EA029084B1 - Аминотриазолопиридин для применения в лечении воспаления и его фармацевтические композиции - Google Patents
Аминотриазолопиридин для применения в лечении воспаления и его фармацевтические композиции Download PDFInfo
- Publication number
- EA029084B1 EA029084B1 EA201590071A EA201590071A EA029084B1 EA 029084 B1 EA029084 B1 EA 029084B1 EA 201590071 A EA201590071 A EA 201590071A EA 201590071 A EA201590071 A EA 201590071A EA 029084 B1 EA029084 B1 EA 029084B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- formula
- compound
- disease
- diseases
- treatment
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
- A61K31/541—Non-condensed thiazines containing further heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к новому медицинскому применению соединения формулы I, в частности при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов. В частности, соединение ингибирует семейство тирозинкиназ JAK и, более конкретно, JAK1. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат указанное соединение, способам профилактики и/или лечения заболеваний, включая воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, аллергию, отторжение трансплантата, заболевания, включающие ухудшение обновления хряща, врожденные мальформации хряща и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией IL-6 или интерферонов, посредством введения указанного соединения.
Description
изобретение относится к новому медицинскому применению соединения формулы I, в частности при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-6 или интерферонов. В частности, соединение ингибирует семейство тирозинкиназ ΙΑΚ и, более конкретно, ΙΑΚ1. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат указанное соединение, способам профилактики и/или лечения заболеваний, включая воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, аллергию, отторжение трансплантата, заболевания, включающие ухудшение обновления хряща, врожденные мальформации хряща и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ь-6 или интерферонов, посредством введения указанного соединения.
029084 В1
029084 Β1
029084
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к медицинскому применению соединения по изобретению формулы I. В частности, настоящее изобретение относится к применению соединения по изобретению формулы I для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-б или интерферонов. В частности, соединение ингибирует .ТАК, семейство тирозинкиназ, и более конкретно 1АК1. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединение, и способам для профилактики и/или лечения заболеваний, включающих воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, аллергию, отторжение трансплантата, заболевания, включающие ухудшение обновления хряща, врожденные мальформаций хряща и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ь-б или интерферонов, посредством введения соединения по изобретению формулы I.
Янус-киназы ПАК) представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, которые передают цитокиновые сигналы с мембранных рецепторов на факторы транскрипции §ТАТ. Описаны четыре члена семейства .ТАК, 1АК1. 1АК2. 1АК3 и ΤΥΚ2. При связывании цитокина со своим рецептором члены семейства .ТАК ауто- и/или трансфосфорилируют друг друга, за чем следует фосфорилирование 8ТАТ, которые затем мигрируют в ядро для того, чтобы модулировать транскрипцию. 1АК-8ТАТ трансдукция внутриклеточных сигналов служит для интерферонов, большинства интерлейкинов, а также различных цитокинов и эндокринных факторов, таких как ЕРО, ТРО, ОН, О8М, Ь1Р, СЫТР, ОМ-С8Р и РКЬ (УашсНепкег А. е! а1. (2008)).
Исследование комбинации генетических моделей и низкомолекулярного ингибитора .ТАК выявило терапевтический потенциал некоторых 1АК.
1АК1 представляет собой мишень в области иммунно-воспалительных заболеваний. 1АК1 образует гетеродимеры с другими .ТАК для того, чтобы передавать запускаемые цитокинами провоспалительные сигналы. Следовательно, для иммунно-воспалительных заболеваний интерес представляет ингибирование 1АК1 с применением ассоциированных с патологией цитокинов, использующих передачу сигналов через 1АК1, таких как 1Ь-б, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-23 или ΙΡΝγ, а также для других заболеваний, запускаемых с помощью 1АК-опосредованной трансдукции сигналов.
Среди членов семейства .ТАК имеет место некоторое перекрытие функций, поскольку в большинство путей передачи сигнала вовлечены более чем одна 1АК, однако для некоторых факторов роста, таких как эритропоэтин и тромбопоэтин, вовлечена только 1АК2.
1АК3 выполняет основную функцию в блокировании иммунной функции через передачу сигналов, генерируемых интерлейкином 2 (1Ь-2).
С другой стороны, ТУК2 похоже работает в комбинации с 1АК2 и 1АК3 для того, чтобы передавать сигналы цитокинов, таких как 1Ь-12 и 1Ь-23.
Роль ферментов .ТАК главным образом изучали у мышей, у которых удаляли каждый из членов семейства .ТАК. Мыши с нокаутом 1АК1 проявляют перинатальный летальный фенотип, а также имеют дефективное развитие и функционирование лимфоидной ткани в результате дефективной передачи сигналов цитокинов через 1АК1. Недостаточность 1АК2 ведет к эмбриональной летальности на 12 сутки в результате невозможности окончательного эритропоэза. Мыши с недостаточностью 1АК3 имеют фенотип с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (§СГО), но не имеют не иммунологических дефектов (Ует51оу5ек, 2009, Нета1о1о§у Ат §ос Нета!о1 Ебис Ргодгат., б3б-42).
Как наблюдали при применении ингибиторов всех .ТАК, неизбирательное ингибирование может быть связано с побочными эффектами, такими как анемия, повышенный уровень инфекций, более низкие количества нейтрофилов и лимфоцитов, снижение гемоглобина и повышенные уровни холестерина (Ейе ИоЩп, 2011, №Циге Ве\ле\У5 Итид И18соуегу И18соуегу 10, 717-718).
Следовательно, разработка селективного ингибитора 1АК будет полезна для того, чтобы минимизировать такие побочные эффекты.
Предпосылки создания изобретения
Дегенерация хряща является признаком различных заболеваний, среди которых ревматоидный артрит и остеоартрит являются наиболее значимыми. Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое дегенеративное заболевание суставов, которое отличается воспалением и разрушением суставных структур. Когда заболевание не приостанавливают, оно ведет к существенной нетрудоспособности и болям из-за утраты функциональности суставов и даже к преждевременной смерти. Следовательно, цель терапии РА состоит в том, чтобы не только замедлять заболевание, но и достигать ремиссии для того, чтобы останавливать разрушение сустава. Помимо тяжести исхода заболевания, высокая распространенность РА (по всему миру поражены ~0,8% взрослых) подразумевает выраженное социальноэкономическое влияние (обзоры по РА см. в §то1еп апб §1ешет (2003); Ьее апб АеигЫаИ (2001); СНоу апб Рапау1 (2001); О'ПеП (2004) и Рие51еш (2003)).
1АК1 вовлечена во внутриклеточную трансдукцию сигналов для многих цитокинов и гормонов. Патологии, связанные с каким-либо из этих цитокинов и гормонов, можно улучшать посредством ингиби- 1 029084
торов 1ΑΚ1. Таким образом, некоторые из аллергии, воспаления и аутоиммунных нарушений могут получать пользу от лечения соединениями, описанными в этом изобретении, включая ревматоидный артрит, системную красную волчанку, ювенильный идеопатический артрит, остеоартрит, астму, хроническое обструктивное заболевание легких (СОРИ), фиброз тканей, эозинофильное воспаление, эзофагит, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), трансплантат, реакцию "трансплантат против хозяина", псориаз, миозит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный идеопатический артрит и рассеянный склероз (Κορί с1 а1., 2010).
Псориаз представляет собой заболевание, которое может поражать кожу. Причина псориаза понята не полностью, однако, полагают, что он представляет собой иммуно-опосредованное заболевание, связанное с высвобождением цитокинов, в частности, ΤΝΕα, который вызывает воспаление и быструю репродукцию клеток кожи. Эту гипотезу подтверждают наблюдения о том, что лечение иммуносупрессантами может устранять псориазные бляшки (Ζβηζ К., ЕГег1 К., Кеппег Ь., с1 а1. (2005). "Р8опа818-Нке 8кт Шзсазс апб агкЬг1Й8 саи8еб Ьу шбиаЫе ер1бегта1 бе1ебоп оГ Кт ргокеш8". №-Ииге 437 (7057): 369-75).
Псориаз также может вызывать воспаление суставов, которое известно как псориатический артрит. От 10 до 30% всех людей с псориазом также имеют псориатический артрит (СоттШее Гог Мебюша1 Ргобиск8 Гог Нитап И8е (СНМР) (18 ШуетЬег 2004). "СтбеПпе оп СПп1са1 1пуе8Йдайоп оГ Мебю1па1 Ргобис18 шбюакеб Гог Ше 1геа1теп1 оГ Р8опа818"). В связи с его хронической рецидивирующей природой, псориаз представляет собой терапевтическую проблему. В последнее время продемонстрировано, что ингибирование 1ΑΚ может вести к успешному улучшению псориатического состояния. (Рииташ е1 а1., (2012) "РгеНтшагу сНтса1 асйуйу оГ а корюа11ΑΚ1/2 1пЛЬйог ш Ше кгеактепк оГ р8опа818" 1 Ат Асаб ЭегтаЮк, 67, 4, 658-664).
Воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ) представляет собой группу воспалительных состояний ободочной кишки и тонкой кишки. Основными типами ΙΒΌ являются болезнь Крона и язвенный колит. В последнее время в исследованиях полногеномных связей (Ο\νΑ8) обнаружено, что Т-клеточная белковая тирозиновая фосфатаза (ТСРТР) представляет собой фосфатазу рецепторов ΙΑΚ/8ΤΑΤ и факторов роста, которая связана с патогенезом диабета 1 типа, ревматоидного артрита и болезни Крона посредством Ο\νΑ8 УПФегтап е1 а1., 1 С1ш 1пуе81. 2011 Эес: 121(12): 4618-21). Следовательно, ингибирование каскада реакций 1ΑΚ может предоставлять путь для лечения ΙΒΌ.
Члены семейства 1ΑΚ вовлечены в дополнительные состояния, включая миелопролиферативные нарушения (О'8иШуап е1 а1., 2007, Мо1 1ттипо1. 44(10): 2497-506), где идентифицированы мутации в 1ΑΚ2. Это указывает на то, что ингибиторы 1ΑΚ, в частности 1ΑΚ2, также можно использовать при лечении миелопролиферативных нарушений. Дополнительно, семейство 1ΑΚ, в частности 1ΑΚ1, 1ΑΚ2 и 1ΑΚ3, связано со злокачественными опухолями, в частности, лейкемиями, например, острым миелолейкозом (О'8иШуап ек а1., 2007, Мо1 1ттипо1. 44 (10): 2497-506; Х1ап§ ек а1., 2008, "Мепкбгсабоп оГ 8ота0с 1ΑΚ1 тикайоп8 ш рабепк8 \νί11ι асике туеЫб 1еикет1а" В1ооб Иг8к Еббюп Рарег, предварительно опубликована онлайн 26 декабря 2007 года; ΌΟΙ 10.1182/Ь1ооб-2007-05-090308) и острой лимфобластной лейкемией (МиШдЬап ек а1., 2009)), Т-клеточной лимфомой кожи (ΖΚπίβ ек а1., 1996, РNΑδ, 93, 9148-9153) или солидными опухолями, например лейомиосаркома матки (Соп8капбпе8си ек а1., 2007, Тгепб8 ш ВюсНеииса1 8аепсе8 33(3): 122-131), злокачественной опухолью предстательной железы (Тагп ек а1., 2007, Βπθ8ΐι 1оигпа1 оГ Сапсег, 97, 378-383) и злокачественной опухолью молочной железы (Веп8На| ек а1., 2007, Вгеа8к Сапсег Ке8еагск 9: К32). Эти результаты показывают, что ингибиторы 1ΑΚ, в частности 1ΑΚ1, также могут иметь полезность при лечении злокачественных опухолей (лейкемий и солидных опухолей, например, лейомиосаркомы матки, злокачественной опухоли предстательной железы).
Кроме того, болезнь Кастлемана, множественная миелома, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, псориаз и саркома Капоши вероятно обусловлены гиперсекрецией цитокина 1Ь-6, биологические эффекты которого опосредованы внутриклеточной 1ΑΚ-8ΤΑΤ передачей сигналов (Тек8ир Nака, ШгПиго №8Ышоко апб Τабат^к8и Κ^8к^тοЮ. Ατί1τίΙί8 Ке8 2002, 4 (8ирр1 3):8233-8242). Этот результат показывает, что ингибиторы 1ΑΚ, также могут иметь полезность при лечении указанных заболеваний.
Существующие способы терапии не удовлетворительны и, следовательно, остается потребность идентифицировать дополнительные соединения, которые можно использовать при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-6 или интерферонов, в частности ревматоидного артрита.
Дополнительно, эти состояния представляют собой хронические состояния, которые требуют длительной терапии и повторяющегося приема лекарственного средства. Длительное лечение может быть тяжелым бременем для пациента, а также практикующего врача, поскольку пациент может быть или становиться не способным переносить лекарственное средство, и, кроме того, высокая доза или высокая частота доз может вести к неприятным побочным эффектами и/или снижать соблюдение пациентом схемы лечения, где пациент может иногда, намеренно или непреднамеренно пропускать дозу. Влияние неприверженности варьирует среди хронических заболеваний и находится в диапазоне от минимального до
- 2 029084
очень значимого (1пдегзо11 е! а1., 2008 I ВеНат Мед.; 31(3): 213-224).
Следовательно, существует необходимость идентифицировать дополнительные соединения, чтобы усиливать арсенал практикующего врача, и соединения со схемой дозирования с низкой частотой, чтобы улучшать жизнь пациентов.
В попытке открыть новые лекарства, часто устанавливают критерии для того, чтобы идентифицировать наилучшего подходящего кандидата, и, таким образом, многие соединения быстро оценивают в модели ίη νίΐΓΟ, и также быстро отбрасывают, если они не отвечают указанным критериям. Исследования ίη νίΐΓΟ обычно имеет более высокую пропускную способность, чем исследования ίη νίνο, и оказывают значительную помощь в процессе принятия решения. Таким образом, обычно ожидают, что модель ίη νίΐΓΟ может прогнозировать свойства лекарственного средства ίη νίνο, и отбрасывают соединения, которые на первый взгляд не выглядят обладающими подходящим профилем ίη νίΐΓΟ. В этом контексте, соединение по изобретению формулы I при исследовании демонстрировало профиль ίη νίΐΓΟ, который вызвал слабый интерес, однако исследования ίη νίνΟ выявляли неожиданные свойства, в частности, у человека.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на том открытии, что соединение по изобретению формулы I можно применять в качестве лекарственного средства. В конкретном аспекте соединение по изобретению формулы I представляет собой ингибитор ΙΆΚ и, более конкретно, ΙΑΚ1.
Настоящее изобретение также относится к способам получения соединения по изобретению формулы I, фармацевтическим композициям, содержащим соединение по изобретению формулы I, и способам профилактики и/или лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией П.-6 или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, посредством введения соединения по изобретению формулы I.
Соответственно в первом аспекте изобретения предоставлено соединение по изобретению для применения в медицине, которое имеет формулу I
Соединение по изобретению формулы I, к удивлению, проявляет у человека ίη νίνΟ профиль, сильно отличающийся от других видов животных, который контрастирует с предсказаниями ίη νίΐΓΟ. В действительности, ίη νίνΟ продемонстрировано, что у человека видимый конечный период полувыведения соединения по изобретению формулы I значительно длиннее, чем у других видов животных, по меньшей мере в 3 раза. Это вызывает у человека накопление, которое ведет к сохраняющемуся терапевтическому эффекту в течение длительного периода времени, тем самым, делая возможным дозирование от одного раза в сутки до одного раза в неделю. Таким образом, соединение по изобретению формулы I может обеспечивать преимущества, включая схему дозирования с низкой частотой и/или повышенное соблюдение пациентом схемы лечения. В частности, можно снижать влияние неприверженности, если пациент пропускает дозу.
В конкретном аспекте предусмотрено соединение по изобретению формулы I для применения в профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией П.-6 или интерферонов, в частности ревматоидного артрита.
В дополнительном аспекте, настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, которые содержат соединение по изобретению формулы I и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель. В конкретном аспекте фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительные терапевтически активные ингредиенты, пригодные для применения в комбинации с соединением по изобретению формулы I. В более конкретном аспекте дополнительный терапевтически активный ингредиент представляет собой соединение для лечения артрита. В наиболее конкретном аспекте дополнительный терапевтически активный ингредиент представляет собой соединение для лечения ревматоидного артрита.
Кроме того, соединение по изобретению формулы I, которое можно использовать в фармацевтиче- 3 029084
ских композициях и способах лечения, описанных в настоящем документе, является фармацевтически приемлемым, как получают и используют.
В дополнительном аспекте изобретения, данное изобретение предусматривает способ лечения млекопитающего, в частности, человека, склонного к или страдающего от состояния, выбранного среди тех, которые перечислены в настоящем документе, и, в частности, воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-б или интерферонов, более конкретно, ревматоидного артрита, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции или соединения по изобретению формулы I, как описано в настоящем документе.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединение по изобретению формулы I, и подходящий фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель для применения в медицине. В конкретном аспекте фармацевтическая композиция предназначена для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита.
В дополнительных аспектах данное изобретение предусматривает способы синтеза соединения по изобретению формулы I с применением репрезентативных протоколов и путей синтеза, раскрытых далее в настоящем документе.
Другие цели и преимущества будут видны специалистам в данной области при рассмотрении следующего подробного описания.
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 представлена клиническая оценка КИА (С1А) у крыс после лечения соединениями, описанными в настоящем документе.
На фиг. 2 представлена эволюция диаметра лодыжки в модели КИА на крысах после лечения соединениями, описанными в настоящем документе.
На фиг. 3 представлен метаболический профиль ίη νίίτο соединения формулы II.
На фиг. 4 представлено соотношение экспозиции (выраженное в виде АИС) для формулы I и формулы II, измеренное при введении соединения формулы II.
На фиг. 5 представлены значения для уровней экспозиции раскрытых соединений после введения соединения формулы II, выраженных в виде кратного для значения ТС50.
На фиг. б представлены комбинированные значения для уровней экспозиции в течение 24 ч периода для соединения формулы I и формулой II после введения соединения формулы II, выраженные в виде кратного для значения ГС50.
Подробное описание изобретения
Определения
Подразумевают, что следующие термины имеют значения, представленные приведенным ниже, и их можно использовать для понимания описания и предполагаемого объема настоящего изобретения.
Когда описывают изобретение, которое может включать соединения, фармацевтические композиции, содержащие такие соединения, и способы применения таких соединений и композиций, следующие термины, если присутствуют, имеют следующие значения, если не указано иное. Также следует понимать, что, при описании в настоящем документе, какой-либо из фрагментов, определенных ниже, можно замещать различными заместителями, и что соответствующие определения предназначены для того, чтобы включать такие замещенные фрагменты в свой объем, как изложено ниже. Если не указано иное, термин "замещенный" следует определять, как изложено ниже. Кроме того, следует понимать, что термины "группы" и "радикалы" можно считать взаимозаменяемыми при применении в настоящем документе.
Форму единственного числа можно использовать в настоящем документе, чтобы отослать к одному или больше чем одному (т.е. по меньшей мере одному) грамматическому объекту изделия. В качестве примера "аналог" обозначает один аналог или больше чем один аналог.
Как используют в настоящем документе, термин 'ДАК" относится к семейству Янус-киназ (ίΑΚ). которые представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, которые осуществляют передачу цитокиновых сигналов от мембранных рецепторов к факторам транскрипции §ТАТ. Описаны четыре члена семейства 1АК, 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ΤΥΚ2, и термин 1АК может относиться ко всем членам семейства 1АК вместе или к одному или нескольким членам семейства 1АК, как указывает контекст.
"Фармацевтически приемлемый" обозначает одобренный или заслуживающий одобрения регулирующим органом федерального или государственного правительства или соответствующего органа в странах, отличных от Соединенных Штатов или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных, более конкретно у человека.
"Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли соединения формулы I, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает желаемой фармакологической активностью исходного соединения. В частности, такие соли нетоксичны и могут представлять собой неорганические или орга- 4 029084
нические кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. В частности, такие соли включают: (1) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.; или образованные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропановая кислота, гексановая кислота, циклопентанпропановая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропановая кислота, триметилуксусная кислота, третичная бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и т.п.; или (2) соли, образованные так, что протон кислоты, присутствующий в исходном соединении, или заменяют на ион металла, например, ион щелочного металла, ион щелочноземельного металла или ион алюминия; или образуют координационные соединения с органическими основаниями, такими как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, Ν-метилглюкамин и т.п. Соли дополнительно включают, только в качестве примера, соли натрия, калия, кальция, магния, аммиака, тетраалкиламмония и т.п.; и когда соединение содержит основную функциональность, соли нетоксичных органических или неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и т.п. Термин "фармацевтически приемлемый катион" относится к приемлемому катионному противоиону кислой функциональной группы. Примерами таких катионов являются катионы натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.п.
"Фармацевтически приемлемый наполнитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят соединение по изобретению формулы I.
"Сольват" относится к формам соединения, которые связаны с растворителем, обычно посредством реакции сольволиза. Это физическое объединение включает образование водородных связей. Стандартные растворители включают воду, этанол, уксусную кислоту и т.п. Соединение по изобретению формулы I можно получать, например, в кристаллической форме и оно может быть сольватированным или гидратированным. Подходящие сольваты включают фармацевтически приемлемые сольваты, такие как гидраты, и, кроме того, включают как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты. В определенных случаях сольват будет способен к выделению, например, когда одна или несколько молекул растворителя встраиваются в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. "Сольват" охватывает как сольваты в растворенной фазе, так и поддающиеся выделению сольваты. Репрезентативные сольваты включают гидраты, этанолаты и метанолаты.
"Субъект" включает человека. Термины "человек", "пациент" и "субъект" используют в настоящем документе взаимозаменяемо.
"Терапевтически эффективное количество" обозначает количество соединения, которое при введении субъекту для лечения заболевания является достаточным для того, чтобы осуществлять такое лечение заболевания. "Терапевтически эффективное количество" может варьировать в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести, а также возраста, массы субъекта, подлежащего лечению, и т.д.
"Предотвращение" относится к снижению риска возникновения или развития заболевания или нарушения (т.е. обеспечивают не развитие по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания у субъекта, который может быть подвержен агенту, вызывающему заболевание, или предрасположен к заболеванию до начала заболевания).
Термин "профилактика" связан с "предотвращением", и относится к мере или процедуре, цель которой состоит в том, чтобы предотвращать, а не лечить или вылечивать заболевание. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать введение вакцин; введение низкомолекулярного гепарина пациентам в больнице с риском тромбоза, например, из-за иммобилизации; и введение антималярийных средств, таких как хлорохин, перед посещением географической области, где малярия является эндемическим заболеванием или высок риск контакта с малярией.
"Лечение" какого-либо заболевания или нарушения в одном из вариантов осуществления относится к улучшению заболевания или нарушения (т.е. приостановке заболевания или снижению манифестации, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления "лечение" относится к улучшению по меньшей мере одного физикального параметра, который может быть не видим субъекту. В еще одном другом варианте осуществления "лечение" относится к модулированию заболевания или нарушения, или физически, (например, стабилизация видимого симптома), физиологически, (например, стабилизация физического параметра), или и то и другое. В дополнительном варианте осуществления "лечение" относится к замедлению прогрессирования заболевания.
Как используют в настоящем документе, термин "воспалительное состояние(я)" относится к группе состояний, включающей ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный идеопатический артрит, псориаз, псориатический артрит, аллергическое заболевание дыхательных путей (например астма, ринит),
- 5 029084
воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), патологические состояния, вызванные токсинами (например, осложнения после шунтирования или хронические состояния эндотоксикации, способствующие, например, хронической сердечной недостаточности), и связанные заболевания хрящей, такие как заболевания суставов. В частности, термин относится к ревматоидному артриту, остеоартриту, аллергическому заболеванию дыхательных путей (например, астме) и воспалительным заболеваниям кишечника.
Как используют в настоящем документе, термин "аутоиммунное заболевание(я)" относится к группе заболеваний, включающей обструктивные заболевания дыхательных путей, включая такие состояния, как СОРЭ. астму (например, наследственную астму, приобретенную астму, пылевую астму или детскую астму), в частности, хроническую или застарелую астму (например, позднюю астму и гиперчувствительность дыхательных путей), бронхит (включая бронхиальную астму), системную красную волчанку (8ЬЕ), кожную красную волчанку (СЬЕ), рассеянный склероз, сахарный диабет I типа и осложнения, связанные с ним, атопическую экзему (атопический дерматит), контактный дерматит и, кроме того, экзематозный дерматит, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит), атеросклероз и амиотрофический боковой склероз. В частности термин относится к СОРЭ, астме, сахарному диабету I типа и воспалительному заболеванию кишечника.
Как используют в настоящем документе термин "пролиферативное заболевание(я)" относится к таким состояниям, как злокачественная опухоль (например, лейомиосаркома матки или злокачественная опухоль предстательной железы), миелопролиферативные нарушения (например, истинная полицитемия, эссенциальный тромбоцитоз и миелофиброз), лейкоз (например, острый миелолейкоз и острый лимфобластный лейкоз), множественная миелома, псориаз, рестеноз, склеродермия или фиброз. В частности, термин относится к злокачественной опухоли, лейкозу, множественной миеломе и псориазу.
Как используют в настоящем документе, термин "злокачественная опухоль" относится к злокачественному или доброкачественному росту клеток в коже или органах тела, например, но без ограничения, молочная железа, предстательная железа, легкие, почки, поджелудочная железа, желудок или кишечник. Злокачественная опухоль стремится инфильтрировать смежные ткани и распространяться (метастазировать) в отдаленные органы, например, в кости, печень, легкие или головной мозг. Как используют в настоящем документе, термин злокачественная опухоль включает как метастатические опухолевые типы клеток, такие как, но не ограничиваясь этим, меланома, лимфома, лейкемия, фибросаркома, рабдомиосаркома и мастоцитома и типы карциномы тканей, такие как, но не ограничиваясь этим, злокачественная опухоль толстой кишки, злокачественная опухоль предстательной железы, мелкоклеточный рак легких и немелкоклеточный рак легких, злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль мочевого пузыря, злокачественная опухоль почки, злокачественная опухоль желудка, глиобластома, первичная злокачественная опухоль печени, злокачественная опухоль яичников, злокачественная опухоль предстательной железы и лейомиосаркома матки.
Как используют в настоящем документе, термин "лейкоз" относится к неопластическим заболеваниям крови и органов кроветворения. Такие заболевания могут вызывать нарушения функций костного мозга и иммунной системы, которые делают носителя сильно склонным к инфицированию и кровотечениям. В частности, термин лейкоз относится к острому миелолейкозу (АМЕ) и острому лимфобластному лейкозу (АЬЬ).
Как используют в настоящем документе, термин "отторжение при трансплантации" относится к острому или хроническому отторжению алло- или ксенотрансплантатов клеток, тканей или солидных органов, например, панкреатических островков, стволовых клеток, костного мозга, кожи, мышц, роговичной ткани, нервной ткани, сердца, легких, комбинированного сердечно-легочного трансплантата, почки, печени, кишечника, поджелудочной железы, трахеи или пищевода или реакции "трансплантат против хозяина".
Как используют в настоящем документе, термин "заболевания, включающие ухудшение обновления хряща" включают такие состояния, как остеоартрит, псориатический артрит, ювенильный ревматоидный артрит, подагрический артрит, септический или инфекционный артрит, реактивный артрит, симпатическая рефлекторная дистрофия, альгодистрофия, синдром Титце или реберный хондрит, фибромиалгия, остеохондрит, нейрогенный или нейропатический артрит, артропатия, эндемические формы артрита, такие как эндемический деформирующий остеоартрит, болезнь Мселени и болезнь Гандигоду; дегенерация в результате фибромиалгия, системная красная волчанка, склеродермия и анкилозирующий спондилит.
Как используют в настоящем документе, термин "врожденная мальформация хряща" включает состояния, такие как врожденный хондролиз, хондродисплазии и псевдохондродисплазии, в частности, но без ограничения, микротия, анотия, метафизарная хондродисплазия и связанные нарушения.
Как используют в настоящем документе термин "заболевание(я), связанное с гиперсекрецией 1Ь-6" включает состояния, такие как болезнь Кастлемана, множественная миелома, псориаз, саркома Капоши и/или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит.
Как используют в настоящем документе, термин "заболевание(я), связанные с гиперсекрецией интерферонов" включает состояния, такие как системная и кожная красная волчанка, волчаночный нефрит,
- 6 029084
дерматомиозит, синдром Шегрена, псориаз, ревматоидный артрит.
"Соединение по изобретению" и эквивалентные выражения обозначают как включающие соединение по изобретению формулы I или формулы II (как говорит контекст), как описано ранее в настоящем документе, это выражение включает фармацевтически приемлемые соли и сольваты, например, гидраты и сольваты фармацевтически приемлемых солей, где контекст допускает это. Аналогичным образом, указание на промежуточные соединения, независимо о того, заявлены они сами или нет, понимают как включающее их соли и сольваты, где контекст допускает это.
Другие производные соединения по изобретению обладают активностью в форме как их кислот, так и производных кислот, но в чувствительной к кислоте форме часто имеют преимущества в виде растворимости, тканевой совместимости или отсроченного высвобождения в организме млекопитающего (см., Випбдагб, Н., Пе81§п о£ Ргобгидз, рр. 7-9, 21-24, ЕВеухег, Аш51егбаш 1985).
Как используют в настоящем документе, термин "изотопный вариант" относится к соединению, которое содержит неприродные соотношения изотопов одного или нескольких атомов, которые образуют такое соединение. Например, "изотопный вариант" соединения может содержать один или несколько нерадиоактивных изотопов, таких как, например, дейтерий (2Н или Ό), углерод 13 (13С), азот 15 (15Ν) или тому подобное. Понятно, что, в соединении, где выполнена такая изотопная замена, следующие атомы, где присутствуют, могут варьировать с тем, чтобы например, любой водород мог представлять собой 2Η/Ό, какой-либо углерод мог представлять собой 13С или какой-либо азот мог представлять собой 15Ν, и что присутствие и расположение таких атомов можно определять в соответствии со знаниями в данной области. Аналогичным образом, изобретение может включать получение изотопных вариантов с применением радиоизотопов, в случае, например, когда получаемые соединения можно использовать для лекарственного средства и/или в исследованиях распределения субстрата в тканях. Радиоактивные изотопы тритий, т.е. 3Н, и углерод 14, т.е. 14С, в частности, можно использовать с этой целью ввиду простоты их встраивания и готовых средств обнаружения. Кроме того, можно получать соединения, которые замещены изотопами, испускающими позитроны, такими как 11С, 18Р, 15О и 13Ν, и которые можно использовать в исследованиях позитронно-эмиссионной томографии (РЕТ) для исследования заполнения рецепторов субстратом.
Предполагают, что все изотопные варианты соединения, предоставленного в настоящем документе, радиоактивные или нет, включены в объем изобретения.
"Таутомеры" относятся к соединениям, которые представляют собой взаимозаменяемые формы конкретной структуры соединения и которые варьируют по смещению атомов водорода и электронов. Таким образом, две структуры могут находиться в равновесии за счет движения π-электронов и атома (обычно Н). Например, енолы и кетоны представляют собой таутомеры, поскольку они быстро взаимопревращаются при обработке кислотой или основанием. Другим примером таутомерии является аци- и нитроформы фенилнитрометана, которые аналогичным образом формируют посредством обработки кислотой или основанием.
Таутомерные формы могут иметь значение для достижения оптимальной химической реакционной способности и биологической активности соединения, представляющего интерес.
Изобретение
Настоящее изобретение основано на том открытии, что соединение по изобретению формулы I может быть полезно в качестве лекарственного средства. В конкретном аспекте, соединение по изобретению формулы I представляет собой ингибитор 1ΛΚ и, более конкретно, 1ΛΚ1.
Настоящее изобретение также относится к способам получения соединения по изобретению формулы I, фармацевтическим композициям, содержащим соединение по изобретению формулы I, и способами профилактики и/или лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией П.-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, посредством введения соединения по изобретению формулы I.
Соответственно в первом варианте осуществления изобретения соединение по изобретению формулы I предоставляют для применения в медицине, которое имеет формулу I
В другом варианте осуществления изобретения соединение по изобретению, которое представляет собой ингибитор .ΙΛΙΚ предоставлено для применения в медицине
- 7 029084
/>- νη2
\\
ο
Соединение по изобретению формулы I, к удивлению, проявляет ίπ νίνο у человека профиль, который сильно отличается от других видов животных и который сильно контрастирует с предсказаниями ίπ νΐίΓο. В действительности, ίπ νίνο демонстрировали, что у человека видимый конечный период полувыведения соединения по изобретению формулы I значительно длиннее, чем у других видов животных, по меньшей мере в 3 раза. Это вызывает накопление у человека, которое ведет к сохраняющемуся терапевтическому эффекту в течение длительного периода времени, тем самым допуская дозирование от одного раза в сутки до одного раза в неделю. Таким образом, соединение по изобретению формулы I может обеспечивать преимущества, включая схему дозирования с низкой частотой и/или повышенное соблюдение пациентом схемы лечения. В частности, можно снижать эффект не соблюдения указаний, если пациент пропускает дозу.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I не является изотопным вариантом.
В одном из аспектов соединение по изобретению формулы I присутствует в виде свободного основания.
В одном из аспектов соединение по изобретению формулы I представляет собой фармацевтически приемлемую соль.
В одном из аспектов соединение по изобретению формулы I представляет собой сольват соединения по изобретению формулы I.
В одном из аспектов соединение по изобретению формулы I представляет собой сольват фармацевтически приемлемой соли соединения по изобретению формулы I.
Соединение по изобретению формулы I представляет собой ингибитор ΙΛΚ. В частности, соединение по изобретению формулы I представляет собой сильный ингибитор ΙΛΚί, однако он может ингибировать ΙΛΚ2, ΙΛΚ3 и ΤΥΚ2 с меньшей активностью.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель.
В еще одном дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительное терапевтическое средство. В конкретном аспекте, другое соединение представляет собой соединение для лечения артрита. В более конкретном аспекте другое соединение представляет собой соединение для лечения ревматоидного артрита. В наиболее конкретном варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой соединение по изобретению формулы II
о
II
Фармацевтические композиции
Когда используют в качестве фармацевтического средства, соединение по изобретению формулы I типично вводят в форме фармацевтической композиции. Такие композиции можно получать способом, хорошо известным в области фармацевтики, и они содержат по меньшей мере одно активное соединение по изобретению формулы I. Обычно соединение по изобретению формулы I вводят в фармацевтически эффективном количестве. Количество вводимого в данный момент соединения по изобретению формулы I типично определяет врач, в свете значимых обстоятельств, включая состояние, подлежащее лечению, выбранный путь введения, вводимое в данный момент соединение по изобретению формулы I, возраст, массу и ответ отдельного пациента, тяжесть симптомов пациента и т.п.
- 8 029084
Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить посредством различных путей, включая пероральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутрисуставной, внутривенный, внутримышечный и интраназальный. В зависимости от планируемого пути доставки, соединение по изобретению формулы I по данному изобретению предпочтительно формулируют в виде или инъецируемых или пероральных композиций или в виде мазей, в виде лосьонов или в виде пластырей, все для трансдермального введения.
Композиции для перорального введения могут принимать форму нерасфасованных жидких растворов или суспензий или нерасфасованных порошков. Однако более часто композиции представляют в стандартных дозированных формах для того, чтобы содействовать точному дозированию. Термин "стандартные дозированные формы" относится к физически отдельным единицам, подходящим в качестве единичных доз для человеческих субъектов и других млекопитающих, каждая единица содержит предварительно определяемое количество активного материала, вычисленное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим эксципиентом, наполнителем или носителем. Типичные стандартные дозированные формы включают предварительно заполненные, предварительно отмеренные ампулы или шприцы с жидкими композициями или пилюли, таблетки, капсулы или тому подобное, в случае твердых композиций. В таких композициях соединение по изобретению формулы I обычно представляет собой минорный компонент (приблизительно от 0,1 приблизительно до 50 мас.% или предпочтительно приблизительно от 1 приблизительно до 40 мас.%), где остальное представляет собой различные наполнители или носители и технологические добавки, которые можно использовать для формирования желаемой формы дозирования.
Жидкие формы, подходящие для перорального введения, могут содержать подходящие водные или неводные наполнители с буферами, суспендирующими и диспергирующими средствами, красящими веществами, ароматами и т.п. Твердые формы могут содержать, например, какие-либо из следующих ингредиентов или соединения по изобретению со схожими свойствами: связующее средство, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза, средство для улучшения распадаемости, такое как альгиновая кислота, Рптоде1 или кукурузный крахмал; смазывающее средство, такое как стеарат магния; скользящее средство, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята или апельсиновый ароматизатор.
Инъецируемые композиции типично основаны на инъецируемом стерильном физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере или других инъецируемых носителях, известных в данной области. Как ранее, активное соединение по изобретению формулы I в таких композициях типично представляет собой минорный компонент, часто составляющий приблизительно от 0,05 до 10 мас.%, причем остальное представляет собой инъецируемый носитель и т.п.
Трансдермальные композиции типично формулируют в виде топической мази или крема, содержащий активный ингредиент(ы), обычно в количестве в диапазоне приблизительно от 0,01 приблизительно до 20 мас.%, предпочтительно приблизительно от 0,1 приблизительно до 20 мас.%, предпочтительно приблизительно от 0,1 приблизительно до 10 мас.% и более предпочтительно приблизительно от 0,5 приблизительно до 15 мас.%. Когда формулируют в виде мази, активные ингредиенты типично объединяют или с парафиновой или смешиваемой с водой основой мази. Альтернативно, активные ингредиенты можно формулировать в креме, например, с применением основы крема масло-в-воде. Такие трансдермальные составы хорошо известны в данной области и обычно содержат дополнительные ингредиенты для того, чтобы усиливать проникновение в кожу или стабильность активных ингредиентов или состава. Все такие известные трансдермальные составы и ингредиенты включены в объем данного изобретения.
Соединение по изобретению формулы I также можно вводить посредством трансдермального устройства.
Соответственно трансдермальное введение можно выполнять с применением пластыря по типу резервуара или пористой мембраны или различных твердых матриц.
Описанные выше компоненты вводимых перорально, инъецируемых или вводимых топически композиций являются лишь репрезентативными. Другие материалы, а также способы обработки и т.п. изложены в Рай 8 в РепипДогА РЬагтасеийса1 Заеисек, 171й οάίΐίοη. 1985, Маек РиЪНкЫид Сотрапу, Еайоп. Реии8у1уата, включенном в настоящий документ посредством ссылки.
Соединение по изобретению формулы I также можно вводить в формах с замедленным высвобождением или из систем доставки лекарственных средств с замедленным высвобождением. Описание репрезентативных материалов с замедленным высвобождением можно найти в ВепипДоп! РЬагтасеийса1 8с1еисе8.
Следующие примеры составов иллюстрируют репрезентативные фармацевтические композиции, которые можно получать в соответствии с данным изобретением. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими фармацевтическими композициями.
- 9 029084
Состав 1 - Таблетки
Соединение по изобретению формулы I можно смешивать в виде сухого порошка с сухим связующим средством желатин приблизительно в массовом соотношении 1:2. Незначительное количество стеарата магния можно добавлять в качестве смазывающего средства. Смесь можно формировать в таблетки 240-270 мг (80-90 мг активного соединения по изобретению формулы I на таблетку) в таблеточном прессе.
Состав 2 - Капсулы
Соединение по изобретению формулы I можно смешивать в виде сухого порошка с разбавителем крахмалом приблизительно в массовом соотношении 1:1. Смесью можно заполнять 250 мг капсулы (125 мг активного соединения по изобретению формулы I на капсулу).
Состав 3 - Жидкость
Соединение по изобретению формулы I (125 мг) можно смешивать с сахарозой (1,75 г) и ксантановой камедью (4 мг), и получаемую смесь тщательно перемешивать, пропускать через США сито 10 меш и затем смешивать с предварительно полученным раствором микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия (11:89, 50 мг) в воде. Бензоат натрия (10 мг), ароматизатор и краситель можно разводить в воде и добавлять при перемешивании. После этого при перемешивании можно добавлять достаточно воды. Кроме того, достаточно воды можно добавлять после этого, чтобы получать общий объем 5 мл.
Состав 4 - Таблетки
Соединение по изобретению формулы I можно смешивать в виде сухого порошка с сухим связующим средством желатином приблизительно в массовом соотношении 1:2. Незначительное количество стеарата магния можно добавлять в качестве смазывающего средства. Смесь можно формировать в 450900 мг таблетки (150-300 мг активного соединения по изобретению формулы I) в таблеточном прессе.
Состав 5 - Инъекция
Соединение по изобретению формулы I можно растворять или суспендировать в забуференном стерильном инъецируемом водном физиологическом растворе до концентрации приблизительно 5 мг/мл.
Состав 6 - Топическое средство
Стеариловый спирт (250 г) и белый вазелин (250 г) можно молоть приблизительно при 75°С и затем можно добавлять смесь соединения по изобретению формулы I (50 г), метилпарабена (0,25 г), пропилпарабена (0,15 г), лаурилсульфата натрия (10 г) и пропиленгликоля (120 г), растворенных в воде (приблизительно 370 г) и получаемую смесь можно перемешивать до тех пор, пока оно не загустеет.
Способы лечения
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения в медицине. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш-6 или интерферонов, в частности ревматоидного артрита.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при изготовлении лекарственного средства для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш-6 или интерферонов, в частности ревматоидного артрита.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I и другое терапевтическое средство. В конкретном варианте осуществления другое терапевтическое средство представляет собой средство для лечения артрита. В более конкретном варианте осуществления, другое терапевтическое средство представляет собой средство для лечения ревматоидного артрита. В наиболее конкретном варианте осуществления другое терапевтическое средство представляет собой соединение по изобретению формулы II.
В дополнительных аспектах способа лечения данное изобретение предусматривает способы профилактики и/или лечения млекопитающего, склонного к или страдающего от воспалительного состояния, эти способы включают введение терапевтически эффективного количества соединения по изобретению формулы I или одной или нескольких фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбрано из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит).
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I
- 10 029084
или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике воспалительного состояния. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики воспалительного состояния. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника (например, болезни Крона или язвенного колита).
В аспектах способов лечения данное изобретение предусматривает способы лечения или профилактики млекопитающего, склонного к или страдающего от аллергической реакции, включающие введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения или профилактики аллергического заболевания дыхательных путей, синусита, экземы и/или сыпи, пищевых аллергий или аллергий на яды насекомых.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике аллергической реакции. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения или профилактики аллергического заболевания дыхательных путей, синусита, экземы и/или сыпи, пищевых аллергий или аллергий на яды насекомых.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики аллергической реакции. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения или профилактики аллергического заболевания дыхательных путей, синусита, экземы и/или сыпи, пищевых аллергий или аллергий на яды насекомых.
В дополнительных аспектах способов лечения данное изобретение предусматривает способы лечения или профилактики млекопитающего, склонного к или страдающего от аутоиммунного заболевания, включающие введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из ревматоидного артрита, СОРЭ. астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идеопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит). В более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой системную красную волчанку. В еще одном более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит или псориатический артрит. В еще одном более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит).
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике аутоиммунного заболевания. В конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из ревматоидного артрита, СОРЭ, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идеопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит). В более конкретном варианте осуществления, аутоиммунное заболевание представляет собой системную красную волчанку. В еще одном более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит или псориатический артрит. В еще одном более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит).
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания. В конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из ревматоидного артрита, СОРЭ, астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идеопатического артрита и воспалительного заболевания кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит). В более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой системную красную волчанку. В еще одном более конкретном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит или псориатический артрит. В еще одном более конкретном варианте осуществления аутоиммунное за- 11 029084
болевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит).
В дополнительных аспектах способов лечения данное изобретение предусматривает способы лечения или профилактики млекопитающего, склонного к или страдающего от пролиферативного заболевания, эти способы включают введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой злокачественную опухоль (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или злокачественная опухоль предстательной железы), Тклеточную лимфому кожи, злокачественную опухоль молочной железы, лейкоз (например, АМЬ, АЬЬ или СЬЬ), множественную миелому и/или псориаз. В более конкретном варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой псориаз.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике пролиферативного заболевания. В конкретном варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой злокачественную опухоль (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или злокачественная опухоль предстательной железы), Тклеточную лимфому кожи, злокачественную опухоль молочной железы, лейкоз (например, АМЬ, АЬЬ или СЬЬ), множественную миелому и/или псориаз. В более конкретном варианте осуществления, пролиферативное заболевание представляет собой псориаз.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики пролиферативного заболевания. В конкретном варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой злокачественную опухоль (например, солидные опухоли, такие как лейомиосаркома матки или злокачественная опухоль предстательной железы), Т-клеточную лимфому кожи, злокачественную опухоль молочной железы, лейкоз (например, АМЬ, АЬЬ или СЬЬ), множественную миелому и/или псориаз. В более конкретном варианте осуществления, пролиферативное заболевание представляет собой псориаз.
В дополнительных аспектах способов лечения данное изобретение предусматривает способы лечения или профилактики млекопитающего, склонного к или страдающего от отторжения трансплантата, эти способы включают введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения или профилактики отторжения трансплантата органа.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике отторжения трансплантата. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения или профилактики отторжения трансплантата органа.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики отторжения трансплантата. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам лечения или профилактики отторжения трансплантата органа.
В одном из аспектов способа лечения данное изобретение предусматривает способ лечения или профилактики у млекопитающего, склонного к или страдающего от заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, эти способы включают введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики врожденных мальформаций хряща, включающему введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике врожденных мальформаций хряща.
В дополнительных аспектах способов лечения, данное изобретение предусматривает способы лечения или профилактики млекопитающего, склонного к или страдающего от заболеваний, связанных с гиперсекрецией ГЬ-6, эти способы включают введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описан- 12 029084
ных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления заболевание, связанное с гиперсекрецией ГЬ-б, выбирают из болезни Кастлемана и мезангиального пролиферативного гломерулонефрита.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-б. В конкретном варианте осуществления заболевание, связанное с гиперсекрецией 1Ь-б, выбирают из болезни Кастлемана и мезангиального пролиферативного гломерулонефрита.
В дополнительных аспектах способов лечения данное изобретение предусматривает способы лечения или профилактики млекопитающего, склонного к или страдающего от заболеваний, связанных с гиперсекрецией интерферонов, эти способы включают введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из фармацевтических композиций или соединения по изобретению формулы I, описанных в настоящем документе, для лечения или профилактики указанного состояния. В конкретном варианте осуществления заболевание, связанное с гиперсекрецией интерферона, выбирают из системной и кожной красной волчанки, волчаночного нефрита, дерматомиозита, синдрома Шегрена, псориаза и ревматоидного артрита.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, для применения при лечении или профилактике заболеваний, связанных с гиперсекрецией интерферонов. В конкретном варианте осуществления заболевание, связанное с гиперсекрецией интерферона, выбирают из системной и кожной красной волчанки, волчаночного нефрита, дерматомиозита, синдрома Шегрена, псориаза и ревматоидного артрита.
Конкретная схема по данному способу включает введение субъекту, страдающему заболеванием, в которое вовлечено воспаление, в частности ревматоидным артритом, остеоартритом, аллергическим заболеванием дыхательных путей (например, астмой) и/или воспалительными заболеваниями кишечника, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению формулы I в течение периода времени, достаточного для того, чтобы снижать уровень воспаления у субъекта и предпочтительно останавливать процессы, отвечающие за указанное воспаление. Конкретный вариант осуществления способа включает введение терапевтически эффективного количества соединения по изобретению формулы I субъекту-пациенту, страдающему от или склонному к развитию ревматоидного артрита, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы снижать или предотвращать соответственно воспаление в суставах указанного пациента, и предпочтительно останавливать, процессы, отвечающие за указанное воспаление.
Дополнительная конкретная схема данного способа включает введение субъекту, страдающему от заболевания или состояния, отличающегося разрушением хряща или суставов (например, ревматоидный артрит и/или остеоартрит), терапевтически эффективного количества соединения по изобретению формулы I в течение периода времени, достаточного для того, чтобы снижать и предпочтительно останавливать бесконечные процессы, отвечающие за указанное разрушение. Конкретный вариант осуществления способа включает введение терапевтически эффективного количества соединения по изобретению формулы I субъекту-пациенту, страдающему от или склонному к развитию остеоартрита, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы снижать или предотвращать соответственно разрушение хряща в суставах указанного пациента, и предпочтительно останавливать, бесконечные процессы, отвечающие за указанное разрушение. В конкретном варианте осуществления указанное соединение по изобретению формулы I, может проявлять анаболические и/или антикатаболические свойства в хряще.
В одном из аспектов, настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией !И-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, где соединение вводят в от одной до четырех (1-4) регулярных дозах каждые сутки и в частности от одной до трех (1-3) регулярных дозах каждые сутки, типично от одной до двух (1-2) регулярных дозах каждые сутки и наиболее типично в одной (1) регулярной дозе каждые сутки.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению формулы I для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, где соединение вводят в от одной до тринадцати (1-13) регулярных доз за двухнедельный период. В конкретном варианте осуществления соединение по изобретению формулы I вводят в от одной до двенадцати (1-12), от одной до десяти (1-10) или от двух до семи (2-7) регулярных дозах за двухнедельный период. В конкретном варианте осуществления соединение по изобретению формулы I вводят раз в неделю.
В дополнительном аспекте, настоящее изобретение предусматривает соединение по изобретению
- 13 029084
формулы II для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, где соединение вводят в от одной до тринадцати (1-13) регулярных дозах за двухнедельный период. В конкретном варианте осуществления соединение по изобретению формулы II вводят в от одной до двенадцати (1-12), от одной до десяти (1-10) или от двух до семи (2-7) регулярных дозах за двухнедельный период. В конкретном варианте осуществления соединение по изобретению формулы II вводят раз в неделю.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает комбинацию соединения по изобретению формулы I и соединения по изобретению формулы II для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией (И-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, где соединение вводят в от одной до четырех (1-4) регулярных дозах каждые сутки и в частности от одной до трех (1-3) регулярных дозах каждые сутки, типично от одной до двух (1-2) регулярных дозах каждые сутки, и наиболее типично одну (1) регулярную дозу каждые сутки.
В еще одном другом дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает комбинацию соединения по изобретению формулы I и соединения по изобретению формулы II для применения при профилактике и/или лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией [И-б или интерферонов, в частности ревматоидного артрита, где соединение вводят в от одной до тринадцати (1-13) регулярных дозах за двухнедельный период. В конкретном варианте осуществления комбинацию соединения по изобретению формулы I и соединения по изобретению формулы II вводят в от одной до двенадцати (1-12), от одной до десяти (1-10) или от двух до семи (2-7) регулярных дозах за двухнедельный период. В конкретном варианте осуществления комбинацию соединения по изобретению формулы I и соединения по изобретению формулы II вводят раз в неделю.
Уровни инъекционных доз варьируют приблизительно от 0,1 мг/кг/ч до по меньшей мере 10 мг/кг/ч, все в течение приблизительно от 1 приблизительно до 120 ч и в частности от 24 до 9б ч. Также можно вводить болюс для предварительной загрузки приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг или больше, чтобы достигать достаточных уровней устойчивого состояния. Предположительно, максимальная суммарная доза не превышает приблизительно 1 г/сутки для человека-пациента от 40 до 80 кг.
Для профилактики и/или лечения длительных состояний, таких как дегенеративные состояния, схему лечения обычно растягивают на многие месяцы или годы, так что пероральное дозирование предпочтительно для удобства и терпения пациента. При пероральном дозировании от одной до четырех (1-4) регулярных доз каждые сутки, в частности, от одной до трех (1-3) регулярных доз каждые сутки, типично от одной до двух (1-2) регулярных доз каждые сутки и наиболее типично одна (1) регулярная доза каждые сутки представляют собой репрезентативные схемы. Альтернативно для лекарственных средств с длительным эффектом, при пероральном дозирование, один раз в две недели, один раз в неделю и один раз в сутки представляют собой репрезентативные схемы. В частности, схема дозирования может быть каждые 1-14 суток, более конкретно 1-10 суток, даже более конкретно 1-7 суток и наиболее конкретно 13 суток.
При применении этих паттернов дозирования, каждая доза предусматривает приблизительно от 1 приблизительно до 1000 мг соединения по изобретению формулы I, причем каждая конкретная доза предусматривает приблизительно от 10 приблизительно до 500 мг и в частности приблизительно от 30 приблизительно до 250 мг.
При применении этих паттернов дозирования, каждая доза предусматривает приблизительно от 1 приблизительно до 1000 мг соединения по изобретению формулы II, причем каждая конкретная доза предусматривает приблизительно от 10 приблизительно до 500 мг и в частности приблизительно от 30 приблизительно до 250 мг.
Трансдермальные дозы обычно выбирают для того, чтобы обеспечивать схожие или более низкие уровни доз, чем достигают при применении инъекционных доз.
Когда используют для того, чтобы предотвращать начало состояния, соединение по изобретению формулы I следует вводить пациенту с риском развития состояния, типично по совету и под наблюдением врача, при уровнях дозы, описанных выше. Пациенты с риском развития конкретного состояния обычно включат тех, которые имеют состояние в семейном анамнезе, или тех, кого идентифицировали с помощью генетического тестирования или скрининга как особенно склонных к развитию состояния.
Соединение по изобретению формулы I можно вводить в виде единственного активного средства или его можно вводить в комбинации с другими терапевтическими средствами, включая другие соединения по изобретению, которые демонстрируют ту же или схожую терапевтическую активность и которые определяют как безопасные и эффективные для такого комбинированного введения. В конкретном вари- 14 029084
анте осуществления совместное введение двух (или больше) средств делает возможными значительно более низкие дозы каждого подлежащего применению, тем самым снижая наблюдаемые побочные эффекты.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I или фармацевтическую композицию, содержащую соединение по изобретению формулы I, вводят в качестве лекарственного средства. В конкретном варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительный активный ингредиент.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики заболевания, в которое вовлечено воспаление; конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим, иммунорегуляторные средства, например, азатиоприн, кортикостероиды (например, преднизолон или дексаметезон), циклофосфамид, циклоспорин А, такролимус, микофенолат мофетил, муромонаб-СЭ3 (ОКТ3, например, ортоколон®), АТО, аспирин, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен и пироксикам.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики артрита (например, ревматоидного артрита); конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим, аналгетики, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), стероиды, синтетические ΌΜΑΚΌ8 (например, но без ограничения, метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин, ауранофин, ауротиомалат натрия, пеницилламин, хлорохин, гидроксихлорохин, азатиоприн, тофацитиниб, барицитниб, фостаматиниб и циклоспорин), и биологические ΌΜΑΚΌ8 (например, но без ограничения, инфликсимаб, этанерцепт, адалимумаб, ритуксимаб и абатацепт).
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики пролиферативных нарушений; конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: метотрексат, лейковорин, адриамицин, преднизон, блеомицин, циклофосфамид, 5-фторурацил, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винбластин, винорелбин, доксорубицин, тамоксифен, торемифен, мегестрол ацетат, анастрозол, гозерелин, моноклональное антитело против НЕК2 (например, герцептин™), капецитабин, гидрохлорид ралоксифена, ингибиторы ЕОРК (например, пресса®, тарцева™, эрбитукс™), ингибиторы УЕОР (например, авастин™), ингибиторы протеасом (например, велкад™), гливек® и ингибиторы Й8р90 (например, 17-ААО). Дополнительно, соединение по изобретению формулы I можно вводить в комбинации с другой терапией, включая в качестве неограничивающих примеров лучевую терапию или хирургическое вмешательство. В конкретном варианте осуществления пролиферативное нарушение выбирают из злокачественной опухоли, миелопролиферативного заболевания или лейкемии.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания, конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: глюкокортикоиды, цитостатические средства (например, аналоги пурина), алкилирующие средства, (например, азотистые иприты (циклофосфамид), нитрозомочевины, соединения платины по изобретению и другие), антиметаболиты (например, метотрексат, азатиоприн и меркаптопурин), цитотоксические антибиотики (например, дактиномицин, антрациклины, митомицин С, блеомицин и митрамицин), антитела (например, моноклональные антитела против СЭ20. против СЭ25 или против СЭ3 (ОТК3), атгамыыы и тимоглобулиныыы), циклоспорин, такролимус, рапамицин (сиролимус), интерфероны (например, ΓΡΝ-β), связывающие ΤΝΡ белки (например, инфликсимаб, этанерцепт или адалимумаб), микофенолат, финголимод и мириоцин.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики отторжения трансплантата, конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: ингибиторы кальциневрина (например, циклоспорин или такролимус (РК506)), ингибиторы тТОК (например, сиролимус, эверолимус), антипролиферативные средства (например, азатиоприн, микофеноловая кислота), кортикостероиды (например, преднизолон, гидрокортизон), антитела (например, моноклональные антитела против рецептора ЕБ-2Ка, базиликсимаб, даклизумаб), поликлональные антитела против Т-клеток (например, антитимоцитарный глобулин (АТО), антилимфоцитарный глобулин (АЬО)).
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики астмы и/или ринита и/или СОРЭ, конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: агонисты в2-адренорецептора (например, сальбутамол, левальбутерол, тербуталин и битолтерол), эпинефрин (в ингаляциях или таблетках), антихолинергические средства (например, бромид ипратропия), глюкокортикоиды (пероральные или ингаляционные), в2-агонисты длительного действия (например, салметерол, формотерол, бамбутерол и пероральный альбутерол с замедленным высвобождением), комбинации ингаляционных стероидов и длительного действия бронходилататоры (например, флутиказон/салметерол, будесонид/формотерол), антагонисты и ингибиторы синтеза лейкотриенов (например, монтелукаст, зафирлукаст и зилейтон), ингибиторы высвобождения медиаторов (например, кромогликат и кетотифен), биологические регуляторы !§Е- 15 029084
ответа (например, инфликсимаб), антигистамины (например, цетиризин, циннаризин, фексофенадин) и сосудосуживающие средства (например, оксиметазолин, ксилометазолин, нафазолин и трамазолин).
Дополнительно, соединение по изобретению формулы I можно вводить в комбинации с неотложной терапией для астмы и/или СОРЭ. такая терапия включает введение кислорода или гелиево-кислородной смеси, небулизированный сальбутамол или тербуталин (необязательно в комбинации с антихолинергическим средством (например, ипратропием), системные стероиды (перорально или внутривенно, например, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметезон или гидрокортизон), сальбутамол внутривенно, неспецифические β-агонисты, инъекционно или ингаляционно (например, эпинефрин, изоэтарин, изопротеренол, метапротеренол), антихолинергические средства (внутривенно или небулизированные, например, гликопирролат, атропин, ипратропий), метилксантины (теофиллин, аминофиллин, бамифиллин), ингаляционные анестетики, которые оказывают бронходилатирующий эффект (например, изофлуран, галотан, энфлуран), кетамин и сульфат магния внутривенно.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики воспалительного заболевания кишечника (ΓΒΌ), конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: глюкокортикоиды (например, преднизон, будесонид) синтетические иммуномодулирующие средства, модифицирующие заболевание (например, метотрексат, лефлуномид, сульфасалазин, месалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурин и циклоспорин) и биологические иммуномодулирующие средства, модифицирующие заболевание (инфликсимаб, адалимумаб, ритуксимаб и абатацепт).
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики §ЬЕ, конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: антиревматические лекарственные средства, модифицирующие заболевание (ΌΜΑΚΌ), такие как противомалярийные средства (например, плаквенил, гидроксихлорохин), иммуносупрессанты (например, метотрексат и азатиоприн), циклофосфамид и микофеноловая кислота; иммуносупрессорные лекарственные средства и аналгетики, такие как нестероидные противовоспалительные средства, опиаты (например, декстропропоксифен и кокодамол), опиоиды (например, гидрокодон, оксикодон, МС контин или метадон) и трансдермальный пластырь с фентанилом дюрогезик.
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики псориаза, конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: топическое лечение, такое как растворы для ванн, увлажнители, лечебные кремы и мази, содержащие каменноугольную смолу, дитранол (антралин), кортикостероиды, такие как дезоксиметазон (топикорт™), флуоцинонид, аналоги витамина Ό3 (например, кальципотриол), масло арганы и ретиноиды (этретинат, ацитретин, тазаротен), системное лечение, такое как метотрексат, циклоспорин, ретиноиды, тиогуанин, гидроксимочевина, сульфасалазин, микофенолат мофетил, азатиоприн, такролимус, сложные эфиры фумаровой кислоты или биологические средства, такие как амевив™, энбрел™, хумира™, ремикейд™, раптива™ и устекинумаб (блокатор [И-12 и !Б-23). Дополнительно, соединение по изобретению формулы I можно вводить в комбинации с другой терапией, включая в качестве неограничивающих примеров фототерапию или фотохимиотерапию (например, псорален и фототерапия ультрафиолетом Α (РИУА)).
В одном из вариантов осуществления соединение по изобретению формулы I вводят совместно с другим терапевтическим средством для лечения и/или профилактики аллергической реакции, конкретные средства включают, но не ограничиваясь этим: антигистаминные средства (например, цетиризин, дифенгидрамин, фексофенадин, левоцетиризин), глюкокортикоиды (например, преднизон, бетаметазон, беклометазон, дексаметезон), эпинефрин, теофиллин или антилейкотриеновые (например, монтелукаст или зафирлукаст), антихолинергические и противозастойные средства.
Совместное введение включает любое средство доставки двух или более терапевтических средства пациенту в качестве части одной и той же схемы лечения, как будет очевидно специалисту. Хотя два или более средства и можно вводить одновременно в одном составе, т.е. в виде одной фармацевтической композиции, это не необходимо. Средства можно вводить в различных составах и в различные моменты времени.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение по изобретению формулы I, и соединение по изобретению формулы II, где соотношение соединения по изобретению формулы ^формулой II составляет от 1/5 до 1/20. В конкретном варианте осуществления соотношение составляет от 1/5 до 1/10.
Основные процедуры синтеза
Основное
Соединение по изобретению формулы I можно легко получать из доступных исходных материалов с применением следующих основных способов и процедур. Следует принимать во внимание, что когда задают типичные или предпочтительные условия процесса (т.е. температуры, время реакции, молярные соотношения реагентов, растворители, давление и т.д.), другие условия процесса также можно использовать, если не указано иное. Оптимальные условия реакции могут варьировать при применении конкрет- 16 029084
ных реагентов или растворителя, но такие состояния может определять специалист в данной области посредством стандартных процедур оптимизации.
Дополнительно, как будет очевидно специалистам в данной области, стандартные защитные группы могут быть необходимы для того, чтобы предотвращать протекание нежелательных реакций с определенными функциональными группами. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также подходящие условия для присоединения и снятия защитных групп хорошо известны в данной области. Например, множество защитных групп, а также их введение и удаление, описано в Т. Огеепе и Р. О. М. \\Шз, Рго1есРп§ Огоирз ш Огдатс 3уп1Рез13, Зесопб Εάΐίΐοη, УПеу, \е\у Уогк, 1991, и цитируемых в них литературных источниках.
Следующие способы представлены в деталях в отношении получения соединения по изобретению формулы I, как определено выше в настоящем документе и сравнительных примерах. Специалист в области органического синтеза может получать соединение по изобретению формулы I из известных или коммерчески доступных исходных материалов и реактивов.
Все реактивы были коммерческих сортов и их использовали, как получали, без дополнительной очистки, если не указано иное. Коммерчески доступные безводные растворители использовали для реакций, проводимых в инертной атмосфере. Во всех других случаях использовали химически чистые растворители, если не указано иное. Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле 60 (35-70 мкм). Тонкослойную хроматографию осуществляли с применением предварительно покрытых силикагелем Р-254 пластин (толщина 0,25 мм). 1Н ЯМР спектры регистрировали на спектрометре Вгикег ΌΡΧ 400 ЯМР (400 МГц). Химические сдвиги (δ) для 1Н ЯМР спектров приведены в миллионных долях (м.д.) по отношению к тетраметилсилану (δ 0,00) или подходящему пику остаточного растворителя, т.е. СНС13 (δ 7,27), в качестве внутреннего эталона. Мультиплетность задают в виде синглета (с.), дублета (д.), триплета (т.), квартета (кВ.), мультиплета (м.) и уширенного (ушир.). Константы взаимодействия (ά) даны в Гц. Спектры МС с электрораспылением получали на платформе ЬС/М8 спектрометра Мюгошазз. Для ЬС/М8 анализа использовали колонки: НюРгош, КгошазП Е1егш1у, 2,5 мкм С18, 150x4,6 мм, \а!егз ХЪпбде 5 мкм С18 (2), 250x4,6 мм (артикул 86003117), \а!егз Х1егга М3 5 мкм С18, 100x4,6 мм (картридж Р1из Оиагб) (артикул 186000486), Оешш1-\Х 3 мкм С18 100x3,0 мм (артикул 00Ό-4453-Υ0), РРепотепех Ьипа 5 мкм С18 (2), 100x4,6 мм. (картридж Р1из Оиагб) (артикул 00Ό-4252-Ε0), КшеПх Ризеб-Соге 2,7 мкм С18 100x4,6 мм (артикул 00Ό-4462-Ε0), 3ире1со, АзсепПз® Ехргезз С18 (артикул 53829-ϋ), или НюРгош На1о С18, 2,7 мкм С18, 150x4,6 мм (артикул 92814-702). РС-М3 регистрировали на \а!егз Мюгошазз ΖΡ, соединенном с НРРС \а!егз 2795, оборудованном УФ детектором \а!егз 2996. РС также проводили на НРРС АдПеп! 1100, соединенном с УФ детектором АдПеп! О1315А. Препаративная НРРС: \а!егз ХВпбде Ргер С18 5 мкм ΟΌΒ 19 мм 10x100 мм Р (номер изделия 186002978). Во всех способах используют градиенты МеС\/Н2О-Н2О содержит или 0,1% ТРА или 0,1% \Н3.
Список сокращений, используемых в экспериментальном разделе
лис | Площадь под кривой |
АРС | Аденоматозный полипоз толстой кишки |
РСМ | Дихлорметан |
ПРЕА | Ν,Ν-диизопропилэтиламин |
МеСЫ | Ацетонитрил |
ΏΜΕ | Ν,Ν-диметилформамид |
Кат. | Каталитическое количество |
ТЕА | Трифторуксусная кислота |
ТНЕ | Тетрагидрофуран |
ЯМР | Ядерный магнитный резонанс |
ΏΜ5Ο | Диметилсульфоксид |
ЬС-М5 | Жидкостная хроматография-Масс-спектрометрия |
м.д. | Миллионные доли |
ЕЕОАс | Этилацетат |
НЕ | Время удержания |
5 | Синглет |
Ьг 5 | Уширенный синглет |
т | Мультиплет |
мин | Минута |
мл | Миллилитр |
мкл | Микролитр |
г | Грамм |
мг | Миллиграмм |
- 17 029084
ΡάΟ12άρρ£ | [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен] дихлорпалладий(II) |
ММР | Матриксная металлопротеиназа |
РНК | Рибонуклеиновая кислота |
АРМА | Ацетат 4-аминофенилртути |
ЕВ 5 | Эмбриональная телячья сыворотка |
кДНК | Комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота |
Ь | Час |
Р1ТС | Флуоресцеинизотиоцианат |
ммоль | Миллимоли |
<2Р | Оиадие ϋίθ (дозирование один раз в сутки) |
ВЮ | Βΐ3 ίη ϋίθ (два раза каждые сутки) |
Отн. | Относительный |
НРЪС | Высокоэффективная жидкостная хроматография |
Получение соединения по изобретению с помощью синтеза
Пример 1. Синтез соединений
1.1. Путь 1
1.1.1. Синтез 5-бром-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2-иламина (промежуточное соединение 3)
1.1.1.1. 1 -(6-Бромпиридин-2-ил)-3 -карбоэтокситиомочевина (2)
В раствор 2-амино-6-бромпиридина (1) (253,8 г, 1,467 моль) в ИСМ (2,5 л), охлажденный до 5°С, добавляли этоксикарбонилизотиоцианат (173,0 мл, 1,467 моль) по каплям в течение 15 мин. После этого реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры (20°С) и перемешивали в течение 16 ч. Испарение ΐπ уаеио давало твердое вещество, которое собирали посредством фильтрования, тщательно промывали бензином (3x600 мл) и сушили на воздухе, чтобы получить (2). Тиомочевину использовали как таковую на следующей стадии без какой-либо очистки.
1Н-ЯМР (400 МГц, СИС13) δ 12,03 (1Н, уш.с, ΝΗ), 8,81 (1Н, д, 1=7,8 Гц, Н-3), 8,15 (1Н, уш.с, ΝΗ), 7,60 (1Н, т, 1=8,0 Гц, Н-4), 7,32 (1Н, дд, 1=7,7 и 0,6 Гц, Н-5), 4,31 (2Н, кв., 1=7,1 Гц, СН), 1,35 (3Η, т, 1=7,1 Гц, СН3).
1.1.1.2. 5-Бром-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридин-2-иламин (3)
В суспензию гидроксиламингидрохлорида (101,8 г, 1,465 моль) в ЕЮН/МеОН (1:1, 900 мл) добавляли Ν,Ν-диизопропилэтиламин (145,3 мл, 0,879 моль) и смесь перемешивали при комнатной температуре (20°С) в течение 1 ч. После этого добавляли 1-(6-бромпиридин-2-ил)-3-карбоэтокситиомочевину (2) (89,0 г, 0,293 моль) и смесь медленно нагревали с обратным холодильником (примечание: отбелочный скруббер требовался для того, чтобы гасить выделяющийся Н28). После 3 ч нагревания с обратным холодильником смесь оставляли остывать и фильтровали для того, чтобы собирать осажденное твердое вещество. Дополнительный продукт собирали посредством испарения фильтрата ΐπ уаеио, добавления Н2О (250 мл) и фильтрования. Объединенное твердое вещество промывали последовательно в Н2О (250 мл), ЕЮН/МеОН (1:1, 250 мл) и ЕкО (250 мл), затем сушили ΐπ уаеио, чтобы получать производное триазолопиридина (3) в виде твердого вещества. Соединение использовали как таковое на следующей стадии без какой-либо очистки.
‘Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6) δ 7,43-7,34 (2Н, м, 2х ароматический-Н), 7,24 (1Н, дд, 1=6,8 и 1,8 Гц, ароматический-Н), 6,30 (2Н, уш, Ν^); т/ζ 213/215 (1:1, М+Н', 100%).
1.1.2. Синтез 4-[4-(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензил]тиоморфолин-1,1-диоксида (промежуточное соединение 4)
2-(4-Бромметилфенил)-4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан (1 экв.) и ΌΙΡΕΑ (2 экв.) растворяли в ИСМ/МеОН (5:1 об.:об.) под Ν2 и частями добавляли тиоморфолин 1,1-диоксид (2 экв.). Получаемый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. После этого времени реакцию завер- 18 029084
шали. Растворитель испаряли. Соединение экстрагировали в ЕЮЛе и воде, промывали солевым раствором и сушили над безводным М§8О4. Органические слои фильтровали и испаряли. Конечное соединение выделяли без дополнительной очистки.
ί.ί.3. Синтез 5-[4-( ί, ί -диоксотиоморфолин-4-илметил)фенил] - [ ί ,2,4]триазоло [1,5-а] пиридин-2иламина (формула I)
4-[4-(4,4,5,5-Тетраметил-[ ί ,3,2]диоксаборолан-2-ил)бензил]тиоморфолин- ί, ί -диоксид (ί,ί экв.) добавляли в раствор 5-бром-[С2,4]триазоло[С5-а]пиридин-2-иламина (4:ί). В раствор добавляли Κ2ϋΟ3 (2 экв.) и РбС12бррР (0,03 экв.). После этого получаемую смесь нагревали на масляной бане при 90°С в течение ί6 ч под Ν2. Добавляли воду и раствор экстрагировали этилацетатом. Органические слои сушили над безводным М§8О4 и испаряли ίπ ναοιιο. Конечное соединение получали после очистки флэшхроматографией.
Ή-ЯМР (400 МГц, СОС13) δ 7,94-7,92 (д, 2Н), 7,52-7,48 (м, 3Н), 7,37-7,34 (м, ίΗ), 7,02-7,00 (м, ίΗ), 6,00 (д, 2Н), 3,76 (д, 2Н), 3,ί5-3,ί2 (м, 4Н), 2,93-2,9ί (м, 4Н).
т/ζ 358,2 (М+Н+, ί00%). ί.2. Путь 2
ί.2.ί. {5-[4-( ί, ί -Диоксотиоморфолин-4-илметил)фенил] - [ ί ,2,4]триазоло [ ί ,5-а]пиридин-2-ил}амид
циклопропанкарбоновой кислоты (формула II)
Соединение по изобретению формулы II можно синтезировать в соответствии с процедурой, описанной в ШО 20ί0/ί49769.
ί.2.2. Синтез 5-[4-(ί,ί-диоксотиоморфолин-4-илметил)фенил]-[ί,2,4]триазоло[ί,5-а]пиридин-2иламина (формула I)
Соединение по изобретению формулы I также можно получать гидролизом соединения формулы II
Хлористо-водородную кислоту 30% водн. (ί2,06 кг; 3,9 отн. объема) добавляли в суспензию соединения формулы II (3,45 кг; ί,0 экв.) в деминерализованной воде (ί0,0 кг; 3,0 отн. объема). Впоследствии осуществляли промывание линии деминерализованной водой (3,4 кг; ί,0 отн. объема). Реакционную смесь нагревали до 80±5°С в течение ί4,5 ч. После завершения реакции (выход >99%), реакционную смесь охлаждали до 20±5°С. Реакционную смесь разводили деминерализованной водой (6,8 кг; 2,0 отн. объема) и гидроксид натрия 33% водн. (9,52 кг; 3,7 отн. объема) дозировали на такой скорости, что температура содержимого реактора оставалась ниже 35°С. Требовалось дополнительное количество гидроксида натрия 33% водн. (2,55 кг; ί,0 отн. объема), чтобы получать рН >ί0. Продукт отфильтровывали, промывали два раза деминерализованной водой (ί,5 отн. объема) и сушили под вакуумом в течение ί ч, таким образом, получая неочищенное соединение по изобретению формулы I.
Повторно получали суспензию неочищенного соединения формулы I (5,70 кг) в деминерализованной воде (23,0 кг; 8,5 отн. объема). Добавляли хлористоводородную кислоту 30% водн. (ί,65 кг; 0,7 отн. объема) и деминерализованную воду (4,3 кг; ί,6 отн. объема) и реакционную смесь перемешивали при 20±5°С в течение 45 мин. Поскольку соединение по изобретению формулы I не растворялось полностью, реакционную смесь перемешивали при 45±5°С в течение ί ч. Реакционную смесь фильтровали и остаток промывали деминерализованной водой (2,0 кг 0,75 отн. объема). В фильтрат добавляли гидроксид натрия 33% водн. (ί,ί2 кг; 0,6 отн. объема). Требовалось дополнительное количество гидроксида натрия 33%> водн. (ί,0ί кг), чтобы получать рН >ί0. Получаемую реакционную смесь перемешивали при 20±5°С в течение приблизительно 3 ч. Продукт отфильтровывали, промывали два раза деминерализованной водой (4,ί кг; ί,5 отн. объема), и два раза трет-бутилметиловым простым эфиром (МТВЕ; 3,0 кг; ί,5 отн. объема) и сушили под вакуумом в течение ί5,5 ч на фильтре. Продукт дополнительно сушили в вакуумной
- ί9 029084
печи при 40±5°С в течение 202 ч, таким образом получая желаемое соединение по изобретению формулы I.
Биологические примеры
Пример 2. Анализы ίη-νίΐτο
2.1. Анализ ингибирования 1ЛК1
2.1.1. Субстрат поли-СТ для анализа 1ЛК1
Рекомбинантный каталитический домен 1ЛК1 человека (аминокислоты 866-1154; номер по каталогу РУ4774) приобретали в Ιηνίίτο^η. 25 нг 1ЛК1 инкубировали с 6,25 мкг субстрата поли-СТ (Б1дта номер по каталогу Р0275) в буфере для киназной реакции (15 мМ Нерек рН 7,5, 0,01% Т\уссп20. 10 мМ М§С12, 2 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,25 мКи 33Ρ-γ-ΑΤΦ (Реткш Е1тег, номер по каталогу ХЕС602К001МС) конечные концентрации) с или без 5 мкл содержащегося тестируемого соединения или наполнителя (ΌΜδΟ, конечная концентрация 1%), в общем объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96луночном планшете (Стешет, У-образное дно). После 75 мин при 30°С, реакцию останавливали посредством добавления 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96-луночные фильтровальные планшеты (Реткш Е1тег номер по каталогу 6005177) с применением сборщика клеток (Реткш Е1тег). Планшеты промывали 6 раз в 300 мкл на лунку 75 мМ раствора фосфорной кислоты и дно планшетов герметизировали. Добавляли 40 мкл/лунка Μίοτο8θίηΐ-20, верхнюю часть планшетов герметизировали и осуществляли считывание с применением Торсоип! (Реткш Е1тег). Киназную активность вычисляли посредством вычитания счетов в мин (счеты/мин), получаемых в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ ставроспорин) из счетов/мин, получаемых в присутствии наполнителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как:
Процентная доля ингибирования = ((счеты/мин, определяемые для образца в присутствии тестируемого соединения счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля), деленные на (счеты/мин, определяемые в присутствии наполнителя - счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля)) х 100.
Для соединений получали серийное разведение доз, что делает возможным тестирование дозозависимых эффектов при анализе 1ЛК1 и вычислении 1С50 для соединения. Соединение тестировали в концентрации 20 мкМ, после чего следовало 1/3 серийное разведение, 8 точек (20 мкМ - 6,67 мкМ - 2,22 мкМ -740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в конечной концентрации 1% ΌΜδΟ. Когда возрастает активность соединения, получают больше разведений и/или снижают максимальную концентрацию (например, 5 мкМ, 1 мкМ).
Активность соединения формулы I в отношении 1ЛК1 определяли в соответствии с анализом, описанным выше, таким образом, получая значения 1С50 460,1, 586, 494,3, 758,2 и 432,7 нМ (среднее 546,26 нМ).
2.1.2. Анализ 1ЛК1 с пептидом и11дЙ-1ЛК1
Рекомбинантный 1ЛК1 человек (каталитический домен, аминокислоты 866-1154; номер по каталогу РУ4774) приобретали в Ιηνίΐτο^η. 1 нг 1ЛК1 инкубировали с 20 нМ пептида иЬдЬ1-1ЛК1 (4уг1023) (Регкш Е1тег номер по каталогу ТРЕ0121) в буфере для киназной реакции (15 мМ МОРБ рН 6,8, 0,01% Вгу35, 5 мМ М§С12, 2 мМ ОТТ, 7 мкМ АТФ) с или без 4 мкл содержащегося тестируемого соединения или наполнителя ЩМБО, 1% конечная концентрация), в общем объеме 20 мкл, в белом планшете 384 Орй (Реткш Е1тег, номер по каталогу 6007290). После 60 мин при комнатной температуре реакции останавливали посредством добавления 20 мкл/лунка смеси для обнаружения (1х буфер для обнаружения (Регкш Е1тег, номер по каталогу СК97-100С), 0,5 нМ европий-антифосфотирозина (РТ66) (Регкш Е1тег, номер по каталогу ΑΌ0068), 10 мМ ЭДТА). Считывание осуществляли с применением Епуйюп с возбуждением на 320 нм и измерением испускания на 615 нм (Реткт Е1тег). Киназную активность вычисляли посредством вычитания относительных единиц флуоресценции (КЕИ), получаемых в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ ставроспорин), из КЕИ, получаемых в присутствии наполнителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность, определяли как
Процентная доля ингибирования = ((КЕИ, определяемые для образца в присутствии тестируемого соединения - КЕИ, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля), деленные на (КЕИ, определяемые в присутствии наполнителя - КЕИ, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля)) х 100.
Для соединения получали серийное разведение доз, что делает возможным тестирование дозозависимых эффектов в анализе 1ЛК1 и вычисление 1С50 для соединения. Соединение обычно тестировали в концентрации 20 мкМ, после чего следовало серийное разведение 1/5, 10 точек в конечной концентрации 1% ОМБО. Когда активность соединения возрастала, получали больше разведений и/или снижали максимальную концентрацию (например, 5 мкМ, 1 мкМ). Данные выражали в виде среднего 1С50 из анализа ± стандартная ошибка среднего.
Активность соединения формулы I в отношении 1ЛК1 определяли в соответствии с анализом, описанным выше, таким образом, получая значения 1С50 346,8, 714,3, 166,6, 103,3, 187,2, 582,3, 295,3, 241,7,
- 20 029084
159,2, 355,3 и 221,6 нМ (среднее = 307 нМ).
2.1.3. Анализ определения Κι 1АК1
Для определения Κι, различные количества соединения смешивают с ферментом и проводят ферментативную реакцию в качестве функции от концентрации АТФ. Κι определяют с помощью графика двойной обратной зависимости Кт от концентрации соединения (график Лайнуивера-Берка). В анализе используют 1 нг 1АК1 (1пуИтодеп, РУ4774). Субстрат представляет собой 20 нМ пептида ийдй1-1АК-1 (Туг1023) (Регкт Е1тег, ΤΚΡΌ121). Реакцию осуществляют в 15 мМ МОРБ рН 6,8, 0,01%, Вту-35, 2 мМ ΌΤΤ, 5 мМ МдС12 с различными концентрациями АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат измеряют с применением меченного европием антитела против фосфотирозина РТ66 (Регкт Е1тег, АЭ0068), как описано в 1.1.2. Считывание осуществляют на Εηνίδίοη (Регкт Е1тег) с возбуждением на 320 нм и последующим испусканием на 615 и 665 нм.
2.2. Анализ ингибирования 1АК2
2.2.1. Субстрат поли-СТ для анализа 1АК2
Рекомбинантный каталитический домен 1АК2 человека (аминокислоты 808-1132; номер по каталогу РУ4210) приобретали в Луйгодет 0,05 мЕд 1АК2 инкубировали с 2,5 мкг субстрата поли-СТ (Б1дта номер по каталогу Р0275) в буфере для киназной реакции (10 мМ МОРБ рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 0,01% Вту-35, 1 мМ ΌΤΤ, 15 мМ МдАс, 1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,25 мкКи 33Р-у-АТФ (Регкт Е1тег, номер по каталогу МЕС602К001МС) конечные концентрации) с или без 5 мкл содержащегося тестируемого соединения или наполнителя (ЭМБО. 1% конечная концентрация), в общем объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Стешет, У-образное дно). После 90 мин при 30°С реакцию останавливали посредством добавления 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96-луночные фильтровальные планшеты (Регкт Е1тег номер по каталогу 6005177) с применением сборщика клеток (Регкт Е1тег). Планшеты промывали 6 раз с применением 300 мкл на лунку 75 мМ раствора фосфорной кислоты и дно планшетов герметизировали. Добавляли Мюго8ст1-2040 мкл/лунка, верхнюю часть планшетов герметизировали и осуществляли считывание с применением Τορ^ιιηΙ (Регкт Е1тег). Киназную активность вычисляли посредством вычитания счетов в мин (счеты/мин), получаемых в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ ставроспорин) из счетов/мин, получаемых в присутствии наполнителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как
Процентная доля ингибирования = ((счеты/мин, определяемые для образца в присутствии тестируемого соединения счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля), деленные на (счеты/мин, определяемые в присутствии наполнителя - счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля)) х 100.
Для соединений получали серийное разведение доз, что делает возможным тестирование дозозависимых эффектов в анализе 1АК2 и вычисление 1С50 для каждого соединения. Соединение тестировали у концентрации 20 мкМ, после чего следовало 1/3 серийное разведение, 8 точек (20 мкМ - 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в конечной концентрации 1% ОМБО. Когда возрастала активность серии соединения, получали дополнительные разведения и/или снижали максимальную концентрацию (например, 5 мкМ, 1 мкМ).
Активность соединения формулы I в отношении 1АК1 определяли в соответствии с анализом, описанным выше, таким образом получая значения 1С50 566,9, 365,5, 256,4, 915,1 и 1017 нМ (среднее = 62 4 нМ).
2.2.2. Анализ 1АК2 с пептидом иПд1и-1АК1
Рекомбинантный 1АК2 человека (каталитический домен, аминокислоты 866-1154; номер по каталогу РУ4210) приобретали в Бгейгодеп. 0,0125 мкЕд 1АК2 инкубировали с 25 нМ пептида иБдЫ-1АК1 (1ут1023) (Регкт Е1тег номер по каталогу ΤΚΕ0121) в буфере для киназной реакции (25 мМ НЕРЕБ рН 7,0, 0,01% Ττίΐοη Х-100, 7,5 мМ МдС12, 2 мМ ΌΤΤ, 7,5 мкМ АТФ) с или без 4 мкл содержащегося тестируемого соединения или наполнителя ЩМБО, 1% конечная концентрация), в общем объеме 20 мкл, в белом планшете 384 ОрИ (Регкт Е1тег, номер по каталогу 6007290). После 60 мин при комнатной температуре реакции останавливали посредством добавления 20 мкл/лунка смеси для обнаружения (1хбуфер для обнаружения (Регкт Е1тег, номер по каталогу СК97-100С), 0,5 нМ европий-антифосфотирозина (РТ66) (Регкт Е1тег, номер по каталогу АЭ0068), 10 мМ ЭДТА). Осуществляли считывание с применением Е^хкюп с возбуждением на 320 нМ и измерением испускания на 615 нм (Регкт Е1тег) . Киназную активность вычисляли посредством вычитания относительных единиц флуоресценции (КРИ), получаемых в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ ставроспорин), из КРИ, получаемых в присутствии наполнителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как
Процентная доля ингибирования = ((КРИ, определяемые для образца в присутствии тестируемого соединения - КРИ, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля), деленные на (КРИ, определяемые в присутствии наполнителя - КРИ, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля)) х 100.
- 21 029084
Для соединения получали серийное разведение доз, что делает возможным тестирование дозозависимых эффектов в анализе 1АК2 и вычисление Κ.'50 для соединения. Соединение тестировали в концентрации 20 мкМ, после чего следовало 1/5 серийное разведение, 10 точек в конечной концентрации 1% ΌΜδΟ. Когда возрастала активность соединения, получали дополнительные разведения и/или снижали максимальную концентрацию (например, 5 мкМ, 1 мкМ). Данные выражали в виде среднего Κ.'50 из анализа ± стандартная ошибка среднего.
Активность соединения формулы I в отношении 1АК2 определяли в соответствии с анализа, описанного выше, таким образом, получая значения ГС50 1031, 351,2, 137,5, 3б7,2, 310,2, 729,2, 151,7, 203,0, 1б8,0 и 517,0 (среднее = 397 нМ).
2.2.3. Анализ определения Ι<ύ/Ι<ί для 1АК2
2.2.3.1. Анализ определения К1 для 1АК2
Для определения К1 различные количества соединения смешивают с ферментом и проводят ферментативную реакцию как функцию концентрации АТФ. К1 определяют с помощью графика двойной обратной зависимости Кт от концентрации соединения (график Лайнуивера-Берка). В анализе используют 0,0125 мкЕд 1АК1 Дтйгодеп, РУ4210). Субстрат представляет собой 25 нМ пептида и11дН1-ЛАК-1 (Туг1023) (Реткш Е1тег, ТКЕ0121). Реакцию осуществляют в 25 мМ НЕРЕ8 рН7,0, 0,01% Ττίίοη Х-100, 7,5 мМ МдС12, 2 мМ ОТТ с различными концентрациями АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат измеряют с применением меченных европием антител против фосфотирозина РТбб (Реткш Е1тег, А00068), как описано в 1.2.2. Считывание осуществляют на ЕпУйюп (Реткш Е1тег) с возбуждением на 320 нм и последующим испусканием на б15 и бб5 нм.
2.2.3.2. Анализ определения Кб для 1АК2
1АК2 Дтйгодеп, РУ4210) используют в конечной концентрации 2,5 нМ. Эксперимент по связыванию осуществляют в 50 мМ Нерек рН 7,5, 0,01% Вту-35, 10 мМ МдС12, 1 мМ ЕОТА с применением 25 нМ Кшаке Тгасег 23б Дшйгодеп, РУ5592) и 2 нМ Енгоршт-апЦ-СБТ Дтйгодеп, РУ5594) с меняющимися концентрациями соединения. Обнаружение Тгасег осуществляют в соответствии с процедурой производителя.
2.2.4. Анализ ингибирования 1АК3
Рекомбинантный каталитический домен 1АК3 человека (аминокислоты 795-1124; номер по каталогу 08-04б) приобретали в Сагпа Вюкшепсек. 0,5 нг бела 1АК3 инкубировали с 2,5 мкг субстрата поли-ОТ (81дта номер по каталогу Р0275) в буфере для киназной реакции (25 мМ Тпк рН 7,5, 0,5 мМ ЕОТА, 10 мМ МдС12, 2,5 мМ ЭТТ, 0,5 мМ Ыа3УО4, 5 мМ β-глицеролфосфат, 0,01% Тгйоп Х-100, 1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,25 мкКи 33Р-у-АТФ (Реткш Е1тег, номер по каталогу ДЕОб02К001МС) конечные концентрации) с или без 5 мкл содержащегося тестируемого соединения или наполнителя (ΌΜδΟ, 1% конечная концентрация), в общем объеме 25 мкл, в полипропиленовом 9б-луночном планшете (Отешет, Уобразное дно). После 45 мин при 30°С, реакции останавливали посредством добавления 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 9б-луночные фильтровальные планшеты (Реткш Е1тег номер по каталогу б005177) с применением сборщика клеток (Реткш Е1тег). Планшеты промывали б раз в 300 мкл на лунку 75 мМ раствора фосфорной кислоты и дно планшетов герметизировали. Добавляли М1стоксшЕ20 40 мкл/лунка, верхние части планшетов герметизировали и осуществляли считывание с применением ТорсошИ (Реткш Е1тег). Киназную активность вычисляли посредством вычитания счетов в мин (счеты/мин), получаемых в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ ставроспорин), из счетов/мин, получаемых в присутствии наполнителя. Способность тестируемого соединения ингибировать эту активность определяли как
Процентная доля ингибирования = ((счеты/мин, определяемые для образца в присутствии тестируемого соединения счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля), деленные на (счеты/мин, определяемые в присутствии наполнителя - счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля)) х 100.
Для соединений получали серийные разведения доз, что делает возможным тестирование дозозависимых эффекты в анализе 1АК3 и вычисление Κ.'50 для соединения. Соединение тестировали в концентрации 20 мкМ, после чего следовало 1/5 серийное разведение, 10 точек в конечной концентрации 1% ΌΜδΟ. Когда соединение увеличивалось, получали дополнительные разведения и/или снижали максимальную концентрацию (например, 5 мкМ, 1 мкМ).
Активность соединения формулы I в отношении 1АК3 определяли в соответствии с анализом, описанным выше, таким образом, получая значения Κ.’50 2497, >4000, >4000, >3333, >3333, 3939, >4000, >4000, >4000, 3201 и 33б8 (среднее >3б0б нМ).
2.2.5. Анализ определения К1 для 1АК3
Для определения Кт различные количества соединения смешивают с ферментом и проводят ферментативную реакцию как функцию от концентрации АТФ. К1 определяют с помощью графика двойной обратной зависимости Кт от концентрации соединения (график Лайнуивера-Берка). 1АК3 (Сагпа Вюксй епсек, 08-04б) используют в конечной концентрации 20 нг/мл. Субстрат представляет собой соль
- 22 029084
поли(С1и, Туг) натрия (4:1), молекулярная масса 20000-50000 (§1§та, Р0275), Реакцию осуществляют в 25 мМ Тпз рН 7,5, 0,01% ТпЮп Х-100, 0,5 мМ ЕСТА, 2,5 мМ ΌΤΤ, 0,5 мМ Ыа3УО4, 5 мМ βглицеролфосфат, 10 мМ МдС12 с различными концентрациями АТФ и соединения и останавливают посредством добавления 150 мМ фосфорной кислоты. Измерение включенного фосфата в субстрате полиСТ выполняют посредством загрузки образцов на фильтровальный планшет (с применением сборщика, Регкш Е1тег) и последующего промывания. Включенный 33Р в поли-СТ измеряют на сцинтилляционном счетчике Торсоип! после добавления сцинтилляционной жидкости в фильтровальные планшеты (Регкш Е1тег).
2.3. Анализ ингибирования ТУК2
Рекомбинантный каталитический домен ТУК2 человека (аминокислоты 871-1187; номер по каталогу 08-147) приобретали в Сагпа Ъюзшепсез. 4 нг ТУК2 инкубировали с 12,5 мкг субстрата поли-СТ (δί§та номер по каталогу Р0275) в буфере для киназной реакции (25 мМ Нерез рН 7,2, 50 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭТТ, 5 мМ МпС12, 10 мМ МдС12, 0,1% Вгу-35, 0,1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,125 мкКи 33Ρ-γ-ΑΤΦ (Регкш Е1тег, номер по каталогу ИЕС602К001МС) конечные концентрации) с или без 5 мкл содержащегося тестируемого соединения или наполнителя (ΌΜ8Ο, 1%> конечная концентрация), в общем объеме 25 мкл, в полипропиленовом 96-луночном планшете (Сгешег, У-образное дно). После 90 мин при 30°С реакции останавливали посредством добавления 25 мкл/лунка 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакции переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 96-луночные фильтровальные планшеты (Регк1п Е1тег номер по каталогу 6005177) с применением сборщика клеток (Регкш Е1тег). Планшеты промывали 6 раз в 300 мкл на лунку 75 мМ раствора фосфорной кислоты и дно планшетов герметизировали. Добавляли Мюго8ст1-20 40 мкл/лунка, верхние части планшетов герметизировали и осуществляли считывание с применением Торсоип! (Регк1п Е1тег). Киназную активность вычисляли посредством вычитания счетов в мин (счеты/мин), получаемых в присутствии ингибитора положительного контроля (10 мкМ ставроспорин), из счетов/мин, получаемых в присутствии наполнителя. Способность тестируемого соединения ингибировать его активность определяли как
Процентная доля ингибирования = ((счеты/мин, определяемые для образца в присутствии тестируемого соединения счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля), деленные на (счеты/мин, определяемые в присутствии наполнителя - счеты/мин, определяемые для образца с ингибитором положительного контроля)) х 100.
Для соединений получали серийные разведения доз, что делает возможным тестирование дозозависимых эффектов в анализе ТУК2 и вычисление 1С50 для каждого соединения. Каждое соединение обычно тестировали в концентрации 20 мкМ, после чего следовало 1/3 серийное разведение, 8 точек (20 мкМ 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в конечной концентрации 1% ΌΜ8Ο. При увеличении активности серии соединений получали дополнительные разведения и/или снижали максимальную концентрацию (например, 5 мкМ, 1 мкМ).
Активность соединения формулы I в отношении ТУК2 определяли в соответствии с анализом, описанным выше, таким образом, получая значения 1С50 >3333, >3333, >3333, 1973, 2121, 3852, 3819, и 2207 (среднее >2996 нМ).
2.3.1. Анализ определения Ι<ύ/Ι<ί для ТУК2
2.3.1.1. Анализ определения К1 для ТУК2
Для определения К различные количества соединения смешивают с ферментом и проводят ферментативную реакцию как функцию от концентрации АТФ. К1 определяют с помощью графика двойной обратной зависимости Кт от концентрации соединения (график Лайнуивера-Берка). ТУК2 (Сагпа ВюзсР епсе8, 08-147) используют в конечной концентрации 160 нг/мл. Субстрат представляет собой соль поли(С1и,Туг) натрия (4:1), молекулярная масса 20000-50000 (§1§ша, Р0275) Реакцию осуществляют в 25 мМ Перез рН 7,2, 50 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ПТТ, 5 мМ МпС12, 10 мМ М§С12, 0,1% Вгу-35 с различными концентрациями АТФ и соединения и останавливают посредством добавления 150 мМ фосфорной кислоты. Измерение включенного фосфата в субстрате поли-СТ выполняют посредством загрузки образцов на фильтровальный планшет (с применением сборщика, Регкш Е1тег) и последующего промывания. Включенный 33Р в поли-СТ измеряют на сцинтилляционном счетчике Торсоип! после добавления сцинтилляционной жидкости в фильтровальные планшеты (Регкш Е1тег).
2.3.1.2. Анализ определения Кб для ТУК2
ТУК2 (Сагпа Вюзаепсез, 08-147) используют в конечной концентрации 50 нМ. Эксперимент по связыванию осуществляют в 50 мМ Нерез рН 7,5, 0,01% Вгу-35, 10 мМ МдС12, 1 мМ ЕСТА с применением 15 нМ Кшазе Тгасег 236 (1пуЦгодеп, РУ5592) и 10 нМ Еигоршт-ап1г-С8Т (1пуЦгодеп, РУ5594) с различными концентрациями соединений. Обнаружение Тгасег осуществляют в соответствии с процедурой производителя.
Пример 3. Клеточные анализы:
3.1. Анализ передачи сигнала 1АК-8ТАТ
Клетки НеЬа содержали в модифицированная по способу Дульбекко среде Игла (ИМЕМ), содержащей 10% инактивированной теплом эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и
- 23 029084
100 мкг/мл стрептомицина. Клетки НеЬа использовали при конфлуентности 70% для трансфекции. 20000 клеток в 87 мкл клеточной культуральной среды временно трансфицировали с применением 40 нг репортера р8ТАТ1(2)-люциферазы (Раиотюк), 8 нг репортера Ьас2 в качестве репортера внутреннего контроля и 52 нг рВ8К с применением 0,32 мкл 1е1-РЕ! (Ро1ур1и§) в качестве трансфекционного реактива на лунку в формате 9б-луночного планшета. После инкубации в течение ночи при 37°С, 5%> СО2, удаляли трансфекционную среду. Добавляли 81 мкл ИМЕМ+1,5% инактивированной теплом эмбриональной телячьей сыворотки. Добавляли 9 мкл соединения в 10х концентрации в течение 60 мин и затем 10 мкл О8М человека (Рерго1есй) в конечной концентрации 33 нг/мл.
Соединение тестировали дважды, начиная с 20 мкМ, после чего следовало 1/3 серийное разведение, всего 8 доз (20 мкМ - 6,6 мкМ - 2,2 мкМ - 740 нМ - 250 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) в конечной концентрации 0,2% ИМ8О.
После инкубации в течение ночи при 37°С, 5% СО2 клетки лизировали посредством добавления 100 мкл лизирующего буфера/лунка (РВ8, 0,9 мМ СаС12, 0,5 мМ МдС12, 10% трегалоза, 0,05% Тегдйо1 №9. 0,3% В8А).
40 мкл клеточного лизата использовали для считывания β-галактозидазной активности посредством добавления 180 мкл раствора β-Ο;·ι1 (30 мкл ΟΝΓΟ 4 мг/мл + 150 мкл буфера β-галактозидазы (0,06 М №2НРО4, 0,04 М NаΗ2РΟ4, 1 мМ МдС12) в течение 20 мин. Реакцию останавливали посредством добавления 50 мкл №-ьСО3, 1 М. Поглощение считывали на 405 нм.
Люциферазную активность измеряли с применением 40 мкл клеточного лизата плюс 40 мкл 81еайу1йе®, как описано производителем (Регкт Е1тег), нВ Епуюоп (Регкт Е1тег).
Исключение О8М использовали в качестве положительного контроля (100% ингибирование). В качестве отрицательного контроля 0,5% использовали ИМ8О (0% ингибирование). Положительные и отрицательные контроли использовали для того, чтобы вычислять значения ζ' и ''процент ингибирования'' (РЕИ).
Процентная доля ингибирования = ((флуоресценция, определяема в присутствии наполнителя флуоресценция, определяемая для образца в присутствии тестируемого соединения), деленная на (флуоресценция, определяемая в присутствии наполнителя - флуоресценция, определяемая для образца без триггера)) х400.
Строили графики значений РШ для соединений, которые тестировали на дозозависимый эффект, и получали значения ЕС50.
Активность соединения формулы I в отношении 1АК-8ТАТ определяли в соответствии с анализом, описанным выше, таким образом, получая значение Κ.'50 для не активного, >6670, >6670, 8943 (среднее >7427 нМ).
3.2. Анализ передачи сигнала О8МДЬ-1в
Показано, что О8М и !И-1 β синергически осуществляют повышающую регуляцию ММР13 в клеточной линии хондросаркомы человека 8^1353. Клетки высевают в 96-луночные планшеты по 15000 клеток/лунка в объеме 120 мкл ИМЕМ Диуйгодеи), содержащем 10% (об./об.) РВ8 и 1% пенициллина/стрептомицина (ШУйгодеи), инкубируемые при 37°С 5% СО2. Клетки предварительно инкубируют с 15 мкл соединения в среде М199 с 2% ИМ8О 1 ч перед запуском с применением 15 мкл О8М и ΓΡ-1β, чтобы достигать 25 нг/мл О8М и 1 нг/мл !И-1 β, и измеряют уровни ММР13 в кондиционированной среде через 48 ч после запуска. Активность ММР13 измеряют с применением анализа активность захвата антител. С этой целью 384-луночные планшеты (ΝϋΝΟ, 460518, Мах18огЬ черные) покрывают 35 мкл раствора антитела против ММР13 человека 1,5 мкг/мл (Κ&Ό 8у81ет8, МАВ511) в течение 24 ч при 4°С. После промывания клеток 2 раза в РВ8+0,05%) Тгееп, оставшиеся сайты связывания блокируют с применением 100 мкл 5% обезжиренного сухого молока (8аи1а Οπζ, кс-2325, В1ойо) в РВ8 в течение 24 ч при 4°С. Затем лунки промывают два раза в РВ8 + 0,05% Тгееи и 35 мкл 1/10 разведения культурального супернатанта, содержащего ММР13 в 100-кратно разведенном блокирующем буфере, добавляют и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем лунки промывают два раза в РВ8 + 0,05% Тгееи, после чего следует активация ММР13 посредством добавления 35 мкл 1,5 мМ раствора ацетата 4аминофенилртути (АРМА) (81дта, А9563) и инкубация при 37°С в течение 1 ч. Лунки снова промывают в РВ8 + 0,05% Т\уееи и 35 мкл добавляют субстрата ММР13 (Вюто1, Р-126, флуорогенный субстрат ОтшММР). После инкубации в течение 24 ч при 37°С флуоресценцию превращенного субстрата измеряют в Регкт Е1тег \Уа11ас Еиу18юи 2102 Ми1й1аЬе1 Кеайег (длина волны возбуждения: 320 нм, длина волны испускания: 405 нм).
Процентная доля ингибирования = ((флуоресценция, определяемая в присутствии наполнителя флуоресценция, определяемая для образца в присутствии тестируемого соединения), деленная на (флуоресценцию, определяемую в присутствии наполнителя - флуоресценция, определяемая для образца без триггера)) х 100.
3.3. Анализ пролиферации РВЬ
Лимфоциты периферической крови человека (РВЬ) стимулируют с применением ГЙ-2 и измеряют пролиферацию с применением анализа встраивания ВгйИ. РВЬ сначала стимулируют в течение 72 ч с
- 24 029084
РНА, чтобы индуцировать рецептор 1Ь-2, затем их лишают питательных веществ в течение 24 ч для того, чтобы останавливать клеточную пролиферацию, за чем следует стимуляция 1Ь-2 в течение других 72 ч (включая мечение Вгби в течение 24 ч). Клетки предварительно инкубируют с тестируемыми соединениями 1 ч перед добавлением 1Ь-2. Клетки культивируют в РРМ1 1640, содержащей 10% (об./об.) РВ8.
3.4. Анализ цельной крови человека (НАВА)
3.4.1. Протокола 1
3.4.1.1. Протокол стимуляции 1Ь-6
Анализ проточной цитометрии осуществляли для того, чтобы устанавливать избирательность соединения к 1АК1 относительно 1АК2 ех νίνο с применением цельной крови человека. Следовательно, кровь берут у людей-добровольцев, которые давали информированное согласие. Затем кровь уравновешивают в течение 30 мин при 37°С при мягком покачивании, затем делят на аликвоты в пробирки ЕррепбогГ. Соединение добавляют в различных концентрациях и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при мягком покачивании и затем стимулируют в течение 20 мин при 37°С при мягком покачивании с применением интерлейкина 6 (1Ь-6) для стимуляции 1АК1-зависимого пути или ОМ-С8Р для стимуляции 1АК2-зависимого пути. Затем фосфо-8ТАТ1 и фосфо-8ТАТ5 оценивают с применением РАС8 анализа.
3.4.1.1.1. Анализ фосфо-8ТАТ1
3.4.1.1.1.1. Получение реактивов
5хбуфер Ьуке/Их (ΒΌ РНо8Р1о№, номер по каталогу 558049) разводили 5-кратно дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разведенный буфер Ьуке/Их выбрасывали.
10 мкг гЫЬ-6 (Κ&Ό 8у51ет5. номер по каталогу 206-1Ь) растворяли в 1 мл РВ8 0,1% В8А, чтобы получать основной раствор 10 мкг/мл. Основной раствор разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.
3-кратное последовательное разведение соединения получали в ΌΜ8Ο (10 мМ основной раствор). Обработанные контролем образцы получали ΌΜ8Ο вместо соединения. Все образцы инкубировали с конечной концентрацией ΌΜ8Ο 1%.
3.4.1.1.1.2. Инкубация крови с соединением и стимуляция 1Ь-6
Кровь человека собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь делили на аликвоты 148,5 мкл. Затем 1,5 мкл разведения тестируемого соединения добавляют в каждую аликвоту крови и образцы крови инкубируют в течение 30 мин при 37°С при мягком покачивании. Полтора микролитра 10-кратно разведенного основного раствора 1Ь-6 добавляют в образцы крови (конечная концентрация 10 нг/мл) и образцы инкубируют при 37°С в течение 20 мин при мягком покачивании.
3.4.1.1.1.3. получение белых клеток крови
В конце периода стимуляции 3 мл 1х предварительно нагретого буфера Ьуке/Их незамедлительно добавляют в образцы крови, быстро перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 мин при 37°С на водяной бане для того, чтобы лизировать красные клетки крови и фиксировать лейкоциты.
Пробирки центрифугируют в течение 5 мин на 400хд при 4°С. Клеточный осадок промывают в 3 мл холодного 1хРВ8, и после центрифугирования клеточный осадок ресуспендируют в 100 мкл ледяного 1хРВ8 и добавляют 900 мкл ледяного 100% метанола. Затем клетки инкубируют при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.
Перемеабилизированные клетки после этого промывают в 1хРВ8, содержащем 3% В8А и наконец ресуспендируют в 80 мкл 1хРВХ, содержащего 3% В8А.
3.4.1.1.1.4. Мечение клеток антителами против фосфо-8ТАТ1 и против СЭ4
20 мкл антитела мыши РЕ против 8ТАТ1 (ρΥ701) или изотипического контрольного антитела мыши РЕ 1§О2ак (ΒΌ Вюкаеисек, номер по каталогу 612564 и 559319 соответственно) и Р1ТСконъюгированного антитела против СИ4 или контрольного Р1ТС-конъюгированного изотипического антитела добавляли и смешивали, затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте.
Затем клетки промывали один раз в 1хРВ8 и анализировали на проточном цитометре РАС8Саи1о II (ΒΌ Вю8С1еисе8).
3.4.1.1.1.5. Анализ флуоресценции на РАС8СапЮ II
Подсчитывали всего 50000 событий и положительные по фосфо-8ТАТ1 клетки измеряют после определения дискриминационного окна на СЭ4+ клетках, в лимфоцитарном дискриминационном окне. Данные анализируют с применением программного обеспечения ΡΛί'.'8Όίγ;·ι и вычисляют процентную долю ингибирования стимуляции ГЕ-6 по процентной доле положительных клеток по фосфо-8ТАТ1 на СЭ4+ клетках.
3.4.1.1.2. Анализ фосфо-8ТАТ5
3.4.1.1.2.1. Получение реактивов
5х буфер Ьуке/Их (ΒΌ РНокИоте, номер по каталогу 558049) разводили 5-кратно дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разведенный буфер Ьуке/Их выбрасывали.
10 мкг гНОМ-С8Р (АЪСук 8.А., номер по каталогу Р300-03) растворяли в 100 мкл РВ8 0,1% В8А, чтобы получать основной раствор 100 мкг/мл. Основной раствор хранили в аликвотах при -80°С.
Получали 3-кратное серийное разведение соединения в ΌΜ8Ο (10 мМ основной раствор). Обрабо- 25 029084
танные контролем образцы получали ЭМ8О без тестируемого соединения. Все образцы инкубировали с конечной концентрацией ΌΜ8Θ 1%.
3.4.1.1.2.2. Инкубация крови с соединением и стимуляция с применением СМ-С8Р
Кровь человека собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь делили на аликвоты 148,5 мкл. Затем 1,5 мкл разведения соединения добавляли в каждую аликвоту и образцы крови инкубировали в течение 30 мин при 37°С при мягком покачивании. 5000-кратное разведение основного раствора СМС8Р (1,5 мкл) добавляли в образцы крови (конечная концентрация 20 пг/мл) и образцы инкубировали при 37°С в течение 20 мин при мягком покачивании.
3.4.1.1.2.3. Получение белых клеток крови
В конце периода стимуляции 3 мл 1х предварительно нагретого буфера Ьуке/Их незамедлительно добавляли в образцы крови, быстро перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 15 мин при 37°С на водяной бане для того, чтобы лизировать красные клетки крови и фиксировать лейкоциты.
Пробирки центрифугировали в течение 5 мин на 400хд при 4°С. Клеточный осадок промывали в 3 мл холодного 1хРВ8 и после центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл ледяного 1хРВ8 и добавляли 900 мкл ледяного 100% метанола. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.
3.4.1.1.2.4. Мечение клеток антителами против фосфо-8ТАТ5 и против СЭ33
Добавляли 20 мкл антитела мыши РЕ против 8ТАТ5 (ρΥ694) или изотипического контрольного антитела мыши РЕ ^С1к (ΒΌ Вю8С1еисе8, номер по каталогу 612567 и 554680 соответственно) и антитела мыши АРС против СЭ33 (ΒΌ Вюкаеисек #345800) или контрольного изотипического антитела мыши АРС ТдС1 (ВО Вюкиеисек #345818), перемешивали, затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С, в темноте.
Затем клетки промывали один раз в 1хРВ8 и анализировали на проточном цитометре РАС8Саи!о II (ВО Вю8С1еисе8).
3.4.1.1.2.5. Анализ флуоресценции на РАС8СапЮ II
Подсчитывали всего 50000 событий и положительные по фосфо-8ТАТ5 клетки измеряли после определения дискриминационного окна на СЭ33+ клетках. Данные анализировали с применением программного обеспечения РАС80А'а и вычисляли соответствие процентной доле ингибирования СМ-С8Р стимуляции по процентной доле положительных по фосфо-8ТАТ5 клеток на СЭ33+ клетках.
3.4.2. Протокол 2
3.4.2.1. Протокол стимуляции
Анализ проточной цитометрии осуществляли для того, чтобы устанавливать избирательность соединения к 1АК1 относительно 1АК2 ех νίνο с применением цельной крови человека. Следовательно, кровь берут у людей-добровольцев, которые давали информированное согласие. Затем кровь уравновешивают в течение 30 мин при 37°С при мягком покачивании, затем делят на аликвоты в пробирки ЕррепйогГ. Соединение добавляют в различных концентрациях и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при мягком покачивании и впоследствии стимулируют в течение 20 мин при 37°С при мягком покачивании интерлейкином 6 (РИ-6) для стимуляции 1АК1-зависимого пути, интерфероном-α (ΓΡΝα) для стимуляции пути ^АК1/ТΥК2, интерлейкином 2 (Ш-2) для стимуляции пути 1АК1/1АК3 или СМ-С8Р для стимуляции 1АК2-зависимого пути. Затем оценивают уровни фосфо-8ТАТ1 (для Ш-6-и ΣΡΝα-стимулированных клеток) и фосфо-8ТАТ5 (для Ш-2- и СМ-С8Р-стимулированных клеток) с применением РАС8 анализа.
3.4.2.2. Анализ фосфо-8ТАТ
3.4.2.2.1. Получение реактивов
5х буфер Ьу8е/Р1х (ВО Р1ю5Р1о\у. номер по каталогу 55804 9) разводили 5-кратно дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разведенный буфер Ьу8е/Р1х выбрасывали.
10 мкг тЫЬ-6 (Κ&Ό 8у81ет8, номер по каталогу 206-7) растворяли в 1 мл РВ8+0,1% В8А, чтобы получать основной раствор 10 мкг/мл. Основной раствор разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.
10 мкг тЫЬ-2 (Κ&Ό 8у51ет5, номер по каталогу 202-7) растворяли в 1 мл РВ8+0,1% В8А, чтобы получать основной раствор 10 мкг/мл. Основной раствор разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.
5 мкг г1СМ-С8Р (АЪСук 8.А., номер по каталогу Р300-03) растворяли в 12,5 мл Рв8+0,1% В8А, чтобы получать основной раствор 400 нг/мл. Основной раствор хранили аликвотами при -80°С.
Получали 3-кратное серийное разведение соединения в ЭМ8О (10 мМ основной раствор). Обработанные контролем образцы получали ЭМ8О вместо соединения. Все образцы инкубировали с ЭМ8О в конечной концентрации 1%.
3.4.2.2.2. Инкубация крови с соединением и стимуляция триггерами
Кровь человека собирали в гепаринизированные пробирки. Кровь делили на аликвоты 148,5 мкл. Затем 1,5 мкл разведения тестируемого соединения добавляли в каждую аликвоту крови и образцы крови инкубировали в течение 30 мин при 37°С при мягком покачивании. Полтора микролитра 10-кратно разведенного основного раствора Ш-6, 1,5 мкл основного раствора иШ^ (РВЬ ВютеФса1, номер по каталогу 11200-1), 1,5 мкл 25-кратно разведенного основного раствора Ш-2 или 1,5 мкл 200-кратного разве- 26 029084
дения основного раствора ОМ-С8Р добавляли в образцы крови и образцы инкубировали при 37°С в течение 20 мин при мягком покачивании.
3.4.2.2.3. Получение белых клеток крови
В конце периода стимуляции 3 мл 1х предварительно нагретого буфера Ьуке/Ρίχ незамедлительно добавляли в образцы крови, быстро перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 15 мин при 37°С на водяной бане для того, чтобы лизировать красные клетки крови и фиксировать лейкоциты.
Пробирки центрифугировали в течение 5 мин на 400хд при 4°С. Клеточный осадок промывали в 3 мл холодного 1хРВ§ и после центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл ледяного 1хРВ§ и добавляли 900 мкл ледяного 100% метанола. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.
Перемеабилизированные клетки после этого промывали в 1хРВ§, содержащем 3% В§А, и, наконец, ресуспендировали в 80 мкл 1хРВХ, содержащего 3% В§А.
3.4.2.2.4. Мечение клеток
20 мкл антитела мыши РЕ против §ТАТ1 (ρΥ701) или изотипического контрольного антитела мыши РЕ ЦСЗак (ВО Вюкшепсек, номер по каталогу 612564 и 559319 соответственно) и АРСконъюгированного антитела против СЭ4 или контрольного АРС-конъюгированного изотипического антитела (ВО В1О8С1еисе8, номер по каталогу 555349 и 555751 соответственно) добавляли в стимулированные с применением ГЬ-6-и ΓΡΝα пробирки и смешивали, затем инкубировали в течение 20 мин при 4°С, в темноте.
20 мкл антитела мыши РЕ против §ТАТ5 (ρΥ694) или изотипического контрольного антитела мыши РЕ ЦСНх (ВО Вюкшепсек, номер по каталогу 612567 и 554680 соответственно) и АРС-конъюгированного антитела против СЭ4 или контрольного АРС-конъюгированного изотипического антитела (ВО Вюкшепсек, номер по каталогу 555349 и 555751 соответственно) добавляли в стимулированные с применением ГЬ-2 пробирки, смешивали, затем инкубировали в течение 20 мин при 4°С, в темноте.
20 мкл антитела мыши РЕ против §ТАТ5 (ρΥ694) или изотипического контрольного антитела мыши РЕ ЦСНх (ВО Вюкшепсек, номер по каталогу 612567 и 554680 соответственно) и антитела мыши АРС против СЭ33 (ВО Вюкшепсек #345800) или контрольного изотипического антитела мыши АРС !дО1 (ВО Вюкшепсек номер по каталогу 345818) добавляли в стимулированные с применением ОМ-С8Р пробирки, смешивали, затем инкубировали в течение 20 мин при 4°С, в темноте.
Затем клетки промывали один раз в 1х РВ§ и анализировали на проточном цитометре РАС§Сап1о II (ВО Вюкшепсек).
3.4.2.2.5. Анализ флуоресценции на РА С§Сап1о II
Считали всего 50000 событий и положительные по фосфо-§ТАТ1 клетки измеряли после определения дискриминационного окна на СЭ4+ клетках, в лимфоцитарном дискриминационном окне для ГЬ-6- и ΓΡΝα-стимулированных клеток. Положительные по фосфо-§ТАТ5 клетки измеряли после определения дискриминационного окна на СЭ4+ клетках, в лимфоцитарном дискриминационном окне для !Б-2стимулированных клеток. Положительные по фосфо-§ТАТ5 клетки измеряли после определения дискриминационного окна на СЭ33+ клетках. Данные анализировали с применением программного обеспечения РАС§ОАа и вычисляли процентную долю ингибирования стимуляции с применением [Ц-6 или ΣΡΝα по процентной доле положительных клеток по фосфо-§ТАТ1 на СЭ4+ клетках. Для стимулированных с применением !Б-2 клеток данные анализировали с применением программного обеспечения РАС§ОАа и вычисляли процентную долю ингибирования стимуляции с применением [Ц-2 по процентной доле положительных клеток по фосфо-§ТАТ1 на СЭ4+ клетках. Для стимулированных с применением ОМ-ѧРклеток процентную долю ингибирования стимуляции с применением ОМ-ѧРвычисляли по процентной доле положительных клеток по фосфо-§ТАТ5 на СЭ33+ клетках.
3.4.3. Результаты
Когда придерживались этих протоколов, соединение по изобретению формулы I показывало среднее Юс 11,9 мкМ на РЬ-б-индуцированном фосфорилировании §ТАТ1, на 6 различных донорах. На Ш^-индуцированном фосфорилировании §ТАТ1 среднее Ю, оценивали равным 15,4 мкМ на 6 различных донорах. На [Ш-индуцированном фосфорилировании §ТАТ5 среднее Κ.'50 оценивали равным 19,6 мкМ у 5 различных доноров. На ОМ-С§Р-индуцированном фосфорилировании §ТАТ5 среднее Ю, оценивали равным выше 100 мкМ у 7 различных доноров.
Пример 4. Модели ш νίνο
4.1. Модель КИА 1
4.1.1. Материалы
Полный адъювант Фрейнда (СРА) и неполный адъювант Фрейнда (ЕРА) приобретали в ЭДсо. Бычий коллаген II типа (СП), липополисахарид (ЬР§), и ЕпЬге1® получали из СБопДгех (^Хе Д'АЬеаи, Ргапсе); §щта (Р4252, Б'Ые Д'АЬеаи, Ргапсе), ХУНуеП (25 мг инъекционный шприц, Ргапсе), ХУНуеО (25 мг инъекционный шприц, Ргапсе) Асгок Огдашск (Ра1о А11о, СА) соответственно. Все другие применяемые реактивы имели химическую степень чисты, а все растворители были аналитической марки.
- 27 029084
4.1.2. Животные
Крыс Эагк АдоиН (самцы, в возрасте 7-8 недель) получали из Наг1ап ЬаЪога!оНе8 (Ме1йег§1о, ЫеШег1апй§). Крыс содержали в 12 ч цикле свет/темнота (0700-1900). Температуру поддерживали равной 22°С, а корм и воду предоставляли ай НЪйпт.
4.1.3. Коллаген-индуцированный артрит (КИА)
За одни сутки до эксперимента раствор СП (2 мг/мл) получали с применением 0,05 М уксусной кислоты и хранили при 4°С. Непосредственно перед иммунизацией равные объемы адъюванта (ГРА) и СП смешивали с помощью гомогенизатора в предварительно охлажденной стеклянной бутылке на ледяной водной бане. Если эмульсия не образуется, может требоваться дополнительный адъювант и длительная гомогенизация. 0,2 мл эмульсии инъецировали внутрикожно в основание хвоста каждой крысы в сутки 1, вторую бустерную внутрикожную инъекцию (раствор СП по 2 мг/мл в СРА 0,1 мл физиологический раствор) осуществляли в сутки 9. Этот способ иммунизации модифицировали из опубликованных способов (81т8 е! а1, 2004; йои е! а1., 2005).
4.1.4. План исследования
Терапевтические эффекты соединений тестировали в модели КИА на крысах. Крыс случайным образом делили на равные группы, и каждая группа содержала 10 крыс. Всех крыс иммунизировали в сутки 1 и повторно иммунизировали в сутки 9. Терапевтическое дозирование длится с суток 16 до суток 30. Группу отрицательного контроля лечили наполнителем (МС 0,5%) и группу положительного контроля с применением ЕпЪге1® (10 мг/кг, 3х в неделю, подкожно). Соединение, представляющее интерес, типично тестировали в 3 дозах, например, 6, 10, 60 мг/кг, ОЭ, перорально.
4.1.5. Клиническая оценка артрита
Артрит оценивали в соответствии со способом КкасЫщап 2006, Ьш е! а1 2007 и МкЫйа е! а1. 2004). Отек каждой из четырех лап ранжировали с применением оценки артрита следующим образом: 0 - нет симптомов; 1 - слабое, но определяемое покраснение и отек сустава одного типа, такого как лодыжка или запястье, или выраженное покраснение и отек, ограниченное отдельными пальцами, независимо от числа пораженных пальцев; 2 - умеренное покраснение и отек суставов двух или более типов; 3 - тяжелое покраснение и отек всей лапы, включая пальцы; 4 - максимально воспаленная конечность с вовлечением множества суставов (максимальная кумулятивная клиническая оценка артрита 16 на животное) (№§Ыйа е! а1., 2004).
Чтобы сделать возможным мета-анализ множества исследований, значения клинической оценки нормализовали следующим образом:
АИС клинической оценки (АИС оценка): площадь под кривой (АИС) от суток 1 до суток 14 вычисляли для каждой отдельной крысы. АИС каждого животного делили на среднюю АИС, полученную для наполнителя в исследовании, из которого получали данные об этом животном, и умножали на 100 (т.е. АИС выражали в виде процентной доли средней АИС наполнителя на исследование).
Увеличение клинической оценки от суток 1 до суток 14 (оценка конечной точки): разность клинической оценки для каждого животного делили на среднюю разность клинической оценки, получаемой для наполнителя в исследовании, из которого получали данные об этом животном, и умножали на 100 (т.е. разность выражали в виде процентной доли средней разности клинической оценки для наполнителя на исследование).
4.1.6. Изменение массы тела (%) после начала артрита
Клинически потерю массы тела связывали с артритом (§Ье1!оп е! а1., 2005; АгдПек е! а1., 1998; Кай, 2004; ХУаРтПк е! а1., 2004). Таким образом, изменения массы тела после начала артрита можно использовать в качестве неспецифической конечной точки для того, чтобы оценивать эффект терапевтического средства в модели на крысах. Изменение массы тела (%) после начала артрита вычисляли следующим образом:
Мыши: (масса тела^ля 6) - масса тела (неделя 5))/масса тела^ля 5) х 100.
Крысы: (масса тела^ля 4) - масса тела^ля 3))/масса тела^ля 3) х 100.
4.1. 7. Радиология
Получали рентгенограммы задних лап каждого отдельного животного. Каждой рентгенограмме вслепую случайным образом присваивали идентификационный номер, и ранжировали тяжесть эрозии кости с помощью двух независимых оценщиков с применением радиологической системы оценки Ларсена следующим образом: 0 - нормальная с неповрежденными костными контурами и нормальной суставной щелью; 1 - легкое отклонение от нормы с любой одной или двумя внешними костями плюсны, демонстрирующими легкую эрозию кости; 2 - определенное раннее отклонение от нормы с любыми от трех до пяти внешних костей плюсны, демонстрирующими эрозию кости; 3 - среднее деструктивное отклонение от нормы со всеми внешними костями плюсны, а также любой одной или двумя внутренними костями плюсны, демонстрирующими определенную эрозию кости; 4 - тяжелое деструктивное отклонение от нормы всех костей плюсны, демонстрирующее определенную эрозию кости, и по меньшей мере один из внутренних суставов плюсны полностью эродирован, оставляя некоторые костные суставные контуры частично сохраненными; 5 - калечащее отклонение от нормы без границ кости. Эта система
- 28 029084
оценки представляет собой модификацию 8а1ует1ш е! а1., 2001; Визй е! а1., 2002; 81тз е! а1., 2004; 1ои е! а1, 2005.
4.1.8. Гистология
После радиологического анализа задние лапы мышей фиксировали в 10% забуференном фосфатом формалине (рН 7,4), декальцифицировали с применением быстрого костного тдекальцификанта для точной гистологии (ЬаЪогаЩпез ЕигоЪю) и заливали в парафин. Чтобы обеспечить всестороннюю оценку суставов с артритом, выполняли по меньшей мере четыре последовательных среза (5 мкм толщиной) и каждая серия срезов имела интервал 100 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). Гистологическое исследование на синовиальное воспаление и повреждение кости и хряща осуществляли с применением двойного слепого протокола. В каждой лапе оценивали четыре параметра с применением шкалы с четырьмя делениями.
Параметры представляют собой клеточную инфильтрацию, тяжесть паннуса, эрозию хряща и эрозию кости. Оценку осуществляли соответственно следующим образом: 1 - нормально, 2 - легко, 3 - умеренно, 4 - выраженно. Четыре оценки суммировали вместе и представляли в качестве дополнительной оценки, а именно ''полной оценки РА''.
4.1.9. Микрокомпьютерный томографический (рСТ) анализ пяточной кости:
Разрушение кости, наблюдаемое при РА, возникает в частности на кортикальной кости и может быть выявлено посредством рСТ анализа (81тз ΝΑ е! а1., АЧйгШз Рйеит. 50 (2004) 2338-2346: Таг§е!т§ оз!еос1аз!8 χνίΐΐι 7о1ейготс асЫ ргеуеиЕ Ъоие йез!гисйои ΐη со11а§еи-1ийисей аг!йгШз; Оз!е Е е! а1., ЕСТС Мои!геа1 2007: Α Ыдй !йгои§йри! те!йой оЕ теазигтд Ъоие агсййес!ига1 Й1з!игЪаисе т а тигте СЛА тойе1 Ъу т1сго-СТ тогрйоте!гу). После сканирования и реконструкции трехмерного объема пяточной кости, разрушение кости измеряли как число дискретных объектов, присутствующих на слайде, которые выделяли 1и зШсо перпендикулярно к продольной оси кости. Чем сильнее была разрушена кость, тем больше дискретных объектов измеряли. Анализировали 1000 срезов, равномерно распределенных вдоль пяточной кости (с пропуском приблизительно 10,8 мкм).
4.1.10. ФК устойчивого состояния
На сутки 7 или 11 брали образцы крови в ретроорбитальном синусе с применением гепарина лития в качестве антикоагулянта в следующие моменты времени: перед дозой, 1, 3 и 6 ч. Образцы цельной крови центрифугировали и получаемые образцы плазмы хранили при -20°С, ожидая анализа. Концентрации каждого тестируемого соединения в плазме определяли способом ЕС-М8/М8, в котором массспектрометр работал в режиме положительного электрораспыления. Фармакокинетические параметры вычисляли с применением Атиоийи® (Рйагз1§й!®, Иийей 8!а!ез) и полагали, что уровни в плазме перед дозой были равны 24 ч уровням в плазме.
4.1.11. Результаты
Соединение формулы I показывало статистически значимые улучшения в нормализованных значениях клинических оценок (вычисленных как АИС или как разность между сутками 1 и сутками 14) в дозе 60 мг/кг, как показано на фиг. 1 и в табл. I.
Таблица I. Клиническая оценка КИА у крыс после лечения соединениями, описанными в настоящем документе
Сутки | 18 | 19 | 20 | 21 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 |
Наполнитель | 2,9 | 3,8 | б, 0 | б, 0 | 6,4 | б, 3 | б, 3 | 6,3 | 6,4 |
формула II (б мг/кг) | 3,0 | 3, б | 4,2 | 5,1 | 5,2 | 5,1 | 4,9 | 5,2 | 5,4 |
формула I (60 мг/кг) | 2,9 | 4,4 | 5, 0 | 3,9 | 4,5 | 4,3 | 3,8 | 3,7 | 3,3 |
формула II (б мг/кг)+формула I (60 мг/кг) | 3,0 | 3, б | 4,4 | 4,5 | 4,5 | 4,1 | 3,9 | 4,3 | 3, б |
4.2. модель КИА 2
4.2.1. Животные
Самок крыс Ее^18 (и=76), которые весили 165-194 г (в среднем приблизительно 178 г) в сутки артрита 0 получали из Сйаг1ез Ктуег ЕаЪога!опез, Шс., АПтт§!ои, МА, (геЕ# 393739). Животных идентифицировали посредством отчетливого номера в основании хвоста, изображающего группу и номер животного.
По прибытии животных помещали по 4/клетка в небольшие поликарбонатные клетки и проводили акклиматизацию в течение 8 суток перед иммунизацией коллагеном II типа. Параллельно не давали никаких лекарственных средств.
Во время акклиматизации и периодов исследования, животных помещали в лабораторную среду с температурами в диапазоне 19-25°Р и относительной влажностью 30-70%.
- 29 029084
Автоматические таймеры обеспечивали 12 ч света и 12 ч темноты. Животным давали доступ к корму и воде.
4.2.2. Коллаген-индуцированный артрит (КИА)
4.2.2.1. Получение
Акклиматизированных самок крыс 1%'\νίδ анестезировали изофлураном и вводили подкожно/внутрикожно (ЗС/ГО) инъекции 300 мкл неполного адъюванта Фрейнда (Όΐίεο, ΌβΐΓοίΐ, МЦ, содержащего 2 мг/мл бычьего коллагена II типа (Е1а§1т Рго4ис1§, О^епзуШе, Μΐδδουπ) в основание хвоста и 2 места на спине в сутки -9 и в сутки -3.
Коллаген получали, делая раствор 4 мг/мл в 0,01 Н уксусной кислоте. Равные объемы коллагена и неполного адъюванта Фрейнда эмульсифицировали, перемешивая вручную до тех пор, пока шарик этого материала не сохранял свою форму, когда его помещали в воду. Каждое животное в каждом случае получало 300 мкл смеси, разделенные на 3 подкожных места на спине.
4.2.2.2. Исследование
В сутки исследования 1 происходило начало артрита и животных рандомизировали по группам лечения. После рандомизации все клетки помечали номером протокола, номером группы и номерами животных. Рандомизацию в каждую группу выполняли после явного формирования отека голеностопного сустава и присутствия достоверных свидетельств билатерального заболевания.
Животных с развившимся артритом на коллаген II типа лечили каждые сутки ^Ό) посредством перорального (РО) пути в течение 13 суток с применением наполнителя (метилцеллюлоза 0,5% (мас./об.)) или активного соединения(й), полученного в метилцеллюлозе, 0,5% (мас./об.). Пероральное дозирование начинали в сутки артрита 1 и продолжали каждые сутки (()□ с интервалами 24 ч) до суток 13. Животных забивали в сутки артрита 14.
4.2.2.3. Клиническая оценка артрита
Тяжесть артрита оценивали посредством измерения диаметра обеих лодыжек животных. Измерение лодыжек штангенциркулем выполняли каждые сутки, начиная с суток 0, с применением микрометра Όΐ§ΐΐΓΐχ II (Ео\х1ег & Ν3Κ). Базовые измерения выполняли с применением одной лодыжки со значениями, округленными до одной тысячной дюйма. Измерения подтверждали как клинически нормальные (0,2б00,2б4 дюйма) посредством сравнения с историческими значениями для крыс на основе диапазона массы тела. Базовые измерения затем применяли к обеим лодыжкам, и эти значения сохранялись у животного при условии, что лодыжка была клинически нормальной при хорошем определении всех костей лодыжки и без признаков воспаления. Животных забивали в сутки 14.
4.2.2.4. Соединения, доза и результаты
Соединения тестировали индивидуально и в комбинации при различных дозах, которые перечислены ниже в табл. II.
Таблица II. Соединения и дозы, которые тестировали во второй модели КИА
Соединения | Доза | Группа |
Контроль РО, φϋ | - | А |
Наполнитель (МС, 0,5%, масс./об.) | 5 мл/кг | В |
Формула II | 1 мг/кг | С |
3 мг/кг | ϋ | |
10 мг/кг (*) | Е | |
30 мг/кг (*) | Е | |
формула I | 25 мг/кг (*) | 6 |
50 мг/кг (*) | Н | |
формула ΙΙ+формула I | 3 мг/кг (формула II) +25 мг/кг (формула I), (*) | I |
(*=р<0,05 дисперсионный анализ для контроля с наполнителем)
4.2.2.5. Заключение
Измерения диаметра лодыжки указывает на то, что введение комбинации соединения формулы I (25 мг/кг) и формулой II (3 мг/кг) обеспечивает более сильный эффект, чем эффект, достигаемый при применении только соединения формулы I (25 мг/кг) или только соединения формулы II (3 мг/кг), как показано ниже на фиг. 2 и в табл. III.
- 30 029084
Таблица III. Эволюция диаметра лодыжки (дюймы) в модели КИА на крысах после лечения соединениями, описанными в настоящем документе
5.1. Исследование метаболизма ΐη νΐίΓΟ
Исследование, в котором сравнивают метаболизм [14С]-соединения формулы II в гепатоцитах мыши, крысы, собаки и человека, ясно демонстрирует, что соединение по изобретению формулы II стабильно во всех видах, и подтверждает, что степень метаболизма низка во всех видах, причем, по меньшей мере 80% соединения формулы II после 24 ч, как показано на фиг. 3.
В табл. IV представлен радиометрический метаболический профиль соединения формулы II, в гепатоцитах человека и видов животных, которые показывали один основной метаболит (соединение по изобретению формулы I, 11%) и два минорных метаболита (не охарактеризованы, <1,0%, видны на хроматограммах).
Таблица IV. Метаболический профиль соединения формулы II ΐη νΐίΓΟ
Структура | X N < ΝΗ | ΧΙ<ΝΗ2 | Метаболит 2 | Метаболит 3 |
Υ | ) О | |||
0 | ||||
Мышь | 85% | 14% | <1,0% | <1,0% |
Крыса | 86% | 12% | <1,0% | <1,0% |
Собака | 93% | 5, 7% | <1,0% | 1,0% |
Человек | 88% | 11,2% | <1,0% | <1,0% |
5.2. Исследования ΐη νΐνο
5.2.1. Фармакокинетика однократных доз у животных
Фармакокинетические исследования осуществляли у различных видов животных, которым дозировали соединение по изобретению формулы II, чтобы определять экспозицию соединения формулы I, а также его видимый конечный период полувыведения (Т1/2), когда возможно.
5.2.1.1. Протокол
5.2.1.1.1. Животные
Крыс 8ргадие-Эа^1еу (самцы, 200-250 г), мышей СЭ1 (самцы, 25-30 г), собак бигль (самцы, 9-10 кг), геттингенских карликовых свиней (самцы, 10-15 кг) и новозеландских белых кроликов (самцы, 3-5 кг) акклиматизировали в течение по меньшей мере 7 суток перед лечением и содержали в 12 ч цикле свет/темнота (07 ч 00-19 ч 00).
Температуру поддерживали приблизительно равной 22°С, а корм и воду предоставляли аб НЪйиш.
- 31 029084
5.2.1.1.2. Фармакокинетическое исследование
Соединение по изобретению формулы I формулировали в 0,5% метилцеллюлозе и дозировали перорально 3 или б животным в виде одного чреспищеводного искусственного кормления в дозе в диапазоне от 15 до 180 мг/кг с объемом дозирования 5 или 10 мл/кг.
Соединение по изобретению формулы II формулировали в 0,5% метилцеллюлозе и дозировали перорально 3 животным (или 3 мышам/момент времени) в виде одного чреспищеводного искусственного кормления в дозе в диапазоне от 15 до 45 мг/кг с объемом дозирования 5 или 10 мл/кг.
Образцы крови брали в течение 24 ч периода через яремную вену (собаки, карликовые свиньи), кровеносный сосуд уха (кролики), сердечный прокол (мыши) или ретроорбитальный синус (крысы) с применением гепарина лития в качестве антикоагулянта.
Образцы цельной крови центрифугировали и получаемые образцы плазмы хранили при -20°С, ожидая анализа.
5.2.1.1.3. Количественное определение уровней соединений в плазме
Концентрации в плазме для соединения формулы I и соединения формулы II определяли способом БС-М8/М8 с пределом количественного определения <10,0 нг/мл как для формулы I, так и для формулы II для всех видов.
5.2.1.1.4. Определение фармакокинетических параметров Фармакокинетические параметры вычисляли с применением пакета для статистического анализа (АчАопкт (РНаг81§Н1, 8иппууа1е, СаНГогша: СА 9408б, и8А).
5.2.1.2. Результаты
5.2.1.2.1. Результат при введении только соединения формулы I
Используя протокол, описанный выше, АиС и видимый конечный период полувыведения определяли, как показано ниже в табл. У.
Таблица У. Экспозиция и видимый конечный период полувыведения у различных видов при введении соединения по изобретению формулы I
Вид | Доза (мг/кг) | лис (мкг х ч/мл) | Видимый конечный период полувыведения (ч) |
Крыса | 20 | 19,7 (самцы) 25,2 (самки) | 7 |
60 | 102 (самцы) 123 (самки) | ||
180 | 376 (самцы) 541 (самки) | ||
Собака (самцы) | 10 | 49, 4 | 9 |
25 | 114 | ||
50 | 290 | ||
Кролик (самки) | 125 | 777 | Не определен |
250 | 1029 |
Результаты, представленные в табл. У, показывают, что соединение по изобретению формулы I, когда дозируют само по себе, всасывается легко, и таким образом подвергается экспозиции т У1уо.
5.2.1.2.2. Результат при введении только соединения формулы II
При введении соединения формулы II, видимый конечный период полувыведения соединения формулы I определяли у мышей (2,1 ч) и кролика (4,б ч).
5.2.2. Фармакокинетика однократных доз у человека
5.2.2.1. Протокол
Субъекты получали однократную дозу (10, 25, 50, 100 или 200 мг) соединения формулы II в виде капсул после высококалорийного завтрака с высоким содержанием жира (рекомендация РЭА: высокое содержание жира (приблизительно 50 процентов от общей энергетической ценности приема пищи) и высокая калорийность (приблизительно от 800 до 1000 калорий). Образцовым тестовым приемом пищи будут два яйца, зажаренные в хлебе, две полоски бекона, два ломтика тоста с маслом, четыре унции картофельных оладий и восемь унций цельного молока. Замены в этом тестовом приеме пищи можно выполнять до тех пор, пока прием пищи обеспечивает схожее количество калорий из белка, углеводов и жира и имеет сравнимый объем пищи и вязкость.
Последовательные образцы крови брали в течение 72 ч для того, чтобы определять концентрации в плазме для соединения формулы II и формулы I с применением одобренного способа жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии/масс-спектрометрии (БС-М8/М8) с пределом количественного определения 1,00 нг/мл. ФК параметры оценивали с применением пакета для статистического анализа (ΑίηШпПп (РНаг81§Н1, 8иппууа1е, СаНГогша: СА 9408б, и8А).
5.2.2.2. Результаты выведения из плазмы
Измеряли средние профили концентрации в плазме в зависимости от времени для соединения фор- 32 029084
мулы II и соединения формулы I.
Выведение соединения формулы II с течением времени показывало двухфазный профиль со средним видимым конечным периодом полувыведения приблизительно 5-8 ч.
В отличие от этого, выведение из плазмы соединения формулы I показывало однофазный профиль со средним видимым конечным периодом полувыведения в диапазоне от 21 до 27 ч.
5.2.2.3. Экспозиция соединения формулы II и формулы I
Для того чтобы показывать сравнительную экспозицию двух соединений, вычисляли АИС соединения формулы I и соединения формулы II. Значение АИС представляет полную экспозицию соединения у биологического вида после дозирования. Затем эти значения выражали в виде соотношения АИС соединения формулы РАИС соединения формулы II на фиг. 4. Из этого соотношения можно ясно видеть, что имела место значительная разность в экспозиции соединения формулы I после введения соединения формулы II у человека по сравнению с экспозицией, которую наблюдали у животных для терапевтически эквивалентных доз. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что эта разность связана с разностью в видимом конечном периоде полувыведения у различных биологических видов.
Таблица VI. Соотношение экспозиции (выраженной в виде АИС) для [формула ^[формула II], измеренное при введении соединения формулы II
Биологические виды | Формула I | Формула II | Соотношение Ι/ΙΙ |
Мышь (30 мг/кг) | 11,4 | 7,3 | 1,56 |
Крыса (45 мг/кг) | 13,3 | 33,3 | 0,40 |
Собака (15 мг/кг) | 10, 6 | 44,9 | 0,24 |
Карликовая свинья (30 мг/кг) | 16, 7 | 19,1 | 0, 88 |
Кролик (20 мг/кг) | 10 | 26 | 0,38 |
Человек (10 мг) | 2,89 | 0, 128 | 22,58 |
Человек (25 мг) | 7,22 | 0,331 | 21,81 |
Человек (50 мг) | 14, 6 | 0,735 | 19,86 |
Человек (100 мг) | 26, 9 | 1, 69 | 15, 92 |
Человек (200 мг) | 57, 6 | 4,5 | 12,8 |
5.2.3. Фармакокинетика повторных доз у человека
5.2.3.1. Протокол
Субъекты получали повторную дозу (25, 50 и 100 мг ВГО или 200, 300 и 450 мг (х)1)) соединения формулы II в виде капсул после стандартного завтрака в течение 10 суток.
Последовательные образцы крови брали в течение 12 ч (ВГО схема) или 24 ч ((.х)1) схема) в сутки 1 и 10 для того, чтобы определять концентрации в плазме для соединения формулы II и формулой I с применением одобренного способа жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии/масс-спектрометрии (ЬС-МЗ/МЗ) с пределом количественного определения 1,00 нг/мл для обеих формул. ФК параметры оценивали с применением пакета для статистического анализа (ΑίηΝΟηΡίη (РНагшдНЕ 3πηηγναΑ СаИ&гша: СА 94086, иЗА).
5.2.3.2. Результаты выведения из плазмы
Измеряли профили средней концентрации в плазме в зависимости от времени для соединения формулы II и соединения формулы I.
Выведение соединения формулы II с течением времени показывало двухфазный профиль со средним видимым конечным периодом полувыведения приблизительно 4-11 ч.
В отличие от этого, выведение из плазмы соединения формулы I показывало однофазный профиль со средним видимым конечным периодом полувыведения в диапазоне от 22 до 27 ч.
5.2.3.3. Экспозиция соединения формулы II и формулой I. Для того чтобы демонстрировать сравнительную экспозицию двух соединений, вычисляли АИС соединения формулы I и соединения формулы II. Значение АИС представляет экспозицию соединений в устойчивом состоянии после повторного дозирования. Соотношение АИС соединения формулы РАИС соединения формулы II представлено в табл. VII.
- 33 029084
Таблица VII. Экспозиция (выраженная в виде АИС в мкг х ч/мл) для формулы II и формулы I, измеренная при повторном введении соединения формулы II
Схема | ВЮ | <20 | ||||
Доза | 2 5 мг | 50 мг | 100 мг | 2 00 мг | 300 мг | 4 50 мг |
Формула II | 0,346 | 0,758 | 2,38 | 4,45 | 4,40 | 10,2 |
Формула I | 8,66 | 15,2 | 41,1 | 70, 0 | 66, 1 | 102 |
Соотношение Ι/ΙΙ | 24,4 | 20,5 | 18,3 | 16, 1 | 15, 0 | 10,1 |
5.2.4. Заключение
Соединение по изобретению формулы I демонстрирует очень схожий профиль у всех биологических видов ίη уйго. Однако, неожиданно, ίη νίνο этот профиль очень сильно различается между человеком и другими видами животных, где у человека видимый конечный период полувыведения составляет по меньшей мере в 3 раза выше. Этот более длительный видимый конечный период полувыведения ведет к накоплению у человека соединения формулы I, что дает возможность широкого диапазона частоты схемы дозирования, в частности схему дозирования с низкой частотой и, более конкретно, от одного раза в сутки до одно раза каждые две недели, наиболее конкретно, от одного раза в сутки до одного раза в неделю.
5.3. Ингибирование мишени
Соединение по изобретению формулы II дозировали каждые сутки здоровым добровольцам по 200 мг С)Г) и 100 мг ВГО.
Затем измеряли получаемые уровни формулы II и формулы I и строили график (фиг. 5) в виде кратности соответствующих им Ю50, как определяют посредством анализа цельной крови, описанного выше в примере 3.4.
Как формула II, так и формула I активны по отдельности в модели КИА на крысах. К удивлению, как показано на фиг. 4, введение соединения формулы II связано с 2 активными частицами, формула I и формула II. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что формула II обеспечивает быстрое ингибирование мишени, и после этого соединение по изобретению формулы I устойчиво формируется и накапливается, что, таким образом, ведет к уровню лекарственного средства выше уровня Ю0 в течение почти 24 ч, как показано в кумулятивной кратности Ю0 на фиг. 6. Это в особенности неожиданно, поскольку такой профиль не мог быть предсказан по модели на крысах, мышах и кроликах, где такого накопления не возникало.
Таблица VIII. Соотношение, вычисленное как [циркулирующая в крови доза соединений, выраженная в нг/мл]/[циркулирующая доза тех же соединений в количестве Ю50]
Формула II 100 мг ВЮ | Формула II 200 мг φϋ | |||||
Момент времени (ч) | Формула II | Формула I | Формула 1 + формула II | Формула II | Формула I | Формула 1 + формула II |
0 | 0, 09 | 0, 97 | 1, 06 | 0, 02 | 0, 69 | 0,71 |
0,5 | 0, 12 | 0, 93 | 1,04 | 0,46 | 0, 65 | 1,11 |
1 | 0,48 | 0, 88 | 1,36 | 3, 14 | 0, 69 | 3, 83 |
2 | 1,28 | 0, 97 | 2,25 | 3, 88 | 0, 84 | 4,72 |
3 | 1,71 | 1,00 | 2,71 | 3,16 | 0, 96 | 4,12 |
5 | 0, 88 | 1,13 | 2,01 | 1,31 | 1,00 | 2,31 |
8 | 0,26 | 0, 96 | 1,22 | 0,36 | 0, 93 | 1,29 |
12 | 0, 09 | 0,86 | 0, 94 | - | - | - |
12,5 | 0, 12 | 0, 93 | 1,04 | - | - | - |
13 | 0,48 | 0, 88 | 1,36 | - | - | - |
14 | 1,28 | 0, 97 | 2,25 | - | - | - |
15 | 1,71 | 1, 00 | 2,71 | - | - | - |
17 | 0, 88 | 1,13 | 2,01 | - | - | - |
20 | 0,26 | 0, 96 | 1,22 | - | - | - |
24 | 0, 09 | 0,86 | 0, 94 | 0, 11 | 0, 84 | 0, 95 |
Общее заключение
Данные, представленные в настоящей заявке, демонстрируют, что несмотря на то, что соединение
- 34 029084
по изобретению формулы I проявляет схожую активность ίη νίίτο в отношении ίΛΚΙ и 1ΆΚ2 в биохимическом анализе, анализ цельной крови на избирательность ίη νίίτο, более близкий к физиологическим условиям (§айагшеп с1 а1. 2000 Μοί. Сс11. Βίο1., 20(10), 3387), показывает, что соединение по изобретению формулы I проявляет более чем 10-кратную избирательность к ίΛΚΙ относительно 1ΆΚ2. Кроме того, соединение по изобретению формулы I показывает неожиданный профиль ίη νίνο у человека по сравнению с профилем, который мог быть предсказан по данным ίη νίίτο или по данным ίη νίνο у других видов. В частности, соединение по изобретению формулы I демонстрирует значительно более длительный видимый конечный период полувыведения у человека в диапазоне от 2ί до 27 ч, который не мог быть предсказан специалистом в данной области, что может вести к преимуществам в виде диапазона от схем дозирования с низкой частотой и повышенного соблюдения пациентом схемы лечения. В частности, может быть снижен эффект от не соблюдения указаний, если пациент пропускает дозу.
Пример 6. Дополнительные протоколы
6.1. Термодинамическая растворимость
Раствор ί мг/мл тестируемого соединения получают в 0,2 М фосфатном буфере рН 7,4 или 0,ί М цитратном буфере рН 3,0 при комнатной температуре в стеклянном сосуде.
Образцы вращали в ΚοΙαΙοτ ЭтАс 8ΤΚ 4 (§1иаг1 §сюйтйс, Βίόόν) на скорости 3,0 при комнатной температуре в течение 24 ч.
После 24 ч 800 мкл образца переносили в пробирку Ерреηбο^Γ и центрифугировали 5 мин при ί4000 об./мин. 200 мкл супернатанта образца после этого переносили в МиШкстсспК. δοϊυόίΐίΐν Р1а1е (Μ^II^рο^е. М§§ЬВРС50) и супернатант фильтровали (10-12" Нд) с помощью вакуумного коллектора в чистый полипропиленовый 96-луночный планшет с У-образным дном Отсшст (номер по каталогу 651201). 5 мкл фильтрата разводят в 95 мкл (Р20) того же буфера, используемого для того, чтобы инкубировать планшет, содержащий калибровочную кривую (Отсшст, номер по каталогу 651201).
Калибровочную кривую для соединения получают заново в ЭМ8О. начиная с ί0 мМ ЭМ8О основного раствора с коэффициентом разведения 2 в ЭМЗО (5000 мкМ) и затем дополнительно разбавляют в ЭМЗО вплоть до 19,5 мкМ. Затем 3 мкл серийного разведения, начиная с 5000 мкМ, переносят в 97 мкл смеси ацетонитрил-буфер (50/50). Диапазон конечной концентрации составляет от 2,5 до 150 мкМ.
Планшет герметизируют с применением герметизирующей прослойки (МА96КБ-04§, ΚίικδΑ. СатЪк, ΡΕί9 8ΥΧ, υΚ) и образцы измеряют при комнатной температуре на ЬСМ§ (ΖΟ 1525 из \Уа1сг8) в оптимизированных условиях с применением Ош-нюрип^с для того, чтобы определять подходящую массу молекулы.
Образцы анализируют на ЬСМ§ при скорости потока ί мл/мин. Растворитель А представляет собой ί5 мМ аммиак и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец прогонят при положительном ионораспылении на колонке ХВпбдс С18 3,5 мкМ (2,1x30 мм), из АаЮгх Градиент растворителя имеет общее время пробега 2 мин и варьирует от 5% В до 95% В.
Площади пиков анализируют с помощью пакета программного обеспечения Ма551уи\ и площади пиков образцов наносят на график против калибровочной кривой, чтобы получать растворимость соединения.
Значения растворимости приводят в мкМ или мкг/мл.
6.2. Водная растворимость
6.2.1. Водная растворимость, процедура с 2% ЭМЗО
Начиная с 10 мМ основного раствора в ЭМЗО. получают серийное разведение соединения в ЭМ8О. Серийные разведения переносят в плоскодонный планшет 96 NυNС Мам^тЪ (номер по каталогу 442404) и при комнатной температуре добавляют 0,2 М фосфатный буфер рН7,4 или 0,ί М цитратный буфер рН 3,0.
Конечная концентрация находится в диапазоне от 200 до 2,5 мкМ в 5 стадиях равного разведения. Конечная концентрация ЭМЗО не превышает 2%. 200 мкМ пирен добавляют в угловые точки каждого 96-луночного планшета, и они выполняют функцию эталонной точки для калибровки оси ζ на микроскопе.
Планшеты с анализами герметизировали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 230 об./мин. Затем планшеты сканировали под микроскопом с белым светом, что давало индивидуальные изображения осадка на концентрацию. Осадок анализировали и преобразовывали в число, которое наносили на график. Первая концентрация, в которой соединение выглядит полностью растворенным, представляют собой концентрацию, которая приведена ниже, однако истинная концентрация будет находиться где-то между этой концентрацией и одной более высокой стадией разведения.
Значения растворимости, измеряемые согласно этому протоколу, приведены в мкг/мл.
6.2.2. Водная растворимость, процедура с 3% ЭМЗО
Начиная с основного раствора 10 мМ в ЭМЗО. получают серийное разведение соединения в ЭМ8О. Серийное разведение переносят в плоскодонный планшет 96 NυNС МамюгЪ (номер по каталогу 442404) и при комнатной температуре добавляют 0,1 М фосфатный буфер рН7,4 или 0,1 М цитратный буфер рН3,0.
Конечная концентрация варьирует от 300 до 18,75 мкМ на 5 стадиях равного разведения. Конечная
- 35 029084
концентрация ЭМ8О не превышает 3%. 200 мкМ пирен добавляют в угловые точки каждого 96луночного планшета, и они выполняют функцию эталонной точки для калибровки оси ζ на микроскопе.
Планшеты с анализами герметизируют и инкубируют в течение 1 ч при 37°С при встряхивании 230 об./мин. Затем планшеты сканировали под микроскопом с белым светом, что давало индивидуальные изображения осадка на концентрацию. Осадок анализировали и с применением программного инструмента преобразовывали в число, которое наносили на график. Первая концентрация, в которой соединение выглядит полностью растворенным, представляют собой концентрацию, которая приведена ниже, однако истинная концентрация будет лежать где-то между этой концентрацией и одной более высокой стадией разведения.
Значения растворимости, измеренные согласно этому протоколу, приведены в мкг/мл.
6.3. Связывание белков плазмы (равновесный диализ)
10 мМ основной раствор соединения в ЭМ8О разводят в 5 раз в ЭМ8О. Этот раствор дополнительно разводят в свежеоттаявшей плазме человека, крысы, мыши или собаки (ВюКес1атайоп ГИС) с конечной концентрацией 10 мкМ и конечной концентрацией ЭМ8О 0,5% (5,5 мкл в 1094,5 мкл плазмы в РРМаНегЫоск 96 лунок (Отешет, номер по каталогу 780285))
Планшет Р1егсе Кей Эе\1се со вставками (ТЬегто8с1епййс, номер по каталогу 89809) получают и вносят 750 мкл РВ8 в камеру для буфера и 500 мкл меченой плазмы в камеру для плазмы. Планшет инкубируют в течение 4 ч при 37°С при встряхивании 230 об./мин. После инкубации 120 мкл из обеих камер переносят в 360 мкл ацетонитрила в 96-луночные круглодонные РР планшеты с глубокими лунками (№тс. номер по каталогу 278743) и герметизируют крышкой из алюминиевой фольги. Образцы смешивают и помещают на лед в течение 30 мин. Затем планшет центрифугируют 30 мин при 1200 оцс при 4°С и супернатант переносят в 96-луночный РР планшет с У-образным дном (Отешет, 651201) для анализа на ЬСМ8.
Планшет герметизируют с применением герметизирующей прослойки (МА96КЭ-048) Капель СатЪк, РЕ19 8ΥΧ, ИК, и образцы измеряют при комнатной температуре на ЬСМ8 (Ζφ 1525 из \Уа1егз) при оптимизированных условиях с применением ОиапорШЮе для того, чтобы определять подходящую массу молекулы.
Образцы анализируют на ЬСМ8 при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представляет собой 15 мМ аммиак и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец прогоняют при положительном ионораспылении на колонке ХВпйде С18 3,5 мкМ (2,1x30 мм), из \Уа1ег5. Градиент растворителя имеет общее время пробега 2 мин и варьирует от 5% В до 95% В.
Площадь пика от соединения в камере для буфера и камере для плазмы принимают за 100% соединения. Процентную долю, связанную с плазмой, выводят из этих результатов и сообщают в виде процентной доли, связанной с плазмой.
Растворимость соединения в конечной тестовой концентрации в РВ8 проверяют с помощью микроскопа, чтобы показать, наблюдают ли образование осадка или нет
6.4. Стабильность микросом
6.4.1. Стабильность микросом в 1 ч процедуре инкубации
10 мМ основной раствор соединения в ЭМ8О разводят в 1000 раз в 182 мМ фосфатном буфере рН7,4 в планшете с 96 глубокими лунками (Отешет, номер по каталогу 780285) и предварительно инкубируют при 37°С.
40 мкл деионизированной воды добавляют в лунку полипропиленовой пробирки для хранения, меченой двухмерным штриховым кодом, Майтх (ТНегто 8с1епййс) и предварительно инкубируют при 37°С.
Получают рабочий основной раствор глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (О6РЭН) в 182 мМ фосфатном буфере рН 7,4 и помещают на лед перед применением. Кофактор, содержащий МдС12, глюкозо-6фосфат и ΝΑΌΡ+, получают в деионизированной воде и помещают на лед перед применением.
Получают конечный рабочий раствор, содержащий микросомы печени (ХепоЮсН) биологических видов, представляющих интерес (человек, мышь, крыса, собака), ранее описанные О6РЭН и кофакторы, и эту смесь инкубируют в течение не более чем 20 мин при комнатной температуре.
30 мкл предварительно нагретого разведения соединения добавляют в 30 мкл предварительной нагретой воды в пробирках Майтх и добавляют 30 мкл смеси микросом. Конечные концентрации реакции составляют 3 мкМ соединения, 1 мг микросом, 0,4 Ед/мл ОЭРЭН, 3,3 мМ МдС12, 3,3 мМ глюкозо-6фосфата и 1,3 мМ ХАЭР+.
Для того чтобы измерять процентную долю остающегося соединение в нулевой момент времени, в лунку добавляют МеОН или МеСN (1:1) перед добавлением смеси микросом. Планшеты герметизируют уплотнителем Майтх 8ерга (Майтх, номер по каталогу 4464) и встряхивают в течение нескольких секунд, чтобы обеспечивать полное смешивание всех компонентов.
Образцы, которые не останавливают, инкубируют при 37°С, 300 об./мин и после 1 ч инкубации реакцию останавливают с применением МеОН или МеСN (1:1).
После остановки реакции образцы смешивают и помещают на лед в течение 30 мин, чтобы осаждать белки. После этого планшеты центрифугируют 30 мин при 1200 оцс при 4°С и супернатант перено- 36 029084
сят в 96-луночный РР планшет с У-образным дном (Стешет, 651201) для анализа на ЬСМБ.
Эти планшеты герметизируют с применением герметизирующих прослоек (МЛ96КО-04Б) КтеЧь СатЬк, РЕ19 8ΥΧ, ИК, и образцы измеряют при комнатной температуре на ЬСМБ (ΖΡ 152 5 из \Уа1егк) при оптимизированных условиях с применением Ош-торипи/е для того, чтобы определять подходящую массу исходной молекулы.
Образцы анализируют на ЬСМБ при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представляет собой 15 мМ аммиак и растворитель В представляет собой метанол или ацетонитрил, в зависимости от используемого останавливающего раствора. Образцы прогоняют при положительном ионораспылении на колонке ХВпкде С18 3,5 мкМ (2,1х30 мм), из \Уа1егк. Градиент растворителя имеет общее время пробега 2 мин и варьирует от 5% В до 95% В.
Площадь пика от исходного соединения в момент времени 0 принимают за 100% оставшегося. Процентную долю, остающуюся после 1 ч инкубации, вычисляют по моменту времени 0 и вычисляют в виде процентной доли оставшегося. Растворимость соединения в конечной тестовой концентрации в буфере проверяют с помощью микроскопа и приводят результаты.
Данные о стабильности микросом выражают в виде процентной доли от общего количества соединения, остающегося после 60 мин.
6.4.2. Стабильность микросом после 30 мин процедуры инкубации
10 мМ основной раствор соединения в ЭМБО разводят до 6 мкМ в 105 мМ фосфатном буфере, рН
7,4, в планшете с 96 глубокими лунками (Стешет, номер по каталогу 780285) и предварительно нагревают при 37°С.
Рабочий основной раствор глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (С6РЭН, КосЬе, 10127671001) 700 Ед/мл разводят с коэффициентом 1:700 в 105 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Смесь кофакторов, содержащую 0,528 М М§С12-6Н2О (Б1дта, М2670), 0,528 М глюкозо-6-фосфата (Брта, С-7879) и 0,208 М ЫЛПР+ (Б1дта,М-0505), разводят с коэффициентом 1:8 в 105 мМ фосфатном буфере, рН 7,4.
Получают рабочий раствор, который содержит микросомы печени 1 мг/мл (РгоуИсг. Хспо1ссН) биологических видов, представляющих интерес (человек, мышь, крыса, собака,...), 0,8 Ед/мл С6РЭН и смесь кофакторов (6,6 мМ М§С12, 6,6 мМ глюкозо-6-фосфат, 2,6 мМ ЫЛПР+). Эту смесь предварительно инкубируют в течение 15 мин, но никогда не больше чем 20 мин, при комнатной температуре.
После предварительной инкубации, разведение соединения и смесь, содержащую микросомы, добавляют вместе в равном количестве и инкубируют в течение 30 мин при 300 об./мин. Для момента времени 0 мин, два объема метанола добавляют в разведение соединения перед тем, как добавляют смесь микросом. Конечная концентрация во время инкубации составляет: 3 мкМ тестируемого соединения или контрольного соединения, 0,5 мг/мл микросом, 0,4 Ед/мл С6РЭН, 3,3 мМ М§С12, 3,3 мМ глюкозо-6фосфат и 1,3 мМ ЫЛПР+.
После 30 мин инкубации реакцию останавливают с применением 2 объемов метанола.
В оба момента времени, образцы смешивают, центрифугируют и собирают супернатант для анализа на ЬС-МБ/МБ.
Ответные сигналы прибора (т.е. высоты пиков) на образцы в нулевой момент времени (100%) представляют собой эталон для того, чтобы определять процентную долю остающегося соединения. Стандартные соединения пропанолол и верапамил включают в план анализа.
Данные о стабильности микросом выражают в виде процентной доли от общего количества соединения, остающегося после 30 мин.
Стабильность гепатоцитов (концентрации соединения формулы II и его основных метаболитов (в виде % от общей радиоактивности) после 24 ч инкубации 100 мкМ [14С]-соединения формулы II в суспензии гепатоцитов различных биологических видов)
6.5. Проницаемость СаСо2
Двунаправленные анализы СаСо-2 осуществляют, как описано ниже. Клетки СаСо-2 получают из Еигорс-п СоПссЕоп оГ Се11 СиНитек (ЕСАСС, номер по каталогу 86010202) и используют после 21 суток клеточной культуры в 24-луночных планшетах Тгаг15\уе11 (ИкЬет ТКТ-545-020В).
2х105 клеток/лунка высевают в среду для посевов, состоящую из ОМЕМ+СЩаМЛХН^ ΝΓΛΛ+10% ЕВБ (Ее1а1с1ог1е П)+1% Ре1т/Б1гер. Среду меняют каждые 2-3 суток.
Тестовые и эталонные соединения (пропранолол и родамин123 или винбластин, все приобретены в Бщта) получают в сбалансированном солевом растворе Хэнка, содержащем 25 мМ НЕРЕБ (рН 7,4), и добавляют или в апикальные (125 мкл) или в базолатеральные (600 мкл) камеры компоновки планшетов Та^уеИ в концентрации 10 мкМ с конечной концентрацией ОМБО 0,25%.
50 мкМ ЬистГет Уе11оу (Бщта) добавляют в донорный буфер во всех лунках для того, чтобы оценивать целостность клеточных слоев посредством мониторинга проникновения Ьисйег Уе11оу. Поскольку Ьисйег Уе11оу (ЬУ) не может свободно проникать через липофильные барьеры, высокая степень транспорта ЬУ указывает на низкую целостность клеточного слоя.
После 1 ч инкубации при 37°С при встряхивании на орбитальном встряхивателе при 150 об./мин, аликвоты 70 мкл берут из апикальных (А) и базальных (В) камер и добавляют в 100 мкл раствора ацето- 37 029084
нитрил:вода 50:50, содержащего аналитический внутренний стандарт (0,5 мкМ карбамазепин), в 96луночном планшете.
ЬисГег Уе11о\у измеряют с применением 8рескгатах Сетии Х8 (возбуждение 426 нм и испускание 538 нм) в чистом 96-луночном планшете, содержащем 150 мкл жидкости с базолатеральной и апикальной стороны.
Концентрации соединения в образцах измеряют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЬС-М8/М8).
Значения видимой проницаемости (Рарр) вычисляют с применением зависимости
Рарр= [соединение] акцептор конечный х Уакцептор/([соединение]донор начальный х Удонор)/ТинкхУдонор/площадь поверхности х 60 х 10-6 см/с.
V = объем камеры.
Τ1Ι1(; = время инкубации.
Площадь поверхности = 0,33 см2.
Степени утечки, в качестве показателя активной утечки с апикальной клеточной поверхности, вычисляют с применением соотношения Рарр В>А/Рарр А>В.
Используют следующие критерии приемлемости анализа:
Пропранолол: значение Рарр (А>В) > 20 (х 10-6 см/с).
Родамин 123 или винбластин: значение Рарр (А>В) <5 (х 10-6 см/с) при степени утечки >5.
Проницаемость ЬисГег Уе11о\у: <100 нм/с.
6.6. Модель септического шока
Инъекция липополисахарида (ЬР8) вызывает быстрое высвобождение растворимого фактора некроза опухоли (ΤΝΕ-α) на периферии. Эту модель используют для того, чтобы анализировать предполагаемые блокаторы высвобождения ΤΝΕ ш У1уо.
Шесть самок мышей ВЛЬВ/с.1 (20 г) на группу лечат в запланированной дозе один раз, перорально. Через 30 мин ЬР8 (15 мкг/кг; Е. соИ серотип 0111:В4) инъецируют интраперитонеально. Через 90 мин мышей эвтаназируют и берут кровь. Уровни циркулирующего ΤΝΕ-α определяют с применением коммерчески доступных наборов ΕΕΙ8Α. Дексаметезон (5 г/кг) используют в качестве эталонного противовоспалительного соединения.
6.7. Модель МАВ
Модель МАВ делает возможной быструю оценку модуляции РА-подобной воспалительной реакции посредством терапевтических средств (1<11ас1ид1ап ЬМ. №киге Ргокосо18 (2006) 2512-2516: Со11адеп апбЬобу-шбисеб аг1Нг1118). Мышам ΌΒΑ/1 внутривенно инъецируют смесь мАт, направленных на коллаген ΙΙ. Через одни сутки начинают лечение соединением (наполнитель: 10% (об./об.) НРрСИ). Через трое суток мыши получают интраперитонеальную инъекцию ЬР8 (50 мкг/мышь), что ведет к быстрому началу воспаления. Лечение соединением продолжают до 10 суток после инъекции мАт. Воспаление считывают посредством измерения отека лапы и регистрации клинической оценки каждой лапы. Кумулятивную клиническую оценку артрита четырех конечностей представляют для того, чтобы показать тяжесть воспаления. Систему оценки применяют к каждой конечности с применением клеточной инфильтрации от 0 до 4, где 4 представляет собой наиболее тяжелое воспаление.
0 без симптомов.
1 легкое, но определенное покраснение и отек сустава одного типа, такого как лодыжка или запястье, или выраженное покраснение и отек, ограниченные отдельными пальцами, независимо от числа пораженных пальцев.
2 умеренное покраснение и отек суставов двух или более типов.
3 тяжелое покраснение и отек всей лапы, включая пальцы.
4 максимально воспаленная конечность с вовлечением множества суставов.
6.8. Онкологические модели
Модели 1п У1уо для валидации эффективности низкомолекулярных соединений против 1ΑΚ2опосредованных миелопролиферативных заболеваний, описаны в Аепид ек а1. Сапсег Се11 13, 311, 2008, и Сегоп ек а1. Сапсег Се11 13, 321, 2008.
6.9. Модель ΙΒΌ на мышах
Модели ш У1кго и ш У1уо для валидации эффективности низкомолекулярных соединений против ΙΒΌ описаны в \νίΠζ ек а1. 2007.
6.10. Модель астмы на мышах
Модели 1п νίΙΐΌ и ш У1уо для валидации эффективности низкомолекулярных соединений против астмы описаны в №а18 ек а1., 2008; ф ек а1. 2006; Регт8 ек а1., 2002; Κϋ6^ζ ек а1., 2008.
Финальные комментарии
Специалисты в данной области примут во внимание, что приведенные выше описания являются примерными и пояснительными по природе и предназначены для того, чтобы иллюстрировать изобретение и его предпочтительные варианты осуществления. Посредством стандартных экспериментов специалист выяснит очевидные модификации и вариации, которые можно создавать, не отступая от сущности
- 38 029084
изобретения. Таким образом, предполагают, что изобретение определено не приведенным выше описанием, а следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.
Все публикации, включая в качестве неограничивающих примеров патенты и патентные заявки, цитированные в этом описании, включены в настоящий документ посредством ссылки, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация была конкретно и индивидуально включена по ссылке в настоящий документ, как будто она полностью изложена.
Из приведенного выше описания различные модификации и изменения в композициях и способах по данному изобретению придут на ум специалистам в данной области. Подразумевают, что все такие модификации, входящие в объем приложенной формулы изобретения, включены в нее.
Следует понимать, что такие факторы, как различная способность клеток к проникновению различных соединений, могут вносить неточности между активностью соединений в биохимических и клеточных анализах ΐη νΐίΓο.
По меньшей мере, некоторые химические названия соединений по изобретению, как приведено и изложено в этой заявке, могли быть сгенерированы на автоматизированной основе с применением коммерчески доступной программы программного обеспечения для создания химических названий, и не были независимо проверены. Репрезентативные программы, осуществляющие эту функцию, включают инструмент создания названия Ьех1сНеш, продаваемый Ореп Еуе ЗоПхуаге, Ипс., и инструмент программного обеспечения ЛЩопош, продаваемый МБЬ, Ипс. В случае, когда указанное химическое название и изображенная структура различаются, изображенная структура имеет приоритет.
Химические структуры, представленные в настоящем документе, получали с применением СНет□гахуСЮ или ШЗОЁГЖАЕ. Любая открытая валентность, встречающаяся на атоме углерода, кислорода или азота в структурах в настоящем документе, указывает на присутствие атома водорода. Когда в структуре существует хиральный центр, но для хирального центра не указаны конкретные стереохимические свойства, структура охватывает оба энантиомера, связанные с хиральной структурой.
Литературные источники
a) Уатпскепкег №. ек а1. 2008 Зеттпагз ίη Се11 &
Оеме1ортепка1 В1о1оду, 19, 385-393.
b) Уегзкомзек ек а1. 2009 Нетако1оду Ат Зое Нетако1 Екис
Ргодгат., 636-42.
c) ЕНе Оо1д0п ек а1. 2011 Ыакиге Кемаемз Огид ΌίβοονθΓγ,
10, 717-718.
ά) Зто1еп ек а1. 2003 Ыак Кем Ыгид ϋί3θον., 2, 473-88. е) Ьее ϋΜ ек а1. 2001 Ьапсек, 358, 903-11. к) Скоу ЕН ек а1. 2001 N Епд1 к Мес!., 344, 907-16. д) О'ЫеН кК. 2004 N Епд1 Л Мес!., 350(25), 2591-602. к) Нгезкетп СЗ. 2003 Ыакиге, 423, 356-61. ί) Корк ек а1. 2010 Ыак. Кем. Огад ϋίβο, 703-718. ί) Ζθηζ К ек а1. 2005 Ыакиге, 437 (7057), 369-75.
k) Сотттккее ког МесНс1па1 Ргокискз ког Нитап Ызе (СНМР)
(18 ЫометЬег 2004). "СиткеНпе оп СИп1са1 1пмезк0дак1оп ок
Мес!1с1па1 Ргокискз опсПсакес! ког кке кгеактепк ок Рзог1аз1з".
l) Рипмапт ек а1, 2012 "РгеЫпМпагу сИп1са1 аск0м1ку ок а кор1са1 кАК1/2 0пк1Ыког ίη кке кгеактепк ок рзог1аз1з" О Ат Асак Регтако1., 67, 4, 658-664.
т) гаккегтап ек а1. 2011 к СНп 1пмезк. 1 (12), 4618-21.
п) О'ЗиШмап ек а1. 2007 Мо1 1ттипо1. 44(10), 2497-506. о) Хаапд ек а1. 2008 ΒΙοοά 111-9, 4809-4812.
р) МиШдкап СС ек а1. 2009 ΡΝΑ3 106(23), 9414-9418.
Ч) гкапд ек а1. 1996 ΡΝΑ3 93, 9148-9153.
г) Сопзкапктпезси ек а1. 2007 Тгепкз ίη В1оскет1са1
Зсаепсез 33(3), 122-131.
з) Тагп ек а1. 2007 Вг1к0зк коигпа1 ок Сапсег 97, 378-383.
к) Вегтзка: ек а1. 2007, Вгеазк Сапсег Кезеагск 9: К32.
и) Ыака ек а1. 2002 Агккг1к0з Кез. 4 (зирр1 3):3233-3242. ν) 1пдегзо11 ек а1. 2008 ά Векам Мек. 31 (3), 213-224.
м) Випкдагк, Н., 0ез0дп ок Ргокгидз, рр. 7-9, 21-24,
Е1зем1ег, Атзкегкат 1985.
х) Кет1пдкоп'з Ркагтасеик1са1 Зстепсез, 17кк εάίΒίοη,
1985, Рагк 8, Маск РиЬНзктпд Сотрапу, Еазкоп, Реппзу1мап1а.
у) Т. №. Сгеепе апк Р. С. М. №икз, Ргокеск1пд Сгоирз ίη Огдапас Зупккез1з, Зесопк Εάίίίοη, ИПеу, Ыем Уогк, 1991.
ζ) №0 2010/149769.
аа) 31тз ΝΑ ек а1. 2004 Агккг1к1з Ккеит. 50, 2338-2346.
ЬЬ) кои ек а1. 2005 Агккг1к1з Ккеит. 52, 339-44.
со) Ккаск1д1ап, Ь. М. ек а1. 2006 Ыакиге Ргокосо1з 1,
2512-6.
кк) Ып НЗ ек а1. 2007 Вг к Ркагтасо1. 150(7), 862-872. ее) Ыазкака К ек а1. 2004 Агккг1к1з Ккеит. 10, 3365-76. кк) Зке1коп ЫЬ ек а1. 2005 Раап 116, 8-16.
дд) АгдИез кМ ек а1. 1998 Сигг Ορίη СНп Ыикг МекаЬ Саге 1, 245-51.
кк) КаН ек а1. 2004 Ккеитако1оду 43, 1219-23.
Н) Иа1зт0кк к ек а1. 2004) к Ккеитако1. 31, 23-9.
%) 5а1мет1п1 Ы ек а1. 2001 АгКкННз Ккеит. 44, 2909-21.
- 39 029084
кк) Визк КА ек а1. 2002 АгкЬгтктз КЬеит. 46, 802-5.
11) Озке Ъ ек а1. , ЕСТС Мопкгеа1 2007.
шп) 5акаг1пеп ек а1. 2000 Мо1. Се11. ΒίοΙ. 20(10), 3387. ηη) Кегпьд ек а1. 2008 Сапсег Се11 13(4), 311-320. оо) Сегоп ек а1. 2008 Сапсег Се11 13(4), 321-30. рр) ТПгкг ек а1. 2007 АсЭапсеб Бгид ΌθϋνθΓγ ΒθνίθΜε,
2007, 1073-1083.
ЧЧ) Ы1а1з ек а1. 2008 Оьзеазе Мос1е1з & Мескапьзтз, 213220.
гг) 1р ек а1. 2006 СПп. Ехр. 1ттип, 162-172.
зз) Регп1з ек а1. 2002 6Г. СПп. ΙηνθΞΠ 1279.
кк) Кис11асг ек а1. 2008 Еиг б РЬагтасо 154-161.
ии) Мсб1пп1ку ек а1. Вгид МекаЬоПзт апб ϋί5ρο5ίΗοη 2004,
32, 11, 1247.
Claims (17)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение соединения формулы Iιили его фармацевтически приемлемой соли при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией ГЬ-6 или интерферонов.
- 2. Применение по п.1 при лечении ревматоидного артрита.
- 3. Применение по п.1 при лечении воспалительных заболеваний кишечника.
- 4. Применение по п.1 при лечении болезни Крона и/или язвенного колита.
- 5. Применение по п.1 при лечении анкилозирующего спондилита, псориаза и/или псориатического артрита.
- 6. Применение по любому из пп.1-5 в комбинации с дополнительным терапевтическим средством, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой тофацитиниб.
- 7. Применение по любому из пп.1-6, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой соединение формулы II
- 8. Способ профилактики и/или лечения млекопитающего, склонного к или страдающего от состояния, выбранного из воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, аллергии, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих ухудшение обновления хряща, врожденных мальформаций хряща и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией ГЬ-6 или интерферонов, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения, определенного в п.1, где указанные соединения в качестве ингибитора 1АК проявляют доступную наблюдению активность ίη νίνο.
- 9. Способ по п.8, где воспалительным заболеванием является ревматоидный артрит.
- 10. Способ по п.8, где воспалительным заболеванием является воспалительное заболевание кишечника.
- 11. Способ по п.8, где воспалительным заболеванием является болезнь Крона и/или язвенный колит.
- 12. Способ по п.8, где аутоиммунным заболеванием является анкилозирующий спондилит и/или- 40 029084псориатический артрит.
- 13. Способ по п.8, где пролиферативным заболеванием является псориаз.
- 14. Способ по п.8, где указанные соединения в качестве ингибитора ЛАК вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, где указанное дополнительное терапевтическое средство представляет собой тофацитиниб.
- 15. Способ по п.8, где указанные соединения в качестве ингибитора ЛАК вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, где дополнительное терапевтическое средство соответствует формуле II
- 16. Способ по п.15, где соотношение формула ^формула II составляет от 1/5 до 1/20.
- 17. Способ по п. 15, где соотношение формула ^формула II составляет от 1/5 до 1/10.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261663520P | 2012-06-22 | 2012-06-22 | |
PCT/EP2013/061914 WO2013189771A1 (en) | 2012-06-22 | 2013-06-10 | Aminotriazolopyridine for use in the treatment of inflammation, and pharmaceutical compositions thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201590071A1 EA201590071A1 (ru) | 2015-04-30 |
EA029084B1 true EA029084B1 (ru) | 2018-02-28 |
Family
ID=48577773
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201590071A EA029084B1 (ru) | 2012-06-22 | 2013-06-10 | Аминотриазолопиридин для применения в лечении воспаления и его фармацевтические композиции |
Country Status (35)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9284311B2 (ru) |
EP (1) | EP2863950B1 (ru) |
JP (2) | JP6238975B2 (ru) |
KR (1) | KR102078069B1 (ru) |
CN (2) | CN107998136A (ru) |
AR (1) | AR091395A1 (ru) |
AU (1) | AU2013279597B2 (ru) |
BR (1) | BR112014031626A8 (ru) |
CA (1) | CA2875619C (ru) |
CL (1) | CL2014003462A1 (ru) |
CO (1) | CO7160085A2 (ru) |
CR (1) | CR20140583A (ru) |
CY (1) | CY1120643T1 (ru) |
DK (1) | DK2863950T3 (ru) |
EA (1) | EA029084B1 (ru) |
ES (1) | ES2685985T3 (ru) |
HK (1) | HK1208368A1 (ru) |
HR (1) | HRP20181364T8 (ru) |
HU (1) | HUE038878T2 (ru) |
IL (1) | IL235923B (ru) |
LT (1) | LT2863950T (ru) |
MA (1) | MA37775A1 (ru) |
MX (1) | MX368511B (ru) |
MY (1) | MY177334A (ru) |
NZ (1) | NZ702480A (ru) |
PE (1) | PE20150187A1 (ru) |
PH (1) | PH12014502615B1 (ru) |
PL (1) | PL2863950T3 (ru) |
PT (1) | PT2863950T (ru) |
SG (2) | SG10201700125VA (ru) |
SI (1) | SI2863950T1 (ru) |
TW (1) | TWI586352B (ru) |
UA (1) | UA112804C2 (ru) |
UY (1) | UY34855A (ru) |
WO (1) | WO2013189771A1 (ru) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JO3041B1 (ar) | 2008-07-25 | 2016-09-05 | Galapagos Nv | مركبات جديدة مفيدة لمعالجة الأمراض التنكسية والالتهابية |
TWI462920B (zh) | 2009-06-26 | 2014-12-01 | 葛萊伯格有限公司 | 用於治療退化性及發炎疾病之新穎化合物 |
GB201402070D0 (en) | 2014-02-07 | 2014-03-26 | Galapagos Nv | Pharmaceutical compositions for the treatment of inflammatory disorders |
GB201402071D0 (en) * | 2014-02-07 | 2014-03-26 | Galapagos Nv | Novel salts and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders |
JP2018511620A (ja) | 2015-04-13 | 2018-04-26 | ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップGalapagos N.V. | 炎症性障害の治療のための方法 |
WO2016165952A1 (en) * | 2015-04-13 | 2016-10-20 | Galapagos Nv | Methods for the treatment of cardiovascular disorders |
WO2016179207A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | Concert Pharmaceuticals, Inc. | Deuterated filgotinib |
CN105061420B (zh) * | 2015-06-04 | 2017-09-05 | 南京旗昌医药科技有限公司 | 一种jak抑制剂的晶型及其制备方法和应用 |
WO2017106568A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Gilead Sciences, Inc. | Combination of a jak inhibitor and a bromodomain inhibitor for treating cancer |
WO2017106564A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Gilead Sciences, Inc. | Combination of a jak inhibitor and a syk inhibitor for treating cancers and inflammatory disorders |
US20170174788A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Gilead Sciences, Inc. | Combination of a jak inhibitor and an mmp9 binding protein for treating inflammatory disorders |
WO2017133423A1 (zh) * | 2016-02-02 | 2017-08-10 | 深圳市塔吉瑞生物医药有限公司 | 一种取代的吡啶酰胺类化合物及其应用 |
WO2018087202A1 (en) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Galapagos Nv | Compounds and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory diseases |
GB201702603D0 (en) | 2017-02-17 | 2017-04-05 | Galápagos Nv | Novel compositions and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders |
GB201808575D0 (en) | 2018-05-24 | 2018-07-11 | Galapagos Nv | Methods for the treatment of psoriatic arthrits |
WO2019246273A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a jak or other kinase inhibitor |
JP2022527512A (ja) * | 2019-03-30 | 2022-06-02 | ユニケム ラボラトリーズ リミテッド | フィルゴチニブおよびその中間体の調製のための新規プロセス |
JP7315166B2 (ja) * | 2019-06-10 | 2023-07-26 | 富士通株式会社 | グラフェンナノリボンネットワーク膜の製造方法及び電子装置の製造方法 |
CN111686106B (zh) * | 2020-04-05 | 2022-07-15 | 温州医科大学附属第一医院 | 提高Dicer表达的化合物在制备药物中的应用 |
CN114409675B (zh) * | 2022-01-07 | 2023-08-04 | 重庆医科大学 | 螺环异恶唑酮色满衍生物在制备用于治疗jak1介导的疾病药物中的用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010141796A2 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Cephalon, Inc. | PREPARATION AND USES OF 1,2,4-TRIAZOLO [1,5a] PYRIDINE DERIVATIVES |
WO2010149769A1 (en) * | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Galapagos Nv | 5-phenyl-[1,2,4 ]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl carboxamides as jak inhibitors |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2007291190A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Cellzome Limited | Triazole derivatives as kinase inhibitors |
TWI453207B (zh) * | 2008-09-08 | 2014-09-21 | Signal Pharm Llc | 胺基三唑并吡啶,其組合物及使用其之治療方法 |
JO3030B1 (ar) * | 2009-06-26 | 2016-09-05 | Galapagos Nv | مركب جديد مفيد لمعالجة الامراض التنكسية والالتهابات |
-
2013
- 2013-06-10 UY UY0001034855A patent/UY34855A/es unknown
- 2013-06-10 KR KR1020157001521A patent/KR102078069B1/ko active IP Right Grant
- 2013-06-10 SI SI201331137T patent/SI2863950T1/sl unknown
- 2013-06-10 EP EP13727625.9A patent/EP2863950B1/en active Active
- 2013-06-10 AU AU2013279597A patent/AU2013279597B2/en active Active
- 2013-06-10 JP JP2015517666A patent/JP6238975B2/ja active Active
- 2013-06-10 PE PE2014002472A patent/PE20150187A1/es not_active Application Discontinuation
- 2013-06-10 WO PCT/EP2013/061914 patent/WO2013189771A1/en active Application Filing
- 2013-06-10 PT PT13727625T patent/PT2863950T/pt unknown
- 2013-06-10 CN CN201810014031.0A patent/CN107998136A/zh active Pending
- 2013-06-10 MY MYPI2014703876A patent/MY177334A/en unknown
- 2013-06-10 ES ES13727625.9T patent/ES2685985T3/es active Active
- 2013-06-10 MX MX2014014800A patent/MX368511B/es active IP Right Grant
- 2013-06-10 CN CN201380032159.5A patent/CN104379173A/zh active Pending
- 2013-06-10 NZ NZ702480A patent/NZ702480A/en unknown
- 2013-06-10 MA MA37775A patent/MA37775A1/fr unknown
- 2013-06-10 LT LTEP13727625.9T patent/LT2863950T/lt unknown
- 2013-06-10 DK DK13727625.9T patent/DK2863950T3/en active
- 2013-06-10 EA EA201590071A patent/EA029084B1/ru unknown
- 2013-06-10 PL PL13727625T patent/PL2863950T3/pl unknown
- 2013-06-10 AR ARP130102033 patent/AR091395A1/es unknown
- 2013-06-10 BR BR112014031626A patent/BR112014031626A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-06-10 US US13/913,597 patent/US9284311B2/en active Active
- 2013-06-10 SG SG10201700125VA patent/SG10201700125VA/en unknown
- 2013-06-10 SG SG11201408123SA patent/SG11201408123SA/en unknown
- 2013-06-10 HU HUE13727625A patent/HUE038878T2/hu unknown
- 2013-06-10 CA CA2875619A patent/CA2875619C/en active Active
- 2013-06-11 TW TW102120793A patent/TWI586352B/zh active
- 2013-10-06 UA UAA201500458A patent/UA112804C2/uk unknown
-
2014
- 2014-11-24 PH PH12014502615A patent/PH12014502615B1/en unknown
- 2014-11-26 IL IL235923A patent/IL235923B/en active IP Right Grant
- 2014-12-16 CR CR20140583A patent/CR20140583A/es unknown
- 2014-12-19 CL CL2014003462A patent/CL2014003462A1/es unknown
- 2014-12-19 CO CO14279834A patent/CO7160085A2/es unknown
-
2015
- 2015-09-17 HK HK15109111.8A patent/HK1208368A1/xx unknown
-
2016
- 2016-03-14 US US15/069,130 patent/US20160296529A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-10-31 JP JP2017210372A patent/JP2018048185A/ja active Pending
-
2018
- 2018-08-27 HR HRP20181364TT patent/HRP20181364T8/hr unknown
- 2018-08-29 CY CY181100902T patent/CY1120643T1/el unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010141796A2 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Cephalon, Inc. | PREPARATION AND USES OF 1,2,4-TRIAZOLO [1,5a] PYRIDINE DERIVATIVES |
WO2010149769A1 (en) * | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Galapagos Nv | 5-phenyl-[1,2,4 ]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl carboxamides as jak inhibitors |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA029084B1 (ru) | Аминотриазолопиридин для применения в лечении воспаления и его фармацевтические композиции | |
EA024743B1 (ru) | Соединение, предназначенное для лечения дегенеративных и воспалительных состояний | |
EA020111B1 (ru) | {5-[4-(3,3-ДИМЕТИЛАЗЕТИДИН-1-КАРБОНИЛ)ФЕНИЛ]-[1,2,4]ТРИАЗОЛ[1,5-a]ПИРИДИН-2-ИЛ}АМИД ЦИКЛОПРОПАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ | |
EA018080B1 (ru) | Соединения, пригодные для лечения дегенеративных и воспалительных заболеваний | |
EA021637B1 (ru) | 5-фенил-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-2-илкарбоксамиды в качестве ингибиторов jak | |
JP6633531B2 (ja) | 炎症性障害の治療のための医薬組成物 | |
EA032596B1 (ru) | Соли, способ их получения и их применение для лечения воспалительных заболеваний | |
CN102112478A (zh) | 用于激酶调节的5h-吡咯[2,3-b]吡嗪衍生物和其适应症 | |
EA034512B1 (ru) | Лечение злокачественной опухоли ингибиторами tor-киназы | |
EA026390B1 (ru) | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ 7-(6-(2-ГИДРОКСИПРОПАН-2-ИЛ)ПИРИДИН-3-ИЛ)-1-((ТРАНС)-4-МЕТОКСИЦИКЛОГЕКСИЛ)-3,4-ДИГИДРОПИРАЗИНО[2,3-b]ПИРАЗИН-2(1Н)-ОНА, ИХ ТВЕРДЫЕ ФОРМЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | |
WO2010071826A2 (en) | Methods for treating osteoclast-related disease, compounds and compositions thereof | |
TW202038944A (zh) | 用於治療胃腸道疾病之jak1路徑抑制劑 | |
US20130217722A1 (en) | Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases | |
JP2015525063A (ja) | 低酸素状態に基づくhsp90インヒビターでの治療のための被験者の予備選択 | |
US20140155372A1 (en) | Combinations of akt and mek inhibitor compounds, and methods of use | |
CN113811301A (zh) | 使用布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂治疗舍格伦综合征的方法 | |
KR20210047308A (ko) | 골수섬유증을 치료하는 혈소판 수-불특정 방법 | |
US20200253959A1 (en) | Compounds and pharmaceutical compositions thereof for use in the treatment of fibrotic diseases | |
WO2022115741A1 (en) | Therapeutic methods and compositions for treating sarcoma using devimistat | |
US20140213576A1 (en) | Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases | |
WO2024023696A1 (en) | Dosing regimen for a nlrp3 inhibitor | |
EA039396B1 (ru) | Лечение рака молочной железы с тройным негативным фенотипом ингибиторами tor-киназы |