TWI536990B - 用於治療退化性及發炎性疾病之新穎化合物 - Google Patents

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Description

用於治療退化性及發炎性疾病之新穎化合物
本發明係關於作為JAK抑制劑之化合物，其係涉及以下疾病之酪胺酸激酶家族：發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。特定而言，本發明化合物可抑制JAK1及/或JAK2。本發明亦提供產生本發明化合物之方法、包括本發明化合物之醫藥組合物、藉由投與本發明化合物來預防及/或治療以下疾病之方法：涉及發炎性病狀之疾病、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
Janus激酶(JAK)係將細胞因子信號自膜受體轉導至STAT轉錄因子之細胞質酪胺酸激酶。闡述四個JAK家族成員：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。在細胞因子結合至其受體後，JAK家族成員自磷酸化及/或彼此轉磷酸化、之後STAT發生磷酸化，隨後磷酸化STAT遷移至細胞核以調節轉錄。JAK-STAT細胞內信號轉導作用於干擾素、大多數介白素、以及各種細胞因子及內分泌因子，例如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF及PRL(Vainchenker W.等人(2008))。
遺傳模型及小分子JAK抑制劑研究之組合揭示若干種JAK之治療潛力。小鼠及人類遺傳學研究確認JAK3可作 為免疫-阻抑靶標(O'Shea J.等人(2004))。JAK3抑制劑已成功地用於臨床研發中，最初用於器官移植排斥但稍後亦用於其他免疫-發炎性適應症，例如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬及克羅恩氏病(Crohn's disease)(http：//clinicaltrials.gov/)。
人類遺傳學及小鼠敲除研究已確認，TYK2係免疫-發炎性疾病之潛在靶標(Levy D.及Loomis C.(2007))。
JAK1及/或JAK2係免疫-發炎性疾病領域之靶標。JAK1及/或JAK2與其他JAK發生異源二聚化以轉導細胞因子引發之促發炎信號傳導。因此，令人感興趣的是，藉由抑制JAK1及/或JAK2來治療免疫-發炎性疾病(具有使用JAK1及/或JAK2信號傳導之與病理學有關之細胞因子，例如IL-6、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、IL-23或IFNγ)以及由JAK調介之信號轉導引發之其他疾病。
軟骨退化係各種疾病之標誌，其中類風濕性關節炎及骨關節炎最顯著。類風濕性關節炎(RA)係一種慢性關節退化性疾病，其特徵在於關節結構發炎及受到破壞。若不對該疾病加以抑制，則其會導致實質失能及因喪失關節功能而引發之疼痛以及甚至過早死亡。因此，RA治療之目標不僅是減緩疾病而且是達到好轉以終止關節破壞。除疾病結果之嚴重性外，RA之高患病率(全世界約0.8%的成人受侵襲)亦意味著高社會-經濟影響。(關於RA之綜述參見Smolen及Steiner(2003)；Lee及Weinblatt(2001)；Choy及 Panayi(2001)；O'Dell(2004)及Firestein(2003))。
JAK1及JAK2與用於許多細胞因子及激素之細胞內信號轉導有關。可藉由JAK1及/或JAK2抑制劑來改善與該等細胞因子及激素中之任一者有關之病況。因此，若干過敏、發炎及自體免疫病症可獲益於本發明所述化合物之治療，該等病症包含類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、幼年型特發性關節炎、骨關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、組織纖維化、嗜酸性發炎、食道炎、發炎性腸病(例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎)、移植、移植物抗宿主疾病、牛皮癬、肌炎、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎、多發性硬化(Kopf等人，2010)。
骨關節炎(亦稱為OA或磨損關節炎)係關節炎之最常見形式且其特徵在於無關節軟骨，其通常與骨肥大及疼痛有關。關於骨關節炎之廣泛綜述參見Wieland等人(2005)。
骨關節炎難以治療。目前，尚不能治癒且治療著重於減輕疼痛及防止受影響關節變形。常見治療包含使用非類固醇消炎藥物(NSAID)。儘管人們已主張飲食補充品(例如，軟骨素及硫酸葡萄糖胺)作為治療骨關節炎之安全及有效選擇，但最近臨床試驗表明該兩種治療皆不減輕與骨關節炎有關之疼痛。(Clegg等人，2006)。
刺激合成代謝過程、阻斷分解代謝過程或該兩者之組合可使得軟骨穩定，且甚至可能使損害逆轉，且因此防止疾病進一步進展。已研發出矯正在形成骨關節疾病期間出現 之關節軟骨病損的治療方法，但迄今無一方法能夠調介關節軟骨在原位及活體內之再生。概言之，尚未獲得改良骨關節炎疾病之藥物。
Vandeghinste等人(WO 2005/124342)發現JAK1可作為其抑制可能對於包含OA之若干疾病具有治療相關性的靶標。小鼠中JAK1基因之敲除證實JAK1在發育期間起基本及非冗餘作用：JAK1-/-小鼠在出生後24 h內死亡且淋巴細胞發育嚴重受損。另外，JAK1 -/-細胞不或較少與使用II類細胞因子受體之細胞因子、使用信號傳導用γ-c亞單位之細胞因子受體及使用信號傳導用gp130亞單位之細胞因子受體的家族反應(Rodig等人，1998)。
軟骨細胞生物學中有多個群組涉及JAK-STAT信號傳導。Li等人(2001)展示製瘤素M藉由活化JAK/STAT及MAPK信號傳導路徑誘導在初級軟骨細胞中表現MMP及TIMP3基因。Osaki等人(2003)展示，軟骨細胞中膠原II之干擾素-γ調介之抑制涉及JAK-STAT信號傳導。IL1-β藉由降低基質組份之表現及藉由誘導膠原酶及誘導型一氧化氮合酶(NOS2)(其調介一氧化氮(NO)之產生)之表現來誘導軟骨分解代謝。Otero等人(2005)展示瘦素及IL1-β協同誘導軟骨細胞中NO之產生或NOS2 mRNA之表現，且展示此係由JAK抑制劑阻斷。Legendre等人(2003)展示IL6/IL6受體會誘導軟骨專用基質基因膠原II、聚集蛋白聚糖核及牛關節軟骨細胞中之連接蛋白下調，且展示此係由JAK/STAT信號傳導調介。因此，該等觀測結果表現JAK激酶活性在 軟骨內穩態中之作用及JAK激酶抑制劑之治療機會。
人們已發現在包含骨髓組織增殖性病症之其他病狀中亦涉及JAK家族成員(O'Sullivan等人，2007，Mol Immunol 44(10)：2497-506)，其中已鑑別出JAK2中之突變。此表明JAK(尤其JAK2)之抑制劑亦可用於治療骨髓組織增殖性病症。另外，JAK家族(尤其JAK1、JAK2及JAK3)與癌症(尤其係白血病，例如急性骨髓性白血病(O'Sullivan等人，2007,Mol Immunol.44(10)：2497-506；Xiang等人，2008,「Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia」Blood First Edition Paper，2007年12月26日在線預公開；DOI 10.1182/blood-2007-05-090308)及急性成淋巴細胞性白血病(Mullighan等人，2009)；或實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤(Constantinescu等人，2007,Trends in Biochemical Sciences 33(3)：122-131)、前列腺癌(Tam等人，2007,British Journal of Cancer,97,378-383))有關。該等結果表明，JAK(尤其JAK1及/或JAK2)之抑制劑亦可用於治療癌症(白血病及實體腫瘤(例如子宮平滑肌肉瘤、前列腺癌))。
此外，卡斯爾曼病(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、腎小球膜增殖性腎小球腎炎、牛皮癬及卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)可能係由於細胞因子IL-6分泌過多所致，細胞因子IL-6之生物效應係由細胞內JAK-STAT信號傳導調介(Tetsuji Naka、Norihiro Nishimoto及Tadamitsu Kishimoto，Arthritis Res 2002,4(增刊3)：S233-S242)。此 結果展示，JAK抑制劑亦可用於治療該等疾病。
當前療法並不令人滿意且由此業內仍需要進一步鑑別可用於治療以下疾病之化合物：發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病(例如骨關節炎、類風濕性關節炎及骨質疏鬆，尤其骨關節炎及類風濕性關節炎)。本發明由此提供一種化合物、其製造方法及包括本發明化合物以及適應醫藥載劑之醫藥組合物。本發明亦提供本發明化合物在製備用於治療以下疾病之藥劑中之用途：發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病(例如骨關節炎、類風濕性關節炎及骨質疏鬆，尤其骨關節炎及類風濕性關節炎)。
本發明係基於如下發現：本發明化合物能夠用作JAK抑制劑且可用於治療發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。在一具體態樣中，本發明化合物係JAK1及/或JAK2之抑制劑。本發明亦提供產生此化合物之方法、包括此化合物之醫藥組合物及藉由投與本發明化合物來治療以下疾病之方法：發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與 IL6或干擾素分泌過多有關之疾病，。
因此，在本發明之第一態樣中，提供式(I)之本發明化合物：
在一特定實施例中，本發明化合物係JAK1及/或JAK2之抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供包括本發明化合物及醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之醫藥組合物。另外，可用於本文所揭示醫藥組合物及治療方法中之本發明化合物在製備及使用時皆呈醫藥上可接受之形式。在本發明之此態樣中，醫藥組合物可另外進一步包括適於與本發明化合物組合使用之活性成份。
在本發明之另一態樣中，本發明提供治療易患或患有如下病狀之哺乳動物之方法：來自本文所列示彼等病狀之病狀及尤其可與異常JAK活性有關之病狀(例如發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病)，該方法包括投與有效量之本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一具體實施例中，該病狀 與異常JAK1及/或JAK2活性有關。
在另一態樣中，本發明提供用作藥劑之本發明化合物或包括本發明化合物之醫藥組合物。在一具體實施例中，該醫藥組合物另外包括另一活性成份。
在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防如下病狀之本發明化合物：選自本文所列示彼等病狀之病狀，尤其可與異常JAK活性有關之病狀，例如發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或患有如下病狀之哺乳動物之方法：其與異常JAK活性因果相關，尤其係發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病，且包括投與有效病狀治療或病狀預防量之本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一具體態樣中，病狀與異常JAK1及/或JAK2活性因果相關，尤其係發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防如下病狀之本發明化合物：其與異常JAK活性因果相關，尤其係發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、 涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
在其他態樣中，本發明提供合成本發明化合物之方法，其中代表性合成方案及路徑將稍後揭示於本文中。
因此，本發明之主要目的係提供一種新穎化合物，其可改良JAK活性且由此防止或治療可能與其因果相關之任何病狀。在一具體態樣中，本發明化合物調節JAK1及/或JAK2之活性。
本發明之另一目的係提供可治療或減輕可與JAK活性(尤其JAK1及/或JAK2)因果相關之病狀或其症狀之化合物，該病狀係(例如)發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
本發明之又一目的係提供可用於治療或預防各種疾病狀態之醫藥組合物，該等疾病狀態包含與JAK活性有關之疾病，例如發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。在一具體實施例中，疾病與JAK1及/或JAK2活性有關，尤其係發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
藉由考慮隨後之詳細說明，彼等熟習此項技術者將明瞭其他目的及優點。
定義
下列術語意欲具有下文所述關於其之含義且可用於理解本發明之說明及既定範圍。
當闡述本發明(其可包含化合物、含有該等化合物之醫藥組合物及使用該等化合物及組合物之方法)時，除非另有說明，否則下列術語(若存在)具有下列含義。亦應理解，當於本文中闡述時，任何下文所定義之部分皆可經各種取代基取代，且各別定義意欲將該等經取代部分包含於其下述範圍內。除非另有說明，否則術語「經取代」欲如下文所述來定義。應進一步理解，在本文中使用時認為術語「基團(group)」及「基團(radical)」可互換使用。
本文可使用之冠詞「一」(a及an)係指一個或一個以上(亦即至少一個)的該冠詞之文法受詞。舉例而言，「一類似物」意指一個類似物或一個以上之類似物。
如本文中所使用，術語「JAK」涉及Janus激酶(JAK)家族，其係將細胞因子信號自膜受體轉導至STAT轉錄因子之細胞質酪胺酸激酶。闡述以下4個JAK家族成員：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，且術語JAK可根據上下文所指定係指全部所有JAK家族成員或JAK家族成員中之一或多者。
「烷氧基」係指基團-OR26，其中R26係C1-8烷基。特定烷氧基係甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、第二丁氧基、正戊氧基、正己氧基及 1,2-二甲基丁氧基。特定烷氧基係低碳烷氧基，亦即具有1至6個碳原子。其他特定烷氧基具有1至4個碳原子。
「烷基」意指具有1至20個碳原子之直鏈或具支鏈脂肪族烴。特定烷基具有1至12個碳原子。更特定而言係具有1至6個碳原子之低碳烷基。更特定基團具有1至4個碳原子。實例性直鏈基團包含甲基、乙基、正丙基及正丁基。具支鏈意指一或多個低碳烷基(例如甲基、乙基、丙基或丁基)附接至直鏈烷基鏈，實例性具支鏈基團包含異丙基、異丁基、第三丁基及異戊基。
「芳基」係指藉由自母體芳族環系統之單一碳原子去除一個氫原子獲得之單價芳族烴基團。特定而言，芳基係指指定環原子數之單環或多環芳族環結構。具體而言，該術語包含含有6至10個環成員之基團。其中芳基係單環系統，其優先含有6個碳原子。特定而言，芳基包含苯基、萘基、茚基及四氫萘基。
「經取代」係指一或多個氫原子各自獨立地經一或多個相同或不同取代基代替之基團。
「醫藥上可接受」意指已獲得聯邦或州政府管理機構或除美國外之國家的相應機構批准或可獲得批准或已；列示於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認藥典中用於動物(且更特定而言用於人類)中者。
「醫藥上可接受之鹽」係指醫藥上可接受且具有母體化合物之期望藥理活性之本發明化合物的鹽。特定而言，該等無毒性鹽可為無機或有機酸加成鹽及鹼加成鹽。具體而 言，該等鹽包含：(1)酸加成鹽，由無機酸形成，該等無機酸係(例如)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及諸如此類；或由有機酸形成，該等有機酸係(例如)乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、甲烷磺酸、乙磺烷酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸，葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸(muconic acid)及諸如此類；或(2)當存在於母體化合物中之酸性質子經金屬離子(例如鹼金屬離子、鹼土金屬離子或鋁離子)代替時或與有機鹼(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺及諸如此類)配位時形成之鹽。鹽進一步包含(僅作為實例)鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、四烷基銨鹽及諸如此類；且當化合物含有鹼性官能基時，為無毒性有機或無機酸之鹽，例如，鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽及諸如此類。術語「醫藥上可接受之陽離子」係指可接受之酸性官能基之陽離子抗衡離子。該等陽離子例示為鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨陽離子及諸如此類。
「醫藥上可接受之媒劑」係指與本發明化合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。
「前藥」係指具有可裂解基團且可藉由溶劑分解或在生理學條件下變為在活體內具有醫藥活性之本發明化合物的化合物，包含本發明化合物之衍生物。該等實例包含但不限於膽鹼酯衍生物及諸如此類、N-烷基嗎啉酯及諸如此類。
「溶劑合物」係指通常藉由溶劑分解反應與溶劑締合之化合物形式。此物理締合包含氫鍵結。習用溶劑包含水、乙醇、乙酸及諸如此類。本發明化合物可以(例如)結晶形式製得且可發生溶合或水合。適宜溶劑合物包含醫藥上可接受之溶劑合物(例如水合物)，且進一步包含化學計量溶劑合物及非化學計量溶劑合物二者。在某些情形下，例如當一或多個溶劑分子納入結晶固體之晶格中時，溶劑合物能夠發生解離。「溶劑合物」包含溶液相及可解離溶劑合物二者。代表性溶劑合物包含水合物、乙醇合物及甲醇合物。
「個體」包含人類。術語「人類」、「患者」及「個體」在本文中可互換使用。
「治療有效量」意指當投與個體以治療疾病時化合物足以實現此疾病治療之量。「治療有效量」可端視該化合物、疾病及其嚴重程度以及擬治療個體之年齡、體重等情況而有所變化。
「防止」(preventing或prevention)係指降低患上或發生疾病或病症之風險(亦即，在疾病發作前使得在暴露於致病因素或易感染該疾病之個體中不出現該疾病之至少一種 臨床症狀)。
術語「預防」係指「防止」，且係指目的為防止而非治療或治癒疾病之措施或程序。預防性措施之非限制性實例可包含投與疫苗；向由於(例如)缺少運動而具有血栓形成風險之住院患者投與低分子量肝素；及在拜訪瘧疾係地方病或感染瘧疾之風險較高之地理區域時提前投與抗瘧疾劑(例如氯喹(chloroquine))。
在一實施例中，任一疾病或病症之「治療」(treating或treatment)係指改善該疾病或病症(亦即，阻止該疾病或減緩其至少一種臨床症狀之表現、程度或嚴重性)。在另一實施例中，「治療」係指改善個體不能感受到之至少一個物理參數。在又一實施例中，「治療」係指在物理方面調節疾病或病症(例如，穩定可感受到之症狀)或在生理學方面調節疾病或病症(例如，穩定物理參數)或二者兼有。在又一實施例中，「治療」係指減緩疾病進展。
如本文所使用，術語「過敏」係指特徵在於免疫系統之過敏病症之病狀群，包含過敏性呼吸道疾病(例如哮喘、鼻炎)、鼻竇炎、濕疹及蕁麻疹以及食物過敏或昆蟲毒素過敏。
如本文所使用，術語「發炎性病狀」係指包含以下之病狀之群：類風濕性關節炎、骨關節炎、幼年型特發性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘、鼻炎)、發炎性腸病(例如，克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎)、內毒素引發之疾病狀態(例如，搭橋手術後併發症 或促成(例如)慢性心力衰竭之慢性內毒素狀態)及涉及軟骨之相關疾病(例如關節之相關疾病)。特定而言，該術語係指類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘)及發炎性腸病，
如本文所使用，術語「自體免疫疾病」係指包含以下之疾病群：阻塞性呼吸道疾病(包含例如以下病狀：COPD、哮喘(例如，內源性哮喘、外源性哮喘、粉塵性哮喘、小兒哮喘)，尤其慢性或頑固性哮喘(例如，遲發性哮喘及呼吸道高反應性)、枝氣管炎(包含枝氣管炎哮喘)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、薛格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、多發性硬化、牛皮癬、乾眼病、I型糖尿病及其相關併發症、特應性濕疹(特應性皮炎)、接觸性皮炎及其他濕疹性皮炎、炎性腸疾病(例如，克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎)、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎、動脈粥樣硬化及脊萎縮側鎖硬化。特定而言，該術語係指COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病及發炎性腸病。
如本文所使用，術語「增殖性疾病」係指例如以下病狀：癌症(例如，子宮平滑肌肉瘤或前列腺癌)、骨髓組織增殖性病症(例如，真性紅細胞增多症、原發性血小板增多症及骨髓纖維化)、白血病(例如，急性髓性白血病、急性及慢性成淋巴細胞性白血病)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、再狹窄症、硬化性皮炎或纖維化。特定而言，該術語係指癌症、白血病、多發性骨髓瘤及牛皮癬。
如本文所使用，術語「癌症」係指皮膚或身體器官(例如但不限於乳房、前列腺、肺、腎、胰腺、胃或腸)中細胞之惡性或良性贅生物。癌症易於滲入鄰近組織並擴散(轉移)至遠隔器官，例如骨、肝、肺或腦。如本文所使用，術語癌症包含轉移性腫瘤細胞類型(例如但不限於黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及肥大細胞瘤)及組織癌瘤類型(例如但不限於結直腸癌、前列腺癌、小細胞肺癌及非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、膠質母細胞瘤、原發性肝癌、卵巢癌、前列腺癌及子宮平滑肌肉瘤)二者。
如本文所使用，術語「白血病」係指血液及血液形成器官之瘤形成疾病。該等疾病可造成骨髓及免疫系統功能障礙，此致使宿主極易受感染及出血影響。特定而言，術語白血病係指急性髓性白血病(AML)及急性成淋巴細胞性白血病(ALL)及慢性成淋巴細胞性白血病(CLL)。
如本文所使用，術語「移植排斥」係指(例如)胰島、幹細胞、骨髓、皮膚、肌肉、角膜組織、神經元組織、心臟、肺、組合之心肺、腎、肝、腸、胰腺、氣管或食道之細胞、組織或實體器官同種-或異種移植物的急性或慢性排斥或移植物抗宿主病。
如本文所使用，術語「涉及軟骨代謝損傷之疾病」包含例如以下病狀：骨關節炎、牛皮癬性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、痛風性關節炎、敗血性或感染性關節炎、反應性關節炎、反射性交感神經營養障礙、痛性營養障礙、 提策(Tietze)症候群或肋軟骨炎、纖維肌痛、骨軟骨炎、神經原性或神經病性關節炎、關節病、關節炎之地方性形式(例如地方性變形性骨關節炎)、Mseleni病及Handigodu病；由纖維肌痛、全身性紅斑狼瘡、硬皮病及強直性脊柱炎造成之退化。
如本文所使用，術語「先天軟骨畸形」包含例如以下病狀：遺傳性軟骨溶解、軟骨發育不全及假軟骨發育不全，尤其但不限於小耳畸形、無耳畸形、幹骺端軟骨發育不全及相關病症。
如本文所使用，術語「與IL6分泌過多有關之疾病」包含例如以下病狀：卡斯爾曼病、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡波西肉瘤及/或腎小球膜增殖性腎小球腎炎。
如本文所使用，術語「與干擾素分泌過多有關之疾病」包含例如以下病狀：全身性及皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、類風濕性關節炎。
「本發明化合物」及等效措辭意欲涵蓋具有本文所述式之化合物，若上下文允許，則該措辭包含醫藥上可接受之鹽及溶劑合物(例如水合物)及醫藥上可接受之鹽之溶劑合物。類似地，當提及中間體時，不管其本身是否提出申請，若上下文允許，其均意欲涵蓋其鹽及溶劑合物。
當在本文中提及範圍(例如但不限於C18烷基)時，所述範圍應視為該範圍各成員之表示。
本發明化合物之其他衍生物以其酸及酸衍生物形式皆具有活性，但酸敏形式在哺乳動物有機體中通常提供溶解 度、組織相容性或緩釋益處(參見Bundgard,H.,Design of Prodrugs，第7至9頁，21-24,Elsevier,Amsterdam 1985)。前藥包含業內從業者熟知之酸衍生物，例如藉由使母體酸與適宜醇反應製備之酯或藉由使母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應製備之醯胺或酸酐或混合酐。衍生自本發明化合物酸性側基之簡單脂肪族或芳族酯、醯胺及酐係特別有用之前藥。在一些情形下，期望製備雙酯型前藥，例如(醯氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。該等前藥尤其係本發明化合物之C1-C8烷基、C2-8烯基、芳基、C7-12經取代芳基及C7-12芳烷基酯。
如本文所使用，術語「同位素變體」係指於構成化合物之一或多個原子處以非天然比例含有同位素之該化合物。舉例而言，化合物之「同位素變體」可含有一或多個非放射性同位素，例如氘(2H或D)、碳-13(13C)、氮-15(15N)或諸如此類。應理解，在進行該同位素取代之化合物中，下列原子(若存在)可變以使(例如)任一氫可為2H/D、任一碳可為13C、或任一氮可為15N，且該等原子之存在及替換可由熟習此項技術者確定。同樣，在(例如)所得化合物可用於藥物及/或基質組織分佈研究中之情形下，本發明可包含製備具有放射性同位素之同位素變體。放射性同位素氚(亦即3H)及碳-14(亦即14C)因易於納入且容易檢測而尤其可用於此目的。另外，可製備經正電子發射同位素(例如11C、18F、15O及13N)取代之化合物且該等化合物可在正電子發射斷層掃描(PET)研究中用來檢驗基質受體佔據情 況。
本文提供之化合物之所有同位素變體，不管是放射性還是非放射性，皆意欲涵蓋於本發明範圍內。
亦應理解，具有相同分子式但其原子之鍵結的性質或順序不同或其原子空間排列不同之化合物稱為「異構體」。原子空間排列不同之異構體稱為「立體異構體」。
彼此非鏡像之立體異構體稱為「非對映異構體」且彼等彼此為不可疊合鏡像者稱為「對映異構體」。當化合物具有不對稱中心(例如其與4個不同基團鍵結)時，可能存在一對對映異構體。對映異構體之特徵在於其不對稱中心之絕對構型且可由Cahn及Prelog之R-及S-排序規則或由分子旋轉偏振光平面之方式來闡述並稱為右旋或左旋(亦即，分別稱為(+)-或(-)異構體)。對掌性化合物可以單獨對映異構體或以其混合物之形式存在。含有相同比例對映異構體之混合物稱為「外消旋混合物」。
「互變異構體」係指具有特定化合物結構之相互轉換形式且在氫原子及電子替換方面不同之化合物。因此，兩個結構可經由π電子及原子(通常為H)運動達到平衡。舉例而言，烯醇及酮係互變異構體，此乃因其可藉由使用酸或鹼處理快速地發生互變。互變異構現象之另一實例係苯基硝基甲烷之酸-及硝基形式，其同樣係藉由使用酸或鹼處理形成。
互變異構形式可能與達成目標化合物之最佳化學反應性及生物活性有關。
除非另有說明，否則當本說明書及申請專利範圍中闡述或命名特定化合物時意欲包含單獨對映異構體及其混合物(外消旋或相反)二者。確定立體化學之方法及立體異構體之分離方法已為此項技術熟知。
化合物
本發明係基於如下鑑別結果：本發明化合物係JAK抑制劑其可用於治療發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。本發明亦提供產生本發明化合物之方法、包括本發明化合物之醫藥組合物及藉由投與本發明化合物來治療以下疾病之方法：發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。在一具體實施例中，本發明化合物係JAK1及/或JAK2之抑制劑。
因此，在本發明之第一態樣中，本發明化合物具有式(I)：
在一實施例中，本發明化合物並非同位素變體。
在一態樣中，本發明化合物呈現為游離鹼形式。
在一態樣中，本發明化合物係醫藥上可接受之鹽。
在一態樣中，本發明化合物係化合物之溶劑合物。
在一態樣中，本發明化合物係化合物之醫藥上可接受之鹽之溶劑合物。
在某些態樣中，本發明提供本發明化合物之前藥及衍生物。前藥係本發明化合物之衍生物，其具有代謝可裂解基團且藉由溶劑分解或在生理條件下變為在活體內具有醫藥活性之本發明化合物。該等實例包含但不限於膽鹼酯衍生物及諸如此類、N-烷基嗎啉酯及諸如此類。
本發明化合物之其他衍生物之酸及酸衍生物形式二者皆具有活性，但酸敏衍生物形式經常在哺乳動物有機體中提供溶解度、組織相容性或緩釋益處(參見Bundgard,H.,Design of Prodrugs，第7至9頁，21-24,Elsevier,Amsterdam 1985)。前藥包含業內從業者熟知之酸衍生物，例如藉由使母體酸與適宜醇反應製備之酯或藉由使母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應製備之醯胺或酸酐或混合酐。衍生自本發明化合物酸性側基之簡單脂肪族或芳族酯、醯胺及酐係較佳前藥。在一些情形下，期望製備雙酯型前藥，例如(醯氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。尤其有用者係本發明化合物之C1-C8烷基、C2-8烯基、芳基、C7-12經取代芳基及C7-12芳烷基酯。
本發明化合物係JAK之新穎抑制劑。特定而言，化合物係JAK1及/或JAK2之有效抑制劑，然而其可以較低功效抑 制TYK2及JAK3。
醫藥組合物
在用作藥物時，本發明化合物通常以醫藥組合物形式投與。該等組合物可以醫藥界習知之方式來製備且其包括至少一種活性化合物。通常，本發明化合物係以醫藥有效量投與。該化合物的實際投與量通常可由醫師根據包含下列相關情況來決定：欲治療之病狀、所選投與途徑、實際投與之化合物、個別患者之年齡、體重及反應、患者症狀之嚴重程度及諸如此類。
本發明之醫藥組合物可藉由包含經口、經直腸、經皮、經皮下、經關節內、經靜脈內、經肌內及經鼻內在內之多種途徑投與。端視既定遞送途徑而定，較佳地將本發明化合物調配為可注射或口服組合物或調配為均用於經皮投與之油膏、洗液或貼劑。
用於經口投與之組合物可採取散裝液體溶液或懸浮液或鬆散粉末形式。然而，更通常地，該等組合物係以單位劑型提供以有利於精確投藥。術語「單位劑型」係指適於作為單一劑量用於人類個體及其他哺乳動物之物理離散單位，各單位含有經計算可產生期望治療效應之預定量的活性材料以及適宜醫藥賦形劑、媒劑或載劑。典型單位劑型包含液體組合物之預填充、預量測安瓿或唧筒或在固體組合物之情形下包含丸劑、錠劑、膠囊或諸如此類。在該等組合物中，本發明化合物通常係次要組份(約0.1重量%至約50重量%或較佳為約1重量%至約40重量%)，且剩餘部分 係有利於形成期望劑型之各種媒劑或載劑及加工助劑。
適於經口投與之液體形式可包括具有緩衝液、懸浮及分散劑、著色劑、矯味劑及諸如此類之適宜水性或非水性媒劑。固體形式可包括(例如)任一以下成份或具有相似性質之化合物：黏結劑，例如微晶纖維素、黃著膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖；崩解劑，例如海藻酸、澱粉羥基乙酸鈉或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；滑動劑，例如膠質二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味矯味劑。
可注射組合物通常係基於可注射無菌鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水或業內熟知之其他可注射載劑。如前文所述，該等組合物中之活性化合物通常係次要組份，通常佔約0.05重量%至10重量%，而剩餘部分係可注射載劑及諸如此類。
通常將經皮組合物調配為局部軟膏或乳霜，其含有通常介於約0.01重量%至約20重量%、較佳約0.1重量%至約20重量%、較佳約0.1重量%至約10重量%、且更佳約0.5重量%至約15重量%之量的活性成份。當調配為軟膏時，活性成份通常可與石蠟或水可混溶軟膏基質組合。另一選擇為，可使用(例如)水包油乳霜基質將活性成份調配成乳霜。該等經皮調配物已為業內所熟知且通常包含其他成份以增強活性成份或調配物之真皮滲透性或穩定性。所有該等習知經皮調配物及成份均包含於本發明範圍內。
本發明化合物亦可藉由經皮裝置投與。因此，經皮投與可使用儲層或多孔膜型貼劑或固體基質類貼劑來實現。
可經口投與、可注射或局部投與之組合物的上述組份僅具代表性。其他材料以及處理技術及諸如此類闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences(第17版，1985，Mack Publishing公司，Easton，Pennsylvania)之第8部分中，該文件係以引用方式併入本文中。
本發明化合物亦可以緩釋形式或自緩釋藥物遞送系統投與。代表性緩釋材料之說明可參見Remington's Pharmaceutical Sciences。
下列調配物實例闡釋可根據本發明製備之代表性醫藥組合物。然而，本發明並不限於下列醫藥組合物。
調配物1-錠劑
可將本發明化合物與乾燥明膠黏結劑以約1：2之重量比混合成乾燥粉末。可添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。該混合物可在壓錠機中形成240-270 mg錠劑(80-90 mg活性醯胺化合物/錠劑)。
調配物2-膠囊
可將本發明化合物與澱粉稀釋劑以約1：1之重量比混合成乾燥粉末。可將該混合物填充成250 mg膠囊(125 mg活性醯胺化合物/膠囊)。
調配物3-液體
可將本發明化合物(125 mg)與蔗糖(1.75 g)及黃原膠(4 mg)混合且可摻和所得混合物、使其經過10號U.S.網篩，且然後與先前製得之微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉(11：89，50 mg)之水溶液混合。可使用水稀釋苯甲酸鈉(10 mg)、矯味劑及著色劑且邊攪拌邊添加。然後邊攪拌邊添加足夠水。然後可進一步添加足夠水以產生5 ml之總體積。
調配物4-錠劑
可將本發明化合物與乾燥明膠黏結劑以約1：2之重量比混合成乾燥粉末。可添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。可在壓錠機中使該混合物形成450-900 mg錠劑(150-300 mg活性醯胺化合物)。
調配物5-注射劑
可將本發明化合物溶解或懸浮於緩衝無菌鹽水可注射水性介質中至約5 mg/ml之濃度。
調配物6-局部調配物
可在約75℃下將硬脂醇(250 g)及白礦脂(250 g)熔化且然後可添加溶於水(約370 g)中之本發明化合物(50 g)、對羥基苯甲酸甲酯(0.25 g)、對羥基苯甲酸丙酯(0.15 g)、月桂基硫酸鈉(10 g)及丙二醇(120 g)之混合物且可攪拌所得混合物直至其凝結為止。
治療方法
可使用本發明化合物作為治療哺乳動物中與JAK活性異常因果相關或歸因於其之病狀的治療劑。特定而言，該等病狀與JAK1及/或JAK2之異常活性相關。
因此，本發明之化合物及醫藥組合物可作為治療劑用於預防及/或治療哺乳動物(包含人類)之發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、過敏、移植排斥、涉及軟骨代謝損 傷之疾病、先天性軟骨畸形及與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
在一態樣中，本發明提供用作藥劑之本發明化合物或包括本發明化合物之醫藥組合物。
在治療態樣之方法中，本發明提供治療易患或患有過敏反應之哺乳動物的方法。在一具體實施例中，本發明提供治療過敏性呼吸道疾病、鼻竇炎、濕疹及蕁麻疹、食物過敏或昆蟲毒素過敏之方法。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防過敏反應。在一具體實施例中，本發明提供治療過敏性呼吸道疾病、鼻竇炎、濕疹及蕁麻疹、食物過敏或昆蟲毒素過敏之方法。
在治療態樣之其他方法中，本發明提供治療易患或患有發炎性病狀之哺乳動物的方法。該等方法包含投與有效病狀治療或病狀預防量之一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一具體實施例中，發炎性病狀係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如，哮喘)及發炎性腸病。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防發炎性病狀。在一具體實施例中，發炎性病狀係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如，哮喘)及發炎性腸病。
在治療態樣之其他方法中，本發明提供治療易患或患有自體免疫疾病之哺乳動物的方法。該等方法包含投與有效 病狀治療或病狀預防量之一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一具體實施例中，自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎及發炎性腸病。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防自體免疫疾病。在一具體實施例中，自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎及發炎性腸病。在一更具體實施例中，自體免疫疾病係全身性紅斑狼瘡。
在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或患有增殖性疾病，尤其癌症(例如，實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如，AML、ALL或CLL)、多發性骨髓瘤及/或牛皮癬之哺乳動物的方法。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防增殖性疾病，尤其癌症(例如，實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如，AML、ALL或CLL)、多發性骨髓瘤及/或牛皮癬。
在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或患有移植排斥之哺乳動物的方法。在一具體實施例中，本發明提供治療器官移植排斥之方法。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防移植排斥。在一具體實施例中，本發明提供治療器官 移植排斥之方法。
在治療態樣之方法中，本發明提供治療或預防易患或患有涉及軟骨代謝損傷之疾病之哺乳動物之方法，該方法包括投與治療有效量之本文所述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防涉及軟骨代謝損傷之疾病。
本發明亦提供治療先天性軟骨畸形之方法，該方法包括投與有效量之本文所述之一或多種醫藥組合物或本發明化合物。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防先天性軟骨畸形。
在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或患有與IL6分泌過多有關之疾病(尤其卡斯爾曼病或腎小球膜增殖性腎小球腎炎)之哺乳動物的方法。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物以用於治療或預防與IL6分泌過多有關之疾病(尤其卡斯爾曼病或腎小球膜增殖性腎小球腎炎)。
在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或患有與IL6分泌過多有關之疾病，尤其全身性及皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、類風濕性關節炎之哺乳動物之方法。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物用於治療或預防與IL6分泌過多有關之疾病，尤其全身性及皮膚紅斑狼 瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、類風濕性關節炎。
根據本發明之另一態樣，提供本發明化合物用作尤其治療或預防上述病狀及疾病之藥物。本文亦提供本發明化合物在製造治療或預防上述病狀及疾病之藥劑中的用途。
本發明方法之特定方案包括向患有涉及發炎之疾病之個體投與有效量的本發明化合物，持續一段足以減輕個體發炎程度之時間，且較佳地終止造成該發炎之過程。該方法之特定實施例包括向患有或易患類風濕性關節炎之個體患者投與有效量之本發明化合物，持續一段足以分別減輕或預防該患者關節發炎之時間，且較佳地終止造成該發炎之過程。
本發明方法之另一特點方案包括向患有特徵為軟骨或關節降解之疾病病狀(例如，類風濕性關節炎及/或骨關節炎)的個體投與有效量之本發明化合物，持續一段足以減輕且較佳地終止造成該降解之自行延續過程之時間。該方法之特定實施例包括向患有或易患骨關節炎之個體患者投與有效量之本發明化合物，持續一段足以分別減輕或預防該患者之關節的軟骨降解之時間，且較佳地終止造成該降解之自行延續過程。在一特定實施例中，該化合物可呈現軟骨合成代謝及/或抗分解代謝性質。
注射劑量值介於約0.1 mg/kg/h至至少10 mg/kg/h之間，其皆歷時約1 h至約120 h及尤其24 h至96 h。亦可投與約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或更高劑量之預裝載濃注，以達成 適當穩態值。對於40-80 kg之人類患者而言，預期最大總劑量不超過約2 g/天。
為預防及/或治療長期病狀(例如退化性病狀)，治療方案通常延續數月或數年，因此患者對經口投藥具有較佳便利性及耐受性。對於經口投藥而言，代表性方案係每天經口投與1-5次劑量，且尤其為2-4次且通常為經口投藥3次劑量。使用該等投藥模式，每次劑量提供約0.01-約20 mg/kg之本發明化合物，其中每次特定劑量提供約0.1-約10 mg/kg且尤其約1-約5 mg/kg本發明化合物。
通常選擇經皮投藥以提供類似於或低於使用注射投藥達成之血液濃度。
當用於預防病狀發作時，通常可根據建議及在醫師監督下、以上述劑量值向具有發生該病狀之風險的患者投與本發明化合物。具有發生特定病狀之風險之患者通常包含彼等具有該病狀之家族病史者或彼等已藉由基因測試或篩選確定尤其易於發生該病狀者。
本發明化合物可作為單一活性藥劑投與或其可與其他治療劑組合投與，該等其他治療劑包含表現相同或類似治療活性之其他化合物及已確定可安全有效地進行該組合投與之其他化合物。在一具體實施例中，兩種(或更多種)藥劑之共投與使得可顯著降低每種藥劑之欲使用劑量，由此減輕所觀察到之副作用。
在一實施例中，投與本發明化合物或包括本發明化合物之醫藥組合物作為藥劑。在一具體實施例中，該醫藥組合 物另外包括另一活性成份。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防涉及發炎之疾病，特定藥劑包含但不限於免疫調節劑(例如，硫唑嘌呤(azathioprine))、皮質類固醇(例如，潑尼松龍(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素A、他克莫司(tacroli-mus)、麥考酚酸嗎乙酯(Mycophenolate Mofetil)、莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3，OKT3，例如Orthocolone®)、ATG、阿司匹林(aspirin)、乙醯胺基酚、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)及吡羅西康(piroxicam)。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防關節炎(例如，類風濕性關節炎)；特定藥劑包含但不限於鎮痛藥、非類固醇消炎藥(NSAIDS)、類固醇、合成DMARDS(例如但不限於胺甲蝶呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、金諾芬(auranofin)、金硫丁二鈉(sodium aurothiomalate)、青黴胺(penicillamine)、氯喹、羥基氯喹、硫唑嘌呤及環孢素)及生物DMARDS(例如但不限於英夫利昔單抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)、阿達木單抗(Adalimumab)、利妥昔單抗(Rituximab)及阿巴他塞(Abatacept))。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防增殖性病症；特定藥劑包含但不限於：胺甲蝶呤、甲醯四氫葉酸(leukovorin)、多柔比星(adriamycin)、 潑尼松(prenisone)、博萊黴素(bleomycin)、環磷醯胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、多柔比星、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、阿那曲唑(anastrozole)、戈含瑞林(goserelin)、抗HER2單株抗體(例如，HerceptinTM)、卡培他濱(capecitabine)、鹽酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride)、EGFR抑制劑(例如lressa®、TarcevaTM、ErbituxTM)、VEGF抑制劑(例如，AvastinTM)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM)、Glivec®或hsp90抑制劑(例如，17-AAG)。另外，可將本發明化合物與其他療法(包含但不限於放射治療或外科手術)組合投與。在一具體實施例中，增殖性病症係選自癌症、骨髓組織增殖性疾病或白血病。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防自體免疫疾病；特定藥劑包含但不限於：糖皮質激素、細胞生長抑制劑(例如嘌呤類似物)、烷基化藥劑(例如，氮芥(環磷醯胺)、亞硝基脲、鉑化合物及其他)、干擾核酸生物合成之藥物(例如，胺甲蝶呤、硫唑嘌呤及巰基嘌呤)、細胞毒性抗生素(例如，放線菌素D蒽環類(dactinomycin anthracyclines)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博萊黴素及光輝黴素(mithramycin))、抗體(例如，抗CD20、抗CD25或抗CD3(OTK3)單株抗體，Atgam®及Thymoglobuline®)、環孢素、他克莫司、雷帕黴素 (rapamycin)(西羅莫斯(sirolimus))、干擾素(例如，IFN-β)、TNF結合蛋白(例如，英夫利昔單抗(RemicadeTM)、依那昔普(EnbrelTM)、或阿達木單抗(HumiraTM))、麥考酚酯(mycophenolate)、芬戈莫德(Fingolimod)及多球菌殼素(Myriocin)。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防移植排斥；特定藥劑包含但不限於：鈣神經素抑制劑(例如，環孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制劑(例如、西羅莫斯、依維莫斯(everolimus))、抗增殖藥物(例如，硫唑嘌呤、麥考酚酸(mycophenolic acid))、皮質類固醇(例如，潑尼松龍、氫化可的松(hydrocortisone))、抗體(例如，單株抗IL-2Rα受體抗體，巴裏昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab))、多株抗T-細胞抗體(例如，抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、抗淋巴細胞球蛋白(ALG))。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防哮喘及/或鼻炎及/或COPD，特定藥劑包含但不限於：β2-腎上腺受體激動劑(例如，沙丁胺醇(salbutamol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林(terbutaline)及比托特羅(bitolterol))、腎上腺素(吸入式或錠劑)、抗膽鹼激導劑(例如，異丙托溴銨)、糖皮質激素(口服或吸入)、長效β2-激動劑(例如，沙莫特羅(salmeterol)、福莫特羅(formoterol)、班布特羅(bambuterol)及緩釋口服沙丁胺醇(albuterol))、吸入式類固 醇及長效枝氣管擴張劑之組合(例如，氟替卡松(fluticasone)/沙莫特羅、布地奈德(budesonide)/福莫特羅)、白三烯拮抗劑及合成抑制劑(例如，孟魯斯特(montelukast)、紮魯斯特(zafirlukast)及齊留通(zileuton))、介導子釋放抑制劑(例如，色苷酸鹽及酮替芬(ketotifen))、IgE反應之生物調節劑(例如，奧馬珠單抗(omalizumab))、抗組胺藥(例如，西替利嗪(ceterizine)、桂利嗪(cinnarizine)、非索非那定(fexofenadine))及血管收縮藥(例如，氧甲唑啉(oxymethazoline)、塞洛唑啉(xylomethazoline)、那法唑啉(nafazoline)及曲馬唑啉(tramazoline))。
另外，可組合投與本發明化合物與應急治療用於哮喘及/或COPD，該等療法包含氧或氮氧混合劑投與、霧化沙丁胺醇或特布他林(視情況與抗膽鹼藥(例如，異丙托銨)組合)、全身性類固醇(口服或經靜脈，例如，潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松或氫化可的松)、靜脈內沙丁胺醇、非特異性β-激動劑(注射或吸入，例如，腎上腺素、異他林、異丙腎上腺素、間羥異丙腎上腺素)、抗膽鹼激導劑(IV或霧化，例如，格隆溴銨(glycopyrrolate)、阿托品(atropine)、異丙托銨)、甲基黃嘌呤(茶鹼、胺茶鹼、苄胺茶鹼)、具有枝氣管擴展效應之吸入麻醉劑(例如，異氟烷、氟烷、恩氟烷)、氯胺酮及靜脈內硫酸鎂。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以 治療及/或預防發炎性腸病(IBD)，特定藥劑包含但不限於：改善疾病之合成糖皮質激素(例如，潑尼松、布地奈德)、免疫調節劑(例如，胺甲蝶呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉秦(mesalazine)、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤及環孢素)及生物疾病改善、免疫調節劑(英夫利昔單抗、阿達木單抗、利妥昔單抗及阿巴他賽)。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防SLE，特定藥劑包含但不限於：改善疾病之抗風濕藥(DMARD)，例如抗瘧疾藥(例如，硫酸羥氯喹片(plaquenil)、羥氯喹)、免疫抑制劑(例如胺甲蝶呤及硫唑嘌呤)、環磷醯胺及麥考酚酸；免疫抑制藥及鎮痛藥，例如非類固醇消炎藥、阿片劑(例如，右丙氧芬(dextropropoxyphene)及複方可待因及撲熱息痛(co-codamol))、阿片樣物質(例如，氫可酮(hydrocodone)、羥可酮(oxycodone)、MS Contin或美沙酮(methadone))及芬太尼透皮貼劑(多瑞吉)(fentanyl duragesic transdermal patch)。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防牛皮癬，特定藥劑包含但不限於：局部治療劑，例如含有煤焦油、二羥基恩酚(dithranol)(地蒽酚(anthralin))、皮質類固醇(例如去羥米松(desoximetasone)(TopicortTM))、乙酸氟輕鬆(fluocinonide)、維他命D3類似物(例如，卡泊三醇(calcipotriol))、Argan oiland類視色素(阿維a酯(etretinate)、維生素A酸(acitretin)、他紮羅汀 (tazarotene))之電解液、濕潤劑、醫用乳霜及軟膏，全身性治療劑，例如胺甲蝶呤、環孢素、類視色素、硫鳥嘌呤、羥基脲、柳氮磺吡啶、麥考酚酸嗎乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、富馬酸酯或生物製劑，例如AmeviveTM、EnbrelTM、HumiraTM、RemicadeTM、RaptivaTM及優斯它單抗(ustekinumab)(IL-12及IL-23封阻劑)。另外，可將本發明化合物與其他療法組合投與，該等療法包含但不限於：光療法或光化學療法(例如，補骨脂素及紫外線A光療法(PUVA))。
在一實施例中，將本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防過敏反應，特定藥劑包含但不限於：抗組胺藥(例如西替利嗪、苯海拉明(diphenhydramine)、非索非那定、左西替立嗪(levocetirizine))、糖皮質激素(例如潑尼松、倍他米松(betamethasome)、倍氯米松(beclomethasone)、地塞米松)、腎上腺素、茶鹼或抗白三烯素(例如孟魯斯特或紮魯斯特)、抗膽鹼能劑及減充血劑。
熟習此項技術者應明瞭，共投與包含向患者遞送兩種或更多種治療劑之任何方式作為同一治療方案之一部分。儘管可以單一調配物形式(亦即以單一醫藥組合物形式)同時投與兩種或更多種藥劑，但這種方式並非必須的。該等藥劑可以不同調配物形式在不同時間投與。
一般合成程序 概述
本發明化合物可自容易獲得之起始材料使用下列一般方 法及程序來製備。應瞭解，其中給出典型或較佳製程條件(亦即，反應溫度、時間、反應物之莫耳比、溶劑、壓力等)；除非另有說明，否則亦可使用其他製程條件。最佳反應條件可隨所用特定反應物或溶劑變化，但該等條件可由熟習此項技術者藉由常規優化程序來確定。
另外，如彼等熟習此項技術者所瞭解，可能需要習用保護基團來防止某些官能基發生不期望反應。用於特定官能基之適宜保護基團以及用於保護及去保護之適宜條件之選擇已為此項技術習知。例如，T.W.Greene及P.G.M.Wuts之Protecting Groups in Organic Synthesis(第二版，Wiley,New York,1991)及本文所列舉之參考文獻中闡述若干保護基團及其引入及去除。
詳細呈現下列方法以製備上文所定義之本發明化合物及比較實例。本發明化合物可由熟習有機合成技術者自習知或市售起始材料及反應物製備。
除非另有說明，否則所有試劑均係商業級且未經進一步純化即以接受狀態使用。使用市售無水溶劑在惰性氛圍下實施反應。除非另有說明，否則在所有其他情形下均使用試劑級溶劑。在矽膠60(35-70 μm)上實施管柱層析。使用預塗覆之矽膠F-254板(厚度為0.25 mm)實施薄層層析。在Bruker DPX 400 NMR光譜儀(400 MHz)上記錄1H NMR光譜。1H NMR光譜之化學位移(δ)係相對於作為內標之四甲基矽烷(δ 0.00)或適當殘餘溶劑峰(亦即，CHCl3(δ 7.27))以百萬份數(ppm)來報告。多重性以單峰(s)、二重峰(d)、 三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)及寬峰(br)給出。偶合常數(J)係以Hz給出。在Micromass平臺LC/MS光譜儀上獲得電噴射MS光譜。LCMS分析所用之管柱：Hichrom，Kromasil Eternity，2.5 μm C18，150×4.6 mm，Waters Xbridge 5 μm C18(2)，250×4.6 mm(參考編號：86003117)；Waters Xterra MS 5 μm C18，100×4.6 mm(Plus guard柱)(參考編號：186000486)；Gemini-NX 3 μm C18 100×3.0 mm(參考編號：00D-4453-Y0)；Phenomenex Luna 5 μm C18(2)，100×4.6 mm。(Plus guard柱)(參考編號：00D-4252-E0)；Kinetix fused core 2.7 μm C18 100×4.6 mm(參考編號：00D-4462-E0)；Supelco，Ascentis® Express C18(參考編號：53829-U)；或Hichrom Halo C18，2.7 μm C18，150×4.6 mm(參考編號：92814-702)。在偶合至HPLC Waters 2795(配備有UV檢測器Waters 2996)之Waters Micromass ZQ記錄LC-MS。亦在偶合至UV檢測器Agilent G1315A之HPLC Agilent 1100上運行LC。製備型HPLC：Waters XBridge Prep C18 5 μm ODB 19 mm ID×100 mm L(部件號186002978)。所有方法均使用MeCN/H2O梯度。H2O含有0.1% TFA或0.1% NH3。
實驗部分中所用之縮寫的列表：
本發明化合物之合成製備
可根據下列反應圖來產生本發明化合物。
化合物1：N-4-(3-氟-4-((4-(甲基磺醯基)六氫吡嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙醯胺
步驟i)：3-溴-2-氰基甲基吡啶(中間體1)
將無水THF(100 ml)冷卻至-78℃且添加正丁基鋰(2.5 M，存於己烷中；23 ml，58 mmol)。逐滴添加乙腈(3.3 ml,64 mmol)以將溫度維持於-60℃以下。形成白色沈澱物且將反應混合物在-78℃下攪拌45 min。逐滴添加存於無水THF(10 ml)中之2,3-二溴吡啶(2.0 g,8.4 mmol)之溶液且將反應混合物在-78℃下攪拌1.5 h，然後升溫至室溫。藉由逐滴添加水來終止反應。使用DCM(×3)萃取水層並使用鹽水洗滌合併之有機物，乾燥(MgSO4)並在真空中濃縮。藉由急驟管柱層析純化(3-溴-吡啶-2-基)-乙腈(中間體1)。
步驟ii)2-(3-溴-吡啶-2-基)-N-羥基-乙脒(中間體2)
將羥胺鹽酸鹽(924 mg,13.3 mmol)、水(4 ml)、NaHCO3(1.12 g,13.3 mmol)、3-溴-2-氰基甲基吡啶(中間體1)(1.31 g,6.65 mmol)及乙醇(14 ml)之劇烈攪拌之混合物加熱至回流保持5 h。將反應混合物冷卻至室溫，在真空中去除乙醇並藉由過濾收集白色固體，使用水洗滌(3×10 ml)。將濕潤固體在40℃下於真空中乾燥1小時以得到固體形式之2-(3-溴-吡啶-2-基)-N-羥基-乙脒(中間體2)。
步驟iii)：3-溴-2-(5-甲基-[1,2,4]噁二唑-3-基甲基)-吡啶(中間體3)
將在步驟ii)中獲得之2-(3-溴-吡啶-2-基)-N-羥基-乙脒(1.24 g,5.39 mmol)與乙酸酐(552 mg,5.41 mmol)之混合物在20℃下於無水THF(10 ml)中攪拌1.5 h。在真空中濃縮反應混合物且將殘餘物在20℃下於2 M Na2CO3(10 ml)與DCM(10 ml)之兩相系統中攪拌劇烈10 min。藉由過濾收集所得白色沈澱物，使用水(2×5 ml)及DCM(2×5 ml)洗滌然後在40℃下於真空中乾燥1 h以得到粉末形式之O-乙醯基胺肟。
將所獲得之O-乙醯基胺肟(610 mg,2.24 mmol)及K2CO3(1.56 g,11.3 mmol)在60℃下於CHCl3(6 ml)中攪拌劇烈41 h。在劇烈攪拌下向混合物中添加水(5 ml)及額外CHCl3(5 ml)。分離各層並在真空中濃縮有機萃取物。獲得黃色液體形式之粗製3-溴-2-(5-甲基-[1,2,4]噁二唑-3-基甲基)-吡啶且未經進一步純化即用於隨後反應中(中間體3)。
步驟iv)：3-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙醯胺(中間體4)
在密封管中，將在步驟iii)中獲得之3-溴-2-(5-甲基- [1,2,4]噁二唑-3-基甲基)-吡啶(663 mg,2.61 mmol)在150℃下於甲苯(5.2 ml)中攪拌41 h。將反應混合物冷卻至室溫，在真空中去除甲苯并藉由管柱層析(梯度：存於DCM中之0-10% MeOH)純化殘餘物。使用二乙醚滴定所獲得固體以得到固體形式之3-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙醯胺(中間體4)。
步驟v)：1-(4-溴-2-氟-苄基)-4-甲烷磺醯基-六氫吡嗪(中間體5)
將存於乙腈(500 ml)中之4-溴-2-氟苄基溴(30.4 g，114 mmol，1當量)、1-甲基磺醯基六氫吡嗪(20.0 g，114 mmol，1當量)及K2CO3(31.6 g，228 mmol，2當量)之混合物在40℃下攪拌18 h。將反應混合物冷卻至室溫，經由矽藻土(Celite)過濾混合物，使用EtOAc洗滌。在真空中濃縮濾液以得到目標胺。
將存於乙腈(500 ml)中之4-溴-2-氟苄基溴(30.4 g，114 mmol，1當量)、1-甲基磺醯基六氫吡嗪(20.0 g，114 mmol，1當量)及K2CO3(31.6 g，228 mmol，2當量)之混合物在40℃下攪拌18 h。將反應混合物冷卻至室溫，經由矽藻土過濾混合物，並使用EtOAc洗滌。在真空中濃縮濾液以得到1-(4-溴-2-氟-苄基)-4-甲烷磺醯基-六氫吡嗪(中間體5)。
步驟vi)：1-[2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧硼 -2-基)-苄基]-4-甲烷磺醯基-六氫吡嗪(中間體6)
將存於脫氣二噁烷(200 ml)中之芳基溴(20.0 g，57 mmol，1當量)、雙(戊醯)二硼(16.0 g，63 mmol，1.1當量)、PdCl2(dppf)(2.3 g，2.9 mmol，0.05當量)及乙酸鉀(6.2 g，63 mmol，1.1當量)之混合物在氮及90℃下於密封管中攪拌18 h。將反應混合物冷卻至室溫，經由二氧化矽塞過濾混合物，並使用DCM洗滌。在真空中濃縮濾液。將殘餘物與異己烷混合且添加二乙醚直至產物發生結晶為止。藉由過濾收集固體產物。
另一選擇為，將存於脫氣二噁烷(3 L)中之芳基溴(309 g,879.7 mmol)、雙(戊醯)二硼(245.7 g,967.7 mmol)、PdCl2(dppf)(35.9 g,43.9 mmol)及乙酸鉀(94.9 g,967.7 mmol)之混合物在氮及100℃下攪拌6 h。將反應混合物冷卻至室溫，經由二氧化矽塞過濾混合物，並使用DCM洗滌。在真空中濃縮濾液。在產物發生沈澱期間，向黏性殘餘物中添加DCM及己烷(2 L)。過濾懸浮液以提供期望化合物。
步驟vii)：N-4-(3-氟-4-((4-(甲基磺醯基)六氫吡嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙醯胺(化合物1)。
使用3種方法。
步驟vii)：第一方法
將1-[2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧硼-2-基)-苄基]-4-甲烷磺醯基-六氫吡嗪(26.4 g，66 mmol，1.1當量)添加至存於1,4-二噁烷/水(540 ml,4：1；v/v)中之芳基溴(16.0 g，63 mmol，1當量)之溶液中。向脫氣溶液中添加Na2CO3(13.4 g，126 mmol，2.0當量)及Pd(dppf)Cl2(2.6 g，3 mmol，0.05當量)(dppf=1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)。將所得混合物在100℃下加熱2 h。使用EtOAc萃取反應混合物，使用MgSO4乾燥，並在真空中濃縮。藉由製備型HLPC進行純化以得到目標化合物
步驟vii)：第二方法
將在上文步驟(ii)中獲得之1-[2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧硼-2-基)-苄基]-4-甲烷磺醯基-六氫吡嗪(7.5 g，18 mmol，1當量)添加至存於1,4-二噁烷/水(150 ml,4：1；v/v)中之芳基溴(4.5 g，18 mmol，1當量)之溶液中。向脫氣溶液中添加Na2CO3(3.8 g，36 mmol，2.0當量)及Pd(dppf)Cl2(0.7 g，0.9 mmol,5%)(dppf=1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)。將所得混合物在100℃下加熱2 h。合併兩種反應混合物並在真空中去除溶劑。將殘餘物與DCM及水混合並藉由過濾去除不溶性材料。(保留不溶性材料且隨後在純化之前與有機殘餘物再次合併。)分離水層並使用DCM(×3)萃取。乾燥(MgSO4)合併之有機物並在真空中濃縮。將此殘餘物與先前收集之不溶性材料合併並吸附於二氧化矽上。藉由管柱層析(梯度：存於EtOAc中之0-5% MeOH)或製備型HLPC純化以得到褐色目標固體。將褐色固體與乙醇混合並將懸浮液加熱至回流。將混合物冷卻至室溫且然後使用冰浴進一步冷卻。藉由過濾收集目標材料並在真空中乾燥。
步驟vii)：第三方法
使用N2將存於1,4-二噁烷(2 L)/水(0.5 L)之室溫溶劑混合 物中之1-N-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙醯胺(149 g,0.586 mol)及Na2CO3(124 g,1.172 mol)之混合物脫氣。向此混合物中添加硼酸酯(270 g，1.15當量)及PdCl2(dppf)(24 g,5 mol%)。將反應器夾套加熱至100℃，終止N2脫氣且將混合物在加熱下攪拌45 min。UPLC顯示硼酸酯完全消耗。添加額外量硼酸酯(10 g，0.05當量)且在100℃下再繼續攪拌30 min。UPLC顯示完全轉化且顯示預期產物之單峰。在減壓下將溶劑體積降至0.5 L且將所得懸浮液在4℃下靜置過夜。向懸浮液中添加水(0.5 L)且攪拌30 min並過濾。使用水(0.5 L)洗滌所得濾餅並在抽吸下乾燥1h。將濾餅轉移至Petri盤(425 g)中並在空氣中乾燥過夜以獲得粗製期望化合物。將粉末置於矽膠墊上並使用DCM/MeOH(9：1混合物)洗滌。將第一部分(2.5 L)濃縮至乾燥以得到樹脂性固體，拋棄該樹脂性固體。將第二部分(10 L DCM/MeOH 9：1混合物，10 L 5：1混合物及3 L 3：1混合物)濃縮至乾燥以得到期望產物。將固體懸浮於EtOH(1.1 L)中，加熱至回流，攪拌30 min，冷卻至5℃，攪拌30 min並過濾。使用冷EtOH(300 ml)洗滌濾餅並轉移至Petri盤中以得到預期產物。
根據上文所述之合成方法製得之本發明化合物列示於下表I中，且本發明化合物之NMR光譜數據在表II中給出。
生物實例 實例1-活體外分析 1.1 JAK1抑制分析 1.1.1 polyGT受質之JAK1分析
自Invitrogen購得重組人類JAK1催化結構域(胺基酸866-1154；目錄號PV4774)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中，在總體積為25 μl且含或不含5 μl包含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之激酶反應緩衝液(最終濃度15 mM Hepes pH 7.5、0.01% Tween20、10 mM MgCl2、2 μM非放射性ATP、0.25 μCi 33P-γ-ATP(Perkin Elmer,，目錄號NEG602K001MC))中，將25 ng JAK1與6.25 μg polyGT受質(Sigma，目錄號P0275)一起培育。在30℃下保持75 min 後，藉由添加25 μl/孔150 mM磷酸終止反應。使用細胞採集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預洗滌(75 mM磷酸)之96孔過濾板(Perkin Elmer，目錄號6005177)上。使用300 μl/孔之75 mM磷酸溶液將板洗滌6次並將板底部密封。添加40 μl/孔之Microscint-20，將板頂部密封並使用Topcount(Perkin Elmer)讀取數據。由在媒劑存在下所得之每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下所得之cpm來計算激酶活性。如下所述測定測試化合物抑制此活性之能力：抑制百分比=((含有本發明測試化合物之試樣所測定之cpm-含有陽性對照抑制劑之試樣所測定之cpm)/(在媒劑存在下測定之cpm-含有陽性對照抑制劑之試樣測定之cpm))＊100。
製備化合物之劑量連續稀釋液，以在JAK1分析中測試劑量反應效應，並計算各化合物之IC50。各化合物自20 μM之濃度開始，隨後依1/3連續稀釋成8個濃度點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)，依常規方式測試，其中DMSO之最終濃度為1%。當化合物系列之功效增加時，採用更大稀釋度及/或降低最大濃度(例如，5 μM、1 μM)。
1.1.2 JAK1 Ulight-JAK1肽分析
自Invitrogen購得重組人類JAK1(催化結構域，胺基酸866-1154；目錄號PV4774)。在白色384 Opti板(Perkin Elmer，目錄號6007290)中，在總體積為20 μl且含或不含4 μl包含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之激酶反應緩衝液(25 mM MOPS pH 6.8、0.01% Brij-35、5 mM MgCl2、2 mM DTT、7 μM ATP)中，將1 ng JAK1與20 nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer，目錄號TRF0121)一起培育。在室溫下保持60 min之後，藉由添加20 μl/孔之檢測混合物(1×檢測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100C)、0.5 nM銪-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0068)、10 mM EDTA)來終止反應。使用Envision(在320 nm下激發且在615 nm下量測發射光，Perkin Elmer)讀取數據。藉由使用在媒劑存在下所得之相對螢光單位(RFU)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下所得之RFU來計算激酶活性。如下所述確定測試化合物抑制此活性之能力：抑制百分比=((使用含有本發明測試化合物之試樣確定之RFU-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之RFU)/(在媒劑存在下確定之RFU-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之RFU))＊100。
製備化合物之劑量稀釋系列以在JAK1分析中測試劑量反應效應並計算化合物之IC50。各化合物自20 μM之濃度開始，隨後依1/5連續稀釋成10個濃度點，依常規方式測試，其中DMSO之最終濃度為1%。當化合物系列之功效增加時，採用更大稀釋度及/或降低最大濃度(例如，5 μM、1 μM)。將數據表示為分析之平均IC50±平均值之標準誤差。
根據上述分析測定本發明化合物對於JAK1之活性，由此返回8.18 nM、11.5 nM、7.71 nM、35.2 nM及7.85 nM之IC50值。
1.2 JAK1 Ki測定分析
對於Ki測定而言，將不同量之化合物與酶混合且隨後隨著ATP濃度變化發生酶反應。藉助Km對化合物濃度之雙倒數繪圖(Lineweaver-Burk曲線)來測定Ki。在分析中使用1 ng JAK1(Invitrogen,PV4774)。受質為20 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer,TRF0121)。使用不同濃度之ATP及化合物在25 mM MOPS pH 6.8、0.01% Brij-35、2 mM DTT、5 mM MgCl2中實施反應。如1.1.2中所述，使用Eu標記之抗磷酸酪胺酸抗體PT66(Perkin Elmer,AD0068)量測磷酸化受質。在envision(Perkin Elmer，在320 nm下激發且在615 nm及665 nm下發射)上讀取數據。
1.2 JAK2抑制分析 1.2.1 polyGT受質之JAK2分析
自Invitrogen購得重組人類JAK2催化結構域(胺基酸808-1132；目錄號PV4210)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中，在總體積為25 μl且含或不含5 μl包含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之激酶反應緩衝液(10 mM MOPS pH 7.5、0.5 mM EDTA、0.01% Brij-35、1 mM DTT、15 mM MgAe、1 μM非放射性ATP、0.25 μCi 33P-γ-ATP(Perkin Elmer，目錄號NEG602K001MC)，最終濃度)中，將0.05 mU JAK2與2.5 μg polyGT受質(Sigma目錄號 P0275)一起培養。在30℃下保持90 min後，藉由添加25 μl/孔150 mM磷酸終止反應。使用細胞採集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預洗滌(75 mM磷酸)之96孔過濾板(Perkin Elmer，目錄號6005177)上。使用300 μl/孔之75 mM磷酸溶液將板洗滌6次並將板底部密封。添加40 μl/孔之Microscint-20，將板頂部密封並使用Topcount(Perkin Elmer)讀取數據。藉由使用在媒劑存在下所得之每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下所得之cpm來計算激酶活性。如下所述確定測試化合物抑制此活性之能力：抑制百分比=((使用含有本發明測試化合物之試樣確定之cpm-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之cpm)/(在媒劑存在下確定之cpm-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之cpm))＊100。
製備化合物之劑量稀釋系列以在JAK2分析中測試劑量反應效應並計算各化合物之IC50。各化合物自20 μM之濃度開始，隨後依1/3連續稀釋成8個濃度點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)，以常規方式測試，其中DMSO之最終濃度為1%。當化合物系列之功效增加時，採用更大稀釋度及/或降低最大濃度(例如，5 μM、1 μM)。
1.2.2 JAK2 Ulight-JAK1肽分析
自Invitrogen購得重組人類JAK2(催化結構域，胺基酸866-1154；目錄號PV4210)。在白色384 Opti板(Perkin Elmer，目錄號6007290)中，在總體積為20 μl且含或不含4 μl包含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之激酶反應緩衝液(25 mM HEPES pH 7.0、0.01% Triton X-100、7.5 mM MgCl2、2 mM DTT、7 μM ATP)中將0.0125 mU JAK2與25 nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer，目錄號TRF0121)一起培育。在室溫下保持60 min之後，藉由添加20 μl/孔之檢測混合物(1×檢測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100C)、0.5 nM銪-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0068)、10 mM EDTA)來終止反應。使用Envision(在320 nm下激發且在615 nm下量測發射，Perkin Elmer)讀取數據。藉由使用在媒劑存在下所得之相對螢光單位(RFU)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下所得之RFU來計算激酶活性。如下所述確定測試化合物抑制此活性之能力：抑制百分比=((使用含有本發明測試化合物之試樣確定之RFU-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之RFU)/(在媒劑存在下確定之RFU-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之RFU))＊100。
製備化合物之劑量稀釋系列以在JAK2分析中測試劑量反應效應並計算化合物之IC50。各化合物自20 μM之濃度開始，隨後依1/5連續稀釋成10個濃度點，依常規方式測試，其中DMSO之最終濃度為1%。當化合物系列之功效增加時，採用更大稀釋度及/或降低最大濃度(例如，5 μM、1 μM)。將數據表示為分析之平均IC50±平均值之標準誤 差。
根據上述分析測定本發明化合物對於JAK2之活性，由此返回17.3 nM、11.3 nM、9.57 nM、26 nM及18.2 nM之IC50值。
1.4 JAK2 Kd/Ki測定分析 1.4.1. JAK2 Ki測定分析
對於Ki測定而言，將不同量之化合物與酶混合且隨後隨著ATP濃度變化發生酶反應。藉助Km對化合物濃度之雙倒數繪圖(Lineweaver-Burk曲線)來測定Ki。在分析中使用0.0125 mU JAK1(Invitrogen,PV4210)。受質為25 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer,TRF0121)。使用不同濃度之ATP及化合物在25 mM HEPES pH 7.0、0.01% Triton X-100、7.5 mM MgCl2、2 mM DTT中實施反應。如1.2.2中所述，使用Eu標記之抗磷酸酪胺酸抗體PT66(Perkin Elmer,AD0068)量測磷酸化受質。在envision(Perkin Elmer，在320 nm下激發且在615 nm及665 nm下發射)上讀取數據。
1.4.2. JAK2 Kd測定分析
使用最終濃度為2.5 nM之JAK2(Invitrogen,PV4210)。使用25 nM激酶示蹤劑236(Invitrogen,PV5592)及2 nM Eu-抗GST(Invitrogen,PV5594)在不同化合物濃度下於50 mM Hepes pH 7.5、0.01% Brij-35、10 mM MgCl2、1 mM EGTA中實施結合實驗。根據製造商之程序來檢測示蹤劑。
1.5 JAK3抑制分析
自Carna Biosciences購得重組人類JAK3催化結構域(胺基酸795-1124；目錄號08-046)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中，在總體積為25 μl且含或不含5 μl包含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之激酶反應緩衝液(25 mM Tris pH 7.5、0.5 mM EGTA、10 mM MgCl2、2.5 mM DTT、0.5 mM Na3VO4、5 mM b-甘油磷酸酯、0.01% Triton X-100、1 μM非放射性ATP、0.25 μCi 33P-γ-ATP(Perkin Elmer,，目錄號NEG602K001MC)，最終濃度)中，將0.5 ng JAK3蛋白與2.5 μg polyGT受質(Sigma目錄號P0275)一起培養。在30℃下保持45 min後，藉由添加25 μl/孔150 mM磷酸終止反應。使用細胞採集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預洗滌(75 mM磷酸)之96孔過濾板(Perkin Elmer，目錄號6005177)上。使用300 μl/孔之75 mM磷酸溶液將板洗滌6次並將板底部密封。添加40 μl/孔之Microscint-20，將板頂部密封並使用Topcount(Perkin Elmer)讀取數據。藉由使用在媒劑存在下所得之每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下所得之cpm來計算激酶活性。如下所述確定測試化合物抑制此活性之能力：抑制百分比=((使用含有本發明測試化合物之試樣確定之cpm-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之cpm)/(在媒劑存在下確定之cpm-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之cpm))＊100。
製備化合物之劑量稀釋系列以在JAK3分析中測試劑量反應效應並計算各化合物之IC50。各化合物自20 μM之濃度開始，隨後依1/5連續稀釋成10個濃度點，依常規方式測試，其中DMSO之最終濃度為1%。當化合物系列之功效增加時，採用更大稀釋度及/或降低最大濃度(例如，5 μM、1 μM)。
根據上述分析測定本發明化合物對於JAK3之活性，由此返回271 nM、299 nM、213 nM及428 nM之IC50值。
1.6 JAK3 Ki測定分析
對於Ki測定而言，將不同量之化合物與酶混合且隨後隨著ATP濃度變化發生酶反應。藉助Km對化合物濃度之雙倒數繪圖(Lineweaver-Burk曲線)來測定Ki。使用最終濃度為20 ng/ml之JAK3(Carna Biosciences,08-046)。受質為Poly(Glu,Tyr)鈉鹽(4：1)(MW 20 000-50 000，Sigma，P0275)。使用不同濃度之ATP及化合物在25 mM Tris pH 7.5、0.01% Triton X-100、0.5 mM EGTA、2.5 mM DTT、0.5 mM Na3VO4、5 mM b-甘油磷酸酯、10 mM MgCl2中實施反應並藉由添加150 mM磷酸終止反應。藉由將試樣裝載於過濾板(使用採集器，Perkin Elmer)上且隨後進行洗滌來量測納入受質polyGT中之磷酸鹽。在向過濾板(Perkin Elmer)中添加閃爍液體之後，在Topcount閃爍計數器中量測納入polyGT中之33P。
舉例而言，在此分析中測試時，化合物21返回Ki=227 nM
1.7 TYK2抑制分析
自Carna biosciences購得重組人類TYK2催化結構域(胺基酸871-1187；目錄號08-147)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中，在總體積為25 μl且含或不含5 μl包含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之激酶反應緩衝液(25 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、5 mM MnCl2、10 mM MgCl2、0.1% Brij-35、0.1 μM非放射性ATP、0.125 μCi 33P-γ-ATP(Perkin Elmer，目錄號NEG602K001MC)，最終濃度)中，將4 ng TYK2與12.5 μg polyGT受質(Sigma，目錄號P0275)一起培養。在30℃下保持90 min後，藉由添加25 μl/孔150 mM磷酸終止反應。使用細胞採集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預洗滌(75 mM磷酸)之96孔過濾板(Perkin Elmer，目錄號6005177)上。使用300 μl/孔之75 mM磷酸溶液將板洗滌6次並將板底部密封。添加40 μl/孔之Microscint-20，將板頂部密封並使用Topcount(Perkin Elmer)讀取數據。藉由使用在媒劑存在下所得之每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下所得之cpm來計算激酶活性。如下所述確定測試化合物抑制此活性之能力：抑制百分比=((使用含有本發明測試化合物之試樣確定之cpm-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之cpm)/(在媒劑存在下確定之cpm-使用含有陽性對照抑制劑之試樣確定之cpm))＊100。
製備化合物之劑量稀釋系列以在TYK2分析中測試劑量反應效應並計算各化合物之IC50。各化合物自20 μM之濃度開始，隨後依1/3連續稀釋成8個濃度點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)，依常規方式測試，其中DMSO之最終濃度為1%。當化合物系列之功效增加時，採用更大稀釋度及/或降低最大濃度(例如，5 μM、1 μM)。
根據上述分析測定本發明化合物對於TYK2之活性，由此返回167 nM、135 nM、119 nM及157 nM之IC50值。
1.8 TYK2 Kd/Ki測定分析 1.8.1 TYK2 Ki測定分析
對於Ki測定而言，將不同量之化合物與酶混合且隨後隨著ATP濃度變化發生酶反應。藉助Km對化合物濃度之雙倒數繪圖(Lineweaver-Burk曲線)來測定Ki。使用最終濃度為160 ng/ml之TYK2(Carna Biosciences,08-147)。受質為Poly(Glu,Tyr)鈉鹽(4：1)(MW 20 000-50 000，Sigma，P0275)。使用不同濃度之ATP及化合物在25 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、5 mM MnCl2、10 mM MgCl2、0.1% Brij-35中實施反應並藉由添加150 mM磷酸終止反應。藉由將試樣裝載於過濾板(使用採集器，Perkin Elmer)上且隨後進行洗滌來量測納入受質polyGT中之磷酸鹽。在向過濾板(Perkin Elmer)中添加閃爍液體之後，在Topcount閃爍計數器中量測納入polyGT中之33P。
舉例而言，在此分析中測試時，本發明化合物返回Ki=110 nM
1.8.2 TYK2 Kd測定分析
使用最終濃度為50 nM之TYK2(Carna Biosciences,08-147)。使用15 nM激酶示蹤劑236(Invitrogen,PV5592)及10 nM Eu-抗GST(Invitrogen,PV5594)在不同化合物濃度下於50 mM Hepes pH 7.5、0.01% Brij-35、10 mM MgCl2、1 mM EGTA中實施結合實驗。根據製造商之程序來檢測示蹤劑。
實例2.細胞分析： 2.1 JAK-STAT信號傳導分析：
將HeLa細胞維持於含有10%熱滅活胎牛血清、100 U/ml青黴素(penicillin)及100 μg/ml鏈黴素(streptomycin)之杜貝克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)中。在70%鋪滿下將HeLa細胞用於轉染。在96-孔板模式中，使用0.32 μl/孔之Jet-PEI(Polyplus)作為轉染劑以40 ng pSTAT1(2)-螢光素酶報導基因(Panomics)、8 ng LacZ報導基因(作為內部對照報導基因)及52 ng pBSK對87 μl細胞培養基中之20,000個細胞實施瞬時轉染。在37℃及5% CO2下培育過夜後，去除轉染培養基。添加81 μl DMEM+1.5%熱滅活胎牛血清。經60 min添加9 μl 10x濃度之化合物，且然後添加10 μl最終濃度為33 ng/ml之人類OSM(Peprotech)。
所有化合物之測試皆係一式兩份進行，其以20 μM開始，之後以1/3連續稀釋，總共8個劑量(20 μM-6.6 μM-2.2 μM-740 nM-250 nM-82 nM-27 nM-9 nM)，其中DMSO之最終濃度為0.2%。
在37℃、5% CO2下培育過夜後，藉由添加100 μl溶胞緩衝液/孔(PBS、0.9 mM CaCl2、0.5 mM MgC12、10% Trehalose、0.05% Tergitol NP9、0.3% BSA)來裂解細胞。
藉由經20 min添加180 μl β-Gal溶液(30 μl ONPG 4 mg/ml+150 μl β-半乳糖苷酶緩衝液(0.06 M Na2HPO4、0.04 M NaH2PO4、1 mM MgCl2))使用40 μl細胞溶解產物來讀取β-半乳糖苷酶活性。藉由添加50 μl 1 M Na2CO3來終止反應。在405 nm下讀取吸光度。
如製造商(Perkin Elmer)所述，使用40 μl細胞溶解產物加上40 μl Steadylite®在Envision(Perkin Elmer)上量測螢光素酶活性。
使用沒有OSM之情況作為陽性對照(100%抑制)。使用0.5% DMSO作為陰性對照(0%抑制)。使用陽性及陰性對照計算「z」及「抑制百分比」(PIN)值。
抑制百分比=((在媒劑存在下確定之螢光度-使用含有本發明測試化合物之試樣確定之螢光度)/(在媒劑存在下確定之螢光度-使用無觸發劑之試樣確定之螢光度))＊100。
繪製劑量反應中測試化合物的PIN值並推導出EC50值。
根據上述分析測定本發明化合物對於JAK-STAT之活性，由此返回970 nM之IC50值。
實例2.2 OSM/IL-1β信號傳導分析
OSM及IL-1β顯示協同上調人類軟骨肉瘤細胞系SW1353中之MMP13量。在96孔板中以15,000個細胞/孔將細胞接種於含有10%(v/v)FBS及1%青黴素/鏈黴素(InVitrogen)之120 μl體積的DMEM(Invitrogen)中，且在37℃及5% CO2下進行培育。在含有2% DMSO之M199培養基中將細胞與15 μl化合物一起預培育1 hr，之後使用15 μl OSM及IL-1β進行觸發，直至達到25 ng/ml OSM及1 ng/ml IL-1β，且在觸發48 h後於條件培養基中量測MMP13量。使用抗體捕獲活性分析量測MMP13活性。出於此目的，使用35 μl 1.5 μg/ml之抗人類MMP13抗體(R&D Systems，MAB511)溶液塗覆384孔板(NUNC,460518,MaxiSorb black)，且在4℃下保持24 hr。在使用PBS+0.05% Tween將孔洗滌2次後，使用存於PBS中之100 μl 5%脫脂奶粉(Santa Cruz,sc-2325,Blotto)封阻剩餘結合位點，且在4℃下保持24 hr。其後，使用PBS+0.05% Tween將孔洗滌2次，且添加培養上清液存於100倍稀釋封阻緩衝液中且含有MMP13之35 μl 1/10稀釋液並在室溫下培育4 hr。隨後使用PBS+0.05% Tween將孔洗滌兩次，之後藉由添加35 μl 1.5 mM乙酸4-胺基苯基汞(APMA)(Sigma,A9563)溶液並在37℃下培育1 hr來活化MMP13。再次使用PBS+0.05% Tween洗滌各孔並添加35 μl MMP13受質(Biomol,P-126,OmniMMP螢光受質)。在37℃下培育24 hr後，在Perkin Elmer Wallac EnVision 2102多標記讀取器(激發波長：320 nm，發射波長：405 nm)中量測經轉化受質之螢光度。
抑制百分比=((在媒劑存在下確定之螢光度-使用含有本發明測試化合物之試樣確定之螢光度)/(在媒劑存在下確定之螢光度-使用無觸發劑之試樣確定之螢光度))＊100。
實例2.3 PBL增殖分析
使用IL-2刺激人類外周血液淋巴細胞(PBL)並使用BrdU納入分析來量測增殖。首先使用PHA將PBL刺激72 hr以誘導IL-2受體，然後禁食24 hr以終止細胞增殖，之後再實施72 hr之IL-2刺激(包含24 hr之BrdU標記)。在添加IL-2之前，將細胞與測試化合物一起預培育1 hr。在含有10%(v/v)FBS之RPMI 1640中培育細胞。
實例2.4 全血分析(WBA) 2.4.1 IFNα刺激方案
為預測測試化合物在活體內抑制JAK1或JAK2依賴性信號傳導路徑之功效，使用人類全血研發生理學相關性活體外模型。在WBA分析中，使用化合物離體處理(1h)自給出知情同意之人類志願者抽取之血液，且隨後使用干擾素α(IFNα，JAK1依賴性路徑)刺激30分鐘或使用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，JAK2依賴性路徑)刺激2 h。
2.4.1.1磷酸-STAT1分析
對於IFNα刺激而言，使用pSTAT1 ELISA分析量測藉由白血細胞提取物中之INFα所達成之信號轉導子及轉錄激活子1磷酸化(pSTAT1)的增加。在干擾素α(IFNα)觸發之後之信號轉導子及轉錄激活子1磷酸化(STAT1)係JAK1調介之事件。研發磷酸-STAT1分析(用於量測細胞提取物中之磷 酸-STAT1含量)以評價化合物抑制JAK1依賴性信號傳導路徑之能力。
使用化合物離體處理(1h)自給出知情同意之人類志願者抽取之人類全血且隨後使用IFNα刺激30分鐘。使用磷酸-STAT1 ELISA量測白血細胞提取物中藉由INFα達成之STAT1磷酸化之增加。
ACK溶胞緩衝液由0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA組成。緩衝液之pH為7.3。
在H2O中將10x細胞溶胞緩衝液濃縮物(來自Cell Signaling之PathScan磷酸-STAT1(Tyr701)夾心式ELISA套組之一部分)稀釋10倍。在使用之前，向緩衝液中添加蛋白酶抑制劑。
將20 μg IFNα溶於40 μl H2O中以獲得500 μg/ml儲備溶液。將儲備溶液儲存於-20℃下。
在DMSO中製備化合物之3倍稀釋系列(最高濃度：10 mM)。隨後，將化合物在培養基中進一步稀釋(稀釋倍數取決於期望之最終化合物濃度)。
2.4.1.1.1將血液與化合物一起培養並使用IFNα進行刺激
在肝素化管中收集人類血液。將血液分成392 μl之等分試樣。然後，將4 μl化合物稀釋液添加至每一等分試樣中且將血液試樣在37℃下培育1 h。將IFNα儲備溶液在RPMI培養基中稀釋1000倍以獲得500 ng/ml工作溶液。將4 μl 500 ng/ml工作溶液添加至血液試樣中(最終IFNα濃度：5 ng/ml)。將試樣在37℃下培育30 min。
2.4.1.1.2細胞提取物之製備
在刺激時段結束時，將7.6 ml ACK緩衝液添加至血液試樣中以裂解紅血細胞。藉由將管翻轉5次來混合試樣且將反應液在冰上培育5 min。RBC之裂解在此培育期間應較為明顯。藉由在300 g及4℃下離心7 min來使細胞沈澱且去除上清液。向每一管中添加10 ml 1×PBS且再懸浮細胞沈澱物。將試樣在300 g及4℃下再次離心7 min。去除上清液並將沈澱物再懸浮於500 μl 1×PBS中。然後，將細胞懸浮液轉移至潔淨之1.5 ml微離心管中。藉由在700 g及4℃下離心5 min來使細胞沈澱。去除上清液且將沈澱物溶於150 μl細胞溶胞緩衝液中。將試樣在冰上培育15 min。然後，將試樣儲存於-80℃下直至進一步處理為止。
2.4.1.1.3藉由ELISA來量測STAT1磷酸化
使用來自Cell Signaling之Pathscan磷酸-STAT1(Tyr701)夾心式ELISA套組(目錄號：7234)來測定磷酸-STAT1含量。
將細胞提取物在冰上解凍。將管在16,000 g及4℃下離心5 min且收穫澄清之溶解產物。同時，將來自套組之微孔條平衡至室溫且藉由在H2O中稀釋20×洗滌緩衝液來製備洗滌緩衝液。將試樣在試樣稀釋劑中稀釋2倍且將100 μl添加至微孔條中。將該等條在4℃下培育過夜。
第二天，使用洗滌緩衝液將孔洗滌3次。向孔中添加100 μl檢測抗體。將條在37℃下培育1 h。然後，使用洗滌緩衝液再次將孔洗滌3次。將100 μl連接HRP之二級抗體添加至 每一孔中且將試樣在37℃下培育。30 min之後，再次將孔洗滌3次且將100 μl TMB受質添加至所有孔中。在試樣變藍時，添加100 μl終止溶液以終止反應。在450 nm下量測吸光度。
2.4.1.2數據分析
針對化合物濃度繪製細胞提取物中IFNα磷酸STAT1誘導之抑制且使用Graphpad軟體推導出IC50值。若R2大於0.8且希爾(Hill)斜率小於3，則保留數據。
2.4.1.3 IL-8 ELISA
對於GM-CSF刺激而言，使用IL-8 ELISA分析量測血漿中介白素-8(IL-8)含量之增加。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)-誘導之介白素8(IL-8)表現係JAK2調介之事件。已研發IL-8 ELISA(可用於量測血漿試樣中之IL-8含量)來評價化合物抑制JAK2依賴性信號傳導路徑之能力。
使用化合物離體處理(1h)自給出知情同意之人類志願者抽取之人類全血且隨後使用GM-CSF刺激2 h。使用IL-8 ELISA分析量測血漿中IL-8含量之增加。
將10 μg GM-CSF溶於100 μl H2O中以獲得100 μg/ml儲備溶液。將儲備溶液儲存於-20℃下。
在DMSO中製備測試化合物之3倍稀釋系列(最高濃度：10 mM)。隨後，將化合物在培養基中進一步稀釋(稀釋倍數取決於期望之最終化合物濃度)。
2.4.1.3.1將血液與化合物一起培育並使用GM-CSF進行刺激
在肝素化管中收集人類血液。將血液分成245 μl之等分試樣。然後，將2.5 μl測試化合物稀釋液添加至每一等分試樣中且將血液試樣在37℃下培育1 h。將GM-CSF儲備溶液在RPMI培養基中稀釋100倍以獲得1 μg/ml工作溶液。將2.5 μl 1 μg/ml工作溶液添加至血液試樣中(最終GM-CSF濃度：10 ng/ml)。將試樣在37℃下培育2 h。
2.4.1.3.2血漿試樣之製備
將試樣在1,000 g及4℃下離心15 min。收穫100 μl血漿並儲存於-80℃下直至進一步使用為止。
2.4.1.3.3藉由ELISA來量測IL-8含量
使用來自R&D Systems之人類IL-8化學發光免疫分析套組(目錄號：Q8000B)來測定IL-8含量。
藉由在H2O中稀釋10×洗滌緩衝液來製備洗滌緩衝液。藉由在使用之前15 min至4 h期間將1份Glo試劑1添加至2份Glo試劑B中來製備工作glo試劑。
向每一孔中添加100 μl分析稀釋劑RD1-86。然後，添加50 μl試樣(血漿)。將ELISA板在室溫及500 rpm下培育2 h。使用洗滌緩衝液將所有孔洗滌4次且向每一孔中添加200 μl IL-8偶聯物。在室溫下培育3 h之後，使用洗滌緩衝液將孔洗滌4次且向每一孔中添加100 μl工作glo試劑。將ELISA板在室溫下培育5 min(避光)。量測發光(讀取時間為0.5 s/孔)。
2.4.2 IL-6刺激方案
此外，使用人類全血實施流式細胞術分析以確立JAK1 高於JAK2之離體化合物選擇性。因此，自給出知情同意之人類志願者獲得血液。然後將血液在37℃及輕微搖動下平衡30分鐘，然後在埃彭道夫管(Eppendorf tube)中分成等分試樣。添加不同濃度之化合物並在37℃及輕微搖動下培育30分鐘，且隨後在37℃及輕微搖動下使用介白素6(IL-6)(對於JAK1依賴性路徑刺激而言)或GM-CSF(對於JAK2依賴性路徑刺激而言)刺激20分鐘。然後使用FACS分析評估磷酸-STAT1及磷酸-STAT5。
2.4.2.1磷酸-STAT1分析
對於白血細胞中IL-6刺激信號轉導子及轉錄激活子磷酸化1(pSTAT1)之增加而言，使用化合物將自給出知情同意之人類志願者抽取之人類全血離體處理30 min且隨後使用IL-6刺激20分鐘。使用抗磷酸-STAT1抗體藉由FACS來量測淋巴細胞中藉由IL-6達成之STAT1磷酸化之增加。
使用蒸餾水將5×裂解/固定緩衝液(BD PhosFlow，目錄號：558049)稀釋5倍並在37℃下預熱。拋棄剩餘之稀釋裂解/固定緩衝液。
將10 μg rhIL-6(R&D Systems，目錄號：206-IL)溶於1 ml PBS 0.1% BSA中以獲得10 μg/ml儲備溶液。將儲備溶液製成等分試樣並儲存於-80℃下。
在DMSO中製備化合物之3倍稀釋系列(10 mM儲備溶液)。經對照處理之試樣接受DMSO而非化合物。將所有試樣與最終濃度為1%之DMSO一起培育。
2.4.2.1.1將血液與化合物一起培育並使用IL-6進行刺激
在肝素化管中收集人類血液。將血液分成148.5 μl之等分試樣。然後，向每一血液等分試樣中添加1.5 μl測試化合物稀釋液且將血液試樣在37℃及輕微搖動下培育30 min。向血液試樣中添加IL-6儲備溶液(1.5 μl)(最終濃度為10 ng/ml)且將試樣在37℃及輕微搖動下培育20 min。
2.4.2.1.2白血細胞製備及CD4標記
在刺激時段結束時，向血液試樣中立即添加3 ml 1X預熱之裂解/固定緩衝液，短暫實施渦旋並在37℃下於水浴中培育15 min以裂解紅血細胞並固定白細胞，然後在-80℃下冷凍直至進一步使用為止。
對於下列步驟而言，將管在37℃下解凍大約20分鐘並在400xg及4℃下離心5 min。使用3 ml冷1X PBS洗滌細胞沈澱物，且在離心之後將細胞沈澱物再懸浮於100 μl含有3% BSA之PBS中。添加FITC偶聯之抗CD4抗體或FITC偶聯之對照同種型抗體並在室溫下於黑暗中培育20 min。
2.4.2.1.3細胞滲透化並使用抗磷酸-STAT1抗體進行標記
使用1×PBS洗滌細胞之後，將細胞沈澱物再懸浮於100 μl冰冷1X PBS中且添加900 μl冰冷100%甲醇。然後將細胞在4℃下培育30 min以進行滲透化。
然後使用含有3% BSA之1X PBS洗滌滲透化細胞並最終再懸浮於含有3% BSA之80 μl 1X PBX中。
添加20 μl PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2a同種型對照抗體(BD Biosciences，目錄號分別為612564及559319)並混合，然後在4℃下於黑暗中培育30 min。
然後使用1×PBS將細胞洗滌一次並在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上進行分析。
2.4.2.1.4 FACSCanto II上之螢光分析
對50,000個總事件進行計數且於淋巴細胞門中針對CD4+細胞進行選通之後量測磷酸-STAT1陽性細胞。使用FACSDiva軟體分析數據，且基於CD4+細胞上磷酸-STAT1之陽性細胞之百分比來計算IL-6刺激之抑制百分比。
2.4.2.2磷酸-STAT5分析
對於白血細胞中之GM-CSF刺激之信號轉導子及轉錄激活子5磷酸化(pSTAT5)之增加而言，使用化合物將自給出知情同意之人類志願者抽取之人類全血離體處理30 min且隨後使用GM-CSF刺激20分鐘。使用抗磷酸-STAT5抗體藉由FACS來量測單核細胞中藉由GM-CSF達成之STAT5磷酸化之增加。
使用蒸餾水將5×裂解/固定緩衝液(BD PhosFlow，目錄號：558049)稀釋5倍並在37℃下預熱。拋棄剩餘之稀釋裂解/固定緩衝液。
將10 μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目錄號：P300-03)溶於100 μl PBS 0.1% BSA中以獲得100 μg/ml儲備溶液。將儲備溶液以等分試樣儲存於-80℃下。
在DMSO中製備化合物之3倍稀釋系列(10 mM儲備溶液)。經對照處理之試樣接受DMSO而並不接受測試化合物。將所有試樣與最終濃度為1%之DMSO一起培育。
2.4.2.2.1將血液與化合物一起培育並使用GM-CSF進行 刺激
在肝素化管中收集人類血液。將血液分成148.5 μl之等分試樣。然後，向每一血液等分試樣中添加1.5 μl化合物稀釋液且將血液試樣在37℃及輕微搖動下培育30 min。向血液試樣中添加GM-CSF儲備溶液(1.5 μl)(最終濃度為20 pg/ml)且將試樣在37℃及輕微搖動下培育20 min。
2.4.2.2.2白血細胞製備及CD14標記
在刺激時段結束時，向血液試樣中立即添加3 ml 1X預熱裂解/固定緩衝液，短暫實施渦旋並在37℃下於水浴中培育15 min以裂解紅血細胞並固定白細胞，然後在-80℃下冷凍直至進一步使用為止。
對於下列步驟而言，將管在37℃下解凍大約20分鐘並在400xg及4℃下離心5 min。使用3 ml冷1X PBS洗滌細胞沈澱物，且在離心之後將細胞沈澱物再懸浮於100 μl含有3% BSA之PBS中。添加FITC小鼠抗CD14抗體(BD Biosciences，目錄號：345784)或對照FITC小鼠IgG2b同種型抗體(BD Biosciences，目錄號：555057)並在室溫下於黑暗中培育20 min。
2.4.2.2.3細胞滲透化並使用抗磷酸-STAT5抗體進行標記
使用1×PBS洗滌細胞之後，將細胞沈澱物再懸浮於100 μl冰冷1X PBS中且添加900 μl冰冷100%甲醇。然後將細胞在4℃下培育30 min以進行滲透化。
然後使用含有3% BSA之1X PBS洗滌滲透化細胞並最終再懸浮於含有3% BSA之80 μl 1X PBX中。
添加20 μl PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1同種型對照抗體(BD Biosciences，目錄號分別為612567及554680)，混合然後在4℃下於黑暗中培育30 min。
然後使用1×PBS將細胞洗滌一次並在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上進行分析。
2.4.2.2.4 FACSCanto II上之螢光分析
對50,000個總事件進行計數且針對CD14+細胞進行選通之後量測磷酸-STAT5陽性細胞。使用FACSDiva軟體分析數據，且對應於基於CD14+細胞上之磷酸-STAT5之陽性細胞之百分比計算之GM-CSF刺激之抑制百分比。
實例3.活體內模型 實例3.1 CIA模型 3.1.1材料
自Difco購得完全弗羅因德氏(Freund's)佐劑(CFA)及不完全弗羅因德氏佐劑(IFA)。分別自Chondrex(Isle d'Abeau,France)、Sigma(P4252,L'Isle d'Abeau,France)、Whyett(25 mg可注射唧筒，France)、Acros Organics(Palo Alto,CA)獲得II型牛膠原(CII)、脂多糖(LPS)及Enbrel。所用之所有其他試劑皆係試劑級且所有溶劑皆係分析級。
3.1.2動物
自Harlan實驗室(Maison-Alfort,France)獲得Dark Agouti大鼠(雄性，7-8週齡)。將大鼠保持在12 hr明/暗循環中(0700-1900)。將溫度維持於22℃下，且隨意提供食物及水。
3.1.3膠原誘導之關節炎(CIA)
在實驗前一天，使用0.05 M乙酸製備CII溶液(2 mg/ml)並儲存於4℃下。在即將免疫前，在冰水浴中藉由均質器將等體積之佐劑(IFA)及CII混合於預冷卻之玻璃瓶中。若未形成乳液，則可能需要額外佐劑及延長均質化。在第一天在各大鼠之尾巴基部經皮內注射0.2 ml乳液，在第9天實施第二次加強皮內注射(0.1 ml CFA鹽水中之2 mg/ml的CII溶液)。此免疫方法係根據已公開之方法(Sims等人，2004；Jou等人，2005)改良。
3.1.4研究設計
以大鼠CIA模型測試該等化合物之治療效應。將大鼠隨機分成數個同等組且各組含有10只大鼠。在第一天對所有大鼠實施免疫且在第9天實施加強免疫。自第16天至第30天持續進行治療性投藥。使用媒劑(MC 0.5%)處理陰性對照組且使用Enbrel(10 mg/kg，3x周，皮下)處理陽性對照組。通常以3種劑量(例如，3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg，經口)測試目標化合物。
3.1.5關節炎之臨床評價
根據Khachigian 2006，Lin等人2007及Nishida等人2004之方法對關節炎進行評分。使用關節炎評分對四個爪各自之腫脹分級，如下所述：0-無症狀；1-一類關節(例如踝或腕)輕微、但明顯充血且腫脹、或僅個別足趾之顯著充血及腫脹(不管受影響足趾之數量為多少)；2-兩類或更多類關節中度充血及腫脹；3-整個爪(包含足趾)嚴重充血及腫 脹；4-肢體中多處關節出現最大發炎(每個動物之最大累積臨床關節炎評分為16)(Nishida等人，2004)。
為允許對多個研究進行meta分析，如下所述將臨床評分值進行正規化：臨床評分之AUC(AUC評分)：計算每一個別大鼠自第1天至第14天之曲線下面積(AUC)。將每一動物之AUC除以針對研究中之媒劑(自其獲得該動物之數據)獲得之平均AUC並乘以100(亦即，將AUC表示為平均媒劑AUC/研究之百分比)。
第1天至第14天之臨床評分增加(終點評分)：將每一動物之臨床評分差除以針對研究中之媒劑(自其獲得該動物之數據)獲得之平均臨床評分差並乘以100(亦即將臨床評分差表示為媒劑之平均臨床評分差/研究之百分比)。
3.1.6關節炎發作後體重之變化(%)
臨床上，體重減輕與關節炎有關(Shelton等人，2005；Argiles等人，1998；Rall,2004；Walsmith等人，2004)。 因此，關節炎發作後之體重變化可用作評估大鼠模型中治療效應之非特異性終點。如下所述計算關節炎發作後之體重變化(%)：
3.1.7放射學
取各個個體動物之後爪的X射線相片。為每張相片指定 隨機盲識別號碼，且由兩個獨立的評分員使用放射性拉爾森(Larsen)評分系統對骨侵蝕之嚴重性進行分級，如下所述：0-正常，具有完整骨輪廓及正常關節間隙；1-輕微異常，其中任何一個或兩個外蹠骨展示輕微骨侵蝕；2-明顯早期異常，其中任何三至五個外蹠骨展示骨侵蝕；3-中度破壞性異常，其中所有外蹠骨以及任何一個或兩個內蹠骨展示明顯骨侵蝕；4-嚴重破壞性異常，其中所有蹠骨皆展示明顯骨侵蝕且至少一個內蹠骨關節完全被侵蝕，僅部分保留某些骨關節之輪廓；5-殘廢性異常，無骨輪廓。此評分系統係根據Salvemini等人，2001；Bush等人，2002；Sims等人，2004；Jou等人，2005進行改良。
3.1.8組織學
在放射性分析後，於10%磷酸鹽緩衝甲醛(pH 7.4)中固定小鼠後爪，使用精細組織學之快速骨脫鈣劑進行脫鈣(Laboratories Eurobio)並埋置於石蠟中。為確保廣泛評估關節炎關節，切割至少四組連續切片(5 μm厚)且各系列切片間隔100 μm。使用蘇木精(hematoxylin)及伊紅(eosin)(H&E)將切片染色。實施關於滑囊發炎及骨及軟骨損傷之雙盲組織實驗。在各爪中，使用四點量表評價四個參數。該等參數係細胞浸潤、血管翳嚴重性、軟骨侵蝕及骨侵蝕。如下所述進行評分：1-正常、2-輕微、3-中度、4-顯著。將該四個評分加在一起且代表另一評分，即「RA總分」。
3.1.9跟骨(腳後跟骨)之顯微電腦斷層掃描(μCT)分析：
RA中觀察到之骨降解尤其發生在骨皮質處且可藉由μCT分析來揭示(Sims NA等人，Arthritis Rheum.50(2004)2338-2346：Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis；Oste L等人，ECTC Montreal 2007：A high throughput method of measuring bone architectural disturbance in a murine CIA model by micro-CT morphometry)。在對跟骨進行掃描及3D體積重建後，根據每個載玻片中存在之以垂直於骨縱軸之方式在電腦中分離之離散物體數來量測骨降解。骨降解愈嚴重，所量測到之離散物體愈多。分析沿跟骨均勻地分佈之1000個切片(間隙為約10.8 μm)。
3.1.10穩態PK
在第7或11天，在眼窩後鼻竇處使用肝素鋰作為抗凝血劑在下列時間點收集血樣：投藥前、1、3及6 hr。將全血試樣離心且在分析之前將所得血漿試樣儲存於-20℃下。藉由LC-MS/MS方法測定各測試化合物之血漿濃度，其中以正電噴射模式操作質譜儀。使用Winnonlin®(Pharsight®，美國)計算藥物代謝動力學參數，且假設投藥前之血漿含量等於24 hr時之血漿含量。
3.1.11結論
本發明化合物展現，在0.1 mg/kg之劑量下正規化臨床評分值(以AUC或第1天至第14天之差形式計算)具有統計學顯著之改良。
實例3.2 敗血性休克模型
注射脂多糖(LPS)會誘導向周圍快速釋放可溶腫瘤壞死因子(TNF-α)。使用此模型來分析有希望之活體內TNF釋放封阻劑。
以既定經口劑量將每組6只BALB/cJ雌性小鼠(20 g)處理一次。30分鐘後，腹腔內注射LPS(15 μg/kg，大腸桿菌(E.Coli)血清型0111：B4)。90分鐘後，對小鼠實施無痛致死術並收集血液。使用市售ELISA套組確定循環TNF α含量。使用地塞米松(5 μg/kg)作為參照消炎化合物。
實例3.3 MAB模型
MAB模型容許快速評價治療劑對RA-樣發炎性反應的調節(Kachigian LM.Nature Protocols(2006)2512-2516：Collagen antibody-induced arthritis)。對DBA/J小鼠靜脈內注射針對膠原II之mAb混合劑。一天後，開始化合物處理(媒劑：10%(v/v)HPβCD)。三天後，小鼠接受腹腔內LPS注射(50 μg/小鼠)，從而導致發炎快速發作。繼續實施化合物處理直至mAb注射後10天為止。藉由量測爪腫脹並記錄各爪之臨床評分讀取發炎數據。呈現四肢之累積臨床關節炎評分以展示發炎之嚴重性。使用0-4之量表對各肢體施用評分系統，其中4係最嚴重發炎。
0 無症狀
1 一類之關節(例如踝或腕)輕微、但明顯充血且腫脹、或僅個別足趾顯著充血且腫脹(不管受影響足趾之數量為多少)
2 兩類或更多類關節中度充血且腫脹
3 整個爪(包含足趾)嚴重充血且腫脹
4 肢體中多處關節最大發炎
實例3.4 腫瘤學模型
Wernig等人，Cancer Cell 13,311,2008及Geron等人，Cancer Cell 13,321,2008闡述證實小分子對JAK2引發之骨髓組織增生性疾病之效能的活體內模型。
實例3.5 小鼠IBD模型
Wirtz等人2007闡述證實小分子對IBD之效能的活體外及活體內模型。
實例3.6 小鼠哮喘模型
Nials等人，2008；Ip等人，2006；Pernis等人，2002；Kudlacz等人，2008闡述證實小分子對哮喘之效能的活體外及活體內模型。
實例4：藥物代謝動力學、DMPK及毒性分析 實例4.1 熱力學溶解度
在室溫下於玻璃瓶中製備存於0.2 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)或0.1 M檸檬酸酯緩衝液(pH 3.0)中之1 mg/ml測試化合物溶液。
在室溫下於旋轉器驅動STR 4(Stuart Scientific,Bibby)中以速度3.0使試樣旋轉24 hr。
24 hr後，將800 μl試樣轉移至埃彭道夫管中並以14000 rpm離心5 min。然後將200 μl試樣之上清液轉移至 MultiscreenR Solubility板(Millipore,MSSLBPC50)中且借助真空歧管將上清液過濾(10-12" Hg)至潔淨Greiner聚丙烯V形底96孔板(目錄號651201)中。將5 μl濾液稀釋至在含有標準曲線之板(Greiner，目錄號651201)中培育所用的95 μl(F20)相同緩衝液中。
在DMSO中製備化合物之新標準曲線，其始於10 mM DMSO儲備溶液，然後於DMSO中將其稀釋2倍(5000 μM)，且然後於DMSO中進一步稀釋至19.5 μM。然後將3 μl始於5000 μM之稀釋系列轉移至97 μl乙腈緩衝液混合物(50/50)中。最終濃度範圍為2.5-150 μM。
使用密封墊(MA96RD-04S,www.kinesis.co.uk)將板密封且於室溫下在LCMS(來自Waters之ZQ 1525)上在最佳條件下使用Quanoptimize量測試樣以確定分子之適當質量。
在流速為1 ml/min之LCMS上分析試樣。溶劑A係15 mM氨且溶劑B係乙腈。在陽離子噴射下在來自Waters之XBridge C18 3.5 μM(2.1×30 mm)管柱上運行試樣。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且介於5% B至95% B之間。
借助Masslynx軟體包分析峰面積且相對於標準曲線繪製試樣之峰面積以獲得化合物之溶解度。
溶解度值係以μM或μg/ml報告。
實例4.2 水溶解度 4.2.1水溶解度，2% DMSO程序
自存於DMSO中之10 mM儲備溶液開始，在DMSO中製備連續稀釋之化合物。將稀釋系列轉移至F形底部之96 NUNC Maxisorb板(目錄號442404)中且在室溫下添加0.2 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)或0.1 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)。
最終濃度介於200 μM至2.5 μM之間，呈5個相等稀釋等級。最終DMSO濃度不超過2%。將200 μM芘添加至各96孔板之拐角點處且在顯微鏡上用作校正Z軸之參照點。
密封分析板並在37℃下培育1 hr，同時以230 rpm振盪。然後在白光顯微鏡下掃描板，在每個濃度下產生沈澱之單獨圖像。分析沈澱物並將其轉化為繪製於圖表上之數值。化合物看起來完全溶解之第一濃度係下文所報告之濃度，然而，實際濃度介於此濃度與比此濃度高一個稀釋等級之濃度之間。
以μg/ml形式報告根據此方案量測之溶解度值。
4.2.2水溶解度，3% DMSO程序
自存於DMSO中之10 mM儲備溶液開始，在DMSO中製備連續稀釋之化合物。將稀釋系列轉移至F形底部之96 NUNC Maxisorb板(目錄號442404)中且在室溫下添加0.1 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)或0.1 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)。
最終濃度介於300 μM至18.75 μM之間，呈5個相等稀釋等級。最終DMSO濃度不超過3%。將200 μM芘添加至各96孔板之拐角點處且在顯微鏡上用作校正Z軸之參照點。
密封分析板並在37℃下培育1 h，同時以230 rpm振盪。然後在白光顯微鏡下掃描板，在每個濃度下產生沈澱之單獨圖像。分析沈澱物並使用軟體工具將其轉化為可繪製於圖表上之數值。化合物看起來完全溶解之第一濃度係所報 告之濃度；然而，實際濃度介於此濃度與比此濃.度高一個稀釋等級之濃度之間。
以μg/ml形式報告根據此方案量測之溶解度值。
實例4.3 血漿蛋白結合(平衡透析)
在DMSO中5倍稀釋存於DMSO中之10 mM化合物儲備溶液。將此溶液進一步稀釋於剛解凍之人類、大鼠、小鼠或狗血漿(BioReclamation INC)中，其最終濃度為10 μM且最終DMSO濃度為0.5%(在PP-Masterblock 96孔(Greiner，目錄號780285)中，5.5 μl於1094.5 μl血漿中)。
製備具有插入物之Pierce Red Device板(ThermoScientific，目錄號89809)且在緩衝液室中填充750 μl PBS且於血漿室中填充500 μl加標血漿。在37℃下將板培育4 hr，同時以230 rpm振盪。在培育後，將兩室中液體之120 μl轉移至96孔圓底、PP深孔板(Nunc，目錄號278743)中之360 μl乙腈中並使用鋁箔蓋密封。混合試樣並置於冰上保持30 min。然後在4℃下以1200 rcf將此板離心30 min且將上清液轉移至96 v形底PP板(Greiner,651201)上用以在LCMS上分析。
使用www.kinesis.co.uk之密封墊(MA96RD-04S)將板密封且於室溫下在LCMS(來自Waters之ZQ 1525)上在最佳條件下使用Quanoptimize量測試樣以確定分子之適當質量。
在流速為1 ml/min之LCMS上分析試樣。溶劑A係15 mM氨且溶劑B係乙腈。在陽離子噴射下在來自Waters之XBridge C18 3.5 μM(2.1×30 mm)管柱上運行試樣。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且介於5% B至95% B之間。
將緩衝液室及血漿室中之化合物的峰面積視為100%化合物。自該等結果推導出結合至血漿之百分比且將其報告為結合至血漿之百分比。
藉由顯微鏡檢查最終測試濃度之化合物在PBS中的溶解性以顯示是否觀察到沈澱。
實例4.4 微粒體穩定性 4.4.1微粒體穩定性，1h培育程序
在96深孔板(Greiner，目錄號780285)中之182 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中將DMSO中之10 mM化合物儲備溶液稀釋1000倍並在37℃下預培育。
將40 μl去離子水添加至聚丙烯Matrix 2D條形碼標記儲存管(Thermo Scientific)之孔中並在37℃下預培育。
在182 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中製備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)工作儲備溶液並在使用前將其放置於冰上。在去離子水中製備含有MgCl2、葡萄糖-6-磷酸酯及NADP+之輔因子並在使用前將其放置於冰上。
製備含有目標物種(人類、小鼠、大鼠、狗)之肝微粒體(Xenotech)、前文所述G6PDH及輔因子的最終工作溶液且在室溫下將此混合物培育不超過20分鐘。
向Matrix管中之40 μl預熱水中添加30 μl預熱化合物稀釋液並添加30 μl微粒體混合物。最終反應濃度係3 μM化合物、1 mg微粒體、0.4 U/ml GDPDH、3.3 mM MgCl2、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸酯及1.3 mM NADP+。
為量測在零時刻化合物之剩餘百分比，在添加微粒體混 合物前向孔中添加MeOH或ACN(1：1)。使用Matrix Sepra sealsTM(Matrix，目錄號4464)將板密封並振盪數秒以確保所有組份均完全混合。
在37℃、300 rpm下培育未終止之試樣且在培育1 hr後，使用MeOH或ACN(1：1)終止反應。
在終止反應後，混合試樣並將其於冰上放置30 min以沈澱蛋白質。然後在1200 rcf、4℃下使板離心30 min且將上清液轉移至96 v形底PP板(Greiner,651201)中用以LCMS上之分析。
使用www.kinesis.co.uk之密封墊(MA96RD-04S)密封該等板且於室溫下在LCMS(來自Waters之ZQ 1525)上在最佳條件下使用Quanoptimize量測試樣以確定母體分子之適當質量。
以1 ml/min之流速在LCMS上分析試樣。端視所用終止溶液，溶劑A係15 mM氨且溶劑B係甲醇或乙腈。在陽離子噴射下在來自Waters之XBridge C18 3.5 μM(2.1×30 mM)管柱上運行試樣。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且介於5% B至95% B之間。
將0時刻時母體化合物的峰面積視為剩餘100%。自0時刻計算培育1 hr後之剩餘百分比且將其計算為剩餘百分比。藉由顯微鏡檢查最終測試濃度之化合物在緩衝液中的溶解度且報告結果。
關於微粒體穩定性之數據表示為60 min後剩餘化合物總量之百分比。
4.4.2微粒體穩定性，30 min培育程序
在96深孔板(Greiner，目錄號780285)中之105 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中將DMSO中之10 mM化合物儲備溶液稀釋至6 μM並在37℃下預熱。
在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中將700 U/ml之葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH,Roche,10127671001)工作儲備溶液稀釋700倍。在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中將含有0.528 M MgCl2.6H2O(Sigma,M2670)、0.528 M葡萄糖-6-磷酸酯(Sigma,G-7879)及0.208 M NADP+(Sigma,N-0505)之輔因子混合物稀釋8倍。
製備含有目標物種(人類、小鼠、大鼠、狗等)之1 mg/ml肝微粒體(Provider,Xenotech)、0.8 U/ml G6PDH及輔因子混合物(6.6 mM MgCl2、6.6 mM葡萄糖-6-磷酸酯、2.6 mM NADP+)之工作溶液。在室溫下，將此混合物預培育15分鐘但不能超過20分鐘。
預培育之後，以相等量一起添加化合物稀釋液及含有微粒體之混合物並以300 rpm培育30分鐘。對於第0分鐘之時間點而言，向化合物稀釋液中添加2體積甲醇，然後添加微粒體混合物。培育期間之最終濃度為：3 μM測試化合物或對照化合物、0.5 mg/ml微粒體、0.4 U/ml G6PDH、3.3 mM MgCl2、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸酯及1.3 mM NaDP+。
在培育30分鐘之後，使用2體積甲醇終止反應。
在兩個時間點中，混合試樣，離心且收穫上清液以用於在LC-MS/MS上進行分析。儀器反應(亦即峰高)可參照零 時間點試樣(100%)以測定剩餘化合物之百分比。在分析設計中包含標準化合物心得安(Propanolol)及維拉帕米(Verapamil)。
關於微粒體穩定性之數據表示為30 min後剩餘化合物總量之百分比。
實例4.5 Caco2滲透性
如下所述實施雙向Caco-2分析。Caco-2細胞係自歐洲動物細胞培育物收集中心(European Collection of Cell Cultures)(ECACC，目錄號86010202)獲得且在24孔Transwell板(Fisher TKT-545-020B)中進行21天之細胞培育後使用。
將2×105個細胞/孔接種於由DMEM+GlutaMAXI+1% NEAA+10% FBS(FetalClone II)+1% Pen/Strep組成之平板培養基中。每2-3天更換培養基。
在含有25 mM HEPES(pH 7.4)之翰克司(Hanks')平衡鹽溶液中製備測試化合物及參照化合物(普萘洛爾(propranolol)及羅丹明(rhodamine)123或長春鹼，所有化合物均係自Sigma購得)且以10 μM之濃度將其添加至Transwell板總成之頂室(125 μl)或底側室(600 μl)中，其中最終DMSO濃度為0.25%。
將50 μM螢光黃(Sigma)添加至所有孔中之供體緩衝液中以藉由監測螢光黃滲透性來平均細胞層之完整性。因螢光黃(LY)不能自由滲透磷親脂性障壁，故高程度之LY轉運表明細胞層之完整性較差。
在37℃下於定軌振盪器中以150 rpm振盪培育1小時後，自頂室(A)及基底室(B)二者中取出70 μl等分試樣並將其添加至96孔板中含有分析性內部標樣(0.5 μM卡馬西平(carbamazepine))之100 μl 50：50乙腈：水溶液中。
使用Spectramax Gemini XS(Ex 426 nm及Em 538 nm)在含有來自底側及頂側之150 μl液體的潔淨96孔板中量測螢光黃。
藉由高效液相層析/質譜(LC-MS/MS)量測試樣中之化合物濃度。
根據以下關係計算表觀滲透率(Papp)值：Papp=[化合物]受體最終濃度×V受體/([化合物]供體初始濃度×V供體)/T培育×V供體/表面積×60×10-6 cm/s
V=室體積
Tinc=培育時間
表面積=0.33 cm2 使用Papp B>A/PappA>B之比計算流出比來指示來自頂室表面之主動流出。
使用下列分析接受標準： 普萘洛爾：Papp(A>B)值20(×10-6 cm/s)
羅丹明123或長春鹼：Papp(A>B)值<5(×10-6 cm/s)，其中流出比5。
螢光黃滲透率：100 nm/s
實例4.6 齧齒類動物中之藥物動力學研究 4.6.1動物
自Janvier(France)獲得斯普拉-道來氏(Sprague-Dawley)大鼠(雄性，5-6週齡)。在治療之前使大鼠適應環境至少7天並保持於12 hr明/暗循環中(0700-1900)。將溫度維持於大約22℃下，且隨意提供食物及水。在投與測試化合物之前兩天時，在異氟烷麻醉下對大鼠實施外科手術以將導管放置於頸靜脈中。外科手術之後，單獨放置大鼠。在經口投藥前至少16 h且在之後6 h剝奪大鼠食物。任意提供水。
4.6.2藥物代謝動力學研究
在PEG200/生理鹽水(60/40)中調配化合物用於靜脈途徑，且在0.5%甲基纖維素或10%羥丙基-β-環狀糊精(pH 3)中調配化合物用於經口途徑。測試化合物係以單一食道管飼劑形式以5 mg/kg在5 ml/kg投藥體積下經口投藥及經由尾靜脈以快速濃注劑形式以1 mg/kg在5 ml/kg投藥體積下經靜脈內投藥。各組由3只大鼠組成。在下列範圍內之時間點使用使用肝素鋰作為抗凝血劑經由頸靜脈收集血樣：0.05、0.25、0.5、1、3、5及8 hr(靜脈內途徑)，及0.25、0.5、1、3、5、8及24 hr(經口途徑)。以5000 rpm將全血試樣離心10 min且在分析前將所得血漿試樣儲存於-20℃下。
4.6.3血漿中化合物濃度之量化
藉由LC-MS/MS方法測定各測試化合物之血漿濃度，其中以正電噴射模式運行質譜儀。
4.6.4藥物代謝動力學參數之測定
可使用Winnonlin®(Pharsight®，美國)計算藥物代謝動力學參數。
實例4.7 7天大鼠毒性研究
以100 mg/kg/天、300 mg/kg/天及500 mg/kg/天之日劑量、藉由管飼法以5 ml/kg/天之恆定劑量體積在斯普拉-道來氏雄性大鼠中使用測試化合物實施7天經口毒性研究以評價其毒性潛能及毒動學。
將測試化合物調配於純淨水中之30%(v/v)HPβCD中。各組包含5個主要雄性大鼠以及3個次要動物用於毒動學。對於第四組，僅以相同頻率、相同劑量體積及相同投與途徑給予存於水中之30%(v/v)HPβCD，且用作媒劑對照組。
研究目的係確定不導致可鑑別不良事件的最低劑量(無明顯副作用之量-NOAEL)。
實例4.8 肝細胞穩定性
McGinnity等人，Drug Metabolism and Disposition 2008,32,11,1247闡述評估肝細胞中之代謝清除率之模型。
實例4.9 QT延長傾向
在hERG膜片鉗分析中評價QT延長之可能性。
習用全細胞膜片-鉗
使用由Pulse v8.77軟體(HEKA)控制之EPC10放大器實施全細胞膜片鉗記錄。串聯電阻通常小於10 MΩ(且補償大於60%，記錄未發生漏電扣除。自GC150TF吸管玻璃(Harvard)來製造電極。
外部浴溶液含有：135 mM NaCl、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4。
內部膜片吸管溶液含有：100 mM Kgluconate、20 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM Na2ATP、2 mM麩胱甘肽、11 mM EGTA、10 mM HEPES，pH 7.2。
使用Biologic MEV-9/EVH-9快速灌注系統灌注藥物。
所有記錄均係在穩定表現hERG通道之HEK293細胞上實施。細胞係在使用兩個鉑棒(Goodfellow)錨定於記錄室中之12 mm圓形蓋玻片(德國玻璃(German glass)，Bellco)上培養。使用激活脈衝誘發hERG電流直至+40 mV且保持1000 ms、之後尾電流脈衝直至-50 mV且保持2000 ms，保持電位為-80 mV。每20 s施加脈衝且所有實驗均係在室溫下實施。
參考文獻
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本說明書引用之所有出版物(包含但不限於專利及專利申請案)皆以引用方式併入本文中，就如同充分陳述之已特定地及個別地指明將各個出版物以引用方式併入本文中一般。
彼等熟習此項技術者應瞭解，前述說明係例示性及解釋性的，且意欲闡釋本發明及其較佳實施例。根據前述說明，彼等熟習此項技術者可對本發明之組合物及方法實施各種修改及改變，且可在並不背離本發明精神之情形下作出。所有屬於隨附申請專利範圍之範圍內之該等修改皆意欲包含於本文中。
應理解，諸如各種化合物之差示細胞滲透能力等因素可促成活體外生物化學及細胞分析中之化合物活性間的差異。
本申請案中給出及所述之本發明化合物的至少某些化學 名稱可藉由使用市售化學品命名軟體程式自動生成，但未經獨立驗證。實施此功能之代表性程式包含由Open Eye Software公司出售之Lexichem命名工具及由MDL公司出售之Autonom Software工具。在所指化學名稱及所繪示結構不同之情況下，以所繪示結構為準。
本文所示化學結構係使用ChemDraw®或ISIS®/DRAW製得。在本文結構中之碳、氧或氮原子上出現之任何空缺化合價皆表示存在氫原子。當結構中存在對掌性中心但該對掌性中心未展示具體立體化學時，結構涵蓋與對掌性結構有關之兩個對映異構體。

Claims (13)

  1. 一種式I化合物或其醫藥上可接受之鹽：
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係用於醫藥中。
  3. 如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防過敏、發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
  4. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎及發炎性腸病。
  5. 一種醫藥組合物，其包括醫藥上可接受之載劑及醫藥有效量之如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
  6. 如請求項5之醫藥組合物，其包括另一治療劑，其中該另一治療劑係用於治療或預防以下疾病之藥劑：過敏、發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6 或干擾素分泌過多有關之疾病。
  7. 如請求項5或6之醫藥組合物，其係用於醫藥中。
  8. 如請求項5或6之醫藥組合物，其用於治療或預防過敏、發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
  9. 如請求項6之醫藥組合物，其中該自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎及發炎性腸病。
  10. 一種如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽或如請求項5或6之醫藥組合物之用途，其係用於製造藥劑。
  11. 一種如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽或如請求項5或6之醫藥組合物之用途，其係用於製造用於治療或預防以下疾病之藥劑：過敏、發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
  12. 如請求項11之用途，其中該自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、幼年型特發性關節炎及發炎性腸病。
  13. 如請求項11之用途，其中如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽或如請求項5之醫藥組合物係與另一治療 劑組合投與，其中該另一治療劑係用於治療或預防以下疾病之藥劑：過敏、發炎性病狀、自體免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及軟骨代謝損傷之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
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