CN103492386B

CN103492386B - 可用于治疗变性和炎性疾病的新化合物

Info

Publication number: CN103492386B
Application number: CN201280020782.4A
Authority: CN
Inventors: C·J·M·梅内特; A·J·霍奇斯; H·D·维特尔
Original assignee: Galapagos NV
Current assignee: Galapagos NV
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2032-04-26
Also published as: HK1195311A1; NZ617528A; HK1195312A1; AU2012247482A1; MX2013012282A; EA024743B1; CA2833942A1; ZA201307793B; MX360697B; AU2012247482B2; AU2012247484B2; CA2833963A1; CA2833963C; CN103492385A; KR101934707B1; MX2013012281A; WO2012146657A1; US20150031706A1; WO2012146659A1; JP5947371B2

Abstract

本文公开了能抑制JAK的新的式I的吡唑并吡啶化合物，这些化合物可以制备成药物组合物，可用于预防和治疗哺乳动物、包括人的多种病症，所述病症非限制性地例如包括过敏、炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

Description

可用于治疗变性和炎性疾病的新化合物

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119要求2011年4月28日申请的美国临时申请号61/479,956的权益，该申请的内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及JAK抑制剂化合物，JAK属于参与炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新(turnover)受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的酪氨酸激酶家族。具体而言，本发明的化合物抑制JAK1和/或JAK2。本发明还提供了本发明的化合物的制备方法、包含本发明的化合物的药物组合物以及通过施用本发明的化合物来预防和/或治疗疾病的方法，所述疾病涉及炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

Janus激酶(JAK)是转导细胞因子信号从膜受体到STAT转录因子的细胞质酪氨酸激酶。已经描述了四种JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。当细胞因子与其受体结合时，JAK家族成员自磷酸化和/或彼此转磷酸化，随后STATs磷酸化，然后迁移至细胞核内以调节转录。JAK-STAT细胞内信号转导适用于干扰素、大多数白细胞介素以及多种细胞因子和内分泌因子，例如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF和PRL(VainchenkerW.等人(2008))。

遗传学模型和小分子JAK抑制剂的组合研究揭示了数种JAKs的治疗潜能。通过小鼠和人遗传学确证JAK3是免疫抑制靶点(O’SheaJ.等人(2004))。JAK3抑制剂成功用于临床开发，最初用于器官移植排斥，但后来也用于其它免疫炎性适应证，例如类风湿性关节炎(RA)、银屑病和克罗恩病(http://clinicaltrials.gov/)。

TYK2是免疫炎性疾病的潜在靶点，已经通过人遗传学和小鼠敲除研究得以确证(LevyD.和LoomisC.(2007))。

JAK1和/或JAK2是免疫炎性疾病领域的靶点。将JAK1和/或JAK2与其它JAKs杂二聚化以转导细胞因子驱动的促炎信号传导。因此，抑制JAK1和/或JAK2对于具有使用JAK1和/或JAK2信号传导的病理学相关细胞因子如IL-6、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、IL-23或IFNγ的免疫炎性疾病以及对于其它由JAK介导的信号转导所驱动的疾病是有益的。

背景技术

软骨变性是很多疾病的标志，其中类风湿性关节炎和骨关节炎是最主要的。类风湿性关节炎(RA)是慢性关节变性疾病，其特征在于关节结构的炎症和破坏。当疾病未受抑制时，由于关节功能性的丧失导致实质性的失能和疼痛，甚至过早死亡。因此，RA治疗的目的不仅在于延缓疾病，而且在于获得减轻，从而终止关节破坏。除了疾病结果的严重性，RA的高度流行性(全球～0.8%的成年人受到困扰)意味着很高的社会经济冲击。(关于RA的综述，参见Smolen和Steiner(2003)；Lee和Weinblatt(2001)；Choy和Panayi(2001)；O’Dell(2004)和Firestein(2003))。

JAK1和JAK2涉及很多细胞因子和激素的细胞内信号转导。通过JAK1和/或JAK2抑制剂可以改善与任意这些细胞因子和激素相关的病变。因此，许多过敏、炎症和自身免疫性疾病可能受益于用本发明所述的化合物进行的治疗，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、幼年型特发性关节炎、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、组织纤维化、嗜酸性粒细胞炎症、eosophagitis、炎性肠病(例如克罗恩病，溃疡性结肠炎)、移植、移植物抗宿主病、银屑病、肌炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎(juvenileideopathicarthrits)和多发性硬化(Kopf等人,2010)。

骨关节炎(也称为OA或磨损性关节炎)是最常见的关节炎形式，其特征在于关节软骨的损失，通常伴随骨肥大和疼痛。关于骨关节炎的深入综述，参见Wieland等人,2005。

骨关节炎难以治疗。目前，尚无法治愈，治疗集中于缓解疼痛和防止患病关节变形。常用的治疗包括应用非甾体抗炎药(NSAID)。尽管膳食增补剂如软骨素和硫酸葡糖胺被提倡对于骨关节炎的治疗是安全有效的选择，然而最近的临床试验表明两种治疗不能降低与骨关节炎有关的疼痛(Clegg等人,2006)。

合成代谢过程的刺激、分解代谢过程的阻断或这两者的组合可以使软骨稳定和甚至可能逆转损伤，因此防止疾病的进一步发展。已经发现了矫正在骨关节炎疾病期间出现的关节软骨损伤的治疗方法，但目前无一能原位和体内介导关节软骨再生。总而言之，目前尚没有改变疾病的骨关节炎药物。

Vandeghinste等人(WO2005/124342)发现JAK1可以作为靶点，对它的抑制对于数种疾病(包括OA)可能具有治疗相关性。小鼠中JAK1基因的敲除证实JAK1在发育过程中发挥必要的非冗余作用：JAK1-/-小鼠在出生后24小时内死亡并且淋巴细胞发育严重受损。而且，JAK1-/-细胞对应用II类细胞因子受体的细胞因子、应用γ-c亚基用于信号传导的细胞因子受体和应用gp130亚基用于信号传导的细胞因子受体家族不反应或反应很低(Rodig等人,1998)。

多个小组已经参与了软骨细胞生物学中JAK-STAT的信号传导。Li等人(2001)指出制癌蛋白M通过活化JAK/STAT和MAPK信号传导途径而诱导原代软骨细胞中MMP和TIMP3基因表达。Osaki等人(2003)指出软骨细胞中干扰素γ介导的胶原II抑制参与JAK-STAT信号传导。IL1-β通过减少基质组分的表达和通过诱导胶原酶和诱导型一氧化氮合酶(NOS2)(其介导一氧化氮(NO)的产生)的表达而诱导软骨的分解代谢。Otero等人(2005)指出瘦蛋白和IL1-β协同诱导软骨细胞中NO的产生和NOS2mRNA的表达，并且指出这种作用可以被JAK抑制剂阻断。Legendre等人(2003)指出IL6/IL6受体诱导牛关节软骨细胞中软骨特异性基质基因胶原II、聚集蛋白聚糖核心和连接蛋白的下调，并且指出这种作用通过JAK/STAT信号传导介导。因此，这些观察表明JAK激酶活性在软骨内稳态中起作用以及JAK激酶抑制剂具有治疗潜能。

JAK家族成员还已经牵涉在其它病症中，包括骨髓增殖性障碍(O’Sullivan等人，2007，MolImmunol.44(10)：2497-506)，其中在JAK2中鉴定出存在突变。这表明JAK、特别是JAK2的抑制剂还能用于治疗骨髓增殖性障碍。另外，JAK家族、特别是JAK1、JAK2和JAK3已经与癌症、特别是白血病如急性髓性白血病(O’Sullivan等人，2007，MolImmunol.44(10)：2497-506；Xiang等人，2008，“IdentificationofsomaticJAK1mutationsinpatientswithacutemyeloidleukemia”,Blood第一版文章，在线发表于2007年12月26日；DOI10.1182/blood-2007-05-090308)和急性原始淋巴细胞白血病(Mullighan等人，2009)或实体瘤如子宫平滑肌肉瘤(Constantinescu等人，2007，TrendsinBiochemicalSciences33(3)：122-131)、前列腺癌(Tam等人，2007，BritishJournalofCancer，97，378-383)相关。这些结果表明JAK、特别是JAK1和/或JAK2的抑制剂还可以用于治疗癌症(白血病和实体瘤，例如子宫平滑肌肉瘤、前列腺癌)。

另外，Castleman病、多发性骨髓瘤、系膜增殖性肾小球肾炎、银屑病和卡波西肉瘤可能归因于细胞因子IL-6的分泌过多，IL-6的生物学效应是通过细胞内JAK-STAT信号传导介导的(TetsujiNaka，NorihiroNishimoto和TadamitsuKishimoto，ArthritisRes2002，4(增刊3)：S233-S242)。该结果表明，JAK的抑制剂还可以用于治疗所述疾病。

目前的治疗不令人满意，因此仍然需要鉴定出其它的化合物，所述化合物可用于治疗炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL-6或干扰素分泌过多相关的疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎，尤其是类风湿性关节炎。因此，本发明提供了化合物、其制备方法和包含本发明的化合物以及包含适宜药物载体的药物组合物。本发明还提供了本发明的化合物在制备用于治疗炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL-6或干扰素分泌过多相关的疾病如骨关节炎和类风湿性关节炎、尤其是类风湿性关节炎的药物中的用途。

发明概述

本发明基于如下发现：本发明的化合物能作为JAK抑制剂起作用，它们可用于治疗炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。在一个具体方面，本发明的化合物是JAK1和/或JAK2的抑制剂。本发明还提供了这些化合物的制备方法、包含这些化合物的药物组合物和通过施用本发明的化合物来治疗炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的方法。

因此，在本发明的第一个方面，提供了具有式(I)的本发明的化合物:

其中

Cy1是C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

R¹选自C_1-6烷基和C_3-7环烷基，其各自可任选被一个或多个卤素、CN或OH取代；

R²各自独立地选自卤素、CN、OH、C_1-6烷基(任选被一个或多个独立地选自卤素、CN、OH和C_1-4烷氧基的基团取代)和C_1-6烷氧基(任选被一个或多个独立地选自卤素、CN、OH和C_1-4烷氧基的基团取代)；

L不存在或选自-O-、-C(O)-、-N(R⁵)-、-CON(R⁵)-、-SO₂N(R⁵)-、-S(O)₂-、-N(R⁵)CO-和-N(R⁵)SO₂-；

Y不存在或是C_1-4亚烷基(任选被一个或多个卤素或CN取代)；

R³选自H、卤素、CN、C_6-10芳基(任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代)、C_3-7环烷基(任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代)、4-7元杂环烷基(任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代)和5-10元杂芳基(任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代)；或

R³选自-OR^3b、-NHR^3b、-C(=O)R^3b、-C(=O)NHR^3b和-SO₂NHR^3b；

R^3a各自独立地选自H、OH、卤素、CN、氧代基、C_1-4烷基(任选被一个或多个独立地选自卤素、C_1-4烷氧基和CN的基团取代)、C_1-4烷氧基(任选被一个或多个卤素或C_1-4烷氧基取代)、氨基(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、-C(=O)NH₂(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、C_1-4硫代烷氧基、4-7元杂环烷基、-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶；

R^3b独立地选自C_1-6烷基、苯基(任选被一个或多个独立地选自卤素和C_1-4烷基的基团取代)、C_3-7环烷基和4-7元杂环烷基(任选被一个或多个独立地选自卤素和C_1-4烷基的基团取代)；

R⁴是H、卤素、CN或C_1-4烷基；

R⁵是H或C_1-4烷基；

R⁶是H或C_1-4烷基；且

下标m是0、1或2。

在一个特定的实施方案中，本发明的化合物是JAK1和/或JAK2的抑制剂。

另一方面，本发明提供了包含本发明的化合物和药物载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。而且，就制备和使用而言，可用于本文公开的药物组合物和治疗方法的本发明的化合物是可药用的。在本发明的该方面，药物组合物可另外包含适于与本发明的化合物组合应用的其它活性成分。

在本发明的另一方面，本发明提供了治疗易感或感染本文所列那些的病症如炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括施用有效量的如本文所述的本发明的药物组合物或化合物。在一个特定的实施方案中，病症与异常的JAK1和/或JAK2活性相关。

在另一方面，本发明提供了用作药物的本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物。在具体的实施方案中，所述药物组合物还包含其它活性成分。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防选自本文所列那些的病症如炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的本发明的化合物。在一个特定的实施方案中，所述病症与异常的JAK1和/或JAK2活性相关。

在另一个治疗方法方面，本发明提供了用于治疗易感或感染选自本文所列那些的病症如炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的本文所述的本发明的药物组合物或化合物。在一个特定的实施方案中，所述病症与异常的JAK1和/或JAK2活性相关。在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防选自本文所列那些的病症如炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的本发明的化合物。在一个特定的实施方案中，所述病症与异常的JAK1和/或JAK2活性相关。

在另一方面，本发明提供了采用本文后面公开的代表性合成方案和路线合成本发明的化合物的方法。

因此，本发明的主要目的是提供新的化合物，其可以修正JAK的活性，从而可用于治疗或预防任何可能与其因果相关的病症。在一个具体的方面，本发明的化合物调节JAK1和/或JAK2的活性。

本发明的另一目的是提供可用于治疗或预防病症或其症状的化合物，所述病症例如是炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。在一个特定的实施方案中，所述病症与异常的JAK1和/或JAK2活性相关。

本发明的另一目的是提供可用于治疗或预防多种疾病状态的药物组合物，所述疾病状态例如是炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。在一个特定的实施方案中，所述疾病与JAK1和/或JAK2活性相关。

考虑到随后的详述，其它目的和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。

发明详述

定义

下列术语旨在具有下面给出的含义并且可用于理解本文中的描述和预期范围。

当描述可以包括化合物、包含该化合物的药物组合物以及应用该化合物和组合物的方法的本发明时，下列术语(如果存在的话)具有下列含义，另有说明除外。还应当理解：当在本文中描述时，下文定义的任何部分可以被多个取代基取代，并且各自的定义意欲在其下文给出的范围内包括这类被取代的部分。术语“取代”如下文定义，另有说明除外。还应当理解，本文中应用的术语“基团”和“基”可以被认为是可以互换的。

物品本身在本文可以用于表示物品的一个(种)或多于一个(种)(即至少一个(种))的合乎语法的对象。例如，“类似物”表示一种类似物或多于一种类似物。

本文所用的术语“JAK”涉及Janus激酶(JAKs)家族，其是从膜受体向STAT转录因子转导细胞因子信号的细胞质酪氨酸激酶。描述了四种JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，术语JAK可表示上下文所示的全体所有JAK家族成员或者一种或多种JAK家族成员。

“烷氧基”表示基团-OR²⁶，其中R²⁶是具有指定碳原子数的烷基。具体的烷氧基是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。具体的烷氧基是低级烷氧基，即具有1至6个碳原子的烷氧基。进一步具体的烷氧基具有1至4个碳原子。

“亚烷基”指具有指定碳原子数、特别是具有1至4个碳原子的二价烷基基团，其可以是直链的或支链的。通过诸如以下的基团举例说明该术语：亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂-CH₂-)、亚丙基异构体(例如-CH₂-CH₂-CH₂-和-CH(CH₃)-CH₂-)等。

“烷基”表示具有指定碳原子数的直链或支链脂肪族烃。具体的烷基具有1至8个碳原子。更具体的是具有1至6个碳原子的低级烷基。进一步具体的基团具有1至4个碳原子。示例性的直链基团包括甲基、乙基、正丙基和正丁基。支链表示一个或多个低级烷基如甲基、乙基、丙基或丁基连接到线性烷基链上，示例性的支链基团包括异丙基、异丁基、叔丁基和异戊基。

“链烯基”指具有指定碳原子数的一价烯属(不饱和)烃基。具体的链烯基具有2至8个碳原子、更特别是具有2至6个碳原子，其可以是直链的或支链的，具有至少1个、特别是1至2个烯属不饱和位点。具体的链烯基包括乙烯基(-CH=CH₂)、正丙烯基(-CH₂CH=CH₂)、异丙烯基(-C(CH₃)=CH₂)等。

“氨基”指基团-NH₂。

“芳基”表示通过从母体芳族环系的一个碳原子上除去一个氢原子而衍生的单价芳族烃基团。具体而言，芳基指具有指定环原子数的单环或多环芳族环结构。特别地，该术语包括含有6-10个环成员的基团。当芳基是单环环系时，其优选含有6个碳原子。具体的芳基包括苯基、萘基、茚基和四氢萘基。

“环烷基”指具有指定环原子数的单环或多环非芳族烃基环结构。环烷基可具有3至10个碳原子、特别是3至7个碳原子。该环烷基包括例如单环结构如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。

“氰基”指基团-CN。

“卤代”或“卤素”指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。特定的卤素基团是氟或溴。

“杂”当用于描述化合物或化合物上存在的基团时指化合物或基团中的一个或多个碳原子已经被氮、氧或硫杂原子替代。杂可以应用于上文描述的任何烃基，例如烷基，如杂烷基；环烷基，如杂环烷基；芳基，如杂芳基等，其具有1至5个、特别是1至3个杂原子、更通常具有1或2个杂原子、例如1个杂原子。

“杂芳基”指包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子和指定数目的环原子的单环或多环芳族环结构。特别是，芳族环结构可以具有5至10个环成员。杂芳基可以是例如五元或六元单环或者是由稠合的五和六元环或两个稠合的六元环或另外例如两个稠合的五元环形成的二环结构。各环可以含有至多四个通常选自氮、硫和氧的杂原子。通常，杂芳基环含有至多4个杂原子、更通常至多3个杂原子、更通常至多2个、例如1个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基环含有至少一个环氮原子。杂芳基环中的氮原子可以是碱性的(如在咪唑或吡啶的情况中)或者基本上是非碱性的(如在吲哚或吡咯氮的情况中)。通常，杂芳基(包括该环的任意氨基取代基)中存在的碱性氮原子的数目在5个以下。五元单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、呋咱、唑、二唑、三唑、异唑、噻唑、异噻唑、吡唑、三唑和四唑基团。六元单环杂芳基的实例包括但不限于吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶和三嗪。含有与另一个五元环稠合的五元环的二环杂芳基的具体实例包括但不限于咪唑并噻唑和咪唑并咪唑。含有与五元环稠合的六元环的二环杂芳基的具体实例包括但不限于苯并呋喃、苯并噻吩、苯并咪唑、苯并唑、异苯并唑、苯并异唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、异苯并呋喃、吲哚、异吲哚、异吲哚酮、吲嗪、二氢吲哚、异二氢吲哚、嘌呤(例如腺嘌呤、鸟嘌呤)、吲唑、吡唑并嘧啶、三唑并嘧啶、苯并二氧杂环戊烯和吡唑并吡啶基团。含有两个稠合的六元环的二环杂芳基的具体实例包括但不限于喹啉、异喹啉、苯并二氢吡喃、二氢苯并噻喃、色烯、异色烯、苯并二氢吡喃、异色满、苯并二烷、喹嗪、苯并嗪、苯并二嗪、吡啶并吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、萘啶和蝶啶基团。具体的杂芳基为源自噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、吡啶、喹啉、咪唑、唑和吡嗪的那些基团。

代表性的杂芳基的实例包括以下基团：

其中Y各自选自>C=O、NH、O和S。

本文使用的术语“杂环烷基”指包含一个或多个独立地选自O、N和S的杂原子和指定数目的环原子的单环或多环的稳定非芳族环结构。非芳族环结构可以具有4至10个环成员、特别是4至7个环成员。稠合的杂环系统可包含碳环，只需要包含一个杂环。杂环的实例包括但不限于吗啉、哌啶(例如1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基和4-哌啶基)、吡咯烷(例如1-吡咯烷基、2-吡咯烷基和3-吡咯烷基)、吡咯烷酮、吡喃、四氢呋喃、四氢噻吩、二烷、四氢吡喃(例如4-四氢吡喃基)、咪唑啉、咪唑烷酮、唑啉、噻唑啉、2-吡唑啉、吡唑烷、哌嗪和N-烷基哌嗪如N-甲基哌嗪。另外的实例包括硫吗啉及其S-氧化物和S,S-二氧化物(特别是硫吗啉)。另外的实例还包括氮杂环丁烷、哌啶酮、哌嗪酮和N-烷基哌啶如N-甲基哌啶。杂环烷基的具体实例在以下的说明性实例中显示：

其中W各自选自CH₂、NH、O和S；且Y各自选自NH、O、CO、SO₂和S。

“羟基”指基团-OH。

“取代”指其中一个或多个氢原子各自独立地被相同或不同取代基所代替的基团。

如本文使用的术语“被一个或多个……取代”指1至4个取代基。在一个实施方案中，其指1至3个取代基。在另一个实施方案中，其指1个或2个取代基。在又一个实施方案中，其指1个取代基。

“硫羟”指基团-SH。

“硫代烷氧基”指基团–SR²⁶，其中R²⁶是具有指定碳原子数的烷基、特别是C_1-8烷基。具体的硫代烷氧基是硫代甲氧基、硫代乙氧基、正硫代丙氧基、异硫代丙氧基、正硫代丁氧基、叔硫代丁氧基、仲硫代丁氧基、正硫代戊氧基、正硫代己氧基和1,2-二甲基硫代丁氧基。具体的硫代烷氧基是低级硫代烷氧基，即具有1至6个碳原子。另外的具体的烷氧基具有1和4个碳原子。

有机合成领域的普通技术人员将认可：在稳定的、化学上可行的杂环(无论是芳族还是非芳族)中的杂原子的最大数目取决于环的大小、不饱和度和杂原子的化合价。通常，杂环可以具有1至4个杂原子，只要杂芳族环是化学上可行的和稳定的即可。

“可药用”指联邦或州政府的管理机构或美国之外国家的相应机构已经批准的或可批准的，或者是对于用于动物、更特别是人而言在美国药典或其它普遍认可的药典中所列出的。

“可药用盐”指在药学上可接受的并且具有母体化合物的预期药理学活性的本发明的化合物的盐。特别地，这类盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。尤其是，这类盐包括：(1)与无机酸形成的酸加成盐，所述的无机酸例如有盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或者与有机酸形成的酸加成盐，所述的有机酸例如有乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或者(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子代替时形成的盐，所述的金属离子例如是碱金属离子、碱土金属离子或铝离子；或者与有机碱的配位物，所述的有机碱例如是乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等。盐还包括例如(仅仅是举例)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等的盐；当化合物含有碱性官能团时，形成无毒有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“可药用阳离子”表示酸性官能团的可接受的阳离子抗衡离子。这类阳离子例如有钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等。

“可药用介质”表示与本发明的化合物一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体。

“前药”表示具有可裂解的基团并且通过水解或在生理条件下变成在体内有药物活性的本发明的化合物的化合物，包括本发明的化合物的衍生物。这类实例包括但不限于胆碱酯衍生物等、N-烷基吗啉酯等。

“溶剂合物”表示与溶剂缔合、通常通过溶剂解反应与溶剂缔合的化合物形式。这种物理缔合包括氢键。常规的溶剂包括水、乙醇、乙酸等。本发明的化合物可以制备成例如结晶形式并且可以溶剂化或水化。适宜的溶剂合物包括可药用溶剂合物如水合物，并且还包括化学计量的溶剂合物和非化学计量的溶剂合物。在某些情况中，溶剂合物能够分离，例如当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”包括溶液相和可分离的溶剂合物。代表性的溶剂合物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。

“个体”包括人。术语“人”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用。

“治疗有效量”指当施用于个体用于治疗疾病时化合物的量足以进行对疾病的这类治疗。“治疗有效量”可根据化合物、疾病及其严重性以及所治疗个体的年龄、体重等变化。

“防止”或“预防”表示降低获得或发展成疾病或病症的风险，即，使疾病的至少一种临床症状不在个体中发展，所述的个体可能暴露于致病因素或在疾病发作前易患该疾病。

术语“预防”涉及“防止”，表示目的在于防止而非治疗或治愈疾病的措施或方法。预防措施的非限制性实例包括施用疫苗；给由于不运动而存在血栓形成风险的住院患者施用低分子量肝素；以及在前往疟疾流行或感染疟疾风险很高的地理区域前施用抗疟疾药如氯奎。

在一个实施方案中，任意疾病或障碍的“治疗”表示改善疾病或障碍(即，阻止疾病或减轻其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，“治疗”表示改善至少一种身体指标，该指标可能不是个体可察觉的。在另一个实施方案中，“治疗”表示从身体上(例如稳定可察觉的症状)、生理上(例如稳定身体指标)或从这两者上调节疾病或障碍。在另一个实施方案中，“治疗”表示减缓疾病的进程。

本文中使用的术语“过敏”表示这样一组病症：其特征在于免疫系统的过敏性紊乱，包括过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、窦炎、湿疹和荨麻疹以及食物过敏或对昆虫毒液过敏。

本文所用的术语“炎性病症”表示包括如下的一组病症：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型特发性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、炎性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、内毒素驱动的疾病状态(例如心脏搭桥手术后的并发症或导致例如慢性心力衰竭的慢性内毒素状态)以及涉及软骨的相关疾病如关节疾病。该术语特别表示类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。

本文所用的术语“自身免疫性疾病”表示包括如下的一组疾病：阻塞性气道疾病，包括病症如COPD、哮喘(例如内源性哮喘、外源性哮喘、粉尘性哮喘、婴幼儿哮喘)、特别是慢性或绵延难治的哮喘(例如晚期哮喘和气道高反应性)、支气管炎(包括支气管哮喘)、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、多发性硬化、银屑病、干眼病、I型糖尿病及其相关的并发症、特应性湿疹(特应性皮炎)、接触性皮炎以及还有湿疹性皮炎、炎性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎、动脉粥样硬化和肌萎缩性侧索硬化症。该术语特别表示COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。

本文所用的术语“增殖性疾病”表示诸如癌症(例如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、骨髓增殖性障碍(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多和骨髓纤维化)、白血病(例如急性髓性白血病、急性和慢性原始淋巴细胞白血病)、多发性骨髓瘤、银屑病、再狭窄、硬皮病或纤维化的病症。该术语特别表示癌症、白血病、多发性骨髓瘤和银屑病。

本文所用的术语“癌症”表示皮肤或机体器官中细胞的恶性或良性生长，所述的器官例如是但不限于乳房、前列腺、肺、肾、胰、胃或肠。癌症易于侵入相邻的组织和扩散(转移)到较远的器官如骨、肝、肺或脑。本文所用的术语癌症包括转移肿瘤细胞类型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤)和组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胶质母细胞瘤、原发性肝癌、卵巢癌、前列腺癌和子宫平滑肌肉瘤)。

本文所用的术语“白血病”表示血液和造血器官的肿瘤疾病。这类疾病可以导致骨髓和免疫系统功能障碍，这使得宿主极易受感染和出血。术语白血病特别表示急性髓性白血病(AML)和急性原始淋巴细胞白血病(ALL)和慢性原始淋巴细胞白血病(CLL)。

本文所用的术语“移植排斥”表示例如胰岛、干细胞、骨髓、皮肤、肌肉、角膜组织、神经元组织、心脏、肺、心肺联合、肾、肝、肠、胰、气管或食道的细胞、组织或实体器官的同种异体移植物或异种移植物的急性或慢性排斥，或者移植物抗宿主病。

本文所用的术语“涉及软骨更新受损的疾病”包括诸如以下的病症：骨关节炎、银屑病关节炎、幼年类风湿性关节炎、痛风性关节炎、脓毒性或感染性关节炎、反应性关节炎、反射交感性营养不良、痛性营养不良、蒂策综合征或肋软骨炎、纤维肌痛、骨软骨炎、神经源性或神经病性关节炎、关节病、关节炎的地方性形式如地方性变形性骨关节炎、Mseleni病和Handigodu病、纤维肌痛引起的变性、系统性红斑狼疮、硬皮病和强直性脊柱炎。

本文所用的术语“先天软骨畸形”包括诸如以下的病症：遗传性软骨溶解、软骨发育不良和假性软骨发育不良，特别是但不限于小耳畸形、无耳畸形、干骺端软骨发育不良和相关病症。

本文所用的术语“与IL6分泌过多相关的疾病”包括诸如以下的病症：Castleman病、多发性骨髓瘤、银屑病、卡波西肉瘤和/或系膜增殖性肾小球肾炎。

本文所用的术语“与干扰素分泌过多相关的疾病”包括诸如以下的病症：系统性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合征、银屑病、类风湿性关节炎。

“本发明的化合物”和等同表述意欲包括文中所述结构式的化合物，该表述包括可药用盐和溶剂合物如水合物以及可药用盐的溶剂合物，只要上下文中允许。类似地，称谓中间体(无论它们本身是否被要求保护)意欲包括它们的盐和溶剂合物，只要上下文中允许。

当本文提及范围时，例如但不限于C_1-8烷基，范围的引用应当被视为所述范围的每个成员的表示。

本发明的化合物的其它衍生物的酸和酸衍生形式具有活性，但是酸敏感形式通常可以在哺乳动物生物体内提供溶解性、组织相容性或延缓释放方面的优点(参见Bundgard,H.,DesignofProdrugs,第7-9、21-24页,Elsevier,Amsterdam1985)。前药包括本领域从业者熟知的酸衍生物，例如通过母体酸与适宜的醇反应制备的酯，或者通过母体酸化合物与取代或未取代的胺反应制备的酰胺，或者酸酐，或者混合的酸酐。由本发明的化合物上的酸性基团衍生的简单的脂族或芳族酯、酰胺和酸酐是特别有用的前药。在某些情况中，需要制备双酯型前药，例如(酰基氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。具体的这类前药有本发明的化合物的C₁-C₈烷基、C₂-C₈链烯基、芳基、C₇-C₁₂取代的芳基和C₇-C₁₂芳基烷基酯。

本文所用的术语“同位素变体”表示在构成该化合物的一个或多个原子上包含非天然比例的同位素的化合物。例如，化合物的“同位素变体”可以含有一个或多个非放射性同位素，例如氘(²H或D)、碳-13(¹³C)、氮-15(¹⁵N)等。应当理解，在其中进行这类同位素取代的化合物中，以下原子(当存在时)可以变化，以便例如任意氢可以是²H/D，任意碳可以是¹³C，或任意氮可以是¹⁵N，并且这类原子的存在和位置可以在本领域的技术内决定。同样，本发明可以包括用放射性同位素制备同位素变体，例如在其中所得化合物可用于药物和/或底物组织分布研究的情况中。考虑到易于掺入和易于检测，放射性同位素氚、即³H和碳-14、即¹⁴C特别适用于该目的。而且，化合物可以制备成被正电子发射同位素如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N所取代，可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检测底物受体占用。

本文提供的化合物的所有同位素变体(无论是放射性的还是非放射性的)意欲包括在本发明的范围内。

还应当理解，具有相同分子式、但是它们的原子键合性质或顺序或它们的原子空间排列不同的化合物称为“异构体”。它们的原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。

彼此不呈镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，那些彼此是不重叠的镜像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心、例如其键合4个不同基团时，一对对映异构体是可能的。对映异构体可以通过其不对称中心的绝对构型来表征，并且通过Cahn和Prelog的R-和S-顺序规则来描述，或者通过其中分子旋转偏振光平面的方式来描述并命名为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以以单独对映异构体或其混合物存在。含有等比例的对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。

“互变异构体”表示是特定化合物结构的可互换形式并且氢原子和电子位移变化的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的移动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们通过用酸或碱处理而快速互变。互变异构现象的另一个实例是苯基硝基甲烷的酸式和硝基式，这同样是通过用酸或碱处理而形成的。

互变异构形式可能与获得感兴趣的化合物的最佳的化学反应性和生物学活性相关。

本发明的化合物可具有一个或多个不对称中心；因此这类化合物可以作为单独的(R)-或(S)-立体异构体或其混合物而制得。

说明书和权利要求书中特定化合物的描述或命名旨在包括单独对映异构体及其混合物、外消旋物等，另外说明除外。测定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域熟知的。

化合物

本发明基于如下鉴别：本发明的化合物是JAK抑制剂，其可以用于治疗炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。本发明还提供了制备本发明的化合物的方法、包含本发明的化合物的药物组合物以及通过施用本发明的化合物来治疗炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的方法。在特定的实施方案中，本发明的化合物是JAK1和/或JAK2抑制剂。

其中

Cy1是C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

Y不存在或是C_1-4亚烷基(任选被一个或多个卤素或CN取代)；

R³选自-OR^3b、-NHR^3b、-C(=O)R^3b、-C(=O)NHR^3b和-SO₂NHR^3b；

R^3a各自独立地选自H、OH、卤素、CN、氧代基、C_1-4烷基(任选被一个或多个独立地选自卤素、C_1-4烷氧基或CN的基团取代)、C_1-4烷氧基(任选被一个或多个卤素或C_1-4烷氧基取代)、氨基(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、-C(=O)NH₂(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、C_1-4硫代烷氧基、4-7元杂环烷基、-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶；

R⁴是H、卤素、CN或C_1-4烷基；

R⁵是H或C_1-4烷基；

R⁶是H或C_1-4烷基；且

下标m是0、1或2。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中m是1。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中m是1，且其中R²是OH、CN、卤素、任选被一个或多个独立地选自卤素的基团取代的C_1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C_1-6烷氧基。在一个特定的实施方案中，R²是Me、Et、-OMe、-OEt、-CF₃、F、Cl、Br、OH或-CN。在一个更特定的实施方案中，R²是F、Cl或Br。在一个最特定的实施方案中，R²是F。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中m是0。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R⁴是Me、Et、F、Cl或Br。在另一个实施方案中，R⁴是H。在一个更特定的实施方案中，R⁴是F、Cl或Br。在一个最特定的实施方案中，R⁴是F。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R¹是Me。在另一个实施方案中，R¹是环丙基。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中Cy1是C_6-10芳基。在一个特定的实施方案中，Cy1是苯基。在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中Cy1是5-10元杂芳基。在一个特定的实施方案中，Cy1是6或9元杂芳基，其选自吡啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、唑基、噻唑基、呋喃基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并二烷基、苯并唑基、喹啉基和异喹啉基。在另一个特定的实施方案中，Cy1是吲哚基或吡啶基。在另一个特定的实施方案中，Cy1是吡啶基、尤其是2-吡啶基。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中L不存在或是-O-、-C(O)-或-CON(R⁵)-。在一个特定的实施方案中，L不存在。在另一个特定的实施方案中，L是–O-、-C(O)-或-CON(R⁵)-。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中Y不存在。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中Y是C_1-4亚烷基。在一个特定的实施方案中，Y是未被取代的C_1-4亚烷基。在另一个特定的实施方案中，Y是-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH(CH₃)-或-C(CH₃)₂-。在另一个更特定的实施方案中，Y是-CH₂-。

在一个实施方案中，R³是–OR^3b，其中R^3b如上文所述。在一个特定的实施方案中，R^3b是C_1-6烷基或苯基。在一个更特定的实施方案中，R^3b是Me或苯基。

在另一个实施方案中，R³是-C(=O)R^3b，其中R^3b如上文所述。在一个特定的实施方案中，R^3b是4-7元杂环烷基(任选被一个或多个独立地选自卤素和C_1-4烷基的基团取代)。在一个更特定的实施方案中，R^3b是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，其被一个或多个独立地选自卤素和C_1-4烷基的基团取代。在另一个更特定的实施方案中，R^3b是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基。在一个最特定的实施方案中，R^3b是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，其被一个或多个独立地选自F、Cl、Me和Et的基团取代。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是H、OH、卤素或CN。在一个特定的实施方案中，R³是H、OH、F或CN。在一个更特定的实施方案中，R³是H。在另一个更特定的实施方案中，R³是OH或CN。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的C_6-10芳基。在一个特定的实施方案中，R³是被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的苯基。在另一个特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的C_6-10芳基。在一个更特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的苯基。在另一个更特定的实施方案中，R³是被一个选自OH、卤素、CN、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基的R^3a基团取代的苯基。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是C_6-10芳基。在一个特定的实施方案中，R³是苯基。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的C_3-7环烷基。在一个特定的实施方案中，R³是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其被一个或多个独立选择的R^3a基团取代。在另一个特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的C_3-7环烷基。在一个更特定的实施方案中，R³是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其被一个R^3a基团取代。在另一个更特定的实施方案中，R³是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自H、OH、卤素、CN、氧代基、C_1-4烷基(任选被一个或多个卤素、C_1-4烷氧基或CN取代)、C_1-4烷氧基(任选被一个或多个卤素或C_1-4烷氧基取代)、氨基(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、-C(=O)NH₂(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、C_1-4硫代烷氧基和4-7元杂环烷基。在最特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自H、OH、F、Cl、CN、氧代基、Me、Et、-CF₃、-OMe、-OEt、-OCF₃、-NH₂、-NHMe、-NHcPr、-NMe₂、-C(=O)NH₂、-C(=O)NHMe、-C(=O)NMe₂和–SMe。在进一步的更特定的实施方案中，R³是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶，其中R⁶是H、Me、Et、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基。在最特定的实施方案中，R³是环丙基、环丁基、环戊基或环己基，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶，其中R⁶是Me。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的4-7元杂环烷基。在一个特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个或多个独立选择的R^3a基团取代。在另一个特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的4-7元杂环烷基。在一个更特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个R^3a基团取代。在另一个更特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自H、OH、卤素、CN、氧代基、C_1-4烷基(任选被一个或多个卤素、C_1-4烷氧基或CN取代)、C_1-4烷氧基(任选被一个或多个独立地选自卤素或C_1-4烷氧基的基团取代)、氨基(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、-C(=O)NH₂(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、C_1-4硫代烷氧基和4-7元杂环烷基。在最特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自H、OH、F、Cl、CN、氧代基、Me、Et、-CF₃、-OMe、-OEt、-OCF₃、-NH₂、-NHMe、-NHcPr、-NMe₂、-C(=O)NH₂、-C(=O)NHMe、-C(=O)NMe₂和–SMe。在进一步更特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶，其中R⁶是H、Me、Et、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基。在最特定的实施方案中，R³是氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、唑烷、吗啉或4-二氧代硫吗啉，其被一个R^3a基团取代，所述R^3a基团选自-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶，其中R⁶是Me。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的5-10元杂芳基。在一个特定的实施方案中，R³是被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的吡啶基。在另一个特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的C_6-10芳基。在一个更特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的吡啶基。在另一个更特定的实施方案中，R³是被一个R^3a基团取代的吡啶基，所述R^3a基团选自OH、卤素、CN、C_1-4烷基和C_1-4烷氧基。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中R³是C_6-10芳基。在一个特定的实施方案中，R³是吡啶基。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I化合物，其中所述化合物是式IIa或IIb化合物:

其中R³、R⁴、L和Y如以上实施方案中的任意一个中所述，且X是CH、CF或N。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式IIa或IIb化合物，其中R⁴是H或卤素。在一个特定的实施方案中，R⁴是H、F或Cl。在一个更特定的实施方案中，R⁴是H。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式IIa或IIb化合物，其中L不存在或是-O-、-C(O)-或-CON(R⁵)-，其中R⁵如上文所述。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式IIa或IIb化合物，其中Y不存在或是C_1-4亚烷基(任选被卤素或CN取代)。在一个特定的实施方案中，Y不存在或是C_1-4亚烷基。在一个更特定的实施方案中，Y不存在或是-CH₂-、-CH(Me)-或-CH₂-CH₂-。在进一步更特定的实施方案中，Y不存在或是-CH₂-。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIb化合物，其中所述化合物是式IIIa、IIb、IIIc、IIId、IIIe、IIIf、IIIg、IIIh、IIIi或IIIj化合物:

其中X和R³如以上实施方案中的任意一个中所述。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式IIIc、IIId、IIIi或IIIf化合物，其中R³选自:

其中R^3a如以上实施方案中的任意一个中所述。在一个特定的实施方案中，R^3a是H、卤素、C_1-4烷基、-S(O)₂Me或-C(=O)OMe。在一个更特定的实施方案中，R^3a是H、F、Me、-S(O)₂Me或-C(=O)OMe。在一个最特定的实施方案中，R^3a是-S(O)₂Me。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式IIIe、IIIf、IIIg或IIIh化合物，其中R³是:

其中R^3a如上文所述。在一个特定的实施方案中，R^3a是H、CN或卤素。在一个更特定的实施方案中，R^3a是H、CN、F或Cl。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIIh化合物，其中X是CH。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIIh化合物，其中X是CF。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIIh化合物，其中X是N。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIIh化合物，且选自:

N-(4-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(4-(苄基氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(1-苄基-1H-吲哚-5-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(1H-吲哚-5-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)-N-苯乙基苯甲酰胺,

4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)-N-(2-苯氧基乙基)苯甲酰胺,

N-(4-(4-(吡啶-3-基甲氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(4-((6-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺,

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-3-氟-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺,

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-3-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺,

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-3-氯-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺,

环丙烷甲酸{4-[4-(哌啶-1-羰基)-苯基]-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺,

N-(4-(4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(3-氯-4-(4-(哌啶-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(3-氯-4-(4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(3-氯-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

4-(乙酰氨基吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苄基)哌嗪-1-甲酸甲酯,

N-(4-(6-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(5-氟-6-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-3-氟-苯基]-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-乙酰胺,

N-(4-(3-氟-4-((4-(2,2,2-三氟乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(6-(2-(1H-吡唑-1-基)乙基1H-吡唑-1-基)乙氧基)-5-氟吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(4,4-二甲基唑烷-3-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(氮杂环丁烷-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(2-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(2-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(2-氧代-2-(哌啶-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(2-吗啉代基-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(2-((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉代基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(2-(4,4-二甲基唑烷-3-基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(哌啶-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(吗啉-4-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺,

(R)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺,

(S)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺，和

N-(4-(4-(2-氧杂-5-氮杂螺[3.5]壬-5-基甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

在一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIIh化合物，且是N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺。

在另一个实施方案中，本发明的化合物是式I-IIIh化合物，且不是N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺。

在一个实施方案中，本发明的化合物不是同位素变体。

在一个方面，根据本文描述的实施方案中的任意一个的本发明的化合物作为游离碱存在。

在一个方面，根据本文描述的实施方案中的任意一个的本发明的化合物是可药用盐。

在一个方面，根据本文描述的实施方案中的任意一个的本发明的化合物是所述化合物的溶剂合物。

在一个方面，根据本文描述的实施方案中的任意一个的本发明的化合物是化合物的可药用盐的溶剂合物。

虽然每个实施方案的具体基团通常已分别在上文列出，但是本发明的化合物包括以下方案，其中上文的式以及本文出现的其它式中的若干或每个实施方案选自对于每个变量而言分别指明的特定的成员或基团中的一个或多个。因此，本发明旨在包括其范围内的所述实施方案的所有组合。

虽然每个实施方案的具体基团通常已分别在上文列出，但是本发明的化合物可以是以下化合物，其一个或多个变量(例如，R基团)选自上文列出的任意式的一个或多个实施方案。因此，本发明旨在包括其范围内的任意所公开的实施方案中的变量的所有组合。

或者，本发明还涉及从基团或实施方案或者它们的组合中排除一个或多个所述的具体变量。

在某些方面，本发明提供了上式化合物的前药和衍生物。前药是本发明的化合物的衍生物，其具有可代谢裂解的基团并且通过溶剂解或在生理条件下变成在体内有药物活性的本发明的化合物。这类实例包括但不限于胆碱酯衍生物等、N-烷基吗啉酯等。

本发明的化合物的其它衍生物的酸和酸衍生形式具有活性，但是酸敏感形式通常可以在哺乳动物生物体内提供溶解性、组织相容性或延缓释放方面的优点(参见Bundgard,H.,DesignofProdrugs,第7-9、21-24页,Elsevier,Amsterdam1985)。前药包括本领域从业者熟知的酸衍生物，例如通过母体酸与适宜的醇反应制备的酯，或者通过母体酸化合物与取代或未取代的胺反应制备的酰胺，或者酸酐，或者混合的酸酐。由本发明的化合物上的酸性基团衍生的简单的脂族或芳族酯、酰胺和酸酐是优选的前药。在某些情况中，需要制备双酯型前药，例如(酰基氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。具特别有用的是本发明的化合物的C₁-C₈烷基、C₂-C₈链烯基、芳基、C₇-C₁₂取代的芳基和C₇-C₁₂芳基烷基酯。

本发明的化合物是JAK的新抑制剂。特别地，所述化合物是JAK1和/或JAK2的强效抑制剂，然而它们可以以较低效力抑制TYK2和JAK3。

条款

1.式I化合物:

其中

Cy1是C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

R²各自独立地选自卤素、CN、OH、C_1-6烷基(任选被一个或多个选自卤素、CN、OH和C_1-4烷氧基的基团取代)和C_1-6烷氧基(任选被一个或多个选自卤素、CN、OH和C_1-4烷氧基的基团取代)；

L不存在或选自-O-、-C(O)-、-N(R⁵)-、-CON(R⁵)-、-SO₂N(R⁵)-、-S(O)₂-、-N(R⁵)CO-和-N(R⁵)SO₂；

Y不存在或是C_1-4亚烷基(任选被一个或多个卤素或CN取代)；

R³选自-OR^3b、-NHR^3b、-C(=O)R^3b、-C(=O)NHR^3b和-SO₂NHR^3b；

R^3a各自独立地选自OH、卤素、CN、氧代基、C_1-4烷基(任选被一个或多个卤素、C_1-4烷氧基或CN取代)、C_1-4烷氧基(任选被一个或多个卤素或C_1-4烷氧基取代)、氨基(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、-C(=O)NH₂(任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代)、C_1-4硫代烷氧基、4-7元杂环烷基、-S(O)R⁶、-S(O)₂R⁶、-C(=O)R⁶、-C(=O)OR⁶和-NHC(=O)R⁶；

R^3b独立地选自C_1-6烷基、苯基(任选被一个或多个卤素或C_1-4烷基取代)、C_3-7环烷基和4-7元杂环烷基(任选被一个或多个卤素或C_1-4烷基取代)；

R⁴是H、卤素、CN或C_1-4烷基；

R⁵是H或C_1-4烷基；

R⁶是H或C_1-4烷基；且

下标m是0、1或2；

或可药用盐或溶剂合物或可药用盐的溶剂合物。

2.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中m是1。

3.根据条款2的化合物或其可药用盐，其中R²是OH、CN、卤素、任选被一个或多个卤素取代的C_1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C_1-6烷氧基。

4.根据条款3的化合物或其可药用盐，其中R²是Me、Et、-OMe、-OEt、-CF₃、F、Cl、Br、OH或-CN。

5.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中m是0。

6.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中R⁴是Me、Et、F、Cl或Br。

7.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中R⁴是H。

8.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中R¹是Me。

9.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中R¹是环丙基。

10.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中Cy1是苯基。

11.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中Cy1是吡啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、唑基、噻唑基、呋喃基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并二烷基、苯并唑基、喹啉基或异喹啉基。

12.根据条款11的化合物或其可药用盐，其中Cy1是吡啶基。

13.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中L不存在或是-O-、-C(O)-或-CON(R⁵)-。

14.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIa或IIb化合物:

其中R³、R⁴、L和Y如条款1中所述，且X是CH、CF或N。

15.根据条款14的化合物或其可药用盐，其中R⁴是H或卤素。

16.根据条款15的化合物或其可药用盐，其中R⁴是H、F或Cl。

17.根据条款15的化合物或其可药用盐，其中R⁴是H。

18.根据条款14的化合物或其可药用盐，其中L不存在或是-O-、-C(O)-或-CON(R⁵)-，其中R⁵如条款1中所述。

19.根据条款14的化合物或其可药用盐，其中Y不存在或是C_1-4亚烷基。

20.根据条款19的化合物或其可药用盐，其中Y是单键、-CH₂-、-CH(Me)-或-CH₂-CH₂-。

21.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIIa-IIIj化合物:

其中X和R³如条款1中所述。

22.根据条款21的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIIc、IIId、IIIi或IIIf化合物，且R³选自:

其中R^3a如条款1中所述。

23.根据条款22的化合物或其可药用盐，其中R^3a是H、卤素、C_1-4烷基、-S(O)₂Me或-C(=O)OMe。

24.根据条款23的化合物或其可药用盐，其中R^3a是H、F、Me、-S(O)₂Me或-C(=O)OMe。

25.根据条款21的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是根据式IIIe-IIIh中任意一个的化合物，其中R³是:

其中R^3a如条款1中所述。

26.根据条款25的化合物或其可药用盐，其中R^3a是H、CN或卤素。

27.根据条款1-26任一项的化合物或其可药用盐，其中X是CF。

28.根据条款1-26任一项的化合物或其可药用盐，其中X是CH。

29.根据条款1-26任一项的化合物或其可药用盐，其中X是N。

30.根据条款1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺。

31.药物组合物，其包含可药用载体及药用有效量的条款1-30任一项的化合物或其可药用盐。

32.根据条款31的的药物组合物，其包含另外的治疗剂。

33.用于医药的条款1-30任一项的化合物或其可药用盐或者条款31或32的药物组合物。

34.条款1-30任一项的化合物或其可药用盐或者条款31或32的药物组合物在制备药物中的应用。

35.根据条款1-30任一项的化合物或其可药用盐或者根据条款31或32的药物组合物，其用于治疗或预防过敏、炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

36.条款1-30任一项的化合物或其可药用盐或者条款31或32的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防过敏、炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

37.治疗或预防过敏、炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的方法，其包括施用足以实现所述治疗或预防的量的条款1-30任一项的化合物或其可药用盐或者条款31或32的药物组合物。

38.根据条款37的方法，其中将条款1-30的化合物或其可药用盐或者条款31或32的药物组合物与另外的治疗剂组合施用。

39.根据权利要求32的药物组合物或根据权利要求38的方法，其中另外的治疗剂是用于治疗或预防过敏、炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病的物质。

40.根据条款35的用于应用的化合物，其中所述自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。

41.根据条款36的应用，其中所述自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。

42.根据条款37的方法，其中所述自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。

43.根据条款39的药物组合物，其中所述自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。

44.根据条款35的用于应用的化合物，其中所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘和炎性肠病。

45.根据条款36的应用，其中所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘和炎性肠病。

46.根据条款37的方法，其中所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘和炎性肠病。

47.根据条款39的药物组合物，其中所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘和炎性肠病。

药物组合物

当作为药物应用时，本发明的化合物通常以药物组合物的形式施用。这类组合物可以以制药领域众所周知的方法制备，并且包含至少一种活性化合物。通常，本发明的化合物以药用有效量施用。实际上所施用的化合物的量通常由医师根据相关情况而定，所述的相关情况包括所治疗的病症、所选的施用途径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度等。

本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括口服、直肠、经皮、皮下、关节内、静脉内、肌内和鼻内。根据预期的递送途径，优选将本发明的化合物配制成可注射组合物或口服组合物或者所有用于经皮施用的软膏、洗剂或贴剂。

口服施用的组合物可以采用大量液体溶液剂或混悬剂或大量散剂的形式。但是，更常见的是，组合物是以单位剂型存在的以便于准确给药。术语“单位剂型”表示物理上分离的单位，适宜作为人个体和其它哺乳动物的单位给药，每个单位含有预定量的活性物质(经计算能产生所需的治疗效果)以及适宜的药物赋形剂、介质或载体。典型的单位剂型包括预填充的、预测定的液体组合物的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况中包括丸剂、片剂、胶囊剂等。在这类组合物中，本发明的化合物通常是较少的组分(约0.1重量%至约50重量%，优选约1重量%至约40重量%)，剩余部分是各种介质或载体和加工助剂以有助于形成所需的给药形式。

适用于口服施用的液体形式可以包括含有缓冲剂、助悬剂和分散剂、着色剂、矫味剂等的适宜的水性或非水性介质。固体形式可以包括例如任意以下成分或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂。

可注射组合物通常是基于可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域已知的其它可注射载体。如上所述，该组合物中活性化合物通常是较少的组分，通常为约0.05重量%至10重量%，剩余部分是可注射载体等。

经皮组合物通常配制成含有活性成分的局部软膏剂或乳膏剂，活性成分的量的范围通常为约0.01%至约20%重量、优选约0.1%至约20%重量、优选约0.1至约10%重量、更优选约0.5至约15%重量。当配制为软膏剂时，活性成分通常与石蜡或水可混溶的软膏基质混合。或者，活性成分可以与例如水包油型乳膏基质一起配制在乳膏剂中。这类经皮制剂是本领域众所周知的并且通常包含其它成分以增强活性成分或制剂的表皮穿透稳定性。所有这类已知的经皮制剂和成分包括在本发明的范围内。

本发明的化合物还可以通过经皮装置施用。因此，经皮施用可以应用储库或多孔膜类型或固体基质变体的贴剂来实现。

口服可施用、可注射或局部可施用的组合物的上述组分仅是代表性的。其它物质和处理技术等在Remington’sPharmaceuticalSciences，第17版，1985，MackPublishingCompany，伊斯顿，宾夕法尼亚州的第8部分中有描述，将其引入本文作为参考。

本发明的化合物还可以以缓释形式或从缓释药物递送系统中施用。代表性的缓释物质的描述参见Remington’sPharmaceuticalSciences。

以下制剂实施例说明了可以根据本发明制备的代表性的药物组合物。但是本发明不限制于以下药物组合物。

制剂1-片剂

可以将本发明的化合物作为干粉与干明胶粘合剂以约1:2重量比混合。加入少量硬脂酸镁作为润滑剂。在压片机中将混合物制成240-270mg片剂(每片含有80-90mg的活性酰胺化合物)。

制剂2-胶囊剂

可以将本发明的化合物作为干粉与淀粉稀释剂以约1:1重量比混合。将混合物填充入250mg胶囊中(每个胶囊含有125mg的活性酰胺化合物)。

制剂3-液体

可以将本发明的化合物(125mg)与蔗糖(1.75g)和黄原胶(4mg)混合，并且可以将产生的混合物混合，通过10号目数的U.S.筛，然后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠(11:89，50mg)的水溶液混合。将苯甲酸钠(10mg)、矫味剂和着色剂用水稀释并且在搅拌下加入。然后可以在搅拌下加入足量的水。然后加入足量的水以制成总体积为5mL。

制剂4-片剂

可以将本发明的化合物作为干粉与干明胶粘合剂以约1:2重量比混合。加入少量硬脂酸镁作为润滑剂。在压片机中将混合物制成450-900mg片剂(150-300mg的活性酰胺化合物)。

制剂5-注射剂

可以将本发明的化合物溶于或混悬于缓冲的无菌盐水可注射水性介质中至浓度为约5mg/mL。

制剂6-局部

将硬脂醇(250g)和白凡士林(250g)在约75℃下熔化，然后可以加入溶于水(约370g)中的本发明的化合物(50g)、对羟基苯甲酸甲酯(0.25g)、对羟基苯甲酸丙酯(0.15g)、十二烷基硫酸钠(10g)和丙二醇(120g)的混合物，并且将产生的混合物搅拌直至凝结。

治疗方法

本发明的化合物可用作在哺乳动物中治疗或预防病症的治疗剂，所述病症例如是炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。特别是，所述病症与JAK的异常活性相关，更特别是，所述病症与JAK1和/或JAK2的异常活性相关。

在一个方面，本发明的化合物和本发明的药物组合物可用作治疗剂用于治疗和/或预防哺乳动物、包括人的炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

一方面，本发明提供了本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物以用作药物。

在治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染过敏反应的哺乳动物的方法。在具体的实施方案中，本发明提供了治疗或预防过敏性气道疾病、窦炎、湿疹和/或荨麻疹、食物过敏或对昆虫毒液过敏的方法。

另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防过敏反应的本发明的化合物。在具体的实施方案中，本发明提供了治疗或预防过敏性气道疾病、窦炎、湿疹和/或荨麻疹、食物过敏或对昆虫毒液过敏的方法。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染炎性疾病的哺乳动物的方法。所述方法包括施用有效量的一种或多种本文中所述的本发明的药物组合物或本发明的化合物用于治疗或预防炎性疾病。在一个具体的实施方案中，炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道反应(例如哮喘)和炎性肠病。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防炎性疾病的本发明的化合物。在特定的实施方案中，炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染自身免疫性疾病的哺乳动物的方法。该方法包括施用有效量的一种或多种本文描述的本发明的药物组合物或化合物用于治疗或预防自身免疫性疾病。在具体的实施方案中，自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防自身免疫性疾病的本发明的化合物。在特定的实施方案中，自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。在一个更具体的实施方案中，自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮。

在进一步的治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染增殖性疾病、特别是癌症(例如实体瘤如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病的哺乳动物的方法。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防增殖性疾病、特别是癌症(例如实体瘤如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病的本发明的化合物。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染移植排斥的哺乳动物的方法。在特定的实施方案中，本发明提供了治疗或预防器官移植排斥的方法。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防移植排斥的本发明的化合物。在特定的实施方案中，本发明提供了治疗或预防器官移植排斥的方法。

在治疗方法方面，本发明提供了在易感或感染涉及软骨更新受损的疾病的哺乳动物中治疗或预防的方法，该方法包括施用治疗有效量的本文描述的本发明的化合物或一种或多种本发明的药物组合物。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防涉及软骨更新受损的疾病的本发明的化合物。

本发明还提供了治疗或预防先天软骨畸形的方法，该方法包括施用有效量的本文描述的一种或多种本发明的药物组合物或化合物。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防先天软骨畸形的本发明的化合物。

在进一步的治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染与IL6分泌过多相关的疾病、特别是Castleman病或系膜增殖性肾小球肾炎的哺乳动物的方法。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防与IL6分泌过多相关的疾病、特别是Castleman病或系膜增殖性肾小球肾炎的本发明的化合物。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗或预防易感或感染与干扰素分泌过多相关的疾病、特别是系统性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合症、银屑病、类风湿性关节炎的哺乳动物的方法。

在本发明的另外方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与干扰素分泌过多相关的疾病、特别是系统性和皮肤型红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肌炎、舍格伦综合症、银屑病、类风湿性关节炎的本发明的化合物。

作为本发明进一步的方面，提供了用作药物、特别是用于治疗和/或预防上述病症和疾病的药物的本发明的化合物。本文还提供了本发明的化合物在制备用于治疗或预防上述病症和疾病之一的药物中的用途。

本方法的一个特定的方案包括给患有涉及炎症(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病)的疾病的个体施用有效量的本发明的化合物达足以降低患者的炎症水平和优选终止负责所述炎症的进程的时间段。该方法的特别实施方案包括给患有或易感发生类风湿性关节炎的个体患者施用有效量的本发明的化合物达足以分别降低或防止所述患者的关节炎症和优选终止负责所述炎症的进程的时间段。

本方法的另一个特别方案包括给患有以软骨或关节退化为特征的疾病病症(例如类风湿性关节炎和/或骨关节炎)的个体施用有效量的本发明的化合物达足以降低和优选终止负责所述退化的自身延续进程的时间段。该方法的特定的实施方案包括给患有或易感发生骨关节炎的个体患者施用有效量的本发明的化合物达足以分别降低或防止所述患者的关节中软骨退化和优选终止负责所述退化的自身延续进程的时间段。在特定的实施方案中，所述化合物可表现出软骨合成代谢和/或抗分解代谢性质。

注射剂量水平范围为约0.1mg/kg/小时至至少10mg/kg/小时，全程约1至约120小时，特别是24至96小时。还可以施用约0.1mg/kg至约10mg/kg或更多的预装推注剂，以获得足够的稳态水平。对于40至80kg人患者而言预计最大总剂量不超过约2g/天。

对于预防和/或治疗长期病症如变性病症，治疗方案通常延续数月或数年，因此为了患者的方便和耐受而优选口服给药。对于口服给药，代表性的方案是每天1至5个、特别是2至4个、通常是3个口服剂量。采用这些给药方式，每个剂量提供约0.01至约20mg/kg的本发明的化合物，对于特定的剂量，每个提供约0.1至约10mg/kg、特别是约1至约5mg/kg。

通常选择经皮给药以提供与用注射给药所获得的血液水平类似或比它更低的血液水平。

当用于预防病症的发作时，通常在医师的告知和监督下将本发明的化合物以上述剂量水平施用于处于发生病症风险的患者。处于发生特定病症风险的患者通常包括有病症家族史的那些或者通过基因测定或筛选确定为特别易感发生病症的那些。

本发明的化合物可以作为单独的活性剂施用，或者其可以与其它治疗剂、包括具有相同或相似治疗活性并且对于这类组合施用确定为安全有效的其它化合物组合施用。在特定的实施方案中，两种(或更多种)活性剂的共同施用使得可以显著降低所用的每种活性剂的剂量，从而降低所见的副作用。

在一个实施方案中，本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物作为药物施用。在具体的实施方案中，所述药物组合物还包含另外的活性成分。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防涉及炎症的疾病；具体的治疗剂包括但不限于免疫调节剂，例如硫唑嘌呤、皮质类固醇(例如泼尼松龙或地塞米松)、环磷酰胺、环孢素A、他克莫司、麦考酚酸吗乙酯、莫罗单抗-CD3(OKT3，例如)、ATG、阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生和吡罗昔康。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防关节炎(例如类风湿性关节炎)；具体的治疗剂包括但不限于镇痛药、非甾体抗炎药(NSAIDS)、类固醇、合成的DMARDS(例如但不限于甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、金诺芬、金硫丁二钠、青霉胺、氯奎、羟氯喹、硫唑嘌呤、Tofacitinib、Fostamatinib和环孢素)和生物的DMARDS(例如但不限于英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、利妥昔单抗和阿巴他塞)。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防增殖性病症；具体的治疗剂包括但不限于：甲氨蝶呤、亚叶酸(leukovorin)、亚德利亚霉素、强的松(prenisone)、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西他赛、长春花新碱、长春花碱、长春瑞滨、多柔比星、他莫昔芬、托瑞米芬、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗-HER2单克隆抗体(例如Herceptin^TM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂(例如Tarceva^TM、Erbitux^TM)、VEGF抑制剂(例如Avastin^TM)、蛋白酶体抑制剂(例如Velcade^TM)、或hsp90抑制剂(例如17-AAG)。另外，本发明的化合物可以与其它治疗、包括但不限于放射疗法或手术组合施用。在特定的实施方案中，增殖性障碍选自癌症、骨髓增殖性疾病或白血病。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防自身免疫性疾病，具体的治疗剂包括但不限于：糖皮质激素、细胞生长抑制剂(例如嘌呤类似物)、烷化剂(例如氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、铂化合物等)、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯嘌呤)、细胞毒性抗生素(例如放线菌素D蒽环、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素)、抗体(例如抗-CD20、抗-CD25或抗-CD3(OTK3)单克隆抗体、和)、环孢素、他克莫司、雷帕霉素(西罗莫司)、干扰素(例如IFN-β)、TNF结合蛋白(例如英夫利昔单抗(Remicade^TM)、依那西普(Enbrel^TM)或阿达木单抗(Humira^TM))、麦考酚酸酯、芬戈莫德(Fingolimod)和多球壳菌素。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防移植排斥，具体的治疗剂包括但不限于：钙神经素抑制剂(例如环孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抗增殖药(例如硫唑嘌呤、麦考酚酸)、皮质类固醇(例如泼尼松龙、氢化可的松)、抗体(例如单克隆抗-IL-2Rα受体抗体、巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗-T-细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG))。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防哮喘和/或鼻炎和/或COPD，具体的治疗剂包括但不限于：β2-肾上腺素受体激动剂(例如沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、特布他林和比托特罗)、肾上腺素(吸入或片剂)、抗胆碱药(例如异丙托溴铵)、糖皮质激素(口服或吸入)、长效β2-激动剂(例如沙美特罗、福莫特罗、班布特罗和缓释口服沙丁胺醇)、吸入的类固醇和长效支气管扩张剂的组合(例如氟替卡松/沙美特罗、布地奈德/福莫特罗)、白三烯拮抗剂和合成抑制剂(例如孟鲁司特、扎鲁司特和齐留通)、介质释放抑制剂(例如色甘酸盐和酮替芬)、IgE响应的生物调节剂(例如奥马珠单抗)、抗组胺药(例如西替利嗪(ceterizine)、桂利嗪、非索非那定)和血管收缩药(例如羟甲唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉(nafazoline)和曲马唑啉)。

另外，本发明的化合物可以与紧急治疗组合施用用于哮喘和/或COPD，这类治疗包括氧气或氦氧混合气(heliox)施用、喷雾沙丁胺醇或特布他林(任选与抗胆碱药(例如异丙托铵)组合)、合成类固醇(口服或静脉内，例如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松或氢化可的松)、静脉内沙丁胺醇、非特异性β-激动剂、注射或吸入的(例如肾上腺素、异他林、异丙肾上腺素、奥西那林)、抗胆碱药(IV或喷雾，例如格隆铵、阿托品、异丙托铵)、甲基黄嘌呤(茶碱、氨茶碱、苄胺茶碱)、具有支气管扩张作用的吸入麻醉药(例如异氟烷、氟烷、恩氟烷))、氯胺酮和静脉内硫酸镁。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防炎性肠病(IBD)，具体的治疗剂包括但不限于：糖皮质激素(例如泼尼松、布地奈德)、合成的缓解疾病的免疫调节剂(例如甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉秦、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和环孢素)和生物的缓解疾病的免疫调节剂(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和阿巴他塞)。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防SLE，具体的治疗剂包括但不限于：缓解疾病的抗风湿药(DMARD)如抗疟疾药(例如plaquenil、羟氯喹)、免疫抑制剂(例如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)、环磷酰胺和麦考酚酸；免疫抑制药物和镇痛药，例如非甾体抗炎药，麻醉剂(例如右丙氧芬和复方可待因扑热息痛(co-codamol))、阿片样物质(例如氢可酮、羟考酮、美施康定(MSContin)或美沙酮)和芬太尼duragesic透皮贴剂。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防银屑病，具体的治疗剂包括但不限于：局部疗法如沐浴溶液剂、湿润剂、含药乳膏剂和含煤焦油的软膏剂、二羟基蒽酚(地蒽酚)、皮质类固醇如去羟米松(Topicort^TM)、醋酸氟轻松、维生素D₃类似物(例如卡泊三醇)、Arganoiland类视色素(阿维A酯、阿维A、他扎罗汀)、全身疗法如甲氨蝶呤、环孢素、类视色素、硫鸟嘌呤、羟基脲、柳氮磺吡啶、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、富马酸酯或生物制品如Amevive^TM、Enbrel^TM、Humira^TM、Remicade^TM、Raptiva^TM和优特克单抗(ustekinumab)(IL-12和IL-23阻断剂)。另外，本发明的化合物可以与其它疗法组合施用，所述的疗法包括但不限于光疗法或光化学疗法(例如补骨脂素和紫外线A光疗法(PUVA))。

在一个实施方案中，本发明的化合物与其它治疗剂共同施用以用于治疗和/或预防过敏反应，具体的治疗剂包括但不限于：抗组胺剂(例如西替利嗪、苯海拉明、非索非那定、左西替利嗪)、糖皮质激素(例如泼尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松)、肾上腺素、茶碱或抗白三烯(如孟鲁斯特、扎鲁司特)、抗胆碱药和减充血剂。

共同施用包括给患者递送两种或更多种治疗剂作为相同治疗方案的一部分的任意方式，这对于技术人员而言是显而易见的。尽管两种或更多种治疗剂可以以单个制剂、即作为单个药物组合物同时施用，但这不是必需的。治疗剂可以以不同的制剂和在不同的时间施用。

通用合成方法

通则

应用以下通用方法和操作由易于获得的原料制备本发明的化合物。应该理解：当给出典型的或优选的工艺条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，还可以应用其它工艺条件，另有说明除外。最佳反应条件可由于所用的具体反应物或溶剂不同而不同，但是这些条件是本领域技术人员通过常规优化程序可以确定的。

另外，对于本领域技术人员而言显而易见的是，可能需要常规保护基以防止某些官能团进行不希望的反应。选择对具体官能团而言适宜的保护基以及适宜的保护和脱保护条件是本领域众所周知的。例如，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，ProtectingGroupsinOrganicSynthesis(有机合成中的保护基)，第二版，Wiley，纽约，1991和文中所引的文献中描述了很多保护基及其引入和除去。

以下方法详细描述了制备上文定义的本发明的化合物和对比实施例。本发明的化合物可以由有机合成领域的技术人员用已知的或市售的原料和试剂来制备。

所有试剂是商品级的并且收到后未经进一步纯化而使用，另有说明除外。市售无水溶剂用于惰性气氛下进行的反应。试剂级的溶剂用于所有其它情况，另有说明除外。柱色谱在硅胶60(35-70μm)上完成。薄层色谱用预涂层的硅胶F-254板(厚度0.25mm)进行。¹HNMR波谱在BrukerDPX400NMR光谱仪(400MHz)上记录。1HNMR波谱的化学位移(δ)以相对于四甲基硅烷(δ0.00)或适宜的残留溶剂峰、即CHCl₃(δ7.27)作为内标的百万分数(ppm)报告。峰裂数以单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)和宽峰(br)给出。偶合常数(J)以Hz给出。电喷雾MS谱在Micromass平台LC/MS谱仪上获得。LCMS分析所用的柱为：Hichrom，KromasilEternity，2.5μmC18，150x4.6mm，WatersXbridge5μmC₁₈(2)，250x4.6mm(ref86003117)，WatersXterraMS5μmC18，100x4.6mm(Plusguardcartridge)(ref186000486)，Gemini-NX3μmC18100x3.0mm(ref00D-4453-Y0)，PhenomenexLuna5μmC18(2)，100x4.6mm.(Plusguardcartridge)(ref00D-4252-E0)，Kinetixfusedcore2.7μmC18100x4.6mm(ref00D-4462-E0)，Supelco,ExpressC₁₈(ref53829-U)或HichromHaloC18,2.7μmC₁₈,150x4.6mm(ref92814-702)。LC-MS被记录在装有UV检测器Waters2996与HPLCWaters2795联用的WatersMicromassZQ上。LC还在与UV检测器AgilentG1315A联用的HPLCAgilent1100上运行。制备型HPLC：WatersXBridgePrepC185μmODB19mmID×100mmL(PartNo.186002978)。所有方法应用MeCN/H₂O梯度。H₂O含有0.1%TFA或0.1%NH₃。

试验部分中所用的缩略词列表：

本发明的化合物和对比实施例的合成制备

本发明的化合物和对比实施例可根据以下流程制备。

通用合成方法

流程1

中间体的合成

中间体1:(3-溴-吡啶-2-基)-乙腈

将干燥THF(100mL)冷却至–78℃，加入正丁基锂(2.5M在己烷中；23mL,58mmol)。滴加乙腈(3.3mL,64mmol)，保持温度低于–60℃。形成白色沉淀，将反应混合物在–78℃搅拌45min。滴加2,3-二溴吡啶(2.0g,8.4mmol)在干燥THF(10mL)中的溶液，将反应混合物在–78℃搅拌1.5h，然后使其温至室温。通过滴加水将反应淬灭。将水相用DCM萃取(x3)，将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。将(3-溴-吡啶-2-基)-乙腈(中间体1)经快速柱色谱纯化。

中间体2:O-(基磺酰基)羟胺

步骤i):N-叔丁氧羰基-O-(基磺酰基)羟胺

将磺酰氯(7.75g,35.4mmol)和N-羟基氨甲酸叔丁基酯(4.72g,35.4mmol)溶于乙醚(150mL)中。在0℃在搅拌下滴加三乙胺(4.88mL,35.4mmol)。添加后将混合物在0℃搅拌1h，通过过滤除去盐酸三乙胺沉淀。将沉淀用乙醚洗涤两次，将洗涤液加入滤液中。将醚在真空下除去，将残余物再溶于最小体积的甲苯中。加入石油醚40-60来沉淀N-叔丁氧羰基-O-(基磺酰基)羟胺，为白色沉淀。

步骤ii):O-(基磺酰基)羟胺

在0℃将N-叔丁氧羰基-O-(基磺酰基)羟胺(4.0g)加入TFA(15mL)中，将混合物在0℃搅拌1h。将反应混合物倾入冰水(100mL)中，通过过滤收集沉淀。将固体溶于最小体积的乙醚中，通过添加三至四倍体积的石油醚40-60进行沉淀。将混合物冷却至0℃，搅拌15min。过滤，得到O-(基磺酰基)羟胺(中间体2)，为固体。

中间体3:4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺

将(3-溴-吡啶-2-基)-乙腈(中间体1)(1.49g,7.56mmol)溶于DCM(25mL)中，将溶液冷却至0℃。分批加入O-(基磺酰基)羟胺(中间体2)(2.12g,9.83mmol)，将反应混合物在0℃搅拌2h，然后在4℃保存16h。加入另外部分的O-(基磺酰基)羟胺(0.81g,3.78mmol)，将反应混合物在0℃搅拌2h。通过过滤收集沉淀，用石油醚40-60洗涤，得到作为盐的4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺(中间体3)。

将粗制的中间体再混悬于EtOH(25mL)中，加入NaOH(173mg,4.3mmol)。将反应混合物在室温搅拌2h，然后将溶剂在真空下除去。将残余物再溶于DCM/水中，将水相用DCM萃取(×3)。使合并的有机物通过疏水性烧结漏斗(frit)，在真空下浓缩。

经快速柱色谱纯化(1:1石油醚40-60:EtOAc)，得到4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺(中间体3)。

中间体4:环丙烷甲酸(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-酰胺

在5℃将4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺(中间体3)(259mg,1.22mmol)溶于干燥CH₃CN(10mL)中，加入Et₃N(425μL，3.05mmol)，随后加入环丙甲酰氯(278μL，3.05mmol)。然后使反应混合物温至室温。在真空下除去溶剂，将残余物用7M甲醇氨溶液(5mL)处理，在室温搅拌1h以水解任意双酰化产物。在真空下除去溶剂，将残余物再溶于DCM中，用水和盐水洗涤。使有机物通过疏水性烧结漏斗，在真空下浓缩。经快速柱色谱纯化(2:1石油醚40-60:EtOAc)，得到环丙烷甲酸(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-酰胺(中间体4)。

中间体5:3-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙酰胺

步骤i):3-溴-2-氰基甲基吡啶(中间体1)

参见中间体1的方案。

步骤ii)2-(3-溴-吡啶-2-基)-N-羟基-乙脒。

将盐酸羟胺(924mg,13.3mmol)、水(4mL)、NaHCO₃(1.12g,13.3mmol)、3-溴-2-氰基甲基吡啶(中间体1)(1.31g,6.65mmol)和乙醇(14mL)的剧烈搅拌的混合物加热至回流达5h。使反应混合物冷却至室温，在真空下除去乙醇，通过过滤收集白色固体，用水(3x10mL)洗涤。将湿的固体在真空下在40℃干燥1h，得到2-(3-溴-吡啶-2-基)-N-羟基-乙脒，为白色沉淀。

步骤iii):3-溴-2-(5-甲基-[1,2,4]二唑-3-基甲基)-吡啶。

将在步骤ii)中获得的2-(3-溴-吡啶-2-基)-N-羟基-乙脒(1.24g,5.39mmol)和醋酸酐(552mg,5.41mmol)的混合物在干燥THF(10mL)中在20℃搅拌1.5h。将反应混合物在真空下浓缩，将残余物在2MNa₂CO₃(10mL)和DCM(10mL)的两相系统中在20℃剧烈搅拌10min。将得到的白色沉淀通过过滤收集，用水(2x5mL)和DCM(2x5mL)洗涤，然后在真空下在40℃干燥1h，得到O-乙酰基偕胺肟，为白色粉末。

将得到的O-乙酰基偕胺肟(610mg,2.24mmol)和K₂CO₃(1.56g,11.3mmol)在CHCl₃(6mL)中在60℃剧烈搅拌41h。在剧烈搅拌下将水(5mL)和另外的CHCl₃(5mL)加入混合物中。将各层分离，将有机萃取物在真空下浓缩。得到粗制的3-溴-2-(5-甲基-[1,2,4]二唑-3-基甲基)-吡啶，为黄色液体，将其未经进一步纯化地用于之后的反应中。

步骤iv):3-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙酰胺

在150℃将在步骤iii)中获得的3-溴-2-(5-甲基-[1,2,4]二唑-3-基甲基)-吡啶(663mg,2.61mmol)在甲苯(5.2mL)中在密封管中搅拌41h。使反应混合物冷却至室温，将甲苯在真空下除去，将残余物经柱色谱纯化(梯度:0-10%在DCM中的MeOH)。将得到的固体用乙醚研磨，得到3-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙酰胺(中间体5)，为米白色固体。

中间体6:5-溴-3-氟-2-(2-吡唑-1-基-乙氧基)-吡啶

步骤i:2-羟基-3-氟-5-溴吡啶

将3-氟-2-羟基吡啶(1g,8.8mmol)在干燥DMF(11mL)中的混悬液在冰浴中冷却。历经10min滴加溴(1.55g,9.7mmol)，将反应混合物在0℃搅拌1h，然后使其温至室温，再搅拌2h。将反应用水淬灭。将水相用DCM萃取(×4)，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。经柱色谱纯化(梯度:20-100%在石油醚40-60中的EtOAc)，得到目标化合物，为浅黄色固体。

步骤ii:5-溴-3-氟-2-(2-吡唑-1-基-乙氧基)-吡啶。

将5-溴-3-氟-2-羟基吡啶(440mg,2.3mmol)、1-(2-氯乙基)-1H-吡唑(330mg,2.5mmol)和K₂CO₃(380mg,2.77mmol)在DMF(5mL)中的剧烈搅拌的混合物加热至90℃达16h。冷却至至室温后，在真空下除去溶剂，将粗品在水和EtOAc之间分配。将水相用EtOAc萃取(x3)，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。经柱色谱纯化(梯度:20%-100%在石油醚40-60中的EtOAc)，得到(中间体6)，为澄清的油状物。

使用方法E的步骤F-2将该芳基溴进一步转化为所需的代硼酸酯。

中间体7:(5-溴-3-氟-吡啶-2-基)-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-甲酮

步骤i):2-酰氨基-3-氨基-5-溴吡啶

将氯化锡(90g,400mmol)加入5-溴-3-硝基吡啶甲腈(17g,74mmol)在甲醇(800mL)中的溶液中，将反应混合物加热至40℃达4.75h。在真空下除去溶剂，加入甲苯，在真空下将其除去。将粗品混悬于EtOAc中，将混合物用饱和NaHCO₃(水溶液)碱化至pH8。将有机层分离，将含水浆液用CHCl₃萃取(x3)。将合并的有机物经Celite过滤，干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩，得到粗制的3-氨基-5-溴吡啶-2-甲酰胺，将其未经进一步纯化地直接使用。

步骤ii):3-氟-5-溴吡啶-2-甲酰胺

将四氟硼酸亚硝鎓(300mg,2.58mmol)加入3-氨基-5-溴吡啶-2-甲酰胺(466mg,2.15mmol)在DCM(30mL)中的混悬液中，将混合物在室温搅拌16h。在真空下除去溶剂，加入甲苯(30mL)，将混合物加热至回流达2h。冷却至室温后，在真空下除去溶剂，将粗品在DCM(10mL)中形成浆液，过滤，用DCM洗涤，在真空下在40℃干燥，得到3-氟-5-溴吡啶-2-甲酰胺，将其未经进一步纯化地直接使用。

步骤iii):3-氟-5-溴吡啶甲酸

将3-氟-5-溴吡啶-2-甲酰胺(1.44g,6.5mmol)在浓HCl(水溶液)(17mL)中的溶液加热至120℃达1.5h。将反应混合物在冰浴中冷却，缓慢加入48%NaOH直至pH为5。在真空下除去溶剂，加入甲苯(25mL)，然后在真空下将其除去。将得到的固体用4:6甲醇/DCM(x2)萃取，将合并的萃取物在真空下蒸发，得到粗制的3-氟-5-溴吡啶甲酸盐酸盐，将其未经进一步纯化地直接使用。

步骤iv):3-氟-5-溴吡啶甲酸甲氧基甲基酰胺

将3-氟-5-溴吡啶甲酸盐酸盐(1.83g,6.5mmol)、N-O-二甲基盐酸羟胺(824mg,8.45mmol)、Et₃N(2.3mL,16.25mmol)和HATU(3.2g,8.45mmol)在干燥DMF(30mL)中的混悬液在室温在N₂下搅拌16h。加入另外的HATU(900mg,2.4mmol)，将反应混合物再搅拌6h。在真空下除去溶剂，将粗品在饱和NaHCO₃(水溶液)和EtOAc之间分配。将水相用另外的EtOAc(x3)萃取，将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。经柱色谱纯化(梯度:20%-80%在石油醚40-60中的EtOAc:EtOAc)，得到3-氟-5-溴吡啶甲酸甲氧基甲基酰胺，为黄色固体。

步骤v)3-氟-5-溴吡啶-2-甲醛

将3-氟-5-溴吡啶甲酸甲氧基甲基酰胺(630mg,2.4mmol)在干燥THF(12mL)中的溶液冷却至–50℃，历经15min加入DIBAL(1M在THF中；2.8mL,2.8mmol)，同时保持温度低于–50℃。将反应混合物在–50℃搅拌2h。加入另外部分的DIBAL(1M在THF中；0.25mL,0.25mmol)，历经2h使反应混合物缓慢温至–10℃。通过滴加水(5mL)将反应淬灭，将THF在真空下除去，加入罗谢尔盐的稀溶液。将水相用EtOAc萃取(×3)，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。经柱色谱纯化(梯度:10%-90%在石油醚40-60c中的EtOAc)，得到3-氟-5-溴吡啶-2-甲醛，为黄色固体。

步骤vi)(5-溴-3-氟-吡啶-2-基)-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-甲酮

将三乙酰氧基硼氢化钠(240mg,1.1mmol)分批加入3-氟-5-溴吡啶2-甲醛(188mg,0.92mmol)、1-甲磺酰基哌嗪(166mg,1.01mmol)和乙酸(0.21mL,3.68mmol)在干燥DMF(2mL)中的溶液中，搅拌45min后，加入另外部分的三乙酰氧基硼氢化钠(30mg,0.14mmol)，将反应混合物再搅拌2.5h。将反应混合物在水和DCM之间分配，将有机层分离，干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。得到粗制的哌嗪，为浅黄色固体，未经纯化地直接使用。

使用方法E的步骤E-2将该芳基溴转化为所需的代硼酸酯。

中间体8:1-((5-溴-3-氟吡啶-2-基)甲基)-4-(甲磺酰基)哌嗪。

步骤1:5-溴-3-氟吡啶甲酸

将5-溴-3-氟吡啶酰胺(1.44g,6.5mmol)在120℃在浓HCl(17mL)中搅拌1.5h。将混合物在冰浴中冷却，用NaOH溶液(48%水溶液)将pH调节至pH5。将混合物用40%在DCM中的MeOH萃取，使用分相器干燥，在真空下浓缩，得到棕色粉末。

步骤2:5-溴-3-氟-N-甲氧基-N-甲基吡啶酰胺

将5-溴-3-氟吡啶甲酸(1.4g,6.5mmol)、N,O-二甲基羟胺.HCl(0.82g,8.45mmol)、(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(3.2g,8.45mmol)和三乙胺(2.3mL,16.3mmol)在DMF(30mL)中在室温搅拌1天。加入EtOAc和饱和Na₂CO₃水溶液，将水相用EtOAc萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩。将残余物经硅胶柱色谱用20-80%在异己烷中的EtOAc洗脱纯化，得到5-溴-3-氟-N-甲氧基-N-甲基吡啶酰胺。

步骤3:5-溴-3-氟吡啶甲醛

将5-溴-3-氟-N-甲氧基-N-甲基吡啶酰胺(0.63g,2.4mmol)在THF(12mL)中在60℃搅拌。滴加二异丁基氢化铝(1M在THF，2.8mL,2.8mmol)，将反应混合物在50℃以下搅拌2h。加入另外的二异丁基氢化铝(1M在THF，0.85mL,0.85mmol)，历经2h使反应混合物温至16℃。加入罗谢尔盐溶液(饱和水溶液)，将水相用EtOAc萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩。将残余物经硅胶柱色谱用10-70%在异己烷中的EtOAc洗脱纯化，得到5-溴-3-氟吡啶甲醛。

步骤4:1-((5-溴-3-氟吡啶-2-基)甲基)-4-(甲磺酰基)哌嗪。

将5-溴-3-氟吡啶甲醛(94mg,0.46mmol)和1-(甲磺酰基)哌嗪(82mg,0.5mmol)在AcOH(0.11mL)和DMF(1mL)中在室温搅拌。缓慢加入NaBH(OAc)₃(160mg,0.75mmol)，将反应混合物在室温搅拌3.5h。加入水和DCM，将水相用DCM萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩，得到1-((5-溴-3-氟吡啶-2-基)甲基)-4-(甲磺酰基)哌嗪(中间体7)，为无色固体。

制备本发明的化合物的通用合成方法

方法A:铃木反应

将芳基溴(1.0当量)、代硼酸或酯(1.1当量)、Pd(PPh₃)₄(5%)和1MK₂CO₃水溶液(1.2当量)在EtOH中的混悬液在微波辐照下在密封管中在110℃加热15min。将反应混合物用DCM稀释，用水洗涤。将有机相通过分相器柱，在真空下浓缩，得到棕色胶状物。经柱色谱(梯度:0-10%在EtOAc中的MeOH)或制备型HLPC纯化，得到目标化合物。

方法B

将代硼酸或酯(1.1当量)加入芳基溴在1,4-二烷/水(4:1；v/v)中的溶液中。将Na₂CO₃(4.0当量)和Pd(dppf)Cl₂(5%)(dppf=1,1’-双(二苯膦基)二茂铁)加入该脱气的溶液中。将得到的混合物在100℃加热1h(或16h)。将反应混合物用EtOAc稀释，经Celite过滤，在真空下浓缩。经柱色谱(梯度:0-5%在EtOAc中的MeOH)或制备型HLPC纯化，得到目标化合物。

方法C:酯水解和酰胺偶联

步骤C-1

将芳基溴(1.0当量)、代硼酸酯(1.1当量)、Pd(PPh₃)₄(5%)和1MK₂CO₃(水溶液)(1.2当量)在EtOH中的混悬液在微波辐照下在密封管中在110℃加热30min。

步骤C-2

将NaOH溶液(1M；2当量)加入，随后加入另外的EtOH，将反应混合物在室温搅拌4h。在真空下除去乙醇，将水相用水稀释，用EtOAc萃取。将有机萃取物用2MHCl(水溶液)酸化至pH2。将得到的沉淀通过过滤收集，在真空下干燥，得到目标羧酸，将其未经进一步纯化地用于之后的反应中。

步骤C-3

将羧酸中间体、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)(1.2当量)、DIPEA(1.2当量)和适宜的胺(1.2当量)在室温在DMF中混合。将得到的混合物在室温搅拌16h。将反应混合物用DMSO稀释，过滤，经制备型HPLC纯化，得到目标化合物。

方法D:代硼酸酯的形成

将2-(4-(溴甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(1当量)、胺(1.1当量)和K₂CO₃(2当量)在乙腈中的混合物在40℃搅拌18h。使反应混合物冷却至室温，将反应混合物经Celite过滤，用EtOAc洗涤。将滤液在真空下浓缩。将产物未经进一步纯化地用于之后的反应中。

方法E:代硼酸酯的形成

步骤E-1:

将4-溴-2-氟苄基溴(1当量)、胺(1.1当量)和K₂CO₃(2当量)在乙腈(70mL)中的混合物在40℃搅拌18h。使反应混合物冷却至室温，将混合物经Celite过滤，用EtOAc洗涤。将滤液在真空下浓缩。将得到的固体溶于最小体积的丙酮中，加样于二氧化硅垫，使用40%在异己烷中的EtOAc(3x400mL)洗脱，得到目标胺。

步骤E-2:

将芳基溴(1当量)、联硼酸频那醇酯(bis(pinacolato)diboron)(1.3当量)、PdCl₂(dppf)(0.05当量)和醋酸钾(1.3当量)在脱气的二烷(10mL)中的混合物在氮气下在密封管中在90℃搅拌18h。使反应混合物冷却至室温，将混合物经Celite过滤，用EtOAc洗涤直至滤液变得无色。将滤液在真空下浓缩，将残余物经柱色谱纯化(梯度:0-100%在异己烷中的EtOAc)，得到代硼酸酯。

方法F:代硼酸酯的形成

步骤F-1

将醛(1.0当量)和胺(1.5当量)在AcOH-DCM(1:10；v/v)中的混合物在室温搅拌30min，然后加入PS-NMe₃BH₃CN(聚合物支持的氰基硼氢化物)(2当量)。将反应混合物在室温振荡14h，然后过滤，通过SCX柱，用MeOH洗涤，用7N甲醇氨在MeOH中的溶液(1:50；v/v)洗脱。将滤液在真空下浓缩。将产物未经进一步纯化地用于之后的反应中。

步骤F-2

将溴(1当量)、联硼酸频那醇酯(1.3当量)、Pd(dppf)Cl₂(5mol%)和KOAc(1.3当量)在二烷中的混合物在室温用N₂气净化10min。将管密封，加热至90℃达20h。使反应混合物冷却至室温，将反应混合物经Celite过滤，将滤液在真空下浓缩，得到棕色胶状物，将其未经进一步纯化地用于之后的反应中。

方法G

步骤G-1

将1-BOC-4-溴哌啶(1g,3.8mmol)、烷基硫醇钠(4.4mmol)和DMF(10mL)的混合物在80℃搅拌16h。使反应混合物冷却至室温，倾入冰水中。将得到的混合物用EtOAc萃取(x3)。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩，得到粗制的产物，为无色胶状物。将粗制的产物未经进一步纯化地用于之后的反应中。

步骤G-2

在0℃将m-CPBA(2.6g,7.5mmol)加入来自步骤G-1的粗制的产物在氯仿(20mL)中的溶液中。使反应混合物温至室温，搅拌16h。通过加入Na₂S₂O₃(水溶液)淬灭过量的m-CPBA。将水相分离，用DCM萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO₃洗涤，然后通过相分离柱，在真空下浓缩。将粗制的产物经柱色谱纯化(梯度:25%在异己烷中的EtOAc)，得到目标化合物，为白色沉淀。

步骤G-3

在0℃将在二烷中的HCl(4M；7.5mL)加入4-(烷基磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.59g,2.24mmol)在EtOAc(10mL)中的溶液中。使反应混合物温至室温，搅拌16h。将溶剂在真空下除去，得到目标化合物，为HCl盐。使用方法D和方法E用该胺合成代硼酸酯。

方法H:脱乙酰

将N-(4-溴吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺(19.0mg,0.075mmol)、HCl(2M，0.2mL)和MeOH(0.2mL)的混合物在70℃搅拌4h。将棕色溶液用饱和NaHCO₃水溶液(0.5mL)碱化，过滤。将残余物用水(0.2mL)洗涤，干燥，得到纯的胺。

方法I-氟化

将Selectfluor(60mg,0.17mmol)加入N-(4-溴吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(中间体4)(42mg,0.15mmol)和MeCN(0.45mL)的混合物中，导致轻微的放热。将反应混合物在室温搅拌42h。加入另外的Selectfluor(30mg,0.9mmol)，将反应混合物在室温再搅拌6h。在剧烈搅拌下将反应混合物用EtOAc和水稀释。将各相分离，将水相用EtOAc萃取。将合并的有机萃取物用水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，在真空下浓缩。将粗制的产物经柱色谱纯化(等浓度:50%在异己烷中的EtOAc)，得到6.5:1的目标物质和起始物质的混合物。将混合物未经进一步纯化地用于使用方法A中描述的实验操作的反应中。

方法J-氯化

将N-氯琥珀酰亚胺(1当量)加入酰化的吡唑并吡啶在MeCN中的混悬液中。将得到的混合物在室温搅拌2h。将溶剂在真空下除去，将产物经柱色谱纯化(梯度:0-8%在DCM中的MeOH)，得到目标化合物。

方法K-溴化

将N-溴琥珀酰亚胺(1当量)加入酰化的吡唑并吡啶在DCM中的混悬液中。将得到的混合物在室温搅拌2h，然后倾入饱和Na₂S₂O₅(水溶液)中。将有机相分离，用水、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)。将溶剂在真空下除去，将粗制的产物经柱色谱纯化(等浓度:20%在异己烷中的EtOAc)，得到目标化合物。

方法L:

步骤i):5-溴-3-氟-2-羟基吡啶

将3-氟-2-羟基吡啶(1g,8.8mmol)在干燥DMF(11mL)中的混悬液在冰浴中冷却。历经10min滴加溴(1.55g,9.7mmol)，将反应混合物在0℃搅拌1h，然后使其温至室温，再搅拌2h。将反应用水淬灭。将水相用DCM萃取(x4)，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。经柱色谱纯化(梯度:20-100%在石油醚40-60中的EtOAc)，得到5-溴-3-氟-2-羟基吡啶，为浅黄色固体。

步骤ii):5-溴-3-氟-2-(2-吡唑-1-基-乙氧基)-吡啶。

将5-溴-3-氟-2-羟基吡啶(440mg,2.3mmol)、1-(2-氯乙基)-1H-吡唑(330mg,2.5mmol)和K₂CO₃(380mg,2.77mmol)在DMF(5mL)中的剧烈搅拌的混合物加热至90℃达16h。冷却至室温后，在真空下除去溶剂，将粗品在水和EtOAc之间分配。将水相用EtOAc萃取(x3)，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。经柱色谱纯化(梯度:20%-100%在石油醚40-60中的EtOAc)，得到5-溴-3-氟-2-(2-吡唑-1-基-乙氧基)-吡啶，为澄清的油状物。

使用方法E的步骤(ii)将芳基溴转化为所需的代硼酸酯。

用于制备本发明的化合物和对比化合物的代表性实施例

化合物7:环丙烷甲酸[4-(4-甲氧基-苯基)-3-苯基-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-酰胺

步骤(i):(3-溴-吡啶-2-基)-苯基-乙腈

将2,3-二溴-吡啶(1当量，0.5g)和苯基-乙腈(4当量，0.97mL)在NMP(3mL)中混合。将叔丁醇钾(1.3当量，0.3g)加入该溶液中。将得到的混合物在微波下在110℃加热40min。将EtOAc和水加入反应混合物中。将水层分离，用EtOAc萃取(×3)。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩，得到标题化合物，为黄色固体。将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤(ii):4-溴-3-苯基-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺

将(3-溴-吡啶-2-基)-苯基-乙腈(0.528g,1当量)溶于DCM(5mL)中，该溶液冷却至0℃。分批加入O-(基磺酰基)羟胺(0.540g,1当量)，将反应混合物在0℃搅拌2h，然后在4℃保存16h。加入另外部分的O-(基磺酰基)羟胺(中间体2，参见上文)，将反应混合物在0℃搅拌2h。通过过滤收集沉淀，用石油醚40-60洗涤，得到中间体氨基吡啶盐。将残余物再溶于DCM/水中，将水相用DCM萃取(×3)。将合并的有机物干燥，在真空下浓缩，得到预期的产物。

步骤(iii):环丙烷甲酸(4-溴-3-苯基-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-酰胺

在5℃将4-溴-3-苯基-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺(0.295g1当量)溶于DCM(3mL)中，加入Et₃N(356μL)，随后加入环丙甲酰氯(234μL)。然后使反应混合物温至室温。在真空下除去溶剂，将残余物用7M甲醇氨溶液(5mL)处理，在室温搅拌1h以水解任意双酰化产物。在真空下除去溶剂，将残余物再溶于DCM中，用水和盐水洗涤。将有机物通过疏水性烧结漏斗，在真空下浓缩。经制备型HPLC纯化。

步骤(iv):化合物7

将代硼酸(56mg,1.2当量)加入芳基溴在1,4-二烷/水(4:1；v/v)中的溶液中。将K₂CO₃(83mg,2.0当量)和Pd(dppf)Cl₂(5%)加入该溶液中。将得到的混合物在100℃加热1h(或16h)。将反应混合物用EtOAc稀释，在真空下浓缩。经制备型HLPC纯化，得到目标化合物。

化合物21:N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

步骤(i):1-(4-溴-2-氟-苄基)-4-甲磺酰基-哌嗪

将4-溴-2-氟苄基溴(30.4g,114mmol，1当量)、1-甲磺酰基哌嗪(20.0g,114mmol，1当量)和K₂CO₃(31.6g,228mmol，2当量)在乙腈(500mL)中的混合物在40℃搅拌18h。使反应混合物冷却至室温，将混合物经Celite过滤，用EtOAc洗涤。将滤液在真空下浓缩，得到目标胺。

将4-溴-2-氟苄基溴(30.4g,114mmol，1当量)、1-甲磺酰基哌嗪(20.0g,114mmol，1当量)和K₂CO₃(31.6g,228mmol，2当量)在乙腈(500mL)中的混合物在40℃搅拌18h。使反应混合物冷却至室温，将混合物经Celite过滤，用EtOAc洗涤。将滤液在真空下浓缩，得到1-(4-溴-2-氟-苄基)-4-甲磺酰基-哌嗪。

步骤(ii):1-[2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苄基]-4-甲磺酰基-哌嗪

将芳基溴(20.0g,57mmol，1当量)、联硼酸频那醇酯(16.0g,63mmol，1.1当量)、PdCl₂(dppf)(2.3g,2.9mmol，0.05当量)和醋酸钾(6.2g,63mmol，1.1当量)在脱气的二烷(200mL)中的混合物在氮气下在密封管中在90℃搅拌18h。使反应混合物冷却至室温，将混合物经由二氧化硅短柱过滤，用DCM洗涤。将滤液在真空下浓缩。将残余物与异己烷混合，加入乙醚直至产物结晶。将产物通过过滤收集，为浅棕色固体。

或者，将芳基溴(309g,879.7mmol)、联硼酸频那醇酯(245.7g,967.7mmol)、PdCl₂(dppf)(35.9g,43.9mmol)和醋酸钾(94.9g,967.7mmol)在脱气的二烷(3L)中的混合物在氮气下在100℃搅拌6h。使反应混合物冷却至室温，将混合物经由二氧化硅短柱过滤，用DCM洗涤。将滤液在真空下浓缩。将DCM和己烷(2L)加入粘稠的残余物中，期间产物沉淀。将混悬液过滤，得到所需化合物。

步骤(iii):N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺(化合物21)。

使用了3种方法。

步骤(iii):第一种方法

将1-[2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苄基]-4-甲磺酰基-哌嗪(26.4g,66mmol，1.1当量)加入芳基溴(16.0g,63mmol，1当量)在1,4-二烷/水(540mL,4:1；v/v)中的溶液中。将Na₂CO₃(13.4g,126mmol，2.0当量)和Pd(dppf)Cl₂(2.6g,3mmol，0.05当量)(dppf=1,1’-双(二苯膦基)二茂铁)加入该脱气的溶液中。将得到的混合物在100℃加热2h。冷却至室温后，将反应混合物用EtOAc萃取，用MgSO₄干燥，在真空下浓缩。经制备型HLPC纯化，得到目标化合物

步骤(iii):第二种方法

将在以上步骤(ii)中得到的1-[2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苄基]-4-甲磺酰基-哌嗪(7.5g,18mmol，1当量)加入芳基溴(4.5g,18mmol，1当量)在1,4-二烷/水(150mL,4:1；v/v)中的溶液中。将Na₂CO₃(3.8g,36mmol，2.0当量)和Pd(dppf)Cl₂(0.7g,0.9mmol，5%)(dppf=1,1’-双(二苯膦基)二茂铁)加入该脱气的溶液中。将得到的混合物在100℃加热2h。将这两个反应混合物合并，在真空下除去溶剂。将残余物与DCM和水混合，通过过滤将不溶的物质除去。(将不溶的物质保留，稍后在纯化之前与有机残余物再合并)。将水层分离，用DCM萃取(×3)。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，在真空下浓缩。将残余物与之前收集的不溶物质合并，吸附至二氧化硅上。经柱色谱(梯度:0-5%在EtOAc中的MeOH)或制备型HLPC纯化，得到作为棕色固体的目标物质。将棕色固体与乙醇混合，将混悬液加热至回流。使该混合物冷却至室温，然后用冰浴进一步冷却。通过过滤收集收集目标物质，在真空下干燥。

步骤(iii):第三种方法

将在室温的1-N-(4-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-乙酰胺(149g,0.586mol)和Na₂CO₃(124g,1.172mol)在1,4-二烷(2L)/水(0.5L)的溶剂混合液中的混合物用N₂脱气。向该混合物中加入代硼酸酯(270g,1.15当量)和PdCl₂(dppf)(24g,5mol%)。将反应器的夹套加热至100℃，停止用N₂脱气，将混合物在加热下搅拌45min。UPLC显示代硼酸酯完全消耗。加入另外量的代硼酸酯(10g,0.05当量)，继续在100℃再搅拌30min。UPLC显示完全转化和预期产物的单峰。将溶剂体积减压缩减至0.5L，将得到的混悬液在4℃放置过夜。将水(0.5L)加入该混悬液中，搅拌30min，过滤。将得到的滤饼用水(0.5L)洗涤，抽吸下干燥1h。将滤饼转移至Petri培养皿(425g)，在空气中放置干燥过夜，得到粗制的期望化合物。将粉末置于硅胶垫上，用DCM/MeOH(9:1混合物)洗涤。将第一个部分(2.5L)浓缩至干燥，得到树脂状固体，将其弃去。将第二个部分(10LDCM/MeOH9:1的混合物，10L5:1的混合物和3L3:1的混合物)浓缩至干燥，得到预期产物。将固体混悬于EtOH(1.1L)中，加热至回流，搅拌30min，冷却至5℃，搅拌30min，过滤。将滤饼用冷的EtOH(300mL)洗涤，转移至Petri培养皿，得到预期产物。

化合物44:(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

步骤1:N-(4-(4-甲酰基苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

将N-(4-溴吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(4.66g,17mmol)、4-甲酰基苯基硼酸(3.06g,20.4mmol)、PdCl₂dppf(0.37g,0.45mmol)和Na₂CO₃(3.6g,34mmol)在1,4-二烷(140mL)和水(28mL)中在100℃搅拌3h。将反应混合物冷却至室温，经Celite过滤，用DCM彻底洗涤，在真空下浓缩。将残余物用EtOAc研磨，在真空下干燥，得到N-(4-(4-甲酰基苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

步骤2:(R)-4-(4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苄基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯

将N-(4-(4-甲酰基苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(122mg,0.4mmol)、(R)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(120mg,0.6mmol)和(聚苯乙烯基甲基)三甲铵氰基硼氢化物(载量4mmol/g,0.3g,1.2mmol)在DCM(15mL)和乙酸(1.5mL)中在室温振荡5天。将珠过滤掉，将滤液在真空下浓缩，得到(R)-4-(4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苄基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤3:(R)-N-(4-(4-((2-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

将(R)-4-(4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苄基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(162mg,0.33mmol)在DCM(2mL)和TFA(0.3mL)中在室温搅拌2h。将反应混合物在真空下浓缩，载入在DCM中的SCX柱。使MeOH(20mL)通过该柱，将化合物用(在MeOH中的7NNH₃，在MeOH中)(1:5)(50mL)洗脱。将滤液在真空下浓缩，得到(R)-N-(4-(4-((2-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

步骤4:(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

将(R)-N-(4-(4-((2-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(97mg,0.24mmol)和三乙胺(40μL，0.29mmol)在DCM(3mL)中在0℃在N₂下搅拌。缓慢加入甲磺酰氯(20μL，0.26mmol)，历经1h使反应混合物温至室温。将反应混合物在真空下浓缩，经制备型HPLC纯化，得到(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

化合物46:(S)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

和

化合物47:(R)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

步骤i):1-溴-4-(1-氯乙基)苯

将1-(4-溴苯基)乙醇(3.17g,15.8mmol)在浓HCl(25mL)和DCM(20mL)中在室温搅拌3天。加入水和DCM，将水相用DCM萃取。将合并的有机物使用分相器干燥，在真空下浓缩，得到1-溴-4-(1-氯乙基)苯(3.49g)，为无色油状物，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤ii):1-(1-(4-溴苯基)乙基)-4-(甲磺酰基)哌嗪。

将1-溴-4-(1-氯乙基)苯(3.46g,15.8mmol)、1-甲磺酰基哌嗪(5.19g,31.6mmol)和二异丙基乙胺(11.8mL,79mmol)在乙腈(125mL)中搅拌，加热至65℃达3天。将反应混合物在真空下浓缩，溶于EtOAc中，用饱和NaHCO₃(水溶液)洗涤。将有机相干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩。将残余物经硅胶柱色谱用100%异己烷至100%EtOAc洗脱纯化，得到标题化合物。

步骤iii):1-(甲磺酰基)-4-(1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)乙基)哌嗪

将1-(1-(4-溴苯基)乙基)-4-(甲磺酰基)哌嗪(2.96g,8.53mmol),4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(2.39g,9.40mmol)、PdCl₂dppf(0.36g,0.44mmol)、dppf(0.24g,0.44mmol)和KOAc(2.52g,25.7mmol)在1,4-二烷(50mL)中搅拌，在N₂下加热至100℃达1天。将反应混合物在真空下浓缩，溶于EtOAc中，经Celite过滤。将滤液在真空下浓缩，将残余物经硅胶柱色谱用100%异己烷至100%EtOAc洗脱纯化，得到标题化合物，为无色固体。

步骤iv:N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

将N-(4-溴吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(0.5g,1.79mmol)、1-(甲磺酰基)-4-(1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)乙基)哌嗪(0.85g,2.16mmol)、PdCl₂dppf(40mg,0.05mmol)和Na₂CO₃(0.38g,3.58mmol)在1,4-二烷(15mL)和水(3mL)中搅拌，在100℃加热1天。将反应混合物冷却至室温，经Celite过滤，用DCM彻底洗涤。将滤液在真空下浓缩，将残余物经硅胶柱色谱用0-5%在DCM中的MeOH洗脱纯化，得到N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺，为无色固体。

步骤5:(S)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺和(R)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺的两个对映异构体均使用手性制备型HPLC分离。

化合物49:R)-N-(4-(4-((1-(甲磺酰基)吡咯烷-3-基)氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

步骤i):(S)-3-((甲磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

在0℃向(S)-3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(200mg,1.07mmol)和三乙胺(0.3mL,1.07mmol)在DCM(10mL)中的搅拌的溶液中滴加甲磺酰氯(0.125mL,1.07mmol)。搅拌3h后，将反应混合物用饱和NaHCO₃溶液(水溶液)洗涤。将水层用DCM萃取，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩，得到标题化合物(350mg)，为无色固体，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤ii):(R)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

将在DMF(5mL)中的(S)-3-((甲磺酰基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.53g,2.0mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯酚(0.48g,2.2mmol)和K₂CO₃(0.33g,2.4mmol)在85℃加热1天。将反应混合物在真空下浓缩，加入Et₂O和水。将水相用Et₂O萃取，将合并的有机物用1MNaOH溶液(水溶液)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩，得到(R)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤iii):(R)-3-(4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

将N-(4-溴吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(265mg,0.95mmol)、(R)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(442mg,1.14mmol)、PdCl₂dppf(39mg,0.047mmol)和Na₂CO₃(501mg,4.73mmol)在1,4-二烷(15mL)和水(3mL)中搅拌，在100℃加热2h。将反应混合物冷却至室温，经Celite过滤。将残余物在EtOAc和水之间分配，将水相用EtOAc萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩，得到(R)-3-(4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯，为棕色油状物，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤iv:(R)-N-(4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

在室温将(R)-3-(4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苯氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.44g,0.95mmol)在DCM(10mL)和TFA(1mL)中搅拌3h。将反应混合物在真空下浓缩，载入在DCM中的SCX柱。使MeOH(100mL)通过该柱，将化合物用(在MeOH中的7NNH₃，在MeOH中)(1:5)(200mL)洗脱。将滤液在真空下浓缩，得到(R)-N-(4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺，将其未经进一步纯化地用于下一个步骤中。

步骤v:(R)-N-(4-(4-((1-(甲磺酰基)吡咯烷-3-基)氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。

将(R)-N-(4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺(340mg,0.94mmol)和三乙胺(0.16mL,1.13mmol)混悬于DCM(10mL)中，在0℃在N₂下搅拌。缓慢加入甲磺酰氯(77μL，0.99mmol)，历经4h使所得溶液温至室温。将反应混合物用饱和NaHCO₃溶液(水溶液)洗涤，将水相用DCM萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤，在真空下浓缩，经制备型HPLC纯化，得到(R)-N-(4-(4-((1-(甲磺酰基)吡咯烷-3-基)氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺。(126mg,30%收率)。

下表I列出了已经按照本文描述的合成方法制备的本发明的化合物和对比实施例。表II给出了本发明的化合物和一些对比实施例的NMR谱数据。

表I

表II:代表性的本发明的化合物的NMR数据

生物学实施例

实施例1：体外测定

1.1JAK1抑制测定

1.1.1JAK1测定polyGT底物

重组人JAK1催化域(氨基酸866-1154；目录号PV4774)购自Invitrogen。将25ngJAK1与6.25μgpolyGT底物(Sigma目录号P0275)在含有或不含有5μL受试化合物或介质(DMSO，1%终浓度)的激酶反应缓冲液(15mMHepespH7.5、0.01%Tween-20、10mMMgCl₂、2μM非放射ATP、0.25μCi³³P-γ-ATP(PerkinElmer，目录号NEG602K001MC)终浓度)中以总体积25μL在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下75分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。应用细胞收集器(PerkinElmer)将所有终止的激酶反应物转移至(75mM磷酸)预先洗涤的96孔滤板(PerkinElmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)的存在下获得的cpm而计算的。受试化合物抑制该活性的能力如下测定：

抑制百分数=((由含有受试化合物的样品测得的cpm－由含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm)/(在介质存在下测得的cpm－由含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm))*100。

制备化合物的剂量稀释系列，使得能够测定JAK1分析中剂量－响应反应和计算每个化合物的IC₅₀。将每个化合物以20μM的浓度、随后进行1/3系列稀释取8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行常规测试，DMSO终浓度为1%。当化合物系列的效力增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已经测试了下列化合物对抗JAK1的活性，下表IIIA中给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表IIIA:化合物的JAK1值

*＞1001nM

**501-1000nM

***101-500nM

****0.01-100nM

化合物编号	JAK1
		1	****
2	****
		3	****
4	****
		5	****
6	****
		7	*
8	****

1.1.2AK1Ulight-JAK1肽测试

重组人JAK1(催化域，氨基酸866-1154；目录号PV4774)购自Invitrogen。将1ngJAK1与20nMUlight-JAK1(tyr1023)肽(PerkinElmer目录号TRF0121)在含有或不含有4μL受试化合物或介质(DMSO，1%终浓度)的激酶反应缓冲液(25mMMOPSpH6.8、0.01％Brij-35、5mMMgCl₂、2mMDTT、7μMATP)中以总体积20μL在白色384Opti板(PerkinElmer，目录号6007290)中温育。室温60分钟后，通过加入20μL/孔的检测混合物(1×检测缓冲液(PerkinElmer，目录号CR97-100C)、0.5nM铕-抗-磷酸酪氨酸(PT66)(PerkinElmer，目录号AD0068)、10mMEDTA)终止反应。应用在320nm激发并在615nm测定发射的Envision(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质存在下获得的相对荧光单位(RFU)减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的RFU而计算的。受试化合物抑制该活性的能力如下测得：

抑制百分数＝((在受试化合物存在下的样品测得的RFU-含有阳性对照抑制剂的样品测得的RFU)/(在介质存在下测得的RFU-含有阳性对照抑制剂的样品测得的RFU))＊100。

制备化合物的剂量稀释系列，使得能够测定JAK1分析中剂量－响应反应和计算化合物的IC₅₀。将每个化合物以20μM的浓度、随后进行1/5系列稀释取10个点进行常规测试，DMSO终浓度为1%。当化合物系列的效力增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。将数据表示为测定的平均IC₅₀±平均值的标准误差。

已经测试了下列化合物对抗JAK1的活性，下表IIIB给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表IIIB:化合物的JAK1值

*＞1001nM

**501-1000nM

***101-500nM

****0.01-100nM

1.2JAK1Ki测定分析

为了测定Ki，将不同量的化合物与酶混合，酶反应是ATP浓度的函数。利用Km对化合物浓度的双倒数图(Lineweaver-Burk图)测定Ki。在该分析中使用1ngJAK1(Invitrogen，PV4774)。底物是20nMUlight-JAK-1(Tyr1023)肽(PerkinElmer，TRF0121)。在含有不同浓度的ATP和化合物的25mMMOPSpH6.8、0.01%、Brij-35、2mMDTT、5mMMgCl₂中进行反应。如在1.1.2中所述那样利用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66(PerkinElmer，AD0068)测定磷酸化底物。通过320nm激发以及在615nm和665nm追踪的发射在envision(PerkinElmer)上进行读数。

1.2JAK2抑制分析

1.2.1JAK2测定polyGT底物

重组人JAK2催化域(氨基酸808-1132；目录号PV4210)购自Invitrogen。将0.05mUJAK2与2.5μgpolyGT底物(Sigma目录号P0275)在含有或不含有5μL受试化合物或介质(DMSO，1%终浓度)的激酶反应缓冲液(10mMMOPSpH7.5、0.5mMEDTA、0.01%Brij-35、1mMDTT、15mMMgAc、1μM非放射性ATP、0.25μCi³³P-γ-ATP(PerkinElmer，目录号NEG602K001MC)终浓度)中以总体积25μL在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下90分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。应用细胞收集器(PerkinElmer)将所有终止的激酶反应物转移至(75mM磷酸)预先洗涤的96孔滤板(PerkinElmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)的存在下获得的cpm而计算的。受试化合物抑制该活性的能力如下测定：

制备化合物的剂量稀释系列，使得能够测定JAK2分析中剂量－响应反应和计算每个化合物的IC₅₀。将每个化合物以20μM的浓度、随后进行1/3系列稀释取8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行常规测试，DMSO终浓度为1%。当化合物系列的效力增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已经测试了下列化合物对抗JAK2的活性，下表IVA中给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表IVA:化合物的JAK2IC ₅₀ 值

#＞1001nM

##501-1000nM

###101-500nM

####0.01-100nM

化合物编号	JAK2
		1	####
2	###
		3	###
4	####
		5	####
6	####
		7	#
8	####

1.2.2JAK2Ulight-JAK1肽分析

重组人JAK2(催化域，氨基酸866-1154；目录号PV4210)购自Invitrogen。将0.0125mU的JAK2与25nMUlight-JAK1(tyr1023)肽(PerkinElmer目录号TRF0121)在含有或不含有4μL受试化合物或介质(DMSO，1%终浓度)的激酶反应缓冲液(25mMHEPESpH7.0、0.01%TritonX-100、7.5mMMgCl₂、2mMDTT、7.5μMATP)中以总体积20μL在白色384Opti板(PerkinElmer，目录号6007290)中温育。室温60分钟后，通过加入20μL/孔的检测混合物(1×检测缓冲液(PerkinElmer，目录号CR97-100C)、0.5nM铕-抗-磷酸酪氨酸(PT66)(PerkinElmer，目录号AD0068)、10mMEDTA)终止反应。应用在320nm激发并在615nm测定发射的Envision(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质存在下获得的相对荧光单位(RFU)减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的RFU而计算的。受试化合物抑制该活性的能力如下测得：

制备每个化合物的剂量稀释系列，使得能够测定JAK2分析中剂量－响应反应和计算化合物的IC₅₀。将每个化合物以20μM的浓度、随后进行1/5系列稀释取10个点进行常规测试，DMSO终浓度为1%。当化合物系列的效力增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。将数据表示为测定的平均IC₅₀±平均值的标准误差。

已经测试了下列化合物对抗JAK2的活性，下表IVB给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表IVB:化合物的JAK2IC ₅₀ 值

#＞1001nM

##501-1000nM

###101-500nM

####0.01-100nM

1.4JAK2Kd/Ki测定分析

1.4.1JAK2Ki测定分析

为了测定Ki，将不同量的化合物与酶混合，酶反应是ATP浓度的函数。利用Km对化合物浓度的双倒数图(Lineweaver-Burk图)测定Ki。在本次测定中使用0.0125mU的JAK1(Invitrogen，PV4210)。底物是25nMUlight-JAK-1(Tyr1023)肽(PerkinElmer，TRF0121)。在含有不同浓度的ATP和化合物的25mMHEPESpH7.0、0.01%TritonX-100、7.5mMMgCl₂、2mMDTT中进行反应。如在1.2.2中所述那样利用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66(PerkinElmer，AD0068)测定磷酸化底物。通过320nm激发以及在615nm和665nm追踪的发射在envision(PerkinElmer)上进行读数。

1.4.2JAK2Kd测定分析

以2.5nM的终浓度使用JAK2(Invitrogen,PV4210)。应用25nM激酶示踪剂236(Invitrogen,PV5592)和2nM铕-抗-GST(Invitrogen,PV5594)及不同的化合物浓度，在50mMHepespH7.5、0.01%Brij-35、10mMMgCl₂、1mMEGTA中进行结合试验。根据制造商的方法检测示踪剂。

1.5JAK3抑制测定

重组人JAK3催化域(氨基酸795-1124；目录号08-046)购自CarnaBiosciences。将0.5ng的JAK3蛋白与2.5μgpolyGT底物(Sigma，目录号P0275)在含有或不含有5μL受试化合物或介质(DMSO，1%终浓度)的激酶反应缓冲液(25mMTrispH7.5、0.5mMEGTA、10mMMgCl₂、2.5mMDTT、0.5mMNa₃VO₄、5mMb-磷酸甘油酯、0.01%TritonX-100、1μM非放射性ATP、0.25μCi³³P-γ-ATP(PerkinElmer，目录号NEG602K001MC)终浓度)中以总体积25μL在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下45分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。采用细胞收集器(PerkinElmer)将所有终止的激酶反应物转移至(75mM磷酸)预先洗涤的96孔滤板(PerkinElmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)的存在下获得的cpm而计算的。受试化合物抑制该活性的能力如下测定：

抑制百分数=((含有受试化合物的样品测得的cpm－含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm)/(在介质存在下测得的cpm－含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm))*100。

制备化合物的剂量稀释系列，使得能够测定JAK3分析中剂量－响应反应和计算每个化合物的IC₅₀。将每个化合物以20μM的浓度、随后进行1/5系列稀释取10个点进行常规测试，DMSO终浓度为1%。当化合物系列的效力增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已经测试了下列化合物对抗JAK3的活性，下表V中给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表V:化合物的JAK3IC ₅₀ 值

+＞1001nM

++501-1000nM

+++101-500nM

++++0.01-10(nM

1.6JAK3Ki测定分析

为了测定Ki，将不同量的抑制剂与酶混合，酶反应是ATP浓度的函数。利用Km对化合物浓度的双倒数图(Lineweaver-Burk图)测定Ki。以20ng/ml的终浓度使用JAK3(CarnaBiosciences，08-046)。底物是Poly(Glu,Tyr)钠盐(4:1)，MW20000-50000(Sigma，P0275)。在含有不同浓度的ATP和化合物的25mMTrispH7.5、0.01%TritonX-100、0.5mMEGTA、2.5mMDTT、0.5mMNa₃VO₄、5mMb-磷酸甘油酯、10mMMgCl₂中进行反应，加入150mM磷酸终止反应。通过将样品装载到滤板上(利用收集器，PerkinElmer)并随后洗涤测定了掺入底物polyGT中的磷酸。向滤板(PerkinElmer)加入闪烁液体后，在Topcount闪烁计数器中测定polyGT中掺入的³³P。

例如，当在该分析中测试时，化合物21得到Ki=227nM。

1.7TYK2抑制测定

重组人TYK2催化域(氨基酸871-1187；目录号08-147)购自Carnabiosciences。将4ng的TYK2与12.5μgpolyGT底物(Sigma，目录号P0275)在含有或不含有5μL受试化合物或介质(DMSO，1%终浓度)的激酶反应缓冲液(25mMHepespH7.2、50mMNaCl、0.5mMEDTA、1mMDTT、5mMMnCl₂、10mMMgCl₂、0.1%Brij-35、0.1μM非放射性ATP,0.125μCi³³P-γ-ATP(PerkinElmer，目录号NEG602K001MC)终浓度)中以总体积25μL在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下90分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。应用细胞收集器(PerkinElmer)将所有终止的激酶反应物转移至(75mM磷酸)预先洗涤的96孔滤板(PerkinElmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星孢素)存在下获得的cpm而计算的。受试化合物抑制该活性的能力如下测得：

抑制百分数＝((在受试化合物存在下的样品测得的cpm-含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm)/(在介质存在下测得的cpm-含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm))＊100。

已经测试了下列化合物对抗JAK2的活性，下表VI中给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表VI：化合物的TYK2IC ₅₀ 值

-＞1001nM

--501-1000nM

---101-500nM

----0.01-100nM

1.8TYK2Kd/Ki测定分析

1.8.1TYK2Ki测定分析

为了测定Ki，将不同量的化合物与酶混合，酶反应是ATP浓度的函数。利用Km对化合物浓度的双倒数图(Lineweaver-Burk图)测定Ki。以160ng/ml的终浓度使用TYK2(CarnaBiosciences,08-147)。底物是Poly(Glu,Tyr)钠盐(4：1)，MW20000-50000(Sigma，P0275)。在含有不同浓度的ATP和化合物的25mMHepespH7.2、50mMNaCl、0.5mMEDTA、1mMDTT、5mMMnCl₂、10mMMgCl₂、0.1%Brij-35中进行反应，加入150mM磷酸终止反应。通过将样品装载到滤板上(利用收集器，PerkinElmer)并随后洗涤测定了掺入底物polyGT中的磷酸。向滤板(PerkinElmer)加入闪烁液体后，在Topcount闪烁计数器中测定polyGT中掺入的³³P。

例如，当在该分析中测试时，化合物21得到Ki=135nM。

1.8.2TYK2Kd测定分析

以50nM的终浓度使用TYK2(CarnaBiosciences,08-147)。应用15nM激酶示踪剂236(Invitrogen,PV5592)和10nM铕-抗-GST(Invitrogen,PV5594)及不同的化合物浓度，在50mMHepespH7.5、0.01%Brij-35、10mMMgCl₂、1mMEGTA中进行结合试验。根据制造商的方法检测示踪剂。

实施例2：细胞分析

2.1JAK-STAT信号传导分析：

将HeLa细胞维持在含有10%热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将Hela细胞在70%汇合时用于转染。在96-孔板的每孔中，应用0.32μLJet-PEI(Polyplus)作为转染试剂将87μL细胞培养基中的20,000个细胞用40ngpSTAT1(2)-荧光素酶报道分子(Panomics)、8ngLacZ报道分子(作为内对照报道分子)和52ngpBSK进行瞬时转染。在37℃、5%CO₂下温育过夜后，除去转染培养基。加入81μLDMEM+1.5%热灭活胎牛血清。加入9μL10×浓度的化合物达60分钟，然后在33ng/mL的终浓度加入10μL人OSM(Peprotech)。

将所有化合物一式两份进行试验，从20μM开始，随后1/3系列稀释，总共8个剂量(20μM-6.6μM-2.2μM-740nM-250nM-82nM-27nM-9nM)，终浓度为0.2%DMSO。

在37℃、5%CO₂下温育过夜后，通过加入100μL裂解缓冲液/孔(PBS、0.9mMCaCl₂、0.5mMMgCl₂、10%海藻糖、0.05%TergitolNP9、0.3%BSA)裂解细胞。

通过加入180μLβ-Gal溶液(30μLONPG4mg/mL+150μLβ-半乳糖苷酶缓冲液(0.06MNa₂HPO₄、0.04MNaH₂PO₄、1mMMgCl₂))达20分钟后读取40μL细胞裂解液的β-半乳糖苷酶活性。通过加入50μLNa₂CO₃1M终止反应。在405nm处读取吸光度。

根据厂商(PerkinElmer)的说明，采用40μL细胞裂解液加40μL在Envision(PerkinElmer)上测定荧光素酶活性。

省略OSM作为阳性对照(100%抑制)。0.5%DMSO用作阴性对照(0%抑制)。阳性和阴性对照用于计算z’和“抑制百分数”(PIN)值。

抑制百分数=((在介质存在下测得的荧光－在受试化合物存在下的样品测得的荧光)/(在介质存在下测得的荧光－不含触发物的样品测得的荧光))*100。

将PIN值对剂量-响应中测试的化合物作图，获得EC₅₀值。

已经在JAK-STAT分析中测试了下列化合物的活性；下表VII给出了使用本文所述的试验测定的IC₅₀值。

表VII

§＞1001nM

§§501-1000nM

§§§101-500nM

实施例2.2OSM/IL-1β信号传导分析

OSM和IL-1β表现出协同上调人软骨肉瘤细胞系SW1353中的MMP13水平。在96-孔板中，将细胞以15,000个细胞/孔接种在120μL体积的含有10%(v/v)FBS和1%青霉素/链霉素(InVitrogen)的DMEM(Invitrogen)中，在37℃、5%CO₂下温育。在用15μLOSM和IL-1β触发达到25ng/mLOSM和1ng/mLIL-1β之前，将细胞与15μL在含有2%DMSO的M199培养基中的化合物预温育1小时，在触发后48小时时在条件培养基中测定MMP13水平。MMP13活性采用抗体捕获活性分析测定。为此目的，将384-孔板(NUNC，460518，MaxiSorb黑色)用35μL的1.5μg/mL抗人MMP13抗体(R&DSystems，MAB511)溶液在4℃下包被24小时。用PBS+0.05%吐温洗涤孔2次后，将剩余的结合位点用100μL在PBS中的5%脱脂奶粉(SantaCruz,sc-2325,Blotto)在4℃下封闭24小时。接着，将孔用PBS+0.05%吐温洗涤2次，加入在100-倍稀释的封闭缓冲液中的35μL1/10稀释的含MMP13的培养上清液，在室温下温育4小时。接着，将孔用PBS+0.05%吐温洗涤2次，随后通过加入35μL1.5mM4-氨基苯基醋酸汞(APMA)(Sigma，A9563)溶液并在37℃下温育1小时进行MMP13活化。将孔再次用PBS+0.05%吐温洗涤，加入35μLMMP13底物(Biomol，P-126，OmniMMP荧光底物)。在37℃下温育24小时后，在PerkinElmerWallacEnVision2102多标记读数器(激发波长：320nm，发射波长：405nm)中测定转化底物的荧光。

实施例2.3PBL增殖分析

将人外周血淋巴细胞(PBL)用IL-2刺激，采用BrdU掺入分析测定增殖。首先，将PBL用PHA刺激72小时以诱导IL-2受体，使它们饥饿(fasted)24小时以终止细胞增殖，随后用IL-2再刺激72小时(包括24小时BrdU标记)。将细胞与受试化合物预温育1小时，然后加入IL-2。将细胞在含10%(v/v)FBS的RPMI1640中培养。

实施例2.4全血分析(WBA)

2.4.1IFNα刺激实验方案

为了预测受试化合物抑制JAK1或JAK2依赖性体内信号传导通路的效力，采用人全血形成了生理学相关的体外模型。在WBA分析中，将从知情同意的人志愿者抽取的血液用化合物离体进行处理(1h)，随后用干扰素α(IFNα，JAK1依赖性通路)刺激30分钟或者用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，JAK2依赖性通路)刺激2h。

2.4.1.1磷酸–STAT1分析

对于IFNα而言，利用pSTAT1ELISA分析测定白血细胞提取物中经IFNα的信号转导子及转录激活子-1磷酸化(pSTAT1)的增加。干扰素α(IFNα)触发后的信号转导子及转录激活子-1磷酸化是JAK1-介导的事件。研发了用于测定细胞提取物中磷酸-STAT1水平的磷酸-STAT1分析，以评价化合物抑制JAK1-依赖性信号传导通路的能力。

将从知情同意的人志愿者抽取的人全血用化合物离体进行处理(1h)，随后用IFNα刺激30分钟。利用磷酸-STAT1ELISA测定白血细胞提取物中经IFNα的STAT1磷酸化的增加。

ACK裂解缓冲液由0.15MNH₄Cl、10mMKHCO₃、0.1mMEDTA构成。缓冲液的pH是7.3。

将10×细胞裂解缓冲液浓缩物(来自CellSignaling的PathScan磷酸-STAT1(Tyr701)夹心ELISA试剂盒的部分)用水稀释10倍。使用前向缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。

将20μgIFNα溶解在40μLH₂O中以获得500μg/mL储备液。将储备液于-20℃贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍系列稀释液(最高浓度：10mM)。随后，将化合物在培养基中进一步稀释(稀释因子取决于所需的化合物终浓度)。

2.4.1.1.1用化合物温育血液和用IFNα刺激

在肝素化试管中收集人血。将血液分成392μL的等分试样。然后，向各等分试样中加入4μL化合物稀释液，将血液样品在37℃温育1h。将IFNα储备液在RPMI培养基中稀释1000-倍，得到500ng/mL工作溶液。将4μL500ng/mL工作溶液加入到血液样品中(IFNα的终浓度：5ng/ml)。将样品在37℃温育30min。

2.4.1.1.2细胞提取物的制备

在刺激末期，将7.6mLACK缓冲液加入到血液样品中以裂解血红细胞。通过翻转试管5次将样品混合，将反应物在冰上温育5min。温育期间，RBC的裂解应该是明显的。通过在300g、4℃离心7min将细胞沉淀，除去上清液。将10mL1×PBS加入到各试管中，将细胞沉淀物再混悬。将样品在300g、4℃再离心7min。除去上清液，将沉淀物再混悬在500μL的1×PBS中。然后，将细胞混悬液转移至透明的1.5mL微量离心管中。通过在4℃于700g离心5min沉淀细胞。除去上清液，将沉淀物溶解在150μL细胞裂解缓冲液中。将样品在冰上温育15min。然后，将样品贮存在-80℃，直至进一步处理。

2.4.1.1.3经ELISA测定STAT1的磷酸化

将来自CellSignaling的Pathscan磷酸-STAT1(Tyr701)夹心ELISA试剂盒(目录号：#7234)用于测定磷酸-STAT1水平。

在冰上解冻细胞提取物。将试管在16,000g、4℃离心5min，收集澄清的溶解产物。同时，将试剂盒的微孔条平衡至室温，通过在H₂O中稀释20×洗涤缓冲液来制备洗涤缓冲液。将样品在样品稀释剂中稀释2倍，取100μL加入到微孔条中。将条在4℃温育过夜。

第二天，将孔用洗涤缓冲液洗涤3次。向孔中加入100μL检测抗体。将条在37℃温育1h。然后，将孔用洗涤缓冲液再洗涤3次。向各孔中加入100μLHRP-连接的二级抗体，在37℃温育样品。30min后，将孔再洗涤3次，向所有孔中加入100μLTMB底物。当样品变蓝时，加入100μLSTOP溶液终止反应。在450nm测定吸收度。

2.4.1.2数据分析

将细胞提取物中IFNα诱导的磷酸STAT1抑制对化合物浓度作图，采用Graphpad软件得到IC₅₀值。如果R²大于0.8且斜率小于3，则保留数据。

2.4.1.3IL-8ELISA

对于GM-CSF刺激，利用IL-8ELISA分析测定血浆中白细胞介素-8(IL-8)水平的增加。粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)-诱导的白细胞介素8(IL-8)表达是JAK2-介导的事件。已经研发了可用于测定血浆样品中IL-8水平的IL-8ELISA以评价化合物抑制JAK2-依赖性信号传导途径的能力。

从知情同意的人志愿者抽取的人全血离体用化合物离体进行处理(1h)，随后用GM-CSF刺激2h。利用IL-8ELISA分析测定血浆中IL-8水平的增加。

将10μgGM-CSF溶解在100μLH₂O中以获得100μg/mL的储备液。将储备液于-20℃贮存。

在DMSO中制备受试化合物的3倍系列稀释物(最高浓度：10mM)。随后，将化合物在培养基中进一步稀释(稀释因子取决于所需的化合物终浓度)。

2.4.1.3.1用化合物温育血液和用GM-CSF刺激

在肝素化试管中收集人血。将血液分成245μL的等分试样。然后，向各等分试样中加入25μL受试化合物稀释液，将血液样品在37℃温育1h。将GM-CSF储备液在RPMI培养基中稀释100-倍，得到1μg/mL的工作溶液。将2.5μL的1μg/mL工作溶液加入到血液样品中(GM-CSF的终浓度：10ng/ml)。将样品在37℃温育2h。

2.4.1.3.2血浆样品的制备

将样品在1,000g、4℃离心15min。收集100μL血浆，于-80℃贮存直到进一步使用。

2.4.1.3.3经ELISA测定IL-8水平

将来自R&DSystems的人IL-8化学发光免疫测定试剂盒(目录号：Q8000B)用于测定IL-8水平。

通过在H₂O中稀释10×洗涤缓冲液来制备洗涤缓冲液。在使用前15分钟至4小时时，通过将1份GloReagent1加入到2份GloReagentB中制备工作glo试剂。向孔中加入100μL分析稀释剂RD1-86。然后，加入50μL样品(血浆)。将ELISA板在室温、500rpm温育2h。用洗涤缓冲液洗涤所有孔4次，向各孔加入200μLIL-8共轭物。在室温温育3h后，将孔用洗涤缓冲液洗涤4次，向各孔加入100μL工作glo试剂。将ELISA板在室温(避光)温育5min。测定发光(0.5s/孔读取时间)。

2.4.2IL-6刺激方案

另外，采用人全血进行了流式细胞分析以确定化合物离体对JAK1的选择性高于JAK2。因此，从知情同意的人志愿者抽取血液。将血液在轻微振摇下于37℃平衡30分钟，接着在Eppendorf试管中进行等分。加入不同浓度的化合物，在轻微振摇下于37℃温育30分钟，随后对于JAK1-依赖性通道刺激而言用白细胞介素6(IL-6)在轻微振摇下于37℃刺激20分钟或者对于JAK2-依赖性通道刺激而言用GM-CSF在轻微振摇下于37℃刺激20分钟。然后，利用FACS分析评价磷酸-STAT1和磷酸-STAT5。

2.4.2.1磷酸–STAT1分析

对于IL-6-刺激的白血细胞中信号转导子及转录激活子-1(pSTAT1)磷酸化的增加，将从知情同意的人志愿者抽取的人全血用化合物离体处理30min，随后用IL-6刺激20分钟。通过FACS利用抗磷酸化-STAT1抗体测定了淋巴细胞中经IL-6的STAT1磷酸化的增加。

将5×溶解/固定缓冲液(BDPhosFlow，目录号558049)用蒸馏水稀释5倍，在37℃预热。弃去剩余的稀释的溶解/固定缓冲液。

将10μgrhIL-6(R&DSystems，目录号206-IL)溶于1mlPBS0.1%BSA中以获得10μg/ml的储备液。将储备液在-80℃等份贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。对照处理的样品加入DMSO而不是化合物。所有样品用1%终浓度的DMSO温育。

2.4.2.1.1用化合物温育血液并用IL-6刺激

在肝素化试管中收集人血。将血液分成148.5μl的等分试样。然后，向各血液等分试样中加入1.5μl受试化合物稀释液，将血液样品在轻微摇动下于37℃温育30min。向血液样品中加入IL-6储备液(1.5μl)(终浓度10ng/ml)，将样品在轻微摇动下于37℃温育20min。

2.4.2.1.2全血细胞制备和CD4标记

在刺激末期，将3ml预加热的1×溶解/固定缓冲液立即加入到血浆样品中、短暂涡旋并在水浴中于37℃温育15min，以溶解血红细胞和固定白细胞，然后在-80℃冷冻直至进一步使用。

对于下面的步骤，在37℃将试管融解大约20分钟，在400×g于4℃离心5min。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，在离心后，将细胞沉淀物再混悬于100μL含有3%BSA的PBS中。加入FITC-轭合的抗-CD4抗体或者对照FITC-轭合的同种型抗体，在黑暗中于室温温育20min。

2.4.2.1.3细胞透化和用磷酸-STAT1抗体标记

用1×PBS洗涤细胞后，将细胞沉淀物再混悬于100μl冰冷的1×PBS中，加入900μl冰冷的100%甲醇。然后将细胞在4℃温育30min以透化。

然后，将透化的细胞用含有3%BSA的1×PBS洗涤，最终混悬于含有3%BSA的80μl1×PBX中。

加入20μLPE鼠抗-STAT1(pY701)或者PE鼠IgG2aκ同种型对照抗体(BDBiosciences，目录号分别是612564和559319)，混合，接着在黑暗中于4℃温育30min。

然后，将细胞用1×PBS洗涤一次，在FACSCantoII流式细胞仪(BDBiosciences)上分析。

2.4.2.1.4在FACSCantoII上的荧光分析

计数50,000个总事件，在CD4+细胞设门控后测定淋巴细胞门控中的磷酸-STAT1阳性细胞。利用FACSDiva软件分析数据，以CD4+细胞上对磷酸-STAT1而言的阳性细胞的百分数计算IL-6刺激的抑制百分数。

2.4.2.2磷酸–STAT5分析

对于白血细胞中信号转导子及转录激活子5(pSTAT5)磷酸化的GM-CSF-刺激的增加，从知情同意的人志愿者抽取的人全血用化合物离体处理30min，随后用GM-CSF刺激20分钟。通过FACS利用抗磷酸-STAT5抗体测定了单核细胞中经GM-CSF的STAT5磷酸化增加。

将10μgrhGM-CSF(AbCysS.A.，目录号P300-03)溶解于100μl的PBS0.1%BSA中以获得10μg/ml的储备液。将储备液在-80℃等份贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。对照处理的样品加入DMSO而不加入受试化合物。所有样品用1%终浓度的DMSO温育。

2.4.2.2.1用化合物温育血液和用GM-CSF刺激

在肝素化试管中收集人血。将血液分成148.5μl的等分试样。然后，向各等分试样中加入1.5μl化合物稀释液，将血液样品在轻微摇动下于37℃温育30min。向血液样品中加入GM-CSF储备液(1.5μl)(终浓度20pg/ml)，将样品在轻微摇动下于37℃温育20min。

2.4.2.2.2全血细胞制备和CD14标记

在刺激末期，将3ml预温热的1×溶解/固定缓冲液立即加入到血浆样品中、短暂涡旋并在水浴中于37℃温育15min，以溶解血红细胞和固定白细胞，然后在-80℃冷冻直至进一步使用。

对于下面的步骤，在37℃将试管融解大约20分钟，在400×g于4℃离心5min。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，在离心后，将细胞沉淀物再混悬于100μL含有3%BSA的PBS中。加入FITC鼠抗-CD14抗体(BDBiosciences，目录号345784)或者对照FITC鼠IgG2bκ同种型抗体(BDBiosciences，目录号555057)，在黑暗中于室温温育20min。

2.4.2.2.3细胞透化和用抗磷酸-STAT5抗体标记

然后，将透化的细胞用含有3%BSA的1×PBS洗涤，最终再混悬于含有3%BSA的80μl1×PBX中。

加入20μLPE鼠抗-STAT5(pY694)或者PE鼠IgG1κ同种型对照抗体(BDBiosciences，目录号分别是612567和554680)，混合，接着在黑暗中于4℃温育30min。

2.4.2.2.4在FACSCantoII上的荧光分析

计数50,000个总事件，在CD14+细胞设门控后测定磷酸-STAT5阳性细胞。利用FACSDiva软件分析数据，数据相应于根据CD14+细胞上对磷酸-STAT5而言的阳性细胞的百分数计算的GM-CSF刺激的抑制百分数。

实施例3：体内模型

实施例3.1：CIA模型

3.1.1材料

完全Freund佐剂(CFA)和不完全Freund佐剂(IFA)购自Difco。II型牛胶原(CII)、脂多糖(LPS)和Enbrel分别获自Chondrex(Isled’Abeau，法国)、Sigma(P4252,L’Isled’Abeau，法国)、Whyett(25mg注射器，法国)、AcrosOrganics(PaloAlto，CA)。所用的所有其它试剂是试剂级，所有溶剂是分析级。

3.1.2动物

黑色刺豚鼠(雄性，7-8周龄)获自HarlanLaboratories(Maison-Alfort，法国)。使大鼠保持在12小时的明/暗周期(0700-1900)。温度维持在22℃，随意取食和饮水。

3.1.3胶原诱导的关节炎(CIA)

试验前一天，用0.05M乙酸配制CII溶液(2mg/mL)，于4℃贮存。在临免疫前，将等体积的佐剂(IFA)和CII通过匀化器在预冷的玻璃瓶中、在冰水浴中混合。如果没有形成乳液，则需要另外的佐剂和延长匀化。第一天在每只鼠的尾巴根部皮内注射0.2mL乳液，第9天进行第二次加强皮内注射(2mg/mL的CII溶液，在CFA0.1mL盐水中)。该免疫方法是由公开的方法(Sims等人，2004；Jou等人，2005)改良的。

3.1.4研究设计

在大鼠CIA模型中测试化合物的治疗效果。将大鼠随机分入相同的组中，每组包括10只动物。将所有大鼠在第1天免疫，在第9天加强。治疗剂量从第16天持续到第30天。阴性对照组用介质(MC0.5%)处理，阳性对照组用Enbrel(10mg/kg，3×周，s.c.)处理。通常在3个剂量下对感兴趣的化合物进行试验，例如口服3、10、30mg/kg。

3.1.5关节炎的临床评价

根据Khachigian2006；Lin等人,2007和Nishida等人,2004的方法对关节炎进行评分。四爪各自的肿胀是根据如下关节炎评分来评级的：0－无症状；1－轻度，但是一种类型的关节如踝或腕出现明显的发红和肿胀，或者限于单个指/趾的明显的发红和肿胀，不管受侵袭指/趾的数目多少；2－两种或更多种类型的关节出现中度发红和肿胀；3－整个爪、包括指/趾出现严重发红和肿胀；4－最严重发炎的肢，涉及多个关节(每只动物最高累积的临床关节炎得分为16)(Nishida等人,2004)。

为了进行多项研究的荟萃分析，临床评分如下进行标准化：

临床评分的AUC(AUC评分)：计算各个大鼠从第1天至第14天的曲线下面积(AUC)。在本研究中，将各动物的AUC除以对介质而言获得的平均AUC，由此获得该动物的数据并乘以100(即，AUC表示为每次研究的平均介质AUC的百分数)。

从第1天至第14天的临床评分增加(结束点评分)：在本研究中，将各动物的临床评分差除以对介质而言获得的平均临床评分差，由此获得该动物的数据并乘以100(即，差表示为每次研究对于介质而言的平均临床评分差的百分数)。

3.1.6关节炎发作后的体重变化(%)

在临床上，体重减轻与关节炎相关(Shelton等人，2005；Argiles等人，1998；Rall，2004；Walsmith等人，2004)。因此，关节炎发作后的体重变化可以用作非特异性端点以评价在大鼠模型中的治疗效果。如下计算关节炎发作后的体重变化(%)：

小鼠：

大鼠：

3.1.7放射学

拍摄每只个体动物的后爪的X-射线照片。随机设盲的识别号分配给每张照片，骨侵蚀的严重度通过两种独立的评分评级，放射学Larsen评分系统如下：0-正常，具有完整的骨轮廓和正常的关节间隙；1－轻度异常，任意一个或两个外部跖骨显示出轻度骨侵蚀；2－明显的早期异常，任意3至5个外部跖骨显示出骨侵蚀；3－中度破坏性异常，所有外部跖骨以及任意一个或两个内部跖骨显示出明显的骨侵蚀；4－严重破坏性异常，所有跖骨显示出明显的骨侵蚀并且至少一个内部跖关节完全侵蚀，留下一些骨关节轮廓被部分保留；5－残毁性异常，没有骨轮廓。该评分系统是对Salvemini等人,2001；Bush等人,2002；Sims等人,2004；Jou等人,2005进行的改良。

3.1.8组织学

放射学分析后，将小鼠的后爪固定在10%磷酸盐缓冲福尔马林(pH7.4)中，用快速骨脱钙剂脱钙用于精细组织学(LaboratoriesEurobio)并包埋在石蜡中。为了确保深入评价关节炎关节，切割至少4个系列切片(5μm厚)，每个系列的切片之间是100μm。将切片用苏木精和伊红(H&E)染色。滑液炎症以及骨和软骨损伤的组织学检测是双盲进行的。在每个爪中，用4-点等级评价4个参数。这些参数是细胞渗透、关节翳严重性、软骨侵蚀和骨侵蚀。评分如下进行：1－正常，2－轻度，3－中度，4－显著。将这4个评分相加并且表示为另一个得分，即“RA总评分”。

3.1.9跟骨(足跟骨)的微计算机断层摄影术(μCT)分析

RA中观察到的骨退化尤其出现在骨皮质中，可以通过μCT分析来显示(SimsNA等人，ArthritisRheum.50(2004)2338-2346：Targetingosteoclastswithzoledronicacidpreventsbonedestructionincollagen-inducedarthritis;OsteL等人，ECTCMontreal2007：AhighthroughputmethodofmeasuringbonearchitecturaldisturbanceinamurineCIAmodelbymicro-CTmorphometry)。跟骨扫描和3D体积重建后，以每个片层出现的分离目标的数目测定骨退化，所述片层是在垂直于骨纵轴方向在硅中分离的。骨退化的越多，测定到的分离目标就越多。分析了1000个沿根骨均匀分布(间隔约10.8μm)的片层。

3.1.10稳态PK

在第7或11天，用肝素锂作为抗凝剂在眶后窦在下列时间点收集血样：给药前、1、3和6小时。将全血样品离心，将得到的血浆样品在分析前贮存于-20℃。通过LC-MS/MS方法测定各受试化合物的血浆浓度，其中质谱以正电子喷雾模式操作。利用(美国)计算药物动力学参数，假定给药前血浆水平等于24小时的血浆水平。

3.1.11结果

例如，在0.1mg/kg剂量下，化合物21的标准化临床评分值(以AUC或者以第1天至第14天的差计算)显示出统计学上显著的改进。

实施例3.2败血症性休克模型

注射脂多糖(LPS)诱导可溶性肿瘤坏死因子(TNF-α)快速释放入外周。该模型用于体内分析有前景的TNF释放阻断剂。

将每组6只BALB/cJ雌性小鼠(20g)在设定的剂量下口服处理一次。30分钟后，腹膜内注射LPS(15μg/kg；大肠杆菌(E.Coli)血清型0111:B4)。90分钟后，将小鼠处以安乐死并采血。用市售ELISA试剂盒测定循环TNF-α水平。将地塞米松(5μg/kg)用作参比抗炎化合物。

实施例3.3MAB模型

MAB模型允许快速评价治疗对RA-样炎性响应的调节(KachigianLM.NatureProtocols(2006)2512-2516:Collagenantibody-inducedarthritis)。给DBA/J小鼠静脉内注射对抗胶原II的mAbs合剂。1天后，开始用化合物处理(介质：10%(v/v)HPβCD)。3天后，小鼠接受腹膜内注射LPS(50μg/小鼠)，导致炎症的快速发作。继续用化合物处理直至mAB注射后10天。通过测定爪肿胀和记录每只爪的临床评分来表示炎症。四肢的累积临床关节炎评分表示炎症的严重性。评分系统应用于各肢，才有0－4的等级，4表示最严重的炎症。

0无症状

1轻度，但是一种类型的关节如踝或腕出现明显的发红和肿胀，或者限于单个指/趾的明显的发红和肿胀，不管受侵袭指/趾的数目多少

2两种或更多种类型的关节出现中度发红和肿胀

3整个爪、包括指/趾出现严重发红和肿胀

4最严重发炎的肢，涉及多个关节

实施例3.4肿瘤学模型

Wernig等人,CancerCell13,311,2008和Geron等人,CancerCell13,321,2008描述了用于确证小分子对JAK2-驱动的骨髓增殖性疾病的作用的体内模型。

实施例3.5小鼠IBD模型

Wirtz等人,2007描述了用于确证小分子对IBD的作用的体外和体内模型。

实施例3.6小鼠哮喘模型

Nials等人,2008；Ip等人,2006；Pernis等人,2002；Kudlacz等人,2008描述了用于确证小分子对哮喘的作用的体外和体内模型。

实施例4：药物动力学、DMPK和毒性分析

实施例4.1热力学溶解度

在室温下，在玻璃瓶中，将1mg/mL受试化合物溶液配制在0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)或0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)中。

在室温下，将样品在旋转驱动器STR4(StuartScientific，Bibby)中以3.0的速度旋转24小时。

24小时后，将800μL样品转移至eppendorf管中，以14000rpm离心5分钟。然后将200μL样品上清液转移至MultiscreenR溶解度板(Millipore,MSSLBPC50)中，借助真空歧管将上清液过滤(10-12”Hg)至干净的Greiner聚丙烯V底96-孔板(目录号651201)中。将5μL滤液稀释在95μL(F20)缓冲液中，所述缓冲液与在含有标准曲线的板中温育时所用的缓冲液相同(Greiner，目录号651201)。

在DMSO中新鲜配制化合物的标准曲线，从10mMDMSO储备液开始以因子2稀释在DMSO中(5000μM)，然后进一步稀释在DMSO中直至19.5μM。然后将3μL由5000μM产生的稀释系列转移至97μL乙腈-缓冲液混合物(50/50)中。终浓度范围是2.5至150μM。

将板用密封垫(MA96RD-04S，Kinesis,Cambs,PE198YX,UK)密封，于室温在LCMS(ZQ1525，Waters)上在优化条件下采用Quanoptimize对分子进行测定，以确定分子的适宜质量。

将样品在LCMS上以1mL/分钟的流速进行分析。溶剂A是15mM氨，溶剂B是乙腈。样品在Waters的XBridgeC183.5μM(2.1×30mm)柱上以正离子喷雾法展开。溶剂梯度的总运行时间为2分钟，范围是5%B至95%B。

借助Masslynx软件包分析峰面积，将样品的峰面积对标准曲线作图以获得化合物的溶解度。

溶解度值以μM或μg/mL报告。

实施例4.2水溶解度

4.2.1水溶解度2%DMSO操作

从10mM在DMSO中的储备液开始，在DMSO中制备化合物的系列稀释。将稀释系列转移至96NUNCMaxisorb板F底(目录号442404)中，加入处于室温的0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)或0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)。

终浓度范围为200μM至2.5μM，5个等比稀释步骤。DMSO终浓度不超过2%。在每个96-孔板的角落点中加入200μM芘，用作显微镜上校准Z轴的参比点。

将分析板密封并于37℃温育1小时，同时以230rpm振摇。然后将板在白光显微镜下扫描，得到每个浓度的沉淀物的单独图片。对沉淀物进行分析并转换成数值，将其绘制成图。化合物出现完全溶解的第一个浓度是下文报告的浓度，但是真实浓度位于该浓度与一个更高稀释步骤之间的某处。

根据该方案测定的溶解度值以μg/mL报告。

4.2.2水溶解度3%DMSO操作

从10mM在DMSO中的储备液开始，在DMSO中制备化合物的系列稀释。将稀释系列转移至96NUNCMaxisorb板F底(目录号442404)中，加入处于室温的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)或0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)。

终浓度范围为300μM至18.75μM，5个等比稀释步骤。DMSO终浓度不超过3%。在每个96-孔板的角落点中加入200μM芘，用作显微镜上校准Z轴的参比点。

将分析板密封并于37℃温育1小时，同时以230rpm振摇。然后将板在白光显微镜下扫描，得到每个浓度的沉淀物的单独图片。对沉淀物进行分析并用软件工具转换成数值，其可以绘制成图。化合物出现完全溶解的第一个浓度是所报告的浓度；但是真实浓度位于该浓度与一个更高稀释步骤之间的某处。

根据该方案测定的溶解度值以μg/mL报告。

实施例4.3血浆蛋白结合(平衡透析)

将化合物在DMSO中的10mM储备液以因子5稀释在DMSO中。将该溶液进一步稀释在新鲜解冻的人血浆、大鼠血浆、小鼠血浆或狗血浆(BioReclamationINC)中，终浓度为10μM，DMSO终浓度为0.5%(5.5μL，在1094.5μL血浆中，在PP-Masterblock96-孔(Greiner，目录号780285)中)。

制备含嵌入物的PierceRedDevice板(ThermoScientific，目录号89809)，在缓冲液槽中装入750μLPBS，在血浆槽中装入500μL加标血浆。将板在37℃下温育4小时并以230rpm振摇。温育后，将两个槽中120μL转移至96-孔圆底PP深孔板(Nunc，目录号278743)的360μL乙腈中并用铝铂盖密封。将样品混合，在冰上放置30分钟。然后将板在4℃下以1200rcf离心30分钟，将上清液转移至96-孔v底PP板(Greiner，651201)中，用于LCMS分析。

将板用Kinesis,Cambs,PE198YX,UK的密封垫(MA96RD-04S)密封，将样品在室温下在LCMS(ZQ1525，Waters)上在优化条件下采用Quanoptimize进行测量，以测定分子的适宜质量。

将样品在LCMS上以1mL/分钟的流速进行分析。溶剂A是15mM氨，溶剂B是乙腈。样品在Waters的XBridgeC183.5μM(2.1×30mm)柱上以正离子喷雾法展开。溶剂梯度的总运行时间为2分钟，范围为5%B至95%B。

缓冲液槽和血浆槽中的化合物的峰面积被认为是100%化合物。结合血浆的百分数由这些结果产生并且作为结合血浆的百分数报告。

通过显微镜检查PBS中最终试验浓度的化合物的溶解度，以确定是否观察到沉淀。

实施例4.4微粒体稳定性

4.1.4微粒体稳定性1小时温育操作

将化合物在DMSO中的10mM储备液在96深孔板(Greiner，目录号780285)中在182mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中稀释1000倍，在37℃预温育。

将40μL去离子水加入聚丙烯Matrix2D条形码标记的存储管(ThermoScientific)的孔中，在37℃预温育。

在182mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中配制葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)工作储备液，在应用前放置在冰上。在去离子水中配制含有MgCl₂、葡萄糖-6-磷酸和NADP+的辅因子，在应用前放置在冰上

配制含有目标种属(人、小鼠、大鼠、狗)的肝微粒体(Xenotech)、先前描述的G6PDH和辅因子的最终工作溶液，将该混合物在室温下温育不超过20分钟。

将30μL预热的化合物稀释液加入至Matrix管中的40μL预热的水中，加入30μL微粒体混合物。最终反应物浓度是3μM化合物、1mg微粒体、0.4U/mLGDPDH、3.3mMMgCl₂、3.3mM葡萄糖-6-磷酸和1.3mMNADP+。

为测定零时间点的剩余化合物的百分数，在加入微粒体混合物前向孔中加入MeOH或ACN(1:1)。将板用MatrixSeprasealsTM(Matrix，目录号4464)密封并震摇数秒，确保所有组分完全混合。

将未终止的样品在37℃、300rpm下温育，温育1小时后用MeOH或ACN(1:1)终止反应。

终止反应后，将样品混合并在冰上放置30分钟以沉淀蛋白质。然后将板于4℃以1200rcf离心30分钟，将上清液转移至96-孔v底PP板(Greiner，651201)中用于LCMS分析。

将这些板用Kinesis,Cambs,PE198YX,UK的密封垫(MA96RD-04S)密封，将样品于室温在LCMS(ZQ1525，Waters)上在优化条件下采用Quanoptimize进行测量，以测定母分子的适宜质量。

将样品在LCMS上以1mL/分钟的流速进行分析。溶剂A是15mM氨，溶剂B是甲醇或乙腈，这取决于所用的终止溶液。样品在Waters的XBridgeC183.5μM(2.1×30mm)柱上以正离子喷雾法展开。溶剂梯度的总运行时间为2分钟，范围为5%B至95%B。

0时间点的母化合物的峰面积被认为是100%剩余。1小时温育后的剩余百分数是从0时间点计算的，计算成剩余百分数。通过显微镜检查缓冲液中最终试验浓度的化合物的溶解度，报告结果。

微粒体稳定性的数据表示为60分钟后剩余化合物总量的百分数。

4.4.2微粒体稳定性30mn温育操作

将化合物在DMSO中的10mM储备液在96深孔板(Greiner，目录号780285)中的105mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中稀释至6μM，于37℃预温热。

将700U/ml的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH,Roche,10127671001)工作储备液在105mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中以1:700的因子稀释。将含有0.528MMgCl₂.6H₂O(Sigma,M2670)、0.528M葡萄糖-6-磷酸(Sigma,G-7879)和0.208MNADP+(Sigma,N-0505)的辅因子混合物在105mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中以1:8的因子稀释。

配制含有1mg/ml目标种属(人、小鼠、大鼠、狗等)的肝微粒体(Provider,Xenotech)、0.8U/mlG6PDH和辅因子混合物(6.6mMMgCl₂、6.6mM葡萄糖-6-磷酸、2.6mMNADP+)的工作溶液。将混合物在室温下预温育15分钟，但不能超过20分钟。

预温育后，将化合物稀释液和含有微粒体的混合物等量加在一起，以300rpm温育30分钟。对于0分钟的时间点，在加入微粒体混合物前向化合物稀释液中加入两体积的甲醇。温育期间的终浓度为：3μM受试化合物或对照化合物、0.5mg/ml微粒体、0.4U/mlG6PDH、3.3mMMgCl₂、3.3mM葡萄糖-6-磷酸和1.3mMNaDP+。

温育30分钟后，用2体积甲醇终止反应。

对于两个时间点，将样品混合、离心，收集上清液用于LC-MS/MS分析。将仪器反应(即峰高)参比为0时间点样品(作为100%)以确定化合物剩余的百分数。在分析设计中包括了标准化合物普萘洛尔(Propanolol)和维拉帕米(Verapamil)。

微粒体稳定性的数据表示为30分钟后剩余化合物总量的百分数。

实施例4.5Caco2渗透率

如下所述进行双向Caco-2分析。Caco-2细胞获自欧洲细胞培养物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures)(ECACC，目录号86010202)，细胞培养21天后在24-孔Transwell板(FisherTKT-545-020B)中应用。

将2×10⁵个细胞/孔接种在含有DMEM+GlutaMAXI+1%NEAA+10%FBS(FetalCloneII)+1%Pen/Strep的平面培养基中。每隔2-3天更换培养基。

将受试化合物和参比化合物(普萘洛尔和罗丹明123或长春花碱，均购自Sigma)配制在含有25mMHEPES(pH7.4)的Hanks平衡盐溶液中，在10μM的浓度下(DMSO终浓度为0.25%)下加入至Transwell板装置的顶端槽(125μL)或底外侧槽(600μL)中。

将50μM荧光黄(Sigma)加入至所有孔的供体缓冲液中，通过监测荧光黄渗透来评价细胞层的完整性。由于荧光黄(LY)不能自由透过脂类屏障，所以高的LY转运表示细胞层的完整性差。

于37℃温育1小时同时以150rpm在定轨摇床上震摇后，从顶端槽(A)和底部槽(B)中各取出70μL等分试样，加入至在96孔板中的100μL含有分析内标(0.5μM卡马西平)的50:50乙腈:水溶液中。

在含有取自底外侧和顶侧的150μL液体的干净96孔板中用SpectramaxGeminiXS(Ex426nm，Em538nm)进行荧光黄测定。

通过高效液相色谱/质谱(LC-MS/MS)测定样品中化合物的浓度。

通过下面关系式计算表观渗透率(P_app)值：

P_app=[化合物]_受体最终×V_受体/([化合物]_供体初始×V_供体)/T_温育×V_供体/表面积×60×10^-6cm/s

V=槽的体积

T_inc=温育时间

表面积=0.33cm²

应用P_appB>A/P_appA>B的比值计算流出比作为顶端细胞表面主动流出的指标。

应用下面的分析接受标准：

普萘洛尔：P_app(A>B)值≥20(×10^-6cm/s)

罗丹明123或长春花碱：P_app(A>B)值<5(×10^-6cm/s)，流出比≥5。

荧光黄渗透率：≤100nm/s

实施例4.6啮齿动物中的药物动力学研究

4.6.1动物

Sprague-Dawley大鼠(雄性，5－6周龄)获自Janvier(法国)。治疗前使大鼠适应至少7天，保持12小时明/暗周期(0700-1900)。温度维持在约22℃，随意摄食和饮水。施用受试化合物前两天，将大鼠在异氟烷麻醉下进行手术以在颈静脉放置导管。手术后，使大鼠单独居住。口服给药前至少16小时和给药后6小时，大鼠不能进食。随意饮水。

4.6.2药物动力学研究

对于静脉内途经，将化合物配制在PEG200/生理盐水(60/40)中，对于口服途经，将化合物配制在0.5%甲基纤维素和10%羟丙基-β-环糊精pH3中。受试化合物以5mg/kg和以5ml/kg的给药体积作为单独食管管饲口服给药，以1mg/kg和以5mL/kg的给药体积作为尾静脉推注经静脉内给药。每组包括3只大鼠。经颈静脉用肝素锂作为抗凝剂在下列时间点采集血样：0.05、0.25、0.5、1、3、5和8小时(静脉内途经)和0.25、0.5、1、3、5、8小时和24小时(口服途经)。将全血样品以5000rpm离心10分钟，将所得血浆样品在-20℃下保存待分析。

4.6.3血浆中化合物水平的定量

通过LC-MS/MS方法测定每个受试化合物的血浆浓度，其中质谱以正离子电喷雾模式操作。

4.6.4药物动力学参数的测定

应用(美国)可以计算药物动力学参数。

实施例4.77-天大鼠毒性研究

受试化合物的7-天口服毒性研究在Sprague-Dawley雄性大鼠中进行以评价它们的中毒可能性和毒物动力学，日剂量为100、300和500mg/kg/天，管饲法，恒定剂量-体积为5mL/kg/天。

将受试化合物配制在HPβCD的30%(v/v)纯水溶液中。对于毒物动力学，每组包括5只主要(principal)雄性大鼠和3只随伴(satellite)动物。第4组以相同的频率、剂量体积和通过相同的施用途径仅给予HPβCD的30%(v/v)水溶液，用作介质对照组。

该研究的目的是测定不产生可鉴别的副作用事件的最低剂量(没有可观察到的副作用的水平-NOAEL)。

实施例4.8肝细胞稳定性

McGinnity等人，DrugMetabolismandDisposition2008，32，11，1247描述了评价肝细胞中代谢清除率的模型。

实施例4.9QT延长的易感性

在hERG膜片钳分析中评价了QT延长的可能性。

常规完整细胞膜片钳

应用Pulsev8.77软件(HEKA)控制的EPC10放大器记录完整细胞膜片钳。串联电阻通常小于10MΩ并且补偿大于60%，记录没有漏减。电极是GC150TF吸管式玻璃制成的(Harvard)。

外部浴溶液含有：135mMNaCl、5mMKCl、1.8mMCaCl₂、5mM葡萄糖、10mMHEPES,pH7.4。

内部贴片吸管溶液含有：100mMKgluconate、20mMKCl、1mMCaCl₂、1mMMgCl₂、5mMNa₂ATP、2mM谷胱甘肽、11mMEGTA、10mMHEPES,pH7.2。

药物是应用生物学MEV-9/EVH-9快速灌流系统灌注的。

在稳定表达hERG通道的HEK293细胞上进行所有记录。在应用两根铂棒(Goodfellow)固定在记录槽中的12mm圆形盖玻片(德国玻璃，Bellco)上培养细胞。应用激活脉冲诱发hERG电流：+40mV，1000ms，随后是尾电流脉冲：-50mV，2000ms，保持电位是-80mV。每隔20秒应用一次脉冲，所有试验在室温下进行。

参考文献

ArgilesJM,Lopez-SorianoFJ.(1998)Catabolicproinflammatorycytokines(分解代谢促炎细胞因子).CurrOpinClinNutrMetabCare.1:245-51.

Bundgard,H.,DesignofProdrugs,pp.7-9,21-24,Elsevier,Amsterdam1985

BushKA,FarmerKM,WalkerJS,KirkhamBW.(2002)Reductionofjointinflammationandboneerosioninratadjuvantarthritisbytreatmentwithinterleukin-17receptorIgG1Fcfusionprotein(通过用白介素-17受体IgG1Fc融合蛋白治疗减少大鼠佐剂性关节炎中的关节炎症和骨侵蚀).ArthritisRheum.46:802-5.

ChoyEH,PanayiGS.(2001).NEnglJMed.344:907-16.

ChubinskayaS和KuettnerKE(2003).Regulationofosteogenicproteinsbychondrocytes(软骨细胞对成骨蛋白的调节).Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology35(9)1323-1340.

CleggD.O.等人(2006)NEnglJMed.2006354:795-808.Glucosamine,chondroitinsulfate,andthetwoincombinationforpainfulkneeosteoarthritis(葡糖胺、硫酸软骨素和两者组合用于疼痛的膝骨关节炎).

Constantinescu等人,2007,TrendsinBiochemicalSciences33(3):122-131

FiresteinGS.(2003).Nature.423:356-61.

Geron等人(2008)SelectiveinhibitionofJAK2-drivenerythroiddifferentiationofpolycythemiaveraprogenitors(选择性抑制真性红细胞增多症前体的JAK2-驱动的红细胞分化).CancerCell13(4),321-30

Ip等人(2006)Interleukin(IL)-4andIL-13up-regulatemonocytechemoattractantprotein-1expressioninhumanbronchialepithelialcells:involvementofp38mitogen-activatedproteinkinase,extracellularsignal-regulatedkinase1/2andJanuskinase-2butnotc-JunNH2-terminalkinase1/2signallingpathways(白介素(IL)-4和IL-13上调人支气管上皮细胞中的单核细胞化学趋化蛋白质-1表达：涉及p38分裂原活化的蛋白激酶、胞外信号调节激酶1/2和Janus激酶-2、而不是c-JunNH2-末端激酶1/2信号传导途径),Clin.Exp.Immun,162-172.

JouIM,ShiauAL,ChenSY,WangCR,ShiehDB,TsaiCS,WuCL.(2005)Thrombospondin1asaneffectivegenetherapeuticstrategyincollagen-inducedarthritis(凝血酶敏感蛋白1作为胶原诱导性关节炎中的有效基因治疗策略).ArthritisRheum.52:339-44.

Khachigian,L.M.Collagenantibody-inducedarthritis(胶原抗体诱导的关节炎).(2006)NatureProtocols1,2512-6.

Kopf等人(2010)Nat.Rev.DrugDisc.,703-718

Kudlacz等人(2008)TheJAK-3inhibitorCP-690550isapotentanti-inflammatoryagentinamurinemodelofpulmonaryeosinophilia(在肺嗜酸粒细胞增多鼠模型中JAK-3抑制剂CP-690550是有效的抗炎剂),EurJPharmaco154-161.

LeeDM,WeinblattME(2001).Lancet.358:903-11.

LegendreF,DudhiaJ,PujolJ-P,BogdanowiczP.(2003)JAK/STATbutnotERK1/ERK2pathwaymediatesinterleuking(IL)-6/solubleIL-6Rdown-regulationoftypeIIcollagen,aggrecancore,andlinkproteintranscriptioninarticularchondrocytes(JAK/STAT而不是ERK1/ERK2途径介导白介素(IL)-6/可溶性IL-6R下调关节软骨细胞中的II型胶原、聚集蛋白聚糖核和连接蛋白转录).JBiolChem.278(5)2903-2912.

LevyD.和LoomisC.NewEnglandJournalofMedicine357(2007)1655-1658:STAT3signalingandtheHyper-IgE-syndrome(STAT3信号通路和Hyper-IgE-综合征)

LiWQ,DehnadeF,ZafarullahM.(2001)OncostatinM-inducedmatrixmetalloproteinaseandtissueinhibitorofmetalloproteinase-3genesexpressioninchondrocytesrequiresjanuskinase/STATsignalingpathway(软骨细胞中制瘤素M诱导的基质金属蛋白酶和金属蛋白酶-3基因表达的组织抑制剂需要janus激酶/STAT信号传导途径).(2001)JImmunol166:3491-3498.

LinHS,HuCY,ChanHY,LiewYY,HuangHP,LepescheuxL,BastianelliE,BaronR,RawadiG,Clément-LacroixP.(2007)Anti-rheumaticactivitiesofhistonedeacetylase(HDAC)inhibitorsinvivoincollagen-inducedarthritisinrodents(在啮齿动物中胶原诱导的关节炎中组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂的体内抗风湿性活性).BrJPharmacol.Apr;150(7):862-872.

McGinnity等人,DrugMetabolismandDisposition2004,32,11,1247.

MullighanCG,ZhangJ,HarveyRC,Collins-UnderwoodJR,SchulmanBA,PhillipsLA,TasianSK,LohML,SuX,LiuW,DevidasM,AtlasSR,ChenI-M,CliffordRJ,GerhardDS,CarrollWL,ReamanGH,SmithM,DowningJR,HungerSPWillmaneCL;(2009)JAKmutationsinhigh-riskchildhoodacutelymphoblasticleukemia(高危幼年急性淋巴细胞白血病中JAK突变),PNASMay22.[印刷出版前的电子出版]

Nials等人(2008)MouseModelsofAllergicAsthma:AcuteandChronicAllergenChallenge(过敏性哮喘的小鼠模型：急性和慢性变应原攻击),DiseaseModels&Mechanisms,213-220.

NishidaK,KomiyamaT,MiyazawaS,ShenZN,FurumatsuT,DoiH,YoshidaA,YamanaJ,YamamuraM,NinomiyaY,InoueH,AsaharaH.(2004)Histonedeacetylaseinhibitorsuppressionofautoantibody-mediatedarthritisinmiceviaregulationofp16INK4aandp21(WAF1/Cip1)expression(组蛋白脱乙酰基酶抑制剂通过调节p16INK4a和p21(WAF1/Cip1)的表达来抑制小鼠中自身抗体介导的关节炎).ArthritisRheum.10:3365-76.

O’SheaJ.等人,NatureReviewDrugDiscovery3(2004)555-564:Anewmodalityforimmunesuppresion:targetingtheJAK/STATpathway(免疫抑制的新模式：靶向JAK/STAT通路)

O’Sullivan等人,2007,MolImmunol.44(10):2497-506

O'DellJR.(2004)Therapeuticstrategiesforrheumatoidarthritis(类风湿性关节炎的治疗策略).NEnglJMed.350(25):2591-602.

OsakiM,TanL,ChoyBK,YoshidaY,CheahKSE,AuronPE,GoldringMB.(2003)TheTATA-conatiningcorepromoterofthetypeIIcollagengene(COL2A1)isthetargetofinterferon-gamma-mediatedinhibitioninhumanchondrocytes:requirementforSTAT1alpha,JAK1andJAK2(人软骨细胞中II型胶原基因(COL2A1)的含TATA核心启动子是干扰素-γ-介导的抑制的靶标：需要STAT1α、JAK1和JAK2).BiochemJ369:103-115.

OteroM,LagoR,LagoF,GomezReinoJJ,GualilloO.(2005)SignallingpathwayinvolvedinnitricoxidesynthasetypeIIactivationinchondrocytes:synergisticeffectofleptinwithinterleukin-1(涉及软骨细胞中一氧化氮合成酶II活化的信号传导途径：瘦素和白介素-1的协同效应).ArthritisResearch&Therapy7:R581-R591.

Pernis等人(2002)JAK-STATsignalinginasthma(哮喘中JAK-STAT信号传导)J.Clin.Invest.1279.

Remington’sPharmaceuticalSciences,第17版,1985,Mack出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚

RodigSJ,MerazMA,WhiteJM,LampePA,RileyJK,ArthurCD,KingKL,SheehanKCF,YinL,PennicaD,JohnsonEM,SchreiberRD.(1998)DisruptionoftheJak1genedemonstratesobligatoryandnonredundantrolesofthejaksincytokine-inducedbiologicresponses(Jak1基因的断裂表明jak在细胞因子诱导的生物学响应中的强制性和非冗余的作用)Cell93:373-383.

SalveminiD,MazzonE,DugoL,SerrainoI,DeSarroA,CaputiAP,CuzzocreaS.(2001)Ameliorationofjointdiseaseinaratmodelofcollagen-inducedarthritisbyM40403,asuperoxidedismutasemimetic(通过超氧化物歧化酶模拟物M40403改善胶原诱导的关节炎大鼠模型中的关节病).ArthritisRheum.44:2909-21.

SheltonDL,ZellerJ,HoWH,PonsJ,RosenthalA.(2005)Nervegrowthfactormediateshyperalgesiaandcachexiainauto-immunearthritis(神经生长因子介导自身免疫关节炎中的痛觉过敏和恶病质).Pain.116:8-16.

SimsNA等人,(2004)Targetingosteoclastswithzoledronicacidpreventsbonedestructionincollagen-inducedarthritis(用唑来膦酸靶向破骨细胞防止胶原诱导的关节炎中的骨破坏),ArthritisRheum.502338-2346:

SmolenJS,SteinerG.(2003).NatRevDrugDiscov.2:473-88.

T.W.Greene和P.G.M.Wuts,ProtectingGroupsinOrganicSynthesis(有机合成中的保护基),第2版,Wiley,纽约,1991

Tam等人,2007,BritishJournalofCancer,97,378–383

TetsujiNaka,NorihiroNishimotoandTadamitsuKishimoto,ArthritisRes2002,4(增刊3):S233-S242

VainchenkerW.等人,SeminarsinCell&DevelopmentalBiology19(2008)385-393:JAKsinpathology:RoleofJanuskinasesinhematopoieticmalignanciesandimmunedeficiencies(病理学中的JAKs：Janus激酶在造血肿瘤和免疫不足中的作用)

Vandeghinste等人(WO2005/124342)

WalsmithJ,AbadL,KehayiasJ,RoubenoffR.(2004)Tumornecrosisfactor-alphaproductionisassociatedwithlessbodycellmassinwomenwithrheumatoidarthritis(肿瘤坏死因子-α的产生与患有类风湿性关节炎女性中较少体细胞质量相关).JRheumatol.;31:23-9.

Wernig等人(2008)EfficacyofTG101348,aselectiveJAK2inhibitor,intreatmentofamurinemodelofJAK2V617F-inducedpolycythemiavera(选择性JAK2抑制剂TG101348用于治疗鼠模型的JAK2V617F-诱导的真性红细胞增多症的效力),CancerCell13(4),311-320

WielandHA,MichaelisM,KirschbaumBJ,RudolphiKA.(2005).NatRevDrugDiscov.4:331-44.Osteoarthritis-anuntreatabledisease?(骨关节炎-不治之症？)

Wirtz等人(2007)MouseModelsofInflammatoryBowelDisease(炎性肠病的小鼠模型),AdvancedDrugDeliveryReviews,2007,1073-1083:

Xiang等人,2008,“IdentificationofsomaticJAK1mutationsinpatientswithacutemyeloidleukemia”(急性髓性白血病症者中JAK1体突变的鉴定)111-9;Blood;4809-4812

将本说明书中引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)引入文中作为参考，如同每个单独的出版物都具体并且单独引入文中作为参考，如同已经进行全部描述。

本领域技术人员将理解，前述说明本质上是示例性和解释性的，并且意在解释说明本发明及其优选实施方案。根据上面的说明，本领域技术人员可以想到对本发明的组合物和方法进行多种修改和变化，并且这些修改和变化可以在不背离本发明宗旨的情况下进行。权利要求范围内出现的所有这些修改均包括在本发明的范围内。

应当理解：因素(例如不同化合物的不同的细胞渗透能力)可以促成体外生物化学分析和细胞分析中化合物活性之间的差异。

可以通过应用市售化学命名软件程序自动产生本申请中给出和描述的本发明的化合物的至少一些化学名称，这些名称没有单独进行查证。执行这项功能的代表性程序包括OpenEyeSoftware,Inc.销售的Lexichem命名工具和MDL,Inc.销售的AutonomSoftware工具。在其中所给化学名和所绘结构不同的情况下，以所绘结构为准。

采用或/DRAW制作本文所示的化学结构。本文结构中碳、氧或氮原子上出现的任意开放的化合价表示存在氢原子。如果结构中存在手性中心但对于该手性中心没有显示具体的立体化学，则该结构包括与手性结构相关的两个对映异构体。

Claims

1.式I化合物或可药用盐:

其中

Cy1是C_6-10芳基或5-10元杂芳基；

R¹选自C_1-6烷基和C_3-7环烷基，其各自任选被一个或多个卤素、CN或OH取代；

R²各自独立地选自卤素；CN；OH；任选被一个或多个选自卤素、CN、OH和C_1-4烷氧基的基团取代的C_1-6烷基；和任选被一个或多个选自卤素、CN、OH和C_1-4烷氧基的基团取代的C_1-6烷氧基；

L不存在或选自-O-、-C(O)-、-N(R⁵)-、-CON(R⁵)-、-SO₂N(R⁵)-、-S(O)₂-、-N(R⁵)CO-、-N(R⁵)SO₂；

Y不存在或是任选被一个或多个卤素或CN取代的C_1-4亚烷基；

R³选自H；卤素；CN；任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的C_6-10芳基；任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的C_3-7环烷基；任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的4-7元杂环烷基；和任选被一个或多个独立选择的R^3a基团取代的5-10元杂芳基；或

R³选自-OR^3b、-NHR^3b、-C(＝O)R^3b、-C(＝O)NHR^3b和-SO₂NHR^3b；

R^3a各自独立地选自H；OH；卤素；CN；氧代基；任选被一个或多个卤素、C_1-4烷氧基或CN取代的C_1-4烷基；任选被一个或多个卤素或C_1-4烷氧基取代的C_1-4烷氧基；任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代的氨基；任选被C_1-4烷基或C_3-7环烷基取代的-C(＝O)NH₂；C_1-4硫代烷氧基；4-7元杂环烷基；-S(O)R⁶；-S(O)₂R⁶；-C(＝O)R⁶；-C(＝O)OR⁶；和-NHC(＝O)R⁶；

R^3b独立地选自C_1-6烷基；任选被一个或多个卤素或C_1-4烷基取代的苯基；C_3-7环烷基；和任选被一个或多个卤素或C_1-4烷基取代的4-7元杂环烷基；

R⁴是H、卤素、CN或C_1-4烷基；

R⁵是H或C_1-4烷基；

R⁶是H或C_1-4烷基；

下标m是0、1或2。

2.根据权利要求1的化合物或其可药用盐，其中m是1。

3.根据权利要求2的化合物或其可药用盐，其中R²是OH、CN、卤素、任选被一个或多个卤素取代的C_1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C_1-6烷氧基。

4.根据权利要求1的化合物或其可药用盐，其中Cy1是苯基。

5.根据权利要求1的化合物或其可药用盐，其中Cy1是吡啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、唑基、噻唑基、呋喃基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并二烷基、苯并唑基、喹啉基或异喹啉基。

6.根据权利要求1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIa或IIb化合物:

其中R³、R⁴、L和Y如在权利要求1中所述，且X是CH、CF或N。

7.根据权利要求1的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIIa-IIIj化合物:

其中X是CH、CF或N且R³如在权利要求1中所述。

8.根据权利要求7的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIIc、IIId、IIIi或IIIf化合物，且R³选自:

其中R^3a如在权利要求1中所述。

9.根据权利要求8的化合物或其可药用盐，其中R^3a是H、卤素、C_1-4烷基、-S(O)₂Me或-C(＝O)OMe。

10.根据权利要求7的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是式IIIe-IIIh化合物中的任意一个，其中R³是:

其中R^3a如在权利要求1中所述。

11.根据权利要求10的化合物或其可药用盐，其中R^3a是H、CN或卤素。

12.根据权利要求1-11任一项的化合物或其可药用盐，其中X是N、CH或CF。

13.化合物或其可药用盐，其中所述化合物是:

N-(4-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(4-(苄基氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(1-苄基-1H-吲哚-5-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(1H-吲哚-5-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)-N-苯乙基苯甲酰胺

4-(2-(环丙烷甲酰氨基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)-N-(2-苯氧基乙基)苯甲酰胺

N-(4-(4-(吡啶-3-基甲氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(4-((6-氰基吡啶-3-基)甲氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-3-氟-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-3-溴-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺

环丙烷甲酸{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-3-氯-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺

环丙烷甲酸{4-[4-(哌啶-1-羰基)-苯基]-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-酰胺

N-(4-(4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(3-氯-4-(4-(哌啶-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(3-氯-4-(4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(3-氯-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

4-(乙酰氨基吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基)苄基)哌嗪-1-甲酸甲酯

N-(4-(6-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(5-氟-6-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-{4-[4-(1,1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-3-氟-苯基]-吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-乙酰胺

N-(4-(3-氟-4-((4-(2,2,2-三氟乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(3-氟-4-((4-(甲磺酰基)哌啶-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(6-(2-(1H-吡唑-1-基)乙基1H-吡唑-1-基)乙氧基)-5-氟吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(4,4-二甲基唑烷-3-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(氮杂环丁烷-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(2-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(2-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(2-氧代-2-(哌啶-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(2-吗啉代基-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(2-((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉代基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(2-(4,4-二甲基唑烷-3-基)-2-氧代乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉-4-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(哌啶-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(吗啉-4-羰基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

(R)-N-(4-(4-((2-甲基-4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)乙酰胺

(R)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺

(S)-N-(4-(4-(1-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)苯基)吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙烷甲酰胺，或

14.药物组合物，包含可药用载体和药用有效量的权利要求1-13任一项的化合物或其可药用盐。

15.根据权利要求14的药物组合物，其包含另外的治疗剂。

16.权利要求1-13任一项的化合物或其可药用盐或者权利要求14或15的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防过敏、炎性病症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

17.根据权利要求16的用途，其中所述自身免疫性疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型突发性关节炎和炎性肠病。