EA029185B1 - Биспецифические антитела против baff и ил-17 - Google Patents

Биспецифические антитела против baff и ил-17 Download PDF

Info

Publication number
EA029185B1
EA029185B1 EA201491622A EA201491622A EA029185B1 EA 029185 B1 EA029185 B1 EA 029185B1 EA 201491622 A EA201491622 A EA 201491622A EA 201491622 A EA201491622 A EA 201491622A EA 029185 B1 EA029185 B1 EA 029185B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bispecific antibody
polypeptide
amino acid
acid sequence
seeg
Prior art date
Application number
EA201491622A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491622A1 (ru
Inventor
Барретт Аллан
Роберт Ян Беншоп
Цзижун Лу
Original Assignee
Эли Лилли Энд Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эли Лилли Энд Компани filed Critical Эли Лилли Энд Компани
Publication of EA201491622A1 publication Critical patent/EA201491622A1/ru
Publication of EA029185B1 publication Critical patent/EA029185B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

В изобретении предложены биспецифические антитела, которые специфически связываются с фактором активации В-клеток из семейства ФНО (BAFF) и интерлейкином-17А (ИЛ-17), которые характеризуются высокой аффинностью и высокими нейтрализующими свойствами как в отношении BAFF, так и в отношении ИЛ-17. Ожидается, что биспецифические антитела согласно изобретению можно будет применять в лечении волчаночного нефрита (ВН), системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита (РА), псориаза (Пс), анкилозирующего спондилоартрита (АС), псориатического артрита (ПА), первичного синдрома Шегрена (пСШ) или множественной миеломы (ММ).

Description

<p>изобретение относится к области медицины, в частности к новой области биспецифических антител, направленных против БАРР - фактора активации В-клеток из семейства факторов некроза опухоли (ФНО) - и интерлейкина-17А (ИЛ-17). Ожидается, что биспецифические антитела согласно настоящему изобретению можно будет применять в лечении волчаночного нефрита (ВН), системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита (РА), псориаза (Пс), анкилозирующего спондилоартрита (АС), псориатического артрита (ПА), первичного синдрома Шегрена (пСШ) или множественной миеломы (ММ).</p> <p>Увеличение концентрации ИЛ-17 ассоциировано с рядом состояний, заболеваний или нарушений, в том числе с воспалением дыхательных путей, ревматоидным артритом, остеоартритом, эрозией кости, интраперитонеальными абсцессами и спайкообразованием, воспалительным заболеванием кишечника, отторжением аллотрансплантата, псориазом, определенными типами рака, ангиогенезом, атеросклерозом и множественным склерозом. Гены ИЛ-17 и рецептора ИЛ-17 активированы в синовиальной ткани пациентов, страдающих от ревматоидного артрита. Блокирование биологической активности ИЛ-17 вызывало уменьшение воспаления и эрозии кости в различных моделях артрита на животных. Более того, ИЛ-17 оказывает ИЛ-1/-независимое действие на разрушение и воспаление коллагенового матрикса и повреждение суставов; кроме того, ИЛ-17 действует синергично с ФНОа и вызывает развитие воспаления. Таким образом, принимая во внимание ограниченное распространение данного цитокина в участке воспаления, ИЛ-17 представляется возможной мишенью для лечения ревматоидного артрита и других воспалительных или аутоиммунных заболеваний с потенциально лучшим профилем безопасности, чем у лекарственных средств, которые направлены на системную циркуляцию провоспалительных цитокинов, таких как ФНОа.</p> <p>Вовлечение фактора активации В-клеток (ВАРР) в патогенез аутоиммунных заболеваний иллюстрирует сверхэкспрессия ВАРР, обнаруженная в мышиных моделях, которая приводит к возникновению аутоиммунных заболеваний, имитирующих ревматоидный артрит, системную красную волчанку и первичный синдром Шегрена, а также к двукратному увеличению частоты возникновения В-клеточной лимфомы. В ряде отчетов об исследованиях на людях было показано увеличение концентрации ВАРР в сыворотке у пациентов, страдающих от СКВ, РА, пСШ и системного склероза. Было продемонстрировано, что ВАРР способствует экспансии клеток ТЙ17 (Т-хелперов 17), а ИЛ-17 является ключевым эффекторным цитокином для ВАРР-опосредованных провоспалительных эффектов во время развития коллаген-индуцированного артрита. Также было показано, что ИЛ-17 действует синергично с ВАРР и оказывает влияние на биологическую активность В-клеток и патофизиологию СКВ. Также существуют доказательства того, что как ВАРР, так и ИЛ-17 играют важную роль в развитии патологии, связанной с ВН; фактически было сообщено, что у пациентов, страдающих от ВН, наблюдается увеличение концентрации ИЛ-17 и ВАРР.</p> <p>СКВ представляет собой высокогетерогенное и мультисистемное аутоиммунное заболевание, которое характеризуется развитием аутоантител и образованием иммунных комплексов. Согласно оценкам специалистов у 30-60% пациентов, страдающих от СКВ, на определенной стадии течения заболевания наблюдается поражение почек. ВН представляет собой комплексное многофакторное аутоиммунное заболевание. При отсутствии лечения степень пятилетней выживаемости пациентов, страдающих от ВН, составляет 0-20%. Внедрение иммуносупрессивной терапии значительно улучшило данную ситуацию, и в настоящий момент степень десятилетней выживаемости составляет 88%. Однако достигнутое усовершенствование терапии дорого обходится пациенту, поскольку многие варианты такого лечения имеют серьезные побочные эффекты, особенно ввиду того, что их необходимо принимать хронически. Кроме того, ответ является медленным и часто неполным, и лишь у 25-50% пациентов достигается ремиссия.</p> <p>Совместное введение антитела против ВАРР и антитела против ИЛ-17 предполагает либо введение инъекций двух отдельных препаратов, либо введение одной инъекции комбинированного состава двух различных антител. Благодаря введению двух инъекций достигается гибкость количества дозы и времени введения, но такая форма введения вызывает неудобства для пациента, обусловленные как необходимостью соблюдения режима терапии, так и болью. Применение комбинированного состава также может обеспечить некоторую гибкость размеров доз, но часто довольно затруднительно или даже невозможно подобрать условия состава, которые обеспечили бы химическую и физическую стабильность обоих антител в связи с отличиями молекулярных характеристик двух различных антител.</p> <p>В международной заявке \70199509917 раскрыт способ получения биспецифических тетравалентных антител (МАЬ-зеРУ) с применением технологии рекомбинантной ДНК путем получения одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела, слитого с полным антителом другой специфичности. Данный химерный ген экспрессируют путем трансфекции, в результате чего получают татравалентное антитело, обладающее двойной специфичностью. В международной заявке \УО2003016468 раскрыты антитела против ВАРР, которые связывают и нейтрализуют как растворимую, так и мембраносвязанную форму ВАРР человека. В международной заявке \УО2007070750 раскрыты антитела против ИЛ-17, которые связывают и нейтрализуют ИЛ-17 человека. Однако при следовании приведенным в заявке \УО199509917 рекомендациям для создания исходного биспецифического антитела, содержащего анти- 1 029185</p> <p>тела против БАРР согласно заявке ΑΘ2003016468 и антитела против ИЛ-17 согласно заявке ΑΘ2007070750, авторы настоящего изобретения столкнулись со значительными проблемами, связанными с химической и физической стабильностью. В исходное биспецифическое антитело потребовалось ввести ряд аминокислотных замен, чтобы в достаточной степени преодолеть возникшие проблемы. Ни о фактических изменениях, ни о потребности в таких изменениях ранее не сообщалось. К тому же, некоторые изменения не являются шаблонными или вытекающими из общепринятых стандартных знаний. Также подобные проблемы не возникают в случае отдельных антител самих по себе, что позволяет предположить, что локальное окружение вокруг данных областей отличается в контексте биспецифических антител. Таким образом, необходимо фармакологическое воздействие с помощью биспецифического антитела, которое нейтрализует как ВАРР, так и ИЛ-17.</p> <p>Настоящее изобретение обеспечивает биспецифическое антитело, содержащее два первых полипептида и два вторых полипептида.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует первый полипептид.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует второй полипептид.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует первый полипептид и второй полипептид.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает клетку млекопитающего, трансформированную молекулой или молекулами ДНК, причем клетка способна экспрессировать биспецифическое антитело, содержащее первый полипептид и второй полипептид.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения биспецифического антитела, содержащего первый полипептид и второй полипептид, включающий культивирование клетки млекопитающего в условиях, при которых экспрессируется биспецифическое антитело.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает биспецифическое антитело, полученное указанным способом.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения системной красной волчанки, волчаночного нефрита, ревматоидного артрита, псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, псориатического артрита, первичного синдрома Шегрена или множественной миеломы, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества биспецифического антитела.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает биспецифическое антитело для применения в терапии.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает биспецифическое антитело для применения при лечении системной красной волчанки, волчаночного нефрита, ревматоидного артрита, псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, псориатического артрита, первичного синдрома Шегрена или множественной миеломы.</p> <p>Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую биспецифическое антитело и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, растворителей или вспомогательных веществ.</p> <p>Под ИЛ-17 человека понимают гомодимерный белок, содержащий два белка ИЛ-17А человека. Гетеродимер ИЛ-17А/Р человека представляет собой белок человека ИЛ-17А и белок человека ИЛ-17Р.</p> <p>Под биспецифическим антителом понимают молекулу иммуноглобулина в формате МАЬ-зеРУ, содержащую четыре антигенсвязывающих сайта, которая связывается с двумя различными антигенами со специфичностью к каждому антигену. Биспецифическое антитело способно связываться с каждым антигеном по отдельности или с каждым антигеном одновременно.</p> <p>Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению содержит два первых полипептида и два вторых полипептида. Каждый из первых полипептидов образует межцепочечную дисульфидную связь с каждым из вторых полипептидов, первый полипептид образует две межцепочечные дисульфидные связи с другим первым полипептидом, а каждый из первых полипептидов образует несколько внутрицепочечных дисульфидных связей. Взаимное расположение полипептидов и дисульфидных связей показано на следующей схеме:</p> <p>Второй полипептид</p> <p>4 гЕ</p> <p>Первый полипептид</p> <p>Первый полипептид</p> <p>Второй полипептид</p> <p>- 2 029185</p> <p>Аминокислотная последовательность первого полипептида представляет собой</p> <table border="1"> <tr><td> ОУОЪООМСАС</td><td> ЬЬКРЗЕТЬЗЬ</td><td> ΤΟΑνΥΟΟ3Ε3</td><td> ΕΥΥ№3ΜΙΚ0Ρ</td><td> РСКСЬЕШСЕ</td><td> 50</td></tr> <tr><td> ΙΝΗ3Ο3ΤΝΥΝ</td><td> Ρ3ΤΚ3ΚνΤΙ3</td><td> νϋΤ3ΚΝ0Ε3Τ</td><td> КЬЗЗУТААЬТ</td><td> ΑνΥΥΟΑΚΟΥΥ</td><td> 100</td></tr> <tr><td> ϋΙΤΤΟΥΥΥΥΕ</td><td> ϋΥΜΟΟΟΤΤνΤ</td><td> УЗЗАЗТКСРЗ</td><td> УЕРЬАРСЗКЗ</td><td> ТЗЕЗТААЬСС</td><td> 150</td></tr> <tr><td> ΣνΚϋΥΓΡΕΡν</td><td> ТУЗЖГЗСАЬТ</td><td> 3ΕνΗΤΕΡΑνΤ</td><td> 033ΕΤΥ3Τ33</td><td> νντνΡ388ΤΕ</td><td> 200</td></tr> <tr><td> ΤΚΤΥΤΟΝνϋΗ</td><td> ΚΡ3ΝΤΚνϋΚΚ</td><td> νΕ3ΚΥ0ΡΡ0Ρ</td><td> РСРАРЕЕЬСС</td><td> РЗУЕЬЕРРКР</td><td> 250</td></tr> <tr><td> ΚϋΤΤΜΙ3ΚΤΡ</td><td> ΕνΤΟνννϋνΒ</td><td> ΟΕϋΡΕνΟΕΝΜ</td><td> ΥνϋΟνΕνΗΝΑ</td><td> ΚΤΚΡΚΕΕΟΕΝ</td><td> 300</td></tr> <tr><td> 5ΤΥΚνν3νΤΤ</td><td> νΤΗΟϋΜΤΝΟΚ</td><td> ΕΥΚ0Κν3ΝΚ0</td><td> ΣΡ33ΙΕΚΤΙ3</td><td> КАКСОРКЕРО</td><td> 350</td></tr> <tr><td> νΥΤΤΡΡ30ΕΕ</td><td> МТКЕОУЗЪТС</td><td> ЬУКСЕТРЗЫ</td><td> ΑΥΕΜΕ3Ν00Ρ</td><td> ΕΝΝΥΚΤΤΡΡν</td><td> 400</td></tr> <tr><td> Εϋ3ϋΟ3ΕΕΤΥ</td><td> 3ΚΤΤνϋΚ3Κ№</td><td> ОЕСКЕЛЕЗСЗУ</td><td> ΜΗΕΑΤΗΝΗΥΤ</td><td> ОКЗЬЗЬЗРСС</td><td> 450</td></tr> <tr><td> есзсссстсс</td><td> еСЗОУОЪУОЗ</td><td> САЕУККРСЗЗ</td><td> νκν3ΟΚΑ3ΟΥ</td><td> ΚΕΤϋΥΗΙΗ?ίν</td><td> 500</td></tr> <tr><td> КОАРСОСЪЕМ</td><td> ΜΟνίΝΡΤΥΟΤ</td><td> ΤϋΥΝΟΚΕΚΟΚ</td><td> νΤΙΤΑϋΕ3Τ3</td><td> ΤΑΥΜΕΤ55ΤΚ</td><td> 550</td></tr> <tr><td> 3ΕϋΤΑνΥΥ0Α</td><td> ΚΥϋΥΕΤΟΤΟν</td><td> ΥΜΟΟεττντν</td><td> 35СССС5ССС</td><td> С5СССС5ССС</td><td> 600</td></tr> <tr><td> Ε3ϋΐνΜΤζ)ΤΡ</td><td> ЬЗЬЗУТРСОР</td><td> А515СК55К5</td><td> ЬУНЗКСЕТТЬ</td><td> ΗΜΥΤΟΚΡΟφδ</td><td> 650</td></tr> <tr><td> Ρ0ΤΤΙΥΚν3Ν</td><td> ΚΕΙ0νΡϋΚΕ3</td><td> сзсзстьеть</td><td> ΚΙ3ΚνΕΑΕϋν</td><td> θνΥΥ0505ΤΗ</td><td> 700</td></tr> <tr><td> ЬРЕТЕСССТК</td><td> ΣΕΙΚ 714</td><td colspan="2"> (8ЕЦ Ш N0:1).</td><td> </td><td> </td></tr> </table> <p>Аминокислотная последовательность второго полипептида представляет собой</p> <table border="1"> <tr><td> ΕΐνΤΤζ)5ΡΑΤ</td><td> ЬЗЬЗРСЕКАТ</td><td> ЬЗСКАЗОЗУЗ</td><td> ΚΥΤΑΜΥΟΟΚΡ</td><td> ΟΟΑΡΚΤΤΙΥϋ</td><td> 50</td></tr> <tr><td> ΑδΝΚΑΤΟΙΡΑ</td><td> КЕЗСЗСЗСТЬ</td><td> 5ТЬТ155ЬЕР</td><td> ΕϋΕΑνΥΥΟΟΟ</td><td> Κ5ΝΜΡΚΤΕ00</td><td> 100</td></tr> <tr><td> ΟΤΚνΕΙΚΚΤν</td><td> ΑΑΡδνΕΙΕΡΡ</td><td> ЗЬЕОЬКЗСТА</td><td> δννΟΤΤΝΝΕΥ</td><td> ΡΚΕΑΚνθ?ίΚν</td><td> 150</td></tr> <tr><td> ϋΝΑΤΟ5ΟΝ5Ο</td><td> ΕδνΤΕΟϋδΚϋ</td><td> 5ΤΥ5Τ5ΝΤΤΤ</td><td> ΤδΚΑϋΥΕΚΗΚ</td><td> νΥΑΟΕΥΤΗΟΟ</td><td> 200</td></tr> <tr><td> Τ55ΡνΤΚ5ΕΝ</td><td> КСЕС 214</td><td colspan="2"> (8ЕЦ Ш N0:2).</td><td> </td><td> </td></tr> </table> <p>Межцепочечная дисульфидная связь между каждым из первых полипептидов и каждым из вторых полипептидов образуется между остатком цистеина 137 из ЗНС) ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 214 в ЗНС) ΙΌ N0: 2. Первый полипептид образует две межцепочечные дисульфидные связи с другим первым полипептидом. Первая межцепочечная дисульфидная связь образуется между остатком цистеина 229 первого полипептида с последовательностью ЗНС) ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 229 другого первого полипептида с последовательностью ЗНС) ΙΌ N0: 1. Вторая межцепочечная дисульфидная связь образуется между остатком цистеина 232 первого полипептида с последовательностью ЗНС) ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 232 другого первого полипептида с последовательностью ЗЕО ΙΌ N0: 1.</p> <p>В пределах зсЕУ (одноцепочечного вариабельного фрагмента) сконструированная внутрицепочечная дисульфидная связь образована между остатком цистеина 507 в ЗНС) ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 707 в ЗНС) ΙΌ N0: 1. Также внутрицепочечная дисульфидная связь образована между остатком цистеина 625 в ЗНС) ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 695 в ЗНС) ΙΌ N0: 1. В пределах МАЬ (моноклонального антитела) внутрицепочечные дисульфидные связи, которые в норме присутствуют в антителе Ι§Ο4, образованы между остатком цистеина 22 в ЗЕО ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 95 в ЗНС) ΙΌ N0: 1, между остатком цистеина 150 в ЗЕО ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 206 в ЗНС) ΙΌ N0: 1, между остатком цистеина 264 в ЗЕО ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 324 в ЗНС) ΙΌ N0: 1, между остатком цистеина 370 в ЗЕО ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 428 в ЗЕО ΙΌ N0: 1, между остатком цистеина 485 в ЗЕО ΙΌ N0: 1 и остатком цистеина 559 в ЗЕО ΙΌ N0: 1, между остатком цистеина 23 в ЗНС) ΙΌ N0: 2 и остатком цистеина 88 в ЗНС) ΙΌ N0: 2 и между остатком цистеина 134 в ЗЕО ΙΌ N0: 2 и остатком цистеина 194 в ЗЕО ΙΌ N0: 2.</p> <p>Первый полипептид содержит первую вариабельную область тяжелой цепи (НСУК1), константную область тяжелой цепи (СН), вторую вариабельную область тяжелой цепи (НСУК2) и вторую вариабельную область легкой цепи (ЬСУК2). Вторые полипептиды содержат первую вариабельную область легкой цепи (ЬСУКЛ) и константную область легкой цепи (СЕ). В областях НСУК и ЬСУК можно дополнительно выделить гипервариабельные, называемые участками, определяющими комплементарность (СЕК), разделенные каркасными областями (ЕК). Каждая область НСУК и ЕСУК состоит из трех СЕК и четырех ЕК, расположенных от аминоконца до карбоксильного конца в следующем порядке: ЕК1, С0К1, ЕК2, С0К2, ЕК3, С0К3, ЕК4.</p> <p>3 СЕК в составе НСУК1 обозначают как СЕКН1-1, СЕКН1-2 и СЕКН1-3; 3 СЕК в составе НСУК2 обозначают как СЕКН2-1, СЕКН2-2 и СЕКН2-3; 3 СЕК в составе ЕСУК1 обозначают как СЕКЕ1-1, СЕКЕ1-2 и СЕКЕ1-3; и 3 СЕК в составе ЕСУК2 обозначают как СЖЪ2-1, СЕКЕ2-2 и СЕКЕ2-3.</p> <p>СН объединяют с НСУК2 с помощью аминокислотного линкера (Ъ1). НСУК2 объединяют с ЕСУК2 с помощью аминокислотного линкера (Е2).</p> <p>- 3 029185</p> <p>Взаимное расположение вариабельных областей и линкеров является следующим</p> <table border="1"> <tr><td colspan="3"> Полипептид 1 - 8ЕЦ ГО N0:1</td><td colspan="3"> Полипептид 2 - 8ЕЦ ГО N0:2</td></tr> <tr><td rowspan="8"> НСУК1 ВАРР</td><td> Область</td><td> Положение</td><td rowspan="8"> ЬСУКТ ВАРР</td><td> Область</td><td> Положение</td></tr> <tr><td> РКН1-1</td><td> 1-26</td><td> РКЫ-1</td><td> 1-23</td></tr> <tr><td> СИКН11</td><td> 27-35</td><td> сокы1</td><td> 24-34</td></tr> <tr><td> РКН1-2</td><td> 36-49</td><td> РКЫ-2</td><td> 35-49</td></tr> <tr><td> СИКН12</td><td> 50-65</td><td> сокы2</td><td> 50-56</td></tr> <tr><td> РКН1-3</td><td> 66-97</td><td> РКЫ-3</td><td> 57-88</td></tr> <tr><td> СИКН13</td><td> 98-112</td><td> сокы3</td><td> 89-97</td></tr> <tr><td> РКН1-4</td><td> 113-123</td><td> РКЫ-4</td><td> 98-107</td></tr> <tr><td> Константная область</td><td> сн</td><td> 124-447</td><td> Констант ная область</td><td> СЬ</td><td> 108-214</td></tr> <tr><td> Линкер</td><td> ы</td><td> 448-463</td><td colspan="3" rowspan="16"> </td></tr> <tr><td rowspan="7"> НСУК2 ИЛ17</td><td> РКН2-1</td><td> 464-487</td></tr> <tr><td> СИКН21</td><td> 488-498</td></tr> <tr><td> РКН2-2</td><td> 499-512</td></tr> <tr><td> СИКН22</td><td> 513-528</td></tr> <tr><td> РКН2-3</td><td> 529-561</td></tr> <tr><td> СИКН23</td><td> 562-571</td></tr> <tr><td> РКН2-4</td><td> 572-582</td></tr> <tr><td> Линкер</td><td> Ь2</td><td> 583-602</td></tr> <tr><td rowspan="7"> ЬСУК2 ИЛ17</td><td> РКЕ2-1</td><td> 603-625</td></tr> <tr><td> СИКЕ2-1</td><td> 626-641</td></tr> <tr><td> РКЕ2-2</td><td> 642-656</td></tr> <tr><td> СИКЕ2-2</td><td> 657-663</td></tr> <tr><td> РКЕ2-3</td><td> 664-695</td></tr> <tr><td> СИКЕ2-3</td><td> 696-704</td></tr> <tr><td> РКЕ2-4</td><td> 705-714</td></tr> </table> <p>Конструирование биспецифических антител.</p> <p>Значительные проблемы, связанные с химической и физической стабильностью, были преодолены при создании биспецифического антитела в формате МАЬ-зсРу со связывающим фрагментом антитела против ИЛ-17, находящимся в конфигурации зсРу.</p> <p>Во фрагменты СЭКЕ2-1 и СЭКН2-2 биспецифического антитела были введены химические модификации, которые улучшили физическую стабильность и уменьшили агрегацию, зависящую от концентрации. Масштабные исследования стабильности и растворимости белка позволили выявить химически нестабильные остатки в СГОРР2-1 и СЭКН2-2. Эти нестабильные остатки были заменены на электронейтральные аминокислоты с использованием целевых библиотек, сконструированных с применением истощения кодонов. Помимо этого, была рассчитана электростатическая поверхность биспецифического антитела и были выявлены заряженные участки. Нарушения в данных заряженных участках в зсРу приводит к уменьшению степени самоассоциации белка. Однако во фрагменте СЭКН2-1 биспецифического антитела была выявлена мутация, которая восстанавливает электростатическое распределение на поверхности и улучшает физическую стабильность и растворимость при высоких концентрациях. Ни одно из перечисленных выше ограничений не было преодолено в случае отдельных антител для парентерального введения. Данные проблемы были преодолены лишь в результате конструирования биспецифического антитела в формате МАЬ-зсРу, а это позволяет предположить, что локальное окружение вокруг мутированных областей отдельного антитела отличается в контексте биспецифического антитела.</p> <p>Дополнительные химические модификации были введены для стабилизации поверхности контакта НСУК2/ЕСУК2 в части биспецифического антитела, направленного против ИЛ-17, и для уменьшения агрегации биспецифического антитела. В исследованиях, проведенных для определения агрегации, было показано, что наблюдаемая самоассоциация белка поддерживалась не конформационной нестабильностью отдельных доменов НСУК2 или ЕСУК2, но скорее открытием или &quot;дыханием&quot; поверхности контакта НСУК2/ЕСУК2, приводящим к возникновению межмолекулярных белковых взаимодействий. Таким образом, в поверхность контакта НСУК2/ЕСУК2 в части биспецифического антитела, направленной против ИЛ-17, были введены различные внутрицепочечные дисульфидные связи. Одна такая внутрицепочечная дисульфидная связь возникает в каждом из первых полипептидов между остатком цистеина 507 в δΡΟ ГО N0: 1 и остатком цистеина 707 в δΡΟ ГО N0: 1. Данная дисульфидная связь ковалентно</p> <p>- 4 029185</p> <p>связывает поверхность контакта НСУК2/ЬСУК2 в части биспецифического антитела, направленной против ИЛ-17, что стабилизирует поверхность контакта НСУК2/ЬСУК2 и уменьшает межмолекулярные белковые взаимодействия, которые могут привести к возникновению физической нестабильности и к нежелательным ограничениям при подборе состава. При введении в молекулу девяти исследованных дисульфидных связей, 8 из которых приводили к экспрессии функционального белка, наблюдалось уменьшение аффинности от приблизительно в 2 раза до приблизительно в 35 раз. Внутрицепочечная дисульфидная связь в каждом из первых полипептидов между остатком цистеина 507 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и остатком цистеина 707 в 8ЕЦ ГО N0: 1 лучше всего стабилизирует поверхность контакта НСУК2/ЬСУК2 и вместе с тем поддерживает оптимальную аффинность связывания с ИЛ-17.</p> <p>Кроме того, в ходе исследований было установлено, что длина линкера Ь1 влияет на кинетику связывания. В анализе кинетики (методом поверхностного плазмонного резонанса) было показано, что введение линкера длиной 10 аминокислот приводило к уменьшению в 2 раза значения К<sub>оп</sub> по сравнению с введением линкеров длиной 15 аминокислот и 20 аминокислот. Исходя из этого, в биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению был введен линкер длиной 15 аминокислот.</p> <p>Связывание биспецифического антитела.</p> <p>Биспецифические антитела согласно настоящему изобретению связываются как с ΒΆΕΡ человека, так и с ИЛ-17 человека и нейтрализуют по меньшей мере одну биологическую активность ΒΆΕΡ человека и по меньшей мере одну биологическую активность ИЛ-17 человека ίη νίίτο или ίη νίνο. Биспецифические антитела согласно настоящему изобретению являются эффективными ингибиторами ИЛ-17 в присутствии и при отсутствии ΒΆΕΡ ίη νίίτο. Биспецифические антитела согласно настоящему изобретению являются эффективными ингибиторами как растворимого, так и мембраносвязанного ΒΑΡΡ в присутствии или при отсутствии ИЛ-17 ίη νίίτο. Биспецифические антитела согласно настоящему изобретению дополнительно характеризуются аффинностью связывания (К<sub>с</sub>) ΒΑΡΡ человека, находящейся в диапазоне от 150 до 1 пМ, и аффинностью связывания ИЛ-17 человека, находящейся в диапазоне от 50 до 1 пМ. Биспецифические антитела характеризуются аффинностью связывания гетеродимера Α/Ρ ИЛ-17 человека, составляющей приблизительно 90 пМ.</p> <p>Биспецифические антитела эффективно нейтрализуют растворимый, а также мембраносвязанный ΒΑΡΡ, причем на данную нейтрализацию не оказывает влияние присутствие насыщающих количеств ИЛ-17 человека. Биспецифические антитела эффективно нейтрализуют ИЛ-17 человека, причем на данную нейтрализацию не оказывает влияние присутствие насыщающих количеств ΒΑΡΡ человека.</p> <p>Экспрессия биспецифического антитела.</p> <p>Экспрессирующие векторы, способные к направленной экспрессии генов, с которыми они функционально связаны, хорошо известны в данной области техники. Экспрессирующие векторы могут кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию полипептида или полипептидов из клетки хозяина. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологический сигнальный пептид. Первый полипептид и второй полипептид могут быть независимо экспрессированы с использованием различных промоторов, с которыми они функционально связаны в одном векторе, или, в качестве альтернативы, первый полипептид и второй полипептид могут быть независимо экспрессированы с использованием различных промоторов, с которыми они функционально связаны в двух векторах - одном, экспрессирующем первый полипептид, и втором, экспрессирующем второй полипептид.</p> <p>Клетка хозяина включает клетки, стабильно или временно трансфицированные, трансформированные, трансдуцированные или инфицированные одним или несколькими экспрессирующими векторами, которые экспрессируют первый полипептид, второй полипептид или как первый полипептид, так и второй полипептид согласно настоящему изобретению. Создание и выделение линий клеток хозяина, продуцирующих биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению, можно проводить с применением стандартных методик, известных в данной области техники. Клетки млекопитающего являются предпочтительными клетками хозяина для экспрессии биспецифических антител. Конкретные клетки млекопитающего представляют собой НЕК 293, N80. ЭС-44 и СНО. Предпочтительно биспецифические антитела секретируются в среду культивирования клеток хозяина, из которой биспецифические антитела могут быть восстановлены или очищены.</p> <p>В данной области техники хорошо известно, что экспрессия антител в клетках млекопитающих приводит к их гликозилированию. Как правило, гликозилирование происходит в Рс-области антитела в высоко консервативном сайте Ν-гликозилирования. Ν-гликаны, как правило, присоединяются к аспарагину. Каждый из первых полипептидов является гликозилированным по остатку аспарагина 300 в 8ЕЦ ГО N0: 1.</p> <p>- 5 029185</p> <p>Конкретная полинуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, представляет собой:</p> <p>САССТССААСТАСАССАСТСССССССАССАСТСТТСААСССТТСССАСАСССТСТСССТСАССТ</p> <p>ССССТеТСТАТССТСеСТССТТСАСТССТТАСТАСТССАССТССАТТССССАССССССАСССА</p> <p>АСССССТССАСТССАТТССССАААТСААТСАТАСТССААССАССААСТАСААССССТСССТСА</p> <p>АСАСТССАСТСАССАТАТСАСТАСАСАССТССААСААССАСТТСТСССТСАААСТСАССТСТС</p> <p>ТСАССеССССССАСАССССТСТСТАТТАСТСТСССАСАСССТАТТАССАТАТТТТСАСТССТТ</p> <p>АТТАТТАСТАСТТТСАСТАСТССССССАСССААСССТССТСАСССТСТССТСАСССТССАССА</p> <p>АССССССАТСССТСТТСССССТАССССССТССТССАССАССАССТСССАСАССАСАССССССС</p> <p>ТССССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССААССССТСАСССТСТССТССААСТСАССССССС</p> <p>ТСАССАССССССТССАСАССТТССССССТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТСССТСАССА</p> <p>СССТСеТСАСССТССССТССАССАССТТССССАССААСАССТАСАССТССААССТАСАТСАСА</p> <p>АССССАССААСАССААССТССАСААСАСАСТТСАСТССАААТАТССТСССССАТССССАСССТ</p> <p>ССССАеСАССТСАСТТССТССССССАССАТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСА</p> <p>СТСТСАТСАТСТСССеСАССССТСАССТСАССТСССТССТССТССАССТСАСССАССААСАСС</p> <p>СССАСеТССАСТТСААСТССТАССТССАТССССТССАССТССАТААТСССААСАСАААССССС</p> <p>СССАСеАССАСТТСААСАССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАСССТССТССАССАССАСТ</p> <p>СССТСААССССААССАСТАСААСТССААССТСТССААСАААССССТССССТССТССАТССАСА</p> <p>АААССАТСТССАААСССАААССССАССССССАСАСССАСАССТСТАСАСССТССССССАТССС</p> <p>АССАСеАСАТСАССААСААССАССТСАСССТСАССТСССТССТСАААСССТТСТАССССАССС</p> <p>АСАТСеСССТССАСТеССАААССААТССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТСССС</p> <p>ТССТСеАСТСССАССеСТССТТСТТССТСТАСАССАСССТААСССТССАСААСАССАССТССС</p> <p>АССАСеССААТСТСТТСТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТССАСААССАСТАСАСАСАСА</p> <p>АСАСССТСТСССТСТСТССТССАСССССАССАТСССССССАСССССТАССССАССАССССССТ</p> <p>СССАСеТССАССТССТССАСТСТСССССТСАССТСААСААСССТСССТССТСАСТСААССТТТ</p> <p>ССТССААСССАТСТСеТТАСААСТТСАСТСАСТАССАТАТТСАТТСССТСССАСАССССССТС</p> <p>САСААТСССТТСАСТеСАТСССАСТААТТААТССТАСТТАТССТАСТАСТСАСТАСААТСАСС</p> <p>ССТТСАААСССССТСТСАССАТТАССССССАССААТССАССАССАСАСССТАСАТССАССТСА</p> <p>ССАСССТСАСАТСТСАССАСАССССССТСТАТТАСТСТСССАСАТАТСАТТАСТТТАСТСССА</p> <p>ССССТеТСТАСТСССеССААССААСССТССТСАСССТСТССТСАССТСССССАССАТСТССТС</p> <p>еАеетеестсАееАеетеесееААесеесееАеетсеААетеАТАттетеАтеАстсАеАстс</p> <p>САСТСТСССТСТСССТСАССССТССАСАСССССССТССАТСТССТССАСАТСТАСТАССАССС</p> <p>ττοταοαοαοτοοτοοαοαααοοταττταοαττοοτατοτοοαοααοοοαοοοοαατοτοοαο</p> <p>АССТССТААТТТАТАААСТТТССААССССТТТАТТССССТСССАСАСАСАТТСАСССССАСТС</p> <p>οοτοαοοοαοαοατττοαοαοτοαααατοαοοαοοοτοοαοοοοοααοατοττοοοοττταττ</p> <p>АСТССТСТСАААеТАСАСАТСТТССАТТСАСеТТТСеСТесеееАССААОСТеСАСАТСААА</p> <p>8 Ер ГО N0:3.</p> <p>Конкретная полинуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8ЕО ГО ΝΟ: 2, представляет собой</p> <p>САААТТСТСТТСАСССАСТСТССАСССАСССТСТСТТТСТСТССАССССАААСАСССАСССТС</p> <p>ТССТССАСССССАСТСАСАСТСТТАСССССТАСТТАСССТССТАССАССАСАААССТССССАС</p> <p>ССТСССАСССТССТСАТСТАТСАТССАТССААСАСССССАСТСССАТСССАСССАССТТСАСТ</p> <p>СССАСТСССТСТСССАСАСАСТССАСТСТСАССАТСАССАСССТАСАСССТСААСАТТТТССА</p> <p>СТТТАТТАСТСТСАССАСССТАССААСТССССТСССАССТТСССССААСССАССААССТССАА</p> <p>АТСАААССААСТСТСССССССССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТСАССАСТТСААА</p> <p>ТССССААСТСССТСТСТТСТСТСССТССТСААТААСТТСТАТСССАСАСАССССАААСТАСАС</p> <p>ТССААССТССАТААСССССТССААТССССТААСТСССАССАСАСТСТСАСАСАССАССАСАСС</p> <p>ААССАСАССАССТАСАСССТСАССААСАСССТСАСССТСАССАААССАСАСТАССАСАААСАС</p> <p>АААСТСТАССССТСССААСТСАСССАТСАСССССТСАССТССССССТСАСАААСАССТТСААС</p> <p>АССССАСАСТСС</p> <p>8 Ер ГО N0:4.</p> <p>Среду, в которую было секретировано биспецифическое антитело, можно очистить с помощью соответствующих методик. Например, среду можно нанести на колонку с привитым белком А или С и элюировать с нее с применением соответствующих способов. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить с колонки с помощью общеизвестных методик, в том числе эксклюзионной хроматографии, хроматографии, основанной на гидрофобных взаимодействиях, ионообменной или гидроксиапатитной хроматографии. Продукт можно незамедлительно заморозить, например, при температуре</p> <p>- 6 029185</p> <p>-70°С или лиофилизовать.</p> <p>Может возникнуть необходимость уменьшить содержание в среде неправильно свёрнутого биспецифического антитела. Неправильно свернутое биспецифическое антитело также известно как диатело. Нарушение свертывания возникает, когда между цепями или внутри цепей ошибочно образуются одна или несколько дисульфидных связей. Неправильно свернутое биспецифическое антитело можно очистить с помощью соответствующих методик. Например, среду, содержащую неправильно свернутое биспецифическое антитело можно нанести на колонку с сильной катионообменной смолой и элюировать с нее с применением соответствующих способов. Например, сильную катионообменную смолу §РБерЬатозе НР применяют для очистки правильно свернутого биспецифического антитела от диатела. рН среды, содержащей диатело, доводят до рН 8 1 М трисовым основанием. Среду наносят на колонку с 8Р8ерЬатозе НР, промывают двумя объемами колонки раствора 20 мМ Трис, рН 8 и элюируют раствором 20 мМ Трис, 100 мМ №С1. рН 8 более чем 30 объемами колонки (0-70 мМ ЫаС1). В собранных объединенных фракциях определяют наличие высокомолекулярных соединений по сравнению с основным пиком. Типичным результатом является улучшение содержания диатела с 10 до 1% с выходом 71%.</p> <p>В другом примере сильную катионообменную смолу Рогоз Н§ 50 применяют для очистки биспецифического антитела, прошедшего правильный фолдинг, от диатела. рН среды, содержащей диатело, доводят до рН 8 1 М трисовым основанием. Среду наносят на колонку с 8Р-8ерЬатозе НР и элюируют раствором 20 мМ Трис, 100 мМ ЫаС1, рН 8 более чем 15 объемами колонки (15-50 мМ ЫаС1). В собранных объединенных фракциях определяют присутствие высокомолекулярных соединений по сравнению с основным пиком. Типичным результатом является улучшение содержания диатела с 10 до 1% с выходом 57%.</p> <p>Терапевтическое применение.</p> <p>Пациент представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека, страдающее от заболевания, нарушения или состояния, которое получит пользу от уменьшения концентрации ВЛРР и/ или ИЛ17 или уменьшения биологической активности ВЛРР и/или ИЛ-17.</p> <p>Лечение означает все процессы, при которых может быть достигнуто замедление, приостановка, угнетение, контроль или остановка прогрессии нарушений, описанных в настоящей заявке, но оно не обязательно означает полное устранение всех симптомов нарушения. Ожидается, что с помощью биспецифического антитела согласно настоящему изобретению можно лечить системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматоидный артрит, псориаз, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, первичный синдром Шегрена или множественную миелому.</p> <p>Фармацевтическая композиция.</p> <p>Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, подходящую для введения пациенту. Такие фармацевтические композиции создают таким образом, чтобы они подходили для выбранного способа введения; также по мере необходимости применяют фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или вспомогательные вещества, такие как диспергирующие агенты, буферные растворы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизаторы и тому подобное. Указанные композиции могут быть разработаны в соответствии с общепринятыми методиками, представленными, например, в руководстве КетшдХои, ТЬе 8с1еисе апб Ртасбсе о! РЬагтасу, 19* Ебйюи, Сеииаго, Еб., Маск РиЬЬзЫид Со., Еаз1ои, РА 1995, которое представляет собой краткий справочник методик по разработке состава, в общем виде известных специалистам-практикам. Подходящие носители для фармацевтических композиций включают любой материал, который при объединении с биспецифическим антителом согласно настоящему изобретению поддерживает активность молекулы и не вызывает реакции со стороны иммунной системы пациента. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит биспецифическое антитело и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, растворителей или вспомогательных веществ.</p> <p>Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению, может быть введена пациенту, подверженному риску развития или уже имеющему заболевания или нарушения, описанные в настоящей заявке, с применением стандартных методик введения.</p> <p>Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит эффективное количество биспецифического антитела согласно настоящему изобретению. Эффективное количество относится к количеству, необходимому (в определенных дозах и в течение определенных периодов времени и для определенных способов введения) для достижения желаемого терапевтического результата. Эффективное количество биспецифического антитела может варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также от способности антитела или фрагмента антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Эффективное количество также является количеством, при котором терапевтически благоприятное действие превосходит любое токсическое или отрицательное действие биспецифического антитела.</p> <p>Биспецифическое антитело согласно следующему примеру, описывающему экспрессию и свойства указанного антитела, содержит два первых полипептида, имеющих аминокислотные последовательности согласно 8ЕО ГО N0: 1, и два вторых полипептида, имеющих аминокислотные последовательности со- 7 029185</p> <p>гласно 8ЕО ГО N0: 2, причем каждый из первых полипептидов образует межцепочечную дисульфидную связь с каждым из вторых полипептидов между остатком цистеина 137 в 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 214 в 8Е0 ГО N0: 2, и первый полипептид образует две межцепочечные дисульфидные связи с другим первым полипептидом между остатком цистеина 229 первого полипептида в 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 229 другого первого полипептида с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 и между остатком цистеина 232 первого полипептида с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 232 другого первого полипептида с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1, и каждый из первых полипептидов образует внутрицепочечную дисульфидную связь между остатком цистеина 22 и остатком цистеина 95 в 8Е0 ГО N0: 1, между остатком цистеина 150 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и остатком цистеина 206 в 8ЕЦ ГО N0: 1, между остатком цистеина 264 в 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 324 в 8ЕЦ ГО N0: 1, между остатком цистеина 370 в 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 428 в 8ЕЦ ГО N0: 1, между остатком цистеина 485 в 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 559 в 8ЕЦ ГО N0: 1, между остатком цистеина 507 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и остатком цистеина 707 в 8Е0 ГО N0: 1 и между остатком цистеина 625 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и остатком цистеина 695 в 8Е0 ГО N0: 1, и каждый из вторых полипептидов образует внутрицепочечную дисульфидную связь между остатком цистеина 23 в 8Е0 ГО N0: 2 и остатком цистеина 88 в 8ЕЦ ГО N0: 2, и между остатком цистеина 134 в 8Е0 ГО N0: 2 и остатком цистеина 194 в 8ЕЦ ГО N0: 2, причем каждый из первых полипептидов является гликозилированным по остатку аспарагина 300 в 8Е0 ГО N0: 1. Соотношение содержания биспецифического антитела, прошедшего правильный фолдинг, и диатела, прошедшего неправильный фолдинг, составляет 90:10.</p> <p>Экспрессия биспецифического антитела.</p> <p>Биспецифическое антитело может быть экспрессировано и очищено, как, по существу, описано ниже. Экспрессирующий вектор глутаминсинтетазы (ГС), содержащий ДНК согласно 8ЕЦ ГО N0: 3 (кодирующую первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0: 1) и согласно 8Е0 ГО N0: 4 (кодирующую легкую цепь аминокислотной последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0: 2), применяют для трансфекции клеточной линии яичников китайского хомячка, СН0К18У (Ьоиζα Вю1ощс5 РЬС, Слау, Великобритания) методом электропорации. Экспрессирующий вектор кодирует ранний промотор 8У (вируса обезьяны 40Е) и гены ГС. Экспрессия ГС позволяет осуществлять биохимический синтез глутамина-аминокислоты, необходимой клеткам СН0К18У. После трансфекции клетки подвергают грубой селекции с помощью 50 мкМ Ь-метионин сульфоксимина (МСК). Ингибирование ГС Ь-метионин сульфоксимином применяют для увеличения строгости селекции. Клетки с кДНК экспрессирующего вектора, интегрированной в транскрипционно активные области генома клеток хозяина, можно отделить от клеток СН0К18У дикого типа, которые экспрессируют эндогенные количества ГС. Трансфицированные пулы высевают с низкой плотностью для обеспечения роста клонов стабильно экспрессирующих клеток. Клетки подвергают скринингу на экспрессию биспецифического антитела и затем масштабируют в бессывороточные суспензионные культуры, которые будут использовать для продукции. Осветленную среду, в которую секретировалось биспецифическое антитело, наносят на колонку для аффинной хроматографии с привитым белком А, уравновешенную совместимым буфером, таким как фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,4). Колонку промывают для удаления неспецифически связавшихся компонентов. Связавшееся биспецифическое антитело элюируют, например, градиентом рН (например, от 0,1 М натрий-фосфатного буферного раствора, рН 6,8, до 0,1 М натрий-цитратного буферного раствора, рН 2,5). Фракции биспецифического антитела обнаруживают, например, методом ДСНПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) или с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии, а затем объединяют. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить с помощью соответствующих методик, в том числе эксклюзионной хроматографии, хроматографии, основанной на гидрофобных взаимодействиях, ионообменной или гидроксиапатитной хроматографии. Биспецифическое антитело можно подвергнуть концентрированию и/или стерильной фильтрации с применением общепринятых методик. Чистота биспецифического антитела после проведения данных этапов хроматографии составляет более 98%. Биспецифическое антитело можно незамедлительно заморозить при температуре -70°С либо можно хранить при температуре 4°С в течение нескольких месяцев.</p> <p>Аффинность связывания с ИЛ-17 и ВАРЕ.</p> <p>Аффинность связывания и стехиометрию связывания биспецифического антитела с ИЛ-17 человека и ВАРЕ человека определяли методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1аеоге 2000, в который инжектировали подвижный буфер НВ8-ЕР+ (ОЕ НеаИЪеаге, 10 мМ Нерек рН 7,4 + 150 мМ №С1 + 3 мМ ЕЭТА + 0,05% поверхностно-активное вещество Р20) и устанавливали температуру анализа 25 °С. На всех четырех проточных ячейках (Пя) использовали датчик СМ5, содержащий иммобилизованный белок А (получен с помощью стандартного аминного присоединения МН8-ЕПС) для постановки методики захвата. Готовили образцы антитела с концентрацией 10 мкг/мл разведением антитела в подвижном буфере. Образцы ИЛ-17 человека или ВАРР человека готовили в конечных концентрациях 20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25 и 0 (бланк-раствор) нМ разведением в подвижном буфере. Каждый цикл анализа состоял из (1) захвата образцов антитела на отдельных проточных ячейках (Пя2, Пя3 и Пя4), (2) инжекции 250 мкл (300-с) ИЛ-17 человека или ВАРЕ человека во все Пя при потоке 50 мкл/мин, (3) возврат к пото- 8 029185</p> <p>ку буфера в течение 20 мин для мониторинга фазы диссоциации, (4) регенерации поверхностей датчиков с помощью инжекции глицина, рН 1,5, объемом 5 мкл (30-с), (5) уравновешивания поверхностей датчиков инжекцией НВ5-ЕР+ объемом 10 мкл (60-с). Данные обрабатывали с помощью стандартного двойного сравнения и описывали с помощью модели связывания 1:1 с применением пробного выпуска программного обеспечения В1аеоге 2000, версия 4.1, для определения степени ассоциации (к<sub>оп</sub>, М<sup>-1</sup>с<sup>-1</sup> единиц), степени диссоциации (коц, с<sup>-1</sup> единиц)) и Ктах (единицы ответа, ЕО)). Равновесную константу диссоциации (Кб) рассчитывали из отношения ΚΏ = к<sub>о1</sub>-,/к<sub>оп</sub> и получали ее величину в молярных единицах).</p> <p>Таблица 1</p> <p>Аффинность связывания биспецифического антитела с ИЛ-17 человека и ВАРР человека</p> <table border="1"> <tr><td> Антиген</td><td> к<sub>оп</sub> среднее ± станд. отклонение М’Е’<sup>1</sup> (10<sup>б</sup>)</td><td> <sup>к</sup>о{Г среднее ± станд. отклонение с&quot;<sup>1</sup></td><td> Кв среднее ± станд. отклонение пМ</td><td> п</td></tr> <tr><td> ИЛ-17 человека</td><td> 2,5 ± 0,4</td><td> 3,7 (± 1,8) х10&quot;<sup>5</sup></td><td> 14± 5</td><td> 3</td></tr> <tr><td> ВАРР человека</td><td> 2,3 ± 0,9</td><td> 1,2 (±0,5)х10&quot;<sup>4</sup></td><td> 60 ± 50</td><td> 3</td></tr> </table> <p>Данные результаты демонстрируют, что биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению связывается с ИЛ-17 человека и ВАРР человека.</p> <p>Одновременное связывание с ИЛ-17 и ВАРР.</p> <p>Прибор В1аеоге 2000 применяли для определения того, могут ли ИЛ-17 человека и ВАРР человека связываться с биспецифическим антителом одновременно. Если не указано обратное, все реактивы и материалы заказывали у В1аеоге АВ (Упсала, Швеция). Все измерения проводили при температуре 25°С. Буфер НВ5-ЕР+ (150 мМ натрия хлорид, 3 мМ 1Р)ТА, 0,05 % (мас./об.) поверхностно-активное вещество Р-20 и 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4) использовали в качестве подвижного буфера и буфера для разведения образца. Белок А иммобилизовали на проточных ячейках 1 и 2 сенсорного датчика СМ4 с помощью набора для аминного присоединения. Биспецифическое антитело сначала захватывали на проточной ячейке 2, а затем инжектировали ИЛ-17 человека в концентрации 20 нМ в течение 5 мин для насыщения сайта связывания ИЛ-17. После связывания ИЛ-17 инжектировали ВАРР человека в концентрации 20 нМ в течение 5 мин и регистрировали дополнительный сигнал связывания. Поверхность датчика затем регенерировали 10 мМ глицином, рН 1,5. Описанный процесс повторяли за исключением того, что порядок инжектирования ИЛ-17 человека и ВАРР человека был другим. Чтобы убедиться в полном насыщении биспецифического антитела ИЛ-17 человека или ВАРР человека, рассчитывали стехиометрию. Стехиометрия связывания ИЛ-17 человека с биспецифическим антителом составляла, как правило, ~1,3, на основании эксперимента кинетики связывания. Аналогичным образом стехиометрия связывания ВАРР человека к биспецифическим антителом составляла, как правило, ~1,0, на основании эксперимента кинетики связывания. Контрольное АТ против ВАРР представляло собой 4А5-3.1.1-В4, описанное в патенте США И57317089. Контрольное АТ против ИЛ-17 представляло собой РаЬ 126, описанное в патенте США И87838638.</p> <p>Таблица 2</p> <p>Одновременное связывание ИЛ-17 человека и ВАРР человека с биспецифическим антителом</p> <table border="1"> <tr><td> Антитело</td><td> Первый аналит</td><td> ΔΕΟ</td><td> Второй аналит</td><td> ΔΕΟ</td></tr> <tr><td> Биспецифическое</td><td> ВАРР</td><td> 22</td><td> ИЛ-17</td><td> 11</td></tr> <tr><td> Биспецифическое</td><td> ИЛ-17</td><td> 15</td><td> ВАРР</td><td> 23</td></tr> <tr><td> АТ против ИЛ-17</td><td> ВАРР</td><td> 0</td><td> ИЛ-17</td><td> 32</td></tr> <tr><td> АТ против ИЛ-17</td><td> ИЛ-17</td><td> 16</td><td> ВАРР</td><td> 0</td></tr> <tr><td> АТ против ВАРР</td><td> ВАРР</td><td> 33</td><td> ИЛ-17</td><td> 0</td></tr> <tr><td> АТ против ВАРР</td><td> ИЛ-17</td><td> 0</td><td> ВАРР</td><td> 32</td></tr> </table> <p>Данные результаты демонстрируют, что биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению может одновременно связываться с ИЛ-17 человека и ВАРР человека, что подтверждается увеличением количества единиц ответа (Δ ЕО) при связывании с биспецифическим антителом двух лигандов.</p> <p>Ингибирование продукции СХСБ1, индуцированной ИЛ-17, в клетках НТ-29 ίη νίίΐΌ.</p> <p>Клетки НТ-29 представляют собой эпителиальные клетки аденокарциномы толстой и прямой кишок человека, которые в норме экспрессируют рецептор ИЛ-17. Инкубация клеток НТ29 с ИЛ-17 человека приводит к образованию СХСБ1, количество которого можно измерять с помощью коммерчески доступного набора для анализа ЕБ18А.</p> <p>Анализировали диапазон доз биспецифического антитела от 41200 до 2,64 пМ (конечную концентрацию рассчитывали на основании молекулярной массы мономера биспецифического антитела (=100 кДа)). Затем в ячейки, в которых находился рекомбинантный ИЛ-17 (конечная концентрация ИЛ-17 в ячейке составляла 3,75 нМ (на основании молекулярной массы мономера ИЛ-17 (=16 кДа)), прибавляли каждую исследуемую концентрацию биспецифического антитела (50 мкл). Анализ для каждой концен- 9 029185</p> <p>трации проводили в трех ячейках. Среду анализа использовали для контролей &quot;только среды&quot; и &quot;только ИЛ-17&quot;. Антитело, нейтрализующее ИЛ-17 (антитело РаЬ 126, описанное в патенте США И87,838,638), применяли в анализе в качестве положительного контроля. Смеси ИЛ-17 и антитела, находящиеся во внутренних лунках обработанного 96-луночного планшета для культивирования тканей, инкубировали в течение 60-90 мин при температуре 37°С и относительной влажности 95% в атмосфере, содержащей 5% СО<sub>2</sub>. В одном варианте данного анализа прибавляли насыщающую концентрацию ВАРР человека (конечная концентрация 1,25 нМ, рассчитанная на основании молекулярной массы ВАРР (=20 кДа)) для того, чтобы определить, будет ли биспецифическое антитело все еще способно нейтрализовать ИЛ-17, когда оно одновременно связано с ВАРР. Клетки НТ-29 культивировали по стандартной методике в среде анализа (МсСоу'8 5А, содержащей 10% ЭТС (эмбриональную телячью сыворотку), пенициллин С (0,2 Ед./мл) и стрептомицин (0,2 мкг/мл)). В день анализа клетки промывали НВ§§ и отделяли от культуральных флаконов трипсином и ЕИТА. Трипсин инактивировали средой анализа. Клетки НТ-29 затем центрифугировали при 500хд в течение 5 мин при комнатной температуре. Осадок клеток ресуспендировали в среде анализа. Плотность клеток измеряли на гемоцитометре, после чего 20000 клеток НТ-29 (в 100 мкл) прибавляли в 96-луночные планшеты, содержащие смесь антитело/ИЛ-17. В каждую неиспользуемую краевую лунку (без клеток) прибавляли по 200 мкл ФБР для уменьшения краевых эффектов, возникающих вследствие испарения. 96-луночные планшеты помещали в инкубатор для культур тканей (37°С, относительная влажность 95%, атмосфера, содержащая 5% СО<sub>2</sub>) приблизительно на 48 ч.</p> <p>По окончании анализа планшеты центрифугировали (500хд в течение 5 мин при комнатной температуре), среду для культивирования клеток переносили в 96-луночные планшеты из полипропилена, которые заклеивали и замораживали при температуре -80°С. В день измерения содержания СХСЬ1 методом ЕЫ§А планшеты размораживали при комнатной температуре. Содержание СХСЬ1 в среде (неразбавленной либо разбавленной в соотношении 1:3) измеряли &quot;сэндвич&quot;-вариантом метода ЕЫ§А для СХСЬ1 (Ρ&amp;Ό 8у81еш8 ЭиоЗс! № ΌΥ275) согласно инструкции производителя, используя следующие буферные растворы и модификации: 1х промывочный буфер для ЕЫ§А от ВюРХ ЬаЬк (приготовленный из 10х, № ^8Н^-1000-01); объем образца и стандарта - 50 мкл на лунку; субстрат от ВюРХ ЬаЬк (1компонентный субстрат пероксидазы хрена, ПХ, № ТМВ\У-1000-01); стоп-раствор от ВюРХ ЬаЬк (№ Ь§ТР-1000-01; 100 мкл на лунку). По окончании реакций ЕЫ§А измеряли оптическую плотность в ячейках планшетов при длине волны 450 нм на микропланшетном спектрофотометре (Мо1еси1аг Эсуюс^ §ресйаМах 190). Данные представляли в виде % максимального количества образованного СХСЬ1 (количество, образовавшееся в присутствии только ИЛ-17, принимали за 100%). Концентрацию, при которой биспецифическим антителом либо положительным контролем ингибировалось 50% индуцированного ИЛ-17 ответа (1С50) рассчитывали с применением 4-параметровой сигмоидальной модели данных (СгарЬРаб РгЕш).</p> <p>Данные результаты демонстрируют, что биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению ингибирует индуцированную ИЛ-17 секрецию СХСЬ1 клетками НТ-29 в зависимости от концентрации. Степень данного ингибирования сравнима со степенью ингибирования, которая наблюдается для антитела положительного контроля (с 1С50 для биспецифического антитела, составляющим 2,00 ± 0,21 нМ, по сравнению с 1,86 ± 0,22 нМ для антитела положительного контроля (среднее 3 независимых экспериментов ± СКО, среднеквадратическое отклонение)), тогда как антитело отрицательного контроля не ингибировало пролиферацию. Более того, подобное ингибирование наблюдалось в присутствии насыщающего количества ВАРР со значением 1С50 для биспецифического антитела, составляющим 1,57 ± 0,45 нМ, по сравнению с 1,41 ± 0,50 нМ для антитела положительного контроля (среднее 3 независимых экспериментов ± СКО). Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению эффективно нейтрализует ИЛ-17, и на данную нейтрализацию не оказывает влияния присутствие насыщающих количеств ВАРР.</p> <p>Ингибирование индуцированной ВАРР пролиферации клеток Т1165 ίη νίίτο.</p> <p>Т1165.17 представляет собой клеточную линию плазмоцитомы мыши, которой для выживания и роста необходимы внешние факторы (ИЛ-1 бета или ВАРР). Данные клетки в норме экспрессируют рецептор ВАРР, и их ответ на ВАРР человека измеряют путем мониторинга пролиферации.</p> <p>Анализировали способность биспецифического антитела в диапазоне доз от 1 нМ до 4,1 пМ (конечная концентрация рассчитана на основании молекулярной массы биспецифического антитела (=100 кДа)) нейтрализовать растворимый ВАРР (конечная концентрация растворимого ВАРР в анализе, составляющая 150 пМ, рассчитана на основании молекулярной массы ВАРР (=20 кДа)). Различные концентрации биспецифического антитела инкубировали с растворимым ВАРР в течение 30-60 мин при температуре 37°С во внутренних лунках 96-луночного планшета для культивирования тканей с плоским дном в общем объеме 50 мкл. Антитело, нейтрализующее ВАРР (антитело 4А5-3.1.1-В4, описанное в патенте США И87317089) использовали в анализе в качестве положительного контроля. Каждую концентрацию анализировали в трех повторах. В варианте данного анализа исследовали способность биспецифического антитела нейтрализовать мембранный ВАРР. Различные концентрации биспецифического антитела инкубировали вместе с мембранной фракцией клеток НЕК293, экспрессирующих неотщепляемую форму</p> <p>- 10 029185</p> <p>БАРР (которая образовалась в результате введения мутации в БАРР, в сайт расщепления фурином, приводящей к постоянной экспрессии ВАРР на клеточной мембране). В другом варианте данного анализа прибавляли насыщающую концентрацию ИЛ-17 человека (конечная концентрация 15,6 нМ, рассчитанная на основании молекулярной массы ИЛ-17 (=16 кДа)) для определения того, будет ли биспецифическое антитело все еще способно нейтрализовать растворимый либо мембранный ВАРР, когда оно одновременно связано с ИЛ-17.</p> <p>Клетки Т1165 культивировали по стандартной методике в среде анализа (ΚΡΜΙ1640, содержащей 10% ЭСТ, ΗΕΡΕδ, Ь-глутамин, 1 мМ натрия пируват, 5х10<sup>-5</sup> М 2-меркаптоэтанол, 1х антибиотикфунгицид), к которой прибавляли 2 нг/мл рекомбинантного ИЛ-1 бета человека. В день анализа клетки промывали 3 раза средой анализа и ресуспендировали до концентрации 1х10<sup>5</sup> клеток/мл в среде анализа. 50 мкл суспензии клеток прибавляли в 9-луночный планшет, содержащий смесь антитела и ВАРР. В каждую неиспользуемую краевую лунку (без клеток) прибавляли по 100 мкл среды анализа для уменьшения краевых эффектов, возникающих вследствие испарения. Планшеты помещали в инкубатор для культур тканей (37°С, относительная влажность 95%, атмосфера, содержащая 5% СО<sub>2</sub>) приблизительно на 44 ч. По окончании анализа к каждой лунке прибавляли по 20 мкл раствора Рготеда Се11 ТПег 96 Адиеоик Опе δοϊυίίοη и инкубировали в течение от 1 до 4 ч при температуре 37°С. Считывали оптическую плотность в планшете при длине волны 490 нм на микропланшетном спектрофотометре (Мо1еси1аг Иеуюек δρесί^аΜаx 190). Данные представляли в виде % ингибирования, значение для лунок без ВАРР принимали за минимальный ответ, значение для лунок с 150 пМ ВАРР принимали за максимальный ответ. Концентрацию, при которой биспецифическим антителом либо положительным контролем ингибировалось 50% индуцированного ВАРР ответа (1С50), рассчитывали с помощью 4-параметровой сигмоидальной модели данных ^щтаР1о1).</p> <p>Данные результаты демонстрируют, что биспецифическое антитело ингибирует пролиферацию клеток Т1165, индуцированную растворимым ВАРР зависимым от концентрации образом. Степень данного ингибирования сравнима со степенью ингибирования, которая наблюдается для антитела положительного контроля (со значением 1С50 для биспецифического антитела, составляющим 0,064 ± 0,021 пМ, по сравнению с 0,071 ± 0,002 пМ для антитела положительного контроля (среднее 2 независимых экспериментов ± СКО)), тогда как антитело отрицательного контроля не ингибирует пролиферацию. Более того, подобное ингибирование наблюдается в присутствии насыщающего количества ИЛ-17, со значением 1С50 для биспецифического антитела, составляющим 0,060 ± 0,014 пМ, по сравнению с 0,073 ± 0,012 пМ для антитела положительного контроля (среднее 2 независимых экспериментов ± СКО). Биспецифическое антитело эффективно нейтрализует ВАРР, и на данную нейтрализацию не оказывает влияния присутствие насыщающих количеств ИЛ-17.</p> <p>Также была продемонстрирована способность биспецифического антитела ингибировать пролиферацию клеток Т1165, индуцированную мембраносвязанным ВАРР. Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению эффективно ингибирует пролиферацию, индуцированную мембраносвязанным ВАРР, подобно антителу против ВАРР положительного контроля (антитело 4А5-3.1.1-В4, описанное в патенте США υδ7317089). Более того, подобное ингибирование наблюдается в присутствии насыщающего количества ИЛ-17.</p> <p>Ингибирование продукции СХСБ1, индуцированной ИЛ-17 человека, ίη νίνο.</p> <p>Инжекция ИЛ-17 человека мышам приводит к быстрому временному увеличению концентрации СХСБ1, находящейся в циркуляции. Мышам-самкам С57В16, соответствующим норме (п=8 в группе), вводили подкожно либо биспецифическое антитело (66 мкг/мышь), либо антитело против ИЛ-17 положительного контроля (антитело РаЬ 126, описанное в патенте США υδ7,838,638, 50 мкг/мышь), либо антитело отрицательного контроля (1ш1дС4. 50 мкг/мышь). Через 2 дня мышам вводили единичную интраперитонеальную инъекцию ИЛ-17 человека (3 мкг/мышь), после чего через 2 ч отбирали сыворотку и хранили ее при температуре -80°С до проведения анализа. Концентрацию СХСБ1 определяли методом ΕυδΛ. На планшеты для микротитрования наносили антитело, захватывающее Рс человека Цасккоп 1ттипоКекеагск 109-005-098, 1 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Планшеты промывали, блокировали казеином и прибавляли 100 мкл сыворотки (разведение 1:1000). Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, промывали и прибавляли идентифицирующее антитело, меченное ПХ (антитело против 1§С человека, .Тасккоп 1ттипоКе5еагск 709-035-149). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, промывали, прибавляли субстрат ТМБ (тетраметилбензидин), что вызывало развитие окрашивания, и измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре. Концентрацию рассчитывали на основании соответствующих стандартных кривых.</p> <p>- 11 029185</p> <p>Таблица 3</p> <p>Содержание ИЛ-17-индуцированного СХСЬ1 после обработки биспецифическим антителом</p> <table border="1"> <tr><td> Вводимое АТ</td><td> Отрицательны й контроль</td><td> Отрицательны й контроль</td><td> Положительны й контроль</td><td> Биспецифическо е антитело</td></tr> <tr><td> Лиганд</td><td> ФБР</td><td> ИЛ-17</td><td> ИЛ-17</td><td> ИЛ-17</td></tr> <tr><td> Среднее иг СХСЫ/мл</td><td> 45,06</td><td> 1071,17</td><td> 482,73</td><td> 387</td></tr> <tr><td> ско</td><td> 45,06</td><td> 141,67</td><td> 263,7</td><td> 175,11</td></tr> <tr><td> Значение р</td><td> </td><td> </td><td> &lt;0,01</td><td> &lt;0,01</td></tr> </table> <p>Полученные данные подтверждают, что ИЛ-17 человека вызывает увеличение концентрации СХСЬ1 в сыворотке. Однако также было продемонстрировано, что в присутствии биспецифического антитела индуцированное ИЛ-17 увеличение концентрации СХСЬ1 уменьшается (Р&lt;0,01, АЫОУЛ) по сравнению с животными, которым вводили антитело отрицательного контроля. Уменьшение концентрации СХСЬ1 при введении биспецифического антитела сравнимо с уменьшением, которое наблюдается при введении антитела против ИЛ-17 положительного контроля. Введение эквивалентных количеств биспецифического антитела, антител положительного и отрицательного контроля для каждой группы было подтверждено количественным вариантом метода ЕЫ5А. Таким образом, биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению эффективно нейтрализует биологические действия, индуцированные ИЛ-17 человека у мыши. Установленное значение Р сравнимо со значением для группы отрицательного контроля/ИЛ-17.</p> <p>Ингибирование ВАРЕ человека ΐη νίνο.</p> <p>У мышей, которые несут трансген, кодирующий растворимый ВАРЕ человека, наблюдается аномально высокое содержание В-лимфоцитов в селезенке.</p> <p>Мышам, трансгенным по гену ВАРЕ человека (п=5 в группе), вводили интраперитонеально либо единичную дозу биспецифического антитела (660 мкг/мышь), либо антитело против ВАРЕ положительного контроля (антитело 4А5-3.1.1-В4, описанное в патенте США И57317089, 500 мкг/мышь), либо антитело отрицательного контроля (йи1§С4, 500 мкг/мышь). Через восемь дней отбирали сыворотку и селезенки. Готовили суспензию отдельных клеток селезенки и определяли общее число лейкоцитов после лизиса красных кровяных телец. Относительный процент В-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии с помощью маркера клеточной поверхности В220. Общее число В-клеток на селезенку рассчитывали, умножая процент В220-положительных клеток на общее число лимфоцитов в селезенке. На планшеты для микротитрования наносили антитело, захватывающее Рс человека (1аскзоп 1ттипоКезеагсй 109-005-098, 1 мкг/мл), и инкубировали планшеты в течение ночи при температуре 4°С. Планшеты промывали, блокировали казеином и прибавляли 100 мкл сыворотки (разведение 1:5000). Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, промывали и прибавляли идентифицирующее антитело, меченное ПХ (антитело против 1§С человека, 1аскзоп 1ттипоКе8еагсй 709-035-149). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, промывали, прибавляли субстрат ТМБ (тетраметилбензидин), что вызывало развитие окрашивания, и измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре. Концентрацию рассчитывали на основании соответствующих стандартных кривых.</p> <p>Таблица 4</p> <p>Количество В-клеток в селезенке мыши, трансгенной по гену ВАРР человека, после введения биспецифического антитела</p> <table border="1"> <tr><td> Введенное АТ</td><td> Отрицательный контроль</td><td> Положительный контроль</td><td> Биспецифическое антитело</td></tr> <tr><td> Среднее количество х 10 Е<sup>6</sup> Вклеток/ селезенку</td><td> 234,84</td><td> 78,87</td><td> 94,77</td></tr> <tr><td> СКО</td><td> 18,93</td><td> 3,49</td><td> 2,34</td></tr> <tr><td> Значение р</td><td> </td><td> &lt;0,0001</td><td> &lt;0,0001</td></tr> </table> <p>Данные результаты демонстрируют, что количество В-клеток в селезенке мышей, трансгенных по гену ВАРР человека, уменьшается (р&lt;0,0001, АЫОУА) после единичного введения биспецифического антитела. Степень данной нормализации количества В-клеток эквивалентна степени нормализации, наблюдаемой для антитела против ВАРР положительного контроля. Введение эквивалентных количеств биспецифического антитела, антител положительного и отрицательного контроля для каждой группы было подтверждено количественным вариантом метода ЕЕ15А. Таким образом, биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению эффективно нейтрализует биологическое действие, индуцированное ВАРР человека у мыши. Установленное значение Р сравнимо со значением группы отрицательного контроля.</p> <p>Анализ растворимости и стабильности.</p> <p>Биспецифическое антитело было приготовлено в состав в ФБР, рН 7,4. Раствор биспецифического антитела с концентрацией 1-2 мг/мл концентрировали с помощью пробирок для концентрирования АтЕ соп до концентрации, варьирующей от 52 до 58 мг/мл. Концентрированные образцы хранили при температуре 25°С в течение 4 недель. Определяли процент высокомолекулярной фракции (% ВМФ) методом</p> <p>- 12 029185</p> <p>эксклюзионной хроматографии (ЭХ, 5ЕС) в образцах в исходной концентрации, а также через 1 день, 1 и 4 недели инкубации. Анализ методом ЭХ проводили на хроматографе Аш1еп1 1100 с использованием колонки Т5К 030008^-ХЬ (ТозоЕ Вюзшепсе). Раствор ФБР + 0,35 М ЖС1, рН 7,4 использовали в качестве подвижной фазы, скорость потока которой составляла 0,5 мл/мин в течение 35 мин. Концентрированное антитело вводили в колонку в объеме 1 мкл, детектирование проводили при длине волны 280 нм. Хроматограммы анализировали с помощью СНетЧаОоп; рассчитывали % высокомолекулярной фракции (ВМФ), используя соотношение величины АиС (площади под кривой) пиков, элюировавшихся перед пиком мономера, к величине суммарной АиС. Определяли % ВМФ в образцах, которые хранили при температуре 25°С в течение различного времени. Полученные результаты обобщены в табл. 5.</p> <p>Таблица 5</p> <p>Результаты определения % высокомолекулярной фракции методом Э ВЭЖХ</p> <table border="1"> <tr><td> </td><td> % ВМФ, определенный</td></tr> <tr><td> </td><td> методом Э ВЭЖХ</td></tr> <tr><td> Исходный образец, неконцентрированный</td><td> 0,95</td></tr> <tr><td> Исходный образец, концентрированный</td><td> 1,63</td></tr> <tr><td> 1 день 25°С</td><td> 1,81</td></tr> <tr><td> 1 неделя 25° С</td><td> 2,61</td></tr> <tr><td> 4 недели 25°С</td><td> 5,35</td></tr> </table> <p>Предварительные исследования исходного биспецифического антитела, содержащего антитело против ВАРЕ согласно международной заявке ΧΥ02003016468 и антитело против ИЛ-17 согласно международной заявке ^02007070750, продемонстрировали, что после концентрирования антитела до концентрации всего лишь 6 мг/мл методом Э ВЭЖХ было зарегистрировано увеличение на 25% процентного содержания ВМФ через 3 недели хранения при температуре 4°С в ФБР; при концентрации 30 мг/мл увеличение % ВМФ составило 15% всего лишь через 2 дня хранения при температуре 4°С в ФБР. Данные результаты демонстрируют, что биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению обладает значительно улучшенными свойствами, в том числе меньшей степенью агрегации и увеличенной физической стабильностью, по сравнению с исходным биспецифическим антителом.</p> <p>ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ</p> <p>&lt;110&gt; Эли Лилли энд Компани</p> <p>&lt;120&gt; БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВАРЕ И ИЛ-17</p> <p>&lt;130&gt; Х19474</p> <p>&lt;150&gt; 61/768747</p> <p>&lt;151&gt; 2013-02-25</p> <p>&lt;150&gt; 61/636302</p> <p>&lt;151&gt; 2012-04-20</p> <p>&lt;150&gt; РСТ/ИВ2013/036677</p> <p>&lt;151&gt; 2013-04-16</p> <p>&lt;160&gt; 4</p> <p>&lt;170&gt; РаЬепЫп версия 3.5</p> <p>&lt;210&gt; 1</p> <p>&lt;211&gt; 714</p> <p>&lt;212&gt; БЕЛОК</p> <p>&lt;213&gt; Искусственная последовательность</p> <p>&lt;220&gt;</p> <p>&lt;223&gt; Синтетическая конструкция</p> <p>&lt;400&gt; 1</p> <p>С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1п Тгр С1у А1а С1у Ьеи Ьеи Ьуз Рго Вег С1и</p> <p>1 5 10 15</p> <p>- 13 029185</p> <table border="1"> <tr><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Ьеи 20</td><td> ТЬг</td><td> Суз</td><td> А1а</td><td> Уа1</td><td> Туг 25</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> Зег</td><td> РЬе</td><td> Зег 30</td><td> О1у</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> Туг</td><td> Тгр</td><td> Зег</td><td> Тгр</td><td> 11е</td><td> Агд</td><td> О1п</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> О1у</td><td> Ьуз</td><td> О1у</td><td> Ьеи</td><td> О1и</td><td> Тгр</td><td> 11е</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 35</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 40</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 45</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1у</td><td> О1и</td><td> 11е</td><td> Азп</td><td> Ηΐ3</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> Азп</td><td> Туг</td><td> Азп</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td></tr> <tr><td> </td><td> 50</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 55</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 60</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Зег</td><td> Агд</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> 11е</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td><td> Зег</td><td> Ьуз</td><td> Азп</td><td> О1п</td><td> РЬе</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td></tr> <tr><td> 65</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 70</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 75</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 80</td></tr> <tr><td> Ьуз</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> А1а</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> Уа1</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Суз</td><td> А1а</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 85</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 90</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 95</td><td> </td></tr> <tr><td> Агд</td><td> О1у</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Азр</td><td> 11е</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> О1у</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> РЬе</td><td> Азр</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 100</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 105</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 110</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Тгр</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> А1а</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> О1у</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 115</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 120</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 125</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> РЬе</td><td> Рго</td><td> Ьеи</td><td> А1а</td><td> Рго</td><td> Суз</td><td> Зег</td><td> Агд</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> Зег</td><td> О1и</td><td> Зег</td></tr> <tr><td> </td><td> 130</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 135</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 140</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td><td> О1у</td><td> Суз</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> Ьуз</td><td> Азр</td><td> Туг</td><td> РЬе</td><td> Рго</td><td> О1и</td><td> Рго</td><td> Уа1</td></tr> <tr><td> 145</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 150</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 155</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 160</td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> Тгр</td><td> Азп</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> Уа1</td><td> Н1з</td><td> ТЬг</td><td> РЬе</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 165</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 170</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 175</td><td> </td></tr> <tr><td> Рго</td><td> А1а</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td><td> О1п</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> Ьеи</td><td> Туг</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Уа1</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 180</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 185</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 190</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> Туг</td><td> ТЬг</td><td> Суз</td><td> Азп</td><td> Уа1</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 195</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 200</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 205</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Азр</td><td> Ηΐ3</td><td> Ьуз</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Азп</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> Ьуз</td><td> Агд</td><td> Уа1</td><td> О1и</td><td> Зег</td><td> Ьуз</td></tr> <tr><td> </td><td> 210</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 215</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 220</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Туг</td><td> О1у</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Суз</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Суз</td><td> Рго</td><td> А1а</td><td> Рго</td><td> О1и</td><td> РЬе</td><td> Ьеи</td><td> О1у</td><td> О1у</td></tr> <tr><td> 225</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 230</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 235</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 240</td></tr> <tr><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> РЬе</td><td> Ьеи</td><td> РЬе</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Ьуз</td><td> Рго</td><td> Ьуз</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> МеЬ</td><td> 11е</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 245</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 250</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 255</td><td> </td></tr> <tr><td> Зег</td><td> Агд</td><td> ТЬг</td><td> Рго</td><td> О1и</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Суз</td><td> Уа1</td><td> Уа1</td><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> О1п</td><td> О1и</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 260</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 265</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 270</td><td> </td><td> </td></tr> </table> <p>- 14 029185</p> <table border="1"> <tr><td> Азр</td><td> Рго</td><td> О1и 275</td><td> Уа1</td><td> О1п</td><td colspan="3"> РЬе Азп Тгр 280</td><td> Туг</td><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> О1у</td><td> Уа1 285</td><td> О1и</td><td> Уа1</td><td> Н1з</td></tr> <tr><td> Азп</td><td> А1а</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> Рго</td><td> Агд</td><td> О1и</td><td> О1и</td><td> О1п</td><td> РЬе</td><td> Азп</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> Туг</td><td> Агд</td></tr> <tr><td> </td><td> 290</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 295</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 300</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ναι</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td><td> Н1з</td><td> О1п</td><td> Азр</td><td> Тгр</td><td> Ьеи</td><td> Азп</td><td> О1у</td><td> Ьуз</td></tr> <tr><td> 305</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 310</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 315</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 320</td></tr> <tr><td> О1и</td><td> Туг</td><td> Ьуз</td><td> Суз</td><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> Азп</td><td> Ьуз</td><td> О1у</td><td> Ьеи</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> 11е</td><td> О1и</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 325</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 330</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 335</td><td> </td></tr> <tr><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> 11е</td><td> Зег</td><td> Ьуз</td><td> А1а</td><td> Ьуз</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> Рго</td><td> Агд</td><td> О1и</td><td> Рго</td><td> О1п</td><td> Уа1</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 340</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 345</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 350</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> С1п</td><td> О1и</td><td> О1и</td><td> МеЬ</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> Азп</td><td> О1п</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 355</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 360</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 365</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> Суз</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> Ьуз</td><td> О1у</td><td> РЬе</td><td> Туг</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Азр</td><td> 11е</td><td> А1а</td><td> Уа1</td><td> О1и</td><td> Тгр</td></tr> <tr><td> </td><td> 370</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 375</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 380</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1и</td><td> Зег</td><td> Азп</td><td> С1у</td><td> О1п</td><td> Рго</td><td> О1и</td><td> Азп</td><td> Азп</td><td> Туг</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> ТЬг</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Уа1</td></tr> <tr><td> 385</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 390</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 395</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 400</td></tr> <tr><td> Ьеи</td><td> Азр</td><td> Зег</td><td> Азр</td><td> О1у</td><td> Зег</td><td> РЬе</td><td> РЬе</td><td> Ьеи</td><td> Туг</td><td> Зег</td><td> Агд</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> Азр</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 405</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 410</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 415</td><td> </td></tr> <tr><td> Ьуз</td><td> Зег</td><td> Агд</td><td> Тгр</td><td> О1п</td><td> О1и</td><td> О1у</td><td> Азп</td><td> Уа1</td><td> РЬе</td><td> Зег</td><td> Суз</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> МеЬ</td><td> Н1з</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 420</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 425</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 430</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1и</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td><td> Н1з</td><td> Азп</td><td> Н1з</td><td> Туг</td><td> ТЬг</td><td> О1п</td><td> Ьуз</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Рго</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 435</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 440</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 445</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1у</td><td> О1у</td><td> С1у</td><td> С1у</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> Зег</td><td> О1п</td></tr> <tr><td> </td><td> 450</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 455</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 460</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ναι</td><td> О1п</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> О1п</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> А1а</td><td> О1и</td><td> Уа1</td><td> Ьуз</td><td> Ьуз</td><td> Рго</td><td> О1у</td><td> Зег</td><td> Зег</td></tr> <tr><td> 465</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 470</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 475</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 480</td></tr> <tr><td> Ча1</td><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> Зег</td><td> Суз</td><td> Ьуз</td><td> А1а</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> Туг</td><td> Ьуз</td><td> РЬе</td><td> ТЬг</td><td> Азр</td><td> Туг</td><td> Н1з</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 485</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 490</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 495</td><td> </td></tr> <tr><td> 11е</td><td> Н1з</td><td> Тгр</td><td> Уа1</td><td> Агд</td><td> С1п</td><td> А1а</td><td> Рго</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> Суз</td><td> Ьеи</td><td> О1и</td><td> Тгр</td><td> МеЬ</td><td> О1у</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 500</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 505</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 510</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Уа1</td><td> 11е</td><td> Азп</td><td> Рго</td><td> ТЬг</td><td> Туг</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> ТЬг</td><td> Азр</td><td> Туг</td><td> Азп</td><td> О1п</td><td> Агд</td><td> РЬе</td><td> Ьуз</td></tr> </table> <p>- 15 029185</p> <table border="1"> <tr><td> </td><td colspan="3"> 515</td><td colspan="7"> 520</td><td colspan="5"> 525</td></tr> <tr><td> О1у</td><td> Агд</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> 11е</td><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> Азр</td><td> О1и</td><td> Бег</td><td> ТЬг</td><td> Бег</td><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> Туг</td><td> МеЬ</td></tr> <tr><td> </td><td> 530</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 535</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 540</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1и</td><td> Ьеи</td><td> Бег</td><td> Бег</td><td> Ьеи</td><td> Агд</td><td> Бег</td><td> О1и</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> Уа1</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Суз</td><td> А1а</td></tr> <tr><td> 545</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 550</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 555</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 560</td></tr> <tr><td> Агд</td><td> Туг</td><td> Азр</td><td> Туг</td><td> РЬе</td><td> ТЬг</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> О1у</td><td> Уа1</td><td> Туг</td><td> Тгр</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 565</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 570</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 575</td><td> </td></tr> <tr><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> Бег</td><td> Бег</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> Бег</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> Бег</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 580</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 585</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 590</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> Бег</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> О1у</td><td> Бег</td><td> Азр</td><td> 11е</td><td> Уа1</td><td> МеЬ</td><td> ТЬг</td><td> О1п</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 595</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 600</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 605</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> Рго</td><td> Ьеи</td><td> Бег</td><td> Ьеи</td><td> Бег</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Рго</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> Рго</td><td> А1а</td><td> Бег</td><td> 11е</td><td> Бег</td></tr> <tr><td> </td><td> 610</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 615</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 620</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Суз</td><td> Агд</td><td> Бег</td><td> Бег</td><td> Агд</td><td> Бег</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> Н1з</td><td> Бег</td><td> Агд</td><td> О1у</td><td> О1и</td><td> ТЬг</td><td> Туг</td><td> Ьеи</td></tr> <tr><td> 625</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 630</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 635</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 640</td></tr> <tr><td> Ηΐ3</td><td> Тгр</td><td> Туг</td><td> Ьеи</td><td> О1п</td><td> Ьуз</td><td> Рго</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> Бег</td><td> Рго</td><td> О1п</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> 11е</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 645</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 650</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 655</td><td> </td></tr> <tr><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> Бег</td><td> Азп</td><td> Агд</td><td> РЬе</td><td> 11е</td><td> О1у</td><td> Уа1</td><td> Рго</td><td> Азр</td><td> Агд</td><td> РЬе</td><td> Бег</td><td> О1у</td><td> Бег</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 660</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 665</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 670</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> О1у</td><td> Бег</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> Азр</td><td> РЬе</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td><td> 11е</td><td> Бег</td><td> Агд</td><td> Уа1</td><td> О1и</td><td> А1а</td><td> О1и</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 675</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 680</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 685</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Азр</td><td> Уа1</td><td> О1у</td><td> Уа1</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Суз</td><td> Бег</td><td> О1п</td><td> Бег</td><td> ТЬг</td><td> Н1з</td><td> Ьеи</td><td> Рго</td><td> РЬе</td><td> ТЬг</td></tr> <tr><td> </td><td> 690</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 695</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 700</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> РЬе</td><td> О1у</td><td> Суз</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> Ьеи</td><td> О1и</td><td> 11е</td><td> Ьуз</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> </table> <p>705 710</p> <p>&lt;210&gt; 2</p> <p>&lt;211&gt; 214</p> <p>&lt;212&gt; БЕЛОК</p> <p>&lt;213&gt; Искусственная последовательность</p> <p>&lt;220&gt;</p> <p>&lt;223&gt; Синтетическая конструкция</p> <p>&lt;400&gt; 2</p> <table border="1"> <tr><td colspan="3"> О1и 11е Уа1 Ьеи ТЬг О1п Бег Рго А1а ТЬг Ьеи</td><td> Бег Ьеи Бег Рго О1у</td></tr> <tr><td> 1</td><td> 5</td><td> 10</td><td> 15</td></tr> </table> <p>- 16 029185</p> <table border="1"> <tr><td colspan="2"> О1и Агд</td><td> А1а</td><td> ТЬг 20</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Суз</td><td colspan="2"> Агд А1а 25</td><td> Зег</td><td> О1п</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Зег 30</td><td> Агд</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> Ьеи</td><td> А1а</td><td> Тгр</td><td> Туг</td><td> О1п</td><td> О1п</td><td> Ьуз</td><td> Рго</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> А1а</td><td> Рго</td><td> Агд</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> 11е</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 35</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 40</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 45</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Туг</td><td> Азр</td><td> А1а</td><td> Зег</td><td> Азп</td><td> Агд</td><td> А1а</td><td> ТЬг</td><td> О1у</td><td> 11е</td><td> Рго</td><td> А1а</td><td> Агд</td><td> РЬе</td><td> Зег</td><td> О1у</td></tr> <tr><td> </td><td> 50</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 55</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 60</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Зег</td><td> О1у</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> Азр</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> 11е</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> О1и</td><td> Рго</td></tr> <tr><td> 65</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 70</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 75</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 80</td></tr> <tr><td> О1и</td><td> Азр</td><td> РЬе</td><td> А1а</td><td> Уа1</td><td> Туг</td><td> Туг</td><td> Суз</td><td> О1п</td><td> О1п</td><td> Агд</td><td> Зег</td><td> Азп</td><td> Тгр</td><td> Рго</td><td> Агд</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 85</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 90</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 95</td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> РЬе</td><td> О1у</td><td> О1п</td><td> О1у</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> О1и</td><td> 11е</td><td> Ьуз</td><td> Агд</td><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> А1а</td><td> А1а</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 100</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 105</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 110</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> РЬе</td><td> 11е</td><td> РЬе</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Зег</td><td> Азр</td><td> О1и</td><td> О1п</td><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td><td> Зег</td><td> О1у</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 115</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 120</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 125</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Уа1</td><td> Суз</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> Азп</td><td> Азп</td><td> РЬе</td><td> Туг</td><td> Рго</td><td> Агд</td><td> О1и</td><td> А1а</td></tr> <tr><td> </td><td> 130</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 135</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 140</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> О1п</td><td> Тгр</td><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> Азп</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td><td> О1п</td><td> Зег</td><td> О1у</td><td> Азп</td><td> Зег</td><td> О1п</td></tr> <tr><td> 145</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 150</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 155</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 160</td></tr> <tr><td> О1и</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> О1и</td><td> О1п</td><td> Азр</td><td> Зег</td><td> Ьуз</td><td> Азр</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> Туг</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 165</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 170</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 175</td><td> </td></tr> <tr><td> Азп</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Ьуз</td><td> А1а</td><td> Азр</td><td> Туг</td><td> О1и</td><td> Ьуз</td><td> Нчз</td><td> Ьуз</td><td> Уа1</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 180</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 185</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 190</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> А1а</td><td> Суз</td><td> О1и</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Нчз</td><td> О1п</td><td> О1у</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Рго</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Ьуз</td><td> Зег</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 195</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 200</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 205</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> РЬе</td><td> Азп</td><td> Агд</td><td> О1у</td><td> О1и</td><td> Суз</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> </table> <p>210</p> <p>&lt;210&gt; 3</p> <p>&lt;211&gt; 2142</p> <p>&lt;212&gt; ДНК</p> <p>&lt;213&gt; Искусственная последовательность</p> <p>&lt;220&gt;</p> <p>&lt;223&gt; Синтетическая конструкция</p> <p>&lt;400&gt; 3</p> <p>- 17 029185</p> <table border="1"> <tr><td> саддРдсаас</td><td> РасадсадРд</td><td> дддсдсадда</td><td> сРдРРдаадс</td><td> сРРсддадас</td><td> ссРдРсссРс</td><td> 60</td></tr> <tr><td> ассРдсдсРд</td><td> РсРаРддРдд</td><td> дРссРРсадР</td><td> ддРРасРасР</td><td> ддадсРддаР</td><td> Рсдссадссс</td><td> 120</td></tr> <tr><td> ссадддаадд</td><td> ддсРддадРд</td><td> даРРддддаа</td><td> аРсааРсаРа</td><td> дРддаадсас</td><td> саасРасаас</td><td> 180</td></tr> <tr><td> ссдРсссРса</td><td> ададРсдадР</td><td> сассаРаРса</td><td> дРадасасдР</td><td> ссаадаасса</td><td> дРРсРсссРд</td><td> 240</td></tr> <tr><td> ааасРдадсР</td><td> сРдРдассдс</td><td> сдсддасасд</td><td> дсРдРдРаРР</td><td> асРдРдсдад</td><td> адддРаРРас</td><td> 300</td></tr> <tr><td> даРаРРРРда</td><td> сРддРРаРРа</td><td> РРасРасРРР</td><td> дасРасРддд</td><td> дссадддаас</td><td> ссРддРсасс</td><td> 360</td></tr> <tr><td> дРсРссРсад</td><td> ссРссассаа</td><td> дддсссаРсд</td><td> дРсРРсссдс</td><td> РадсдсссРд</td><td> сРссаддадс</td><td> 420</td></tr> <tr><td> ассРссдада</td><td> дсасадссдс</td><td> ссРдддсРдс</td><td> сРддРсаадд</td><td> асРасРРссс</td><td> сдаассддРд</td><td> 480</td></tr> <tr><td> асддРдРсдР</td><td> ддаасРсадд</td><td> сдсссРдасс</td><td> адсддсдРдс</td><td> асассРРссс</td><td> ддсРдРссРа</td><td> 540</td></tr> <tr><td> садРссРсад</td><td> дасРсРасРс</td><td> ссРсадсадс</td><td> дРддРдассд</td><td> РдсссРссад</td><td> садсРРдддс</td><td> 600</td></tr> <tr><td> асдаадассР</td><td> асассРдсаа</td><td> сдРадаРсас</td><td> аадсссадса</td><td> асассааддР</td><td> ддасаадада</td><td> 660</td></tr> <tr><td> дРРдадРсса</td><td> ааРаРддРсс</td><td> сссаРдссса</td><td> сссРдсссад</td><td> сассРдадРР</td><td> ссРдддддда</td><td> 720</td></tr> <tr><td> ссаРсадРсР</td><td> РссРдРРссс</td><td> сссаааассс</td><td> ааддасасРс</td><td> РсаРдаРсРс</td><td> ссддассссР</td><td> 780</td></tr> <tr><td> даддРсасдР</td><td> дсдРддРддР</td><td> ддасдРдадс</td><td> саддаадасс</td><td> ссдаддРсса</td><td> дРРсаасРдд</td><td> 840</td></tr> <tr><td> РасдРддаРд</td><td> дсдРддаддР</td><td> дсаРааРдсс</td><td> аадасааадс</td><td> сдсдддадда</td><td> дсадРРсаас</td><td> 900</td></tr> <tr><td> адсасдРасс</td><td> дРдРддРсад</td><td> сдРссРсасс</td><td> дРссРдсасс</td><td> аддасРддсР</td><td> даасддсаад</td><td> 960</td></tr> <tr><td> дадРасаадР</td><td> дсааддРсРс</td><td> саасаааддс</td><td> сРсссдРссР</td><td> ссаРсдадаа</td><td> аассаРсРсс</td><td> 1020</td></tr> <tr><td> ааадссааад</td><td> ддсадссссд</td><td> ададссасад</td><td> дРдРасассс</td><td> РдсссссаРс</td><td> ссаддаддад</td><td> 1080</td></tr> <tr><td> аРдассаада</td><td> ассаддРсад</td><td> ссРдассРдс</td><td> сРддРсааад</td><td> дсРРсРассс</td><td> садсдасаРс</td><td> 1140</td></tr> <tr><td> дссдРддадР</td><td> дддааадсаа</td><td> Рдддсадссд</td><td> дадаасаасР</td><td> асаадассас</td><td> дссРсссдРд</td><td> 1200</td></tr> <tr><td> сРддасРссд</td><td> асддсРссРР</td><td> сРРссРсРас</td><td> адсаддсРаа</td><td> ссдРддасаа</td><td> дадсаддРдд</td><td> 1260</td></tr> <tr><td> саддадддда</td><td> аРдРсРРсРс</td><td> аРдсРссдРд</td><td> аРдсаРдадд</td><td> сРсРдсасаа</td><td> ссасРасаса</td><td> 1320</td></tr> <tr><td> садаададсс</td><td> РсРсссРдРс</td><td> РссРддаддс</td><td> ддаддаРссд</td><td> ддддаддддд</td><td> Рассддадда</td><td> 1380</td></tr> <tr><td> дддддсРсдс</td><td> аддРдсадсР</td><td> ддРдсадРсР</td><td> ддддсРдадд</td><td> Рдаадаадсс</td><td> РдддРссРса</td><td> 1440</td></tr> <tr><td> дРдааддРРР</td><td> ссРдсааддс</td><td> аРсРддРРас</td><td> аадРРсасРд</td><td> асРассаРаР</td><td> РсаРРдддРд</td><td> 1500</td></tr> <tr><td> сдасаддссс</td><td> сРддасааРд</td><td> ссРРдадРдд</td><td> аРдддадРаа</td><td> РРааРссРас</td><td> РРаРддРасР</td><td> 1560</td></tr> <tr><td> асРдасРаса</td><td> аРсадсддРР</td><td> саааддссдР</td><td> дРсассаРРа</td><td> ссдсддасда</td><td> аРссасдадс</td><td> 1620</td></tr> <tr><td> асадссРаса</td><td> РддадсРдад</td><td> садссРдада</td><td> РсРдаддаса</td><td> сддссдРдРа</td><td> РРасРдРдсд</td><td> 1680</td></tr> <tr><td> адаРаРдаРР</td><td> асРРРасРдд</td><td> дасдддРдРд</td><td> РасРддддсс</td><td> ааддаасссР</td><td> ддРсассдРс</td><td> 1740</td></tr> <tr><td> РссРсаддРд</td><td> дсддаддаРс</td><td> РддРддаддР</td><td> ддсРсаддад</td><td> дРддсддаад</td><td> сддсддаддР</td><td> 1800</td></tr> <tr><td> ддаадРдаРа</td><td> РРдРдаРдас</td><td> РсадасРсса</td><td> сРсРсссРдР</td><td> ссдРсасссс</td><td> Рддасадссд</td><td> 1860</td></tr> <tr><td> дссРссаРсР</td><td> ссРдсадаРс</td><td> РадРаддадс</td><td> сРРдРасаса</td><td> дРсдРддада</td><td> аассРаРРРа</td><td> 1920</td></tr> </table> <p>- 18 029185</p> <table border="1"> <tr><td> саЕЕддЕаЕс</td><td> Едсадаадсс</td><td> аддссааЕсЕ</td><td> ссасадсЕсс</td><td> ЕааЕЕЕаЕаа</td><td> адЕЕЕссаас</td><td> 1980</td></tr> <tr><td> сддЕЕЕаЕЕд</td><td> дддЕсссада</td><td> садаЕЕсадс</td><td> ддсадЕдддЕ</td><td> саддсасада</td><td> ЕЕЕсасасЕд</td><td> 2040</td></tr> <tr><td> ааааЕсадса</td><td> дддЕддаддс</td><td> сдаадаЕдЕЕ</td><td> ддддЕЕЕаЕЕ</td><td> асЕдсЕсЕса</td><td> аадЕасасаЕ</td><td> 2100</td></tr> <tr><td> сЕЕссаЕЕса</td><td> сдЕЕЕддсЕд</td><td> сдддассаад</td><td> сЕддадаЕса</td><td> аа</td><td> </td><td> 2142</td></tr> </table> <p>&lt;210&gt; 4</p> <p>&lt;211&gt; 642</p> <p>&lt;212&gt; ДНК</p> <p>&lt;213&gt; Искусственная последовательность</p> <table border="1"> <tr><td colspan="7"> <p>&lt;220&gt;</p></td></tr> <tr><td colspan="3"> <p>&lt;223&gt; Синтетическая конструкция</p> <p>&lt;400&gt; 4</p> <p>даааЕЕдЕдЕ ЕдасдсадЕс Ессадссасс</p></td><td> <p>сЕдЕсЕЕЕдЕ</p></td><td> <p>сЕссадддда</p></td><td> <p>аададссасс</p></td><td> <p>60</p></td></tr> <tr><td> <p>сЕсЕссЕдса</p></td><td> <p>дддссадЕса</p></td><td> <p>дадЕдЕЕадс</p></td><td> <p>сдсЕасЕЕад</p></td><td> <p>ссЕддЕасса</p></td><td> <p>дсадааассЕ</p></td><td> <p>120</p></td></tr> <tr><td> <p>ддссаддсЕс</p></td><td> <p>ссаддсЕссЕ</p></td><td> <p>саЕсЕаЕдаЕ</p></td><td> <p>дсаЕссааса</p></td><td> <p>дддссасЕдд</p></td><td> <p>саЕсссадсс</p></td><td> <p>180</p></td></tr> <tr><td> <p>аддЕЕсадЕд</p></td><td> <p>дсадЕдддЕс</p></td><td> <p>Едддасадас</p></td><td> <p>ЕссасЕсЕса</p></td><td> <p>ссаЕсадсад</p></td><td> <p>ссЕададссЕ</p></td><td> <p>240</p></td></tr> <tr><td> <p>даадаЕЕЕЕд</p></td><td> <p>садЕЕЕаЕЕа</p></td><td> <p>сЕдЕсадсад</p></td><td> <p>сдЕадсаасЕ</p></td><td> <p>ддссЕсддас</p></td><td> <p>дЕЕсддссаа</p></td><td> <p>300</p></td></tr> <tr><td> <p>дддассаадд</p></td><td> <p>ЕддаааЕсаа</p></td><td> <p>асдаасЕдЕд</p></td><td> <p>дсддсдссаЕ</p></td><td> <p>сЕдЕсЕЕсаЕ</p></td><td> <p>сЕЕсссдсса</p></td><td> <p>360</p></td></tr> <tr><td> <p>ЕсЕдаЕдадс</p></td><td> <p>адЕЕдаааЕс</p></td><td> <p>сддаасЕдсс</p></td><td> <p>ЕсЕдЕЕдЕдЕ</p></td><td> <p>дссЕдсЕдаа</p></td><td> <p>ЕаасЕЕсЕаЕ</p></td><td> <p>420</p></td></tr> <tr><td> <p>сссадададд</p></td><td> <p>ссааадЕаса</p></td><td> <p>дЕддааддЕд</p></td><td> <p>даЕаасдссс</p></td><td> <p>ЕссааЕсддд</p></td><td> <p>ЕаасЕсссад</p></td><td> <p>480</p></td></tr> <tr><td> <p>дададЕдЕса</p></td><td> <p>сададсадда</p></td><td> <p>садсааддас</p></td><td> <p>адсассЕаса</p></td><td> <p>дссЕсадсаа</p></td><td> <p>сасссЕдасд</p></td><td> <p>540</p></td></tr> <tr><td> <p>сЕдадсааад</p></td><td> <p>садасЕасда</p></td><td> <p>дааасасааа</p></td><td> <p>дЕсЕасдссЕ</p></td><td> <p>дсдаадЕсас</p></td><td> <p>ссаЕсадддс</p></td><td> <p>600</p></td></tr> <tr><td> <p>сЕдадсЕсдс</p></td><td> <p>ссдЕсасааа</p></td><td> <p>дадсЕЕсаас</p></td><td> <p>аддддададЕ</p></td><td> <p>дс</p></td><td> <p></p></td><td> <p>642</p></td></tr> <tr><td> <p></p></td><td> <p></p></td><td colspan="3">

Claims (10)

  1. <claim-text>ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ</claim-text></td><td> </td><td> </td></tr> </table> <claim-text>1. Биспецифическое антитело против ВАРР и ИЛ-17, содержащее два первых полипептида и два вторых полипептида, причем аминокислотная последовательность первого полипептида представляет собой 8Е0 ГО N0: 1 и аминокислотная последовательность второго полипептида представляет собой 8ЕС) ГО N0: 2.</claim-text>
  2. 2. Биспецифическое антитело по п.1, имеющее внутрицепочечную дисульфидную связь между остатком цистеина 507 в 8Е0 ГО N0: 1 и остатком цистеина 707 в 8Е0 ГО N0: 1.
  3. 3. Молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1, и содержащая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2.
  4. 4. Клетка млекопитающего, содержащая молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1, и молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2, причем указанная клетка способна экспрессировать биспецифическое антитело против ВАРР и ИЛ-17, содержащее первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0: 1, и второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0: 2.
  5. 5. Клетка млекопитающего, трансформированная молекулой ДНК согласно п.3, причем указанная клетка способна экспрессировать биспецифическое антитело против ВАРР и ИЛ-17, содержащее первый
    - 19 029185
    полипептид, аминокислотная последовательность которого представляет собой 8ЕС ГО N0: 1, и второй полипептид, аминокислотная последовательность которого представляет собой 8ЕС ГО N0: 2.
  6. 6. Клетка млекопитающего по пп.4 и 5, где клетка млекопитающего представляет собой СН0.
  7. 7. Способ получения биспецифического антитела, содержащего первый полипептид, аминокислотная последовательность которого представляет собой 8ЕС ГО N0: 1, и второй полипептид, аминокислотная последовательность которого представляет собой 8ЕС ГО N0: 2, включающий культивирование клетки млекопитающего по п.4 или клетки млекопитающего по п.5 в условиях, при которых экспрессируется биспецифическое антитело против БАЕР и ИЛ-17, и выделение экспрессированного биспецифического антитела.
  8. 8. Применение биспецифического антитела по п.1 в терапии состояний, заболеваний или нарушений, ассоциированных с увеличенной концентрацией ВАРР и ИЛ-17.
  9. 9. Применение биспецифического антитела по п.1 в лечении системной красной волчанки, волчаночного нефрита, ревматоидного артрита, псориаза, анкилозирующего спондилоартрита, псориатического артрита, первичного синдрома Шегрена или множественной миеломы.
  10. 10. Фармацевтическая композиция для лечения состояний, заболеваний или нарушений, ассоциированных с увеличенной концентрацией ВАРР и ИЛ-17, содержащая биспецифическое антитело по п.1 и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
    4^)
EA201491622A 2012-04-20 2013-04-16 Биспецифические антитела против baff и ил-17 EA029185B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261636302P 2012-04-20 2012-04-20
US201361768747P 2013-02-25 2013-02-25
PCT/US2013/036677 WO2013158577A1 (en) 2012-04-20 2013-04-16 Anti-baff-anti-il-17 bispecific antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491622A1 EA201491622A1 (ru) 2015-01-30
EA029185B1 true EA029185B1 (ru) 2018-02-28

Family

ID=48539373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491622A EA029185B1 (ru) 2012-04-20 2013-04-16 Биспецифические антитела против baff и ил-17

Country Status (40)

Country Link
US (2) US9359448B2 (ru)
EP (2) EP2838920B1 (ru)
JP (1) JP6216772B2 (ru)
KR (1) KR101673735B1 (ru)
CN (1) CN104220455B (ru)
AP (1) AP2014008002A0 (ru)
AR (1) AR090626A1 (ru)
AU (1) AU2013249546B2 (ru)
BR (1) BR112014025649A2 (ru)
CA (1) CA2869148C (ru)
CL (1) CL2014002616A1 (ru)
CO (1) CO7160039A2 (ru)
CR (1) CR20140466A (ru)
CY (1) CY1118824T1 (ru)
DK (1) DK2838920T3 (ru)
DO (1) DOP2014000234A (ru)
EA (1) EA029185B1 (ru)
EC (1) ECSP14023405A (ru)
ES (2) ES2621917T3 (ru)
GT (1) GT201400217A (ru)
HK (1) HK1201862A1 (ru)
HR (1) HRP20170468T1 (ru)
HU (1) HUE032153T2 (ru)
IL (1) IL234965B (ru)
IN (1) IN2014MN01876A (ru)
LT (1) LT2838920T (ru)
ME (1) ME02596B (ru)
MX (1) MX367460B (ru)
MY (1) MY173282A (ru)
NZ (1) NZ630865A (ru)
PE (1) PE20142147A1 (ru)
PH (1) PH12014502333A1 (ru)
PL (1) PL2838920T3 (ru)
PT (1) PT2838920T (ru)
RS (1) RS55729B1 (ru)
SG (1) SG11201406726PA (ru)
SI (1) SI2838920T1 (ru)
TW (1) TWI585103B (ru)
WO (1) WO2013158577A1 (ru)
ZA (1) ZA201407272B (ru)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3546483A1 (en) 2010-05-20 2019-10-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
AR090626A1 (es) * 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos
TW201444867A (zh) 2013-03-08 2014-12-01 Lilly Co Eli 抗ｔｎｆ－抗ｉｌ－１７雙特異性抗體
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
EP3071024B1 (en) 2013-11-19 2018-09-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
KR20160113715A (ko) 2014-01-31 2016-09-30 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 신규한 항-ｂａｆｆ 항체
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
IL256665B2 (en) * 2015-07-23 2023-10-01 Boehringer Ingelheim Int IL-23A Targeting Compound and B-Cell Activating Factor Nucleic Acids Encoding Them and Use of Products Containing Them
CN105061596B (zh) * 2015-08-05 2019-01-29 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 人b淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及其应用
EP3735272A4 (en) * 2018-01-05 2021-09-22 Biograph 55, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNO CANCEROTHERAPY
WO2022258045A1 (zh) * 2021-06-11 2022-12-15 山东先声生物制药有限公司 抗人il-17抗体和taci的双功能融合蛋白分子

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007070750A1 (en) * 2005-12-13 2007-06-21 Eli Lilly And Company Anti-il-17 antibodies
US7317089B2 (en) * 2001-08-16 2008-01-08 Eli Lilly And Company Antagonistic anti-hTNFSF13b human antibodies
WO2011141823A2 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 Orega Biotech Methods of treating and/or preventing cell proliferation disorders with il-17 antagonists

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
EP1928506A4 (en) * 2005-08-19 2009-10-21 Abbott Lab IMMUNOGLOBULIN HAVING TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
AR090626A1 (es) * 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7317089B2 (en) * 2001-08-16 2008-01-08 Eli Lilly And Company Antagonistic anti-hTNFSF13b human antibodies
WO2007070750A1 (en) * 2005-12-13 2007-06-21 Eli Lilly And Company Anti-il-17 antibodies
WO2011141823A2 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 Orega Biotech Methods of treating and/or preventing cell proliferation disorders with il-17 antagonists

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGNÈS DOREAU ET AL.: "Interleukin 17 acts in synergy with B cell-activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus", NATURE IMMUNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 10, no. 7, 1 July 2009 (2009-07-01), pages 778-785, XP002661456, ISSN: 1529-2908, DOI: 10.1038/NI.1741 [retrieved on 2009-05-31], fig. 1-6 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013249546A1 (en) 2014-09-25
GT201400217A (es) 2015-06-02
PH12014502333B1 (en) 2014-12-22
EP3192809B1 (en) 2020-04-15
HK1201862A1 (en) 2015-09-11
CO7160039A2 (es) 2015-01-15
PL2838920T3 (pl) 2017-07-31
US9359448B2 (en) 2016-06-07
ME02596B (me) 2017-06-20
CY1118824T1 (el) 2018-01-10
ZA201407272B (en) 2016-11-30
AR090626A1 (es) 2014-11-26
MX367460B (es) 2019-08-22
PE20142147A1 (es) 2014-12-13
TW201402607A (zh) 2014-01-16
BR112014025649A2 (pt) 2017-07-04
MX2014012692A (es) 2015-01-22
RS55729B1 (sr) 2017-07-31
ES2621917T3 (es) 2017-07-05
EP2838920B1 (en) 2017-02-01
TWI585103B (zh) 2017-06-01
IN2014MN01876A (ru) 2015-07-03
WO2013158577A1 (en) 2013-10-24
DOP2014000234A (es) 2014-11-30
AU2013249546B2 (en) 2017-10-26
US9708402B2 (en) 2017-07-18
SG11201406726PA (en) 2014-11-27
KR20140135830A (ko) 2014-11-26
PT2838920T (pt) 2017-05-03
CA2869148A1 (en) 2013-10-24
SI2838920T1 (sl) 2017-03-31
CL2014002616A1 (es) 2015-01-30
MY173282A (en) 2020-01-10
JP6216772B2 (ja) 2017-10-18
AP2014008002A0 (en) 2014-10-31
JP2015514423A (ja) 2015-05-21
PH12014502333A1 (en) 2014-12-22
HRP20170468T1 (hr) 2017-06-02
CN104220455A (zh) 2014-12-17
EA201491622A1 (ru) 2015-01-30
LT2838920T (lt) 2017-05-25
EP3192809A1 (en) 2017-07-19
EP2838920A1 (en) 2015-02-25
CR20140466A (es) 2014-11-13
HUE032153T2 (en) 2017-09-28
NZ630865A (en) 2016-02-26
US20130280256A1 (en) 2013-10-24
ES2789474T3 (es) 2020-10-26
KR101673735B1 (ko) 2016-11-07
DK2838920T3 (en) 2017-04-18
CA2869148C (en) 2017-06-20
IL234965B (en) 2018-04-30
ECSP14023405A (es) 2015-09-30
CN104220455B (zh) 2017-04-26
US20160251430A1 (en) 2016-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029185B1 (ru) Биспецифические антитела против baff и ил-17
EP2964674B1 (en) Anti-tnf-anti-il-17 bispecific antibodies
JP2022550420A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１抗原結合タンパク質及びその応用
KR20190067771A (ko) 인터루킨-6의 인간 수용체에 결합가능한 항체 또는 항원 결합성 단편
CN104231086B (zh) 双功能融合蛋白及其制备方法和用途
CN117843777A (zh) 用于炎性疾病治疗的新型纳米抗体及其产品和方法
US20160340422A1 (en) Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof
US11976115B2 (en) Antibody binding to human IL-1β, preparation method therefor and use thereof
EP4279509A1 (en) Garp protein antibody and application thereof
WO2024002145A1 (zh) 结合il-17a和il-17f的抗体分子及其应用
CN110573182A (zh) 抗cgrp/抗il-23双特异性抗体及其用途
CN117843780A (zh) 抗白介素的单域抗体、编码基因、下游产品及制药用途
CN117843778A (zh) 针对白介素家族成员的新型纳米抗体及其产品和应用
CN114621354A (zh) Fab-白蛋白结合肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN116854819A (zh) 抗cd25抗体及其应用
CA3230246A1 (en) Bispecific antibody and use thereof
JP2018515437A (ja) 抗ｃｄ２０／抗ｂａｆｆ二重特異性抗体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AZ BY KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM