KR102078069B1 - 염증의 치료에 사용하기 위한 아미노트라이아졸로피리딘, 및 그의 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특히, 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료에 있어서, 화학식 I에 따른 화합물의 신규의 의학적 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 화합물은 타이로신 키나제의 한 과인 JAK, 및 보다 특히 JAK1을 억제한다. 본 발명은 또한 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 상기 화합물을 투여함에 의한 염증 상태를 수반하는 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다.

Description

염증의 치료에 사용하기 위한 아미노트라이아졸로피리딘, 및 그의 약학 조성물{AMINOTRIAZOLOPYRIDINE FOR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATION, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF}
본 발명은 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 의학적 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료를 위한 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 화합물은 타이로신 키나제의 한 과인 JAK, 및 보다 특히 JAK1을 억제한다. 본 발명은 또한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 상기 화합물을 투여함에 의한 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
야누스 키나제(JAK)는 사이토킨 신호를 막 수용체로부터 STAT 전사 인자로 전달하는 세포질 타이로신 키나제이다. 4 개의 JAK과 구성원, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2가 개시되어 있다. 상기 사이토킨이 그의 수용체에 결합시, JAK과 구성원들은 서로 자기인산화 및/또는 트랜스인산화한 다음, STAT를 인산화하고, 이어서 상기는 핵으로 이동하여 전사를 조절한다. JAK-STAT 세포내 신호 전달은 인터페론, 대부분의 인터류킨뿐만 아니라 다양한 사이토킨 및 내분비 인자들, 예를 들어 EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF 및 PRL을 제공한다(Vainchenker W. et al. (2008)).
유전자 모델과 소분자 JAK 억제제의 병용 연구는 다수의 JAK의 치료학적 가능성을 밝혀내었다.
JAK1은 면역-염증 질병 분야의 표적이다. JAK1은 다른 JAK들과 이종이량체화하여 사이토킨-구동된 염증전 신호를 전달한다. 따라서, JAK1의 억제는 JAK1 신호를 이용하는 병리학-관련된 사이토킨, 예를 들어 IL-6, IL-4, IL-5, IL-12, IL-13, IL-23, 또는 IFN감마를 갖는 면역-염증 질병뿐만 아니라 JAK-매개된 신호 전달에 의해 구동되는 다른 질병들에 중요하다.
상기 JAK과 구성원들의 역할에서, 대부분의 신호전달 경로는 하나보다 많은 JAK를 수반하기 때문에 일부 중복이 존재하지만, 일부 성장 인자들, 예를 들어 에리쓰로포이에틴 및 트롬보포이에틴의 경우에는 오직 JAK2만이 관련된다.
JAK3은 인터류킨(IL)-2에 의해 발생된 신호의 전달을 통해 면역 기능을 차단하는데 중요한 역할을 한다.
다른 한편으로, TYK2는 IL-12 및 IL-13과 같은 사이토킨의 신호를 전달하기 위해서 JAK2 및 JAK3와 함께 작용하는 듯하다.
상기 JAK 효소들의 역할은 대개 상기 JAK과 구성원들 각각이 결실된 마우스를 사용하여 연구되었다. JAK1 녹아웃 마우스는 분만전후 치사 표현형을 나타내고 또한 결함성 림프구 발생을 가지며 JAK1을 통한 사이토킨에 의한 결함성 신호의 결과로서 작용한다. JAK2 결함은 명확한 조혈의 실패의 결과로서 12일째에 태아 사망을 발생시킨다. JAK3-결손 마우스는 중증 복합 면역결핍(SCID) 표현형을 갖지만, 비-면역 결함은 갖지 않는다(Verstovsek, 2009, Hematology Am Soc Hematol Educ Program., 636-42).
범 JAK 억제제들에 대해 관찰된 바와 같이, 비선택적 억제는 빈혈, 증가된 감염률, 보다 낮은 호중구 및 림프구수, 헤모글로빈 감소, 및 상승된 콜레스테롤 수준과 같은 부작용과 관련될 수 있다(Elie Dolgin, 2011, Nature Reviews Drug Discovery 10, 717-718).
따라서, 선택성 JAK 억제제의 개발은 상기와 같은 부작용을 최소화하기 위해서 이로울 것이다.
연골의 퇴행은 다양한 질병의 특징이며, 상기 질병 중에서 류마티스성 관절염 및 골관절염이 가장 현저하다. 류마티스성 관절염(RA)은 만성적인 관절 퇴행성 질병이며, 관절 구조의 염증 및 파괴를 특징으로 한다. 상기 질병이 관리되지 않으면, 관절 기능의 상실로 인한 실질적인 불구 및 통증 및 심지어 조기 사망에 이르게 된다. 따라서, RA 요법의 목적은 상기 질병을 늦추는 것뿐만 아니라 관절 파괴를 멈추기 위해서 완화를 획득하는 것이다. 상기 질병 결과의 중증도외에, RA의 높은 유병률(세계적으로 성인의 약 0.8%가 병에 걸린다)은 높은 사회-경제적 영향을 의미한다(RA에 대한 검토를 위해서, 우리는 문헌[Smolen and Steiner (2003)]; [Lee and Weinblatt (2001)]; [Choy and Panayi (2001)]; [O’Dell (2004)] 및 [Firestein (2003)]을 참조한다).
JAK1은 다수의 사이토킨 및 호르몬에 대한 세포내 신호전달과 관련된다. 이들 사이토킨 및 호르몬 중 어느 하나와 관련된 병리는 JAK1 억제제의 의해 개선될 수 있다. 따라서, 다수의 알러지, 염증 및 자가면역 질환들, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 소아 특발성 관절염, 골관절염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 조직 섬유증, 호산성 염증, 식도염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 이식, 이식편대 숙주병, 건선, 근염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염 및 다발성 경화증은 본 발명에 개시된 화합물에 의한 치료가 이로울 수 있다(Kopf et al., 2010).
건선은 피부를 침범하는 질병이다. 건선의 원인은 완전히 이해되어 있지 않지만, 피부세포의 염증 및 빠른 번식을 야기하는 사이토킨, 특히 TNFα의 방출과 연계된 면역 매개 관련 질병인 것으로 여겨진다. 이러한 가설은 면역억제성 약물이 건선 플라크를 제거할 수 있다는 관찰에 의해 확증되었다(Zenz R, Eferl R, Kenner L, et al. (2005). "Psoriasis-like skin disease and arthritis caused by inducible epidermal deletion of Jun proteins". Nature 437 (7057): 369-75).
건선은 또한 관절의 염증을 유발시킬 수 있으며, 이는 건선성 관절염으로서 공지되어 있다. 전체 건선 환자 중 10 내지 30%는 건선성 관절염을 또한 갖는다(Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (18 November 2004). "Guideline on Clinical Investigation of Medicinal Products indicated for the treatment of Psoriasis"). 건선은 그의 만성적인 재발 성질로 인해 치료하기 힘들다. 최근에 JAK의 억제가 상기 건선 상태의 성공적인 개선을 생성시킬 수 있음이 입증되었다(Punwani et al., (2012) “Preliminary clinical activity of a topical JAK1/2 inhibitor in the treatment of psoriasis“ J Am Acad Dermatol., 67, 4, 658-664).
염증성 장 질병(IBD)은 결장 및 소장의 염증 상태의 한 그룹이다. IBD의 주요 유형은 크론병 및 궤양성 대장염이다. 최근에, 게놈-전장 관련(GWAS) 연구를 통해, T 세포 단백질 타이로신 포스파타제(TCPTP)가 GWAS에 의해 1형 당뇨병, 류마티스성 관절염 및 크론병의 병인에 연관된 JAK/STAT 및 성장 인자 수용체 포스파타제임이 밝혀졌다(Zikherman et al., J Clin Invest. 2011 Dec;121(12):4618-21). 따라서, 상기 JAK 경로의 억제는 IBD의 한 치료 방편을 제공할 수도 있다.
JAK과 구성원들은 골수증식성 질환을 포함한 추가적인 상태들에 관련되었다(O’Sullivan et al, 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506)(여기에서 JAK2의 돌연변이가 확인되었다). 이는 JAK, 특히 JAK2의 억제제들이 또한 골수증식성 질환의 치료에 사용될 수 있음을 가리킨다. 또한, 상기 JAK과, 특히 JAK1, JAK2 및 JAK3는 암, 특히 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(O’Sullivan et al, 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506; Xiang et al., 2008, “Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia” Blood First Edition Paper, prepublished online December 26, 2007; DOI 10.1182/blood-2007-05-090308) 및 급성 림프모구성 백혈병(Mullighan et al, 2009), 피부 T-세포 림프종(Zhang et al., 1996, PNAS, 93, 9148-9153) 또는 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종(Constantinescu et al., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131), 전립선암(Tam et al., 2007, British Journal of Cancer, 97, 378 - 383) 및 유방암(Berishaj et al., 2007, Breast Cancer Research 9: R32)과 관련되었다. 이들 결과는 JAK, 특히 JAK1의 억제제가 암(백혈병 및 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종, 전립선암)의 치료에도 또한 유용성을 가질 수 있음을 가리킨다.
또한, 캐슬만병, 다발성 골수종, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 건선 및 카포시육종이 상기 사이토킨 IL-6(그의 생물학적 효과는 세포내 JAK-STAT 신호에 의해 매개된다)의 분비과잉에 기인하는 듯하다(Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3):S233-S242). 상기 결과는 JAK의 억제제가 상기 질병의 치료에 또한 유용성을 가질 수도 있음을 보인다.
현행 요법들은 만족스럽지 못하며 따라서 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 치료에 사용될 수 있는 추가의 화합물들을 확인할 필요가 여전하다.
또한, 이들 상태는 장기간 요법, 및 반복되는 약물 복용을 요하는 만성적인 상태들이다. 장기간 치료는 환자 및 의사에게도 비슷하게 무거운 부담이 될 수 있는데, 그 이유는 상기 환자가 상기 약물에 불내성이거나 불내성으로 될 수도 있으고, 더욱 또한 고용량 또는 높은 투여 횟수는 불편한 부작용, 및/또는 낮은 환자 순응을 발생시킬 수 있으며, 이때 상기 환자는 때때로, 의도적으로 또는 우연히 복용량을 빠뜨릴 수도 있기 때문이다. 비-준수의 영향은 만성 질병 전체를 통해, 최소에서부터 매우 중대한 정도까지의 범위로 다양하다(Ingersoll et al., 2008 J Behav Med.; 31(3): 213-224).
따라서, 의사의 곳간을 강화하기 위해 보다 많은 화합물을 확인하고 환자의 수명을 개선시키기 위해서 보다 낮은 횟수의 투여 섭생을 갖는 화합물을 확인할 필요가 있다.
신약을 발견하고자, 가장 적합한 후보를 확인하는 기준이 종종 설정되며, 따라서 다수의 화합물들이 시험관내 모델에서 신속하게 평가되고, 상기 화합물들이 상기 기준을 충족하지 못하는 경우 동등하게 신속히 폐기된다. 시험관내 연구는 대개 생체내 연구보다 더 높은 처리량을 가지며 의사결정 과정에 큰 도움이 된다. 따라서 상기 시험관내 모델은 대개 상기 약물의 생체내 양상을 예견할 것으로 예상되며, 일견 시험관내에서 적합한 프로파일을 제공하는 것으로 보이지 않는 화합물은 폐기된다. 이와 관련하여, 화학식 I에 따른 화합물은 연구시 낮은 관심의 시험관내 프로파일을 나타내었지만, 생체내 연구는 특이적으로 인간에서 뜻밖의 성질을 드러내었다.
발명의 요약
본 발명은 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물이 약제로서 유용할 수 있다는 발견을 기본으로 한다. 특정한 태양에서, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 JAK, 및 보다 특히 JAK1의 억제제이다.
본 발명은 또한 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 제조 방법, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함에 의한 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물을 약물에 사용하기 위해 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112015005936003-pct00001
상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 놀랍게도 인간에서 다른 동물종들과 매우 상이한 생체내 프로파일을 나타내며, 이는 시험관내 예견과 대비된다. 실제로, 생체내에서, 인간에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 겉보기 말단 반감기는 다른 동물종에서보다 3 배 이상까지 현저하게 더 긴 것으로 나타났다. 이는 인간에서 축적을 일으켜 연장된 기간에 걸쳐 유지되는 치료 효과를 생성시키며, 이에 의해 매일 1 회 내지 매주 1 회 투여를 허용한다. 따라서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 낮은 횟수 투여 섭생 및/또는 증가된 환자 순응을 포함한 이점을 제공할 수 있다. 특히, 상기 환자가 용량을 빠뜨린 경우, 비-준수의 영향을 감소시킬 수도 있다.
특정한 태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 제공한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물, 및 약학 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 태양에서, 상기 약학 조성물은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물과 함께 사용하기에 적합한 추가의 치료 활성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 보다 특정한 태양에서, 상기 추가의 치료 활성 성분은 관절염 치료용 화합물이다. 가장 특정한 태양에서, 상기 추가의 치료 활성 성분은 류마티스성 관절염 치료용 화합물이다.
더욱이, 본 발명에 개시된 약학 조성물 및 치료 방법에 유용한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 제조 및 사용시 약학적으로 허용 가능하다.
본 발명의 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 나열된 것들 중에서 선택된 상태, 및 특히 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 보다 특히 류마티스성 관절염에 민감하거나 상기 질병에 걸린 포유동물, 특히 인간의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 약학 조성물 또는 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물, 및 약물에 사용하기에 적합한 약학 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 태양에서, 상기 약학 조성물은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 이후에 본 발명에 개시되는 전형적인 합성 프로토콜 및 경로에 의해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 합성하는 방법을 제공한다.
다른 목적 및 이점들은 이어지는 상세한 설명을 고려하여 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
도 1은 본 발명에 개시된 화합물로 처리후 래트 CIA 임상 점수를 도시한다.
도 2는 본 발명에 개시된 화합물로 처리후 래트 CIA 모델에서 발목 직경의 진전을 도시한다.
도 3은 화학식 II에 따른 화합물의 시험관내 대사 프로파일을 도시한다.
도 4는 화학식 II에 따른 화합물의 투여시 측정된 화학식 I:화학식 II에 대한 노출의 비(AUC로서 나타냄)를 도시한다.
도 5는 IC50 값의 배수로서 나타낸 화학식 II에 따른 화합물의 투여후 개시된 화합물들의 노출 수준에 대한 값들을 도시한다.
도 6은 IC50 값의 배수로서 나타낸 화학식 II에 따른 화합물의 투여후 화학식 I 및 화학식 II에 따른 화합물들의 24 시간의 기간에 걸친 노출 수준에 대한 결합 값들을 도시한다.
정의
하기의 용어들은 하기에 함께 나타낸 의미들을 갖고자 하며 본 발명의 설명 및 의도된 범위를 이해하는데 유용하다.
화합물, 상기와 같은 화합물을 함유하는 약학 조성물, 및 상기와 같은 화합물 및 조성물을 사용하는 방법을 포함할 수 있는 본 발명을 개시할 때, 하기의 용어들은, 존재하는 경우, 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미를 갖는다. 또한 본 발명에 개시될 때 하기에 정의된 부분들 중 임의의 부분들은 다양한 치환체들로 치환될 수 있으며, 각각의 정의가 하기에 나타낸 바와 같은 범위내에 상기와 같은 치환된 부분들을 포함하고자 함은 물론이다. 달리 서술되지 않는 한, "치환된"이란 용어는 하기에 나타낸 바와 같이 정의되어야 한다. '기' 및 '라디칼'이란 용어는 본 발명에 사용될 때 호환 가능한 것으로 간주될 수 있음은 또한 물론이다.
'하나의'란 관사는 하나 또는 하나보다 많은(즉 하나 이상) 상기 관사의 문법적 목적어를 지칭하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 예로서 "유사체"는 하나 이상의 유사체를 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 'JAK'는 사이토킨 신호를 막 수용체로부터 STAT 전사 인자로 전달하는 세포질 타이로신 키나제인 야누스 키나제(JAK)의 과에 관한 것이다. 4 개의 JAK과 구성원, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2가 개시되며, 상기 JAK란 용어는 집합적으로 모든 JAK과 구성원 또는 문맥이 가리키는 바와 같은 JAK과 구성원들 중 하나 이상을 지칭할 수 있다.
'약학적으로 허용 가능한'은 연방 또는 주정부의 규제 당국 또는 미국 이외 국가의 상응하는 당국에 의해 승인되었거나 승인될 수 있거나, 또는 동물 및 보다 특히 인간에의 사용에 대해서 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열됨을 의미한다.
'약학적으로 허용 가능한 염'은, 약학적으로 허용 가능하며 모 화합물의 목적하는 약물 활성을 갖는 화학식 I에 따른 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 상기와 같은 염은 무독성이며 무기 또는 유기산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 상기와 같은 염은 (1) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산 등과 형성되거나; 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포르설폰산, 4-메틸바이사이클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등과 형성되는 산부가염; 또는 (2) 모 화합물 중에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나; 또는 유기 염기, 예를 들어 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 배위될 때 형성되는 염을 포함한다. 염은 또한 단지 예로서 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등을 포함하며; 상기 화합물이 염기성 작용기를 함유하는 경우, 무독성 유기 또는 무기산과의 염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이브로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말리에이트, 옥살레이트 등을 포함한다. '약학적으로 허용 가능한 양이온'이란 용어는 산성 작용기의 허용 가능한 양이온성 대이온을 지칭한다. 상기와 같은 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등에 의해 예시된다.
'약학적으로 허용 가능한 비히클'은 상기 화학식 I에 따른 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
'용매화물'은 대개 용매분해 반응에 의해 용매와 회합되는 화합물의 형태를 지칭한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 포함한다. 통상적인 용매는 물, 에탄올, 아세트산 등을 포함한다. 상기 화학식 I에 따른 화합물을, 예를 들어 결정성 형태로 제조하고 용매화시키거나 수화시킬 수 있다. 적합한 용매화물은 약학적으로 허용 가능한 용매화물, 예를 들어 수화물을 포함하며, 화학량론적 용매화물 및 비-화학량론적 용매화물 모두를 추가로 포함한다. 몇몇 상황에서 상기 용매화물은, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자가 결정성 고체의 결정 격자 중에 결합될 때 고립될 수 있을 것이다. '용매화물'은 용액상 및 고립성 용매화물 모두를 포함한다. 전형적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.
'환자'는 인간을 포함한다. '인간', '환자' 및 '피실험자'란 용어들은 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
'치료 유효량'은 질병을 치료하기 위해서 환자에게 투여될 때 상기 질병에 대한 상기와 같은 치료를 수행하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. '치료 유효량'은 상기 화합물, 질병 및 그의 중증도, 및 치료되는 환자의 연령, 체중 등에 따라 변할 수 있다.
'예방하는' 또는 '예방'은 질병 또는 질환의 초래 또는 발생 위험성의 감소(즉 상기 질병의 임상 증상 중 하나 이상이, 질병원인인자에 노출되거나 또는 질병의 개시에 앞서 상기 질병에 소인이 있을 수 있는 환자에서 발병되지 않게 함)를 지칭한다.
'예방학'이란 용어는 '방지'와 관련되며, 질병의 치료 또는 치유보다는 방지할 목적의 수단 또는 과정을 지칭한다. 예방학적 수단의 비제한적인 예는 백신의 투여; 예를 들어 부동화로 인해 혈전증의 위험이 있는 입원 환자에게 저분자량 헤파린의 투여; 및 말라리아가 풍토병이거나 또는 말라리아와 접촉할 위험성이 높은 지리학적 지역에 방문하기 전에, 클로로퀸과 같은 항말라리아제의 투여를 포함할 수 있다.
임의의 질병 또는 질환을 '치료하는' 또는 '치료'는 하나의 태양에서 상기 질병 또는 질환을 개선시킴(즉 상기 질병을 억제하거나 또는 상기 질병의 임상 증상 중 하나 이상의 발현, 정도 또는 중증도를 감소시킴)을 지칭한다. 또 다른 실시태양에서 '치료하는' 또는 '치료'는 환자에 의해 식별될 수 없을 수도 있는 하나 이상의 신체 매개변수를 개선시킴을 지칭한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, '치료하는' 또는 '치료'는 질병 또는 질환을 신체적으로(예를 들어 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어 신체 매개변수의 안정화), 또는 둘 다에 의해 조절함을 지칭한다. 추가의 실시태양에서, '치료하는' 또는 '치료'는 상기 질병의 진행을 늦춤을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 '염증 상태(들)'란 용어는 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 염증성 장 질병(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 내독소-유발된 질병 상태(예를 들어 우회술후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 원인이 되는 만성적인 내독소 상태), 및 연골 관련 질병, 예를 들어 관절의 질병을 포함한 상태 그룹을 지칭한다. 특히 상기 용어는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '자가면역 질병(들)'이란 용어는 폐쇄성 기도 질병, 예를 들어 COPD, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식 또는 유아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응성), 기관지염(기관지 천식 포함), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부 홍반성 루푸스(CLE), 다발성 경화증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 접촉 피부염 및 추가적인 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 질병 그룹을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '증식성 질병(들)'이란 용어는 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증과 같은 상태를 지칭한다. 특히 상기 용어는 암, 백혈병, 다발성 골수종 및 건선을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, '암'이란 용어는 피부 또는 신체 기관, 예를 들어 비제한적으로 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장에서 세포의 악성 또는 양성 성장을 지칭한다. 암은 인접한 조직내로 침투하고 원위 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)하는 경향이 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이 암이란 용어는 전이성 종양 세포 유형, 예를 들어 비제한적으로 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종 및 비만세포종 및 조직 암종의 유형, 예를 들어 비제한적으로 결장직장암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포종, 원발성 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁 평활근육종을 모두 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '백혈병'이란 용어는 혈액 및 혈액 형성 기관의 종양성 질병을 지칭한다. 상기와 같은 질병은 골수 및 면역계 기능이상을 유발할 수 있으며, 이는 숙주를 감염 및 출혈에 매우 민감하게 만든다. 특히 백혈병이란 용어는 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL)을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '이식 거부'란 용어는 예를 들어 췌장섬의 세포, 조직 또는 고형 기관 동종- 또는 이종이식편, 줄기세포, 골수, 피부, 근육, 각막 조직, 신경 조직, 심장, 폐, 복합 심장-폐, 신장, 간, 장, 췌장, 기관 또는 식도의 급성 또는 만성 거부, 또는 이식편대 숙주병을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, '연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병'이란 용어는 골관절염, 건선성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 패혈성 또는 감염성 관절염, 반응성 관절염, 교감신경성 이영양증, 발육이상, 티체 증후군 또는 늑골 연골염, 섬유근육통, 골연골염, 신경 또는 신경병성 관절염, 관절증, 풍토성 변형 골관절염과 같은 관절염의 풍토성 형태, 므셀레니병 및 한디고두병; 섬유근육통, 전신 홍반성 루푸스, 피부경화증 및 강직성척추염으로부터 발생하는 퇴행과 같은 상태를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '선천성 연골 기형(들)'이란 용어는 유전성 연골용해, 연골이형성증 및 의사연골이형성증, 특히 비제한적으로 소이증, 무이증, 골간단 연골이형성증, 및 관련 질환과 같은 상태를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 'IL6의 분비과잉과 관련된 질병(들)'이란 용어는 캐슬만병, 다발성 골수종, 건선, 카포시 육종 및/또는 혈관사이세포 증식성 사구체신염과 같은 상태를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '인터페론의 분비과잉과 관련된 질병(들)'이란 용어는 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선, 류마티스성 관절염과 같은 상태를 포함한다.
'본 발명의 화합물' 및 등가의 표현은 본 발명에서 이전에 개시된 바와 같은 화학식 I 또는 II(문맥상 가리키는 바와 같은)에 따른 화합물을 포함함을 의미하며, 상기 표현은 약학적으로 허용 가능한 염, 및 용매화물, 예를 들어 수화물, 및 문맥상 허용되는 경우 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물을 포함한다. 유사하게, 중간체에 대한 언급은 상기 자체가 청구되는 여부와 관계없이, 문맥상 허용되는 경우 그의 염 및 용매화물을 포함함을 의미한다.
본 발명 화합물의 다른 유도체들은 그의 산 및 산 유도체 형태 모두에서 활성을 갖지만, 산 민감성 형태에서 종종 포유동물 유기체에서의 용해도, 조직 적합성 또는 지연된 방출의 이점을 제공한다(문헌[Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985]을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같이, '동위원소 변체'란 용어는 화합물을 구성하는 원자들 중 하나 이상에서 동위원소의 비천연 비율을 함유하는 상기 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 화합물의 '동위원소 변체'는 하나 이상의 비-방사성 동위원소, 예를 들어 중수소(2H 또는 D), 탄소-13(13C), 질소-15(15N) 등을 함유할 수 있다. 상기와 같은 동위원소 치환이 이루어진 화합물에서, 다음의 원자들(존재하는 경우)은, 예를 들어 임의의 수소가 2H/D이거나, 임의의 탄소가 13C이거나, 또는 임의의 질소가 15N일 수 있도록 변할 수 있으며 상기와 같은 원자의 존재 및 배치는 당해 분야의 기술내에서 결정될 수 있음을 알 것이다. 마찬가지로, 본 발명은, 예를 들어 생성되는 화합물을 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 사용할 수 있는 경우, 방사성 동위원소를 갖는 동위원소 변체의 제조를 포함할 수 있다. 방사성 동위원소 삼중수소, 즉 3H 및 탄소-14, 즉 14C가 그들의 결합 용이성 및 즉시 검출 수단에 비추어 상기 목적에 특히 유용하다. 더욱이, 양전자 방출 동위원소, 예를 들어 11C, 18F, 15O 및 13N으로 치환된 화합물을 제조할 수 있으며, 이들은 기질 수용체 점유를 검사하기 위한 양전자 단층 촬영(PET)에 유용할 것이다.
본 발명에 제공된 화합물의 모든 동위원소 변체는 방사성이든 아니든 본 발명의 범위내에 포함하고자 한다.
'토오토머'는 특정 화합물 구조의 호환가능한 형태이고 수소 원자 및 전자의 배치가 변하는 화합물을 지칭한다. 따라서, 2 개의 구조는 π 전자 및 원자(대개는 H)의 이동을 통해 평형을 이룰 수 있다. 예를 들어, 에놀 및 케톤은 산이나 염기에 의한 처리에 의해 신속하게 상호전환되므로 토오토머이다. 토오토머화의 또 다른 예는 페닐나이트로메탄의 산- 및 질소-형태이며, 이들은 마찬가지로 산 또는 염기에 의한 처리에 의해 형성된다.
토오토머성 형태들은 관심 화합물의 최적의 화학 반응성 및 생물 활성의 획득에 적합할 수 있다.
발명
본 발명은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물이 약제로서 유용할 수 있다는 발견을 기본으로 한다. 특정한 태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 JAK, 및 보다 특히 JAK1의 억제제이다.
본 발명은 또한 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 제조 방법, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함에 의한 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물을 약물에 사용하기 위해 제공한다:
화학식 I
Figure 112015005936003-pct00002
본 발명의 또 다른 실시태양에서, JAK 억제제인 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물을 약물에 사용하기 위해 제공한다:
화학식 I
Figure 112015005936003-pct00003
상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 놀랍게도 인간에서 다른 동물종들과 매우 상이한 생체내 프로파일을 나타내며, 이는 시험관내 예견과 대비된다. 실제로, 생체내에서, 인간에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 겉보기 말단 반감기는 다른 동물종에서보다 3 배 이상까지 현저하게 더 긴 것으로 나타났다. 이는 인간에서 축적을 일으켜 연장된 기간에 걸쳐 유지되는 치료 효과를 생성시키며, 이에 의해 매일 1 회 내지 매주 1 회 투여를 허용한다. 따라서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 낮은 횟수 투여 섭생 및/또는 증가된 환자 순응을 포함한 이점을 제공할 수 있다. 특히, 상기 환자가 용량을 빠뜨린 경우, 비-준수의 영향을 감소시킬 수도 있다.
하나의 실시태양에서 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 동위원소 변체가 아니다.
하나의 태양에서 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 유리 염기로서 존재한다.
하나의 태양에서 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염이다.
하나의 태양에서 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 용매화물이다.
하나의 태양에서 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물이다.
상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 JAK의 억제제이다. 특히 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 JAK1의 효능있는 억제제이나, JAK2, JAK3 및 TYK2를 보다 낮은 효능으로 억제할 수도 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물, 및 약학 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
더욱 추가의 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 추가의 치료제를 또한 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 다른 화합물은 관절염 치료용 화합물이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 다른 화합물은 류마티스성 관절염 치료용 화합물이다. 가장 특정한 실시태양에서, 상기 추가의 치료제는 하기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물이다:
화학식 II
Figure 112015005936003-pct00004
약학 조성물
상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 약제로서 사용될 때 전형적으로는 약학 조성물의 형태로 투여된다. 상기와 같은 조성물을 제약 분야에 널리 공지된 방식으로 제조할 수 있으며 상기 조성물은 하나 이상의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물을 포함한다. 일반적으로, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 실제로 투여되는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 양은 전형적으로 치료하려는 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 상기 환자 증상의 중증도 등을 포함하여, 관련 상황에 비추어 의사에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 약학 조성물을 다양한 경로들, 예를 들어 경구, 직장, 경피, 피하, 동맥내, 정맥내, 근육내, 및 비내에 의해 투여할 수 있다. 의도하는 전달 경로에 따라, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 바람직하게는 주사성 또는 경구 조성물로서, 또는 경피 투여를 위해 연고로서, 로션으로서 또는 패치로서 제형화한다.
경구 투여용 조성물은 벌크 액체 용액 또는 현탁액, 또는 벌크 분말의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 보다 통상적으로 상기 조성물은 정확한 투약을 용이하게 하기 위해서 단위 투여형으로 제공된다. '단위 투여형'이란 용어는 인간 환자 및 다른 포유동물에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 적합한 약학 부형제, 비히클 또는 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다. 전형적인 단위 투여형은 액체 조성물의 미리 충전되거나, 미리 측정된 앰풀 또는 주사기 또는 고체 조성물의 경우에 환제, 정제, 캡슐 등을 포함한다. 상기와 같은 조성물에서, 본 발명의 화합물은 대개 소량 성분(약 0.1 내지 약 50 중량% 또는 바람직하게는 약 1 내지 약 40 중량%)이며, 나머지는 다양한 비히클 또는 담체 및 목적하는 투여형의 형성에 도움이 되는 가공 보조제이다.
경구 투여용으로 적합한 액체 형태는 완충제, 현탁 및 분배제, 착색제, 풍미제 등과 함께 적합한 수성 또는 비수성 비히클을 포함할 수 있다. 고체 형태는 예를 들어 하기의 성분들 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모젤, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 활주제, 예를 들어 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향.
주사성 조성물은 전형적으로는 주사성 멸균 염수 또는 포스페이트-완충된 염수 또는 당해 분야에 공지된 다른 주사성 담체를 기본으로 한다. 이전과 같이, 상기와 같은 조성물 중의 활성 화합물은 전형적으로는 소량 성분(종종 약 0.05 내지 10 중량%)이며, 나머지는 주사성 담체 등이다.
경피 조성물을 전형적으로는 상기 활성 성분(들)을 일반적으로 약 0.01 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량% 범위의 양으로 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 제형화한다. 연고로서 제형화 시, 상기 활성 성분을 전형적으로는 파라핀성 또는 수-혼화성 연고 베이스와 배합할 것이다. 한편으로, 상기 활성 성분을 예를 들어 수중 유적형 크림 베이스와 함께 크림으로 제형화할 수도 있다. 상기와 같은 경피 제형은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 일반적으로는 상기 활성 성분 또는 상기 제형의 피부 침투 안정성을 증대시키기 위해서 추가적인 성분들을 포함한다. 모든 상기와 같은 공지된 경피 제형 및 성분들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 화합물을 또한 경피 장치에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 경피 투여를 수용조 또는 다공성 막 유형, 또는 고체 기질 잡동사니의 패치를 사용하여 수행할 수 있다.
경구 투여성, 주사성 또는 국소 투여성 조성물에 대한 상술한 성분들은 단지 예시적인 것이다. 다른 물질들뿐만 아니라 가공 기법 등이 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Part 8 of Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 나열되어 있다.
본 발명의 화합물을 또한 서방성 형태로 또는 서방성 약물 전달 시스템으로부터 투여할 수 있다. 전형적인 서방성 물질에 대한 명세를 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.
하기의 제형예들은 본 발명에 따라 제조될 수 있는 전형적인 약학 조성물들을 예시한다. 그러나, 본 발명을 하기의 약학 조성물들로 제한하지 않는다.
제형 1 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:2 중량비로 건조 젤라틴 결합제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가할 수도 있다. 상기 혼합물을 정제 프레스에서 240 내지 270 ㎎ 정제(정제당 80 내지 90 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물)로 형성시킬 수 있다.
제형 2 - 캡슐
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:1 중량비로 전분 희석제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 상기 혼합물을 250 ㎎ 캡슐에 충전할 수 있다(캡슐당 125 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물).
제형 3 - 액체
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(125 ㎎)을 슈크로스(1.75 g) 및 잔탄 검(4 ㎎)과 혼합하고, 생성된 혼합물을 블렌딩하고, 10번 메쉬 U.S. 체에 통과시키고, 이어서 앞서 제조된 미정질 셀룰로스와 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(11:89, 50 ㎎)의 수중 용액과 혼합할 수 있다. 나트륨 벤조에이트(10 ㎎), 풍미제 및 착색제를 물로 희석하고, 교반하면서 첨가할 수도 있다. 이어서 충분한 물을 교반하면서 가할 수 있다. 이어서 충분한 물을 가하여 총 5 ㎖의 부피를 생성시킬 수 있다.
제형 4 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:2 중량비로 건조 젤라틴 결합제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가할 수 있다. 상기 혼합물을 정제 프레스에서 450 내지 900 ㎎ 정제(150 내지 300 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물)로 형성시킨다.
제형 5 - 주사액
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 5 ㎎/㎖의 농도로 완충된 멸균 염수 주사성 수성 매질에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
제형 6 - 국소용
스테아릴 알콜(250 g) 및 백색 바셀린(250 g)을 약 75 ℃에서 용융시키고 이어서 수(약 370 g) 중에 용해된 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(50 g), 메틸파라벤(0.25 g), 프로필파라벤(0.15 g), 나트륨 라우릴 설페이트(10 g), 및 프로필렌 글리콜(120 g)의 혼합물을 가하고, 생성되는 혼합물을 응결시까지 교반할 수 있다.
치료 방법
하나의 실시태양에서, 본 발명은 약물에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물, 및 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 다른 치료제는 관절염 치료제이다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 다른 치료제는 류마티스성 관절염 치료제이다. 가장 특정한 실시태양에서, 상기 다른 치료제는 화학식 II에 따른 화합물이다.
추가적인 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 염증 상태에 민감하거나 또는 상기 상태가 침범한 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 염증 상태는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염) 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 염증 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 염증 상태는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 염증 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 염증 상태는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염) 중에서 선택된다.
치료 방법의 태양에서, 본 발명은 알러지 반응에 민감하거나 또는 상기 반응이 침범한 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 알러지성 기도 질병, 부비강염, 습진 및/또는 두드러기, 식품 알러지 또는 곤충독에 대한 알러지의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 알러지 반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 알러지성 기도 질병, 부비강염, 습진 및/또는 두드러기, 식품 알러지 또는 곤충독에 대한 알러지의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 알러지 반응의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 알러지성 기도 질병, 부비강염, 습진 및/또는 두드러기, 식품 알러지 또는 곤충독에 대한 알러지의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 자가면역 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염) 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다. 더욱 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, 자가면역 질병은 류마티스성 관절염 또는 건선성 관절염이다. 더욱 추가의 특정한 실시태양에서, 자가면역 질병은 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염)이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 자가면역 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염) 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다. 더욱 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, 자가면역 질병은 류마티스성 관절염 또는 건선성 관절염이다. 더욱 추가의 특정한 실시태양에서, 자가면역 질병은 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염)이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 자가면역 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염) 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스이다. 더욱 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, 자가면역 질병은 류마티스성 관절염 또는 건선성 관절염이다. 더욱 추가의 특정한 실시태양에서, 자가면역 질병은 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염)이다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 증식성 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 피부 T-세포 림프종, 유방암, 백혈병(예를 들어 AML, ALL 또는 CLL), 다발성 골수종 및/또는 건선이다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 건선이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 증식성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 피부 T-세포 림프종, 유방암, 백혈병(예를 들어 AML, ALL 또는 CLL), 다발성 골수종 및/또는 건선이다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 건선이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 증식성 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 피부 T-세포 림프종, 유방암, 백혈병(예를 들어 AML, ALL 또는 CLL), 다발성 골수종 및/또는 건선이다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 건선이다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 이식 거부에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식 거부의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 이식 거부의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식 거부의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 이식 거부의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식 거부의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
치료 방법의 태양에서, 본 발명은 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 선천성 연골 기형의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 선천성 연골 기형의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 IL6의 분비과잉과 관련된 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 IL6의 분비과잉과 관련된 질병은 캐슬만병 및 혈관사이세포 증식성 사구체신염 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 IL6의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 IL6의 분비과잉과 관련된 질병은 캐슬만병 및 혈관사이세포 증식성 사구체신염 중에서 선택된다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 상태의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병은 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선 및 류마티스성 관절염 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병은 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선 및 류마티스성 관절염 중에서 선택된다.
본 발명의 방법의 특정한 섭생은 염증, 특히 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및/또는 염증성 장 질병을 수반하는 질병을 앓고 있는 환자에게, 상기 환자에서 상기 염증의 수준을 감소시키고, 바람직하게는 상기 염증의 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시태양은 류마티스성 관절염을 앓고 있거나 상기 관절염의 발병에 민감한 피실험 환자에게, 상기 환자의 관절에서 염증을 각각 감소시키거나 예방하고, 바람직하게는 상기 염증의 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 방법의 추가의 특정한 섭생은 연골 또는 관절 변성을 특징으로 하는 질병 또는 상태(예를 들어 류마티스성 관절염 및/또는 골관절염)를 특징으로 하는 질병 또는 상태를 앓고 있는 환자에게, 상기 변성을 감소시키고, 바람직하게는 상기 변성의 저절로 계속되는 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시태양은 골관절염을 앓고 있거나 상기 관절염의 발병에 민감한 피실험 환자에게, 상기 환자의 관절에서 연골 변성을 각각 감소시키거나 예방하고, 바람직하게는 상기 변성의 저절로 계속되는 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 치료 유효량의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 연골 동화 및/또는 이화-억제 성질을 나타낼 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 제공하며, 여기에서 상기 화합물을 매일 1 내지 4 회의 규칙적인 용량 및 특히 매일 1 내지 3 회의 규칙적인 용량, 전형적으로 매일 1 내지 2 회의 규칙적인 용량, 및 가장 전형적으로는 매일 하나의 규칙적인 용량으로 투여한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 제공하며, 여기에서 상기 화합물을 2-주 기간 동안 1 내지 13 회의 규칙적인 용량으로 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 화합물을 2 주 기간 동안 1 내지 12 회, 1 내지 10 회 또는 2 내지 7 회의 규칙적인 용량을 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 매주 1 회 기준으로 투여한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물을 제공하며, 여기에서 상기 화합물을 2-주 기간 동안 1 내지 13 회의 규칙적인 용량으로 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 II에 따른 화합물을 2 주 기간 동안 1 내지 12 회, 1 내지 10 회 또는 2 내지 7 회의 규칙적인 용량을 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물을 매주 1 회 기준으로 투여한다.
더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 및 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물의 조합을 제공하며, 여기에서 상기 화합물을 매일 1 내지 4 회의 규칙적인 용량 및 특히 매일 1 내지 3 회의 규칙적인 용량, 전형적으로 매일 1 내지 2 회의 규칙적인 용량, 및 가장 전형적으로는 매일 하나의 규칙적인 용량으로 투여한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 염증 상태, 자가면역 질병, 증식성 질병, 알러지, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병, 특히 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 및 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물의 조합을 제공하며, 여기에서 상기 화합물을 2-주 기간 동안 1 내지 13 회의 규칙적인 용량으로 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 및 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물의 조합을 2 주 기간 동안 1 내지 12 회, 1 내지 10 회 또는 2 내지 7 회의 규칙적인 용량을 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 및 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물의 조합을 매주 1 회 기준으로 투여한다.
주사 용량 수준은 모두 약 1 내지 약 120 시간 및 특히 24 내지 96 시간 동안 약 0.1 ㎎/㎏/h 내지 적어도 10 ㎎/㎏/h의 범위이다. 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 이상의 프리로딩 일시주사를 또한 투여하여 적합한 정상 상태 수준을 성취할 수 있다. 최대 총 용량은 40 내지 80 ㎏ 인간 환자의 경우 약 1 g/일을 초과하지 않을 것으로 예상된다.
장기적인 상태, 예를 들어 퇴행 상태의 예방 및/또는 치료를 위해서, 상기 치료 섭생을 대개는 수개월 또는 수년에 걸쳐 늘릴 수 있으며 따라서 경구 투여가 환자의 편의성 및 허용성을 위해 바람직하다. 경구 투여의 경우, 매일 1 내지 4 회의 규칙적인 용량, 특히 매일 1 내지 3 회의 규칙적인 용량, 전형적으로 매일 1 내지 2 회의 규칙적인 용량, 및 가장 전형적으로 매일 1 회의 규칙적인 용량이 전형적인 섭생이다. 한편으로 오래 지속되는 유효 약물의 경우, 경구 투여시, 2주마다 1 회, 매주 1회, 및 하루에 1회가 전형적인 섭생이다. 특히 투여 섭생은 매 1 내지 14일마다, 보다 특히 1 내지 10일마다, 훨씬 더 특히 1 내지 7일마다, 및 가장 특히 1 내지 3일마다일 수 있다.
이러한 투여 패턴을 사용하는 경우, 각각의 용량은 약 1 내지 약 1000 ㎎의 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 제공하며, 특히 각각의 용량은 약 10 내지 약 500 ㎎ 및 특히 약 30 내지 약 250 ㎎을 제공한다.
이러한 투여 패턴을 사용하는 경우, 각각의 용량은 약 1 내지 약 1000 ㎎의 상기 화학식 II에 따른 본 발명의 화합물을 제공하며, 특히 각각의 용량은 약 10 내지 약 500 ㎎ 및 특히 약 30 내지 약 250 ㎎을 제공한다.
경피 용량은 일반적으로 주사 용량을 사용하여 성취되는 경우와 유사하거나 이보다 낮은 혈액 수준을 제공하도록 선택된다.
상태의 발병을 예방하기 위해 사용될 때, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 상기 상태의 발병 위험이 있는 환자에게, 전형적으로는 의사의 권고 및 관리 하에 상술한 투여량 수준으로 투여할 것이다. 특정 상태의 발병 위험이 있는 환자는 일반적으로 상기 상태의 가족력이 있는 환자, 또는 상기 상태의 발병에 특히 민감한 것으로 유전자 시험 또는 선별에 의해 확인된 환자를 포함한다.
상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 단독 활성제로서 투여하거나 또는 다른 치료제, 예를 들어 동일하거나 유사한 치료 활성을 나타내고 복합 투여에 안전하고 효능있는 것으로 측정된 본 발명의 다른 화합물과 함께 투여할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 2 개(또는 그 이상)의 작용제의 동시 투여는 사용되는 각 작용제의 현저하게 더 낮은 용량을 허용하여, 나타나는 부작용을 감소시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 약제로서 투여한다. 특정한 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 추가의 활성 성분을 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 염증을 수반하는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 면역조절제, 예를 들어 아자티오프린, 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론 또는 덱사메타손), 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 뮤로모냅-CD3(OKT3, 예를 들어 오쏘콜론(Orthocolone)(등록상표)), ATG, 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센, 및 피록시캄을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 관절염(예를 들어 류마티스성 관절염)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 진통제, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 스테로이드, 합성 DMARDS(예를 들어 비제한적으로 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 오라노핀, 나트륨 오로티오말레이트, 페니실라민, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 토파시티니브, 바리시티니브, 포스타마티니브, 및 사이클로스포린), 및 생물학적 DMARDS(예를 들어 비제한적으로 인플릭시맵, 에타너셉트, 아달리뮤맵, 리툭시맵 및 아바타셉트)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 증식성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프레드니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오로유라실, 패클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜, 메제스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단클론 항체(예를 들어 허셉틴(상표)), 카페시타빈, 랄록시펜 하이드로클로라이드, EGFR 억제제(예를 들어 이레사(등록상표), 타세바(상표), 에르비툭스(상표)), VEGF 억제제(예를 들어 아바스틴(상표)), 프로테오솜 억제제(예를 들어 벨케이드(상표)), 글리벡(등록상표) 및 hsp90 억제제(예를 들어 17-AAG)를 포함한다. 또한, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 다른 요법, 예를 들어 비제한적으로 방사선요법 또는 수술과 함께 투여할 수도 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질환은 암, 골수증식성 질병 및 백혈병 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 글루코코르티코이드, 세포성장억제제(예를 들어 퓨린 유사체), 알킬화제(예를 들어 질소 머스터드(사이클로포스파미드), 니트로소유레아, 본 발명의 백금 화합물 등), 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 머캅토퓨린), 세포독성 항생제(예를 들어 닥티노마이신 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 및 미트라마이신), 항체(예를 들어 항-CD20, 항-CD25 또는 항-CD3(OTK3) 단클론 항체, 아트감(등록상표) 및 티모글로뷸린(등록상표)), 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신(시로리무스), 인터페론(예를 들어 IFN-β), TNF 결합 단백질(예를 들어 인플릭시맵, 에타너셉트, 또는 아달리뮤맵), 마이코페놀레이트, 핑고리모드 및 미리오신을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 칼시뉴린 억제제(예를 들어 사이클로스포린 또는 타크로리무스(FK506)), mTOR 억제제(예를 들어 시로리무스, 에베로리무스), 증식억제제(예를 들어 아자티오프린, 마이코페놀산), 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론, 하이드로코르티손), 항체(예를 들어 단클론 항-IL-2Rα 수용체 항체, 바실릭시맵, 다클리주맵), 다클론 항-T-세포 항체(예를 들어 항-흉선세포 글로불린(ATG), 항-림프구 글로불린(ALG))를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 비염 및/또는 COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 베타2-아드레날린수용체 작용물질(예를 들어 살부타몰, 레발뷰테롤, 터부탈린 및 비톨테롤), 에피네프린(흡입 또는 정제), 항콜린제(예를 들어 이프라트로피움 브로마이드), 글루코코르티코이드(경구 또는 흡입) 장기간-작용성 β2-작용물질(예를 들어 살메테롤, 포모테롤, 밤부테롤, 및 서방성 경구 알부테롤), 흡입 스테로이드 및 장기간 작용성 기관지확장제의 조합(예를 들어 플루티카손/살메테롤, 부데소니드/포모테롤), 류코트리엔 길항물질 및 합성 억제제(예를 들어 몬테류카스트, 자피르류카스트 및 질류톤), 매개체 방출 억제제(예를 들어 크로모글리케이트 및 케토티펜), IgE 반응의 생물학적 조절제(예를 들어 오말리주맵), 항히스타민제(예를 들어 세테리진, 신나리진, 펙소페나딘) 및 혈관수축제(예를 들어 옥시메타졸린, 자일로메타졸린, 나파졸린 및 트라마졸린)를 포함한다.
또한, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 COPD에 대한 응급요법과 함께 투여할 수 있으며, 상기와 같은 요법은 산소 또는 헬리옥스 투여, 분무되는 살부타몰 또는 터부탈린(항콜린제(예를 들어 이프라트로피움)와 임의로 병용되는), 전신 스테로이드(경구 또는 정맥내, 예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손), 정맥내 살부타몰, 주사 또는 흡입되는 비-특이성 베타-작용물질(예를 들어 에피네프린, 아이소에타린, 아이소프로테레놀, 메타프로테레놀), 항콜린제(IV 또는 분무되는, 예를 들어 글리코피롤레이트, 아트로핀, 이프라트로피움), 메틸잔틴(테오필린, 아미노필린, 바미필린), 기관지확장 효과를 갖는 흡입 마취제(예를 들어 아이소플루란, 할로탄, 엔플루란), 케타민 및 정맥내 마그네슘 설페이트를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 염증성 장 질병(IBD)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 부데소니드) 합성적 질병 변경, 면역조절제(예를 들어 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 메살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린 및 사이클로스포린) 및 생물학적 질병 변경, 면역조절제(인플릭시맵, 아달리뮤맵, 리툭시맵 및 아바타셉트)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 SLE의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 질병-변경 류마티스 억제 약물(DMARD), 예를 들어 항말라리아제(예를 들어 플라퀘닐, 하이드록시클로로퀸), 면역억제제(예를 들어 메토트렉세이트 및 아자티오프린), 사이클로포스파미드 및 마이코페놀산; 면역억제성 약물 및 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 오피에이트(예를 들어 덱스트로프로폭시펜 및 코-코다몰), 오피오이드(예를 들어 하이드로코돈, 옥시코돈, MS 콘틴 또는 메타돈) 및 펜타닐 듀라제식 경피 패치를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 건선의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 국소 치료제, 예를 들어 입욕액, 보습제, 콜타르를 함유하는 약물첨가 크림 및 연고, 다이트라놀(안트랄린), 데속시메타손(토피코트(상표))과 같은 코르티코스테로이드, 플루시노니드, 비타민 D3 유사체(예를 들어 칼시포트리올), 아르간 오일 및 레티노이드(에트레티네이트, 아시트레틴, 타자로텐), 전신 치료제, 예를 들어 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 레티노이드, 티오구아닌, 하이드록시유레아, 설파살라진, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크로리무스, 퓨마르산 에스터 또는 생물제, 예를 들어 아메바이브(상표), 엔브렐(상표), 휴미라(상표), 레미케이드(상표), 랩티바(상표) 및 유스테키뉴맵(IL-12 및 IL-23 차단제)을 포함한다. 또한, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 다른 요법, 예를 들어 비제한적으로 광선요법, 또는 광화학요법(예를 들어 프소랄렌 및 자외선 A 광선요법(PUVA))과 함께 투여할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 알러지 반응의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정한 작용제는 비제한적으로 항히스타민제(예를 들어 세티리진, 다이펜하이드라민, 펙소페나딘, 레보세티리진), 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 베타메타손, 베클로메타손, 덱사메타손), 에피네프린, 테오필린 또는 항-류코트리엔(예를 들어 몬테류카스트 또는 자피르류카스트), 항-콜린제 및 충혈완화제를 포함한다.
동시 투여는 숙련가에게 자명한 바와 같이 2 개 이상의 치료제를 동일한 치료 섭생의 부분으로서 환자에게 전달하는 임의의 수단을 포함한다. 2 개 이상의 작용제를 단일 제형으로 동시에 투여할 수도 있지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 상기 작용제를 상이한 제형으로 상이한 시점에서 투여할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 및 상기 화학식 II에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 화학식 I/화학식 II에 따른 본 발명의 화합물의 비는 1/5 내지 1/20이다. 특정 실시태양에서, 상기 비는 1/5 내지 1/10이다.
일반적인 합성 과정
일반적인 내용
상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 하기의 일반적인 방법 및 과정을 사용하여 쉽게 입수할 수 있는 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 전형적이거나 바람직한 공정 조건(즉 반응 온도, 시간, 반응물들의 몰비, 용매, 압력 등)이 주어지는 경우, 달리 나타내지 않는 한 다른 공정 조건들을 또한 사용할 수 있음을 알 것이다. 최적의 반응 조건은 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 변할 수 있지만, 상기와 같은 조건들은 통상적인 최적화 과정에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
추가로, 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 몇몇 작용기들이 바람직하지 못한 반응을 겪지 않도록 하기 위해서 통상적인 보호기가 필요할 수 있다. 특정 작용기에 적합한 보호기뿐만 아니라 보호 및 탈보호에 적합한 조건의 선택은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 다수의 보호기 및 그의 도입 및 제거가 문헌[T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991] 및 상기 문헌 중에 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다.
하기의 방법들을 상기에 정의된 바와 같은 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물의 제조 및 비교예에 관한 상세한 내용과 함께 제공한다. 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 유기 합성 분야의 숙련가에 의해 공지되거나 상업적으로 입수할 수 있는 출발 물질 및 시약으로부터 제조할 수 있다.
모든 시약들은 상업적인 등급의 것들이었으며 달리 나타내지 않는 한 추가의 정제 없이 제공받은 대로 사용되었다. 상업적으로 입수할 수 있는 무수 용매를 불활성 분위기 하에서 수행된 반응들에 사용하였다. 달리 나타내지 않는 한 다른 모든 경우는 시약 등급 용매가 사용되었다. 컬럼 크로마토그래피를 실리카젤 60(35 내지 70 ㎛) 상에서 수행하였다. 박층 크로마토그래피를 사전-코팅된 실리카젤 F-254 플레이트(두께 0.25 ㎜)를 사용하여 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼은 브룩커(Bruker) DPX 400 NMR 분광계(400 MHz) 상에 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼에 대한 화학 이동(δ)은 내부 기준으로서 테트라메틸실란(δ 0.00) 또는 적합한 잔류 용매 피크, 즉 CHCl3(δ 7.27)에 대한 백만당 부(ppm)로 보고된다. 다중도는 단일선(s), 이중선(d), 삼중선(t), 사중선(q), 다중선(m) 및 브로드(br)로서 제공된다. 결합 상수(J)를 Hz로 제공한다. 전기분무 MS 스펙트럼을 마이크로매스 플랫폼 LC/MS 분광계 상에서 획득하였다. LCMS 분석에 사용된 컬럼들: 하이크롬(Hichrom), 크로마실 이터니티(Kromasil Eternity), 2.5μm C18, 150 x 4.6mm, 워터스 엑스브리지(Waters Xbridge) 5μm C18 (2), 250 x 4.6mm (ref 86003117), 워터스 엑스테라(Waters Xterra) MS 5μm C18, 100 x 4.6mm (플러스 가드 카트리지(Plus guard cartridge)) (ref 186000486), 제미니(Gemini)-NX 3 μm C18 100 x 3.0 mm (ref 00D-4453-Y0), 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 5μm C18 (2), 100 x 4.6mm. (플러스 가드 카트리지) (ref 00D-4252-E0), 키네틱스(Kinetix) 융합된 코어 2.7μm C18 100 x 4.6 mm (ref 00D-4462-E0), 슈펠코(Supelco), 아센티스(등록상표) 익스프레스(Ascentis Express) C18 (ref 53829-U), 또는 하이크롬 할로(Halo) C18, 2.7μm C18, 150 x 4.6mm (ref 92814-702). LC-MS는 UV 검출기 워터스 2996이 구비된, HPLC 워터스 2795에 결합된 워터스 마이크로매스 ZQ 상에 기록되었다. LC는 또한 UV 검출기 에이질런트 G1315A에 결합된 HPLC 에이질런트 1100상에서 실행되었다. 예비 HPLC: 워터스 엑스브리지 프렙(XBridge Prep) C18 5 ㎛ ODB 29 ㎜ ID x 100 ㎜ L(부품 번호 186002978). 상기 방법들은 모두 MeCN/H2O 구배를 사용한다. H2O는 0.1% TFA 또는 0.1% NH3를 함유한다.
하기는 실험 부분에 사용된 약어들의 목록이다:
Figure 112015005936003-pct00005
본 발명의 화합물의 합성적 제조
실시예 1. 화합물의 합성
1.1. 경로 1
1.1.1. 5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일아민(중간체 3)의 합성
Figure 112015005936003-pct00006
1.1.1.1. 1-(6-브로모-피리딘-2-일)-3-카보에톡시-티오유레아(2)
5 ℃로 냉각시킨 DCM(2.5 L) 중의 2-아미노-6-브로모피리딘(1)(253.8 g, 1.467 mol)의 용액에 에톡시카보닐 아이소티오시아네이트(173.0 ㎖, 1.467 mol)를 15 분에 걸쳐 적가하였다. 이어서 상기 반응 혼합물을 실온(20 ℃)으로 가온하고 16 시간 동안 교반하였다. 진공 하에서 증발시켜 고체를 제공하고 이를 여과에 의해 수거하였으며, 가솔린(3 x 600 ㎖)으로 철저히 세척하고 공기 건조시켜 (2)를 제공하였다. 상기 티오유레아를 임의의 정제 없이 다음 단계에 그대로 사용하였다.
1H (400 MHz, CDCl3) δ 12.03 (1H, br s, NH), 8.81 (1H, d, J 7.8 Hz, H-3), 8.15 (1H, br s, NH), 7.60 (1H, t, J 8.0 Hz, H-4), 7.32 (1H, dd, J 7.7 및 0.6 Hz, H-5), 4.31 (2H, q, J 7.1 Hz, CH2), 1.35 (3H, t, J 7.1 Hz, CH3).
1.1.1.2. 5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일아민(3)
EtOH/MeOH(1:1, 900 ㎖) 중의 하이드록실아민 하이드로클로라이드(101.8 g, 1.465 mol)의 현탁액에 N,N-다이아이소프로필에틸아민(145.3 ㎖, 0.879 mol)을 가하고 상기 혼합물을 실온(20 ℃)에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서 1-(6-브로모-피리딘-2-일)-3-카보에톡시-티오유레아(2)(89.0 g, 0.293 mol)를 가하고 상기 혼합물을 서서히 가열 환류시켰다(주: 방출된 H2S를 급냉시키기 위해서 표백제 스크러버가 필요하였다). 환류 하에서 3 시간 후에, 상기 혼합물을 냉각시키고 여과하여 침전된 고체를 수거하였다. 상기 여액을 진공 하에서 증발시키고, H2O(250 ㎖)를 가하고 여과하여 추가의 생성물을 수거하였다. 합한 고체를 H2O(250 ㎖), EtOH/MeOH(1:1, 250 ㎖) 및 Et2O(250 ㎖)로 연속적으로 세척하고, 이어서 진공 하에서 건조시켜 고체로서 트라이아졸로피리딘 유도체(3)를 제공하였다. 상기 화합물을 임의의 정제 없이 다음 단계에 그대로 사용하였다.
1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.43-7.34 (2H, m, 2 x 방향족-H), 7.24 (1H, dd, J 6.8 및 1.8 Hz, 방향족-H), 6.30 (2H, br, NH2); m/z 213/215 (1:1, M+H+, 100%).
1.1.2. 4-[4-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보로란-2-일)-벤질]-티오모폴린-1,1-다이옥사이드(중간체 4)의 합성
Figure 112015005936003-pct00007
2-(4-브로모메틸-페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보로란(1 당량) 및 DIPEA(2 당량)를 N2 하에서 DCM/MeOH(5:1 v:v)에 용해시키고 티오모폴린 1,1-다이옥사이드(2 당량)를 나누어 가하였다. 생성 용액을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 이 시간 후에, 상기 반응이 완료되었다. 용매를 증발시켰다. 상기 화합물을 EtOAc 및 물로 추출하고, 염수로 세척하고 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기층을 여과하고 증발시켰다. 최종 화합물을 추가의 정제 없이 단리하였다.
1.1.3. 5-[4-(1,1-다이옥소티오모폴린-4-일메틸)-페닐]-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일아민(화학식 I)의 합성
Figure 112015005936003-pct00008
4-[4-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보로란-2-일)-벤질]-티오모폴린-1,1-다이옥사이드(1.1 당량)를 5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일아민(4:1)의 용액에 가하였다. K2CO3(2 당량) 및 PdCl2dppf(0.03 당량)를 상기 용액에 가하였다. 이어서 생성 혼합물을 N2 하에 90 ℃에서 16 시간 동안 오일 욕에서 가열하였다. 물을 가하고 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO4 상에서 건조시키고 진공 하에서 증발시켰다. 최종 화합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제후 수득하였다.
1H (400 MHz, CDCl3) δ 7.94-7.92 (d, 2H), 7.52-7.48 (m, 3H), 7.37-7.34 (m, 1H), 7.02-7.00 (m, 1H), 6.00 (d, 2H), 3.76 (d, 2H), 3.15-3.13 (m, 4H), 2.93-2.91 (m, 4H).
m/z 358.2 (M+H+, 100%).
1.2. 경로 2
1.2.1. 사이클로프로판카복실산 {5-[4-(1,1-다이옥소-티오모폴린-4-일메틸)-페닐]-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일}-아미드(화학식 II)
화학식 II에 따른 화합물을 WO 2010/149769에 개시된 과정에 따라 합성할 수 있다.
1.2.2. 5-[4-(1,1-다이옥소티오모폴린-4-일메틸)-페닐]-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일아민(화학식 I)의 합성
상기 화학식 I에 따른 화합물을 또한 하기 화학식 II에 따른 화합물의 가수분해에 의해 생성시킬 수 있다:
Figure 112015005936003-pct00009
30% 수성 염산(12.06 ㎏; 3.9 상대 부피)을 탈염수(10.0 ㎏; 3.0 상대 부피) 중의 화학식 II에 따른 화합물(3.45 ㎏; 1.0 당량)의 슬러리에 가하였다. 후속으로, 탈염수(3.4 ㎏; 1.0 상대 부피)로 라인 세정을 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 80±5 ℃로 14.5 시간 동안 가열하였다. 상기 반응의 완료(전환 ≥99%) 후에, 상기 반응 혼합물을 20±5 ℃로 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물을 탈염수(6.8 ㎏; 2.0 상대 부피)로 희석하고 33% 수성 수산화 나트륨(9.52 ㎏; 3.7 상대 부피)을, 반응기 내용물의 온도가 35 ℃ 이하에서 유지되는 비율로 투여하였다. 추가량의 33% 수성 수산화 나트륨(2.55 ㎏; 1.0 상대 부피)이 pH≥10을 획득하는데 필요하였다. 상기 생성물을 여과하고, 탈염수(1.5 상대 부피)로 2 회 세척하고 진공 하에서 1 시간 동안 건조시켜, 화학식 I에 따른 조 화합물을 제공하였다.
상기 화학식 I에 따른 조 화합물(5.70 ㎏)을 탈염수(23.0 ㎏; 8.5 상대 부피)에 재슬러리화하였다. 30% 수성 염산(1.65 ㎏; 0.7 상대 부피) 및 탈염수(4.3 ㎏; 1.6 상대 부피)를 가하고 상기 반응 혼합물을 20±5 ℃에서 45 분간 교반하였다. 상기 화학식 I에 따른 화합물이 완전히 용해되지 않았으면, 상기 반응 혼합물을 45±5 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과하고 잔사를 탈염수(2.0 ㎏ 0.75 상대 부피)로 세척하였다. 33% 수성 수산화 나트륨(1.12 ㎏; 0.6 상대 부피)을 상기 여액에 가하였다. 추가량의 33% 수성 수산화 나트륨(1.01 ㎏)이 pH≥10을 획득하는데 필요하였다. 생성 반응 혼합물을 20±5 ℃에서 약 3 시간 동안 교반하였다. 상기 생성물을 여과하고, 탈염수(4.1 ㎏; 1.5 상대 부피)로 2 회 세척하고 메틸 3급 부틸 에테르(MTBE; 3.0 ㎏; 1.5 상대 부피)로 2 회 세척하고, 상기 필터 상에서 진공 하에 15.5 시간 동안 건조시켰다. 상기 생성물을 진공 오븐에서 40±5 ℃에서 202 시간 동안 추가로 건조시켜, 목적하는 화학식 I에 따른 화합물을 제공하였다.
생물학적 실시예
실시예 2. 시험관내 분석
2.1. JAK1 억제 분석
2.1.1. JAK1 분석 폴리GT 기질
재조합 인간 JAK1 촉매 도메인(아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4774)을 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입하였다. 25 ng의 JAK1을 키나제 반응 완충제(15 mM Hepes pH 7.5, 0.01% 트윈20, 10 mM MgCl2, 2 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 카탈로그 번호 KEG602K001MC) 최종 농도) 중의 6.25 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너(Greiner), V-바닥)에서 배양하였다. 30 ℃에서 75 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정시켰다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉하였다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트(Microscint)-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(Topcount)(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행하였다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)/(비히클의 존재 하에서 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)) x 100.
일련의 용량 희석물을, JAK1 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/3 희석, 8 개 점(20μM - 6.67μM - 2.22μM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 시험하였다. 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
JAK1에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 460.1, 586, 494.3, 758.2, 및 432.7 nM(평균 546.26 nM)의 IC50 값을 얻었다.
2.1.2. JAK1 Ulight-JAK1 펩타이드 분석
재조합 인간 JAK1(촉매 도메인, 아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4774)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 1 ng의 JAK1을 키나제 반응 완충제(15 mM MOPS pH 6.8, 0.01% 브리즈(Brij)-35, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 7 μM ATP) 중의 20 nM Ulight-JAK1(tyr1023) 펩타이드와 4 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 20 ㎕의 부피로, 백색 384 Opti 플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6007290)에서 배양하였다. 실온에서 60 분 후에, 20 ㎕/웰의 검출 혼합물(1 x 검출 완충제(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 CR97-100C), 0.5 nM 유로피움-항-포스포타이로신(PT66)(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AD0068), 10 mM EDTA)을 가함으로써 반응을 정시켰다. 320 ㎚에서의 여기를 갖는 엔비젼(Envision)을 사용하고 615 ㎚에서 방출을 측정하여 판독을 수행하였다(퍼킨 엘머). 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 상대 형광 단위(RFU)를 비히클의 존재 하에서 획득된 RFU로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)/(비히클의 존재 하에서 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)) x 100.
일련의 용량 희석물을 JAK1 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/5 희석, 10 개 점에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC50 ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타내었다.
JAK1에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 346.8, 714.3, 166.6, 103.3, 187.2, 582.3, 295.3, 241.7, 159.2, 355.3, 및 221.6 nM(평균 = 307 nM)의 IC50 값을 얻었다.
2.1.3. JAK1 Ki 측정 분석
Ki의 측정을 위해서, 상이한 양의 화합물을 효소와 혼합하며, 상기 효소 반응은 ATP 농도의 함수로서 추적된다. 상기 Ki를, Km 대 화합물 농도의 이중 역비례 플롯팅(라인웨버-버크 플롯)에 의해 측정한다. 1 ng의 JAK1(인비트로젠, PV4774)을 상기 분석에 사용한다. 기질은 20 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023) 펩타이드(퍼킨 엘머, TRF0121)이다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 15mM MOPS pH 6.8, 0.01%, 브리즈-35, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2에서 수행한다. 인산화된 기질을 1.1.2에 개시된 바와 같이 유로피움-표지된 항-포스포타이로신 항체 PT66(퍼킨 엘머, AD0068)를 사용하여 측정한다. 320 ㎚에서의 여기 및 615 ㎚ 및 665 ㎚에서의 방출을 갖는 엔비젼(퍼킨 엘머)상에서 판독을 수행한다.
2.2. JAK2 억제 분석
2.2.1. JAK2 분석 폴리GT 기질
재조합 인간 JAK2 촉매 도메인(아미노산 808-1132; 카탈로그 번호 PV4210)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.05 mU의 JAK2를 키나제 반응 완충제(10mM MOPS pH 7.5, 0.5mM EDTA, 0.01% 브리즈-35 , 1mM DTT , 15mM MgAc, 1 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 NEG602K001MC) 최종 농도) 중의 2.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너, V-바닥)에서 배양하였다. 30 ℃에서 90 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정시켰다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉하였다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행하였다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)/(비히클의 존재 하에서 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)) x 100.
일련의 용량 희석물을 JAK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/3 희석, 8 개 점(20μM - 6.67μM - 2.22μM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 시험하였다. 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
JAK1에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 566.9, 365.5, 256.4, 915.1, 및 1017 nM(평균 = 624 nM)의 IC50 값을 얻었다.
2.2.2. JAK2 Ulight-JAK1 펩타이드 분석
재조합 인간 JAK2(촉매 도메인, 아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4210)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.0125 mU의 JAK2를 키나제 반응 완충제(25mM HEPES pH7.0, 0.01% 트리톤 X-100, 7.5mM MgCl2 , 2mM DTT, 7.5μM ATP) 중의 25 nM Ulight-JAK1(tyr1023) 펩타이드(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 TRF0121))와 4 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 20 ㎕의 부피로, 백색 384 Opti 플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6007290)에서 배양하였다. 실온에서 60 분 후에, 20 ㎕/웰의 검출 혼합물(1 x 검출 완충제(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 CR97-100C), 0.5 nM 유로피움-항-포스포타이로신(PT66)(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AD0068), 10 mM EDTA)을 가함으로써 반응을 정시켰다. 320 ㎚에서의 여기를 갖는 엔비젼을 사용하고 615 ㎚에서 방출을 측정하여 판독을 수행하였다(퍼킨 엘머). 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 상대 형광 단위(RFU)를 비히클의 존재 하에서 획득된 RFU로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)/(비히클의 존재 하에서 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)) x 100.
일련의 용량 희석물을 JAK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/5 희석, 10 개 점에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮추었다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC50 ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타내었다.
JAK2에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 1031, 351.2, 137.5, 367.2, 310.2, 729.2, 151.7, 203.0, 168.0, 및 517.0(평균 = 397 nM)의 IC50 값을 얻었다.
2.2.3. JAK2 Kd/Ki 측정 분석
2.2.3.1. JAK2 Ki 측정 분석
Ki의 측정을 위해서, 상이한 양의 화합물을 효소와 혼합하며, 상기 효소 반응은 ATP 농도의 함수로서 추적된다. 상기 Ki를, Km 대 화합물 농도의 이중 역비례 플롯팅(라인웨버-버크 플롯)에 의해 측정한다. 0.0125 mU의 JAK1(인비트로젠, PV4210)을 상기 분석에 사용한다. 기질은 25 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023) 펩타이드(퍼킨 엘머, TRF0121)이다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25mM HEPES pH7.0, 0.01% 트리톤 X-100, 7.5mM MgCl2, 2mM DTT에서 수행한다. 인산화된 기질을 1.2.2에 개시된 바와 같이 유로피움-표지된 항-포스포타이로신 항체 PT66(퍼킨 엘머, AD0068)를 사용하여 측정한다. 320 ㎚에서의 여기 및 615 ㎚ 및 665 ㎚에서의 방출을 갖는 엔비젼(퍼킨 엘머)상에서 판독을 수행한다.
2.2.3.2. JAK2 Kd 측정 분석
JAK2(인비트로젠, PV4210)를 2.5 nM의 최종 농도로 사용한다. 결합 실험을 다양한 화합물 농도로, 25 nM 키나제 추적자 236(인비트로젠, PV5592) 및 2 nM 유로피움-항-GST(인비트로젠, PV5594)를 사용하여 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% 브리즈-35, 10mM MgCl2, 1mM EGTA에서 수행한다. 추적자의 검출은 제조사의 절차에 따라 수행한다.
2.2.4. JAK3 억제 분석
재조합 인간 JAK3 촉매 도메인(아미노산 795-1124; 카탈로그 번호 08-046)을 카르나 바이오사이언시즈(Carna Biosciences)로부터 구입하였다. 0.5 ng JAK3 단백질을 키나제 반응 완충제(25 mM 트리스 pH 7.5, 0.5 mM EGTA, 10mM MgCl2, 2.5mM DTT, 0.5 mM Na3VO4, 5 mM b-글리세로포스페이트, 0.01% 트리톤 X-100, 1 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 NEG602K001MC) 최종 농도) 중의 2.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너, V-바닥)에서 배양하였다. 30 ℃에서 45 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정시켰다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉하였다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행하였다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)/(비히클의 존재 하에서 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)) x 100.
일련의 용량 희석물을 JAK3 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/5 희석, 10 개 점에서 1% DMSO의 최종 농도로 시험하였다. 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
JAK3에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 2497, >4000, >4000, >3333, >3333, 3939, >4000, >4000, >4000, 3201, 및 3368(평균 > 3606 nM)의 IC50 값을 얻었다.
2.2.5. JAK3 Ki 측정 분석
Ki의 측정을 위해서, 상이한 양의 화합물을 효소와 혼합하며, 상기 효소 반응은 ATP 농도의 함수로서 추적된다. 상기 Ki를, Km 대 화합물 농도의 이중 역비례 플롯팅(라인웨버-버크 플롯)에 의해 측정한다. JAK3(카르나 바이오사이언시즈, 08-046)을 20 ng/㎖의 최종 농도로 사용한다. 기질은 폴리(Glu,Tyr)나트륨 염(4:1) , MW 20 000 - 50 000(시그마, P0275)이다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25mM 트리스 pH 7.5, 0.01% 트리톤 X-100, 0.5mM EGTA, 2.5mM DTT, 0.5mM Na3VO4, 5mM b-글리세로포스페이트, 10mM MgCl2에서 수행하고 150 mM 인산의 첨가에 의해 정지시킨다. 상기 기질 폴리GT에 결합된 포스페이트의 측정을, 필터 플레이트(수확기 사용, 퍼킨 엘머) 상에 상기 샘플들을 로딩하고 후속으로 세척하여 수행한다. 폴리GT 중의 결합된 33P를 상기 필터 플레이트(퍼킨 엘머)에 섬광 액체의 첨가후 탑카운트 섬광 계수기에서 측정한다.
2.3. TYK2 억제 분석
재조합 인간 TYK2 촉매 도메인(아미노산 871-1187; 카탈로그 번호 08-147)을 카르나 바이오사이언시즈로부터 구입하였다. 4 ng의 TYK2를 키나제 반응 완충제(25 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 5mM MnCl2, 10mM MgCl2, 0.1% 브리즈-35, 0.1 μM 비-방사성 ATP, 0.125 μCi 33P-감마-ATP(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 NEG602K001MC) 최종 농도) 중의 12.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너, V-바닥)에서 배양하였다. 30 ℃에서 90 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정시켰다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉하였다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행하였다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)/(비히클의 존재 하에서 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)) x 100.
일련의 용량 희석물을 TYK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/3 희석, 8 개 점(20μM - 6.67μM - 2.22μM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
TYK2에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 >3333, >3333, >3333, 1973, 2121, 3852, 3819, 및 2207(평균 >2996 nM)의 IC50 값을 얻었다.
2.3.1. TYK2 Kd/Ki 측정 분석
2.3.1.1. TYK2 Ki 측정 분석
Ki의 측정을 위해서, 상이한 양의 화합물을 효소와 혼합하며, 상기 효소 반응은 ATP 농도의 함수로서 추적된다. 상기 Ki를, Km 대 화합물 농도의 이중 역비례 플롯팅(라인웨버-버크 플롯)에 의해 측정한다. TYK2(카르나 바이오사이언시즈, 08-147)를 160 ng/㎖의 최종 농도로 사용한다. 기질은 폴리(Glu,Tyr)나트륨 염(4:1) , MW 20 000 - 50 000(시그마, P0275)이다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 5mM MnCl2, 10mM MgCl2, 0.1% 브리즈-35에서 수행하고 150 mM 인산의 첨가에 의해 정지시킨다. 상기 기질 폴리GT에 결합된 포스페이트의 측정을, 필터 플레이트(수확기 사용, 퍼킨 엘머) 상에 상기 샘플들을 로딩하고 후속으로 세척하여 수행한다. 폴리GT 중의 결합된 33P를 상기 필터 플레이트(퍼킨 엘머)에 섬광 액체의 첨가후 탑카운트 섬광 계수기에서 측정한다.
2.3.1.2. TYK2 Kd 측정 분석
TYK2(카르나 바이오사이언시즈, 08-147)를 50 nM의 최종 농도로 사용한다. 결합 실험을 다양한 화합물 농도로, 25 nM 키나제 추적자 236(인비트로젠, PV5592) 및 10 nM 유로피움-항-GST(인비트로젠, PV5594)를 사용하여 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% 브리즈-35, 10mM MgCl2, 1mM EGTA에서 수행한다. 추적자의 검출은 제조사의 절차에 따라 수행한다.
실시예 3. 세포 분석:
3.1. JAK-STAT 신호분석:
HeLa 세포를 10% 심장 불활성화된 송아지 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 유지시켰다. HeLa 세포를 형질감염을 위해 70% 세포밀집도로 사용하였다. 87 ㎕ 세포 배양 배지 중 20,000 개의 세포를 96-웰 플레이트 포맷에서 형질감염 시약으로서 웰당 0.32 ㎕ Jet-PEI(폴리플러스(Polyplus))를 사용하여 40 ng pSTAT1(2)-루시페라제 리포터(파노믹스(Panomics)), 내부 대조용 리포터로서 8 ng의 LacZ 리포터 및 52 ng의 pBSK로 일시적으로 형질감염시켰다. 37 ℃에서 밤새 배양후에, 형질감염 배지를 제거하였다. 81 ㎕의 DMEM + 1.5% 열 불활성화된 송아지 태아 혈청을 가하였다. 9 ㎕ 화합물을 10x 농도로 60 분간 가하고 이어서 10 ㎕의 인간 OSM(펩프로테크(Pepprotech))을 33 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다.
상기 화합물을 20 μM로부터 출발한 다음 1/3 연속 희석으로, 총 8 개의 용량(20 μM - 6.6 μM - 2.2 μM - 740 nM - 250 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM)을 0.2% DMSO의 최종 농도로 중복 시험하였다.
37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양후, 100 ㎕ 용해 완충제/웰(PBS, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 10% 트레할로스, 0.05% 터지톨 NP9, 0.3% BSA)을 가하여 세포를 용해시켰다.
40 ㎕의 세포 용해물을 사용하여, 180 ㎕ β-Gal 용액(30 ㎕ ONPG 4 ㎎/㎖ + 150 ㎕ β-갈락토시다제 완충제(0.06 M Na2HPO4, 0.04 M NaH2PO4, 1 mM MgCl2))을 20 분간 가함으로써 β-갈락토시다제 활성을 판독하였다. 50 ㎕ 1 M Na2CO3를 가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도를 405 ㎚에서 판독하였다.
루시페라제 활성을 엔비젼(퍼킨 엘머)상에서, 제조사(퍼킨 엘머)에 의해 개시된 바와 같이 40 ㎕ 세포 용해물 + 40 ㎕ 스테디라이트(Steadylite)(등록상표)를 사용하여 측정하였다.
OSM 생략을 양성 대조군(100% 억제)으로서 사용하였다. 음성 대조군으로서 0.5% DMSO(0% 억제)를 사용하였다. 상기 양성 및 음성 대조군을 사용하여 z' 및 '억제 퍼센트'(PIN) 값을 계산하였다.
억제 백분율 = ((비히클 존재 하에서 측정된 형광 - 시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 형광)/(비히클 존재 하에서 측정된 형광 - 촉발제 부재 샘플에 대해 측정된 형광)) x 100.
PIN 값을 용량-반응으로 시험된 화합물들에 대해 플롯팅하였으며 EC50 값이 유도되었다.
JAK-STAT에 대한 화학식 I에 따른 화합물의 활성을 상술한 분석에 따라 측정하였으며, 따라서 비활성, >6670, >6670, 8943(평균 > 7427 nM)의 IC50 값을 얻었다.
3.2. OSM/IL-1β 신호 분석
OSM 및 IL-β는 인간 연골육종 세포주 SW1353에서 MMP13을 상승적으로 상향조절하는 것으로 나타났다. 상기 세포를 96 웰 플레이트에서 10%(v/v) FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠)을 함유하는 120 ㎕ 부피의 DMEM(인비트로젠) 중에 15,000 세포/웰로 시딩하고 37 ℃ 5% CO2에서 배양하였다. 세포를 2% DMSO를 함유하는 M199 배지에서 15 ㎕의 화합물과 1 시간 예비배양한 후에 15 ㎕ OSM 및 IL-1β로 촉발시켜 25 ng/㎖ OSM 및 1 gn/㎖ IL-1β에 도달시키고 MMP13 수준을 촉발 후 48 시간째에 처리된 배지에서 측정한다. MMP13 활성을 항체 포착 활성 분석을 사용하여 측정한다. 이를 위해서, 384 웰 플레이트(NUNC, 460518, 맥시솔브(MaxiSorb) 블랙)를 4 ℃에서 24 시간 동안 35 ㎕의 1.5 ㎍/㎖ 항-인간 MMP13 항체(R&D 시스템스, MAB511) 용액으로 코팅한다. 상기 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 2 회 세척한 후에, 남은 결합 부위를 4 ℃에서 24 시간 동안 PBS 중의 5% 무지방 분유(산타 크루즈(Santa Cruz), sc-2325, 블로토(Blotto)) 100 ㎕로 차단한다. 이어서, 상기 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 2 회 세척하고 100배 희석된 차단 완충제 중의 MMP13을 함유하는 배양 상등액의 1/10 희석물 35 ㎕를 가하고 실온에서 4 시간 동안 배양한다. 이어서 상기 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 2 회 세척한 다음 1.5 mM 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)(시그마, A9563) 용액 35 ㎕를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하여 MMP13을 활성화시킨다. 상기 웰을 다시 PBS + 0.05% 트윈으로 세척하고 35 ㎕ MMP13 기질(바이오몰(Biomol), P-126, OmniMMP 형광원 기질)을 가한다. 37 ℃에서 24 시간 동안 배양후, 상기 전환된 기질의 형광을 퍼킨 엘머 왈락 엔비젼 2102 다중표지 판독기(여기 파장: 320 ㎚, 방출 파장: 405 ㎚)에서 측정한다.
억제 백분율 = ((비히클의 존재 하에서 측정된 형광 - 시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 형광)/(비히클의 존재 하에서 측정된 형광 - 촉발재 부재 샘플에 대해 측정된 형광)) x 100.
3.3. PBL 증식 분석
인간 말초 혈액 림프구(PBL)를 IL-2로 자극하고 증식을 BrdU 결합 분석을 사용하여 측정한다. 상기 PBL을 먼저 72 시간 동안 PHA로 자극하여 IL-2 수용체를 유도하고, 이어서 24 시간 동안 절식시켜 세포 증식을 정지시킨 다음 추가로 72 시간 동안 IL-2 자극한다(24 시간 BrdU 표지화 포함). 세포를 IL-2 첨가 1 시간 전에 시험 화합물과 예비배양시킨다. 세포를 10%(v/v) FBS를 함유하는 RPMI 1640에서 배양한다.
3.4. 인간 전혈 분석(hWBA)
3.4.1. 프로토콜 1
3.4.1.1. IL-6 자극 프로토콜
유식 세포측정 분석을 수행하여 인간 전혈로 생체외 JAK2 화합물 선택성에 대해 JAK1을 확립시켰다. 따라서, 사전 동의를 받은 인간 지원자로부터 혈액을 채취한다. 이어서 혈액을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 평형화하고, 이어서 에펜도르프 튜브에 분액하였다. 화합물을 상이한 농도로 가하고 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하고 후속으로 JAK1-의존성 경로 자극에 대해서는 인터류킨 6(IL-6)으로, 또는 JAK2-의존성 경로 자극에 대해서는 GM-CSF로, 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 자극한다. 이어서 포스포-STAT1 및 포스포-STAT5를 FACS 분석을 사용하여 평가한다.
3.4.1.1.1. 포스포-STAT1 분석
3.4.1.1.1.1. 시약의 제조
5X 용해/고정 완충제(BD 포스플로우(PhosFlow), 카탈로그 번호 558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온하였다. 남은 희석된 용해/고정 완충제는 버렸다.
10 ㎍ rhIL-6(R&D 시스템스, 카탈로그 번호 206-IL)을 1㎖의 PBS 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관하였다.
상기 화합물의 3배 연속 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조하였다. 대조용-처리된 샘플은 화합물 대신에 DMSO를 수용하였다. 모든 샘플을 1% 최종 DMSO 농도로 배양하였다.
3.4.1.1.1.2. 혈액과 화합물과의 배양 및 IL-6에 의한 자극
인간 혈액을 헤파린처리된 튜브에 수거한다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 나눈다. 이어서, 1.5 ㎕의 시험 화합물 희석액을 각 혈액 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 1과 1/2 마이크로리터의 10배 희석된 IL-6 모액을 상기 혈액 샘플(최종 농도 10 ng/㎖)에 가하고 상기 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
3.4.1.1.1.3. 전혈 세포 제제
상기 자극 기간의 끝에서, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 3 ㎖의 1X 예온된 용해/고정 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양한다.
튜브를 400xg에서 4 ℃에서 5 분간 원심분리시킨다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리후 상기 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁하고 900 ㎕ 빙냉 100% 메탄올을 가한다. 이어서 세포를 침투를 위해 30 분간 4 ℃에서 배양한다.
이어서 침투된 세포를 3% BSA를 함유하는 1x PBS로 세척하고 최종적으로 3% BSA를 함유하는 1X PBX 80 ㎕에 재현탁한다.
3.4.1.1.1.4. 항 포스포-STAT1 및 항-CD4 항체에 의한 세포 표지
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT1(pY701) 또는 PE 마우스 IgG2aκ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612564 및 559319) 및 FITC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 FITC-접합된 아이소타입 항체를 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다.
이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다.
3.4.1.1.1.5. FACSCanto II상에서 형광 분석
총 50,000 개의 사건을 카운트하고 포스포-STAT1 양성 세포를 림프구 게이트에서 CD4+ 세포에 게이트화후 측정한다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-6 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산한다.
3.4.1.1.2. 포스포-STAT5 분석
3.4.1.1.2.1. 시약의 제조
5X 용해/고정 완충제(BD 포스플로우, 카탈로그 번호 558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온하였다. 남은 희석된 용해/고정 완충제는 버렸다.
10 ㎍ rhGM-CSF(AbCys S.A., 카탈로그 번호 P300-03)을 100 ㎕의 PBS 0.1% BSA에 용해시켜 100 ㎍/㎖ 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관하였다.
상기 화합물의 3배 연속 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조하였다. 대조용-처리된 샘플은 시험 화합물없이 DMSO를 수용한다. 모든 샘플을 1% 최종 DMSO 농도로 배양하였다.
3.4.1.1.2.2. 혈액과 화합물과의 배양 및 GM-CSF에 의한 자극
인간 혈액을 헤파린처리된 튜브에 수거하였다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 나누었다. 이어서, 1.5 ㎕의 화합물 희석액을 각 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 5,000 배 희석된 GM-CSF 모액(1.5 ㎕)을 상기 혈액 샘플(최종 농도 20 ng/㎖)에 가하고 상기 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분 동안 배양하였다.
3.4.1.1.2.3. 전혈 세포 제제
상기 자극 기간의 끝에서, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 3 ㎖의 1X 예온된 용해/고정 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양하였다.
튜브를 400xg에서 4 ℃에서 5 분간 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리후 상기 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁하고 900 ㎕ 빙냉 100% 메탄올을 가하였다. 이어서 세포를 침투를 위해 30 분간 4 ℃에서 배양하였다.
3.4.1.1.2.4. 항 포스포-STAT5 및 항-CD33 항체에 의한 세포 표지
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612567 및 554680) 및 APC 마우스 항 CD33 항체(BD 바이오사이언시즈 #345800) 또는 대조용 APC 마우스 IgG1 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈 #345818)를 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 30 분 동안 배양하였다.
이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다.
3.4.1.1.2.5. FACSCanto II상에서 형광 분석
총 50,000 개의 사건을 카운트하고 포스포-STAT5 양성 세포를 림프구 CD33+ 세포상에서 게이트화후 측정하였다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며 이는 CD33+ 세포상의 포스포-STAT5에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산된 GM-CSF 자극의 억제의 백분율에 상응한다.
3.4.2. 프로토콜 2
3.4.2.1. 자극 프로토콜
유식 세포측정 분석을 수행하여 인간 전혈로 생체외 JAK2 화합물 선택성에 대해 JAK1을 확립시켰다. 따라서, 사전동의를 받은 인간 지원자로부터 혈액을 채취한다. 이어서 혈액을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 평형화하고, 이어서 에펜도르프 튜브에 분액하였다. 화합물을 상이한 농도로 가하고 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하고 후속으로 JAK1-의존성 경로 자극에 대해서는 인터류킨 6(IL-6)으로, JAK1/TYK2 경로 자극에 대해서는 인터페론 알파(IFNα)로, JAK1/JAK3 경로 자극에 대해서는 인터류킨 2(IL-2)로, 또는 JAK2-의존성 경로 자극에 대해서는 GM-CSF로, 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 자극한다. 이어서 포스포-STAT1(IL-6- 및 IFNα-자극된 세포의 경우) 및 포스포-STAT5(IL-2- 및 GM-CSF-자극된 세포의 경우)를 FACS 분석을 사용하여 평가한다.
3.4.2.2. 포스포-STAT 분석
3.4.2.2.1. 시약의 제조
5X 용해/고정 완충제(BD 포스플로우, 카탈로그 번호 558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온하였다. 남은 희석된 용해/고정 완충제는 버렸다.
10 ㎍ rhIL-6(R&D 시스템스, 카탈로그 번호 206-IL)을 1㎖의 PBS + 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관하였다.
10 ㎍ rhIL-2(R&D 시스템스, 카탈로그 번호 202-IL)을 1㎖의 PBS + 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관하였다.
5 ㎍ rhGM-CSF(AbCys S.A., 카탈로그 번호 P300-03)를 12.5㎖의 PBS + 0.1% BSA에 용해시켜 400 ng/㎖ 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관하였다.
상기 화합물의 3배 연속 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조하였다. 대조용-처리된 샘플은 화합물 대신에 DMSO를 수용하였다. 모든 샘플을 1% 최종 DMSO 농도로 배양하였다.
3.4.2.2.2. 혈액과 화합물과의 배양 및 촉발제에 의한 자극
인간 혈액을 헤파린처리된 튜브에 수거하였다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 나누었다. 이어서, 1.5 ㎕의 시험 화합물 희석액을 각 혈액 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 1과 1/2 마이크로리터의 10배 희석된 IL-6 모액, 1.5 ㎕의 uIFNα(PBL 바이오메디컬(Biomedical), 카탈로그 번호 11200-1) 모액, 1.5 ㎕의 25배 희석된 IL-2 모액 또는 1.5 ㎕의 200배 희석된 GM-CSF 모액을 상기 혈액 샘플에 가하고 상기 샘플들을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분 동안 배양하였다.
3.4.2.2.3. 전혈 세포 제제
상기 자극 기간의 끝에서, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 3 ㎖의 1X 예온된 용해/고정 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양하였다.
튜브를 400xg에서 4 ℃에서 5 분간 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리후 상기 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁하고 900 ㎕ 빙냉 100% 메탄올을 가한다. 이어서 세포를 침투를 위해 30 분간 4 ℃에서 배양하였다.
이어서 침투된 세포를 3% BSA를 함유하는 1x PBS로 세척하고 최종적으로 3% BSA를 함유하는 1X PBX 80 ㎕에 재현탁한다.
3.4.2.2.4. 세포 표지
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT1(pY701) 또는 PE 마우스 IgG2aκ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612564 및 559319) 및 APC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 APC-접합된 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 555349 및 555751)를 IL-6 및 IFNα-자극된 튜브에 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다.
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612567 및 554680) 및 APC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 APC-접합된 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 555349 및 555751)를 IL-2-자극된 튜브에 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다.
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612567 및 554680) 및 APC 마우스 항 CD33 항체(BD 바이오사이언시즈 #345800) 또는 대조용 APC 마우스 IgG1 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 345818)를 GM-CSF-자극된 튜브에 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다.
이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다.
3.4.2.2.5. FACSCanto II상에서 형광 분석
총 50,000 개의 사건을 카운트하고 포스포-STAT1 양성 세포를 IL-6- 및 IFNα-자극된 세포에 대해서 림프구 게이트에서 CD4+ 세포에 게이트화후 측정하였다. 포스포-STAT5 양성 세포를 IL-2-자극된 세포에 대해서 림프구 게이트에서 CD4+ 세포에 게이트화후 측정하였다. 포스포-STAT5 양성 세포를 CD33+ 세포에 게이트화후 측정하였다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-6 또는 IFNα 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산한다. IL-2 자극된 세포의 경우, 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-2 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산하였다. GM-CSF 자극된 세포의 경우, GM-CSF 자극의 억제 백분율을 CD33+ 세포상의 포스포-STAT5에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산하였다.
3.4.3. 결과
이들 프로토콜에 따라, 상기 화학식 I에 따른 화합물은 6 명의 상이한 공여자에 대해서, IL-6-유도된 STAT1 인산화에 대해 11.9 μM의 평균 IC50을 제공하였다. IFNα-유도된 STAT1 인산화에 대해서, 상기 평균 IC50은 6 명의 상이한 공여자에 대해서 15.4 μM인 것으로 평가되었다. IL-2-유도된 STAT5 인산화에 대해서, 상기 평균 IC50은 5 명의 상이한 공여자에 대해서 19.6 μM인 것으로 평가되었다. GM-CSF-유도된 STAT5 인산화에 대해서, 상기 평균 IC50은 7 명의 상이한 공여자에 대해서 100 μM 이상인 것으로 평가되었다.
실시예 4. 생체내 모델
4.1. CIA 모델 1
4.1.1. 물질
완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)를 디프코(Difco)로부터 구입하였다. 소 콜라겐 유형 II(CII), 리포폴리사카라이드(LPS), 및 엔브렐(Enbrel)(등록상표)을 각각 콘드렉스(Chondrex)(Isle d’Abeau, 프랑스 소재); 시그마(P4252, 프랑스(L’Isle d’Abeau) 소재), 와이예트(Whyett)(25mg 주사성 주사기, 프랑스 소재), 와이예트(25mg 주사성 주사기, 프랑스 소재) 아크로스 오가닉스(Acros Organics)(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)로부터 수득하였다. 사용된 다른 모든 시약들은 시약 등급의 것이었으며 모든 용매는 분석 등급의 것이었다.
4.1.2. 동물
검은 아구티 래트(수컷, 7-8 주된 것)를 할란 레보라토리즈(Harlan Laboratories)(네덜란드 멜데르슬로 소재)로부터 수득하였다. 래트를 12 시간 명/암 주기(0700-1900)로 유지시켰다. 온도를 22 ℃에서 유지시키고, 사료와 물을 자유롭게 제공하였다.
4.1.3. 콜라겐 유발된 관절염(CIA)
실험 하루전에, CII 용액(2 ㎎/㎖)을 0.05 M 아세트산으로 제조하고 4 ℃에서 보관하였다. 면역화 직전에, 동부피의 항원보강제(IFA) 및 CII를 빙수욕에서 미리 냉각시킨 유리병에서 균질화기에 의해 혼합하였다. 유화액이 형성되지 않는 경우 잉여의 항원보강제 및 연장된 균질화가 필요할 수도 있다. 0.2 ㎖의 상기 유화액을 제1일에 각 래트의 꼬리 기부에 피내 주사하고, 두 번째 추가 피내 주사(CFA 0.1 ㎖ 염수 중 2 ㎎/㎖의 CII 용액)를 제9일에 수행하였다. 상기 면역화 방법은 공개된 방법(Sims et al, 2004; Jou et al., 2005)으로부터 변형되었다.
4.1.4. 연구 설계
상기 화합물들의 치료 효과를 상기 래트 CIA 모델에서 시험하였다. 래트를 동등한 그룹으로 무작위로 나누었으며 각각의 그룹은 10 마리의 래트를 함유하였다. 모든 래트를 제1일에 면역시키고 제9일에 추가 면역시켰다. 치료 투약을 제16일에서부터 제30일까지 지속한다. 음성 대조군은 비히클(MC 0.5%)로 처리하고 양성 대조군은 엔브렐(등록상표)(10 ㎎/㎏, 3x 주, s.c.)로 처리하였다. 관심 화합물을 전형적으로는 3 회 용량, 예를 들어 6, 10, 60 ㎎/㎏, q.d., p.o.으로 시험하였다.
4.1.5. 관절염의 임상 평가
관절염을 문헌[Khachigian 2006], [Lin et al 2007] 및 [Nishida et al. 2004)]의 방법에 따라 채점하였다. 4 개의 발 각각의 팽창을 하기와 같이 관절염 점수로 순위를 매겼다: 0 - 증상 없음; 1 - 발목 또는 손목과 같은 한 가지 유형의 관절의 순하지만 명확한 발적 및 팽창, 또는 병든 손발가락 수와 관계없이, 개별 손발가락으로 한정된 겉보기 발적 및 팽창; 2 - 2 가지 이상의 유형의 관절의 보통의 발적 및 팽창; 3 - 손발가락을 포함한 전체 발의 심한 발적 및 팽창; 4 - 다수의 관절을 포함하여 최대로 염증을 일으킨 사지(최대 누적 임상 관절 점수는 동물당 16점이다)(Nishida et al., 2004).
수회 연구의 메타분석을 허용하기 위해서, 상기 임상 점수값들을 하기와 같이 표준화하였다:
임상 점수의 AUC(AUC 점수): 제1일부터 제14일까지의 곡선 아래 면적(AUC)을 각각의 개별 래트에 대해서 계산하였다. 각 동물의 AUC를, 상기 동물에 대한 데이터가 획득된 연구에서 비히클에 대해 획득된 평균 AUC로 나누고 100을 곱하였다(즉 AUC는 연구당 평균 비히클 AUC의 백분율로서 표현되었다).
임상 점수는 제1일에서부터 제14일(종점 점수)까지 증가한다: 각 동물에 대한 임상 점수 차이를, 상기 동물에 대한 데이터가 획득된 연구에서 비히클에 대해 획득된 평균 임상 점수 차이로 나누고 100을 곱하였다(즉 상기 차이는 연구당 상기 비히클에 대한 평균 임상 점수 차이의 백분율로서 표현되었다).
4.1.6. 관절염의 발병후 체중 변화(%)
임상적으로, 체중 손실은 관절염과 관련되었다(Shelton et al., 2005; Argiles et al., 1998; Rall, 2004; Walsmith et al., 2004). 따라서, 관절염 발병후 체중 변화를 상기 래트 모델에서 치료 효과의 평가를 위한 비-특이적 종점으로서 사용할 수 있다. 상기 관절염 발병후 체중 변화(%)를 하기와 같이 계산하였다:
마우스: (체중(주 6) - 체중(주 5))/체중(주 5) x 100%
래트: (체중(주 4) - 체중(주 3))/체중(주 3) x 100%
4.1.7. 방사선학
X-선 사진을 각각의 개별적인 동물의 뒷발에서 촬영하였다. 무작위한 맹검 식별 번호를 각각의 사진에 부여하고, 골 미란의 중증도를 하기와 같은 방사선학적 라르센(Larsen) 점수 시스템으로 2 개의 독립적인 점수에 의해 순위를 매겼다: 0-완전한 골 윤곽 및 정상적인 관절 공간을 갖는 정상; 1-외부 중족골 중 임의의 3 내지 5 개가 가벼운 골 미란을 보이는 명확한 조기 이상; 3-상기 외부 중족골 모두뿐만 아니라 내부 중족골 중 임의의 하나 또는 2개가 명확한 골 미란을 보이는 중간의 파괴성 이상; 4-모든 중족골이 명확한 골 미란을 보이고 내부 중족골 중 하나 이상이 완전히 미란되어 일부 골 관절 윤곽이 부분적으로 보존되는 중증의 파괴성 이상; 5-골 윤곽이 없는 절단 이상. 이러한 득점 시스템은 하기 문헌들의 변형이었다: Salvemini et al., 2001; Bush et al., 2002; Sims et al., 2004; Jou et al., 2005.
4.1.8. 조직학
방사선학 분석후에, 마우스의 뒷발을 10% 포스페이트-완충된 포르말린(pH 7.4) 중에 고정시키고, 정밀한 조직학을 위해 빠른 골 탈회제(레보라토리즈 유로바이오(Laboratories Eurobio))로 탈회시키고 파라핀에 묻었다. 관절염에 걸린 관절의 확실한 광범위한 평가를 위해서, 4 개 이상의 일련의 단편(5 ㎛ 두께)을 절단하였으며 각각의 일련의 단편의 사이는 100 ㎛이었다. 상기 단편들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 활액막 염증 및 골 및 연골 손상에 대한 조직 검사를 이중 맹검 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 각각의 발에서, 4 개의 매개변수를 4-점 규모로 평가하였다. 상기 매개변수는 세포 침윤, 판누스 중증도, 연골 미란 및 골 미란이었다. 상응하게 하기와 같이 점수를 매겼다: 1-정상, 2-순한, 3-보통, 4-심한. 상기 4 개의 점수를 함께 합하고 추가적인 점수, 즉 'RA 총점'으로서 나타내었다.
4.1.9. 종골(뒤꿈치 뼈)의 미세전산화 단층촬영(μCT) 분석
RA에서 관찰된 골 손상은 특히 골피질에서 발생하며 μCT 분석에 의해 밝혀질 수 있다(Sims NA et al., Arthritis Rheum. 50 (2004) 2338-2346: 졸레드론산에 의한 파골세포의 표적화는 콜라겐-유발된 관절염에서 골 파괴를 방지한다; Oste L et al., ECTC Montreal 2007: 미세-CT 형태측정에 의한 쥐 CIA 모델에서 골 건축 장애를 측정하는 고도의 대량처리 방법). 상기 종골의 스캐닝 및 3D 용적 재건후에, 골 손상을 상기 뼈의 종방향 축에 수직인 인실리코 단리된, 슬라이드당 존재하는 식별 대상의 수로서 측정하였다. 상기 골이 많이 손상될수록 보다 많은 식별 대상이 측정되었다. 종골을 따라 균일하게 분배된(약 10.8 ㎛로 이격됨) 1000 개의 슬라이드를 분석하였다.
4.1.10. 정상상태 PK
제7일 또는 제11일째에, 혈액 샘플을 하기의 시점들에서 응고 방지제로서 리튬 헤파린을 사용하여 눈뒤 공동에서 채취하였다: 투여전, 1, 3 및 6 시간. 전혈 샘플을 원심분리하고 생성되는 혈장 샘플을 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다. 각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였으며, 여기에서 질량 분광계는 양의 전기분무 방식으로 작동되었다. 약동학적 매개변수들을 윈놀린(Winnonlin)(등록상표)(파사이트(Pharsight)(등록상표), 미국 소재)을 사용하여 계산하였으며 상기 투여전 혈장 수준은 24 시간 혈장 수준과 같은 것으로 가정되었다.
4.1.11. 결과
상기 화학식 I에 따른 화합물은 도 1 및 표 I에 나타낸 바와 같이 60 ㎎/㎏의 용량에서 표준화된 임상 점수값(AUC로서 또는 제1일에서부터 제14일까지의 차이로서 계산됨)의 통계학적 유의수준의 개선을 나타내었다.
[표 I]
본 발명에 개시된 화합물들로 처리후 래트 CIA 임상 점수.
Figure 112015005936003-pct00010
4.2. CIA 모델 2
4.2.1. 동물
제0일에 관절염이 있는 165 내지 194 그램(평균 대략 178 g) 중량의 암컷 루이스 래트(n=76)를 찰스 리버 레보라토리즈 인코포레이티드(Charles River Laboratories, Inc.)(미국 메릴랜드주 윌밍톤 소재, (ref# 393739))로부터 수득하였다. 동물을 꼬리 묘사 그룹 및 동물수에 근거한 독특한 수에 의해 식별하였다.
도착시, 동물들을 신발상자 폴리카보네이트 우리에서 4/우리로 수용하고 II형 콜라겐으로 면역화전에 8일 동안 환경에 순응되게 하였다. 동반되는 투약은 제공되지 않았다.
상기 순응 및 연구 기간 동안, 동물들을 19 내지 25 ℉ 범위의 온도 및 30% 내지 70%의 상대 습도를 갖는 실험 환경에 수용하였다. 자동 타이머는 12 시간의 명 및 12 시간의 암을 제공하였다. 동물들은 먹이와 물에 자유롭게 접근이 허용되었다.
4.2.2. 콜라겐 유발된 관절염(CIA)
4.2.2.1. 준비
순응된 암컷 루이스 래트를 아이소플루란으로 마취시키고 2 ㎎/㎖ 소 II형 콜라겐(엘라스틴 프로덕츠(Elastin Products), 미국 미주리주 오웬스빌 소재)을 함유하는 300 ㎕의 프로인트 불완전 항원보강제(디프코, 미국 미시간주 디트로이트 소재)로 -9일 및 -3일에 꼬리의 기부 및 2 개의 등 부위에 피하/피내(SC/ID) 주사하였다.
콜라겐은 0.01 N 아세트산 중의 4 ㎎/㎖ 용액을 제조함으로써 제조하였다. 같은 부피의 콜라겐 및 프로인트 불완전 항원보강제를, 상기 물질의 비드가 수중에 놓일 때 그의 형태를 유지할 때까지 손으로 유화시켰다. 각각의 동물에게 300 ㎕의 상기 혼합물을 제공하였으며 이때 각각의 경우에 등의 3 개의 피하 부위 위에 분할하여 제공하였다.
4.2.2.2. 연구
연구 제1일에, 관절염이 발병하였으며 동물들을 처리 그룹들로 무작위화하였다. 무작위화 후에, 모든 우리에 프로토콜 번호, 그룹 번호, 및 동물수를 표지하였다. 각 그룹으로의 무작위화는 발목 관절 팽창이 명백히 확립되고 양방향 질병의 양호한 증거가 존재할 때 수행되었다.
II형 콜라겐 관절염이 확립된 동물들을 비히클(0.5%(w/v) 메틸셀룰로스)로, 또는 0.5%(w/v) 메틸셀룰로스 중에서 제조된 활성 화합물(들)로 13일 동안 경구(PO) 경로에 의해 매일(QD) 처리하였다. 경구 투여를 관절염 제1일에 개시하였으며 13일 전체를 통해 매일 속행하였다(24 시간 간격으로 QD). 동물들을 관절염 제14일에 죽였다.
4.2.2.3. 관절염의 임상 평가
상기 관절염의 중증도를 상기 동물들의 양쪽 발목의 직경을 측정하여 평가하였다. 발목의 두께 측정은 디지트릭스(Digitrix) II 마이크로미터(파울러(Fowler) & NSK)를 사용하여 제0일에 시작하여 매일 수행하였다. 기준선 측정은 소숫점 셋째자리까지 반올림된 인치의 값으로 하나의 발목을 사용하여 수행하였다. 측정치는 체중 범위를 근거로 래트에 대한 기록 값들과의 비교에 의해 임상적으로 정상인 것(0.260-0.264 in)으로 확인되었다. 이어서 기준선 측정을 양쪽 발목에 적용하였으며, 이들 값은 상기 발목이 임상적으로 정상인 한(모든 발목뼈가 양호하게 한정되고 염증의 증거가 없다) 상기 동물에서 여전하다. 동물들을 제14일에 죽였다.
4.2.2.4. 화합물, 투여량 및 결과
화합물들을 하기 표 II에 나열한 다양한 용량으로 개별적으로 및 함께 시험하였다.
[표 II]
CIA 2차 모델에서 시험된 화합물 및 용량
Figure 112015005936003-pct00011
(* = 비히클 대조군에 대한 p ≤ 0.05 ANOVA)
4.2.2.5. 결론
발목 직경 측정은 화학식 I(25 ㎎/㎏) 및 화학식 II(3 ㎎/㎏)에 따른 화합물의 조합의 투여가, 하기 도 2 및 표 III에 도시된 바와 같이, 화학식 I에 따른 화합물(25 ㎎/㎏) 단독 또는 화학식 II에 따른 화합물(3 ㎎/㎏) 단독에 의해 획득된 효과보다 더 강한 효과를 제공함을 가리킨다.
[표 III]
본 발명에 개시된 화합물로 처리후 래트 CIA 모델에서 발목 직경(인치)의 진전
Figure 112015005936003-pct00012
실시예 5. 약동학 연구
5.1. 시험관내 대사 연구
마우스, 래트, 개 및 인간의 간세포에서 화학식 II에 따른 [14C]-화합물의 대사를 비교하는 연구는 상기 화학식 II에 따른 화합물이 모든 종에서 안정하였음을 명백히 나타하며, 상기 대사의 정도가, 도 3에 도시된 바와 같이 24 시간 후에 상기 화학식 II에 따른 화합물이 80% 이상으로, 모든 종에서 낮음을 입증한다.
표 IV는 인간 및 동물 종 간세포에서, 하나의 주대사(상기 화학식 I에 따른 화합물, 11%) 및 2 개의 부대사(특성화되지 않음, <1.0%, 크로마토그램상에서 볼 수 있음)를 나타내는, 상기 화학식 II에 따른 화합물의 방사성측정 대사 프로파일을 나타낸다.
[표 IV]
화학식 II에 따른 화합물의 시험관내 대사 프로파일
Figure 112015005936003-pct00013
5.2. 생체내 연구
동물에서 단일용량 약동학
상기 화학식 II에 따른 화합물을 투여한 다양한 동물 종에서 약동학 연구를 수행하여 상기 화학식 I에 따른 화합물에의 노출뿐만 아니라 가능한 경우 그의 겉보기 말단 반감기(T1 /2)를 측정하였다.
5.2.1.1. 프로토콜
5.2.1.1.1. 동물
스프래그 다우리 래트(수컷, 200-250 g), CD1 마우스(수컷, 25-30 g), 비글개(수컷, 9-10 ㎏), 괴팅겐 미니피그(수컷, 10-15 ㎏) 및 뉴질랜드 화이트 토끼(수컷, 3-5 ㎏)를 처리전 7일 이상 순응시키고 12 시간 명/암 주기(07h00-19h00)로 유지시켰다.
온도를 대략 22 ℃에서 유지시키고, 먹이와 물은 자유롭게 제공하였다.
5.2.1.1.2. 약동학 연구
상기 화학식 I에 따른 화합물을 0.5% 메틸셀룰로스 중에서 제형화하고 5 또는 10 ㎖/㎏의 투여 부피하에 15 내지 180 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 단일 식도 위관영양으로서 3 또는 6 마리의 동물에게 경구 투여하였다.
상기 화학식 II에 따른 화합물을 0.5% 메틸셀룰로스 중에서 제형화하고 5 또는 10 ㎖/㎏의 투여 부피하에 15 내지 45 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 단일 식도 위관영양으로서 3 마리의 동물(또는 3 마리의 마우스/시점)에게 경구 투여하였다.
혈액 샘플을 경정맥(개, 미니피그), 귀 혈관(토끼), 심장 천자(마우스) 또는 눈뒤 공동(래트)을 통해 응고방지제로서 리튬 헤파린을 사용하여 24-시간 기간에 걸쳐 채혈하였다. 전혈 샘플을 원심분리하고 생성되는 혈장 샘플을 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
5.2.1.1.3. 혈장 중 화합물 수준의 정량분석
상기 화학식 I에 따른 화합물 및 화학식 II에 따른 화합물의 혈장 농도를 모든 종들에 대해서 화학식 I 및 화학식 II 모두에 관해 ≤10.0 ng/㎖의 정량분석 한계로 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였다.
5.2.1.1.4. 약동학 매개변수의 측정
약동학 매개변수들을 통계 분석 패키지(윈놀린(파사이트, 미국 캘리포니아주 94086 써니베일 소재))를 사용하여 계산하였다.
5.2.1.2. 결과
5.2.1.2.1. 화학식 I에 따른 화합물 단독 투여에 대한 결과
상술한 프로토콜을 사용하여, AUC 및 겉보기 말단 반감기가 하기 표 V에 나타낸 바와 같이 측정되었다.
[표 V]
화학식 I에 따른 본 발명 화합물의 투여시 다양한 종에서의 노출 및 겉보기 말단 반감기
Figure 112015005936003-pct00014
표 V에 나타낸 결과들은 화학식 I에 따른 화합물이 단독으로 투여될 때 쉽게 흡수되며 따라서 생체내에서 노출됨을 나타낸다.
5.2.1.2.2. 화학식 II에 따른 화합물의 단독 투여에 대한 결과
상기 화학식 II에 따른 화합물의 투여시, 상기 화합물 I에 따른 화합물의 겉보기 말단 제거 반감기가 마우스(2.1 시간) 및 토끼(4.6 시간)에서 측정되었다.
5.2.2. 인간에서 단일 용량 약동학
5.2.2.1. 프로토콜
환자에게 고지방 고열량 아침식사(FDA 권고: 고지방(식사의 총 칼로리 함량의 대략 50%) 및 고열량(대략 800 내지 1000 칼로리)) 후에 캡슐로서 단일 용량(10, 25, 50, 100 또는 200 ㎎)의 화학식 II에 따른 화합물을 제공하였다. 예시적인 시험 식사는 버터에 튀긴 달걀 2개, 베이컨 두줄, 버터바른 토스트 2조각, 4 온스의 해시 브라운 감자, 및 8 온스의 전유일 수 있다. 상기 시험 식사의 대용으로 식사가 감자, 탄수화물 및 지방으로부터 유사한 양의 열량을 제공하고 필적하는 식사 분량 및 점도를 갖는 한 대신할 수 있다.
1.00 ng/㎖의 정량분석 한계로 적합한 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법/질량 분광분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 상기 화학식 II 및 화학식 I에 따른 화합물의 혈장 농도를 측정하기 위해서 일련의 혈액 샘플을 72 시간에 걸쳐 채혈하였다. PK 매개변수를 통계 분석 패키지(윈놀린(파사이트, 미국 캘리포니아주 94086 써니베일 소재))를 사용하여 평가하였다.
5.2.2.2. 혈장 제거 결과
상기 화학식 II 및 화학식 I에 따른 화합물의 평균 혈장 농도-시간 프로파일을 측정하였다.
상기 화학식 II에 따른 화합물의 시간에 따른 화합물의 제거는 약 5 내지 8 시간의 평균 겉보기 말단 제거 반감기를 갖는 2상 프로파일을 나타내었다.
대조적으로, 상기 화학식 I에 따른 화합물의 혈장 제거는 21 내지 27 시간 범위의 평균 겉보기 말단 제거 반감기를 갖는 단일상 프로파일을 나타내었다.
5.2.2.3. 화학식 II 및 화학식 I에 따른 화합물에의 노출
상기 두 화합물의 비교 노출을 나타내기 위해서, 상기 화학식 I에 따른 화합물 및 화학식 II에 따른 화합물의 AUC를 계산하였다. 상기 AUC 값은 투여후 종들에서의 상기 화합물의 총 노출을 나타낸다. 이어서 상기 값을 도 4에 화학식 I에 따른 화합물의 AUC:화학식 II에 따른 화합물의 AUC의 비로서 나타내었다. 상기 비로부터, 치료학적으로 동등한 용량에 대해서 동물들에게서 나타난 노출에 비해 인간에서 화학식 II에 따른 화합물의 투여 후 화학식 I에 따른 화합물에의 노출에 있어서 현저한 차이가 있었음을 명백히 알 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 차이는 상이한 종들에서 겉보기 말단 반감기 차이와 관련있는 것으로 여겨졌다.
[표 VI]
화학식 II에 따른 화합물의 투여시 측정된 [화학식 I]:[화학식 II]에 대한 노출비(AUC로서 표현됨).
Figure 112015005936003-pct00015
5.2.3. 인간에서 반복된 용량 약동학
5.2.3.1. 프로토콜
환자에게 10일 동안 표준 아침식사후 캡슐로서 반복된 용량(25, 50 및 100 ㎎ BID 또는 200, 300 및 450 ㎎ QD)의 화학식 II에 따른 화합물을 제공하였다.
1.00 ng/㎖의 정량분석 한계로 적합한 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법/질량 분광분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 상기 화학식 II 및 화학식 I에 따른 화합물의 혈장 농도를 측정하기 위해서 일련의 혈액 샘플을 제1일 및 제10일에 12 시간(BID 섭생) 또는 24 시간(QD 섭생)에 걸쳐 채혈하였다. PK 매개변수를 통계 분석 패키지(윈놀린(파사이트, 미국 캘리포니아주 94086 써니베일 소재))를 사용하여 평가하였다.
5.2.3.2. 혈장 제거 결과
상기 화학식 II 및 화학식 I에 따른 화합물의 평균 혈장 농도-시간 프로파일을 측정하였다.
상기 화학식 II에 따른 화합물의 시간에 따른 화합물의 제거는 약 4 내지 11 시간의 평균 겉보기 말단 제거 반감기를 갖는 2상 프로파일을 나타내었다.
대조적으로, 상기 화학식 I에 따른 화합물의 혈장 제거는 22 내지 27 시간 범위의 평균 겉보기 말단 제거 반감기를 갖는 단일상 프로파일을 나타내었다.
5.2.3.3. 화학식 II 및 화학식 I에 따른 화합물에의 노출
상기 두 화합물의 비교 노출을 나타내기 위해서, 상기 화학식 I에 따른 화합물 및 화학식 II에 따른 화합물의 AUC를 계산하였다. 상기 AUC 값은 반복 투여후 상기 화합물들의 정상 상태 노출을 나타낸다. 화학식 I에 따른 화합물의 AUC:화학식 II에 따른 화합물의 AUC의 비를 표 VII에 나타낸다.
[표 VII]
화학식 II에 따른 화합물의 반복된 투여시 측정된 화학식 II 및 화학식 I에 대한 노출(㎍.h/㎖의 AUC로서 표현됨).
Figure 112015005936003-pct00016
5.2.4. 결론
상기 화학식 I에 따른 화합물은 시험관내에서 모든 종에서 매우 유사한 프로파일을 나타낸다. 그러나, 뜻밖에도, 생체내에서, 상기 프로파일은 인간과 다른 동물 종들 사이에서 매우 차이가 있었으며, 이때 겉보기 말단 반감기는 인간에서 3 배 이상 더 높았다. 이러한 보다 긴 겉보기 말단 반감기는 인간에서 화학식 I에 따른 화합물의 축적을 생성시키며, 이는 광범위한 투여 섭생 횟수, 특히 낮은 횟수의 투여 섭생, 및 보다 특히 매일 1회 내지 매 2주마다 1회, 가장 특히는 매일 1회 내지 매주 1회의 가능성을 제공한다.
5.3. 표적 억제
상기 화학식 II에 따른 화합물을 건강한 자원자에게 200 ㎎ QD 및 100 ㎎ BID로 매일 투여하였다.
이어서 생성되는 화학식 II 및 화학식 I의 수준을 측정하고 상기 실시예 3.4에 개시된 전혈 분석에 의해 측정되는 바와 같이 이들 각각의 IC50의 배수로서 플롯팅하였다(도 5).
화학식 II 및 화학식 I은 모두 상기 CIA 래트 모델에서 단독으로 활성이었다. 놀랍게도, 도 4에 도시된 바와 같이, 화학식 II 화합물의 투여는 2 개의 활성 종, 화학식 I 및 화학식 II와 관련된다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 화학식 II는 표적의 빠른 억제를 제공하고 이어서 화학식 I에 따른 화합물은 꾸준히 형성되고 축적되며, 따라서 도 6에서 IC50에 대한 축적 배수로서 나타난 바와 같이 거의 24 시간에 걸쳐 상기 IC50 수준 이상의 약물 수준을 생성시키는 것으로 여겨진다. 이는 상기와 같은 프로파일이 래트, 마우스 및 토끼의 모델(여기에서 상기와 같은 축적은 발생하지 않는다)로부터 예견되지 않았기 때문에 특히 뜻밖이었다.
[표 VIII]
[ng/㎖로서 나타낸 화합물의 혈액 순환 용량]/[IC50 량에서 동일한 화합물의 순환 용량]으로서 계산된 비
Figure 112015005936003-pct00017
일반적인 결론
본 출원에 제공된 데이터는 화학식 I에 따른 화합물이 생화학적 분석에서 JAK1 및 JAK2에 대해 유사한 시험관내 효능을 나타내지만, 생리학적 조건에 더 가까운 시험관내 전혈 선택성 분석(Saharinen et al. 2000 Mol. Cell. Biol., 20(10), 3387)은 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물이 JAK2보다 JAK1에 대해서 10 배 이상의 선택성을 나타냄을 보인다. 더욱 또한, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 다른 종에서의 시험관내 데이터 또는 생체내 데이터로부터 예상될 수 있는 것에 비해 인간에서 뜻밖의 생체내 프로파일을 나타낸다. 특히, 상기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 21 내지 27 시간 범위의, 인간에서 현저하게 더 긴 겉보기 말단 반감기를 나타내며, 이는 당해 분야의 숙련가에 의해 예견될 수 없었고, 그 결과 낮은 횟수의 투여량 섭생 및 증가된 환자 순응 범위의 이점을 생성시킬 수 있다. 특히, 환자가 복용을 놓친 경우 비준수의 영향을 감소시킬 수도 있다.
실시예 6. 추가적인 프로토콜
6.1. 열역학적 용해도
상기 시험 화합물 1 ㎎/㎖의 용액을 실온에서 유리 바이알 중에 0.2 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 또는 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.0중에서 제조한다.
샘플들을 로테이터 드라이브(Rotator drive) STR 4(스튜어트 사이언티픽(Stuart Scientific), Bibby)에서 3.0의 속도로 실온에서 24 시간 동안 회전시킨다.
24 시간 후에, 800 ㎕의 상기 샘플을 에펜도르프 튜브로 옮기고 14000 rpm에서 5분 원심분리시킨다. 이어서 상기 샘플의 상등액 200 ㎕를 멀티스크린R(MultiscreenR) 용해도 플레이트(밀리포어(Millipore), MSSLBPC50)로 옮기고, 상기 상등액을 진공 다기관의 도움으로 깨끗한 그레이너 폴리프로필렌 V-바닥 96 웰 플레이트(카탈로그 번호 651201)로 여과한다(10-12" Hg). 5 ㎕의 상기 여액을, 표준 곡선을 함유하는 플레이트에서의 배양에 사용된 동일한 완충제 95 ㎕(F20)에 희석한다(그레이너, 카탈로그 번호 651201).
상기 화합물에 대한 표준 곡선을 DMSO(5000 μM) 중에서 인자 2 희석된 10 mM DMSO 모액으로부터 출발하여 DMSO 중에서 새로 제조하고 이어서 DMSO 중에서 19.5 μM까지 추가로 희석한다. 이어서 5000 μM로부터의 일련의 희석액 3 ㎕를 97 ㎕ 아세토나이트릴-완충제 혼합물(50/50)로 옮겼다. 최종 농도 범위는 2.5 내지 150 μM이다.
상기 플레이트를 밀봉 매트(MA96RD-04S, Kinesis, Cambs, PE19 8YX, UK)로 밀봉하고 샘플을 실온에서 콴옵티파이즈(Quanoptimize)를 사용하여 최적화된 조건 하에서 LCMS(ZQ 1525, 워터스)상에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.
상기 샘플을 1 ㎖/분의 유량으로 LCMS 상에서 분석한다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 아세토나이트릴이다. 상기 샘플을 엑스브리지 C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(워터스) 상에서 양이온 분무 하에 실행시킨다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B까지의 범위이다.
피크 면적을 매시링크스(Masslynx) 소프트웨어의 도움으로 분석하고 샘플의 피크 면적을 표준 곡선에 대해 플롯팅하여 화합물의 용해도를 획득한다.
용해도 값을 μM 또는 ㎍/㎖로 보고한다.
6.2. 수성 용해도
6.2.1. 수성 용해도 2% DMSO 과정
DMSO 중 10 mM 모액으로부터 출발하여, 일련의 상기 화합물의 희석물을 DMSO 중에서 제조한다. 상기 연속 희석물을 96 NUNC 맥시솔브 플레이트 F-바닥(카탈로그 번호 442404)으로 옮기고 실온에서 0.2 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 또는 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.0을 가한다.
최종 농도 범위는 5 회의 동등한 희석 단계에서 200 μM에서부터 2.5 μM이다. 최종 DMSO 농도는 2%를 초과하지 않는다. 200 μM 파이렌을 각각의 96 웰 플레이트의 구석 지점에 가하며 이를 현미경상의 Z-축 눈금화를 위한 기준 점으로서 제공한다.
상기 분석 플레이트를 밀봉하고 230 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이어서 상기 플레이트를 백색광 현미경 하에서 스캐닝하여, 농도당 침전물의 개별적인 그림을 제공한다. 상기 침전물을 분석하고 숫자로 전환시켜 그래프상에 플롯팅한다. 상기 화합물이 완전히 용해된 것으로 보이는 첫 번째 농도는 하기에 보고된 농도이나, 진정한 농도는 상기 농도와 보다 높은 하나의 희석 단계 사이의 어딘가에 놓일 것이다.
상기 프로토콜에 따라 측정된 용해도값을 ㎍/㎖로 보고한다.
6.2.2. 수성 용해도 3% DMSO 과정
DMSO 중 10 mM 모액으로부터 출발하여, 일련의 상기 화합물의 희석물을 DMSO 중에서 제조한다. 상기 연속 희석물을 96 NUNC 맥시솔브 플레이트 F-바닥(카탈로그 번호 442404)으로 옮기고 실온에서 0.1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 또는 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.0을 가한다.
최종 농도 범위는 5 회의 동등한 희석 단계에서 300 μM에서부터 18.75 μM일 것이다. 최종 DMSO 농도는 3%를 초과하지 않는다. 200 μM 파이렌을 각각의 96 웰 플레이트의 구석 지점에 가하며 이를 현미경상의 Z-축 눈금화를 위한 기준 점으로서 제공한다.
상기 분석 플레이트를 밀봉하고 230 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이어서 상기 플레이트를 백색광 현미경 하에서 스캐닝하여, 농도당 침전물의 개별적인 그림을 제공한다. 상기 침전물을 분석하고 숫자로 전환시켜 그래프상에 플롯팅한다. 상기 화합물이 완전히 용해된 것으로 보이는 첫 번째 농도는 하기에 보고된 농도이나, 진정한 농도는 상기 농도와 보다 높은 하나의 희석 단계 사이의 어딘가에 놓일 것이다.
상기 프로토콜에 따라 측정된 용해도값을 ㎍/㎖로 보고한다.
6.3. 혈장 단백질 결합(평형 투석)
DMSO 중의 상기 화합물의 10 mM 모액을 DMSO에서 인자 5로 희석한다. 상기 용액을 새로 해동시킨 인간, 래트, 마우스 또는 개 혈장(바이오리클레메이션(BioReclamation) INC) 중에서 10 μM의 최종 농도 및 0.5%의 최종 DMSO 농도로 추가로 희석한다(PP-마스터블록 96 웰(그레이너, 카탈로그 번호 780285)에서 1094.5 ㎕ 혈장 중 5.5 ㎕).
삽입물이 있는 피어스 레드 디바이스(Pierce Red Device)(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 89809)를 준비하고 완충제 챔버에 750 ㎕ PBS 및 혈장 챔버에 500 ㎕의 스파이크 혈장을 충전시킨다. 상기 플레이트를 230 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한다. 배양후, 상기 두 챔버 모두의 120 ㎕를 96-웰 환저, PP 깊은 웰 플레이트(Nunc, 카탈로그 번호 278743) 중의 360 ㎕ 아세토나이트릴로 옮기고 알루미늄 호일 뚜껑으로 밀봉한다. 상기 샘플을 혼합하고 얼음상에 30 분간 둔다. 이어서 상기 플레이트를 1200 rcf에서 4 ℃에서 30 분 원심분리하고 상등액을 LCMS상에서의 분석을 위해 96 v-바닥 PP 플레이트(그레이너, 651201)로 옮긴다.
상기 플레이트를 밀봉 매트(MA96RD-04S, Kinesis, Cambs, PE19 8YX, UK)로 밀봉하고 샘플을 실온에서 콴옵티파이즈를 사용하여 최적화된 조건 하에서 LCMS(ZQ 1525, 워터스)상에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.
상기 샘플을 1 ㎖/분의 유량으로 LCMS 상에서 분석한다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 아세토나이트릴이다. 상기 샘플을 엑스브리지 C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(워터스) 상에서 양이온 분무 하에 실행시킨다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B까지의 범위이다.
상기 완충제 챔버 및 혈장 챔버 중의 화합물로부터의 피크 면적은 100% 화합물인 것으로 간주된다. 혈장에 결합된 백분율이 상기 결과로부터 유도되며 이를 혈장에 결합된 백분율로서 보고한다.
PBS 중 최종 시험 농도의 화합물의 용해도를 현미경에 의해 검사하여 침전의 관찰 여부를 나타낸다.
6.4. 마이크로솜 안정성
6.4.1. 마이크로솜 안정성 1 시간 배양 과정
DMSO 중의 화합물의 10 mM 모액을 96 깊은 웰 플레이트(그레이너, 카탈로그 번호 780285)에서 182 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4에서 1000 배 희석하고 37 ℃에서 예비배양한다.
40 ㎕의 탈이온수를 폴리프로필렌 매트릭스 2D 바코드 표지된 보관 튜브(써모 사이언티픽)의 웰에 가하고 37 ℃에서 예비배양한다.
글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH) 작용 모액을 182 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4 중에서 제조하고 사용전에 얼음상에 둔다. MgCl2, 글루코스-6-포스페이트 및 NADP+를 함유하는 보조인자를 탈이온수 중에서 제조하고 사용전에 얼음상에 둔다.
관심 종(인간, 마우스, 래트, 개)의 간 마이크로솜(제노테크(Xenotech)), 앞서 개시한 G6PDH 및 보조인자를 함유하는 최종 작용 용액을 제조하고 상기 혼합물을 실온에서 20 분 이하로 배양한다.
30 ㎕의 상기 예비배양된 화합물 희석물을 상기 매트릭스 튜브 중의 예열된 물 40 ㎕에 가하고 상기 마이크로솜 혼합물 30 ㎕를 가한다. 최종 반응 농도는 3 μM 화합물, 1 ㎎ 마이크로솜, 0.4 U/㎖ GDPDH, 3.3 mM MgCl2, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트 및 1.3 mM NADP+이다.
0 시간에서 화합물의 남은 백분율을 측정하기 위해서, MeOH 또는 MeCN을 상기 마이크로솜 혼합물의 첨가전에 상기 웰에 (1:1)로 가한다. 상기 플레이트를 매트릭스 세프라(Matrix Sepra) 밀봉제(매트릭스, 카탈로그 번호 4464)로 밀봉하고 수초간 진탕시켜 모든 성분들이 완전히 혼합되게 한다.
정지되지 않은 샘플들을 37 ℃, 300 rpm에서 배양하고 배양 1 시간 후에 반응을 MeOH 또는 MeCN(1:1)으로 정지시킨다.
상기 반응의 정지후에, 상기 샘플들을 혼합하고 30 분간 얼음상에 두어 단백질을 침전시킨다. 이어서 상기 플레이트를 1200 rcf에서 4 ℃에서 30 분 원심분리하고 상등액을 LCMS상에서의 분석을 위해 96 v-바닥 PP 플레이트(그레이너, 651201)로 옮긴다.
상기 플레이트를 밀봉 매트(MA96RD-04S, Kinesis, Cambs, PE19 8YX, UK)로 밀봉하고 샘플을 실온에서 콴옵티파이즈를 사용하여 최적화된 조건 하에서 LCMS(ZQ 1525, 워터스)상에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.
상기 샘플을 1 ㎖/분의 유량으로 LCMS 상에서 분석한다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 사용되는 정지 용액에 따라 메탄올 또는 아세토나이트릴이다. 상기 샘플을 엑스브리지 C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(워터스) 상에서 양이온 분무 하에 실행시킨다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B까지의 범위이다.
0 시간째에 모 화합물로부터의 피크 면적은 100% 남아있는 것으로 간주된다. 1 시간 배양후 남은 백분율은 0 시간으로부터 계산되며 남은 백분율로서 계산된다.완충제 중 최종 시험 농도의 화합물의 용해도를 현미경에 의해 검사하고 결과를 보고한다.
마이크로솜 안정성에 대한 데이터를 60 분 후에 남은 화합물의 총량의 백분율로서 나타낸다.
6.4.2. 마이크로솜 안정성 30 분 배양 과정
DMSO 중의 화합물의 10 mM 모액을 96 깊은 웰 플레이트(그레이너, 카탈로그 번호 780285)에서 105 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4에서 6 μM로 희석하고 37 ℃에서 예온한다.
700 U/㎖의 글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH, 롯슈, 10127671001) 작용 모액을 105 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4 중에서 인자 1:700으로 희석한다. 0.528 M MgCl2.6H2O(시그마, M2670), 0.528 M 글루코스-6-포스페이트(시그마, G-7879) 및 0.208 M NADP+(시그마, N-0505)를 함유하는 보조인자 혼합물을 105 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4 중에서 인자 1:8로 희석한다.
1 ㎎/㎖의 관심 종(인간, 마우스, 래트, 개...)의 간 마이크로솜(제공자, 제노테크), 0.8 U/㎖ G6PDH 및 보조인자 혼합물(6.6 mM MgCl2, 6.6 mM 글루코스-6-포스페이트, 2.6 mM NADP+)를 함유하는 작용 용액을 제조한다. 상기 혼합물을 실온에서 15 분간 예비배양하나, 결코 20 분을 넘어서는 안 된다.
예비 배양후, 화합물 희석물 및 상기 마이크로솜을 함유하는 혼합물을 함께 동량으로 가하고 300 rpm에서 30 분간 배양한다. 0 분의 시점에 대해서 2 부피의 메탄올을 상기 화합물 희석물에 가한 후 상기 마이크로솜 혼합물을 가한다. 배양 중 최종 농도는 3 μM 화합물 또는 대조용 화합물, 0.5 ㎎/㎖ 마이크로솜, 0.4 U/㎖ G6PDH, 3.3 mM MgCl2, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트 및 1.3 mM NADP+이다.
배양 30 분 후에, 상기 반응을 2 부피의 메탄올로 정지시킨다.
상기 두 시점 모두에서, 샘플들을 혼합하고, 원심분리하고, 상등액을 LC-MS/MS상에서의 분석을 위해 수확한다. 장비 반응(즉 피크 높이)을, 남은 화합물의 백분율을 측정하기 위해서 0 시점 샘플(100%로서)에 대해 참조한다. 표준 화합물 프로판올올 및 베라파밀을 상기 분석 설계에 포함시킨다.
마이크로솜 안정성에 대한 데이터를 30 분 후에 남은 화합물의 총량의 백분율로서 나타낸다.
간세포 안정성(상이한 종의 간세포 현탁액에서 화합물 II에 따른 100 μM[14C]-화합물의 24 시간 배양 후 화학식 II에 따른 화합물의 농도 및 그의 주요 대사산물(총 방사성의 %로서)).
6.5. Caco2 투과성
양방향 Caco-2 분석을 하기에 개시하는 바와 같이 수행한다. Caco-2 세포를 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC, cat 86010202)로부터 수득하고 이를 24-웰 트랜스웰 플레이트(피셔 TKT-545-020B)에서 21 일 세포 배양 후에 사용한다.
2 x 105 세포/웰을 DMEM + GlutaMAXI + 1% NEAA + 10% FBS(페이탈클론(FetalClone) II) + 1% Pen/Strep으로 이루어진 도말 배지에 시딩한다. 상기 배지를 매 2 내지 3일마다 교환한다.
시험 및 비교 화합물(프로프라놀올 및 로다민 123 또는 빈블라스틴, 모두 시그마로부터 구입하였다)을 25 mM HEPES(pH 7.4)를 함유하는 행크의 균형 염 용액 중에서 제조하고 이를 0.25%의 최종 DMSO 농도로, 10 μM의 농도에서 상기 트랜스웰 플레이트 조립체의 정점(125 ㎕) 또는 측저(600 ㎕) 챔버에 가한다.
50 μM 루시퍼 옐로우(시그마)를 모든 웰 중의 공여 완충제에 가하여 루시퍼 옐로우 침투를 모니터함으로써 세포 층의 통합성을 평가한다. 루시퍼 옐로우(LY)는 친지성 장벽을 자유롭게 투과할 수 없으므로, 높은 정도의 LY 운반은 상기 세포층의 불량한 통합성을 가리킨다.
150 rpm에서 궤도 진탕기에서 진탕시키면서 37 ℃에서 1 시간 배양 후에, 70 ㎕의 분액을 상기 정점(A) 및 기부(B) 챔버로부터 취하여 96 웰 플레이트 중에 분석 내부 표준(0.5 μM 카바마제핀)을 함유하는 100 ㎕의 50:50 아세토나이트릴:수 용액에 가한다.
루시퍼 옐로우를 측저 및 정점쪽으로부터의 액체 150 ㎕를 함유하는 깨끗한 96 웰 플레이트 중의 스펙트라맥스 제미니(Spectramax Gemini) XS(Ex 426 nm 및 Em 538 nm)로 측정한다.
상기 샘플들 중의 화합물의 농도를 고성능 액체-크로마토그래피/질량 분광학(LC-MS/MS)에 의해 측정한다.
겉보기 투과성(Papp) 값을 하기의 관계식으로부터 계산한다:
Papp = [화합물]수용체 최종 x V수용체/([화합물]공여체 초기 x V공여체)/Tinc x V공여체/표면적 x 60 x 10-6 ㎝/s
V = 챔버 부피
Tinc = 배양 시간.
표면적 = 0.33 ㎤
상기 정점 세포 표면으로부터 활성 유출의 지표로서 유출비를 PappB>A/Papp A>B의 비를 사용하여 계산한다.
하기의 분석 허용 기준을 사용한다:
프로프라놀올: Papp(A>B) 값 ≥ 20(x10-6 ㎝/s)
로다민 123 또는 빈블라스틴: Papp(A>B) 값 < 5(x10-6 ㎝/s), 유출비 ≥ 5.
루시퍼 옐로우 투과성: ≤ 100 ㎚/s
6.6. 패혈성 쇼크 모델
리포폴리사카라이드(LPS)의 주사는 말초에서 용해성 종양 괴사 인자(TNF-알파)의 빠른 방출을 유도한다. 상기 모델을 사용하여 생체내에서 TNF 방출의 유망한 차단제를 분석한다.
그룹당 6 마리의 BALB/cJ 암컷 마우스(20 g)를 의도된 1 회, po투여로 처리한다. 30 분 후에, LPS(15 ㎍/㎏; 이 콜라이 혈청형 0111:B4)를 ip 주사한다. 90분 후에, 마우스를 안락사시키고 채혈한다. 순환하는 TNF 알파 수준을 상업적으로 입수할 수 있는 ELISA 키트를 사용하여 측정한다. 덱사메타손(5 ㎍/㎏)을 기준 소염 화합물로서 사용한다.
6.7. MAB 모델
MAB 모델은 치료제에 의한 RA-형 염증 반응의 조절에 대한 빠른 평가를 허용한다(Khachigian LM. Nature Protocols (2006) 2512-2516: Collagen antibody-induced arthritis). DBA/J 마우스에게 콜라겐 II에 대한 mAb의 칵테일을 i.v. 주사한다. 1일 후에, 화합물 처리를 개시한다(비히클: 10% (v/v) HPβCD). 3일 후에, 마우스에게 i.p. LPS 주사(50 ㎍/마우스)를 제공하여, 빠른 염증의 개시를 발생시킨다. 화합물 처리를 상기 mAb 주사후 10일까지 속행한다. 앞발 팽창을 측정하고 각 발의 임상 점수를 기록함으로써 염증을 판독한다. 4 개 사지의 누적 임상 관절염 점수를 염증의 중증도를 보이기 위해 제공한다. 득점 시스템을 0-4의 규모를 사용하여 각 사지에 적용하고, 이때 4가 가장 심한 염증이다.
0 무증상
1 발목 또는 손목과 같은 한 가지 유형의 관절의 순하지만, 명확한 발적 및 팽창, 또는 병든 손발가락 수와 관계없이, 개별 손발가락으로 한정된 겉보기 발적 및 팽창
2 2 가지 이상의 유형의 관절의 보통의 발적 및 팽창
3 손발가락을 포함한 전체 발의 심한 발적 및 팽창
4 다수의 관절을 포함하여 최대로 염증을 일으킨 사지
6.8. 종양학 모델
JAK2-구동된 골수증식성 질병에 대한 소분자의 효능을 확인하기 위한 생체내 모델이 문헌[Wernig et al. Cancer Cell 13, 311, 2008 and Geron et al. Cancer Cell 13, 321, 2008]에 개시되어 있다.
6.9. 마우스 IBD 모델
IBD에 대한 소분자의 효능을 확인하기 위한 시험관내 및 생체내 모델이 문헌[Wirtz et al. 2007]에 개시되어 있다.
6.10. 마우스 천식 모델
천식에 대한 소분자의 효능을 확인하기 위한 시험관내 및 생체내 모델이 문헌[Nials et al., 2008]; [Ip et al. 2006]; [Pernis et al., 2002]; [Kudlacz et al., 2008]에 개시되어 있다.
최종 발언
당해 분야의 숙련가들은 상기 설명이 사실상 예시적이고 설명적이며, 본 발명과 그의 바람직한 실시태양들을 예시하고자 함을 알 것이다. 통상적인 실험을 통해서, 숙련가는 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행될 수 있는 명백한 변형 및 변화들을 인식할 것이다. 첨부된 청구의 범위 내에 있는 모든 상기와 같은 변형들을 포함시키고자 한다. 따라서, 본 발명을 상기 설명에 의해서가 아닌, 하기의 청구의 범위 및 그의 등가물들에 의해서 한정하고자 한다.
본 명세서에 인용된, 비제한적으로 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 공보들은, 각각의 개별적인 공보가 마치 완전히 개시된 것처럼 본 발명에 참고로 인용됨을 구체적이고 개별적으로 가리키는 바와 같이 본 발명에 참고로 인용된다.
상기 설명으로부터, 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가들에게 떠오를 것이다. 첨부된 특허청구범위의 범위내에 있는 상기와 같은 변형들을 모두 상기 중에 포함시키고자 한다.
다양한 화합물들의 차별적인 세포 침투 능력과 같은 인자들이 시험관 내 생화학에서 화합물의 활성과 세포 분석 간의 불일치에 기여할 수도 있음은 물론이다.
본 출원에 제공되고 나타낸 바와 같은 본 발명 화합물들의 화학 명칭들 중 적어도 일부는 상업적으로 입수할 수 있는 화학물질 명명 소프트웨어 프로그램의 사용에 의해 자동화된 토대로 발생될 수 있으며 독립적으로 입증되지는 않았다. 이러한 기능을 수행하는 전형적인 프로그램은 오픈 아이 소프트웨어 인코포레이티드(Open Eye Software, Inc.)에 의해 판매되는 렉시켐(Lexichem) 명명 도구 및 MDL, Inc.에 의해 판매되는 오토놈(Autonom) 소프트웨어 도구를 포함한다. 상기 나타낸 화학물질 명칭 및 도시된 구조가 상이한 경우에, 상기 도시된 구조는 억제될 것이다.
본 발명에 나타낸 화학적 구조는 켐드로우(ChemDraw)(등록상표) 또는 ISIS(등록상표)/DRAW를 사용하여 제조되었다. 본 발명의 구조에서 탄소, 산소 또는 질소 원자 상에 존재하는 임의의 개방 원자가는 수소 원자의 존재를 가리킨다. 키랄 중심이 상기 구조 중에 존재하고 특이적인 입체 화학을 상기 키랄 중심에 대해 나타내지 않은 경우, 상기 키랄 구조와 관련된 2 개의 거울상이성체가 모두 상기 구조에 의해 포함된다.
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  8. 하기 화학식 I에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    화학식 I
    Figure 112019093955881-pct00020
  9. 제 8 항에 있어서,
    추가적인 치료제를 또한 포함하는 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    추가적인 치료제가 류마티스성 관절염 치료제인 약학 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서,
    추가적인 치료제가 하기 화학식 II에 따른 약학 조성물:
    화학식 II
    Figure 112015005936003-pct00021
  12. 제 11 항에 있어서,
    화학식 II/화학식 I의 중량비가 1/5 내지 1/20인 약학 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    화학식 II/화학식 I의 중량비가 1/5 내지 1/10인 약학 조성물.
  14. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물에 사용하기 위한 약학 조성물.
  15. 하기 화학식 I에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 염증 상태 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    화학식 I
    Figure 112019093955881-pct00029
  16. 하기 화학식 I에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 자가면역 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    화학식 I
    Figure 112019093955881-pct00030
  17. 하기 화학식 I에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 알러지 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    화학식 I
    Figure 112019093955881-pct00031
  18. 하기 화학식 I에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 이식 거부 치료용 약학 조성물:
    화학식 I
    Figure 112019093955881-pct00032
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