TW201402607A - 抗ｂａｆｆ抗ｉｌ－１７雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供雙特異性抗體，其特異性結合TNF家族之B細胞活化因子(BAFF)及介白素-17A(IL-17)且特徵為對BAFF與IL-17二者具有高親和力及強中和性質。預期本發明雙特異性抗體可用於治療狼瘡性腎炎(LN)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬(Ps)、僵直性脊椎炎(AS)、牛皮癬性關節炎(PA)、原發性修格蘭氏症候群(primary Sjogren's Syndrome，pSS)或多發性骨髓瘤(MM)。

Description

抗BAFF抗IL-17雙特異性抗體
本發明係關於醫學領域，尤其係關於針對TNF家族之B細胞活化因子(BAFF)及介白素-17A(IL-17)之雙特異性抗體的新穎領域。預計本發明雙特異性抗體可用於治療狼瘡性腎炎(LN)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬(Ps)、僵直性脊椎炎(AS)、牛皮癬性關節炎(PA)、原發性修格蘭氏症候群(pSS)或多發性骨髓瘤(MM)。
IL-17之含量增加與若干病況、疾病或病症相關，包括氣道發炎、類風濕性關節炎、骨關節炎、骨侵蝕、腹膜內膿腫及黏連、發炎性腸病、同種異體移植物排斥、牛皮癬、某些類型之癌症、血管生成、動脈粥樣硬化及多發性硬化。IL-17及IL-17受體在類風濕性關節炎患者之滑膜組織中受到上調。阻斷IL-17生物活性可減少各種動物關節炎模型中之發炎及骨侵蝕。此外，IL-17對膠原基質分解及發炎以及關節損傷具有獨立於IL-1β之效應，同時IL-17與TNF-α具有促進發炎之協同作用。因此，假定IL-17集中分佈於發炎部位，則其似乎為治療類風濕性關節炎及其他發炎性或自體免疫疾病的可能靶標，且其安全性可能優於靶向諸如TNF-α等促炎性細胞介素之全身循環之藥物。
B細胞活化因子(BAFF)在自體免疫疾病之發病機制中之參與係藉由小鼠模型中之BAFF過表現來闡釋，此導致類似於類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡及原發性修格蘭氏症候群之自體免疫疾病，以及 導致B細胞淋巴瘤之發生率增加兩倍。在人類中，許多報告已顯示在SLE、RA、pSS及全身性硬化患者中之血清BAFF含量升高。已證實，BAFF促進Th17細胞之擴增且IL-17係膠原誘導之關節炎產生期間BAFF介導促炎效應之關鍵效應子細胞介素。亦已顯示，IL-17與BAFF協同作用以影響SLE之B細胞生物學及病理生理學。亦有證據表明，BAFF與IL-17二者在與LN相關之病理學中起作用，實際上已報導，患有LN之患者之IL-17及BAFF含量升高。
SLE係高度差異之多系統自體免疫疾病，其特徵在於產生自體抗體及形成免疫複合物。估計30-60% SLE患者在其疾病進程期間的某一階段涉及到腎。LN係複雜的多因素自體免疫疾病。若不予治療，則LN患者之5年存活率為0-20%。引入免疫抑制療法已顯著改良此情形且目前10年存活率為88%。然而，此改良需要患者付出一定代價，此乃因許多該等治療具有嚴重不良事件，尤其係由於該等治療必須長期進行所致。另外，反應緩慢且經常不完全，僅有25-50%患者達到緩解。
共投與BAFF抗體及IL-17抗體需要注射兩種單獨產物或單一注射兩種不同抗體之共調配物。兩次注射可允許靈活佈置劑量量及時間安排，但在順應性及疼痛二方面不利於患者。共調配亦可提供劑量量之一定靈活性，但經常因兩種不同抗體之不同分子特性而使得非常難或不可能找到允許該兩種抗體保持化學及物理穩定之調配條件。
WO199509917揭示使用重組DNA技術藉由產生融合至具有不同特異性之完整抗體之單鏈片段可變抗體來產生雙特異性四價抗體(MAb-scFV)之方法。此基因融合係藉由產生具有雙重特異性之四價抗體之轉染來表現。WO2003016468揭示結合及中和可溶形式及膜結合形式之人類BAFF之抗BAFF抗體。WO2007070750揭示結合及中和人類IL-17之抗IL-17抗體。然而，當依照WO199509917中之教示來產 生包含WO2003016468之抗BAFF抗體及WO2007070750之抗IL-17抗體之起始雙特異性抗體時，本發明者發現與化學及物理穩定性相關之重大問題。在起始雙特異性抗體中需要改變許多胺基酸以充分地克服該等問題。不論是對改變之需要抑或實際改變，業內皆不推薦。此外，若干變化並不常見或並不能自普通常識獲得。同樣，單一抗體本身不具有該等問題，表明該等區域周圍的局部環境在雙特異性抗體之背景下有所不同。因此，需要利用中和BAFF與IL-17二者之雙特異性抗體進行之藥理學干預。
本發明提供包含兩個第一多肽及兩個第二多肽之雙特異性抗體。
本發明亦提供包含編碼第一多肽之聚核苷酸序列之DNA分子。
本發明亦提供包含編碼第二多肽之聚核苷酸序列之DNA分子。
本發明亦提供包含編碼第一多肽及第二多肽之聚核苷酸序列之DNA分子。
本發明亦提供用DNA分子轉化之哺乳動物細胞，該細胞能夠表現包含第一多肽及第二多肽之雙特異性抗體。
本發明亦提供產生包含第一多肽及第二多肽之雙特異性抗體之方法，其包含在使得可表現雙特異性抗體之條件下培育哺乳動物細胞。
本發明亦提供藉由該方法產生之雙特異性抗體。
本發明亦提供治療全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、原發性修格蘭氏症候群或多發性骨髓瘤之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之雙特異性抗體。
本發明亦提供用於療法中之雙特異性抗體。
本發明亦提供用於治療全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕 性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、原發性修格蘭氏症候群或多發性骨髓瘤之雙特異性抗體。
本發明亦提供包含雙特異性抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。
人類IL-17應理解為意指包含兩種人類IL-17A蛋白之同源二聚體蛋白。人類IL-17A/F異源二聚體係人類IL-17A蛋白及人類IL-17F蛋白。
雙特異性抗體應理解為意指包含4個抗原結合位點之免疫球蛋白分子，其結合兩種不同抗原且以MAb-scFV格式對各抗原具有特異性。雙特異性抗體能夠單獨結合各抗原或同時結合各抗原。
本發明雙特異性抗體包含兩個第一多肽及兩個第二多肽。各第一多肽與各第二多肽形成鏈間二硫鍵，且第一多肽與另一第一多肽形成兩個鏈間二硫鍵，且各第一多肽形成若干鏈內二硫鍵。多肽與二硫鍵之關係示於以下圖解中：
第一多肽之胺基酸序列為： (SEQ ID NO：1)。
第二多肽之胺基酸序列為： (SEQ ID NO：2).。
各第一多肽與各第二多肽之鏈間二硫鍵在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基137與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基214之間形成。第一多肽與另一第一多肽形成兩個鏈間二硫鍵。第一鏈間二硫鍵在SEQ ID NO：1之第一多肽之半胱胺酸殘基229與SEQ ID NO：1之另一第一多肽之半胱胺酸殘基229之間形成。第二鏈間二硫鍵在SEQ ID NO：1之第一多肽之半胱胺酸殘基232與SEQ ID NO：1之另一第一多肽之半胱胺酸殘基232之間形成。
在scFV內，經改造鏈內二硫鍵在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基507與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基707之間形成。此外，鏈內二硫鍵在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基625與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基695之間形成。在MAb內，通常出現於IgG4抗體中之鏈內二硫鍵在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基22與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基95之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基150與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基206之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基264與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基324之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基370與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基428之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基485與 SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基559之間，在SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基23與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基88之間，且在SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基134與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基194之間形成。
第一多肽包含第一重鏈可變區(HCVR1)、重鏈恆定區(CH)、第二重鏈可變區(HCVR2)及第二輕鏈可變區(LCVR2)。第二多肽包含第一輕鏈可變區(LCVR1)及輕鏈恆定區(CL)。可將HCVR區及LCVR區進一步細分成散佈有框架區(FR)之超變區(稱為互補決定區(CDR))。各HCVR及LCVR由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
HCVR1之3個CDR稱作CDRH1-1、CDRH1-2及CDRH1-3，且HCVR2之3個CDR稱作CDRH2-1、CDRH2-2及CDRH2-3，且LCVR1之3個CDR稱作CDRL1-1、CDRL1-2及CDRL1-3，且LCVR2之3個CDR稱作CDRL2-1、CDRL2-2及CDRL2-3。
CH藉由胺基酸連接體(L1)融合至HCVR2。HCVR2藉由胺基酸連接體(L2)融合至LCVR2。
不同區與連接體之關係如下：
雙特異性抗體改造
在構築呈MAb-scFv格式且在scFv組態中具有抗IL-17結合部分之雙特異性抗體時，遇到與化學及物理穩定性相關之重大問題。對雙特異性抗體之CDRL2-1及CDRH2-2部分進行化學修飾，此可改良物理穩定性並減少與濃度相關之聚集性。廣泛的蛋白質穩定性及溶解性研究鑑別出CDRL2-1及CDRH2-2中之化學不穩定殘基。使用藉由密碼子缺失構築之靶向文庫，以帶中性電價胺基酸替換該等容易變換之殘基。另外，計算雙特異性抗體之靜電表面並鑑別帶電嵌片(charged patch)。破壞scFv中之該等帶電嵌片可減少蛋白質自我締合。然而，在雙特異性抗體之CDRH2-1部分中鑑別出使表面靜電分佈重新平衡並改良高濃度下之物理穩定性及溶解性之突變。在親本單一抗體中未遇到上述問題。僅在構築呈MAb-scFv格式之雙特異性抗體之背景下遇到該等問題，此表示單一抗體之突變區域周圍之局部環境在雙特異性 抗體之背景下會有所不同。
進行進一步化學修飾以穩定雙特異性抗體之IL-17部分中之HCVR2/LCVR2界面及減少雙特異性抗體聚集。測定聚集性所進行之研究顯示，所觀察到之蛋白質自我締合並非由個別HCVR2或LCVR2結構域之構型不穩定性所驅動，而是由引起分子間蛋白質相互作用之HCVR2/LCVR2界面之開放或呼吸來驅動。因此，將各種不同鏈內二硫鍵引入雙特異性抗體之IL-17部分之HCVR2/LCVR2界面中。其中一種此類鏈內二硫鍵出現於各第一多肽中SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基507與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基707之間。此二硫鍵共價連接雙特異性抗體之IL-17部分中之HCVR2/LCVR2界面，從而穩定HCVR2/LCVR2界面並減少可導致物理不穩定性及不利之調配限制性之分子間蛋白質相互作用。在所測試9種不同二硫鍵中，有8種表現功能蛋白質，親和力損失量值在約2倍至約35倍範圍內。各第一多肽中SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基507與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基707之間之鏈內二硫鍵使HCVR2/LCVR2界面具有最佳穩定性，同時維持對IL-17之最佳結合親和力。
另外，研究指示，L1之連接體長度影響結合動力學。動力學分析(藉由表面電漿共振)顯示，10個胺基酸之連接體使Kon速率比15個胺基酸之連接體及20個胺基酸之連接體減慢2倍。因此，將長度為15個胺基酸之連接體引入本發明雙特異性抗體中。
雙特異性抗體結合
本發明雙特異性抗體在活體外或活體內結合人類BAFF與人類IL-17二者並中和至少一種人類BAFF生物活性及至少一種人類IL-17生物活性。本發明雙特異性抗體在活體外存在及不存在BAFF時係IL-17之有效抑制劑。本發明雙特異性抗體在活體外存在或不存在IL-17時係可溶及膜結合BAFF之有效抑制劑。本發明雙特異性抗體之特徵進一 步在於對人類BAFF之結合親和力(KD)在150pM至1pM範圍中且對人類IL-17之結合親和力(KD)在50pM至1pM範圍中。雙特異性抗體對人類IL-17A/F異源二聚體之結合親和力為約90pM。
雙特異性抗體有效地中和可溶以及膜結合BAFF且此中和不受飽和量之人類IL-17之存在的影響。雙特異性抗體有效地中和人類IL-17且此中和不受飽和量之人類BAFF之存在的影響。
雙特異性抗體表現
能夠引導可操作地連接之基因表現之表現載體為業內所熟知。表現載體可編碼促進宿主細胞分泌多肽之信號肽。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。第一多肽及第二多肽可在一個載體中自其可操作地連接之不同啟動子獨立地表現，或另一選擇為，第一多肽及第二多肽可在兩個載體中自其可操作地連接之不同啟動子獨立地表現，即一個載體表現第一多肽且一個載體表現第二多肽。
宿主細胞包括經一或多個表現本發明之第一多肽、第二多肽或第一多肽與第二多肽二者之表現載體穩定或短暫轉染、轉化、轉導或感染的細胞。產生本發明雙特異性抗體之宿主細胞系之建立及分離可使用業內已知之標準技術達成。哺乳動物細胞係用於表現雙特異性抗體之較佳宿主細胞。特定哺乳動物細胞係HEK 293、NS0、DG-44及CHO。較佳地，將雙特異性抗體分泌至培養宿主細胞之培養基中，自該培養基可回收或純化雙特異性抗體。
業內熟知，哺乳動物表現抗體會產生糖基化。通常，糖基化出現於抗體Fc區中之高度保守之N-糖基化位點。N-聚糖通常附接至天冬醯胺。各第一多肽係於SEQ ID NO：1之天冬醯胺殘基300處糖基化。
編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽之特定DNA聚核苷酸序列係： SEQ ID NO：3.。
編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之第二多肽之特定DNA聚核苷酸序列係： SEQ ID NO：4。
可藉由習用技術來純化已有雙特異性抗體分泌至其中之培養基。例如，可使用習用方法將培養基施加至蛋白質A或G管柱並自其溶析。可藉由包括尺寸排除、疏水相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析在內的常見技術有效地去除可溶聚集體及多聚物。可將產物在(例如)-70℃下立即冷凍或可將其凍乾。
可能需要降低存於培養基中之錯誤摺疊之雙特異性抗體之含量。錯誤摺疊之雙特異性抗體亦稱為二鏈抗體。當不正確地形成一或多個鏈間或鏈內二硫鍵時，產生錯誤摺疊。可藉由習用技術來純化錯誤摺疊之雙特異性抗體。例如，可將含有錯誤摺疊之雙特異性抗體之培養基施加至強陽離子交換樹脂中並自其溶析。例如，使用SP-Sepharose HP強陽離子交換樹脂自二鏈抗體純化正確摺疊之雙特異性抗體。使用1M Tris鹼將含有二鏈抗體之培養基之pH調節至pH 8。將該培養基加載至SP-Sepharose HP管柱上，用2管柱體積之20mM Tris(pH 8)洗滌並用20mM Tris、100mM NaCl(pH8)對30管柱體積(0-70mM NaCl)溶析。可評價所收集彙集物之高分子量對主峰。典型結果係自10%二鏈抗體至1%二鏈抗體之改良與71%回收率。
在另一實施例中，使用Poros HS 50強陽離子交換樹脂自二鏈抗 體純化正確摺疊之雙特異性抗體。使用1M Tris鹼將含有二鏈抗體之培養基之pH調節至pH 8。將該培養基加載至SP-Sepharose HP管柱上並用20mM Tris、100mM NaCl(pH8)對15管柱體積(15-50mM NaCl)溶析。可評價所收集彙集物之高分子量對主峰。典型結果係自10%二鏈抗體至1%二鏈抗體之改良與57%回收率。
治療用途
患者係指患有將受益於BAFF及/或IL-17含量降低或BAFF及/或IL-17生物活性降低之疾病、病症或病況之哺乳動物，較佳為人類。
治療(Treatment及/或treating)意欲指可減緩、中斷、阻止、控制或終止本文所述病症之進展的所有過程，但未必指示所有病症症狀之完全消除。預計本發明雙特異性抗體可治療全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、原發性修格蘭氏症候群或多發性骨髓瘤。
醫藥組合物
可將本發明雙特異性抗體納入適於投與患者之醫藥組合物中。設計此等醫藥組合物以適於所選投與模式，且視需要使用醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑，例如分散劑、緩衝劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩定劑及諸如此類。可根據揭示於(例如)Remington, The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro編輯，Mack Publishing公司，Easton,PA 1995中之習用技術設計該等組合物，該文獻提供為從業者所習知之調配技術概要。適於醫藥組合物之載劑包括當與本發明雙特異性抗體組合時保持分子之活性且與患者之免疫系統無反應性的任何材料。本發明醫藥組合物包含雙特異性抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
可使用標準投與技術將包含本發明雙特異性抗體之醫藥組合物投與具有本文所述疾病或病症之風險或展現該等疾病或病症之患者。
本發明醫藥組合物含有有效量之本發明雙特異性抗體。有效量係指達成期望治療結果所需之量(以一定劑量且在一段時間內且對於某一投與手段而言)。雙特異性抗體之有效量可根據諸如以下等因素而變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及抗體或抗體部分於該個體內誘發期望反應之能力。有效量亦為治療有益效應勝過雙特異性抗體之任何毒性或有害效應之量。
以下表現及展示性質之實例之雙特異性抗體包含兩個具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽及兩個具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之第二多肽，其中各第一多肽與各第二多肽在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基137與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基214之間形成鏈間二硫鍵，且第一多肽與另一第一多肽在SEQ ID NO：1之第一多肽之半胱胺酸殘基229與SEQ ID NO：1之另一第一多肽之半胱胺酸殘基229之間及在SEQ ID NO：1之第一多肽之半胱胺酸殘基232與SEQ ID NO：1之另一第一多肽之半胱胺酸殘基232之間形成兩個鏈間二硫鍵，且各第一多肽在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基22與半胱胺酸殘基95之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基150與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基206之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基264與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基324之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基370與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基428之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基485與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基559之間，在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基507與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基707之間及在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基625與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基695之間形成鏈內二硫鍵，且各第二多肽在SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基23與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基88之間及在SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基134與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基194之間形成鏈內二硫鍵，且其中各第一多肽於SEQ ID NO：1之天冬醯胺殘基300處糖基化。正確摺疊之雙特異性抗體對錯誤摺疊 之二鏈抗體之比率係約90：10。
雙特異性抗體之表現
雙特異性抗體可基本上如下表現及純化。藉由電穿孔使用含有DNA SEQ ID NO：3(編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽)及SEQ ID NO：4(編碼輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：2)之麩醯胺酸合成酶(GS)表現載體來轉染中國倉鼠細胞系CHOK1SV(Lonza Biologics PLC,Slough,United Kingdom)。表現載體編碼SV早期(猿猴病毒40E)啟動子及GS之基因。GS之表現允許以生物化學方式合成CHOK1SV細胞所需之胺基酸麩醯胺酸。轉染後，細胞經受用50μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)進行混合選擇。利用MSX對GS之抑制來增加選擇的嚴格性。可選擇將表現載體cDNA整合至宿主細胞基因組之轉錄活性區中之細胞，而非表現內源含量之GS之CHOK1SV野生型細胞。以低密度平鋪轉染彙集物以允許穩定表現之細胞接近純系地過度生長。針對雙特異性抗體表現篩選母孔(masterwell)且隨後在欲用於生產之無血清懸浮培養物中按比例放大。將已有雙特異性抗體分泌至其中之澄清培養基施加至已經相容緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4))平衡之蛋白質A親和力管柱。洗滌管柱以去除非特異性結合組份。藉由(例如)pH梯度(例如0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)至0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5))來溶析經結合雙特異性抗體。藉由(例如)SDS-PAGE或分析型尺寸排除來檢測雙特異性抗體流份，且隨後彙集。可藉由包括尺寸排除、疏水相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析在內之常見技術有效地去除可溶聚集體及多聚體。可使用常見技術濃縮及/或無菌過濾雙特異性抗體。在該等層析步驟後，雙特異性抗體之純度大於98%。可將雙特異性抗體在-70℃下立即冷凍或在4℃下儲存若干個月。
對IL-17及BAFF之結合親和力
在用HBS-EP+(GE Healthcare,10mM Hepes pH7.4+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05%表面活性劑P20)運行緩衝液起動且分析溫度設定在25℃下之Biacore 2000儀器上使用表面電漿共振分析測定雙特異性抗體對人類IL-17及人類BAFF之結合親和力及結合化學計量。使用在所有4個流動槽(Fc)上含有固定蛋白質A(使用標準NHS-EDC胺偶合產生)之CM5晶片來採用捕獲方法。藉由稀釋至運行緩衝液中以10mcg/mL製備抗體試樣。藉由稀釋至運行緩衝液中以20.0nM、10.0nM、5.0nM、2.5nM、1.25nM及0nM(空白)之最終濃度製備人類IL-17或人類BAFF。各分析循環由以下組成：(1)在單獨流動槽(Fc2、Fc3及Fc4)上捕獲抗體試樣，(2)在所有Fc上以50mcL/min注射250mcL(300-sec)人類IL-17或人類BAFF，(3)返回至緩衝液流並保持20min以監測解離階段，(4)藉由注射5mcL(30-sec)甘胺酸(pH1.5)使晶片表面再生，(5)藉由注射10mcL(60-sec)HBS-EP+來平衡晶片表面。使用標準雙重參照處理數據且使用Biacore 2000評估軟體第4.1版將其擬合至1：1結合模型，以測定締合速率(kon，M-1s-1單位)、解離速率(koff，s-1單位)及Rmax(RU單位)。根據關係KD=koff/kon計算平衡解離常數(KD)，且其係以莫耳濃度單位計。.
該等結果證實，本發明雙特異性抗體結合人類IL-17及人類BAFF。
IL-17及BAFF之同時結合
使用BIAcore 2000儀器來確定人類IL-17及人類BAFF是否可同時結合雙特異性抗體。除了上文所述之外，所有試劑及材料皆購自 BIAcore AB(Upsala,Sweden)。所有量測皆在25℃下實施。使用HBS-EP+緩衝液(150mM氯化鈉、3mM EDTA、0.05%(w/v)表面活性劑P-20及10mM HEPES(pH7.4))作為運行緩衝液及試樣緩衝液。使用胺偶合套組將蛋白質A固定在CM4感測器晶片之流動槽1及2上。首先在流動槽2上捕獲雙特異性抗體，之後經5min以20nM注射人類IL-17，以使IL-17結合位點飽和。在結合IL-17後，然後經5min以20nM注射人類BAFF並觀察另一結合信號。然後使用10mM甘胺酸(pH 1.5)使晶片表面再生。重複相同過程，只是人類IL-17及人類BAFF之順序不同。計算化學計量以確保人類IL-17或人類BAFF對雙特異性抗體完全飽和。基於動力學結合實驗，人類IL-17對雙特異性抗體之化學計量通常為約1.3。類似地，基於動力學結合實驗，人類BAFF對雙特異性抗體之化學計量通常為約1.0。對照BAFF Ab係US7,317,089之4A5-3.1.1-B4。對照IL-17 Ab係US7,838,638之Fab 126。
該等結果證實，本發明雙特異性抗體可同時結合人類IL-17及人類BAFF，如來自結合至雙特異性抗體之兩種配體之反應單位之增加(△RU)所示。
在活體外對IL-17誘導之HT-29細胞之CXCL1產生之抑制
HT-29細胞係天然表現IL-17受體之人類結腸直腸腺癌上皮細胞。將HT29細胞與人類IL-17一起培育導致產生CXCL1，其可使用市售 ELISA來量測。
評估41200pM至2.64pM之雙特異性抗體之劑量範圍(基於雙特異性抗體之單體MW(=100kDa)之最終濃度)。然後添加各測試濃度之雙特異性抗體(50mcl)至含有重組IL-17之孔(孔中之最終IL-17濃度為3.75nM(基於IL-17之單體MW(=16kDa))中。每種處理於三個重複孔中實施測試。「單獨培養基」及「單獨IL-17」對照組則使用分析培養基。使用IL-17中和抗體(US7,838,638之Fab 126)作為分析中之陽性對照組。在37℃、95%相對濕度、5% CO2下，在經組織培養處理之96孔板之內孔中，由含有IL-17及抗體混合物之分析板培育60分鐘至90分鐘。在此分析之變化形式中，添加飽和濃度之人類BAFF(1.25nM最終濃度，基於BAFF之單體MW(=20kDa))，目標在於確定雙特異性抗體在同時結合BAFF時是否仍能中和IL-17。以常規方式，在分析培養基(含有10% FBS、青黴素G(0.2U/mL)及鏈黴素(0.2mcg/mL)之McCoy’s 5A)中培養HT-29細胞。在分析當天，用HBSS沖洗細胞且利用胰蛋白酶+EDTA使其剝離培養瓶。用分析培養基使胰蛋白酶失活。然後在RT下將HT-29細胞以500×g離心5分鐘。使細胞沈澱再懸浮於分析培養基中。用血球計量測細胞密度，且將20,000個HT-29細胞(100mcl)添加至含有抗體/IL-17混合物之96孔板中。將200mcl PBS添加至邊緣各未使用孔(無細胞)中，以降低蒸發引起之邊緣效應。將96孔板置於組織培養培育器(37℃、95%相對濕度、5%CO2)中保持約48小時。
在分析結束時，將分析板離心(以500×g在RT下離心5分鐘)，且將細胞培養基轉移至聚丙烯96孔板中，將該等板密封並在-80℃下冷凍。在藉由ELISA量測CXCL1當天，在RT下將板解凍。用CXCL1夾心ELISA(R&D Systems DuoSet DY275號)依照製造商說明書，使用以下緩衝液及修改法來量測培養基(未經稀釋或以1：3稀釋)中之CXCL1含 量：來自BioFX Labs之1×ELISA洗滌緩衝液(來自10×，編號為WSHW-1000-01)；試樣及標準物體積為50mcL/孔；來自BioFX Labs之受質(1組份HRP受質，編號為TMBW-1000-01)；來自BioFX Labs之終止溶液(編號為LSTP-1000-01；100mcl/孔)。在ELISA反應結束時，在微量板讀取器(Molecular Devices SpectraMax 190)上在450nm下讀取板。以所產生CXCL1之最大量之%(以單獨使用IL-17時為100%)收集數據。使用4參數S形數據擬合法(GraphPad Prism)計算雙特異性抗體或陽性對照組使IL-17所誘導之反應受到50%抑制時之濃度(IC50)。
結果證實，本發明雙特異性抗體以濃度依賴方式抑制IL-17誘導之HT-29細胞之CXCL1分泌。該抑制與用陽性對照抗體觀察到者相當(雙特異性抗體之IC50為2.00±0.21nM，而陽性對照抗體之IC50為1.86±0.22nM(3個獨立實驗之平均值±SEM))，而陰性對照抗體不抑制增殖。此外，在飽和量之BAFF存在下觀察到類似抑制，其中雙特異性抗體之IC50為1.57±0.45nM，而陽性對照抗體之IC50為1.41±0.50nM(3個獨立實驗之平均值±SEM)。本發明雙特異性抗體有效地中和IL-17且此中和不受飽和量之BAFF之存在的影響。
在活體外對BAFF誘導之T1165細胞之增殖之抑制
T1165.17係存活及生長依賴外部因子(IL-1β或BAFF)之鼠類漿細胞瘤細胞系。該等細胞天然表現BAFF之受體且藉由監測增殖來量測其對人類BAFF之反應。
評估1nM至4.1pM之雙特異性抗體之劑量範圍(基於雙特異性抗體之單體MW(=100kDa)之最終濃度)中和可溶BAFF之能力(基於BAFF之單體MW(=20kDa)，分析中之最終可溶BAFF濃度為150pM)。在37℃下在平底96孔組織培養板之內孔中以50mcl總體積將不同濃度之雙特異性抗體與可溶BAFF一起培育30-60分鐘。使用BAFF中和抗體(US7,317,089之4A5-3.1.1-B4)作為分析中之陽性對照。以一 式三份測試各條件。在此分析之變化形式中，測試雙特異性抗體中和膜BAFF之能力。將不同濃度之雙特異性抗體與HEK293細胞之膜部分一起培育，該等細胞表現不可裂解形式之BAFF(藉由使BAFF中之弗林蛋白酶(furin)裂解位點突變從而使得在細胞膜上永久表現BAFF來達成)。在此分析之另一變化形式中，添加飽和濃度之人類IL-17(15.6nM最終濃度，基於IL-17之單體MW(=16kDa))，目標在於確定雙特異性抗體在同時結合IL-17時是否仍能中和可溶或膜BAFF。
以常規方式在補充有2ng/mL重組人類IL-1β之分析培養基(含有10% FBS、HEPES、L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、5×10-5M 2-巰基乙醇、1×抗生素-抗黴劑之RPMI1640)中培養T1165細胞。在分析當天，用分析培養基將細胞洗滌3次且使其於分析培養基中再懸浮至1×105個細胞/mL。將50mcl細胞懸浮液添加至含有抗體與BAFF之混合物之96孔板中。將100mcl分析培養基添加至各未使用邊緣孔(無細胞)中以降低蒸發引起之邊緣效應。將板置於組織培養培育器(37℃、95%相對濕度、5%CO2)中保持約44小時。在分析結束時，將20mcl Promega Cell Titer 96水性單溶液(Aqueous One Solution)添加至各孔中且在37℃下培育1小時至4小時。在微量板讀取器(Molecular Devices SpectraMax 190)上在490nm下讀取板。以抑制%收集數據，其中使用無BAFF之孔作為最低反應且使用具有150pM BAFF之孔作為最大反應。使用4參數S形數據擬合(SigmaPlot)計算雙特異性抗體或陽性對照將BAFF誘導之反應抑制50%之濃度(IC50)。
結果證實，雙特異性抗體以濃度依賴方式抑制可溶BAFF誘導之T1165細胞之增殖。此抑制與用陽性對照抗體觀察到者相當(雙特異性抗體之IC50為0.064±0.021pM，而陽性對照抗體之IC50為0.071±0.002pM(2個獨立實驗之平均值±SEM))，而陰性對照抗體不抑制增殖。此外，在飽和量之IL-17存在下觀察到類似抑制，其中雙特異性 抗體之IC50為0.060±0.014pM，而陽性對照抗體之IC50為0.073±0.012pM(2個獨立實驗之平均值±SEM)。雙特異性抗體有效地中和BAFF且此中和不受飽和量之IL-17之存在的影響。
亦證實雙特異性抗體抑制由膜結合BAFF誘導之T1165細胞增殖之能力。本發明雙特異性抗體有效地抑制由膜結合BAFF誘導之增殖，此類似於陽性對照BAFF抗體(US7,317,089之4A5-3.1.1-B4)。此外，在飽和量之IL-17存在下觀察到類似抑制。
在活體內對人類IL-17誘導之CXCL1產生之抑制
注射人類IL-17導致小鼠循環中之CXCL1快速且短暫地增加。向常規雌性C57B16小鼠(n=8只/組)經皮下注射雙特異性抗體(66mcg/小鼠)或陽性對照抗IL-17抗體(US7,838,638之Fab 126，50mcg/小鼠)或陰性對照抗體(huIgG4，50mcg/小鼠)。兩天後，小鼠接受人類IL-17之單一腹膜內注射(3mcg/小鼠)且在2小時後收集血清並將其儲存在-80℃下直至分析。藉由ELISA測定CXCL1之濃度。用捕獲人類Fc之抗體(Jackson ImmunoResearch 109-005-098，1mcg/mL)塗覆微量滴定板且在4℃下培育過夜。洗滌板，用酪蛋白阻斷，並添加100mcl血清(1：1000稀釋)。在RT下將板培育2h，洗滌並添加HRP標記之檢測抗體(抗人類IgG，Jackson ImmunoResearch 709-035-149)。在RT下將板培育1h，洗滌且使用TMB受質顯色且使用板讀取器讀取。基於適當標準曲線計算濃度。
該等數據確認，人類IL-17使血清CXCL1含量增加。然而，在雙特異性抗體存在下，該等結果證實，相對於接受陰性對照抗體之動物，IL-17誘導之CXCL1增加有所減小(P<0.01，ANOVA)。利用雙特異性抗體達成之CXCL1減少與利用陽性對照抗IL-17抗體觀察到者相當。藉由定量ELISA來確認各組內於雙特異性抗體、陽性及陰性對照抗體中之等效暴露。因此，本發明雙特異性抗體有效地中和小鼠之由人類IL-17誘導之生物效應。比較P值測定與陰性對照/IL-17組。
在活體內對人類BAFF之抑制
攜帶編碼可溶人類BAFF之轉基因之小鼠在脾臟中具有異常高之B淋巴球數。
向針對人類BAFF轉基因之小鼠(n=5只/組)經腹膜內注射單一劑量之雙特異性抗體(660cg/小鼠)或陽性對照抗BAFF抗體(4A5-3.1.1-B4 US7,317,089，500mcg/小鼠)或陰性對照抗體(huIgG4，500mcg/小鼠)。8天後，收集血清及脾臟。製備脾臟細胞之單細胞懸浮液且在溶解紅血球後測定總白血球數。使用細胞表面標記物B220藉由流式細胞術測定B淋巴球之相對百分比。藉由用B220陽性細胞之百分比乘以脾臟中之總淋巴球數來計算每個脾臟之總B細胞數。用捕獲人類Fc之抗體(Jackson ImmunoResearch 109-005-098，1mcg/mL)塗覆微量滴定板且在4℃下培育過夜。洗滌板，用酪蛋白阻斷，並添加100mcl血清(1：5000稀釋)。在RT下將板培育2h，洗滌並添加HRP標記之檢測抗體(抗人類IgG，Jackson ImmunoResearch 709-035-149)。在RT下將板培育1h，洗滌且使用TMB受質顯色並使用板讀取器讀取。基於適當標準曲線計算濃度。
表4：在暴露於雙特異性抗體後針對人類BAFF轉基因之小鼠之脾臟中之B細胞數.
該等結果證實，藉由單一投與雙特異性抗體使針對人類BAFF轉基因之小鼠之脾臟中之B細胞數有所減少(p<0.0001，ANOVA)。B細胞數之此正規化等效於利用陽性對照BAFF抗體所觀察到者。藉由定量ELISA來確認各組內於雙特異性抗體、陽性及陰性對照抗體中之等效暴露。因此，本發明雙特異性抗體有效地中和小鼠之由人類BAFF誘導之生物效應。比較P值測定與陰性對照組。
溶解性及穩定性分析
將雙特異性抗體調配於PBS(pH 7.4)中。使用Amicon濃縮器將雙特異性抗體自1-2mg/mL濃縮至52mg/mL至58mg/mL範圍內之濃度。將濃縮試樣在25℃下儲存4週之時期。於初始濃度下、培育1天、1週及4週時利用尺寸排除層析(SEC)分析試樣之高分子量百分比(HMW%)。在Agilent 1100系統上使用TSK G3000SW-XL(Tosoh Bioscience)管柱實施SEC。使用PBS+0.35M NaCl(pH 7.4)作為移動相，以0.5mL/min運行35分鐘。將1μL體積之濃縮抗體注入管柱中並在280nm下量測檢測。使用ChemStation分析層析圖並使用在單體峰之前溶析之峰之AUC對總AUC之比率來計算高分子量(HMW)%。在不同時間點分析在25℃下儲存之試樣之HMW%且將結果匯總於表5中。
利用包含WO2003016468之BAFF抗體及WO2007070750之IL-17抗體之起始雙特異性抗體進行之初步研究證實，在濃縮至僅6mg/mL後，在4℃下在PBS中儲存3週後，藉由SE-HPLC檢測到HMW物質%增加25%，且在30mg/mL下，在4℃下在PBS中儲存僅2天後，HMW物質%增加15%。該等結果證實，本發明雙特異性抗體相對於起始雙特異性抗體具有顯著改良之性質，包括減少聚集及增加物理穩定性。
<110> 美國禮來大藥廠(ELI LILLY AND COMPANY)
<120> 抗BAFF抗IL-17雙特異性抗體
<130> X19474
<150> 61/768747
<151> 2013-02-25
<150> 61/636302
<151> 2012-04-20
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 1
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 2
<210> 3
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 3
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4

Claims (14)

  1. 一種雙特異性抗體，其包含兩個第一多肽及兩個第二多肽，其中該第一多肽之胺基酸序列係SEQ ID NO：1且該第二多肽之胺基酸序列係SEQ ID NO：2。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中鏈內二硫鍵在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基507與SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基707之間。
  3. 一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之多肽的聚核苷酸序列。
  4. 一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之多肽的聚核苷酸序列。
  5. 一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之多肽之聚核苷酸序列且包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之多肽之聚核苷酸序列。
  6. 一種哺乳動物細胞，其包含如請求項3之DNA分子及如請求項4之DNA分子，該細胞能夠表現包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之第二多肽之雙特異性抗體。
  7. 一種經過如請求項5之DNA分子轉化之哺乳動物細胞，該細胞能夠表現包含胺基酸序列為SEQ ID NO：1之第一多肽及胺基酸序列為SEQ ID NO：2之第二多肽之雙特異性抗體。
  8. 如請求項6或7之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞係CHO。
  9. 一種產生包含胺基酸序列為SEQ ID NO：1之第一多肽及胺基酸序列為SEQ ID NO：2之第二多肽之雙特異性抗體之方法，其包括：(1)在可表現該雙特異性抗體之條件下培育如請求項8之哺乳動物細胞，及(2)回收所表現之雙特異性抗體。
  10. 一種雙特異性抗體，其係藉由如請求項9之方法來產生。
  11. 一種如請求項1、2或10中任一項之雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療以下疾病之藥劑：全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、原發性修格蘭氏症候群(primary Sjögren's syndrome)或多發性骨髓瘤。
  12. 如請求項1、2或10中任一項之雙特異性抗體，其用於療法。
  13. 如請求項1、2或10中任一項之雙特異性抗體，其用於治療全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、原發性修格蘭氏症候群或多發性骨髓瘤。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1、2或10中任一項之雙特異性抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2012149227A (ru) 2010-05-20 2014-06-27 Аблинкс Нв Биологические материалы, относящиеся к her3
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
AR090626A1 (es) * 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos
TW201444867A (zh) * 2013-03-08 2014-12-01 Lilly Co Eli 抗ｔｎｆ－抗ｉｌ－１７雙特異性抗體
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
CA2929846C (en) * 2013-11-19 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
WO2016039801A1 (en) 2014-01-31 2016-03-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel anti-baff antibodies
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
TW202144411A (zh) * 2015-07-23 2021-12-01 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向il-23a與b細胞活化因子(baff)之化合物及其用途
CN105061596B (zh) * 2015-08-05 2019-01-29 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 人b淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及其应用
US20200385478A1 (en) * 2018-01-05 2020-12-10 Biograph 55, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
CN117529506A (zh) * 2021-06-11 2024-02-06 海南先声药业有限公司 抗人il-17抗体和taci的双功能融合蛋白分子

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
AR035119A1 (es) * 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
RU2515108C2 (ru) * 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
KR101158959B1 (ko) 2005-12-13 2012-07-09 일라이 릴리 앤드 캄파니 항-ｉｌ-17 항체
US20110293629A1 (en) * 2010-05-14 2011-12-01 Bastid Jeremy Methods of Treating and/or Preventing Cell Proliferation Disorders with IL-17 Antagonists
AR090626A1 (es) * 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos

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