MX2014012692A - Anticuerpos biespecificos anti-baff-anti-il-17. - Google Patents

Anticuerpos biespecificos anti-baff-anti-il-17.

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Abstract

Se proporcionan anticuerpos biespecíficos que específicamente enlazan el Factor de Activación de células B de la Familia TNF (BAFF) e lnterleucina-17A (lL-17) y se caracterizan porque tienen alta afinidad y fuertes propiedades neutralizantes tanto para BAFF como IL-17. Se espera que los anticuerpos biespecíficos de la invención sean útiles en el tratamiento de Nefritis Lúpica (LN), Lupus Eritematoso Sistémico (SLE), Artritis Reumatoide (RA), Psoriasis (Ps), Espondilitis Anquilosante (AS), Artritis Psoriática (PA), Síndrome de Sjögren primario (pSS), o Mieloma Múltiple (MM).

Description

ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS ANTI-BAFF-ANTI-IL-17 La presente invención está en el campo de la medicina, particularmente en el nuevo campo de anticuerpos biespecíficos dirigidos contra el Factor de Activación de Células B de la familia TNF (BAFF) e lnterleucina-17A (IL-17). Se espera que los anticuerpos biespecíficos de la presente invención sean útiles en el tratamiento de Nefritis Lúpica (LN), Lupus Eritematoso Sistémico (SLE), Artritis Reumatoide (RA), Psoriasis (Ps), Espondilitis Anquilosante (AS), Artritis Psoriática (PA), Síndrome de Sjógren primario (pSS), o Mieloma Múltiple (MM).
Los niveles incrementados de 11-17 se han asociado con diversas afecciones, enfermedades o trastornos incluyendo inflamación de las vías respiratorias, artritis reumatoide, osteoartritis, erosión ósea, abscesos intraperitoneales y adhesiones, trastorno inflamatorio de los intestinos, rechazo de aloinjerto, psoriasis, ciertos tipos de cáncer, angiogénesis, ateroesclerosis y esclerosis múltiple. IL-17 y el receptor IL-17 son sobrerregulados en el tejido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide. El bloqueo de una bioactividad de IL-17 recude la inflamación y erosión ósea en varios modelos de artritis en animales. Además, IL-17 tiene efectos independientes de I L- 1 ß en la ruptura de la matriz de colágeno e inflamación y daflo articular, mientras que IL-17 tiene sinergia con TNF-a para amplificar la inflamación. Por consiguiente, dada su distribución localizada en el sitio de inflamación, la IL-17 parece ser un objetivo posible para el tratamiento de artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes con un perfil de seguridad potencialmente mayor que los fármacos que se dirigen a la circulación sistémica de citocinas pro-inflamatorias tal como TNF-a.
El involucramiento del factor de activación de células B (BAFF) en la patogénesis de enfermedades autoinmunes se ilustra por la sobreexpresión de BAFF en modelos de ratones, la cual conduce a la enfermedad autoinmune que imita la artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y síndrome primario de Sjógren, así como también un incremento de dos veces de la ocurrencia de linfoma de células B. En los humanos, numerosos reportes han mostrado niveles elevados de BAFF en suero en pacientes con SLE, RA, pSS, y esclerosis sistémica. Se ha demostrado que BAFF promueve la expansión de las células Th17 e IL-17 es una citocina efectora crucial para los efectos proinflamatorios mediados por BAFF durante el desarrollo de la artritis inducida por colágeno. También se ha mostrado que IL-17 actúa en sinergia con BAFF para influir en la biología de células B y la patofisiología de SLE. También hay evidencia que tanto BAFF como IL-17 juegan un papel en la patología asociada con LN, en efecto se ha reportado que los pacientes con LN tienen niveles elevados de IL-17 y BAFF.
SLE es una enfermedad autoinmune multisistémica y altamente heterogénea que se caracteriza por el desarrollo de auto-anticuerpos y la formación de complejos inmunes. Un 30-60% de pacientes estimados con SLE tienen afectación renal en alguna etapa durante el transcurso de su enfermedad. LN es una enfermedad autoinmune multifactorial compleja. Si no se trata, la tasa de supervivencia de 5 años de los pacientes con LN es 0-20%. La introducción de terapia inmunosupresora ha mejorado grandemente esta situación y la tasa de supervivencia de 10 años actual es 88%. Sin embargo, esta mejoría tiene un costo para el paciente, ya que muchos de estos tratamientos tienen eventos adversos severos, especialmente puesto que tienen que ser tomados crónicamente. Además, la respuesta es lenta y con frecuencia incompleta, con solo 25-50% de pacientes que llegan a remisión.
La co-administración de un anticuerpo BAFF y anticuerpo IL- 17 requiere ya sea inyecciones de dos productos separados o una inyección única de una co-formulación de dos diferentes anticuerpos. Dos inyecciones permitirían la flexibilidad de la sincronización y cantidad de dosis, pero son inconvenientes a pacientes tanto para cumplimiento como dolor. Una co-formulación también puede proporcionar alguna flexibilidad de cantidades de dosis, pero con frecuencia es bastante desafiante o imposible encontrar condiciones de formulación que permitan la estabilidad química y física de ambos anticuerpos debido a diferentes características moleculares de los dos diferentes anticuerpos.
WO199509917 describe un método para producir anticuerpos tetravalentes biespecíficos (MAb-scFV) usando tecnología de DNA recombinante produciendo un anticuerpo de fragmento variable de cadena ligera fusionado a un anticuerpo completo que tiene una diferente especificidad. Esta fusión de genes se expresa por transfección resultando en un anticuerpo tetravalente que tiene especificidad dual. WO2003016468 describe anticuerpos anti-BAFF que enlazan y neutralizan tanto formas solubles como unidas de membrana de BAFF humano. WO2007070750 describe anticuerpos anti-IL-17 que enlazan y neutralizan IL-17 humana. Sin embargo, cuando se siguen las enseñanzas en WO199509917 para crear un anticuerpo biespecífico de partida que comprende los anticuerpos anti-BAFF de WO2003016468 y los anticuerpos anti-IL-17 de WO2007070750, los presentes inventores descubrieron problemas significativos asociados con la estabilidad química y física. Muchos cambios de aminoácido se requirieron en el anticuerpo biespecífico de partida para superar lo suficiente estos problemas. Ninguna necesidad de cambios actuales se sugiere en el arte. Además, los diversos cambios no son rutinarios o derivados del conocimiento general común. Igualmente, los anticuerpos únicos por si solos no tienen estos problemas, sugiriendo que el ambiente local alrededor de estas áreas difiere del contexto de anticuerpos biespecíficos. Por consiguiente, se necesita la intervención farmacológica con un anticuerpo biespecífico que neutraliza tanto BAFF como IL-17.
La presente invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos.
La presente invención también proporciona una molécula de DNA que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el primer polipéptido.
La presente invención también proporciona una molécula de DNA que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el segundo polipéptido.
La presente invención también proporciona una molécula de DNA que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el primer polipéptido y el segundo polipéptido.
La presente invención también proporciona una célula de mamífero transformada con moléculas de DNA las cuales la célula es capaz de expresar como un anticuerpo biespecífico que comprende el primer polipéptido y el segundo polipéptido.
La presente invención también proporciona un proceso para producir un anticuerpo biespecífico que comprende el primer polipéptido y el segundo polipéptido, que comprender cultivar la célula de mamífero bajo condiciones tales que el anticuerpo biespecífico se expresa.
La presente invención también proporciona un anticuerpo biespecífico producido por el proceso.
La presente invención también proporciona un método para tratar Lupus Eritematoso Sistémico, Nefritis Lúpica, Artritis Reumatoide, Psoriaris, Espondilitis Anquilosante, Artritis Psoriática, síndrome primario de Sjógren, o Mieloma Múltiple que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico.
La presente invención también proporciona un anticuerpo biespecífico para el uso en terapia.
La presente invención también proporciona un anticuerpo biespecífico para el uso en el tratamiento de Lupus Eritematoso Sistémico, Nefritis Lúpica, Artritis Reumatoide, Psoriaris, Espondilitis Anquilosante, Artritis Psoriática, síndrome primario de Sjógren, o Mieloma Múltiple.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
IL-17 humana se entiende que significa una proteína homodimérica que comprende dos proteínas IL-17A humanas. Un heterodímero de IL-17A/F humana es una proteína IL-17A humana y una proteína IL-17F humana.
Un anticuerpo biespecífico se entiende que significa una molécula de inmunoglobulina que comprende cuatro sitios de enlace de antígeno, que enlace dos diferentes antígenos con especificidad para cada antígeno en el formato MAb-scFV. El anticuerpo biespecífico es capaz de enlazar cada antígeno solo o cada antígeno simultáneamente.
El anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende dos primeros polipéptidos y dos segundos polipéptidos. Cada uno de los primeros prolipéptidos forma un enlace de disulfuro intercadena con cada uno de los segundos polipéptidos, y el primer polipéptido forma dos enlaces de disulfuro intercadena con el otro primer polipéptido, y cada uno de los primeros polipéptidos forma diversos enlaces de disulfuro intracadena. La relación de los polipéptidos y los enlaces de disulfuro se muestra en el siguiente esquema: Segundo polipéptido Pri Primer polipéptido Segundo polipéptido La secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es: QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQP PGKGLEWIGE 50 INHSGSTNYN PSLKSRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARGYY 100 DILTGYYYYF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 150 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG 200 TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP 250 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN 300 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ 350 VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 400 LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGG 450 GGSGGGGTGG GGSQVQLVQS GAEVKKPGSS VKVSCKASGY KFTDYHIHWV 500 RQAPGQCLEW MGVINPTYGT TDYNQRFKGR VTITADESTS TAYMELSSLR 550 SEDTAVYYCA RYDYFTGTGV YWGQGTLVTV SSGGGGSGGG GSGGGGSGGG 600 GSDIVMTQTP LSLSVTPGQP ASISCRSSRS LVHSRGETYL HWYLQKPGQS 650 PQLLIYKVSN RFIGVPDRFS GSGSGTDFTL KISRVEAEDV GVYYCSQSTH 700 LPFTFGCGTK LEIK 714 (SEC ID NO: 1) .
La secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido es: EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS RYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 50 ASNRATGIPA RFSGSGSGTD STLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPRTFGQ 100 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQ KV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSNTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 (SEC ID NO : 2) .
El enlace de disulfuro intercadena de cada uno de los primeros polipéptidos y cada uno de los segundos polipéptidos se forma entre el residuo cisteína 137 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 214 de SEC ID NO: 2. El primer polipéptido forma dos enlaces de disulfuro intercadena con el otro primer polipéptido. El primer enlace de disulfuro intercadena se forma entre el residuo cisteína 229 del primer polipéptido de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 229 del otro primer polipéptido de SEC ID NO: 1. El segundo enlace de disulfuro intercadena se forma entre el residuo cisteína 232 del primer polipéptido de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 232 del otro primer polipéptido de SEC ID NO: 1.
Dentro del scFV, un enlace de disulfuro intracadena modificado genéticamente se forma entre el residuo cisteína 507 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 707 de SEC ID NO: 1. Además, un enlace de disulfuro intracadena se forma entre el residuo cisteína 625 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 695 de SEC ID NO: 1. Dentro del MAb, los enlaces de disulfuro intracadena que normalmente ocurren en un anticuerpo lgG4 se forman entre el residuo cisteína 22 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 95 de SEC ID NO: 1, entre el residuo cisteína 150 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 206 de SEC ID NO: 1, entre el residuo cisteína 264 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 324 de SEC ID NO: 1, entre el residuo cisteína 370 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 428 de SEC ID NO: 1, entre el residuo cisteína 485 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 559 de SEC ID NO: 1, entre el residuo cisteína 23 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 88 de SEC ID NO: 1, y entre el residuo cisteína 134 de SEC ID NO: 2 y el residuo cisteína 194 de SEC ID NO: 2.
El primer polipéptido comprende una primera región variable de cadena pesada (HCVR1), una región constante de cadena pesada (CH), una segunda región variable de cadena pesada (HCVR2) y una segunda región variable de cadena ligera (LCVR2). El segundo polipéptido comprende una primera región variable de cadena ligera (LCVR1) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones HCVR y LCVR se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones de armazón (FR). Cada HCVR y LCVR está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas de amino término a carboxilo término en el siguiente orden: FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Las 3 CDRs de HCVR1 son referidas como CDRH1-1, CDRH1-2, y CDRH1-3 y las 3 CDRs de HCVR2 son referidas como CDRH2-1, CDRH2-2, y CDRH2-3 y las 3 CDRs de LCVR1 son referidas como CDRL1-1, CDRL1-2 y CDRL1-3 y las 3 CDRs de LCVR2 son referidas como CDRL2-1, CDRL2-2 y CDRL2-3.
La CH se fusiona a HCVR2 por un enlazante de aminoácido (L1). HCVR2 se fusiona a LCVR2 por un enlazante de aminoácido (L2).
La relación de las diversas regiones y enlazantes es como sigue: Modificación Genética de Anticuerpo Biespecífico Los problemas significativos asociados con la estabilidad química y física se encontraron cuando se construyó un anticuerpo biespecífico en el formato MAb-scFv con la porción de enlace anti-IL-17 en la configuración de scFv. Las modificaciones químicas se hicieron en las porciones de CDRL2-1 y CDRH2-2 del anticuerpo biespecífico que mejoran la estabilidad física y reducen la agregación dependiente de la concentración. Los estudios extensos de solubilidad y estabilidad de proteína identificaron residuos químicamente inestables en CDRL2-1 y CDRH2-2. Estos residuos lábiles se remplazaron con aminoácidos de carga neutra usando bibliotecas de objetivo construidas por agotamiento de codón. Adicionalmente, la superficie electrostática del anticuerpo biespecífico se calculó y los parches cargados se identificaron. Las rupturas de estos parches cargados en el scFv condujeron a una disminución en la auto-asociación de proteínas. Sin embargo, se identificó una mutación en la porción de CDRH2-1 del anticuerpo biespecífico que volvió a equilibrar la distribución electrostática de superficie, y mejoró la solubilidad y estabilidad física a altas concentraciones. Ninguno de los puntos anteriores se encontró en los anticuerpos únicos parentales. Estos problemas se encontraron solamente en el contexto de la construcción de un anticuerpo biespecífico en el formato Ab-scFv, sugiriendo que el ambiente local alrededor de las áreas mutadas del anticuerpo único difirió en el contexto de un anticuerpo biespecífico.
Las modificaciones químicas adicionales se hicieron para estabilizar la interfaz de HCVR2/LCVR2 en la porción de IL-17 del anticuerpo biespecífico, y reducir la agregación de anticuerpo biespecífico. Los estudios conducidos para determinar la agregación mostraron que la auto-asociación de proteína observada no fue impulsada por la inestabilidad conformacional de los dominios de HCVR2 o LCVR2 individuales, sino más bien por la abertura o respiración de la interfaz de HCVR2/LCVR2, conduciendo a interacciones intermoleculares de proteína. Por consiguiente, varios enlaces de disulfuro intracadena se introdujeron en la interfaz de HCVR2/LCVR2 de la porción IL-17 del anticuerpo biespecífico. Tal enlace de disulfuro intracadena ocurre en cada uno de los primeros polipéptipos entre el residuo cisteína 507 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 707 de SEC ID NO: 1. Este enlace de disulfuro conecta covalentemente la interfaz de HCVR2/LCVR2 en la porción IL-17 del anticuerpo biespecífico, lo cual estabiliza la interfaz de HCVR2/LCVR2 y reduce las interacciones intermoleculares de proteína que pueden conducir a inestabilidad física y limitaciones de formulación no favorables. De los nueve diferentes enlaces de disulfuro probados, 8 expresaron proteína funcional, la magnitud de la pérdida de afinidad varió desde aproximadamente 2 a aproximadamente 35 veces. El enlace de disulfuro intracadena en cada uno de los primeros polipéptidos entre el residuo cisteína 507 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 707 de SEC ID NO: 1 estabiliza mejor la interfaz de HCVR2/LCVR2 mientras mantiene la afinidad de enlace óptima para IL-17.
Además, los estudios indicaron que la longitud del enlazante para L1 afectó las cinéticas de enlace. El análisis cinético (por resonancia de plasmón superficial) mostró que un enlazante de 10 aminoácidos causó una velocidad Kon 2 veces más lenta en comparación con los enlazantes de 15 aminoácidos y 20 aminoácidos. Por consiguiente, una longitud de enlazante de 15 se introdujo en el anticuerpo biespecífico de la presente invención.
Enlace de Anticuerpo Biespecífico Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención enlazan tanto BAFF humano como IL-17 humana y neutralizan al menos una bioactividad de BAFF humano y al menos una bioactividad de IL-17 humana in vitro o in vivo. Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención son inhibidores potentes de IL-17 en la presencia y ausencia de BAFF in vitro. Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención son potentes inhibidores de BAFF tanto soluble como unido a la membrana en la presencia o ausencia de IL-17 in vitro. Los anticuerpos biespecíficos de la invención se caracterizan adicionalmente por tener una afinidad de enlace (KD) para BAFF humano en el intervalo de 150 pM a 1 pM e IL-17 humana en el intervalo de 50 pM a 1 pM. Los anticuerpos biespecíficos tienen una afinidad de enlace para el heterodímero de IL-17A/F humana de aproximadamente 90 pM.
Los anticuerpos biespecíficos neutralizan efectivamente el BAFF soluble así como también unido a la membrana y esta neutralización no es afectada por la presencia de cantidades saturantes de IL-17 humana. Los anticuerpos biespecíficos neutralizan efectivamente IL-17 humana y esta neutralización no se afecta por la presencia de cantidades saturantes de BAFF humano.
Expresión de Anticuerpo Biespecífico Los vectores de expresión capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente son bien conocidos en el arte. Los vectores de expresión pueden codificar un péptido señal que facilita la secreción de los polipéptidos de una célula huésped. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo. El primer polipéptido y el segundo polipéptido se pueden expresar independientemente de diferentes promotores a los cuales se enlazan operativamente en un vector o, alternativamente, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se pueden expresar independientemente de diferentes promotores a los cuales se enlazan operativamente en dos vectores - uno que expresa el primer polipéptido y uno que expresa el segundo polipéptido.
Una célula huésped incluye células establemente o transitoriamente transfectadas, transformadas, transducidas o infectadas con uno o más vectores de expresión que expresan un primer polipéptido, un segundo polipéptido o tanto un primer polipéptido como un segundo polipéptido de la invención. La creación y aislamiento de líneas de células huéspedes que producen un anticuerpo biespecífico de la invención se pueden realizar usando técnicas estándares conocidas en el arte. Las células de mamífero son células huéspedes preferidas para la expresión de anticuerpos biespecíficos. Las células de mamífero particulares son HEK 293, NSO, DG-44, y CHO. Preferiblemente, los anticuerpos biespecíficos son secretados en el medio en el cual las células huéspedes son cultivadas, del cual los anticuerpos biespecíficos se pueden recuperar o purificar.
Es bien conocido en el arte que la expresión de anticuerpos en mamíferos resulta en glicosilación. Típicamente, la glicosilación ocurre en la región Fe del anticuerpo en un sitio de N-glicosilación altamente conservado. Los N-glicanos típicamente se unen a asparagina. Cada uno de los primeros polipéptidos es glicosilado al residuo asparagina 300 de SEC ID NO: 1.
Una secuencia de polinucleótido de DNA particular que codifica el primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1 es: CAGGTGCAACTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTG TCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATTCGCCAGC CCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCC GTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGTATTACGATATTTTGA CTGGTTATTATTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCG CCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT GCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC TCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCC GAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGG AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGA ATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCTGGAGGCGGAGGATCCGGGGGAGGGGGTACCGGAGGAGGGGGCTCGCAGGTGCAG CTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCAT CTGGTTACAAGTTCACTGACTACCATATTCATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAATGCCTTGA GTGGATGGGAGTAATTAATCCTACTTATGGTACTACTGACTACAATCAGCGGTTCAAAGGCCGT GTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG AGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATGATTACTTTACTGGGACGGGTGTGTACTGGGG CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGAGGATCTGGTGGAGGTGGCTCAGGAGGT GGCGGAAGCGGCGGAGGTGGAAGTGATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCCGTCA CCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTAGGAGCCTTGTACACAGTCGTGGAGA AACCTATTTACATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATAAAGTT TCCAACCGGTTTATTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTCACAC TGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCCGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAAGTACACATCT TCCATTCACGTTTGGCTGCGGGACCAAGCTGGAGATCAAA SEC ID NO: 3.
Una secuencia de polinucleótido de DNA particular que codifica el segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 2 es: GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGA GCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCCGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTCCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGAT TTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGAACTGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT GAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAACACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACA CAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGC SEC ID N0:4.
El med io, en el cual un anticuerpo biespecífico se ha secretado, se puede purificar por técnicas convenciona les. Por ejem plo , el medio se puede apl icar y eluir de una columna de Proteína A o G usando métodos convencionales . Los m ultímeros y agregados solubles se pueden remover efectivamente por técnicas com u nes, incluyendo exclusión por tamaño, interacción hidrofóbica , intercambio iónico, o cromatografía de hidroxiapatita . E l producto se puede congelar inmed iatamente, por ejem plo a -70°C , o se puede liofi lizar.
Puede haber la necesidad de reducir el nivel de anticuerpo biespecífico mal plegado presente en el med io. El anticuerpo biespecífico mal plegado tam bién es conocido como diacuerpo . El mal plegamiento resu lta cuando uno o más enlaces de disulfuro se forman incorrectamente, ya sea ínter o intracadenas. El anticuerpo biespecífico mal plegado se puede purificar por técnicas convencionales. Por ejem plo , el med io q ue contiene el anticuerpo biespecífico mal plegado se puede apl icar y eluir de resina de i ntercam bio catión ico fuerte. Por ejemplo , se usa resina de intercambio catiónico fuerte SP-Sefarosa H P para purificar el anticuerpo biespecífico correctamente plegado del diacuerpo. El pH del medio que contiene el diacuerpo se ajusta a pH 8 usando Tris Base 1M. El medio se carga sobre una columna de SP-Sefarosa HP, se lava con 2 volúmenes de columna de Tris 20 mM, pH 8 y se eluye con Tris 20 mM, NaCI 100 mM, pH 8 sobre 30 volúmenes de columna (NaCI 0-70 mM). Los grupos colectados se pueden evaluar para alto peso molecular versus pico principal. Un resultado típico es un mejoramiento de 10% diacuerpo a 1% diacuerpo con 71% de recuperación.
En otro ejemplo, se usa resina de intercambio catiónico fuerte Poros HS 50 para purificar el anticuerpo biespecífico correctamente plegado del diacuerpo. El pH del medio que contiene el diacuerpo se ajusta a pH 8 usando Tris Base 1M. El medio se carga sobre columna de SP-Sefarosa HP y se eluye con Tris 20 mM, NaCI 100 mM, pH 8 sobre 15 volúmenes de columna (NaCI 15-50 mM). Los grupos colectados se pueden evaluar para alto peso molecular versus pico principal. Un resultado típico es un mejoramiento de 10% diacuerpo a 1% diacuerpo con 57% de recuperación.
Usos Terapéuticos Un paciente se refiere a un mamífero, preferiblemente un humano con una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de un nivel disminuido de BAFF y/o IL-17 o bioactividad disminuida de BAFF y/o IL-17.
El tratamiento y/o tratado se pretende que se refiera a todos los procesos en donde puede haber una desaceleración, interrupción, detención, control, o suspensión de la progresión de los trastornos descritos en la presente, pero no necesariamente indica una eliminación total de todos los síntomas del trastorno. Se espera que el anticuerpo biespecífico de la presente invención trate lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, artritis reumatoide, psoriaris, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, síndrome primario de Sjógren, o mieloma múltiple.
Composición Farmacéutica Un anticuerpo biespecífico de la invención se puede incorporar en una composición farmacéutica adecuada para la administración a un paciente. Tales composiciones farmacéuticas se diseñan para ser apropiadas para el modo de administración seleccionado, y diluyentes, portador, y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes dispersantes, amortiguadores, surfactantes, conservadores, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares se usan como sea apropiado. Las composiciones se pueden diseñar de conformidad con las técnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Reminaton. The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 la cual proporciona un compendio de técnicas de formulación como generalmente se conocen por los profesionales. Los portadores adecuados para composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material el cual, cuando se combina con un anticuerpo biespecífico de la invención, retiene la actividad de la molécula y no es reactivo con el sistema inmune del paciente. Una composición farmacéutica de la presente invención comprende un anticuerpo biespecífico y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de la presente invención se puede administrar a un paciente en riesgo de o que exhibe enfermedades o trastornos como se describen en la presente usando técnicas de administración estándares.
Una composición farmacéutica de la invención contiene una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico de la invención. Una cantidad efectiva se refiere a una cantidad necesaria (a dosificaciones y por períodos de tiempo y por los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico puede variar de acuerdo con los factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo Una cantidad efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o nocivo del anticuerpo biespecífico, es compensado por los efectos terapéuticamente benéficos.
El anticuerpo biespecífico del siguiente ejemplo de expresión y demostración de propiedades comprende dos primeros polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1 y dos segundos polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 2 en donde cada uno de los primeros polipéptidos forma un enlace de disulfuro intercadena con cada uno de los segundos polipéptidos entre el residuo cisteína 137 de SEC ID NO: 1 y el residuo cisteína 214 de SEC ID NO: 2, y el primer polipéptido forma dos enlaces de disulfuro intercadena con el otro primer polipéptido entre el residuo de cisteína 229 de primer polipéptido de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 229 del otro primer polipéptido de SEC ID NO: 1 y entre el residuo de cisteína 232 de primer polipéptido de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 232 del otro primer polipéptido de SEC ID NO: 1, y cada uno de los primeros polipéptidos forma un enlace de disulfuro intracadena entre el residuo de cisteína 22 y el residuo cisteína 95 de SEC ID NO: 1, entre el residuo de cisteína 150 de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 206 de SEC ID NO: 1, entre el residuo de cisteína 264 de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 324 de SEC ID NO: 1, entre el residuo de cisteína 370 de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 428 de SEC ID NO: 1, entre el residuo de cisteína 485 de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 559 de SEC ID NO: 1, entre el residuo de cisteína 507 de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 707 de SEC ID NO: 1, y entre el residuo de cisteína 625 de SEC ID NO: 1 y el residuo de cisteína 695 de SEC ID NO: 1, y cada uno de los segundos polipéptidos forma un enlace de disulfuro intracadena entre el residuo de cisteína 23 de SEC ID NO: 2 y el residuo de cisteína 88 de SEC ID NO: 2, y entre el residuo de cisteína 134 de SEC ID NO: 2 y el residuo de cisteína 194 de SEC ID NO: 2, y en donde cada uno de los primeros polipéptidos es glicosilado al residuo asparagina 300 de SEC ID NO: 1. La relación de anticuerpo biespecífico correctamente plegado a diacuerpo mal plegado está en el orden de 90:10.
Expresión de Anticuerpo Biespecífico El anticuerpo biespecífico se puede expresar y purificar esencialmente como sigue. Un vector de expresión de glutamina sintetasa (GS) que contiene el DNA de SEC ID NO: 3 (que codifica el primer polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1) y SEC ID NO: 4 (que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEC ID NO: 2) se usa para transfectar la línea de células de hámster Chino, CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, Reino Unido) por electroporación. El vector de expresión codifica un promotor temprano de SV (Virus de Simio 40 E) y el gene para GS. La expresión de GS permite la síntesis bioquímica de glutamina, un aminoácido requerido por las células CHO 1SV. En la post-transfección, las células sufren de selección volumétrica con L-metionina sulfoximina 50 µ? (MSX). La inhibición de GS por MSX se utiliza para incrementar la severidad de selección. Las células con integración del cDNA de vector de expresión en regiones transcripcionalmente activas del genoma de célula huésped se pueden seleccionar contra células tipo silvestre CHOK1SV, las cuales expresan un nivel endógeno de GS. Los grupos transfectados se colocan en placas a baja densidad para permitir la excrecencia cercana a la clonal de células de expresión estable. Las cavidades principales se seleccionan para la expresión de anticuerpo biespecífico y luego se escalan en cultivos de suspensión libres de suero que se usan para la producción. El medio aclarado, en el cual el anticuerpo biespecífico se ha secretado, se aplica a una columna de afinidad de Proteína A que se ha equilibrado con un amortiguador compatible, tal como solución salina amortiguada con fosfato (pH 7.4). La columna se lava para remover los componentes de enlace no específicos. El anticuerpo biespecífico unido se eluye, por ejemplo, por gradiente de pH (tal como amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.8 a amortiguador de citrato de sodio 0.1 M pH 2.5). Las fracciones de anticuerpo biespecífico se detectan, tal como por SDS-PAGE o exclusión por tamaño analítica, y luego se agrupan. Los multímeros y agregado soluble se pueden remover efectivamente por técnicas comunes, incluyendo exclusión por tamaño, intetracción hidrofóbica, intercambio iónico, o cromatografía de hidroxiapatita. El anticuerpo biespecífico se puede concentrar y/o filtrar estéril usando técnicas comunes. La pureza del anticuerpo biespecífico después de estas etapas de cromatografía es mayor que 98%. El anticuerpo biespecífico se puede congelar inmediatamente a -70°C o almacenar a 4°C por varios meses.
Afinidad de enlace a IL-17 y BAFF La afinidad de enlace y estequiometría de enlace del anticuerpo biespecífico a IL-17 humana y BAFF humano se determinaron usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore 2000 cebado con amortiguador de corrida HBS-EP+ (GE Healthcare, Hepes 10 mM pH7.4 + NaCI 150 mM + EDTA 3 mM + 0.05% surfactante P20) y temperatura de análisis establecida a 25°C. Un chip CM5 que contiene proteína A inmovilizada (generada usando acoplamiento de amina NHS-EDC estándar) en todas las cuatro celdas de flujo (Fe) se utilizó para emplear una metodología de captura. Las muestras de anticuerpo se prepararon a 1 0 mcg/mL por dilución en amortiguador de corrida. La IL-17 humana o BAFF humano se prepararon a concentraciones finales de 20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1 .25 y 0 (solución testigo) nM por dilución en amortiguador de corrida. Cada ciclo de análisis consistió de (1 ) captura de las muestras de anticuerpo en celdas de flujo separadas (Fc2, Fc3, y Fc4) , (2) inyección de 250 mcL (300-sec) de I L-1 7 humana o BAFF humano sobre todas las Fe a 50 mcL/min, (3) retorno al flujo de amortiguador por 20 min para monitorear la fase de disociación, (4) regeneración de superficies del chip con una inyección de 5 mcL (30 seg) de glicina, pH 1 .5, (5) equilibrio de superficies del chip con una inyección de 10 mcL (60 seg) de HBS-EP+. Los datos se procesaron usando doble referenciado estándar y se ajustaron a un modelo de enlace 1 : 1 usando software Biacore 2000 Evaluation, versión 4.1 , para determinar la velocidad de asociación (kon, unidades M" 1s" 1 ), velocidad de disociación (k0ff , unidades s" 1 ) , y Rmax (unidades RU). La constante de disociación de equilibrio (KD) se calculó de la relación KD = koff/k0n, y está en unidades molares.
Tabla 1 : Afinidad de enlace a I L-1 7 humana y BAFF humano por el anticuerpo biespecífico.
Estos resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención enlaza IL-17 humana y BAFF humano.
Enlace Simultáneo de IL-17 y BAFF Se utilizó el instrumento BIAcore 2000 para determinar si IL- 17 humana y BAFF humano pueden enlazar el anticuerpo biespecífico simultáneamente. Excepto como se señaló, todos los reactivos y materiales se compraron de BIAcore AB (Upsala, Suecia). Todas las mediciones se realizaron a 25°C. Se utilizó amortiguador HBS-EP+ (cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, 0.05 % (p/v) de surfactante P-20, y HEPES 10 mM, pH7.4) como el amortiguador de corrida y amortiguador de muestra. La Proteína A se inmovilizó en celdas de flujo 1 y 2 de un chip de sensor CM4 usando un kit de acoplamiento de amina. El anticuerpo biespecífico primero se capturó en la celda de flujo 2, seguido por inyección de IL-17 humana a 20 nM por 5 min para saturar el sitio de enlace de IL-17. Después del enlace de IL-17, BAFF humano a 20 nM luego se inyectó por 5 min. y se observó señal de enlace adicional. La superficie de chip luego se regeneró usando glicina 10 mM pH 1.5. El mismo proceso se repitió excepto con un diferente orden de IL-17 humana y BAFF humano. La estequiometría se calculó para asegurar la saturación completa de IL-17 humana o BAFF humano al anticuerpo biespecífico. La estequiometría de IL-17 humana al anticuerpo biespecífico típicamente es a -1.3 con base en un experimento de enlace cinético. De manera similar, la estequiometría de BAFF humano al anticuerpo biespecífico típicamente es a ~1.0 con base en un experimento de enlace cinético. El Ab de BAFF de control es 4A5-3.1 .1 -B4 de US7,31 7, 089. El Ab de I L-1 7 de control es Fab 1 26 de US7,838,638.
Tabla 2: Enlace simultáneo de I L-1 7 humana y BAFF humano al anticuerpo biespecífico.
Estos resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención puede enlazar IL-17 humana y BAFF humano simultáneamente como se muestra por el incremento de las unidades de respuesta (? RU) de los dos ligandos que enlazan el anticuerpo biespecífico.
Inhibición de la producción de CXCL1 inducida por I L-1 7 in vitro a partir de células HT-29 Las células HT-29 son células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano que expresan naturalmente el receptor IL-17. La incubación de células HT29 con I L-1 7 humana resulta en la producción de CXCL1, que se puede medir usando un ELISA comercialmente disponible.
Un intervalo de dosis del anticuerpo biespecífico de 41200 a 2.64 pM se evaluó (concentración final basada en el MW monomérico del anticuerpo biespecífico (=100 kDa)). Cada concentración de prueba del anticuerpo biespecífico luego se agregó (50 mcl) a las cavidades que contienen IL-17 recombinante (la concentración final de IL-17 en la cavidad es 3.75 nM (con base en el MW monomérico de IL-17 (=16 kDa)). La prueba se realiza en cavidades triplicadas por tratamiento. El medio de ensayo se utilizó para controles de "medio solo" e "IL-17 sola". Un anticuerpo neutralizante de IL-17 (Fab 126 de US7, 838,638) se utilizó como control positivo en el ensayo. Las placas que contienen mezclas de IL-17 y anticuerpo se incubaron por 60 a 90 minutos a 37°C, 95% de humedad relativa, 5% C02 en las cavidades internas de las placas de 96 cavidades tratadas con cultivo de tejido. En una variación de este ensayo, una concentración saturante de BAFF humano se agregó (1.25 nM de concentración final con base en el MW monomérico de BAFF (=20 kDa)), con el objetivo de determinar si el anticuerpo biespecífico aún sería capaz de neutralizar IL-17 cuando se une simultáneamente a BAFF. Las células HT-29 se cultivaron rutinariamente en medio de ensayo (McCoy 5A que contiene 10% FBS, penicilina G (0.2 U/mL) y estreptomicina (0.2 mcg/mL)). En el día del ensayo, las células se enjuagaron con HBSS y se separaron de los matraces de cultivo con tripsina + EDTA. La tripsina se inactivo con medio de ensayo. Las células HT-29 luego se centrifugaron a 500 Xg por 5 minutos a RT. La 8 pella celular se resuspendió en medio de ensayo. La densidad celular se midió con hemocitómetro, y 20,000 células HT-29 (en 100 mcl) se agregaron a las placas de 96 cavidades que contienen la mezcla de anticuerpo/IL-17. Doscientos mcl de PBS se agregaron a cada una de las cavidades de borde no usadas (sin células) para reducir los efectos de borde resultantes de la evaporación. Las placas de 96 cavidades se colocaron en un incubador de cultivo de tejido (37°C, 95% de humedad relativa, 5% C02) por aproximadamente 48 horas.
Al final del ensayo, las placas se centrifugaron (500 Xg por 5 minutos a RT), y el medio de cultivo celular se transfirió a placas de 96 cavidades de polipropileno, las cuales se sellaron y congelaron a -80°C. En el día de la medición de CXCL1 por ELISA, las placas se descongelaron a RT. Los niveles de CXCL1 en medio (ya sea no diluido, o diluido 1:3) se midieron con un ELISA de intercalación de CXCL1 (R&D Systems DuoSet #DY275), según las instrucciones del fabricante, usando los siguientes amortiguadores y modificaciones: 1X amortiguador de lavado de ELISA de BioFX Labs (de 10X, #WSHW-1000-01); volumen de muestra y estándar de 50 mcL por cavidad; sustrato de BioFX Labs (1 sustrato HRP de componente, #TMBW-1000-01 ); una solución de detención de BioFX Labs (#LSTP-1000-01 ; 100 mcl por cavidad). Al final de las reacciones de ELISA, las placas se leyeron a 450 nm en un lector de microplacas (Dispositivos Moleculares SpectraMax 190). Los datos se colectaron como % de cantidad máxima de CXCI1 producida (con IL-17 sola siendo 100%). La concentración donde 50% de la respuesta inducida por IL-17 se inhibió (IC50) ya sea por anticuerpo biespecífico o el control positivo se calculó usando un ajuste sigmoidal de 4 parámetros de los datos (GraphPad Prism).
Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención inhibió la secreción inducida por IL-17 de CXCL1 por células HT-29 en una manera dependiente de la concentración. La inhibición es comparable con aquella observada con el anticuerpo de control positivo (con una IC50 para anticuerpo biespecífico de 2.00 ± 0.21 nM versus 1.86 ± 0.22 nM para el anticuerpo de control positivo (promedio de 3 experimentos independientes ± SEM)), mientras que el anticuerpo de control negativo no inhibe la proliferación. Además, se observó una inhibición similar en la presencia de una cantidad saturante de BAFF, con una IC50 para anticuerpo biespecífico de 1.57 ± 0.45 nM versus 1.41 ± 0.50 nM para el anticuerpo de control positivo (promedio de 3 experimentos independientes ± SEM). El anticuerpo biespecífico de la presente invención neutraliza efectivamente IL-17 y esta neutralización no es afectada por la presencia de cantidades saturantes de BAFF.
Inhibición de proliferación inducida por BAFF in vitro de células T1165 T1165.17 es una línea celular de plasmacitoma murino que es dependiente de factores externos (IL-1 beta o BAFF) para supervivencia y crecimiento. Estas células expresan naturalmente el receptor para BAFF y su respuesta a BAFF humano se mide monitoreando la proliferación.
Un intervalo de dosis del anticuerpo biespecífico de 1 nM a 4.1 pM (concentración final con base en el MW monomérico de anticuerpo biespecífico (=100 kDa)) se evaluó para la capacidad de neutralizar BAFF soluble (la concentración de BAFF soluble final en el ensayo es 150 pM con base en el MW monomérico de BAFF (=20 kDa)). Varias concentraciones de anticuerpo biespecífico se incubaron con BAFF soluble por 30-60 minutos a 37°C en las cavidades internas de una placa de cultivo de tejido de 96 cavidades de fondo plano en un volumen total de 50 mcl. Un anticuerpo neutralizante BAFF (4A5-3.1.1-B4 de US7,317,089) se utilizó como control positivo en el ensayo. Cada condición se probó por triplicado. En una variación de este ensayo, la capacidad de la condición de anticuerpo biespecífico se probó por triplicado. En una variación de este ensayo, se probó la capacidad de anticuerpo biespecífico para neutralizar el BAFF de membrana. Varias concentraciones de anticuerpo biespecífico se incubaron con la fracción de membrana de células HEK293 que expresan una forma no escindible de BAFF (lograda mutando el sitio de escisión de furina en BAFF, resultando en la expresión permanente de BAFF en la membrana de células). En otra variación de este ensayo, una concentración saturante de IL-17 humana se agregó (15.6 nM de concentración final, con base en el MW monomérico de IL-17 (=16 kDa)), con el objetivo de determinar si el anticuerpo biespecífico sería capaz de neutralizar ya sea BAFF soluble o de membrana cuando se une simultáneamente a IL-17.
Las células T1165 se cultivaron rutinariamente en medio de ensayo (RPMI 1640 que contiene 10% FBS, HEPES, L-Glutamina, Piruvato de Sodio 1 mM, 5 x 10~5 M 2-mercaptoetanol, 1X antibiótico- antimicótico) suplementado con 2 ng/mL de IL-1 beta humana recombinante. En el día del ensayo, las células se lavaron 3 veces con medio de ensayo y se resuspendieron a 1 x 105 células/ml en medio de ensayo. Cincuenta mcl de la suspensión celular se agregaron a la placa de 96 cavidades, que contiene la mezcla de anticuerpo y BAFF. Cien mcl de medio de ensayo se agregaron a cada una de las cavidades de borde no usadas (sin células) para reducir los efectos de borde resultantes de la evaporación. Las placas se colocaron en un incubador de cultivo de tejido (37°C, 95% de humedad relativa, 5% C02) por aproximadamente 44 horas. Al final del ensayo 20 mcl de Titulador de Células Promega 96 Aqueous One Solution se agregaron a cada cavidad y se incubaron por 1 a 4 horas a 37°C. Las placas se leyeron a 490 nm en un lector de microplaca (Molecular Devices SpectraMax 190). Los datos se colectaron como % de inhibición, usando cavidades sin BAFF como las respuestas mínimas y cavidades con BAFF 150 pM como las respuestas máximas. La concentración donde 50% de la respuesta inducida por BAFF se inhibió (IC50) ya sea por anticuerpo biespecífico o el control positivo se calculó usando un ajuste sigmoidal de 4 parámetros de los datos (SigmaPlot).
Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico inhibe la proliferación inducida por BAFF soluble de células T1165 en una manera dependiente de la concentración. Esta inhibición es comparable con aquella observada con el anticuerpo de control positivo (con una IC50 para anticuerpo biespecífico de 0.064 ± 0.021 pM versus 0.071 ± 0.002 pM para el anticuerpo de control positivo (promedio de 2 experimentos independientes ± SEM)), mientras que el anticuerpo de control negativo no inhibe la proliferación. Además, una inhibición similar se observó en la presencia de una cantidad saturante de IL-17, con una IC50 para anticuerpo biespecífico de 0.060 ± 0.014 pM versus 0.073 ± 0.012 pM para el anticuerpo de control positivo (promedio de 2 experimentos independientes ± SEM). El anticuerpo biespecífico neutraliza efectivamente BAFF y esta neutralización no es afectada por la presencia de cantidades saturantes de IL-17.
La capacidad del anticuerpo biespecífico para inhibir la proliferación de células T1165 inducida por BAFF unido a la membrana también se demostró. El anticuerpo biespecífico de la presente invención inhibe efectivamente la proliferación inducida por BAFF unido a la membrana de manera similar como el anticuerpo BAFF de control positivo (4A5-3.1.1-B4 de US7, 317,089). Además, se observó inhibición similar en la presencia de una cantidad saturante de IL-17.
Inhibición de producción inducida por IL-17 humana de CXCL1 in vivo La inyección de IL-17 humana conduce a un incremento rápido y transitorio de CXCL1 de ratón en la circulación. Ratones C57B16 hembras regulares (n=8 por grupo) se inyectaron SC ya sea con anticuerpo biespecífico (66 mcg/ratón), o un anticuerpo anti-IL-17 de control positivo (Fab 126 de US7,838,638, 50 mcg/ratón) o anticuerpo de control negativo (hulgG4, 50 mcg/ratón). Dos días después, los ratones recibieron una inyección IP única de IL-17 humana (3 mcg/ratón) y 2 horas después el suero se colectó y se almacenó a -80°C hasta el análisis. La concentración de CXCL1 se determinó por ELISA. Las placas de microtitulación se revistieron con un Fe de captura de anticuerpo (Jackson ImmunoResearch 1 09-005-098, 1 mcg/mL) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron, se bloquearon con caseína, y se agregaron 1 00 mcl de suero (dilución 1 : 1 000). Las placas se incubaron por 2 h a RT, se lavaron y se agregó un anticuerpo de detección etiquetado con HRP (IgG anti-humana, Jackson I mmunoResearch 709-035-149). Las placas se incubaron por 1 h a RT, se lavaron y desarrollaron usando sustrato TMB y se leyeron usando un lector de placa. La concentración se calculó con base en las curvas estándares apropiadas.
Tabla 3: Niveles inducidos por I L-1 7 de CXCL1 después de la exposición a anticuerpo biespecífico.
Estos datos confirman que I L-1 7 humana resulta en un incremento de niveles de CXCL1 en suero. Sin embargo, en la presencia del anticuerpo biespecífico estos resultados demuestran que el incremento inducido por I L-1 7 de CXCL1 se reduce (P<0.01 , ANOVA) con relación a los animales que reciben el anticuerpo de control negativo. La reducción de CXCL1 con anticuerpo biespecífico es comparable con aquella observada con el anticuerpo anti-IL-17 de control positivo. La exposición equivalente a cualquier anticuerpo biespecífico, los anticuerpos de control positivo y negativo dentro de cada grupo, se confirmó por ELISA cuantitativo. Por consiguiente, el anticuerpo biespecífico de la presente invención neutraliza efectivamente los efectos biológicos inducidos por IL-17 humana en el ratón. La determinación de valor p se comparó con el grupo de control negativo/IL-17.
Inhibición de BAFF humano in vivo Los ratones que portan un transgene que codifica BAFF humano soluble tienen un número anormalmente alto de linfocitos B en el bazo.
Ratones transgénicos para BAFF humano (n=5 por grupo) se inyectaron IP ya sea con una dosis única de anticuerpo biespecífico (660 mcg/ratón), o un anticuerpo anti-BAFF de control positivo (4A5-3.1.1-B4 US7,317,089, 500 mcg/ratón) o anticuerpo de control negativo (hulgG4, 500 mcg/ratón). Ocho días después, el suero y bazos se recolectaron. Una suspensión celular única de células de bazo se preparó y el número total de leucocitos se determinó después del lisado de los glóbulos rojos. El porcentaje relativo de linfocitos B se determinó usando el marcador de superficie celular B220 por citometría de flujo. El número total de células B por bazo se calculó multiplicando el porcentaje de células positivas B220 por el número total de linfocitos en el bazo. Las placas de microtitulación se revistieron con un Fe humano de captura de anticuerpo (Jackson ImmunoResearch 1 09-005-098, 1 mcg/mL) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron, se bloquearon con caseína, y se agregaron 100 mcl de suero (dilución 1 : 5000). Las placas se incubaron por 2 h a RT, se lavaron y se agregó un anticuerpo de detección etiquetado con HRP (IgG anti-humana, Jackson ImmunoResearch 709-035-149). Las placas se incubaron por 1 h a RT, se lavaron y desarrollaron usando sustrato TMB y se leyeron usando un lector de placas. La concentración se calculó con base en las curvas estándares apropiadas.
Tabla 4: Números de células B en el bazo de ratones transgénicos para BAFF humano después de la exposición de anticuerpo biespecífico .
Estos resultados demuestran que el número de células B en los bazos de ratones transgénicos para BAFF humano se redujo (p<0.0001 , ANOVA) por una administración única de anticuerpo biespecífico. Esta normalización de números de células B es equivalente a aquella observada con el anticuerpo BAFF de control positivo. La exposición equivalente a cualquier anticuerpo biespecífico, los anticuerpos de control positivo y negativo dentro de cada grupo, se confirmó por ELISA cuantitativa. Por consiguiente, el anticuerpo biespecífico de la presente invención neutraliza efectivamente los efectos biológicos inducidos por BAFF humano en el ratón. La determinación de valor P se comparó con el grupo de control negativo.
Análisis de Solubilidad y Estabilidad El anticuerpo biespecífico se formuló en PBS a pH 7.4. El anticuerpo biespecífico se concentró de 1-2 mg/mL a una concentración que varía desde 52 mg/ml a 58 mg/ml usando concentradores Amicon. Las muestras concentradas se almacenaron a 25°C durante un período de 4 semanas. Las muestras se analizaron para el porcentaje de alto peso molecular (% HMW) con cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) a concentración inicial, 1 día, 1 semana, y 4 semanas de incubaciones. La SEC se realizó en un sistema Agilent 1100 usando una columna TSK G3000SW-XL (Tosoh Bioscience). Se utilizó PBS + NaCI 0.35 M, pH 7.4 como la fase móvil que corre a 0.5 mL/min por 35 minutos. Un volumen de 1 uL del anticuerpo concentrado se inyectó en la columna y la detección se midió a 280 nm. Los cromatogramas se analizaron usando ChemStation y el % de alto peso molecular (HMW) se calculó usando la relación de AUC de los picos eluidos antes del pico de monómero a AUC total. Las muestras almacenadas a 25°C a diferentes puntos de tiempo se analizaron para % de HMW y los resultados se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5: Resumen de % de especies de alto peso molecular medido por SE-HPLC.
Los estudios preliminares con un anticuerpo biespecífico de partida que comprende un anticuerpo BAFF de WO2003016468 y un anticuerpo IL-17 de WO2007070750 demostraron que después de la concentración a solo 6 mg/mL, un incremento de 25% de % de especies de HMW se detectó por SE-HPLC después de 3 semanas de almacenamiento a 4°C en PBS, y a 30 mg/mL el incremento de % de especies de HMW fue 15% después de solo 2 días de almacenamiento a 4°C en PBS. Estos resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención tiene muchas propiedades mejoradas, incluyendo agregación disminuida y estabilidad física incrementada, sobre el anticuerpo biespecífico de partida.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1 . Un anticuerpo biespecífico que comprende dos primeros poiipéptidos y dos segundos polipéptidos, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido es SEC I D NO: 1 y la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido es SEC I D NO: 2.
2. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el enlace de disulfuro intracadena está entre el residuo de cisteína 507 de SEC I D NO: 1 y el residuo de cisteína 707 de SEC I D NO: 1 .
3. Una molécula de DNA, caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de am inoácidos de SEC I D NO: 1 .
4. Una molécula de DNA, caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 2.
5. Una molécula de DNA, caracterizada porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 1 y comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.
6. Una célula de mam ífero que comprende la molécula de DNA de conformidad con la reivindicación 3 y la molécula de DNA de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la célula es capaz de expresar un anticuerpo biespecífico que comprende un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEC I D NO: 1 y un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 2.
7. Una célula de mamífero transformada con la molécula de DNA de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la célula es capaz de expresar un anticuerpo biespecífico que comprende un primer polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEC I D NO: 1 y un segundo polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEC I D NO: 2.
8. La célula de mamífero de conformidad con las reivindicaciones 6 y 7, caracterizada porque la célula de mam ífero es CHO.
9. Un proceso para producir un anticuerpo biespecífico que comprende un primer polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEC I D NO: 1 y un segundo polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEC I D NO: 2, caracterizado porque comprende: ( 1 ) cultivar la célula de mam ífero de conformidad con la reivindicación 8 bajo condiciones tales que el anticuerpo biespecífico se expresa, y; (2) recuperar el anticuerpo biespecífico expresado.
1 0. Un anticuerpo biespecífico, caracterizado porque se produce por el proceso de conformidad con la reivindicación 9.
1 1 . Un método para tatar Lupus Eritematoso Sistémico, Nefritis Lúpica, Artritis Reumatoide, Psoriaris, Espondilitis Anquilosante, Artritis Psoriática, síndrome primario de Sjógren , o Mieloma Múltiple que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10.
12. Un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10, caracterizado para el uso en terapia.
13. Un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 o 10, caracterizado para el uso en el tratamiento de Lupus Eritematoso Sistémico, Nefritis Lúpica, Artritis Reumatoide, Psoriaris, Espondilitis Anquilosante, Artritis Psoriática, síndrome primario de Sjógren, o Mieloma Múltiple.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10 y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
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