CN104220455A

CN104220455A - 抗-baff-抗-il-17双特异性抗体

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Publication number: CN104220455A
Application number: CN201380020761.7A
Authority: CN
Inventors: B.艾伦; R.J.本肖普; J.卢
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-04-16
Also published as: CA2869148C; BR112014025649A2; PH12014502333B1; ES2621917T3; AU2013249546A1; LT2838920T; SG11201406726PA; JP6216772B2; EP2838920B1; ES2789474T3; MX367460B; MY173282A; KR20140135830A; WO2013158577A1; PH12014502333A1; KR101673735B1; AR090626A1; JP2015514423A; US9708402B2; EA201491622A1

Abstract

提供了特异性结合TNF家族的B-细胞活化因子(BAFF)和白介素-17A(IL-17)的双特异性抗体，并且其特征是对BAFF和IL-17二者具有高的亲和力和强的中和性质。本发明的双特异性抗体可望用于治疗狼疮性肾炎(LN)、系统性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎(RA)、银屑病(Ps)、强直性脊柱炎(AS)、银屑病关节炎(PA)、原发性干燥综合症(pSS)或多发性骨髓瘤(MM)。

Description

抗-BAFF-抗-IL-17双特异性抗体

本发明属于医药领域，特别属于新的针对TNF家族的B-细胞活化因子(BAFF)和白介素-17A (IL-17)的双特异性抗体的领域。本发明的双特异性抗体可望用于治疗狼疮性肾炎 (LN)、系统性红斑狼疮 (SLE)、风湿性关节炎 (RA)、银屑病 (Ps)、强直性脊柱炎 (AS)、银屑病关节炎 (PA)、原发性干燥综合征 (pSS)或多发性骨髓瘤 (MM)。

升高水平的IL-17与几种状况，疾病或病症，包括气道炎症、风湿性关节炎、骨关节炎、骨侵蚀、腹腔内脓肿和粘连、炎性肠病、同种异体移植排斥、银屑病、特定类型的癌症、血管生成、动脉粥样硬化和多发性硬化相关。在风湿性关节炎患者的滑膜组织中IL-17和IL-17受体被上调。在各种动物关节炎模型中，阻断IL-17生物活性减少炎症和骨侵蚀。而且，IL-17对于胶原蛋白基质分解和炎症和关节损伤具有独立于IL-1β的效果，虽然IL-17与TNF-α协同作用增强炎症。因此，考虑到IL-17在炎症部位的局部分布，IL-17似乎是治疗风湿性关节炎和其它炎性或自体免疫疾病的可能的靶点，这与靶向促炎性细胞因子如TNF-α的系统性循环的药物相比，有潜在的更强的安全性概况。

自体免疫疾病的发病机理中B-细胞活化因子(BAFF)的参与通过小鼠模型中BAFF的过表达来说明，其导致模拟风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和原发性干燥综合征的自体免疫疾病，以及B细胞淋巴瘤的发生增加两倍。在人中，多个报道已表明SLE，RA，pSS和系统性硬化患者中血清BAFF水平升高。已证明BAFF促进Th17细胞的扩张，且对于胶原诱导性关节炎发生过程中BAFF-介导的促炎性作用来说，IL-17是重要的效应物细胞因子。IL-17还被证明与BAFF协同作用影响B细胞生物学和SLE的病理生理学。还有证据表明BAFF和IL-17二者在与LN相关的病理学中起作用，实际上已报道具有LN的患者具有升高水平的IL-17和BAFF。

SLE是高度异质性和多系统的自体免疫疾病，它的特点在于产生自身抗体和形成免疫复合物。估计有30-60% SLE患者在其疾病进程期间在某个阶段具有肾损害。LN是复杂的多因素的自体免疫疾病。如果不进行治疗，LN患者的5年生存率为0-20%。免疫抑制疗法的引入极大地改善了这种状况，且目前的10年生存率为88%。但是，这种改善对于患者来说是有代价的，因为许多这种治疗具有严重的副作用，特别是因为他们必须长期进行治疗。此外，反应慢并且常常不全，只有25-50%的患者达到缓解。

BAFF抗体和IL-17抗体共同施用要求注射两种单独的产品或者单次注射两种不同抗体的共同制剂。两次注射使得剂量的量和时间有灵活性，但是对于患者的依从性和痛苦来说不方便。共同制剂也可以提供剂量的量的灵活性，但是要找到允许两种抗体的化学和物理稳定性的制剂条件通常是非常具有挑战性的或不可能的，因为这两种不同的抗体具有不同的分子特性。

WO199509917公开了使用重组DNA技术通过产生与具有不同特异性的完整抗体融合的单链片段可变抗体来产生双特异性四价抗体 (MAb-scFV)的方法。这种基因融合通过转染表达，获得具有双特异性的四价抗体。WO2003016468公开了结合并中和人BAFF的可溶形式和膜结合形式二者的抗-BAFF抗体。WO2007070750公开了结合并中和人IL-17的抗-IL-17抗体。但是，当按照WO199509917中的教导创造包含WO2003016468的抗-BAFF抗体和WO2007070750的抗-IL-17抗体的初始双特异性抗体时，本发明人发现与化学和物理稳定性相关的重大问题。为了充分克服这些问题需要在初始双特异性抗体中进行许多氨基酸的改变。现有技术中既没有提出这种需要也没有进行实际的改变。更进一步，有几种改变不是常规的或者不是来自于熟知常识。同样地，单抗体自身没有这些问题，说明在双特异性抗体的情况中这些区域周围的局部环境不同。因此，需要用中和BAFF和IL-17两者的双特异性抗体的药物介入。

本发明提供包含两个第一多肽和两个第二多肽的双特异性抗体。

本发明还提供包含编码第一多肽的多核苷酸序列的DNA分子。

本发明还提供包含编码第二多肽的多核苷酸序列的DNA分子。

本发明还提供包含编码第一多肽和第二多肽的多核苷酸序列的DNA分子。

本发明还提供用一个或多个DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述细胞能表达包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体。

本发明还提供产生包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体的方法，包括在使得所述双特异性抗体被表达的条件下培养哺乳动物细胞。

本发明还提供由所述方法产生的双特异性抗体。

本发明还提供治疗系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、原发性干燥综合征或多发性骨髓瘤的方法，包括给有需要的患者施用有效量的双特异性抗体。

本发明还提供用于治疗的双特异性抗体。

本发明还提供用于治疗系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、原发性干燥综合征或多发性骨髓瘤的双特异性抗体。

本发明还提供包含双特异性抗体和一种或多种药学可接受的载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物。

人IL-17被认为是指包含两个人IL-17A蛋白的同二聚体蛋白。人IL-17A/F异二聚体是人IL-17A蛋白和人IL-17F蛋白。

双特异性抗体被认为是指MAb-scFV形式的免疫球蛋白分子，其包含四个抗原结合位点，结合两种不同的抗原，对每种抗原有特异性。双特异性抗体能单独结合每种抗原或同时结合每种抗原。

本发明的双特异性抗体包含两个第一多肽和两个第二多肽。每个第一多肽与每个第二多肽形成链间二硫键，并且第一多肽与另一个第一多肽形成两个链间二硫键，并且每个第一多肽形成几个链内二硫键。多肽和二硫键的关系显示在下面的示意图中：

第一多肽的氨基酸序列是：

。

第二多肽的氨基酸序列是：

。

每个第一多肽和每个第二多肽的链间二硫键在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基137和SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基214之间形成。第一多肽与另一个第一多肽形成两个链间二硫键，第一个链间二硫键在SEQ ID NO:1的第一多肽的半胱氨酸残基229和SEQ ID NO:1的另一个第一多肽的半胱氨酸残基229之间形成。第二个链间二硫键在SEQ ID NO:1的第一多肽的半胱氨酸残基232和SEQ ID NO:1的另一个第一多肽的半胱氨酸残基232之间形成。

在scFV内，工程化链内二硫键在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基507和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基707之间形成。还有一个链内二硫键在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基625和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基695之间形成。在MAb内，通常发生在IgG4-抗体中的链内二硫键在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基22和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基95之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基150和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基206之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基264和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基324之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基370和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基428之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基485和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基559之间，在SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基23和SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基88之间，以及在SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基134和SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基194之间形成。

第一多肽包含第一重链可变区 (HCVR1)，重链恒定区 (CH)，第二重链可变区 (HCVR2)和第二轻链可变区 (LCVR2)。第二多肽包含第一轻链可变区 (LCVR1)和轻链恒定区 (CL)。HCVR和LCVR区域可以被进一步细分为高变区，称为互补决定区 (CDR)，其间穿插有框架区 (FR)。每个HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下述顺序排列：FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。

HCVR1的3个CDR被称为CDRH1-1, CDRH1-2和CDRH1-3，且HCVR2的3个CDR被称为CDRH2-1, CDRH2-2和CDRH2-3，且LCVR1的3个CDR被称为CDRL1-1, CDRL1-2和CDRL1-3，且LCVR2的3个CDR被称为CDRL2-1, CDRL2-2和CDRL2-3。

CH通过氨基酸接头(L1)与HCVR2融合。HCVR2通过氨基酸接头(L2)与LCVR2融合。

不同区域和接头的关系如下所示：

双特异性抗体工程改造

当构建在scFv构型中具有抗-IL-17结合部分的MAb-scFv形式的双特异性抗体时，遇到了与化学和物理稳定性相关的重大问题。在双特异性抗体的CDRL2-1和CDRH2-2 部分进行化学修饰，改善了物理稳定性并减少了浓度依赖性聚集。大量的蛋白稳定性和溶解性研究鉴定了CDRL2-1和CDRH2-2 中的化学不稳定残基。使用通过密码子损耗(codon depletion)构建的靶向文库将这些不稳定残基用带电荷的中性氨基酸替换。此外，计算双特异性抗体的静电表面，鉴定带电区域。在scFv中破坏这些带电区域导致蛋白自聚集的减少。但是，在双特异性抗体的CDRH2-1部分鉴定了一个突变，其再平衡表面静电分布，并提高高浓度的物理稳定性和溶解性。在亲本的单抗体中没有遇到上述问题。这些问题仅仅是在构建MAb-scFv形式的双特异性抗体的情况下遇到的，表明在双特异性抗体的情况下，单抗体突变区域周围的局部环境有所不同。

进行进一步的化学修饰以使双特异性抗体的IL-17部分中的HCVR2/LCVR2交界面稳定，并减少双特异性抗体聚集。为确定聚集进行的研究表明，观察到的蛋白自聚集不是由于单个HCVR2或LCVR2结构域的构象不稳定驱动的，更可能是由HCVR2/LCVR2交界面的开放或呼吸（breathing）驱动的，导致分子间蛋白相互作用。因此，不同的链内二硫键被引入到双特异性抗体的IL-17部分中的HCVR2/LCVR2交界面中。每个第一多肽中的一个这种链内二硫键是在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基507和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基707之间形成。该二硫键共价连接双特异性抗体的IL-17部分中的HCVR2/LCVR2交界面，使HCVR2/LCVR2交界面稳定并减少会导致物理不稳定性和不利的制剂限制(formulation limitations)的分子间蛋白相互作用。在试验的9个不同的二硫键中，其中8个表达功能性蛋白，亲和力损失的量级为大约2至大约35倍范围。每个第一多肽中SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基507和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基707之间的链内二硫键最好地稳定了HCVR2/LCVR2交界面，同时保持与IL-17的最佳结合亲和力。

此外，研究表明L1的接头长度影响结合动力学。动力学分析(通过表面等离子体共振)表明10个氨基酸的接头与15个氨基酸和20个氨基酸的接头相比使得K_on速度慢2倍。因此，长度为15的接头被引入到本发明的双特异性抗体中。

双特异性抗体结合

本发明的双特异性抗体在体外或体内结合人BAFF和人IL-17二者，并中和至少一种人BAFF生物活性和至少一种人IL-17生物活性。本发明的双特异性抗体在体外在存在或不存在BAFF的条件下是IL-17的潜在抑制剂。本发明的双特异性抗体在体外在存在或不存在IL-17的条件下是可溶性和膜结合BAFF二者的潜在抑制剂。本发明的双特异性抗体的特征进一步在于与人BAFF的结合亲和力(K_D) 在150 pM至1 pM的范围内，与人IL-17的结合亲和力(K_D) 在50 pM至1 pM的范围内。双特异性抗体与人IL-17A/F异二聚体的结合亲和力为大约90 pM。

双特异性抗体有效中和可溶性和膜结合BAFF，并且这种中和不受饱和量的人IL-17的存在的影响。双特异性抗体有效中和人IL-17，并且这种中和不受饱和量的人BAFF的存在的影响。

双特异性抗体表达

能引导与之可操作连接的基因表达的表达载体是本领域熟知的。表达载体可以编码促进一个或多个多肽从宿主细胞分泌的信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。第一多肽和第二多肽可以在一个载体中由与其可操作连接的不同启动子独立表达，或者可选地，第一多肽和第二多肽可以在两个载体中由与其可操作连接的不同启动子独立表达— 一个表达第一多肽，一个表达第二多肽。

宿主细胞包括用一个或多个表达本发明的第一多肽、第二多肽或第一多肽和第二多肽二者的载体稳定地或瞬时地转染，转化，转导或感染的细胞。产生本发明双特异性抗体的宿主细胞系的产生和分离可以通过本领域已知的标准技术实现。哺乳动物细胞是用于表达双特异性抗体的优选宿主细胞。特定的哺乳动物细胞是HEK 293, NS0, DG-44和CHO。优选地，双特异性抗体被分泌到培养宿主细胞的培养基中，从中回收或纯化双特异性抗体。

本领域熟知抗体的哺乳动物表达导致糖基化。典型地，糖基化发生在抗体的Fc区域中的高度保守的N-糖基化位点。N-聚糖典型地与天冬酰胺连接。每个第一多肽在SEQ ID NO:1的天冬酰胺残基300被糖基化。

编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽的特定的DNA多核苷酸序列是：

。

编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二多肽的特定的DNA多核苷酸序列是：

SEQ ID NO:4。

双特异性抗体被分泌到其中的培养基可以通过传统技术纯化。例如，培养基可以使用传统方法被应用到Protein A或G柱上并从其上被洗脱。可溶性聚集体和多聚体可以有效地通过常用技术，包括尺寸排阻，疏水相互作用，离子交换或羟磷灰石层析被移除。产物可以立即被冷冻，例如在-70℃，或者可以被冻干。

可能有需要减少培养基中存在的错误折叠的双特异性抗体的水平。错误折叠的双特异性抗体也被称为双体抗体(diabody)。当一个或多个二硫键在链间或链内错误形成时导致错误折叠。错误折叠的双特异性抗体可以通过传统技术被纯化。例如，含有错误折叠的双特异性抗体的培养基可以被应用于强阳离子交换树脂并从其上被洗脱。例如，SP-Sepharose HP强阳离子交换树脂被用于从双体抗体纯化正确折叠的双特异性抗体。含有双体抗体的培养基的pH用1M Tris 碱调节为pH 8。将培养基加载到SP-Sepharose HP柱上，用2倍柱体积的20mM Tris, pH 8洗涤，并用超过30倍柱体积的20mM Tris, 100mM NaCl, pH8(0-70 mM NaCl)洗脱。收集的合并液被进行高分子量对主峰的评价。典型的结果是从10%双体抗体改善为1%双体抗体和71%回收率。

在另一个实施例中，Poros HS 50强阳离子交换树脂被用于从双体抗体纯化正确折叠的双特异性抗体。含有双体抗体的培养基的pH用1M Tris 碱调节为pH 8。将培养基加载到SP-Sepharose HP柱上，并用超过15倍柱体积的20mM Tris, 100mM NaCl, pH8(15-50 mM NaCl)洗脱。收集的合并液被进行高分子量对主峰的评价。典型的结果是从10%双体抗体提高为1%双体抗体和57%回收率。

治疗用途

患者指患有疾病，病症或状况的哺乳动物，优选人，其会得益于BAFF和/或IL-17水平的降低或者BAFF和/或IL-17生物活性的降低。

治疗(treatment)和/或治疗(treating)意在指其中可能存在本文所述的病症的减慢，中断，抑制，控制或停止发展的所有过程，但不一定表示所有病症症状的完全消失。本发明的双特异性抗体预计治疗系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎，风湿性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，银屑病关节炎，原发性干燥综合征或多发性骨髓瘤。

药物组合物

本发明的双特异性抗体可以被包含在适合于给患者施用的药物组合物中。这种药物组合物被设计为适合于选定的施用模式，并且适当地使用药学可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等。所述组合物可以根据例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995中公开的传统技术设计，该文献提供了从业者一般知晓的制剂技术的汇总。用于药物组合物的合适的载体包括与本发明的双特异性抗体组合时，保留分子的活性并且与患者免疫系统无反应性的任何材料。本发明的药物组合物包括双特异性抗体和一种或多种药学可接受的载体，稀释剂或赋形剂。

包含本发明的双特异性抗体的药物组合物可以通过标准施用技术被施用给具有如本文所述疾病或病症风险或表现出如本文所述疾病或病症的患者。

本发明的药物组合物含有有效量的本发明的双特异性抗体。有效量指达到所期望的治疗结果所必需的量(剂量和对于时间段和对于给药方式)。双特异性抗体的有效量可能根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个体中引起所期望反应的能力而变化。有效量还指治疗有益效果超过双特异性抗体的任何毒性和有害作用的量。

下述表达和性质证明实例的双特异性抗体包含两个具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽和两个具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二多肽，其中每个第一多肽与每个第二多肽在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基137和SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基214之间形成链间二硫键，且第一多肽与另一个第一多肽在SEQ ID NO:1的第一多肽的半胱氨酸残基229和SEQ ID NO:1的另一个第一多肽的半胱氨酸残基229之间，以及SEQ ID NO:1的第一多肽的半胱氨酸残基232和SEQ ID NO:1的另一个第一多肽的半胱氨酸残基232之间形成两个链间二硫键，并且每个第一多肽在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基22和半胱氨酸残基95之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基150和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基206之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基264和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基324之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基370和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基428之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基485和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基559之间，在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基507和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基707之间，以及在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基625和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基695之间形成链内二硫键，并且每个第二多肽在SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基23和SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基88之间，以及在SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基134和SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基194之间形成链内二硫键，并且其中每个第一多肽在SEQ ID NO:1的天冬酰胺残基300处被糖基化。正确折叠的双特异性抗体与错误折叠的双体抗体的比例达90:10的量级（on the order to 90:10）。

双特异性抗体的表达

双特异性抗体可以基本上如下所示进行表达和纯化。含有SEQ ID NO:3 (编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽)和SEQ ID NO:4 (编码SEQ ID NO:2的轻链氨基酸序列)的DNA的谷氨酰胺合成酶 (GS)表达载体被用于通过电穿孔转染中国仓鼠细胞系，CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, United Kingdom)。表达载体编码SV早期(猿猴病毒40E)启动子和GS基因。GS的表达使得可以生化合成谷氨酰胺，CHOK1SV细胞所需的一种氨基酸。转染之后，细胞用50μM L-蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)进行批量选择(bulk selection)。MSX对GS的抑制被用于增加选择的严谨性。相对于表达内源水平GS的CHOK1SV野生型细胞，选择表达载体cDNA被整合到宿主细胞基因组的转录活性区域的细胞。转染的细胞库以低密度涂在平板上以使得稳定表达的细胞接近于克隆性生长（close-to-clonal outgrowth）。筛选主要孔（the masterwells）的双特异性抗体的表达，然后在用于生产的无血清的悬浮培养中按比例扩大。双特异性抗体被分泌到其中的澄清培养基被应用到用相容缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡的Protein A亲和柱上。洗涤柱以除去非特异性结合的组分。例如通过pH梯度(如0.1 M磷酸钠缓冲液pH 6.8至0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)洗脱结合的双特异性抗体。例如通过SDS-PAGE或分析型尺寸排阻检测双特异性抗体级分，并然后合并。可溶性聚集物和多聚体可通过常用技术，包括尺寸排阻，疏水相互作用，离子交换或羟磷灰石层析被有效移除。双特异性抗体可以通过常用技术浓缩和/或无菌过滤。这些层析步骤之后双特异性抗体的纯度大于98%。双特异性抗体可以立即在-70℃冷冻或在4℃储存数月。

与IL-17和BAFF的结合亲和力

双特异性抗体与人IL-17和人BAFF的结合亲和力和结合化学计量比在Biacore 2000仪器上通过表面等离子体共振测定来确定，该仪器用HBS-EP+ (GE Healthcare，10 mM Hepes pH7.4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05% 表面活性剂 P20)运行缓冲液活化，并且分析温度设定为25℃。在所有四个流动池(flow cells, Fc)上含有固定化蛋白A的CM5芯片(通过标准的NHS-EDC氨基偶联产生)用于采用捕获方法学。抗体样品通过稀释入运行缓冲液制备为10 mcg/mL。人IL-17或人BAFF通过稀释入运行缓冲液制备为终浓度为20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1.25和0 (空白) nM。每个分析周期由下列步骤组成：(1)在单独的流动池(Fc2, Fc3和Fc4)上捕获抗体样品，(2)注入250 mcL (300-sec)人IL-17或人BAFF，以50 mcL/min的速度流过所有的Fc，(3)恢复缓冲液流20 min以监测解离阶段，(4) 注入5 mcL (30-sec)甘氨酸, pH1.5，再生芯片表面， (5)注入10 mcL (60-sec) HBS-EP+平衡芯片表面。使用Biacore 2000评价软件，4.1版本，使用标准双重参考处理数据并拟合为1:1结合模型处理数据，以确定结合速率 (k_on, M^-1s^-1 单位)，解离速率(k_off, s^-1 单位)和R_max(RU 单位)。由关系式K_D = k_off/k_on计算平衡解离常数(K_D)，且以摩尔为单位。

表1：双特异性抗体与人IL-17和人BAFF的结合亲和力

这些结果证明本发明的双特异性抗体结合人IL-17和人BAFF。

IL-17和BAFF的同时结合

BIAcore 2000仪器被用于确定人IL-17和人BAFF是否可以同时结合双特异性抗体。除非另有注明，所有试剂和材料购自BIAcore AB (Upsala, Sweden)。所有测量在25℃进行。HBS-EP+缓冲液(150 mM氯化钠，3 mM EDTA，0.05 % (w/v)表面活性剂P-20和10 mM HEPES, pH7.4)被用作运行缓冲液和样品缓冲液。蛋白A用氨基偶联试剂盒固定在CM4传感器芯片的流动池1和2上。双特异性抗体首先被捕获在流动池2上，然后注入20 nM的人IL-17持续5分钟，以饱和IL-17结合位点。结合IL-17后，然后注入20 nM的人BAFF持续5分钟并观察额外的结合信号。然后用10mM甘氨酸pH 1.5再生芯片表面。重复同样的过程，除了人IL-17和人BAFF的顺序不同。计算化学计量比以确保人IL-17或人BAFF对双特异性抗体完全饱和。根据动力学结合试验，人IL-17与双特异性抗体的化学计量比典型地是~1.3。类似地，根据动力学结合试验，人BAFF与双特异性抗体的化学计量比典型地是~1.0。对照BAFF Ab是US7,317,089的4A5-3.1.1-B4。对照IL-17 Ab是US7,838,638的Fab 126。

表2：人IL-17和人BAFF与双特异性抗体同时结合

这些结果证明本发明的双特异性抗体可以同时结合人IL-17和人BAFF，如来自与双特异性抗体结合的两个配体的反应单位的增加(△ RU)所示。

体外IL-17-诱导的HT-29细胞产生CXCL1的抑制

HT-29细胞是天然表达IL-17受体的人结直肠腺癌上皮细胞。HT29细胞与人IL-17温育导致产生CXCL1，其可以用商业可获得的ELISA测量。

剂量范围为41200至2.64 pM的双特异性抗体被评价(终浓度是基于双特异性抗体的单体MW (=100 kDa))。然后将每个试验浓度的双特异性抗体加入(50 mcl)到含有重组IL-17(孔中的最终IL-17浓度为3.75 nM (基于IL-17的单体MW (=16 kDa))的孔中。每个处理在一式三份的孔中进行试验。测定培养基被用于“单独的培养基”和“单独的IL-17”对照。IL-17中和抗体 (US7,838,638的Fab 126)在测定中被用作阳性对照。含有IL-17和抗体混合物的板在组织培养处理96孔板的内孔中在37℃、95%相对湿度、5% CO₂温育60-90分钟。在该测定的一种变化中，加入饱和浓度的人BAFF(终浓度1.25 nM，基于BAFF的单体MW (=20 kDa))，其目的是确定当双特异性抗体同时结合BAFF时，是否仍然能够中和IL-17。在测定培养基(含有10% FBS ，青霉素G(0.2 U/mL)和链霉素(0.2 mcg/mL)的McCoy’s 5A)中常规培养HT-29细胞。在测定的当天，细胞用HBSSO漂洗并用胰蛋白酶+ EDTA使其与培养瓶分离。用测定培养基使胰蛋白酶失活。然后在RT在500Xg 离心HT-29细胞5分钟。在测定培养基中重悬细胞沉淀。用血细胞计数器测量细胞密度，并将20,000个HT-29细胞 (100 mcl)加入到含有抗体/IL-17混合物的96-孔板中。向每个未使用的边缘孔(无细胞)中加入200 mcl的PBS以减少蒸发导致的边缘效应。将96-孔板在组织培养箱 (37℃，95%相对湿度，5%CO2)中放置大约48小时。

在测定的最后，板被离心 (在RT，500Xg，5分钟)，并且细胞培养基被转移至聚丙烯96-孔板，其被封闭并在–80℃冷冻。在通过ELISA测量CXCL1的当天，在RT融解板。用CXCL1夹心ELISA(R&D Systems DuoSet #DY275)测量培养基(未稀释或者1:3稀释)中CXCL1的水平，按照制造商的说明书进行，使用下述缓冲液和修改：来自BioFX Labs (10X起, #WSHW-1000-01)的1X ELISA洗涤缓冲液；每孔样品和标准体积为50 mcL；底物来自BioFX Labs (1组分HRP底物，#TMBW-1000-01)；停止液来自BioFX Labs (#LSTP-1000-01; 每孔100 mcl)。在ELISA反应的最后，在酶标仪(Molecular Devices SpectraMax 190)上在450 nm读板。数据收集为最大CXCL1产生量的百分数%(用单独的IL-17获得为100%)。使用数据的4参数S拟合(GraphPad Prism)计算IL-17-诱导反应的50%被双特异性抗体或阳性对照抑制的浓度(IC50)。

结果证明本发明的双特异性抗体以浓度依赖的方式抑制IL-17诱导HT-29细胞分泌CXCL1。这种抑制与利用阳性对照抗体观察到的结果相当 (双特异性抗体的IC50为2.00 + 0.21 nM，相对的，阳性对照抗体为1.86 + 0.22 nM (3次独立试验的平均值+ SEM))，但阴性对照抗体没有抑制增殖。而且，在存在饱和量的BAFF的条件下观察到类似的抑制，双特异性抗体的IC50为1.57 + 0.45 nM，相对的，阳性对照抗体为1.41 + 0.50 nM (3次独立试验的平均值+ SEM)。本发明的双特异性抗体有效中和IL-17，并且这种中和不受饱和量的BAFF的存在的影响。

BAFF诱导的T1165细胞体外增殖的抑制

T1165.17是小鼠浆细胞瘤细胞系，其存活和生长依赖于外部因子(IL-1β或BAFF)。这些细胞天然表达BAFF受体，通过监测增殖测量它们对人BAFF的反应。

剂量范围为1 nM至4.1 pM的双特异性抗体被评价(终浓度是基于双特异性抗体的单体MW (=100 kDa))其中和可溶性BAFF(测定中最终的可溶性BAFF浓度为150 pM，基于BAFF的单体MW (=20 kDa))的能力。不同浓度的双特异性抗体与可溶性BAFF在平底96孔组织培养板的内孔中在37℃ 温育30-60分钟，总体积为50 mcl。BAFF中和抗体 (US7,317,089的4A5-3.1.1-B4) 在测定中被用作阳性对照。一式三份对每种条件进行试验。在该测定的一种变化中，试验双特异性抗体中和膜BAFF的能力。不同浓度的双特异性抗体与表达非可切割形式的BAFF的HEK293细胞(通过突变BAFF中弗林蛋白酶切割位点获得，导致BAFF在细胞膜上的持久表达)的膜级分温育。在该测定的另一种变化中，加入饱和浓度的人IL-17(终浓度15.6 nM，基于IL-17的单体MW (=16 kDa))，其目的是确定当双特异性抗体同时结合IL-17时，是否仍然能够中和可溶性或膜BAFF。

在加入2 ng/mL重组人IL-1β的测定培养基(含有10% FBS ，HEPES，L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5 x 10^-5M 2-巯基乙醇，1X抗菌-抗真菌剂的RPMI1640)中常规培养T1165细胞。在测定的当天，细胞用测定培养基洗涤3次并在测定培养基中重悬为1x10⁵个细胞/mL。50 mcl细胞悬液被加入到含有抗体和BAFF混合物的96孔板中。100 mcl测定培养基被加入到每个未使用的边缘孔(无细胞)中以减少蒸发导致的边缘效应。将板在组织培养箱 (37℃，95%相对湿度，5%CO2)中放置大约44小时。在测定的最后，20 mcl Promega Cell Titer 96 Aqueous One溶液被加入到每个孔中并在37℃温育1-4小时。在酶标仪(Molecular Devices SpectraMax 190)上在490 nm读板。数据收集为%抑制，使用没有BAFF的孔作为最小反应，用有150 pM BAFF的孔作为最大反应。使用数据的4参数S拟合(SigmaPlot)计算BAFF-诱导反应的50%被双特异性抗体或阳性对照抑制的浓度(IC50)。

结果证明双特异性抗体以浓度依赖的方式抑制可溶性BAFF诱导的T1165细胞的增殖。这种抑制与利用阳性对照抗体观察到的结果相当 (双特异性抗体的IC50为0.064 + 0.021 pM，相对的，阳性对照抗体为0.071 + 0.002 pM (2次独立试验的平均值+ SEM))，但阴性对照抗体没有抑制增殖。而且，在存在饱和量的IL-17的条件下观察到类似的抑制，双特异性抗体的IC50为0.060 + 0.014 pM，相对的，阳性对照抗体为0.073 + 0.012 pM (2次独立试验的平均值+ SEM)。双特异性抗体有效中和BAFF，并且这种中和不受饱和量的IL-17的存在的影响。

双特异性抗体抑制膜结合BAFF诱导的T1165细胞增殖的能力也被证明。本发明的双特异性抗体有效抑制膜结合BAFF诱导的增殖，与阳性对照BAFF抗体(US7,317,089的4A5-3.1.1-B4)类似。而且，在存在饱和量的IL-17的条件下观察到类似的抑制。

体内人IL-17-诱导的CXCL1产生的抑制

人IL-17的注射导致循环中小鼠CXCL1快速而短暂地增加。普通雌性C57Bl6小鼠(每组n=8)被SC注射双特异性抗体 (66 mcg/小鼠)或阳性对照抗-IL-17抗体 (US7,838,638, 50的Fab 126 mcg/小鼠)或阴性对照抗体(huIgG4，50 mcg/小鼠)。两天后，小鼠接受人IL-17 (3 mcg/小鼠)的单次IP注射，2小时后收集血清并储存于-80℃直至分析。通过ELISA确定CXCL1浓度。微量滴定板用抗体捕获人Fc (Jackson ImmunoResearch 109-005-098, 1 mcg/mL)包被并在4℃温育过夜。洗涤板，用酪蛋白封闭，并加入100 mcl血清 (1:1000稀释)。在RT温育板2h，洗涤并加入HRP-标记的检测抗体 (抗人IgG, Jackson ImmunoResearch 709-035-149)。在RT温育板1h，洗涤并用TMB底物显色，使用酶标仪读板。基于合适的标准曲线计算浓度。

表3：暴露于双特异性抗体之后IL-17-诱导的CXCL1的水平

这些数据证明人IL-17导致血清CXCL1水平的升高。但是，在存在双特异性抗体的条件下，这些结果证明相对于接受阴性对照抗体的动物，IL-17-诱导的CXCL1的升高被减少了 (P<0.01, ANOVA)。用双特异性抗体导致的CXCL1的减少与用阳性对照抗-IL-17抗体观察到的结果相当。在每组中对双特异性抗体，阳性和阴性对照抗体的等价暴露通过定量ELISA证明。因此，本发明的双特异性抗体在小鼠中有效中和人IL-17诱导的生物学效果。P值确定与阴性对照/IL-17组比较。

体内人BAFF的抑制

携带有编码可溶性人BAFF的转基因的小鼠在脾脏具有异常高数量的B淋巴细胞。

人BAFF的转基因小鼠 (每组n=5)被IP注射单次剂量的双特异性抗体 (660 mcg/小鼠)，或阳性对照抗-BAFF抗体 (4A5-3.1.1-B4 US7,317,089，500 mcg/小鼠)或阴性对照抗体 (huIgG4, 500 mcg/小鼠)。8天后，收集血清和脾脏。制备脾细胞的单细胞悬液，裂解红细胞之后确定白细胞的总数。B淋巴细胞的相对百分比通过流式细胞术用细胞表面标记B220确定。将B220阳性细胞的百分数乘以脾脏淋巴细胞的总数计算每个脾脏的B细胞的总数。微量滴定板用抗体捕获人Fc (Jackson ImmunoResearch 109-005-098, 1 mcg/mL)包被并在4℃温育过夜。洗涤板，用酪蛋白封闭，加入100 mcl血清 (1:5000稀释)。在RT温育板2h，洗涤并加入HRP-标记的检测抗体 (抗人IgG, Jackson ImmunoResearch 709-035-149)。在RT温育板1h，洗涤并用TMB底物显色，使用酶标仪读板。基于合适的标准曲线计算浓度。

表 4：人BAFF转基因小鼠暴露于双特异性抗体后脾脏中的B细胞数量

给药Ab	阴性对照	阳性对照	双特异性抗体
				平均数量 X 10E6 B 细胞/脾脏	234.84	78.87	94.77
SEM	18.93	3.49	2.34
				p 值		<0.0001	<0.0001

这些结果证明通过双特异性抗体单次给药，人BAFF转基因小鼠脾脏中B细胞的数量被减少 (p<0.0001, ANOVA) 。这种B细胞数量的标准化等价于用阳性对照BAFF抗体观察到的结果。在每组中对双特异性抗体，阳性和阴性对照抗体的等价暴露通过定量ELISA证明。因此，本发明的双特异性抗体在小鼠中有效中和人BAFF诱导的生物学效果。P值确定与阴性对照组比较。

溶解性和稳定性分析

双特异性抗体在pH 7.4的PBS 中配制。使用Amicon 浓缩器将双特异性抗体从1-2 mg/mL浓缩为浓度范围为52 mg/mL至58 mg/mL。浓缩样品在25℃储存超过4周的时间。在初始浓度，温育1天，1周和4周时用尺寸排阻层析(SEC)分析高分子量百分比 (%HMW)。使用TSK G3000SW-XL (Tosoh Bioscience)柱在Agilent 1100系统上进行SEC。PBS + 0.35M NaCl, pH 7.4被用作流动相，以0.5 mL/min的速度运行35分钟。1uL体积的浓缩抗体被注入柱中，检测在280nm测量。使用ChemStation 分析色谱图，并用单体峰之前的洗脱峰的AUC与总AUC的比值计算高分子量百分比 (%HMW)。分析在25℃储存不同时间点的样品%HMW，并将结果总结在表5中。

表5：SE-HPLC测量的%高分子量种类的总结

	%HMW　由SE-HPLC测得
		初始，未浓缩	0.95
初始，浓缩	1.63
		1 天 25℃	1.81
1 周 25℃	2.61
		4 周 25℃	5.35

用包含WO2003016468 的BAFF抗体和WO2007070750 的IL-17抗体的初始双特异性抗体进行的初步研究证明，在浓缩到仅有6 mg/mL之后，在PBS中在4℃储存3周后由SE-HPLC检测出% HMW种类增加25%，并且在30 mg/mL，在PBS中在4℃储存仅2天后% HMW种类增加为15%。这些结果证明本发明的双特异性抗体相对于初始双特异性抗体具有许多改善的性质，包括减少聚集和增加物理稳定性。

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> 抗-BAFF-抗-IL-17双特异性抗体

<130> X19474

<150> 61/768747

<151> 2013-02-25

<150> 61/636302

<151> 2012-04-20

<150> PCT/US2013/036677

<151> 2013-04-16

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln

450 455 460

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser

465 470 475 480

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr His

485 490 495

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly

500 505 510

Val Ile Asn Pro Thr Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys

515 520 525

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

530 535 540

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

545 550 555 560

Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

565 570 575

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

580 585 590

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

595 600 605

Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser

610 615 620

Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser Arg Gly Glu Thr Tyr Leu

625 630 635 640

His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

645 650 655

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

660 665 670

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

675 680 685

Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Leu Pro Phe Thr

690 695 700

Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

705 710

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat tcgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aaactgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agggtattac 300

gatattttga ctggttatta ttactacttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360

gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttcccgc tagcgccctg ctccaggagc 420

acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480

acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600

acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660

gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccctgcccag cacctgagtt cctgggggga 720

ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840

tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1080

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggaaagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320

cagaagagcc tctccctgtc tcctggaggc ggaggatccg ggggaggggg taccggagga 1380

gggggctcgc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctca 1440

gtgaaggttt cctgcaaggc atctggttac aagttcactg actaccatat tcattgggtg 1500

cgacaggccc ctggacaatg ccttgagtgg atgggagtaa ttaatcctac ttatggtact 1560

actgactaca atcagcggtt caaaggccgt gtcaccatta ccgcggacga atccacgagc 1620

acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg 1680

agatatgatt actttactgg gacgggtgtg tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 1740

tcctcaggtg gcggaggatc tggtggaggt ggctcaggag gtggcggaag cggcggaggt 1800

ggaagtgata ttgtgatgac tcagactcca ctctccctgt ccgtcacccc tggacagccg 1860

gcctccatct cctgcagatc tagtaggagc cttgtacaca gtcgtggaga aacctattta 1920

cattggtatc tgcagaagcc aggccaatct ccacagctcc taatttataa agtttccaac 1980

cggtttattg gggtcccaga cagattcagc ggcagtgggt caggcacaga tttcacactg 2040

aaaatcagca gggtggaggc cgaagatgtt ggggtttatt actgctctca aagtacacat 2100

cttccattca cgtttggctg cgggaccaag ctggagatca aa 2142

<210> 4

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc cgctacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac tccactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctcggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc cggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcaa caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

Claims

1.双特异性抗体，其包含两个第一多肽和两个第二多肽，其中所述第一多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:1并且所述第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。

2.权利要求1的双特异性抗体，其中链内二硫键在SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基507和SEQ ID NO:1的半胱氨酸残基707之间。

3.DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。

4.DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。

5.DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，并包含编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。

6.哺乳动物细胞，其包含权利要求3的DNA分子和权利要求4的DNA分子，所述细胞能表达包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一多肽，和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二多肽的双特异性抗体。

7.用权利要求5的DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述细胞能表达包含氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第一多肽，和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的第二多肽的双特异性抗体。

8.权利要求6和7的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO。

9.用于产生包含氨基酸序列为SEQ ID NO:1的第一多肽，和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的第二多肽的双特异性抗体的方法，包括 (1) 在使得所述双特异性抗体被表达的条件下培养权利要求8的哺乳动物细胞，以及；(2) 回收被表达的双特异性抗体。

10.由权利要求9的方法产生的双特异性抗体。

11.治疗系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、原发性干燥综合征或多发性骨髓瘤的方法，包括给有需要的患者施用有效量的权利要求1，2或10任一项的双特异性抗体。

12.权利要求1，2或10任一项的双特异性抗体，其用于治疗。

13.权利要求1，2或10任一项的双特异性抗体，其用于治疗系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、原发性干燥综合征或多发性骨髓瘤。

14.药物组合物，其包含权利要求1，2或10任一项的双特异性抗体和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。