la purificacion el ligando se proporciona / o contacta con el portador de oxigeno.

El monoxido de carbono tiene una alta afinidad por el/los sitio(s) de union de O2 de la hemoglobina/mioglobina y sirve como un protector frente a la oxidacion del ion central Fe3+ del hemo.

El o los portador(es) de oxigeno cargado esta/estan preferiblemente disuelto(s) en un medio acuoso u organico, prefiriendose una solucion acuosa, en una cantidad de 0,1 a 35 % en peso, preferiblemente de 0,1 a 20 % en peso, mas preferiblemente de 0,1 a 15 % en peso, para estar listas para su aplicacion.

La composicion de acuerdo con la presente invencion comprende ademas al menos un aditivo adicional, preferiblemente seleccionado del grupo que comprende electrolito(s), estabilizante(s), anti-floculante(s), conservante(s), agente(s) tamponadores del pH, disolvente(s), antioxidante(s) y agente(s) formadores de pelicula, mas preferiblemente seleccionado de electrolito(s), estabilizante(s), anti-floculante(s), conservante(s) y agente(s) tamponadores del pH. Lo mas preferido es que la composicion este en forma de una solucion y comprenda al menos un electrolito y, opcionalmente, un estabilizador.

La solucion puede comprender electrolitos fisiologicamente compatibles, tales como sales, en cantidades adecuadas o deseadas. Los electrolitos pueden estar presentes en cantidades del 0,1 al 30 % en peso, preferiblemente del 0,1 al 10 %, pero preferiblemente estan presentes en una concentracion fisiologica, respectivamente. Preferiblemente, la composicion comprende una sal en las cantidades antes mencionadas, como por ejemplo, NaCl, KCl, NH4Cl, CaCO3, Na2CO3, K2CO3, MgSO4, Na2SO4, CaCh, MgCh, citrato de sodio, lactato de sodio o mezclas de los mencionados o similares, sin estar restringida a estos ejemplos. La sal mas preferida es NaCl, en particular en una concentracion del 0,9 % (solucion isotonica).

De acuerdo con la invencion, se prefiere particularmente que la composicion comprenda un compuesto que actue como un estabilizador y/o anti-floculante para proteinas, en particular, para la hemoglobina / mioglobina, tales como N-acetil cisteina, cisteina, N-actil metionina, metionina, sales no caotropicas, polioles, tales como azucares, preferiblemente disacaridos, y aminoacidos, preferiblemente cada uno en cantidades del 0,001 % en peso al 20 % en peso.

Los polioles que se pueden emplear son preferiblemente polioles de bajo peso molecular aunque se pueden emplear derivados polimericos. Dichos polioles incluyen etilenglicol, glicerol, eritritol y manitol. Los polioles ciclicos que pueden ser empleados incorporan uno o mas anillos aliciclicos y pueden tener al menos una cadena lateral. Los polioles preferidos incluyen disacaridos y alcoholes de azucar, por ejemplo lactitol, sorbitol e inositol. Se prefieren los compuestos que tienen de 2 a 10 grupos hidroxilo. La cantidad del poliol puede estar en el intervalo preferido del 0,001 al 20 %, mas preferiblemente del 1 al 15 %, y lo mas preferiblemente del 2 al 10 % p/v.

Ademas el aditivo estabilizador de proteinas puede ser seleccionado de un compuesto de tris(hidroximetil)metilo de formula 1; (HOCH2)3C-R (1) en la que R es: alquilo C1-C4, alquilo C1-C4 sustituido, NH2, NHC(CH2OH)3, hidroxialquilo C1-C4; carboxilato de alquilo C1-C4, NR1R2 (en la que R1 y R2 pueden ser de forma independiente: H, alquilo C1-C4, sulfonato de alquilo C1-C4, sulfonato de hidroxialquilo C1-C4). Ejemplos de compuestos preferidos de formula (1) incluyen: tris(hidroximetil)etano; 1,1',1"-tris(hidroximetil)propano; tris(hidroximetil)aminometano o sales de los mismos, por ejemplo, cloruro, maleato, fosfato, sales de succinato; 1,3 bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano; bis(2- hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano; sulfonato de N [tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetano; sulfonato de N

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[tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropano; sulfonato de N [tris(hidroximetil)metil]-3-amino-2-hidroxipropano; N [tris(hidroximetil)metil]-glicina. Estos compuestos tambien se pueden anadir en el intervalo preferido del 0,001 al 20 % mas preferiblemente del 1 al 15 %, y lo mas preferiblemente del 2 al 10 % p/v.

Ademas el aditivo estabilizador de proteinas se puede seleccionar de un polielectrolito. El polielectrolito puede ser un polielectrolito cationico o anionico. Polielectrolitos anfoteros tambien pueden emplearse. El polielectrolito cationico es preferiblemente un polimero con grupos cationicos distribuidos a lo largo de la cadena molecular.

Los grupos cationicos, que son preferiblemente funciones derivadas de amonio cuaternario, pueden estar dispuestos en grupos laterales colgantes de la cadena o se pueden incorporar en ella. Ejemplos de polielectrolitos cationicos incluyen: Copolimeros de vinil pirrolidona y metacrilato de metilo cuaternario, por ejemplo, series Gafquat (755N, 734, HS-100) obtenidos de ISP; poliacrilamidas sustituidas; polietilenimina, polipropilenimina y derivados sustituidos; homopolimeros de poliamina (Golchem CL118); copolimeros de poliamina (por ejemplo, condensados de epiclorhidrina y mono- o dimetilamina); cloruro de polidialil dimetil amonio (poliDADMAC); dextranos sustituidos; goma guar modificada (sustituida con cloruro de hidroxipropiltrimonio); proteinas sustituidas (por ejemplo, grupos cuaternarios sustituidos en proteina de soja y colageno hidrolizado); poliaminoacidos (por ejemplo, polilisina); compuestos poliamino de bajo peso molecular (por ejemplo, espermina y espermidina). Se pueden emplear polimeros naturales o artificiales.

Se pueden emplear polielectrolitos cationicos con pesos moleculares de 150 a 5.000.000, preferiblemente de 5.000 a 500.000, mas preferiblemente de 5.000 a 100.000. Se prefiere una cantidad del 0,01 al 10 %, mas preferiblemente del 0,1 al 2 %, especialmente del 0,05 al 5 % p/v.

El polielectrolito anionico preferiblemente es un polimero con grupos anionicos distribuidos a lo largo de la cadena molecular. Los grupos anionicos, que pueden incluir carboxilato, sulfonato, sulfato u otros agrupamientos grupos ionizables cargados negativamente, se pueden disponer sobre grupos colgantes de la cadena o unidos directamente a la cadena principal del polimero. Se pueden emplear polimeros naturales o artificiales.

Ejemplos de polielectrolitos anionicos incluyen: Gantrez (Sseries, AN-series), acido alginico y sales; carboximetil celulosas y sales; poliacrilamidas sustituidas (por ejemplo, sustituidas con grupos acidos carboxilicos); acidos poliacrilicos y las sales; acidos sulfonicos de poliestireno y sales; sulfatos de dextrano; sacaridos sustituidos, por ejemplo octosulfato de sacarosa; heparina. Se pueden utilizar polielectrolitos anionicos con pesos moleculares de 150 a 5.000.000, preferentemente 5.000 a 500.000, mas preferiblemente de 5.000 a 100.000. Se prefiere una cantidad del 0,01 % al 10 %, especialmente del 0,05 al 5 %, y mas especialmente del 0,1 al 2 % p/v.

Un estabilizante preferido en particular es N-acetil cisteina en una cantidad del 0 al 10 %, preferiblemente del 0,01 al 5 %.

Ademas, la composicion puede contener cualquier conservante como por ejemplo, fenoxietanol, isotiazolina, acido sorbico o cualquier otro conservante adecuado conocido para las personas expertas en la materia.

La composicion puede comprender ademas, preferentemente cualquier agente tampon. Todos los tampones conocidos comunmente puede ser utilizados, como Tris/HCl, K2HPO4/KH2PO4, Na2HPO4 /NaH2PO4, MOPS (acido 3- (N-morfolino)propansulfonico), HEPES (acido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetansulfonico), TAPS (acido 3-{[tris (hidroximetil)metil]amino}propansulfonico), Bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), Tricina (N-tris(hidroximetil) metilglicina), TES (acido 2- {[tris(hidroximetil)metil]amino}etansulfonico), PIPES (piperazina-N,N'-bis(acido 2- etansulfonico)), SSC (citrato sodico salino), MES (acido 2-(N-morfolino)etansulfonico) sin limitarse a estos.

Los disolventes adecuados en la composicion segun la invencion son preferiblemente agua o soluciones acuosas, disolventes organicos como el alcohol, preferiblemente etanol, o polietilenglicol (PEG). Tambien pueden utilizarse mezclas de dichos disolventes. Ademas aceites naturales pueden ser utilizados como un disolvente para algunos de los ingredientes y la composicion puede proporcionarse como una emulsion. Un disolvente particularmente preferido es agua o una solucion acuosa.

Los antioxidantes utiles para la presente composicion puede ser, por ejemplo, vitamina C, vitamina E, flavonoides, carotenoides, o sales o derivados de los mismos.

Agentes formadores de pelicula preferidos son aquellos agentes comunmente usados en aplicacion cosmetica, como por ejemplo, acrilamida/sodio, copolimero de acrilato, copolimero de acrilatos/acrilamida, butil ester de copolimero PVM/MA, carboximetil quitina, quitosan, hidroxipropil celulosa, Polyquaternium-36, PVP, copolimero de PVP/VA, copolimero de VA/crotonatos o copolimero de vinilo caprolactama/PCP/metacrilato de dimetilaminooctilo.

Todos los aditivos mencionados anteriormente pueden estar presentes en una cantidad del 0 al 20, preferiblemente del 0,001, 0,01, 0,05 o 0,1 al 10, mas preferiblemente del 0,5 al 5 % (p/v), si no se indica lo contrario.

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Si se desea, pueden estar presentes aditivos adicionales, en particular en una cantidad del 0 al 20, preferiblemente del 0,1 al 20, preferiblemente del 0,2 al 15, especialmente del 0,5 al 10 % en peso. Los aditivos preferidos son nutrientes para las celulas. Estos pueden ser seleccionados de glucosa, por ejemplo, en cantidades del 0,1 al 5 % en peso, insulina en cantidades de hasta 25 lU/ml, los aminoacidos naturales, en particular cisteina, por ejemplo del 0,1 al 5 % en peso, o factores de tejido, tales como interleucinas en cantidades fisiologicas, hasta una cantidad de 10 veces la de los mismos.

Preferiblemente, la composicion representa una solucion acuosa que comprende

(a) un portador de oxigeno, preferiblemente hemoglobina o mioglobina, en la que en al menos el 40 % de dicho portador de oxigeno, el sitio de union de oxigeno esta cargado con un ligando que no es O2, y

(b) al menos un ingrediente adicional, seleccionado de electrolito(s) conservante(s), estabilizante(s), anti- floculante(s), anticoagulante(s), agente(s) tamponadores del pH, antioxidante(s), disolvente organico, agente(s) formador(es) de pelicula y agente(s) de reticulacion.

En una realizacion preferida de la presente invencion, la composicion comprende un portador de oxigeno, que se aisla de la sangre entera de un ser humano o animal, preferiblemente de cerdos.

En consecuencia, es un aspecto adicional de la invencion proporcionar un proceso para la purificacion de un portador de oxigeno utilizable para la composicion de la presente invencion a partir de sangre entera.

Para la preparacion de la composicion segun la realizacion preferida el portador de oxigeno se aisla de la sangre de un ser humano o animal y se purifica adicionalmente para presentarse esencialmente libre de plasma y constituyentes de la membrana celular.

Con "esencialmente libre" se quiere decir que el compuesto o composicion considerada no comprende mas del 20 %, preferiblemente no mas del 10 %, incluso mas preferiblemente no mas del 5 % y particularmente preferido no mas del 2 % o menos del 1 % del o de los compuesto(s) no deseado(s) mencionado(s).

La purificacion puede comprender cualquier medio o etapas de metodo adecuados, como por ejemplo, la lisis selectiva o precipitation, centrifugation, ultracentifugation, centrifugation fraccionada, metodos de cromatografia como la cromatografia de intercambio anionico, cromatografia de exclusion por tamano, cromatografia de afinidad o de adsorcion, cromatografia de filtration en gel o filtro molecular, o dialisis, sin estar limitada a estos ejemplos, con tal de que los metodos aplicados desnaturalicen lo menos posible el portador de oxigeno. Preferiblemente durante el aislamiento y purificacion el portador de oxigeno se mantiene esencialmente en solucion.

Cuando el portador de oxigeno esta aislado de la sangre entera, se prefiere que o bien las celulas que comprenden el portador de oxigeno sean separadas de otros componentes de la sangre o bien que dichas celulas se lisen selectivamente para suministrar el portador de oxigeno (soluble) a la solucion y, posteriormente, los componentes no solubles sean separados. Una combination de los dos metodos es asimismo adecuada. La lisis de las celulas que contienen el portador de oxigeno puede ser llevada a cabo por cualquier metodo adecuado de lisis, por ejemplo, lisis quimica, lisis osmotica, lisis mecanica, lisis termica o similar.

Los restos celulares se pueden separar por cualquier medio o metodo adecuado. Esto incluye por ejemplo, centrifugacion, filtracion, sedimentation y decantation, la dialisis o cualquier metodo similar.

Para separar las celulas no lisadas o los restos de celulas del portador de oxigeno disuelto un metodo comun es la sedimentacion del material solido. Por ejemplo se puede llevar a cabo una etapa de centrifugacion. La centrifugacion con 2 a 5000 x g por lo general es suficiente para sedimentar las celulas y restos celulares.

Para la sedimentacion de otros componentes no disueltos, por ejemplo, cualquier precipitado desarrollado durante el proceso de purificacion, en cualquier momento durante el proceso de purificacion se pueden llevar a cabo mas etapas de centrifugacion, en particular, etapas de centrifugacion utilizando fuerzas superiores, hasta ultracentrifugacion con hasta 6 x 10 g.

La purificacion de la solucion que contiene el portador de oxigeno, ademas o como una alternativa a cualquier etapa de centrifugacion, puede comprender al menos una etapa de filtracion, preferiblemente al menos dos, tres o mas etapas de filtracion. Esto puede llevarse a cabo ya sea mediante el uso de al menos uno, preferiblemente al menos dos, mas preferiblemente al menos tres filtros (si se utiliza mas de un filtro en la presente solicitud se utiliza el termino "cascada de filtros"), o por una, dos, tres o mas etapas de filtracion separadas.

Dicha cascada de filtros o de las diferentes etapas de filtrado pueden incluir dos, tres, cuatro, cinco filtros de tipo diferente, material diferente y/o diferentes tamanos de poro. Ademas un filtro de lecho profundo, como por ejemplo lana de vidrio o similares se puede usar, preferiblemente como un primer material de filtro para retener los desechos celulares gruesos. Si se utiliza mas de un filtro, se prefiere el uso de filtros que proporcionan diferentes diametros de poro en orden decreciente. Por ejemplo, si se utilizan tres filtros diferentes, el primer filtro (despues del filtro de lecho

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profundo) puede tener un tamano medio de poro de 1 a 0,5 jm, el segundo filtro puede tener un tamano de poro de 0,7 a 0,3 |jm y el tercero un poro tamano de 0,4 a 0,1 |jm, donde independientes de los intervalos que se solapan citados antes, el siguiente filtro, en cualquier caso, tiene un tamano de poro mas pequeno que el filtro anterior a este. Mediante dicha(s) etapa(s) de filtrado, se elimina esencialmente material solido y precipitado que tiene un tamano mayor que el tamano de poro de los filtros utilizados.

Ademas, en el proceso de purificacion se puede incluir una etapa de ultrafiltracion para purificar el o los portador(es) de oxigeno. Mediante una etapa tal de ultrafiltracion, macromoleculas no disueltas no deseadas se pueden separar. Preferiblemente, el limite de exclusion de tamano se selecciona para separar macromoleculas que son mas grandes (peso molecular mayor, mas alto) que los portadores de oxigeno deseados, y en consecuencia, dichas macromoleculas son retenidas por el filtro. Debido al peso molecular de la hemoglobina de aproximadamente 64.000 Dalton, el limite de exclusion de tamano del filtro de ultrafiltracion debe ser mayor. Para asegurarse de que el rendimiento de hemoglobina no se reduce en la etapa de ultrafiltracion, se prefiere seleccionar la exclusion de tamano del filtro a aproximadamente 100.000 Dalton, preferiblemente a aproximadamente 200.000 Dalton, mas preferiblemente a aproximadamente 300.000 Dalton, sin estar limitada a estos valores.

Adicionalmente o como una alternativa, se puede llevar a cabo cualquier etapa de cromatografia adecuada. Un tipo particularmente preferido de cromatografia es intercambio ionico o cromatografia de exclusion por tamano.

El mismo resultado puede obtenerse mediante una etapa de dialisis utilizando una membrana de dialisis que proporciona los limites de exclusion de tamano anteriormente mencionados, permitiendo que el portador de oxigeno pase, pero reteniendo las macromoleculas que tienen un tamano molecular mas alto.

Para reducir la cantidad de compuestos de bajo peso molecular en solucion se puede llevar a cabo una etapa de dialisis adicional utilizando una membrana de dialisis que tiene un limite de exclusion de tamano de aproximadamente 50.000 Dalton, permitiendo que las moleculas mas pequenas pasen, pero reteniendo el portador de oxigeno.

Para disminuir la contaminacion de virus y/o microorganismos en la composition se prefiere particularmente incluir una etapa de degradation de contenido de virus en el proceso de purificacion. El contenido de virus se reduce mediante esta etapa, preferiblemente a una carga de menos de 10, preferiblemente menos de 5, mas preferiblemente menos de 2 particulas de virus por ml, e incluso mas preferiblemente a 0. En esta etapa se prefiere que la solucion que comprende el portador de oxigeno, se pase a traves de un filtro de degradacion del contenido de virus ("filtro de virus"). Tales filtros son comunmente conocidos y disponibles en el mercado. Ejemplos son Sartorius Virosart® CPV, Planova® 15N, 20N, Millipore Viresolve® NFP o PALL Pegasus® Grado LV6, sin limitarse a estos. Alternativamente o adicionalmente, preferiblemente despues del paso a traves del filtro, se puede aplicar un tratamiento con luz UV, en particular la luz UV de una longitud de onda de 245 nm para eliminar cualquier virus restante. Opcionalmente, en cualquier etapa durante el proceso de aislamiento del portador de oxigeno se puede llevar a cabo al menos una etapa de calentamiento. Esta etapa comprende el calentamiento de la suspension o la solucion que contiene el portador de oxigeno durante el procedimiento de aislamiento a una temperatura en el intervalo de 40 a 85 °C, preferiblemente de 60 a 80 °C, mas preferiblemente en el intervalo de 65 a 75 °C. La etapa de calentamiento se lleva a cabo preferiblemente durante 10 minutos a 6 horas, preferentemente durante 20 minutos a 4 horas y lo mas preferido de 30 min a 3 horas y puede comprender varias temperaturas diferentes dentro del rango antes mencionado. De acuerdo con el procedimiento de la presente invention, se prefiere que el portador de oxigeno permanezca en solucion durante todo el proceso de purificacion. Ademas se prefiere que el portador de oxigeno permanezca en solucion durante todo el proceso de purificacion y durante la preparation de la composicion de la presente invencion. Esto significa que se prefiere que el portador de oxigeno no se precipite durante el procedimiento de la presente invencion y, por consiguiente conserve su estructura tridimensional natural como la que presenta en su entorno natural.

De acuerdo con la presente invencion, el procedimiento para purificar un portador de oxigeno de la sangre entera comprende al menos las etapas:

(a) separar el plasma de la sangre entera

(b) lisar los globulos rojos de la sangre

(c) cargar los portadores de oxigeno con el ligando

(d) calentar la muestra a una temperatura en el intervalo de 40 a 85 °C

(e) separar el portador de oxigeno de cualquiera de los componentes sanguineos no deseados, en el que la

etapa (e) incluye al menos una etapa de filtration.

Mediante estas etapas se obtiene una solucion que contiene un portador de oxigeno que puede ser utilizado para la preparacion de la composicion de la presente invencion. En particular, la solucion que contiene un portador de oxigeno obtenible mediante estas etapas puede ser concentrada a una cantidad deseada del portador de oxigeno y a esta solucion, se le anade/n, el al menos un ingrediente adicional(es) para obtener la composicion de la presente invencion.

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La etapa (a) del presente metodo se puede llevar a cabo mediante uno cualquiera de los metodos comunmente utilizados para separar el plasma de la sangre entera, preferentemente por centrifugacion o filtracion. Por centrifugacion durante aproximadamente 30 min a aproximadamente 2000 a 5000 rpm, por ejemplo, 4000 rpm, los globulos rojos de la sangre se sedimentan, mientras que los compuestos solubles y los globulos blancos de la sangre se quedan predominantemente en el sobrenadante. Mediante la repeticion de resuspension y sedimentacion de los globulos rojos de la sangre, por ejemplo de 2 a 5 veces, se puede aumentar la separacion de los globulos rojos de la sangre de los compuestos no deseados de sangre.

La etapa (b) se lleva a cabo preferentemente mediante la adicion de agua, preferiblemente agua destilada o un tampon sub-isotonico adecuado, preferiblemente un tampon de fosfato, a la sangre espesada de la etapa (a). Despues de romper los globulos rojos de la sangre con agua o con un tampon sub-isotonico, se anade preferiblemente una sal a la solucion / suspension para obtener la concentracion fisiologica de dicha sal en solucion. Preferiblemente se anade NaCl a una cantidad del 0,9 % en solucion.

La etapa (c) puede llevarse a cabo despues de la etapa (a), despues de la etapa (b), despues de la etapa (d) o despues de la etapa (e), pero se lleva a cabo preferiblemente al menos despues de la etapa (b). Se senala de forma particular que la etapa (c) no se lleva a cabo necesariamente de forma inmediata como la siguiente etapa despues de la etapa (b), sino que tambien puede llevarse a cabo o repetirse despues de la etapa (d), despues de la etapa (e) o de cualquier etapa de tratamiento. La carga del portador de oxigeno en la solucion / suspension puede llevarse a cabo mediante la introduccion de gas en la solucion / suspension, preferiblemente gas CO o NO o una mezcla de los mismos. En una realizacion preferida se introduce gas CO en la solucion / suspension por un periodo de tiempo lo suficientemente largo para obtener una saturacion > 90 % en la solucion / suspension, preferiblemente una saturacion > 95 %.

La etapa (d) puede llevarse a cabo despues de la etapa (a), despues de la etapa (b), despues de la etapa (c) o despues de la etapa (e), pero se lleva a cabo preferiblemente despues de la etapa (c). Ademas el calentamiento se puede repetir durante el procedimiento de aislamiento. Esta etapa comprende el calentamiento de la suspension o la solucion que contiene el portador de oxigeno durante el procedimiento de aislamiento a una temperatura en el intervalo de 40 a 85 °C, preferiblemente de 60 a 80 °C, mas preferentemente en el intervalo de 65 a 75 °C. La etapa de calentamiento se lleva a cabo preferiblemente durante 10 minutos a 6 horas, preferentemente durante 20 minutos a 4 horas y lo mas preferido de 30 min a 3 horas y puede comprender varias temperaturas diferentes dentro del rango antes mencionado.

En la etapa (e) el portador de oxigeno se purifica de otros ingredientes adicionales no deseados contenidos todavia en solucion, como celulas no lisadas, restos celulares, cualquier precipitado u otros ingredientes no solubles. Ademas el portador de oxigeno puede ser purificado adicionalmente mediante la separacion de, al menos parcialmente, compuestos solubles no deseados, como por ejemplo, macromoleculas solubles o compuestos solubles de bajo peso molecular.

En consecuencia, dicha etapa (e) puede incluir varias etapas individuales, como filtracion, ultrafiltracion, centrifugacion, ultracentrifugacion, cromatografia, dialisis utilizando diferentes tipos de membranas de dialisis que proporcionan diferentes limites de exclusion de tamano, etapas de lavado, concentracion del contenido de portador de oxigeno, etc. Cualquiera de los metodos citados anteriormente puede estar incluido en esta etapa de purificacion.

Preferiblemente, la etapa (e) comprende al menos una etapa de centrifugacion y/o al menos una etapa de filtracion. Por ejemplo, el lisado se puede centrifugar en una centrifugadora para separar las celulas y restos celulares restantes o se filtra por ejemplo, por una cascada de filtros como se describio anteriormente. Asimismo, el lisado se puede centrifugar primero y, posteriormente filtrar, o puede ser filtrado en una primera etapa a traves de un filtro de lecho profundo y, posteriormente, a traves de al menos un filtro o un filtro en cascada. Mediante la centrifugacion o el filtro de lecho profundo, se simplifica el manejo durante cualquiera de las siguientes etapas de filtrado debido a la menor cantidad de material que se sedimenta u obstruye el/los filtro(s). Si no se utiliza una cascada de filtros, se prefiere que al menos un filtro se utilice para permitir que se retenga esencialmente la totalidad de los materiales solidos contenidos en la suspension y permitir que pasen todos los componentes disueltos. En una forma de realizacion mas preferida, al menos uno de los filtro(s) utilizado(s) es capaz de retener asimismo microorganismos, actuando asi como filtro esteril. Ademas puede llevarse a cabo preferiblemente una etapa de ultrafiltracion y/o una etapa para disminuir el contenido de virus y/o microorganismos de la solucion. Por consiguiente, se prefiere que despues de la etapa (e) la solucion que contiene el portador de oxigeno este esencialmente libre de cualquier particula no disuelta, floculo o precipitado.

En la etapa (e), ademas de cualquiera de las etapas / metodos citados anteriormente, la solucion que comprende el portador de oxigeno deseado se puede lavar y/o concentrar. Por "lavado" se quiere decir que las moleculas mas pequenas que el portador de oxigeno deseado (que tienen un peso molecular inferior) se separan, preferiblemente mediante la adicion de la misma cantidad o un multiplo (por ejemplo 5 a 10 veces) de una solucion isotonica a la solucion que contiene el portador de oxigeno y despues de ello filtracion de la solucion obtenida (diluida) mediante un filtro que retiene el portador de oxigeno y permite que las moleculas mas pequenas pasen. Para el lavado de la solucion preferentemente se utiliza una solucion de NaCl al 0,9 %. La etapa de lavado se puede repetir 2 o 3 o 4 o 5

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o hasta 10 veces. Una realizacion preferida se ejemplifica mediante el uso de un filtro que tiene un limite de exclusion de tamano de 5000 Dalton, 10.000 Dalton o 20.000 Dalton, permitiendo que las moleculas mas pequenas pasen. En esta etapa la solucion que contiene el portador de oxigeno (preferiblemente despues del lavado) se puede concentrar hasta una concentracion deseada del portador de oxigeno, por ejemplo, a una concentracion de 50 g/l, 100 g/l o 200 g/l sin ser restringida a estas cantidades. Cualquier concentracion deseada se puede obtener ya sea mediante la concentracion por filtracion o mediante la adicion del 0,9 % de NaCl o una solucion isotonica similares.

La solucion que contiene el portador de oxigeno asi obtenida puede usarse a continuation para preparar la composition de la presente invention mediante la adicion de al menos un ingrediente adicional descrito arriba a la solucion en la cantidad deseada.

En una realizacion preferida, la composicion de la presente invencion se prepara mediante la adicion a la solucion que contiene el portador de oxigeno de al menos un conservante, preferiblemente un conservante farmaceuticamente aceptable como por ejemplo, fenoxietanol, parabenos, benzoato de sodio, alcohol bencilico, hexaclorofeno y un antioxidante y/o estabilizante como por ejemplo, N-acetilcisteina, octanoato de sodio, N-acetil-I- triptofanato, N-acetil-metioninato, vitamina E, vitamina C, metil prednisolona o manitol. Ademas cualquiera de los ingredientes adicionales descritos anteriormente puede ser anadido adicionalmente.

La composicion terminada puede ser esterilizado de nuevo, si se desea, por ejemplo, por calentamiento, filtracion, centrifugation, por la adicion de conservantes, aplicacion de vapor, la aplicacion de gas o aplicacion de UV o una combination de al menos dos de estas, preferentemente por una etapa adicional de filtracion esteril y preferiblemente se introduce en recipientes esteriles o bolsas esteriles para almacenamiento.

De acuerdo con una realizacion preferida, las bolsas esteriles son colocadas en un contenedor de aerosol para su uso posterior. Un ejemplo puede ser un sistema bolsa-en valvula (Bag-on-Valve), que comprende una bolsa, por ejemplo, una bolsa de aluminio laminado y un contenedor de aerosol de lamina de estano o aluminio. Debido a la separation de producto y propelente, el sistema bolsa-en-valvula se puede utilizar con aire comprimido o nitrogeno a una presion por ejemplo de 2 a 9 bar.

De acuerdo con la invencion, la composicion se utiliza preferiblemente para el tratamiento de heridas abiertas, preferiblemente heridas cronicas de seres humanos y animales, en donde se prefiere el uso para el tratamiento de seres humanos. El uso preferido es por tratamiento topico de la herida(s) con el/los portador(es) de oxigeno cargado(s) descritos.

Sorprendentemente, se ha encontrado que es posible tratar eficazmente heridas abiertas con dichos portadores de oxigeno cargados. Como se describio anteriormente la curacion de heridas cronicas a menudo se ve disminuida debido a la disminucion del suplemento de oxigeno. En consecuencia, parece logico que el tratamiento de las heridas requiera de portadores de oxigeno cargados de oxigeno para tratamiento. Sin embargo, de acuerdo con la presente invencion, se encontro que es posible obtener una curacion externa de herida positiva mediante la aplicacion de un portador de oxigeno cargado con CO. Sin estar ligado a ella, nuestra teoria es que debido a la presion parcial de oxigeno en el aire el ligando puede ser reemplazado por el oxigeno cuando se aplica a la herida y en consecuencia se refuerza la curacion de la herida.

La composicion de la presente invencion tiene la clara ventaja de una mayor estabilidad del portador de oxigeno debido a su estado no oxidado basado en la carga con el ligando CO que resulta en una buena preparation y estabilidad de almacenamiento. Ademas, la composicion es facil de aplicar y facil de manejar y proporciona un enfoque seguro y eficaz para mejorar la curacion de heridas mediante la facilitation de la difusion mediada por el portador / agente de oxigeno.

La composicion de la presente invencion se aplica externamente. Dependiendo del estado de la herida, se aplica preferiblemente pulverizada, sobre el area de la herida en forma de una pulverization fina.

De acuerdo con la invencion, se ha demostrado que las heridas abiertas, en particular tambien las heridas cronicas que tienen muy diferentes causas, pueden ser tratadas eficazmente. Estas pueden ser heridas despues de operaciones, despues de un traumatismo, despues de lesiones, heridas con mala curacion o heridas hipoxicas, o tambien heridas causadas por cambios degenerativos en el tejido. A este respecto, puede haber heridas causadas por cambios degenerativos de los vasos sanguineos arteriales y heridas que resultan de la insuficiencia venosa cronica. Estas incluyen particularmente decubito, asi como heridas cronicas, en particular aquellas que resultan de la diabetes. Otras heridas causadas por quemaduras (ya sea por el calor, por productos quimicos o por congelation) o por escaldado pueden ser tratadas eficazmente.

Figuras

La Figura 1 muestra la curva de saturation de O2 de la hemoglobina dependiente de la presion parcial del O2 circundante.

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Ejemplos

Ejemplo 1:

La hemoglobina se aislo a partir de sangre entera de cerdos mediante la separacion de los globulos rojos del suero, ruptura de los globulos rojos recogidos, sedimentation de restos de celulas, carga de la hemoglobina con CO mediante la introduction de gas CO hasta que se obtiene la saturation de la muestra de liquido, calentamiento de la solution, realization de varias etapas de filtracion, incluyendo una etapa de filtracion de virus y lavado de la solution de hemoglobina obtenida mediante la adicion de dos veces un volumen 2 veces mayor del 0,9 % de solucion salina y filtrado de la solucion.

Se preparo una composition lista para usar para el tratamiento de heridas, que comprende el 10 % de hemoglobina purificada y estabilizada, el 0,05 % de N-acetil cisteina y el 0,7 % de fenoxi etanol en NaCl al 0,9 %. La composicion se cargo de nuevo con gas CO, se separo en 10 partes y se envaso en un contenedor de aerosol, respectivamente.

Ejemplo 2:

Una primera parte de la composicion del Ejemplo 1 se utilizo inmediatamente despues de la preparation para el tratamiento de una paciente femenina (Diagnostico: Diabetes, Hipertension) con una herida cronica en el pie derecho (7x2cm). La herida se trato una vez al dia mediante pulverization de la composicion sobre la herida. Despues de 3 semanas los primeros signos de curacion eran visibles. En las siguientes semanas el proceso de curacion fue pronunciado y completo, obteniendose el cierre de la herida despues de 18 semanas.

Ejemplo 3:

Una segunda parte de la composicion del Ejemplo 1 se almaceno a 4 °C durante 2 anos despues de la preparacion y despues de ello, se utilizo para tratar una herida cronica de un paciente masculino que sufria de diabetes mellitus tipo II. La composicion se aplico a una ulcera cronica superficial (4x3cm) en la tibia izquierda del paciente. La herida se trato una vez al dia. Despues de 2,5 semanas la curacion se hizo visible; despues de 4 semanas la herida se curo mas del 50 % de la linea de base. En las siguientes semanas se observo una curacion rapida y el cierre completo de la herida se obtuvo despues de 8 semanas.

Ejemplo 4:

Una tercera parte de la composicion del Ejemplo 1 se almaceno a 10 °C durante 2 anos. Despues de ello se utilizo para el tratamiento de una ulcera cronica superficial (4x2cm) en la pierna derecha de un paciente masculino que sufria de diabetes mellitus tipo II. La herida se trato una vez al dia. Despues de 2,5 semanas la curacion era visible. En las siguientes semanas se observo una curacion rapida y el cierre completo de la herida se obtuvo despues de 12 semanas.

Ejemplo 5:

Una parte de la composicion del ejemplo 1 se utilizo para tratar un paciente masculino despues del contacto con agua hirviendo y vapor. El diagnostico fue de quemaduras de primer y segundo grado en el rostro.

El tratamiento inicial con gel frio y Neosporin durante una semana no mostro mejora y el medico que lo atendia propuso la aplicacion de injertos de piel en la nariz y otras partes de la cara, como los parpados.

Sin embargo, el paciente fue tratado con la composicion del ejemplo 1 durante 7 semanas. La composicion se aplico a la piel por pulverizacion tres o cuatro veces al dia. Se observo una mejoria y curacion rapida de la piel y el paciente fue dado de alta del hospital despues de siete semanas. No se requirieron injertos de piel.

Ejemplo 6: Comparacion de hemoglobina cargada/no cargada

A) Se preparo un aerosol de hemoglobina cargada de acuerdo con el Ejemplo 1

Se preparo una composicion lista para usar para tratamiento de heridas, que comprende 10 % de hemoglobina purificada y estabilizada, 0,05 % de N-acetil cisteina y 0,7 % de fenoxi etanol en NaCl al 0,9 %. La composicion se cargo de nuevo con CO gas, se separo en 20 partes que se envasaron en un contenedor de aerosol, respectivamente.

La composicion puede almacenarse entre 4 °C y temperatura ambiente durante meses a anos.

B) Se trato una segunda parte de sangre entera de cerdo como en el Ejemplo 1, con la exception de que no se llevo a cabo carga de CO. Durante la etapa de calentamiento precipito una cantidad considerable de hemoglobina. Las siguientes etapas de filtracion fueron dificiles de llevar a cabo. El rendimiento de hemoglobina purificada por litro de sangre entera disminuyo a menos del 30 % del rendimiento cuando la carga de CO se llevo a cabo antes del calentamiento. Esto muestra que cargar las muestras con CO durante la preparacion estabiliza la hemoglobina de una manera durante una etapa de calentamiento que precipita considerablemente menos

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hemoglobina.

Se preparo una composicion lista para su uso para el tratamiento de heridas, que comprende el 10 % de hemoglobina purificada, 0,05 % de N-acetil cisteina y 0,7 % de fenoxi etanol en NaCl al 0,9 %. La composicion se dividio en partes que se envasaron en contenedores de aerosol, respectivamente.

C) Se aislo una parte adicional de hemoglobina de sangre entera de cerdos por un metodo como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2003/077941 sin cargar la hemoglobina durante la preparacion: la hemoglobina se libero del plasma y los constituyentes de la membrana celular sin calentamiento, mediante centrifugacion y ultrafiltracion, y se purifico.

Se preparo una solucion lista para su uso para tratamiento de heridas, que comprende un 10 % de hemoglobina purificada, un 0,05 % de N-acetil cisteina y 0,7 % de fenoxi etanol en NaCl al 0,9 %. La composicion se separo en 10 partes que se envasaron en un contenedor de aerosol, respectivamente.

Se preparo un aerosol nuevo de hemoglobina no cargada, preparado de esta manera, durante el periodo de tratamiento tan a menudo como fuera necesario (cada uno de los tres dias) y se almaceno a 4 °C como maximo durante un dia antes de su uso.

Tratamiento de pacientes:

Se trataron varios pacientes masculinos (edad 65-75) con ulcera de pie diabetico en la parte inferior de la pierna durante tres meses con aerosol de hemoglobina de acuerdo con A) (almacenado a 10 °C durante hasta 6 meses) o un aerosol de hemoglobina recien preparado de acuerdo con C) (almacenamiento a 4 °C durante 3 dias maximo, es decir, cada uno de los tres dias se uso una composicion fresca) hasta que se obtuvo una curacion completa de la herida en todos los pacientes. De acuerdo con los dermatologos asistentes, la curacion de la herida obtenida con las composiciones de acuerdo con A) mostro en todos los casos menor secrecion, menor incrustacion y/o menor supuracion en comparacion con las heridas tratadas por el aerosol de hemoglobina de acuerdo con C) y, en particular, en comparacion con las heridas tratadas convencionalmente. Debido a problemas minimos, las heridas tratadas con la composicion de hemoglobina cargada de acuerdo con A) mostraron una curacion mas rapida por cm2 que las heridas tratadas con el aerosol de hemoglobina no cargada C) y mucho mas rapido que las heridas tratadas convencionalmente. Los pacientes tratados con la composicion A) presentaron ademas menos molestias.

Ejemplo 7:

Se prepararon muestras de composiciones de acuerdo con el Ejemplo 6A), Ejemplo 6B) o Ejemplo 6C), respectivamente, se examinaron considerando la carga de O2 de las muestras asi como la produccion de methemoglobina, una especie que es incapaz de unirse al O2. Ademas la methemoglobina afecta a las moleculas de hemoglobina en la proximidad inmediata, de manera que estas puedan aun unirse al O2, pero no puedan liberarse de este nunca mas.

Todas las muestras de la Tabla 1 se diluyeron 1:1 con una solucion de NaCl al 0,9 % para imitar las condiciones de un tratamiento de herida. Las muestras 7.1 a 7.8 se midieron inmediatamente despues de la dilucion (el almacenamiento de las muestras 7.5 a 7.8 fue a temperatura ambiente antes de la dilucion). El tratamiento con gas fue el siguiente: 6 ml de dicha solucion diluida se transfirieron a 30 ml de cada matraz de vidrio. El tratamiento con gas se llevo a cabo llenando los matraces de vidrio completamente con el gas respectivo, cerrando el matraz y haciendo pivotar la muestra durante 30 s. Todas las muestras se almacenaron durante el periodo de tiempo mencionado a 30 °C. Las muestras se trataron de acuerdo con las condiciones descritas en la Tabla 1 y se midieron la cantidad total de hemoglobina (hemoglobina + methemoglobina), el contenido de oxigeno, el contenido de methemoglobina y opcionalmente el contenido de CO.

Tabla 1

Ejemplo: muestra tratamiento Hb total g/dl % O2 % CO % MetHb

7.1: Comp. recien preparada de acuerdo con en el Ejemplo 6A) ninguno 5,5 1,7 96,3 3,9

7.2: Comp. recien preparada de acuerdo con en el Ejemplo 6B) ninguno 5,7 26,8 5,1

7.3: Comp. recien preparada de acuerdo con en el Ejemplo 6C) ninguno 5,6 27,0 4,7

7.4: Composicion del Ejemplo 6A), almacenada durante 3 meses (10 °C) ninguno 5,9 1,8 96,5 3,8

7.5: Composicion del Ejemplo 7.2 Almacenado durante 24 h 5,6 26,9 11,2

7.6: Composicion del Ejemplo 7.2 Almacenado durante 48 h 5,5 27,0 17,0

7.7: Composicion del Ejemplo 7.3 Almacenado durante 24 h 5,7 26,5 10,5

7.8: Composicion del Ejemplo 7.3 Almacenado durante 48 h 5,6 26,7 16,2

7.9: Composicion del Ejemplo 7.4 0,5 h O2 5,8 13,7 84,7 4,4

7.10: Composicion del Ejemplo 7.4 1 h O2 5,7 19,6 79,1 4,2

7.11: Composicion del Ejemplo 7.4 2 h O2 5,8 25,7 73,1 4,3

7.12: Composicion del Ejemplo 7.4 3 h O2 5,9 30,7 68,1 4,2

7.13: Composicion del Ejemplo 7.4 24 h O2 5,7 33,5 59,6 9,8

7.14: Composicion del Ejemplo 7.4 48 h O2 5,8 32,5 55,9 15,5

7.15: Composicion del Ejemplo 7.4 72 h O2 5,7 31,7 55,8 16,0

7.16: Composicion del Ejemplo 7.4 0,5 h CO2 5,8 4,0 91,8 5,7

7,17: Composicion del Ejemplo 7.4 1 h CO2 5,7 6,0 90,0 5,7

7,18: Composicion del Ejemplo 7.4 2 h CO2 5,9 9,2 86,7 5,8

7.19: Composicion del Ejemplo 7.4 3 h CO2 5,7 9,6 85,1 6,9

7.20: Composicion del Ejemplo 7.4 24 h CO2 5,6 4,9 77,5 19,7

7.21: Composicion del Ejemplo 7.4 48 h CO2 5,8 8,2 68,2 27,4

7.22: Composicion del Ejemplo 7.4 72 h CO2 5,7 9,4 65,9 28,3

7.23: Composicion del Ejemplo 7.4 0,5 h aire 5,8 9,2 89,0 4,5

7.24: Composicion del Ejemplo 7.4 1 h aire 5,7 12,4 85,9 4,4

7.25: Composicion del Ejemplo 7.4 2 h aire 5,9 18,0 80,5 4,3

7.26: Composicion del Ejemplo 7.4 3 h aire 5,6 20,7 77,9 4,3

7.27: Composicion del Ejemplo 7.4 24 h aire 5,8 24,3 69,3 9,1

7.28: Composicion del Ejemplo 7.4 48 h aire 5,7 25,4 64,3 13,9

7.29: Composicion del Ejemplo 7.4 72 h aire 5,7 26,8 62,2 14,3

Como puede verse a partir de los resultados en la Tabla 1 las composiciones de la invencion, en las que el portador de oxigeno se carga con CO2, no solo pueden almacenarse durante un largo tiempo sin formar methemoglobina, sino que ademas son capaces de reemplazar el CO unido por O2 cuando este se ofrece al portador de oxigeno 5 cargado. Si se exponen a 100 % de O2 (ejemplos 7.9 a 7.15) la saturacion de O2 en la hemoglobina aumenta muy rapido.

Si la composicion se expone a CO2, que representa la situation dentro del tejido activo para la ruta de mamiferos, se forma una mayor cantidad de methemoglobina (ejemplos 7.16 a 7.22).

10

La presion parcial de O2 en aire es de solo aproximadamente 21 %, esto de acuerdo con la curva de saturacion de O2 de la hemoglobina mostrada en la Figura 1, la saturacion maxima posible de O2 de la hemoglobina con oxigeno en aire es de aproximadamente 29 %. Considerando los ejemplos 7.23 a 7.29, el resultado sorprendente es que en 3 horas la composicion expuesta al aire se carga con 20,7 % de oxigeno, pero aun tiene un contenido de 15 methemoglobina muy bajo. Cuando se tratan heridas externas, la composicion se pulveriza en la superficie de la herida (limpiada) y permanece en contacto con el aire.

Estos resultados muestran que una composicion de acuerdo con la invencion comprende un portador de oxigeno estabilizado que despues de varios meses de almacenamiento proporciona un alto transporte de oxigeno cuando 20 esta en contacto con el aire.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un contenedor de aerosol, preferiblemente un contenedor de aerosol envasado a presion, que contiene una composition que comprende

(a) un portador de oxigeno, que es hemoglobina o mioglobina, en donde en al menos un 40 % de dicho portador de ox^geno el sitio de union a oxigeno esta cargado con monoxido de carbono y

(b) al menos un ingrediente adicional, seleccionado de electrolito(s), conservante(s), estabilizador(es), antifloculante(s), anticoagulante(s), agente(s) de tamponador(es) del pH, disolvente(s), antioxidante(s), agente(s) formadores de pelicula o agente(s) reticulante(s).
2. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 1 caracterizada por que la composicion es una solution acuosa u organica.
3. Composicion de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 60 %, mas preferido al menos un 70 %, incluso mas preferido al menos un 80 %, particularmente preferido al menos un 90 % del portador de oxigeno se proporciona en forma cargada con monoxido de carbono.
4. Composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que el portador de oxigeno es hemoglobina o mioglobina natural de origen humano o animal, o es una hemoglobina o una mioglobina de origen humano o animal tratadas, reticuladas o modificadas artificialmente.
5. Composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 proporcionada en forma esterilizada.
6. Composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el contenido de virus de dicha composicion es menor de 10, preferiblemente menor de 5, mas preferiblemente menor de 2 particulas de virus por ml, e incluso mas preferido de 0.
7. Metodo para preparar una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que

(i) el portador de oxigeno se carga con el ligando protector de monoxido de carbono durante o despues del aislamiento de su entorno natural, (ii) se anade al menos otro ingrediente (b), (iii) la composicion se esteriliza opcionalmente y (iv) la composicion se envasa en un contenedor de aerosol.
8. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que la composicion se esteriliza en la etapa (iii) por calentamiento, filtration, centrifugation, adicion de conservantes, aplicacion de vapor, aplicacion de gas o aplicacion de UV o una combination de al menos dos de los mismos.
9. Proceso para purificar un portador de oxigeno, que es hemoglobina o mioglobina, para la preparation de una composicion como se describe en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 6, a partir de sangre entera, que comprende las etapas de:

a. separar el plasma de la sangre entera

b. lisar los globulos rojos de la sangre

c. cargar el portador de oxigeno con monoxido de carbono

d. calentar la muestra a una temperatura en el intervalo de 40 a 85 °C

e. separar el portador de oxigeno de cualquier componente sanguineo no deseado,

en el que la etapa (e) incluye al menos una etapa de filtracion.
10. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que la filtracion en la etapa (e) comprende el uso de un filtro esteril y/o un filtro para virus.
11. Solucion o composicion que comprenden un portador de oxigeno, seleccionado de hemoglobina o mioglobina, que se preparan mediante un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 10.
12. Composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho portador de oxigeno se prepara de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10.
13. Portador para oxigeno seleccionado de hemoglobina o mioglobina, purificado por un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en un metodo para el tratamiento externo de heridas.
14. Composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende una solucion de acuerdo con la reivindicacion 11 o un portador de oxigeno, seleccionado de hemoglobina o mioglobina, purificado por un proceso de acuerdo con la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, para su uso en un metodo para el tratamiento

externo de heridas.