CN107998136A

CN107998136A - 用于治疗炎症的氨基三唑并吡啶及其药物组合物

Info

Publication number: CN107998136A
Application number: CN201810014031.0A
Authority: CN
Inventors: G·A·E·范特克罗斯特; R·C·X·布莱斯; L·J·C·范尤帕伊; F·S·纳莫
Original assignee: Galapagos NV
Current assignee: Galapagos NV
Priority date: 2012-06-22
Filing date: 2013-06-10
Publication date: 2018-05-08
Also published as: JP2015520198A; IL235923B; PH12014502615A1; TW201400114A; BR112014031626A2; CA2875619C; PL2863950T3; UA112804C2; US20130345209A1; AR091395A1; HRP20181364T1; ES2685985T3; US9284311B2; MA37775A1; CN104379173A; CA2875619A1; KR102078069B1; CL2014003462A1; SI2863950T1; TWI586352B

Abstract

本发明涉及式I化合物的新医学用途，具体而言其用于治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。具体而言，所述的化合物抑制JAK(酪胺酸激酶家族)，且更具体而言JAK1。本发明也提供包括所述的化合物的药物组合物、通过施用所述的化合物来预防和/或治疗涉及以下疾病的方法：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多有关的疾病。

Description

用于治疗炎症的氨基三唑并吡啶及其药物组合物

本申请是中国专利申请201380032159.5的分案申请，原申请的申请日是2013年6月10日，名称是“用于治疗炎症的氨基三唑并吡啶及其药物组合物”。

发明领域

本发明涉及本发明式I化合物的医学用途。具体而言，本发明涉及本发明式I化合物在治疗以下疾病中的用途：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。具体而言，所述的化合物抑制JAK(酪胺酸激酶家族)，且更具体而言JAK1。本发明也提供包括所述的化合物的药物组合物和通过施用本发明式I化合物来预防和/或治疗包含以下疾病的方法：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

Janus激酶(JAK)是将细胞因子信号自膜受体转导至STAT转录因子的细胞质酪胺酸激酶。阐述四个JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。在细胞因子结合至其受体后，JAK家族成员自磷酸化和/或彼此转磷酸化、之后STAT发生磷酸化，随后磷酸化STAT迁移至细胞核以调节转录。JAK-STAT细胞内信号转导作用于干扰素、大多数白介素以及各种细胞因子和内分泌因子，例如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF和PRL(Vainchenker W.等人(2008))。

遗传模型和小分子JAK抑制剂研究的组合公开若干种JAK的治疗潜力。

JAK1是免疫-炎症性疾病领域的靶标。JAK1与其他JAK发生异源二聚化以转导细胞因子引发的促炎症信号传导。因此，令人感兴趣的是，通过抑制JAK1来治疗免疫-炎症性疾病(具有使用JAK1信号传导的与病理学相关的细胞因子，例如IL-6、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、IL-23或IFNγ)以及由JAK介导的信号转导引发的其他疾病。

在JAK家族成员的作用中，存在一些重迭，这是由于大多数信号传导路径涉及一种以上的JAK，然而对于一些生长因子(例如红细胞生成素和促血小板生成素)仅涉及JAK2。

JAK3在经由传递由白介素(IL)-2产生的信号来阻断免疫功能中起主要作用。

另一方面，TYK2似乎将与JAK2和JAK3组合作用以转导诸如IL-12和IL-23等细胞因子的信号传导。

已使用JAK家族成员中的每一种缺失的小鼠对JAK酶的作用进行了主要研究。由于细胞因子通过JAK1的信号传导存在缺陷，JAK1敲除的小鼠呈现围产期致死表型且也具有缺陷性淋巴发育和功能。由于定向型红系造血失败，JAK2缺陷在第12天时导致胚胎致死性。JAK3缺陷型小鼠具有严重的合并的免疫缺陷(SCID)表型但并不具有非免疫性缺陷(Verstovsek，2009，Hematology Am Soc Hematol Educ Program.，636-42)。

如使用泛JAK抑制剂已观察到，非选择性抑制可能与诸如以下等副作用相关：贫血、感染率增加、嗜中性和淋巴细胞计数较少、血红蛋白减少和胆固醇含量升高(ElieDolgin，2011，Nature Reviews Drug Discovery 10，717-718)。

因此，研发出选择性JAK抑制剂将有益于最小化这样的副作用。

背景技术

软骨退化是多种疾病的标志，其中类风湿性关节炎和骨关节炎最显著。类风湿性关节炎(RA)是一种慢性关节退化性疾病，其特征在于关节结构炎症和受到破坏。若不对该疾病加以抑制，则其会导致实质失能及因丧失关节功能而引发的疼痛以及甚至过早死亡。因此，RA治疗的目标不仅在于减缓疾病且在于达到好转以终止关节破坏。除疾病结果的严重性外，RA的高患病率(全世界约0.8％的成人受侵袭)也意味着高的社会-经济影响。(关于RA的综述参见Smolen和Steiner(2003)；Lee和Weinblatt(2001)；Choy和Panayi(2001)；O′Dell(2004)和Firestein(2003))。

JAK1参与许多细胞因子及激素的细胞内信号转导。可通过JAK1抑制剂来改善与这样的细胞因子及激素中的任一种相关的病况。因此，若干过敏、炎症及自体免疫障碍可获益于本发明所述化合物的治疗，这样的障碍包含类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、幼年型特发性关节炎、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、组织纤维化、嗜酸性炎症、食道炎、炎症性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎)、移植、移植物抗宿主疾病、银屑病、肌炎、银屑病性关节炎、关节黏连性脊椎炎、幼年型特发性关节炎、多发性硬化(Kopf等人，2010)。

银屑病是可侵袭皮肤的疾病。然而，并未完全了解银屑病的原因，人们相信其是与细胞因子(具体而言TNFα)释放相关的免疫介导相关疾病，其引起炎症及皮肤细胞的快速再现。此假设已经以下观察结果证实：免疫阻抑药物可清除银屑病斑块(Zenz R、Eferl R、Kenner L等人(2005)“Psoriasis-like skin disease and arthritis caused byinducible epidermal deletion of Jun proteins”。Nature 437(7057)：369-75)。

银屑病也可导致关节炎症，此称为银屑病性关节炎。银屑病患者总人数的10％-30％也患有银屑病性关节炎(Committee for Medicinal Products for Human Use(CHMP)(2004年11月18日)。“Guideline on Clinical Investigation of Medicinal Productsindicated for the treatment of Psoriasis”)。银屑病因其慢性复发性质而难以治疗。最近已证实抑制JAK可成功改善银屑病病症。(Punwani等人，(2012)“Preliminaryclinical activity of a topical JAK1/2 inhibitor in the treatment ofpsoriasis”J Am Acad Dermatol.，67，4，658-664)。

炎症性肠病(IBD)是一组结肠和小肠的炎症性病症。IBD的主要类型是克罗恩氏病及溃疡性结肠炎。最近已经由全基因组关联(genome-wide association，GWAS)研究发现，T细胞蛋白酪胺酸磷酸酶(TCPTP)是JAK/STAT及生长因子受体磷酸酶，其已通过GWAS与1型糖尿病、类风湿性关节炎及克罗恩氏病的发病机制相关联(Zikherman等人，J ClinInvest.2011Dec；121(12)：4618-21)。因此，抑制JAK路径可能提供治疗IBD的方式。

人们已发现在包含骨髓增生性障碍的其他病症中也涉及JAK家族成员(O′Sullivan等人，2007，Mol Immunol.44(10)：2497-506)，其中已鉴别出JAK2中的突变。此表明JAK(尤其JAK2)的抑制剂也可用于治疗骨髓增生性障碍。此外，JAK家族(尤其JAK1、JAK2及JAK3)与癌症(尤其白血病，例如急性髓性白血病(O′Sullivan等人，2007，MolImmunol.44(10)：2497-506；Xiang等人，2008，“Identification of somatic JAK1mutations in patients with acute myeloid leukemia”Blood First Edition Paper，2007年12月26日在线预公开；DOI 10.1182/blood-2007-05-090308)及急性成淋巴细胞性白血病(Mullighan等人，2009))、皮肤T细胞淋巴瘤(Zhang等人，1996，PNAS，93，9148-9153)或实体肿瘤(例如子宫平滑肌肉瘤(Constantinescu等人，2007，Trends in BiochemicalSciences 33(3)：122-131)、前列腺癌(Tam等人，2007，British Journal of cancer，97，378-383)及乳腺癌(Berishaj等人，2007，Breast cancer Research 9：R32))相关。这样的结果表明，JAK(尤其JAK1)的抑制剂也可用于治疗癌症(白血病及实体肿瘤(例如子宫平滑肌肉瘤、前列腺癌))。

此外，卡斯尔曼病(Castleman′s disease)、多发性骨髓瘤、系膜增生性肾小球肾炎、银屑病及卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)可能是由于细胞因子IL-6分泌过多所致，细胞因子IL-6的生物效应是由细胞内JAK-STAT信号传导介导(Tetsuji Naka、NorihiroNishimoto和Tadamitsu Kishimoto，Arthritis Res 2002，4(增刊3)：S233-S242)。此结果显示，JAK抑制剂也可用于治疗这样的疾病。

当前疗法并不令人满意且因此本领域仍需要鉴别其他可用于治疗以下疾病的化合物：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎。

此外，这样的病症是需要长期治疗且重复摄取药物的慢性病症。长期治疗可能对患者及医师一样均是沉重负担，这是由于患者可能无法耐受或变得无法耐受药物，且此外高剂量或高剂量频率可能引起不适副作用和/或低患者依从性，其中该患者可能偶然、有意或意外地错过一次给药。不遵从性对慢性疾病的影响有所不同，且介于最低至极显著范围内。(Ingersoll等人，2008J Behav Med.；31(3)：213-224)。

因此，本领域需要鉴别出更多化合物以增强医师的手段，及具有低频率剂量方案的化合物以改善患者的生活。

为发现新药品，通常设定标准以鉴别出最适宜的候选药物，因此，许多化合物在体外模型中经快速评价，且若其不满足这样的标准则同样快速放弃。体外研究通常具有高于活体内研究的通量且对决策作出过程有极大帮助。因此，通常预期体外模型可预测药物的体内行为，且放弃表面上看似乎在体外将不提供适宜特征的化合物。在此背景下，所研究的式I化合物显示不够令人感兴趣的体外特征，然而尤其在人类中的体内研究显示其出乎意料的性质。

发明概述

本发明基于以下发现：本发明式I化合物可用作药物。在具体方面中，本发明式I化合物是JAK、且更具体而言JAK1的抑制剂。

本发明也提供生产本发明式I化合物的方法、包含本发明式I化合物的药物组合物和通过施用本发明式I化合物来预防和/或治疗以下疾病的方法：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，特别是类风湿性关节炎。

因此，在本发明的第一方面中，提供本发明的化合物用于药品中，所述的化合物具有式I：

令人惊奇的是，本发明式I化合物在人类体内呈现与其他动物物种显著不同的特征，此与体外预测相反。实际上，已在人类体内证实，本发明式I化合物的表观末端半衰期明显是其他动物物种中的至少3倍以上。此导致所述的化合物在人类中蓄积从而使治疗作用维持较长时间段，由此允许每天一次至每周一次给药。因此，本发明式I化合物可提供包含低频率剂量方案和/或增加患者依从性在内的优点。具体而言，若患者错过一次给药，则可降低不遵从性的影响。

在具体方面中，提供本发明式I化合物用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其是类风湿性关节炎。

在又一方面中，本发明提供包括本发明式I化合物及药学载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在具体方面中，药物组合物可另外包括适于与本发明式I化合物组合使用的其他治疗活性成份。在更具体方面中，又一治疗活性成份是用于治疗关节炎的化合物。在最具体方面中，又一治疗活性成份是用于治疗类风湿性关节炎的化合物。

此外，可用于本文所公开的药物组合物和治疗方法中的本发明式I化合物在制备及使用时都为药学可接受的。

在本发明的又一方面中，本发明提供治疗易患或患有选自本文所列的病症的哺乳动物(尤其人类)的方法：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，更尤其类风湿性关节炎，该方法包括施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物或本发明式I化合物。

本发明也提供包含本发明式I化合物及适宜药学载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物，其用于药品中。在具体方面中，药物组合物用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎。

在其他方面中，本发明提供合成本发明式I化合物的方法，其中代表性合成方案及路径将稍后公开于本文中。

通过考虑随后的详细说明，本领域技术人员将明了其他目的及优点。

附图简述

图1：显示在用本文所公开的化合物治疗后大鼠CIA临床评分。

图2：显示在用本文所公开的化合物治疗后大鼠CIA模型中踝直径的进化。

图3：显示式II化合物的体外代谢特征。

图4：显示施用式II化合物时所测定的式I：式II的暴露比率(以AUC表示)。

图5：显示在施用式II化合物后所公开化合物的暴露水平的值，以IC₅₀值的倍数表示。

图6：显示在施用式II化合物后式I及式II化合物在24h时段内暴露水平的合并值，以IC₅₀值的倍数表示。

发明详述

定义

下列术语意欲具有下文所呈现关于其的含义且可用于理解本发明的说明及既定范围。

当描述本发明(其可包含化合物、含有这样的化合物的药物组合物及使用这样的化合物及组合物的方法)时，除非另有说明，否则下列术语(若存在)具有下列含义。也应理解，当于本文中描述时，任何下文所定义的部分都可经各种取代基取代，且各自的定义意欲将这样的被取代部分包含于其下述范围内。除非另有说明，否则术语“被取代”如下文所述来定义。应进一步理解，在本文中使用时认为术语“基团(group)”与“基团(radical)”可互换使用。

本文可使用的冠词“一(a和an)”是指一个或一个以上(即至少一个)的该冠词的文法受词。例如，“一个类似物”意指一个类似物或一个以上的类似物。

如本文中所使用的术语“JAK”涉及Janus激酶(JAK)家族，其是将细胞因子信号自膜受体转导至STAT转录因子的细胞质酪胺酸激酶。描述了以下4个JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，且术语JAK可如上下文所指示是指全部所有JAK家族成员或JAK家族成员中一个或多个。

“药学上可接受”意指已获得联邦或州政府管理机构或除美国外的国家的相应机构批准或可获得批准或已列于美国药典(US Pharmacopeia)或其他公认药典中，其用于动物(且更具体而言用于人类)中。

“药学可接受的盐”是指药学上可接受且具有母体化合物的期望药理学活性的式I化合物的盐。具体而言，这样的盐是无毒的，可为无机或有机酸加成盐和碱加成盐。特定而言，这样的盐包含：(1)酸加成盐，由无机酸形成，这样的无机酸是(例如)盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或由有机酸形成，(例如)乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子经金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代时或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等)配位时形成的盐。盐进一步包含(仅举例而言)钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；且当化合物含有碱性官能团时，为无毒性有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“药学可接受的阳离子”是指可接受的酸性官能团的阳离子抗衡离子。这样的阳离子示例为钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等。

“药学可接受的媒剂”是指与式I化合物一起施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或载体。

“溶剂合物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂结合的化合物形式。此物理结合包含氢键结。常规溶剂包含水、乙醇、乙酸等。式I化合物可以(例如)结晶形式制备且可呈溶剂合或水合形式。适宜溶剂合物包含药学可接受的溶剂合物(例如水合物)，且进一步包含化学计量溶剂合物及非化学计量溶剂合物。在某些情形下，例如当一或多个溶剂分子纳入结晶固体的晶格中时，溶剂合物将能够解离。“溶剂合物”涵盖溶液相及可解离溶剂合物。代表性溶剂合物包含水合物、乙醇合物及甲醇合物。

“个体”包含人类。术语“人类”、“患者”及“个体”在本文中可互换使用。

“治疗有效量”意指当施用于个体以治疗疾病时化合物足以实现此疾病治疗的量。“治疗有效量”可根据所述的化合物、疾病及其严重程度以及欲治疗个体的年龄、体重等而变化。

“防止”(preventing或prevention)是指降低患上或发生疾病或障碍的风险(即在疾病发作前使得在可能暴露于致病剂或易感染该疾病的个体中不出现该疾病的至少一种临床症状)。

术语“预防”是指“防止”，且是指目的为防止而非治疗或治愈疾病的措施或程序。预防性措施的非限制性实例可包含施用疫苗；向由于(例如)缺少运动而具有血栓形成风险的住院患者施用低分子量肝素；及在拜访疟疾是地方病或感染疟疾的风险较高的地理区域时提前施用抗疟疾剂(例如氯喹(chloroquine))。

在一个实施方案中，任一疾病或障碍的“治疗(Treating或treatment)”是指改善该疾病或障碍(即阻止该疾病或减缓其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，“治疗”是指改善个体不能感受到的至少一个物理参数。在又一个实施方案中，“治疗”是指在物理方面调节疾病或障碍(例如稳定可感受到的症状)或在生理学方面调节疾病或障碍(例如稳定物理参数)或二者。在又一个实施方案中，“治疗”是指减缓疾病进展。

如本文所使用，术语“炎症性病症”是指包含以下的病症：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型特发性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、炎症性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、内毒素引发的疾病状态(例如搭桥手术后并发症或促成(例如)慢性心力衰竭的慢性内毒素状态)及涉及软骨的相关疾病(例如关节的相关疾病)。具体而言，该术语是指类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘.)及炎症性肠病。

如本文所使用，术语“自体免疫疾病”是指包含以下的疾病：阻塞性气道疾病(包含例如以下的病症：COPD、哮喘(例如内源性哮喘、外源性哮喘、粉尘性哮喘或婴儿型哮喘)、尤其慢性或顽固性哮喘(例如迟发性哮喘及气道高反应性)、支气管炎(包含支气管炎哮喘)、全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤性红斑狼疮(CLE)、多发性硬化、I型糖尿病及其相关并发症、异位性湿疹(异位性皮炎)、接触性皮炎及其他湿疹性皮炎、炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)、动脉粥样硬化及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化。具体而言，该术语是指COPD、哮喘、I型糖尿病及炎症性肠病。

如本文所使用，术语“增殖性疾病”是指诸如以下等病症：癌症(例如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、骨髓增生性障碍(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症及骨髓纤维化)、白血病(例如急性髓性白血病及急性淋巴细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、银屑病、再狭窄、硬化性皮炎或纤维化。具体而言，该术语是指癌症、白血病、多发性骨髓瘤及银屑病。

如本文所使用，术语“癌症”是指皮肤或身体器官(例如但不限于乳房、前列腺、肺、肾脏、胰脏、胃或肠)中细胞的恶性或良性赘生物。癌症易于渗入邻近组织且扩散(转移)至远端器官，例如骨、肝脏、肺或脑。如本文所使用，术语癌症包含转移性肿瘤细胞类型(例如但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及肥胖细胞瘤)及组织癌瘤类型(例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌及非小细胞肺癌、乳腺癌、胰脏癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胶质母细胞瘤、原发性肝癌、卵巢癌、前列腺癌及子宫平滑肌肉瘤)。

如本文所使用，术语“白血病”是指血液及血液形成器官的瘤形成疾病。这样的疾病可造成骨髓及免疫系统功能障碍，此致使宿主极易受感染及出血影响。具体而言，术语白血病是指急性髓性白血病(AML)及急性成淋巴细胞白血病(ALL)。

如本文所使用，术语“移植排斥”是指(例如)胰岛、干细胞、骨髓、皮肤、肌肉、角膜组织、神经元组织、心脏、肺、组合的心脏-肺、肾脏、肝脏、肠、胰脏、气管或食道的细胞、组织或实体器官同种-或异种移植物的急性或慢性排斥或移植物抗宿主疾病。

如本文所使用，术语“涉及软骨代谢损伤的疾病”包含诸如以下等病症：骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、痛风性关节炎、败血性或感染性关节炎、反应性关节炎、反射性交感神经营养障碍、痛性营养障碍、提策(Tietze)综合征或肋软骨炎、纤维肌痛、骨软骨炎、神经原性或神经病性关节炎、关节病、关节炎的地方性形式(例如地方性变形性骨关节炎)、Mseleni病及Handigodu病；由纤维肌痛、全身性红斑狼疮、硬皮病及关节粘连性脊椎炎造成的退化。

如本文所使用，术语“先天软骨畸形”包含诸如以下等病症：遗传性软骨溶解、软骨发育不全及假软骨发育不全、尤其(但不限于)小耳畸形、无耳畸形、干骺端软骨发育不全及相关障碍。

如本文所使用，术语“与IL6分泌过多相关的疾病”包含诸如以下等病症：卡斯尔曼病、多发性骨髓瘤、银屑病、卡波西氏肉瘤和/或系膜增生性肾小球肾炎。

如本文所使用，术语“与干扰素分泌过多相关的疾病”包含诸如以下等病症：全身性及皮肤性红斑狼疮、狼疮肾炎、皮肌炎、休格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)、银屑病、类风湿性关节炎。

“本发明化合物”及等效表述意欲涵盖如前文所述的式I或式II化合物(如上下文所指示)，若上下文允许，则该表述包含药学上可接受的盐及溶剂合物(例如水合物)及药学上可接受的盐的溶剂合物。相似地，当提及中间体时，不论其本身是否提出申请，若上下文允许，则其意欲涵盖其盐及溶剂合物。

本发明化合物的其他衍生物以其酸及酸衍生物形式都具有活性，但酸敏感形式在哺乳动物生物体中通常提供溶解度、组织兼容性或延迟释放优点(参见Bundgard，H.，Design of Prodrugs，第7-9页，第21-24页，Elsevier，Amsterdam 1985)。

如本文所使用，术语“同位素变体”是指于构成化合物之一或多个原子处以非天然比例含有同位素的所述的化合物。例如，化合物的“同位素变体”可含有一或多个非放射性同位素，例如氘(²H或D)、碳-13(¹³C)、氮-15(¹⁵N)等。应了解，在进行该同位素取代的化合物中，下列原子(若存在)可改变以使(例如)任一氢可为²H/D、任一碳可为¹³C或任一氮可为¹⁵N，且本领域技术人员可决定这样的原子的存在及替换。同样，在(例如)所得化合物可用于药物和/或基质组织分布研究中的情形下，本发明可包含制备具有放射性同位素的同位素变体。放射性同位素氚(即³H)及碳-14(即¹⁴C)因易于纳入且容易检测而尤其可用于此目的。此外，可制备经正电子发射同位素(例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O及¹³N)取代的化合物且这样的化合物可在正电子发射断层扫描(PET)研究中用来检查基质受体占据情况。

本文所提供化合物的所有同位素变体，不管是放射性还是非放射性，都意欲涵盖于本发明范围内。

“互变异构体”是指具有具体化合物结构的相互转换形式且在氢原子及电子置换方面不同的化合物。因此，两种结构可经由π电子及原子(通常为H)移动来达到平衡。例如，烯醇及酮是互变异构体，因为其可通过使用酸或碱处理快速地发生互变。互变异构现象的另一实例是苯基硝基甲烷的酸式及硝基形式，其同样通过使用酸或碱处理形成。

互变异构形式可能与达成目标化合物的最佳化学反应性及生物活性相关。

本发明

本发明也提供生产本发明式I化合物的方法、包含本发明式I化合物的药物组合物和通过施用本发明式I化合物来预防和/或治疗以下疾病的方法：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，更具体地是类风湿性关节炎。

因此，在本发明的第一个实施方案中提供本发明式I化合物，其用于药品中，所述的化合物具有式I：

在本发明的另一个实施方案中提供为JAK抑制剂的本发明化合物，其用于药品中，所述的化合物具有式I：

令人惊奇的是，本发明式I化合物在人类体内呈现与其他动物物种显著不同的特征，此与体外预测相反。实际上，已在人类体内证实，本发明式I化合物的表观末端半衰期明显是其他动物物种的至少3倍。这导致所述的化合物在人类中蓄积从而使治疗作用维持较长时间段，由此允许每天一次至每周一次给药。因此，本发明式I化合物可提供包含低频率剂量方案和/或增加患者依从性在内的优点。具体而言，若患者错过一次给药，则可降低不遵从性的影响。

在一个实施方案中，本发明式I化合物并非同位素变体。

在一方面中，本发明式I化合物以游离碱形式存在。

在一方面中，本发明式I化合物是药学上可接受的盐。

在一方面中，本发明式I化合物是本发明式I化合物的溶剂合物。

在一方面中，本发明式I化合物是本发明式I化合物的药学上可接受的盐的溶剂合物。

本发明式I化合物是JAK抑制剂。具体而言，本发明式I化合物是JAK1的强效抑制剂，然而其可抑制JAK2、JAK3及TYK2且具有较低效能。

在又一实施方案中，本发明提供包括本发明式I化合物及药学载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

在又一个实施方案中，药物组合物进一步包含另一治疗剂。在具体方面中，另一化合物是用于治疗关节炎的化合物。在更具体方面中，另一化合物是用于治疗类风湿性关节炎的化合物。在最具体的实施方案中，又一治疗剂是本发明式II化合物：

药物组合物

在用作药物时，本发明式I化合物通常以药物组合物形式施用。这样的组合物可以药学领域众所周知的方式制备且包括至少一种本发明式I的活性化合物。通常，本发明式I化合物以药学有效量施用。本发明式I化合物的实际施用量通常将由医师根据包含以下在内的相关情况来确定：所治疗的病症、所选施用途径、实际施用的本发明式I化合物、个体患者的年龄、体重及反应、患者症状的严重程度等。

本发明的药物组合物可通过包含口服、直肠、经皮、皮下、关节内、静脉内、肌内及鼻内在内的多种途径施用。根据既定递送途径，将本发明式I化合物优选配制为可注射或口服组合物或配制为都用于经皮施用的洗液或贴片。

用于口服施用的组合物可采取散装液体溶液或悬浮液或散装粉末形式。然而，更通常地，这样的组合物以单位剂型呈现以有利于精确给药。术语“单位剂型”是指适于作为单一剂量用于人类个体及其他哺乳动物的物理离散单位，各单位含有经计算可产生期望治疗作用的预定量的活性材料以及适宜药学赋形剂、媒剂或载体。典型单位剂型包含液体组合物的预填充、预测定安瓿或注射器或在固体组合物的情形下包含丸剂、片剂、胶囊等。在这样的组合物中，本发明式I化合物通常是次要组份(约0.1重量％至约50重量％或优选约1重量％至约40重量％)，且剩余部分是有利于形成期望剂型的各种媒剂或载体及处理助剂。

适于口服施用的液体形式可包含具有缓冲液、悬浮及分散剂、着色剂、矫味剂等的适宜水性或非水性媒剂。固体形式可包含(例如)以下成份中的任一种或具有相似性质的本发明化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、淀粉羟基乙酸钠或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶质二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷或橙味矫味剂。

可注射组合物通常基于可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域已知的其他可注射载体。如前文所述，这样的组合物中的本发明式I的活性化合物通常是次要组份，通常占约0.05重量％至10重量％，且剩余部分是可注射载体等。

通常将经皮组合物配制为局部软膏或乳霜，其含有通常介于约0.01重量％至约20重量％、优选约0.1重量％至约20重量％、优选约0.1重量％至约10重量％且更优选约0.5重量％至约15重量％之间的量的活性成份。当配制为软膏时，活性成份通常将与石蜡或水可混溶软膏基质组合。或者，可使用(例如)水包油乳霜基质将活性成份配制成乳霜。这样的经皮制剂已为本领域所众所周知且通常包含其他成份以增强活性成份或制剂的真皮渗透性或稳定性。所有这样的已知经皮制剂及成份均包含于本发明范围内。

本发明式I化合物也可通过经皮装置施用。因此，经皮施用可使用贮库或多孔膜型贴片或固体基质类贴片来实现。

可口服施用、可注射或局部施用的组合物的上述组份仅具代表性。其他材料以及处理技术等阐述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985，MackPublishing公司，Easton，Pennsylvania的第8部分中，该文件以引用方式并入本文作为参考。

本发明式I化合物也可以持续释放形式或自持续释放药物递送系统施用。代表性持续释放材料的说明可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences。

下列制剂实例示例可根据本发明制备的代表性药物组合物。然而，本发明并不限于下列药物组合物。

制剂1-片剂

可将本发明式I化合物与干燥明胶粘合剂以约1∶2的重量比混合成干燥粉末。可添加少量硬脂酸镁作为润滑剂。该混合物可在压片机中形成240-270mg片剂(80-90mg本发明式I的活性化合物/片剂)。

制剂2-胶囊

可将本发明式I化合物与淀粉稀释剂以约1∶1的重量比混合成干燥粉末。该混合物可填充成250mg胶囊(125mg本发明式I的活性化合物/胶囊)。制剂3-液体

可将本发明式I化合物(125mg)与蔗糖(1.75g)及黄原胶(4mg)混合且可混合所得混合物、使其通过10号网目美国筛，且然后与先前制备的微晶纤维素及羧甲基纤维素钠(11∶89，50mg)于水中的溶液混合。可用水稀释苯甲酸钠(10mg)、矫味剂及着色剂且边搅拌边添加。然后边搅拌边添加足量水。然后可进一步添加足量水以产生5mL的总体积。

制剂4-片剂

可将本发明式I化合物与干燥明胶粘合剂以约1∶2的重量比混合成干燥粉末。可添加少量硬脂酸镁作为润滑剂。该混合物可在压片机中形成450-900mg片剂(150-300mg本发明式I的活性化合物)。

制剂5-注射剂

可将本发明式I化合物于缓冲无菌盐水可注射水性介质中溶解或悬浮至约5mg/mL的浓度。

制剂6-局部制剂

可在约75℃下将硬脂醇(250g)及白石蜡脂(250g)熔融且然后可添加溶于水(约370g)中的本发明式I化合物(50g)、对羟基苯甲酸甲酯(0.25g)、对羟基苯甲酸丙酯(0.15g)、月桂基硫酸钠(10g)及丙二醇(120g)的混合物且可搅拌所得混合物直至其凝结为止。

治疗方法

在一个实施方案中，本发明提供包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于药品中。在具体实施方案中，本发明提供包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎。

在另一个实施方案中，本发明提供包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于制造用来预防和/或治疗以下疾病的药物：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，且尤其是类风湿性关节炎。

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明式I化合物及另一治疗剂的药物组合物。在具体实施方案中，另一治疗剂是关节炎治疗剂。在更具体实施方案中，另一治疗剂是类风湿性关节炎治疗剂。在最具体实施方案中，另一治疗剂是式II化合物。

在其他治疗方法方面中，本发明提供预防和/或治疗易患或患有炎症性病症的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的本发明式I化合物或一种或多种药物组合物。在特定实施方案中，炎症性病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)及炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防炎症性病症。在特定实施方案中，炎症性病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)及炎症性肠病。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于制造用来治疗或预防炎症性病症的药物。在特定实施方案中，炎症性病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)及炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。

在治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有过敏反应的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。在特定实施方案中，本发明提供治疗或预防过敏性气道疾病、鼻窦炎、湿疹和/或荨麻疹、食物过敏或昆虫毒素过敏的方法。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防过敏反应。在特定实施方案中，本发明提供治疗或预防过敏性气道疾病、鼻窦炎、湿疹和/或荨麻疹、食物过敏或昆虫毒素过敏的方法。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于制造用来治疗或预防过敏反应的药物。在特定实施方案中，本发明提供治疗或预防过敏性气道疾病、鼻窦炎、湿疹和/或荨麻疹、食物过敏或昆虫毒素过敏的方法。

在其他治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有自体免疫疾病的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。在特定实施方案中，自体免疫疾病选自类风湿性关节炎、COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病性关节炎、关节黏连性脊椎炎、幼年型特发性关节炎及炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。在更特定实施方案中，自体免疫疾病是全身性红斑狼疮。在又一更特定实施方案中，自体免疫疾病是类风湿性关节炎或银屑病性关节炎。在又一更特定实施方案中，自体免疫疾病是炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防自体免疫疾病。在特定实施方案中，自体免疫疾病选自类风湿性关节炎、COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病性关节炎、关节黏连性脊椎炎、幼年型特发性关节炎及炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。在更特定实施方案中，自体免疫疾病是全身性红斑狼疮。在又一更特定实施方案中，自体免疫疾病是类风湿性关节炎或银屑病性关节炎。在又一更特定实施方案中，自体免疫疾病是炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于制造用来治疗或预防自体免疫疾病的药物。在特定实施方案中，自体免疫疾病选自类风湿性关节炎、COPD、哮喘、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、银屑病性关节炎、关节黏连性脊椎炎、幼年型特发性关节炎及炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。在更特定实施方案中，自体免疫疾病是全身性红斑狼疮。在又一更特定实施方案中，自体免疫疾病是类风湿性关节炎或银屑病性关节炎。在又一更特定实施方案中，自体免疫疾病是炎症性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)。

在其他治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有增殖性疾病的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。在特定实施方案中，增殖性疾病是癌症(例如实体瘤，例如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、乳腺癌、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病。在更特定实施方案中，增殖性疾病是银屑病。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防增殖性疾病。在特定实施方案中，增殖性疾病是癌症(例如实体瘤，例如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、乳腺癌、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病。在更特定实施方案中，增殖性疾病是银屑病。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于制造用来治疗或预防增殖性疾病的药物。在特定实施方案中，增殖性疾病是癌症(例如实体瘤，例如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、乳腺癌、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病。在更特定实施方案中，增殖性疾病是银屑病。

在其他治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有移植排斥的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。在特定实施方案中，本发明提供治疗或预防器官移植排斥的方法。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防移植排斥。在特定实施方案中，本发明提供治疗或预防器官移植排斥的方法。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于制造用来治疗或预防移植排斥的药物。在特定实施方案中，本发明提供治疗或预防器官移植排斥的方法。

在治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有涉及软骨代谢损伤的疾病的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防涉及软骨代谢损伤的疾病。

本发明也提供治疗或预防先天性软骨畸形的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包括本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防先天性软骨畸形。

在其他治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有与IL6分泌过多相关的疾病的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。在特定实施方案中，与IL6分泌过多相关的疾病选自卡斯尔曼病及系膜增生性肾小球肾炎。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防与IL6分泌过多相关的疾病。在特定实施方案中，与IL6分泌过多相关的疾病选自卡斯尔曼病及系膜增生性肾小球肾炎。

在其他治疗方法方面中，本发明提供治疗或预防易患或患有与干扰素分泌过多相关的疾病的哺乳动物的方法，这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述用于治疗或预防该病症的一种或多种药物组合物或本发明式I化合物。在特定实施方案中，与干扰素分泌过多相关的疾病选自全身性及皮肤性红斑狼疮、狼疮肾炎、皮肌炎、休格伦氏综合征、银屑病及类风湿性关节炎。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物，其用于治疗或预防与干扰素分泌过多相关的疾病。在特定实施方案中，与干扰素分泌过多相关的疾病选自全身性及皮肤性红斑狼疮、狼疮肾炎、皮肌炎、休格伦氏综合征、银屑病及类风湿性关节炎。

本发明方法的具体方案包括向患有涉及炎症的疾病、尤其类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和/或炎症性肠病的个体施用治疗有效量的本发明式I化合物足够时间段以减轻个体的炎症程度，且优选终止造成该炎症的过程。该方法的特定实施方案包括向患有或易患类风湿性关节炎的个体患者施用治疗有效量的本发明式I化合物足够时间段以分别减轻或预防该患者关节中的炎症，且优选地终止造成该炎症的过程。

本发明方法的另一具体方案包括向患有特征在于软骨或关节降解的疾病或病症(例如类风湿性关节炎和/或骨关节炎)的个体施用治疗有效量的本发明式I化合物足够时间段以减轻且优选终止造成该降解的自身延续性过程。该方法的具体实施方案包括向患有或易患骨关节炎的个体患者施用治疗有效量的本发明式I化合物足够时间段以分别减轻或预防该患者关节中的软骨降解，且优选终止造成该降解的自身延续性过程。在具体实施方案中，该本发明式I化合物可呈现软骨合成代谢和/或抗分解代谢性质。

在一方面中，本发明提供本发明式I化合物，其用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎，其中所述的化合物以一至四(1-4)次常规剂量/天、且尤其一至三(1-3)次常规剂量/天、通常一至二(1-2)次常规剂量/天、且最通常一(1)次常规剂量/天来施用。

在另一方面中，本发明提供本发明式I化合物，其用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎，其中所述的化合物以两周时段内一至十三(1-13)次常规剂量来施用。在特定实施方案中，式I化合物以两周时段内一至十二(1-12)次、一至十(1-10)次或二至七(2-7)次常规剂量来施用。在特定实施方案中，本发明式I化合物基于每周一次施用。

在又一方面中，本发明提供本发明式II化合物，其用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎，其中所述的化合物以两周时段内一至十三(1-13)次常规剂量来施用。在特定实施方案中，式II化合物以两周时段内一至十二(1-12)次、一至十(1-10)次或二至七(2-7)次常规剂量来施用。在特定实施方案中，本发明式II化合物基于每周一次施用。

在又一方面中，本发明提供本发明式I化合物与本发明式II化合物的组合，其用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎，其中所述的化合物以每天一至四(1-4)次常规剂量，且尤其每天一至三(1-3)次常规剂量，通常每天一至二(1-2)次常规剂量，且最通常每天一(1)次常规剂量来施用。

在又一方面中，本发明提供本发明式I化合物与本发明式II化合物的组合，其用于预防和/或治疗炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病，尤其类风湿性关节炎，其中所述的化合物以两周时段内一至十三(1-13)次常规剂量来施用。在特定实施方案中，本发明式I化合物与本发明式II化合物的组合以两周时段内一至十二(1-12)次、一至十(1-10)次或二至七(2-7)次常规剂量来施用。在特定实施方案中，本发明式I化合物与本发明式II化合物的组合基于每周一次来施用。

注射剂量值介于约0.1mg/kg/h至至少10mg/kg/h之间，其都在约1h至约120h及尤其24h至96h内施用。也可施用约0.1mg/kg至约10mg/kg或更高剂量的预装载浓注，以达成适当稳态值。预计40kg至80kg人类患者的最大总剂量不超过约1g/天。

为预防和/或治疗长期病症(例如退化性病症)，治疗方案通常延长至数月或数年，因此口服给药对患者因为便利性及耐受性是优选的。口服给药时，代表性疗程为每天一至四(1-4)次常规剂量，尤其每天一至三(1-3)次常规剂量，通常每天一至二(1-2)次常规剂量，且最通常每天一(1)次常规剂量。或者，对于长效性药物，口服给药时，代表性疗程为每隔一周一次、每周一次及每天一次。具体而言，剂量疗程可每1-14天一次，更尤其1-10天、甚至更尤其1-7天且最尤其1-3天一次。

使用这样的给药模式，各剂量提供约1-约1000mg/kg本发明式I化合物，其中具体剂量各自提供约10-约500mg且尤其约30-约250mg/kg本发明式I化合物。

使用这样的给药模式，各剂量提供约1-约1000mg/kg本发明式II化合物，其中具体剂量各自提供约10-约500mg且尤其约30-约250mg/kg本发明式II化合物。

通常选择经皮给药以提供相似于或低于使用注射给药达成的血液水平。

当用于预防病症发作时，通常可根据建议且在医师监督下、以上文所述的剂量值对具有罹患该病症风险的患者施用本发明式I化合物。具有罹患具体病症风险的患者通常包含那些具有该病症的家族病史者或那些已通过基因测试或筛选确定尤其易于罹患该病症者。

本发明式I化合物可作为单一活性药物施用或其可与其他治疗剂组合施用，这样的其他治疗剂包括呈现相同或相似治疗活性的本发明其他化合物及已确定可安全且有效地进行该组合施用的其他化合物。在特定实施方案中，两种(或更多种)药物的共施用可显著降低每种药物的使用剂量，由此减轻所见副作用。

在一个实施方案中，施用作为药物的本发明式I化合物或包含本发明式I化合物的药物组合物。在特定实施方案中，该药物组合物另外包括又一活性成份。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防涉及炎症的疾病；具体药物包含(但不限于)免疫调节剂(例如硫唑嘌呤(azathioprine))、皮质类固醇(例如泼尼松龙(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone))、环磷酰胺、环孢素A、他克莫司(tacrolimus)、麦考酚酸吗乙酯(Mycophenolate Mofetil)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3，OKT3，例如)、ATG、阿司匹林(aspirin)、乙酰氨基酚、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)及吡罗昔康(piroxicam)。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防关节炎(例如类风湿性关节炎)；具体药物包含(但不限于)镇痛药、非类固醇抗炎药(NSAIDS)、类固醇、合成DMARDS(例如(但不限于)甲氨蝶呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、金诺芬(auranofin)、金硫丁二钠(sodiumaurothiomalate)、青霉胺(penicillamine)、氯喹、羟基氯喹(hydroxychloroquine)、硫唑嘌呤、托法替尼(tofacitinib)、白瑞西替尼(baricitinib)、福他替尼(fostamatinib)及环孢素)及生物DMARDS(例如(但不限于)英利昔单抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)、阿达木单抗(Adalimumab)、利妥昔单抗(Rituximab)及阿巴他塞(Abatacept))。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防增生性障碍；具体药物包含(但不限于)：甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸(leukovorin)、多柔比星(adriamycin)、泼尼松(prednisone)、博来霉素(bleomycin)、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、多柔比星、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2单克隆抗体(例如Herceptin^TM)、卡培他滨(capecitabine)、盐酸雷洛昔芬(raloxifenehydrochloride)、EGFR抑制剂(例如Tarceva^TM、Erbitux^TM)、VEGF抑制剂(例如Avastin^TM)、蛋白酶体抑制剂(例如VelcadeTM)、或hsp90抑制剂(例如17-AAG)。此外，可将本发明式I化合物与其他疗法(包含(但不限于)放射疗法或外科手术)组合施用。在特定实施方案中，增生性障碍选自癌症、骨髓增生疾病或白血病。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防自体免疫疾病；具体药物包括(但不限于)：糖皮质素、细胞生长抑制剂(例如嘌呤类似物)、烷基化药物(例如氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、本发明的铂化合物及其他)、抗代谢药物(例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤及巯基嘌呤)、细胞毒抗生素(例如放线菌素D蒽环类(dactinomycinanthracyclines)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素及光辉霉素(mithramycin))、抗体(例如抗CD20、抗CD25或抗CD3(OTK3)单克隆抗体，及)、环孢素、他克莫司、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫斯(sirolimus))、干扰素(例如IFN-β)、TNF结合蛋白(例如英夫利昔单抗、依那昔普或阿达木单抗)、麦考酚酯(mycophenolate)、芬戈莫德(Fingolimod)及多球壳菌素(Myriocin)。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防移植排斥；具体药物包含(但不限于)：钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司(everolimus))、抗增殖药物(例如硫唑嘌呤、麦考酚酸(mycophenolic acid))、皮质类固醇(例如泼尼松龙、氢化可体松(hydrocortisone))、抗体(例如单克隆IL-2Rα受体抗体、巴利昔单抗(basiliximab)、达珠单抗(daclizumab))、多克隆抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG))。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防哮喘和/或鼻炎和/或COPD，具体药物包含(但不限于)：β2-肾上腺受体激动剂(例如沙丁胺醇(salbutamol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林(terbutaline)及比托特罗(bitolterol))、肾上腺素(吸入式或片剂)、抗胆碱药(例如异丙托溴铵)、糖皮质素(口服或吸入)、长效β2-激动剂(例如沙莫特罗(salmeterol)、福莫特罗(formoterol)、班布特罗(bambuterol)及缓释口服沙丁胺醇(albuterol))、吸入式类固醇及长效支气管扩张剂的组合(例如氟替卡松(fluticasone)/沙莫特罗、布地奈德(budesonide)/福莫特罗)、白三烯拮抗剂及合成抑制剂(例如孟鲁司特(montelukast)、扎鲁司特(zafirlukast)及齐留通(zileuton))、介导剂释放抑制剂(例如色苷酸盐及酮替芬(ketotifen))、IgE反应的生物调节剂(例如奥马佐单抗(omalizumab))、抗组胺药(例如西替利嗪(ceterizine)、桂利嗪(cinnarizine)、非索非那定(fexofenadine))及血管收缩剂(例如氧甲唑啉(oxymethazoline)、塞洛唑啉(xylomethazoline)、那法唑啉(nafazoline)及曲马唑啉(tramazoline))。

此外，可组合施用本发明式I化合物与应急疗法用于哮喘和/或COPD，这样的疗法包含氧或氦氧混合剂(heliox)施用、雾化沙丁胺醇或特布他林(任选与抗胆碱药(例如异丙托铵)组合)、全身性类固醇(口服或静脉内，例如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙(methylprednisolone)、地塞米松或氢化可体松)、静脉内沙丁胺醇、非特异性β-激动剂(注射或吸入，例如肾上腺素、异他林、异丙基肾上腺素、间羟异丙基肾上腺素)、抗胆碱药(静脉内或雾化，例如格隆溴铵(glycopyrrolate)、阿托品(atropine)、异丙托铵)、甲基黄嘌呤(茶碱、胺茶碱、苄胺茶碱)、具有支气管扩张作用的吸入麻醉剂(例如异氟烷、氟烷、恩氟烷)、氯胺酮及静脉内硫酸镁。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防炎症性肠病(IBD)，具体药物包含(但不限于)：改质疾病的合成糖皮质素(例如泼尼松、布地奈德)、免疫调节剂(例如甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉秦(mesalazine)、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤及环孢素)及生物疾病改质、免疫调节剂(英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗及阿巴他塞)。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防SLE，具体药物包含(但不限于)：改质疾病的抗风湿药(DMARD)，例如抗疟疾药(例如plaquenil，羟氯喹)、免疫阻抑剂(例如甲氨蝶呤及硫唑嘌呤)、环磷酰胺及麦考酚酸；免疫阻抑药及镇痛药，例如非类固醇抗炎药、鸦片剂(例如右旋丙氧芬(dextropropoxyphene)及复方可待因及扑热息痛(co-codamol))、类鸦片(例如氢可酮(hydrocodone)、羟可酮(oxycodone)、美施康定(MS Contin)或美沙酮(methadone))及芬太尼(fentanyl，duragesic)经皮贴片。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防银屑病，具体药物包含(但不限于)：局部治疗剂，例如含有以下物质的沐浴液、湿润剂、医用乳霜及软膏：煤焦油、二羟基蒽酚(dithranol)(地蒽酚(anthralin))、皮质类固醇(如去羟米松(desoximetasone)(Topicort^TM))、醋酸氟轻松(fluocinonide)、维生素D3类似物(例如卡泊三醇(calcipotriol))、Argan oiland类视色素(阿维A酯(etretinate)、阿维A酸(acitretin)、他扎罗汀(tazarotene))；全身性治疗剂，例如甲氨蝶呤、环孢素、类视色素、硫鸟嘌呤、羟基脲、柳氮磺吡啶、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、富马酸酯或生物制剂，例如Amevive^TM、Enbrel^TM、Humira^TM、Remicade^TM、Raptiva^TM及优特克单抗(ustekinumab，IL-12及IL-23阻断剂)。此外，可将本发明式I化合物与其他疗法组合施用，这样的疗法包含(但不限于)：光疗法或光化学疗法(例如补骨脂素及紫外线A光疗法(PUVA))。

在一个实施方案中，将本发明式I化合物与另一治疗剂共施用以治疗和/或预防过敏反应，具体药物包含(但不限于)：抗组胺药(例如西替利嗪、苯海拉明(diphenhydramine)、非索非那定、左西替利嗪(levocetirizine))、糖皮质素(例如泼尼松、倍他米松(betamethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、地塞米松)、肾上腺素、茶碱或抗白三烯素(例如孟鲁司特或扎鲁司特)、抗胆碱药及去充血剂。

如本领域技术人员应明了，共施用包含向患者递送两种或更多种治疗剂的任何方式作为同一治疗方案的部分。尽管可以单一制剂形式(即以单一药物组合物形式)同时施用两种或更多种药物，但此并非必需。这样的药物可以不同制剂形式在不同时间施用。

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明式I化合物的药物组合物及式II化合物，其中本发明式I化合物/式II化合物的比率为1/5至1/20。在具体实施方案中，该比率为1/5至1/10。

一般合成方法

概述

本发明式I化合物可使用下列一般方法及程序自容易获得的起始材料来制备。应了解，其中给出典型或优选方法条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)；除非另有说明，否则也可使用其他方法条件。最佳反应条件可随所使用的具体反应物或溶剂变化，但本领域技术人员可通过常规优化程序来确定这样的条件。

此外，如本领域技术人员将明了，可能需要常规保护基团来防止某些官能团发生不期望反应。用于具体官能团的适宜保护基团以及用于保护及去保护的适宜条件的选择已为本领域所众所周知。例如，在T.W.Greene及P.G.M.Wuts的Protecting Groups inOrganic Synthesis，第二版，Wiley，New York，1991及本文所列举的参考文献中阐述多种保护基团及其引入及去除。

详细呈现下列方法以制备如上文所定义的本发明式I化合物及比较实施例。本发明式I化合物可由有机合成领域技术人员自已知或市售起始材料及反应物制备。

除非另有说明，否则所有试剂都是商业级且未经进一步纯化即以接受状态使用。使用市售无水溶剂在惰性气氛下实施反应。除非另有说明，否则在所有其他情形下都使用试剂级溶剂。在硅胶60(35-70μm)上实施柱色谱。使用预涂覆的硅胶F-254板(厚度为0.25mm)实施薄层色谱。在Bruker DPX 400NMR光谱仪(400MHz)上记录¹H NMR光谱。¹H NMR光谱的化学位移(δ)相对于作为内标的四甲基硅烷(δ0.00)或适当残余溶剂峰(即CHCl₃(δ7.27))以百万分数(ppm)来报告。多重性以单峰(s)、二重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)及宽峰(br)给出。偶合常数(J)以Hz给出。在Micromass平台LC/MS光谱仪上获得电喷雾MS光谱。LCMS分析所使用的柱：Hichrom，Kromasil Eternity，2.5μm C₁₈，150×4.6mm，Waters Xbridge 5μm C₁₈(2)，250×4.6mm(参考编号为86003117)；Waters Xterra MS 5μmC₁₈，100×4.6mm(Plus guard柱)(参考编号为186000486)；Gemini-NX3μm C₁₈100×3.0mm(参考编号为00D-4453-Y0)；Phenomenex Luna 5μm C₁₈(2)，100×4.6mm。(Plus预柱)(参考编号为00D-4252-E0)；Kinetix fused core 2.7μm C₁₈ 100×4.6mm(参考编号为00D-4462-E0)；Supelco，Express C₁₈(参考编号为53829-U)；或Hichrom Halo C18，2.7μmC₁₈，150×4.6mm(参考编号为92814-702)。在偶合至HPLC Waters 2795(配备有UV检测器Waters 2996)的Waters Micromass ZQ上记录LC-MS。也在偶合至UV检测器Agilent G1315A的HPLC Agilent 1100上运行LC。制备型HPLC：Waters XBridge Prep C₁₈ 5μm ODB 19mm ID×100mm L(部件号186002978)。所有方法都使用MeCN/H₂O梯度。H₂O含有0.1％TFA或0.1％NH₃。

实验部分中所使用的缩写的列表：

本发明化合物的合成制备

实施例1.化合物的合成

1.1.途径1

1.1.1. 5-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-2-基胺(中间体3)的合成

1.1.1.1. 1-(6-溴-吡啶-2-基)-3-乙氧羰基-硫脲(2)

经15min向冷却至5℃的2-氨基-6-溴吡啶(1)(253.8g，1.467mol)于DCM(2.5L)中的溶液逐滴添加异硫氰酸乙氧基羰基酯(173.0mL，1.467mol)。然后使反应混合物升温至室温(20℃)且搅拌16h。在真空中蒸发通过过滤收集固体，用汽油(3×600mL)彻底洗涤且空气干燥以提供(2)。硫脲未经任何纯化用于下一步骤中。

¹H(400MHz，CDCl₃)δ12.03(1H，br s，NH)，8.81(1H，d，J 7.8Hz，H-3)，8.15(1H，brs，NH)，7.60(1H，t，J 8.0Hz，H-4)，7.32(1H，dd，J 7.7和0.6Hz，H-5)，4.31(2H，q，J 7.1Hz，CH₂)，1.35(3H，t，J 7.1Hz，CH₃)。

1.1.1.2. 5-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-2-基胺(3)

向羟基胺盐酸盐(101.8g，1.465mol)于EtOH/MeOH(1∶1，900mL)中的悬浮液中添加N，N-二异丙基乙胺(145.3mL，0.879mol)且在室温下(20℃)将混合物搅拌1h。然后添加1-(6-溴-吡啶-2-基)-3-乙氧羰基-硫脲(2)(89.0g，0.293mol)且将混合物缓慢加热至回流(注意：需要漂白涤气器来骤冷所形成的H₂S)。在回流下保持3h后，冷却混合物且过滤以收集所沉淀的固体。通过在真空中蒸发滤液、添加H₂O(250mL)并过滤来收集其他产物。相继用H₂O(250mL)、EtOH/MeOH(1∶1，250mL)及Et₂O(250mL)洗涤合并的固体，然后在真空中干燥以提供固体状三唑并吡啶衍生物(3)。所述的化合物未经任何纯化用于下一步骤中。

¹H(400MHz，DMSO-d₆)δ7.43-7.34(2H，m，2×芳香族-H)，7.24(1H，dd，J6.8和1.8Hz，芳香族-H)，6.30(2H，br，NH₂)；m/z 213/215(1∶1，M+H⁺，100％)。

1.1.2. 4-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苄基]-硫吗啉-1，1-二氧化物(中间体4)的合成

在N₂下将2-(4-溴甲基-苯基)-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂环戊硼烷(1当量)和DIPEA(2当量)溶解于DCM/MeOH(5∶1 v∶v)中且逐份添加硫吗啉1，1-二氧化物(2当量)。在室温下将所得溶液搅拌16h。此后反应完成。蒸发溶剂。用EtOAc及水萃取化合物，用盐水洗涤且用无水MgSO₄干燥。过滤且蒸发有机层。未经进一步纯化即分离出最终化合物。

1.1.3. 5-[4-(1，1-二氧代硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-2-基胺(式I)的合成

将4-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苄基]-硫吗啉-1，1-二氧化物(1.1当量)添加至5-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-2-基胺的溶液(4∶1)中。将K₂CO₃(2当量)和PdCl₂dppf(0.03当量)添加至该溶液中。然后在油浴下在90℃下在N₂下将所得混合物加热16h。添加水且用乙酸乙酯萃取溶液。用无水MgSO₄干燥有机层且在真空中蒸发。通过快速色谱纯化后获得最终化合物。

¹H(400MHz，CDCl₃)δ7.94-7.92(d，2H)，7.52-7.48(m，3H)，7.37-7.34(m，1H)，7.02-7.00(m，1H)，6.00(d，2H)，3.76(d，2H)，3.15-3.13(m，4H)，2.93-2.91(m，4H)。

m/z 358.2(M+H⁺，100％)。

1.2.途径2

1.2.1.环丙烷甲酸{5-[4-(1，1-二氧代-硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-2-基}-酰胺(式II)

式II化合物可根据WO 2010/149769中所述的方法来合成。

1.2.2. 5-[4-(1，1-二氧代硫吗啉-4-基甲基)-苯基]-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-2-基胺(式I)的合成

式I化合物也可通过水解式II化合物来产生：

将30％盐酸水溶液(12.06kg；3.9相对体积)添加至式II化合物(3.45kg；1.0当量)于脱离子水(10.0kg；3.0相对体积)中的浆液中。随后，用脱离子水(3.4kg；1.0相对体积)实施线冲洗。将反应混合物于80℃±5℃下加热14.5h。反应完成后(转化率≥99％)，将反应混合物冷却至20℃±5℃。用脱离子水(6.8kg；2.0相对体积)稀释反应混合物且以使反应器内容物的温度保持在35℃以下的速率加入33％氢氧化钠水溶液(9.52kg；3.7相对体积)。需要额外量的33％氢氧化钠水溶液(2.55kg；1.0相对体积)以使pH≥10。过滤产物，用脱离子水(1.5相对体积)洗涤两次且在真空下干燥1h，由此产生粗品式I化合物。

将粗品式I化合物(5.70kg)于脱离子水(23.0kg；8.5相对体积)中再制成浆液。添加30％盐酸水溶液(1.65kg；0.7相对体积)及脱离子水(4.3kg；1.6相对体积)且在20℃±5℃下将反应混合物搅拌45min。因式I化合物未完全溶解，故在45℃±5℃下将反应混合物搅拌1h。过滤反应混合物且用脱离子水(2.0kg；0.75相对体积)洗涤残余物。将33％氢氧化钠水溶液(1.12kg；0.6相对体积)添加至滤液中。需要额外量的33％氢氧化钠水溶液(1.01kg)以使pH≥10。在20℃±5℃下将所得反应混合物搅拌约3h。过滤产物，用脱离子水(4.1kg；1.5相对体积)洗涤两次，且用甲基叔丁基醚(MTBE；3.0kg；1.5相对体积)洗涤两次，并在真空下在滤器上干燥15.5h。进一步在40℃±5℃下在真空炉中将产物干燥202h，由此提供期望的式I化合物。

生物学实施例

实施例2.体外分析

2.1. JAK1抑制分析

2.1.1. polyGT底物的JAK1分析

自Invitrogen购得重组人类JAK1催化结构域(氨基酸866-1154；目录编号为PV4774)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中在总体积为25μL且有或没有5μL测试化合物或媒剂(DMSO，1％最终浓度)的激酶反应缓冲液(15mM Hepes pH 7.5、0.01％Tween20、10mMMgCl₂、2μM非放射性ATP、0.25μCi ³³P-γ-ATP(Perkin Elmer，目录编号为NEG602K001MC)，最终浓度)中，将25ng JAK1与6.25μg polyGT底物(Sigma，目录编号为P0275)一起孵育。在30℃下保持75min后，通过添加25μL/孔150mM磷酸终止反应。使用细胞收获器(PerkinElmer)将所有终止的激酶反应物转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer，目录编号为6005177)上。使用300μL/孔的75mM磷酸溶液将板洗涤6次并将板底部密封。添加40μL/孔的Microscint-20，将板顶部密封并使用Topcount(Perkin Elmer)读取。从在媒剂存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的cpm，计算激酶活性。如下测定测试化合物抑制此活性的能力：

抑制百分比＝((含有本发明测试化合物的样本测定的cpm-含有阳性对照抑制剂的样本测定的cpm)/(在媒剂存在下测定的cpm-含有阳性对照抑制剂的样本测定的cpm))＊100。

制备化合物的连续剂量稀释液，以便在JAK1分析中测试剂量反应效应并计算化合物的IC₅₀。在20μM的浓度下、随后以1/3连续稀释，在8个浓度点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)下测试化合物，其中DMSO的最终浓度为1％。当化合物效能增加时，制备更高稀释度和/或降低最大浓度(例如5μM、1μM)。

根据上文所述的分析法测定式I化合物针对JAK1的活性，由此返回460.1nM、586nM、494.3nM、758.2nM和432.7nM(平均值为546.26nM)的IC₅₀值。

2.1.2.JAK1 Ulight-JAK1肽分析

自Invitrogen购得重组人类JAK1(催化结构域，氨基酸866-1154；目录编号为PV4774)。在白色384Opti板(Perkin Elmer，目录编号为6007290)中在总体积为20μL且有或没有4μL测试化合物或媒剂(DMSO，1％最终浓度)的激酶反应缓冲液(15mM MOPS pH 6.8、0.01％Brij-35、5mM MgCl₂、2mM DTT、7μM ATP)中将1ng JAK1与20nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer，目录编号为TRF0121)一起孵育。在室温下保持60min之后，通过添加20μL/孔的检测混合物(1×检测缓冲液(Perkin Elmer，目录编号为CR97-100C)、0.5nM铕-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目录编号为AD0068)、10mM EDTA)来终止反应。使用Envision(在320nm下激发且在615nm下测定发射，Perkin Elmer)实施读取。通过使用在媒剂存在下获得的相对荧光单位(RFU)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的RFU来计算激酶活性。如下测定测试化合物抑制此活性的能力：

抑制百分比＝((使用含有本发明测试化合物的样本测定的RFU-使用含有阳性对照抑制剂的样本测定的RFU)/(在媒剂存在下测定的RFU-使用含有阳性对照抑制剂的样本测定的RFU))＊100。

制备化合物的剂量稀释系列以能够在JAK1分析中测试剂量反应效应并计算化合物的IC₅₀。在20μM的浓度下、随后以1/5连续稀释在10个浓度点下以常规方式测试化合物，其中DMSO的最终浓度为1％。当化合物效能增加时，制备更多稀释度和/或降低最大浓度(例如5μM、1μM)。数据表示为分析的平均IC₅₀±平均值的标准误差。

根据上文所述的分析测定式I化合物针对JAK1的活性，由此返回346.8nM、714.3nM、166.6nM、103.3nM、187.2nM、582.3nM、295.3nM、241.7nM、159.2nM、355.3nM和221.6nM(平均值＝307nM)的IC₅₀值。

2.1.3. JAK1 Ki测定分析

对于Ki测定而言，将不同量的化合物与酶混合且随后随着ATP浓度变化发生酶反应。通过Km对化合物浓度的双倒数作图(Lineweaver-Burk曲线)来测定Ki。在分析中使用1ng JAK1(Invitrogen，PV4774)。底物为20nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer，TRF0121)。使用不同浓度的ATP及化合物在15mM MOPS pH 6.8、0.01％Brij-35、2mM DTT、5mM MgCl2中实施反应。使用如1.1.2中所述的铕标记的抗磷酸酪胺酸抗体PT66(PerkinElmer，AD0068)测定磷酸化底物。在envision(Perkin Elmer，在320nm下激发且在615nm及665nm下发射)上实施读取。

2.2. JAK2抑制分析

2.2.1. polyGT底物的JAK2分析

自Invitrogen购得重组人类JAK2催化结构域(氨基酸808-1132；目录编号为PV4210)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中在总体积为25μL且有或没有5μL测试化合物或媒剂(DMSO，1％最终浓度)的激酶反应缓冲液(10mM MOPS pH 7.5、0.5mM EDTA、0.01％Brij-35、1mM DTT、15mM MgAc、1μM非放射性ATP、0.25μCi ³³p-γ-ATP(Perkin Elmer，目录编号为NEG602K001MC)，最终浓度)中，将0.05mU JAK2与2.5μg polyGT底物(Sigma，目录编号为P0275)一起孵育。在30℃下保持90min后，通过添加25μL/孔150mM磷酸终止反应。使用细胞收获器(Perkin Elmer)将所有终止的激酶反应物转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer，目录编号为6005177)上。使用300μL/孔的75mM磷酸溶液将板洗涤6次并将板底部密封。添加40μL/孔的Microscint-20，将板顶部密封并使用Topcount(PerkinElmer)实施读取。通过使用在媒剂存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的cpm来计算激酶活性。如下测定测试化合物抑制此活性的能力：

抑制百分比＝((使用含有本发明测试化合物的样本测定的cpm-使用含有阳性对照抑制剂的样本测定的cpm)/(在媒剂存在下测定的cpm-使用含有阳性对照抑制剂的样本测定的cpm))＊100。

制备化合物的剂量稀释系列以在JAK2分析中测试剂量反应效应并计算各化合物的IC₅₀。在20μM的浓度下、随后以1/3连续稀释在8个浓度点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)下测试化合物，其中DMSO的最终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多稀释度和/或降低最大浓度(例如5μM、1μM)。

根据上文所述的分析测定式I化合物针对JAK1的活性，由此返回566.9nM、365.5nM、256.4nM、915.1nM及1017nM(平均值为624nM)的IC₅₀值。

2.2.2. JAK2 Ulight-JAK1肽分析

自Invitrogen购得重组人类JAK2(催化结构域，氨基酸866-1154；目录编号为PV4210)。在白色384Opti板(Perkin Elmer，目录编号为6007290)中在总体积为20μL且有或没有4μL测试化合物或媒剂(DMSO，1％最终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM HEPES pH 7.0、0.01％Triton X-100、7.5mM MgCl₂、2mM DTT、7.5μM ATP)中将0.0125mU JAK2与25nMUlight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer，目录编号为TRF0121)一起孵育。在室温下保持60min之后，通过添加20μL/孔的检测混合物(1×检测缓冲液(Perkin Elmer，目录编号为CR97-100C)、0.5nM铕-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目录编号为AD0068)、10mMEDTA)来终止反应。使用Envision(在320nm下激发且在615nm下测定发射，Perkin Elmer)实施读取。通过使用在媒剂存在下获得的相对荧光单位(RFU)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的RFU来计算激酶活性。如下测定测试化合物抑制此活性的能力：

制备化合物的剂量稀释系列以能够在JAK2分析中测试剂量反应效应并计算化合物的IC₅₀。在20μM的浓度下、随后以1/5连续稀释在10个浓度点下测试化合物，其中DMSO的最终浓度为1％。当化合物效能增加时，制备更多稀释度和/或降低最大浓度(例如5μM、1μM)。数据表示为分析的平均IC₅₀±平均值的标准误差。

根据上文所述的分析测定式I化合物针对JAK2的活性，由此返回1031nM、351.2nM、137.5nM、367.2nM、310.2nM、729.2nM、151.7nM、203.0nM、168.0nM及517.0nM(平均值＝397nM)的IC₅₀值。

2.2.3. JAK2Kd/Ki测定分析

2.2.3.1. JAK2Ki测定分析

对于Ki测定而言，将不同量的化合物与酶混合且随后随着ATP浓度变化发生酶反应。通过Km对化合物浓度的双倒数作图(Lineweaver-Burk曲线)来测定Ki。在分析中使用0.0125mU JAK1(Invitrogen，PV4210)。底物为25nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(PerkinElmer，TRF0121)。使用不同浓度的ATP及化合物在25mM HEPES pH 7.0、0.01％Triton X-100、7.5mM MgCl₂、2mM DTT中实施反应。使用如1.2.2中所述的铕标记的抗磷酸酪胺酸抗体PT66(Perkin Elmer，AD0068)测定磷酸化底物。在envision(Perkin Elmer，在320nm下激发且在615nm及665nm下发射)上实施读取。

2.2.3.2. JAK2 Kd测定分析

使用最终浓度为2.5nM的JAK2(Invitrogen，PV4210)。使用25nM激酶示踪剂236(Invitrogen，PV5592)及2nM铕-抗GST(Invitrogen，PV5594)在不同化合物浓度下于50mMHepes pH 7.5、0.01％Brij-35、10mM MgCl₂、1mM EGTA中实施结合实验。根据制造商的程序来检测示踪剂。

2.2.4. JAK3抑制分析

自Carna Biosciences购得重组人类JAK3催化结构域(氨基酸795-1124；目录编号为08-046)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中在总体积为25μL且有或没有5μL测试化合物或媒剂(DMSO，1％最终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM Tris pH 7.5、0.5mM EGTA、10mMMgCl₂、2.5mM DTT、0.5mM Na₃VO₄、5mM b-甘油磷酸酯、0.01％Triton X-100、1μM非放射性ATP、0.25μCi 33P-γ-ATP(Perkin Elmer，目录编号为NEG602K001MC)，最终浓度)中，将0.5ng JAK3蛋白与2.5μg polyGT底物(Sigma，目录编号为P0275)一起孵育。在30℃下保持45min后，通过添加25μL/孔150mM磷酸终止反应。使用细胞收获器(Perkin Elmer)将所有终止的激酶反应物转移至预洗涤(75mM磷酸)的96孔过滤板(Perkin Elmer，目录编号为6005177)上。使用300μL/孔的75mM磷酸溶液将板洗涤6次并将板底部密封。添加40μL/孔的Microscint-20，将板顶部密封并使用Topcount(Perkin Elmer)实施读取。通过使用在媒剂存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的cpm来计算激酶活性。如下测定测试化合物抑制此活性的能力：

制备化合物的剂量稀释系列以能够在JAK3分析中测试剂量反应效应并计算化合物的IC₅₀。在20μM的浓度下、随后以1/5连续稀释在10个浓度点下测试化合物，其中DMSO的最终浓度为1％。当化合物增加时，制备更多稀释度和/或降低最大浓度(例如5μM、1μM)。

根据上文所述的分析测定式I化合物针对JAK3的活性，由此返回2497nM、＞4000nM、＞4000nM、＞3333nM、＞3333nM、3939nM、＞4000nM、＞4000nM、＞4000nM、3201nM及3368nM(平均值＞3606nM)的IC₅₀值。

2.2.5. JAK3 Ki测定分析

对于Ki测定而言，将不同量的化合物与酶混合且随后随着ATP浓度变化发生酶反应。通过Km对化合物浓度的双倒数作图(Lineweaver-Burk曲线)来测定Ki。使用最终浓度为20ng/ml的JAK3(Carna Biosciences，08-046)。底物为Poly(Glu，Tyr)钠盐(4∶1)(MW 20000-50 000，Sigma，P0275)。使用不同浓度的ATP及化合物在25mM Tris pH 7.5、0.01％Triton X-100、0.5mM EGTA、2.5mM DTT、0.5mM Na₃VO₄、5mM b-甘油磷酸酯、10mM MgCl₂中实施反应并通过添加150mM磷酸终止反应。通过将样本装载于过滤板(使用收获器，PerkinElmer)上且随后进行洗涤来测定纳入底物polyGT中的磷酸盐。在向过滤板(Perkin Elmer)中添加闪烁液体之后，在Topcount闪烁计数器中测定纳入polyGT中的³³p。

2.3. TYK2抑制分析

自Carna biosciences购得重组人类TYK2催化结构域(氨基酸871-1187；目录编号为08-147)。在聚丙烯96-孔板(Greiner，V形底)中在总体积为25μL且有或没有5μL测试化合物或媒剂(DMSO，1％最终浓度)之激酶反应缓冲液(25mM Hepes pH 7.2、50mM NaCI、0.5mMEDTA、1mM DTT、5mM MnCl₂、10mM MgCl₂、0.1％Brij-35、0.1μM非放射性ATP、0.125μCi³³P-γ-ATP(Perkin Elmer，目录编号为NEG602K001MC)，最终浓度)中，将4ng TYK2与12.5μgpolyGT底物(Sigma，目录编号为P0275)一起孵育。在30℃下保持90min后，通过添加25μL/孔150mM磷酸终止反应。使用细胞收获器(Perkin Elmer)将所有终止之激酶反应物转移至预洗涤(75mM磷酸)之96孔过滤板(Perkin Elmer，目录编号为6005177)上。使用300μL/孔之75mM磷酸溶液将板洗涤6次并将板底部密封。添加40μL/孔之Microscint-20，将板顶部密封并使用Topcount(Perkin Elmer)实施读取。通过使用在媒剂存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的cpm来计算激酶活性。如下测定测试化合物抑制此活性的能力：

制备化合物的剂量稀释系列以在TYK2分析中测试剂量反应效应并计算各化合物的IC₅₀。在20μM的浓度下、随后以1/3连续稀释在8个浓度点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)下测试各化合物，其中DMSO的最终浓度为1％。当化合物系列的效能增加时，制备更多稀释度和/或降低最大浓度(例如5μM、1μM)。

根据上文所述的分析测定式I化合物针对TYK2的活性，由此返回＞3333nM、＞3333nM、＞3333nM、1973nM、2121nM、3852nM、3819nM及2207nM(平均值＞2996nM)的IC₅₀值。

2.3.1. TYK2 Kd/Ki测定分析

2.3.1.1. TYK2 Ki测定分析

对于Ki测定而言，将不同量的化合物与酶混合且随后随着ATP浓度变化发生酶反应。通过Km对化合物浓度的双倒数作图(Lineweaver-Burk曲线)来测定Ki。使用最终浓度为160ng/ml的TYK2(Carna Biosciences，08-147)。底物为Poly(Glu，Tyr)钠盐(4∶1)(MW 20000-50 000(Sigma，P0275)。使用不同浓度的ATP及化合物在25mM Hepes pH 7.2、50mMNaCI、0.5mM EDTA、1mM DTT、5mM MnCl₂、10mM MgCl₂、0.1％Brij-35中实施反应并通过添加150mM磷酸终止反应。通过将样本装载于过滤板(使用收获器，Perkin Elmer)上且随后进行洗涤来测定纳入底物polyGT中的磷酸盐。在向过滤板(Perkin Elmer)中添加闪烁液体之后，在Topcount闪烁计数器中测定纳入polyGT中的³³P。

2.3.1.2. TYK2 Kd测定分析

使用最终浓度为50nM的TYK2(Carna Biosciences，08-147)。使用15nM激酶示踪剂236(Invitrogen，PV5592)及10nM铕-抗GST(Invitrogen，PV5594)在不同化合物浓度下于50mM Hepes pH 7.5、0.01％Brij-35、10mM MgCl₂、1mM EGTA中实施结合实验。根据制造商的程序来检测示踪剂。

实施例3.细胞分析：

3.1. JAK-STAT信号传导分析：

将HeLa细胞维持于含有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素(penicillin)及100μg/mL链霉素(streptomycin)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium，DMEM)中。在70％铺满下将HeLa细胞用于转染。在96-孔板模式中，使用0.32μL/孔的Jet-PEI(Polyplus)作为转染试剂以40ng pSTAT1(2)-荧光素酶报道基因(Panomics)、8ng LacZ报道基因(作为内部对照报道基因)及52ng pBSK对87μL细胞培养基中的20,000个细胞实施瞬时转染。在37℃、5％CO₂下孵育过夜后，去除转染培养基。添加81μL DMEM+1.5％热灭活胎牛血清。经60min添加9nL10×浓度的化合物，且然后添加10μL最终浓度为33ng/mL的人类OSM(Peprotech)。

自20μM开始、之后以1/3连续稀释、总共8个剂量(20μM-6.6μM-2.2μM-740nM-250nM-82nM-27nM-9nM)以一式两份测试化合物，其中DMSO的最终浓度为0.2％。

在37℃、5％CO₂下孵育过夜后，通过添加100μL溶解缓冲液/孔(PBS、0.9mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂、10％海藻糖、0.05％Tergitol NP9、0.3％BSA)来裂解细胞。

通过经20min添加180μL β-Gal溶液(30μL ONPG 4mg/mL+150μL β-半乳糖苷酶缓冲液(0.06M Na₂HPO₄、0.04M NaH₂PO₄、1mM MgCl₂))使用40μL细胞溶解物来读取β-半乳糖苷酶活性。通过添加50μL 1M Na₂CO₃来终止反应。在405nm下读取吸收度。

如制造商(Perkin Elmer)所述，使用40μL细胞溶解物加上40μL在Envision(Perkin Elmer)上测定荧光素酶活性。

使用没有OSM的情况作为阳性对照(100％抑制)。使用0.5％DMSO作为阴性对照(0％抑制)。使用阳性及阴性对照计算z′及“抑制百分数”(PIN)值。

抑制百分比＝((在媒剂存在下测定的荧光度-使用含有本发明测试化合物的样本测定的荧光度)/(在媒剂存在下测定的荧光度-使用无触发剂的样本测定的荧光度))＊100。

绘制剂量反应中所测试化合物的PIN值并推导出EC₅₀值。

根据上文所述的分析测定式I化合物针对JAK-STAT的活性，由此返回无活性、＞6670nM、＞6670nM、8943nM(平均值＞7427nM)的IC₅₀值。

3.2. OSM/IL-1β信号传导分析

显示OSM及IL-1β协同上调人类软骨肉瘤细胞系SW1353中的MMP13含量。在96孔板中以15,000个细胞/孔将细胞接种于含有10％(v/v)FBS及1％青霉素/链霉素(InVitrogen)的120μL体积的DMEM(Invitrogen)中，且在37℃、5％CO₂下进行孵育。在含有2％DMSO的M199培养基中将细胞与15μL化合物一起预孵育1h，然后使用15μL OSM及IL-1β进行触发以达到25ng/mL OSM及1ng/mL IL-1β，且在触发后48h时于条件培养基中测定MMP13含量。使用抗体捕获活性分析测定MMP13活性。出于此目的，使用35μL 1.5μg/mL的抗人类MMP13抗体(R&DSystems，MAB511)溶液涂覆384孔板(NUNC，460518，MaxiSorb black)且在4℃下保持24h。在使用PBS+0.05％Tween将孔洗涤2次后，使用存于PBS中的100μL 5％脱脂奶粉(Santa Cruz，sc-2325，Blotto)阻断剩余结合位点，且在4℃下保持24h。其后，使用PBS+0.05％Tween将孔洗涤2次，且添加存于100倍稀释的阻断缓冲液中的35μL 1/10稀释的含有MMP13的培养物上清液并在室温下孵育4h。然后用PBS+0.05％Tween将孔洗涤两次，随后通过添加35μL1.5mM4-氨基苯基汞乙酸盐(APMA)(Sigma，A9563)溶液且在37℃下孵育1h来活化MMP13。再次用PBS+0.05％Tween洗涤各孔且添加35μL MMP13底物(Biomol，P-126，OmniMMP荧光底物)。在37℃下孵育24h后，在Perkin Elmer Wallac EnVision 2102多标记读取器(激发波长：320nm，发射波长：405nm)中测定经转化底物的荧光度。

3.3. PBL增生分析

使用IL-2刺激人类外周血液淋巴细胞(PBL)并使用BrdU纳入分析来测定增生。首先使用PHA将PBL刺激72h以诱导IL-2受体，然后禁食24h以终止细胞增生，之后再实施72hIL-2刺激(包含24hr的BrdU标记)。在添加IL-2之前，将细胞与测试化合物一起预孵育1hr。在含有10％(v/v)FBS的RPMI 1640中培养细胞。

3.4.人类全血分析(hWBA)

3.4.1.方案1

3.4.1.1. IL-6刺激方案

使用人类全血实施流式细胞术分析以确立JAK1高于JAK2的离体化合物选择性。因此，自给出知情同意的人类志愿者采集血液。然后将血液在37℃下在轻微摇动下平衡30min，然后在埃彭道夫管(Eppendorf tube)中等分。添加不同浓度的化合物并在37℃下在轻微摇动下孵育30min，且随后在37℃下在轻微摇动下使用白介素6(IL-6)(对于JAK1依赖性路径刺激而言)或GM-CSF(对于JAK2依赖性路径刺激而言)刺激20min。然后使用FACS分析评估磷酸-STAT1及磷酸-STAT5。

3.4.1.1.1.磷酸-STAT1分析

3.4.1.1.1.1.试剂的制备

使用蒸馏水将5×裂解/固定缓冲液(BD PhosFlow，目录编号为558049)稀释5倍并在37℃下预热。丢弃剩余的经稀释裂解/固定缓冲液。

将10μg rhIL-6(R&D Systems，目录编号为206-IL)溶解于1ml PBS0.1％BSA中以获得10μg/ml储备溶液。将储备溶液等分并储存于-80℃下。

在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备溶液)。经对照处理的样本接受DMSO而非化合物。将所有样本与最终浓度为1％的DMSO一起孵育。

3.4.1.1.1.2.将血液与化合物一起孵育并用IL-6进行刺激

在肝素化管中收集人类血液。将血液分成148.5μL的等分样本。然后，向每一血液等分样本中添加1.5μL测试化合物稀释液且将血液样本在37℃下在轻微摇动下孵育30min。将1.5微升10倍稀释的IL-6储备溶液添加至血液样本(最终浓度为10ng/mL)中且将样本在37℃下在轻微摇动下孵育20min。

3.4.1.1.1.3.白血细胞制备

在刺激时段结束时，向血液样本中立即添加3ml 1×预热裂解/固定缓冲液，短暂涡旋并在37℃下在水浴中孵育15min以裂解红血细胞并固定白细胞。

在4℃下在400×g下将试管离心5min。用3mL冷1×PBS洗涤细胞沉淀物，且离心后将细胞沉淀物再悬浮于100μL冰冷1×PBS中并添加900μL冰冷100％甲醇。然后将细胞在4℃下孵育30min以进行渗透化。

然后使用含有3％BSA的1×PBS洗涤渗透化细胞并最终再悬浮于含有3％BSA的80μL 1×PBX中。

3.4.1.1.1.4.用抗磷酸-STAT1及抗CD4抗体进行细胞标记

添加且混合20μL PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2aκ同型对照抗体(BDBiosciences，目录编号分别为612564及559319)及FITC结合的抗CD4抗体或FITC结合的同型对照抗体，然后在4℃下在黑暗中孵育30min。

然后使用1×PBS将细胞洗涤一次并在FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences)上进行分析。

3.4.1.1.1.5. FACSCanto II上的荧光分析

对50,000个总事件进行计数且于淋巴细胞门中对CD4⁺细胞进行门控之后测定磷酸-STAT1阳性细胞。使用FACSDiva软件分析数据，且基于CD4⁺细胞上磷酸-STAT1的阳性细胞的百分比来计算IL-6刺激的抑制百分比。

3.4.1.1.2.磷酸-STAT5分析

3.4.1.1.2.1.试剂的制备

将10μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目录编号为P300-03)溶解于100μL PBS 0.1％BSA中以获得100μg/ml储备溶液。将储备溶液于-80℃下储存并等分。

在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备溶液)。经对照处理的样本接受DMSO而并不接受测试化合物。将所有样本与最终浓度为1％的DMSO一起孵育。

3.4.1.1.2.2.将血液与化合物一起孵育并使用GM-CSF进行刺激

在肝素化管中收集人类血液。将血液分成148.5μL的等分样本。然后，向每一等分样本中添加1.5μL测试化合物稀释液且将血液样本在37℃下在轻微摇动下孵育30min。将5,000倍稀释的GM-CSF储备溶液(1.5μL)添加至血液样本(最终浓度为20pg/mL)中且将样本在37℃下在轻微摇动下孵育20min。

3.4.1.1.2.3.白血细胞制备

在刺激时段结束时，向血液样本中立即添加3ml1×预热裂解/固定缓冲液，短暂涡旋并在37℃下在水浴中孵育15min以裂解红血细胞并固定白细胞。

3.4.1.1.2.4.用抗磷酸-STAT5及抗CD33抗体进行细胞标记

添加20μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型对照抗体(BDBiosciences，目录编号分别为612567及554680)及APC小鼠抗CD33抗体(BD Biosciences编号为345800)或APC小鼠IgG1同型对照抗体(BD Biosciences编号为345818)，混合，然后在4℃下在黑暗中孵育30min。

3.4.1.1.2.5. FACSCanto II上的荧光分析

对50,000个总事件进行计数且对CD33⁺细胞进行门控之后测定磷酸-STAT5阳性细胞。使用FACSDiva软件分析数据，且对应于基于CD33⁺细胞上的磷酸-STAT5的阳性细胞的百分比计算的GM-CSF刺激的抑制百分比。

3.4.2.方案2

3.4.2.1.刺激方案

使用人类全血实施流式细胞术分析以确立JAK1高于JAK2的离体化合物选择性。因此，自给出知情同意的人类志愿者采集血液。然后将血液在37℃下在轻微摇动下平衡30min，然后在埃彭道夫管中等分。添加不同浓度的化合物并在37℃下在轻微摇动下孵育30min，且随后在37℃下在轻微摇动下使用白介素6(IL-6)(对于JAK1依赖性路径刺激而言)、白介素α(IFNα)(对于JAK1/TYK2路径刺激而言)、白介素2(IL-2)(对于JAK1/JAK3路径刺激而言)或GM-CSF(对于JAK2依赖性路径刺激而言)刺激20min。然后使用FACS分析来评估磷酸-STAT1(对于IL-6-及IFNα-刺激的细胞)及磷酸-STAT5(对于IL-2-及GM-CSF-刺激的细胞)含量。

3.4.2.2.磷酸-STAT分析

3.4.2.2.1.试剂的制备

将10μg rhIL-6(R&D Systems，目录编号为206-IL)溶解于1ml PBS+0.1％BSA中以获得10μg/ml储备溶液。将储备溶液等分并储存于-80℃下。

将10μg rhIL-2(R&D Systems，目录编号为202-IL)溶解于1ml PBS+0.1％BSA中以获得10μg/ml储备溶液。将储备溶液等分并储存于-80℃下。

将5μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目录编号为P300-03)溶解于12.5mL PBS+0.1％BSA中以获得400μg/ml储备溶液。将储备溶液于-80℃下储存并等分。

3.4.2.2.2.将血液与化合物一起孵育并使用触发剂进行刺激

在肝素化管中收集人类血液。将血液分成148.5μL的等分样本。然后，向每一血液等分样本中添加1.5μL测试化合物稀释液且将血液样本在37℃下在轻微摇动下孵育30min。将1.5微升10倍稀释的IL-6储备溶液、1.5μL uIFNα(PBL Biomedical，目录编号为11200-1)储备溶液、1.5μL 25倍稀释的IL-2储备溶液或1.5μL200倍稀释的GM-CSF储备溶液添加至血液样本中且将样本在37℃下在轻微摇动下孵育20min。

3.4.2.2.3.白血细胞制备

3.4.2.2.4.细胞标记

将20μL PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2aκ同型对照抗体(BD Biosciences，目录编号分别为612564及559319)及APC结合的抗CD4抗体或对照APC结合的同型对照抗体(BD Biosciences，目录编号分别为555349及555751)添加至IL-6-及IFNα-刺激的试管中且混合，然后在4℃下在黑暗中孵育20min。

将20μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型对照抗体(BD Biosciences，目录编号分别为612567及554680)及APC结合的抗CD4抗体或对照APC结合的同型对照抗体(BD Biosciences，目录编号分别为555349及555751)添加至IL-2刺激的试管中，混合，然后在4℃下在黑暗中孵育20min。

将20μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型对照抗体(BD Biosciences，目录编号分别为612567及554680)及APC小鼠抗CD33抗体(BD Biosciences编号为345800)或对照APC小鼠IgG1同型对照抗体(BD Biosciences编号为345818)添加至GM-CSF刺激的试管中，混合，然后在4℃下在黑暗中孵育20min。

3.4.2.2.5. FACSCanto II上的荧光分析

对50,000个总事件进行计数且于针对IL-6-及IFNα-刺激的细胞的淋巴细胞门中对CD4+细胞进行门控之后测定磷酸-STAT1阳性细胞。于针对IL-2刺激的细胞的淋巴细胞门中对CD4+细胞进行门控之后测定磷酸-STAT5阳性细胞。对CD33+细胞进行门控后测定磷酸-STAT5阳性细胞。使用FACSDiva软件分析数据，且基于CD4+细胞上磷酸-STAT1的阳性细胞的百分比来计算IL-6或IFNα刺激的抑制百分比。对于IL-2刺激的细胞，使用FACSDiva软件分析数据，且基于CD4+细胞上磷酸-STAT1的阳性细胞的百分比来计算IL-2刺激的抑制百分比。对于GM-CSF刺激的细胞，基于CD33+细胞上磷酸-STAT5的阳性细胞的百分比来计算GM-CSF刺激的抑制百分比。

3.4.3.结果

当提交这样的方案时，针对6种不同供体，式I化合物返回对于IL-6诱导的STAT1磷酸化的平均IC₅₀为11.9μM。对于IFNα诱导的STAT1磷酸化，6种不同供体的平均IC₅₀经评估为15.4μM。对于IL-2诱导的STAT5磷酸化，5种不同供体的平均IC₅₀经评估为19.6μM。对于GM-CSF诱导的STAT5磷酸化，7种不同供体的平均IC₅₀经评估为100μM以上。

实施例4.体内模型

4.1. CIA模型1

4.1.1.材料

自Difco购得完全弗罗因德氏(Freund′s)佐剂(CFA)及不完全弗罗因德氏佐剂(IFA)。分别自Chondrex(Isle d′Abeau，法国)、Sigma(P4252，L′Isle d′Abeau，法国)、Whyett(25mg可注射注射器，法国)、Whyett(25mg可注射注射器，法国)、Acros Organics(Palo Alto，CA)获得II型牛胶原(CII)、脂多糖(LPS)及所使用的所有其他试剂都是试剂级且所有溶剂都是分析级。

4.1.2.动物

自Harlan实验室(Melderslo，Netherlands)获得黑暗刺豚大鼠(Dark Agoutirat，雄性，7-8周龄)。将大鼠保持在12hr光照/黑暗循环中(0700-1900)。将温度维持在22℃下，且随意提供食物及水。

4.1.3.胶原诱导的关节炎(CIA)

在实验前一天，使用0.05M乙酸制备CII溶液(2mg/mL)并储存于4℃下。在即将免疫前，在冰水浴中通过匀化器将等体积的佐剂(IFA)及CII混合于预冷却的玻璃瓶中。若未形成乳液，则可能需要额外佐剂及延长均质化。在第1天在各大鼠的尾巴根部经皮内注射0.2mL乳液，在第9天实施第二次加强皮内注射(存于0.1mL CFA盐水中的2mg/mL的CII溶液)。此免疫方法是根据已公开的方法(Sims等人，2004；Jou等人，2005)改良的。

4.1.4.研究设计

在大鼠CIA模型中测试这样的化合物的治疗作用。将大鼠随机分成数个相同组且各组含有10只大鼠。在第1天对所有大鼠实施免疫且在第9天实施加强免疫。自第16天至第30天持续进行治疗性给药。使用媒剂(MC 0.5％)处理阴性对照组且使用(10mg/kg，3×周，皮下)处理阳性对照组。通常以3种剂量(例如6mg/kg、10mg/kg、60mg/kg，q.d.，p.o)测试目标化合物。

4.1.5.关节炎的临床评价

根据Khachigian 2006，Lin等人2007及Nishida等人2004)的方法对关节炎进行评分。使用关节炎评分对四个爪各自的肿胀分级如下：0-无症状；1-一类关节(例如踝或腕)轻微、但明显充血且肿胀、或限于个别脚趾的显著充血及肿胀(不管受侵袭脚趾的数量为多少)；2-两类或更多类关节中度充血及肿胀；3-整个爪(包含脚趾)严重充血及肿胀；4-肢体中多处关节出现最大炎症(每个动物的最大累积临床关节炎评分为16)(Nishida等人，2004)。

为允许对多个研究进行统合分析(meta-analysis)，如下所述将临床评分值进行正规化：

临床评分的AUC(AUC评分)：计算每一个别大鼠自第1天至第14天的曲线下面积(AUC)。将每一动物的AUC除以针对研究中的媒剂(自其获得该动物的数据)获得的平均AUC并乘以100(即将AUC表示为平均媒剂AUC/研究的百分比)。

第1天至第14天的临床评分增加(终点评分)：将每一动物的临床评分差除以针对研究中的媒剂(自其获得该动物的数据)获得的平均临床评分差并乘以100(即将临床评分差表示为媒剂的平均临床评分差/研究的百分比)。

4.1.6.关节炎发作后体重的变化(％)

临床上，体重减轻与关节炎相关(Shelton等人，2005；Argiles等人，1998；Rall，2004；Walsmith等人，2004)。因此，关节炎发作后的体重变化可用作评估大鼠模型中治疗作用的非特异性终点。关节炎发作后的体重变化(％)计算如下：

小鼠：

大鼠：

4.1.7.放射学

拍摄每一个别动物的后爪的X射线照片。为每张照片指定随机盲识别号码，且由两个独立的评分员使用放射性拉尔森(Larsen)评分系统对骨侵蚀的严重性如下进行分级：0-正常，具有完整骨轮廓及正常关节间隙；1-轻微异常，其中任一个或两个外跖骨显示轻微骨侵蚀；2-明显早期异常，其中任何三至五个外跖骨显示骨侵蚀；3-中度破坏性异常，其中所有外跖骨以及任一个或两个内跖骨显示明显骨侵蚀；4-严重破坏性异常，其中所有跖骨都显示明显骨侵蚀且至少一个内跖骨关节完全被侵蚀，仅部分保留某些骨关节的轮廓；5-残废性异常，无骨轮廓。此评分系统是根据Salvemini等人，2001；Bush等人，2002；Sims等人，2004；Jou等人，2005进行改良的。

4.1.8.组织学

在放射性分析后，于10％磷酸盐缓冲的福尔马林(pH 7.4)中固定小鼠后爪，使用精细组织学的快速骨脱钙剂进行脱钙(Laboratories Eurobio)并包埋于石蜡中。为确保深入评估关节炎关节，切割至少四组连续切片(5μm厚)且每一系列连续切片之间间隔100μm。使用苏木精(hematoxylin)及曙红(eosin)(H&E)将切片染色。使用双盲方案对滑囊炎症及骨及软骨损伤实施组织学检查。在各爪中，使用四点量表评价四个参数。这样的参数是细胞浸润、血管翳严重性、软骨侵蚀及骨侵蚀。如下所述进行评分：1-正常、2-轻微、3-中度、4-显著。将该四个评分加在一起且表示为另一评分，即“RA总分”。

4.1.9.跟骨(脚后跟骨)的显微电脑断层扫描(μCT)分析：

在RA中所观察到的骨降解尤其出现在皮质骨上且可通过μCT分析来显示(Sims NA等人，Arthritis Rheum.50(2004)2338-2346：Targeting osteoclasts with zoledronicacid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis；Oste L等人，ECTCMontreal 2007：A high throughput method 0f measuring bone architecturaldisturbance in a murine CIA model by micro-CT morphometry)。在对跟骨进行扫描及3D体积重建后，分析每个载玻片中以垂直于骨纵轴的方式分离的离散物体数量，来测定骨降解。骨降解愈多，所测定到的离散物体愈多。分析沿着跟骨均匀分布的1000个切片(间隙为约10.8μm)。

4.1.10.稳态PK

在第7或11天时，在眼眶后静脉窦处使用肝素锂作为抗凝血剂，在下列时间点收集血液样本：给药前、1、3及6hr。将全血样本离心且将所得血浆样本储存于-20℃下以备分析用。通过LC-MS/MS方法测定各测试化合物的血浆浓度，其中以正电喷雾模式操作质谱仪。使用(United States)计算药物动力学参数，且假设给药前的血浆水平等于24h时的血浆水平。

4.1.11.结果

如图1及表I中所显示，式I化合物在60mg/kg的剂量下呈现正规化临床评分值(根据AUC或第1天至第14天之差计算)的统计上显著改善。

表I：在用本文所公开的化合物治疗后大鼠CIA临床评分

4.2. CIA模型2

4.2.1.动物

自Charles River Laboratories公司(Wilmington，MA)获得在关节炎第0天称重为165-194克(平均约为178g)的雌性路易斯大鼠(Lewis rat，n＝76，参考编号为393739)。通过描述组及动物编号的尾巴根部的不同数字来鉴别动物。

收到时，动物以4只/笼圈养于鞋盒式聚碳酸酯笼中且使其适应8天，然后用II型胶原进行免疫。未给予同时服用的药物。

在适应及研究时段期间，将动物圈养于温度介于19°F-25°F之间且相对湿度为30％-70％的实验室环境中。自动定时器提供12h光照及12h黑暗环境。允许动物随意获取食物及水。

4.2.2.胶原诱导的关节炎(CIA)

4.2.2.1.准备

用异氟烷麻醉已适应的雌性路易斯大鼠且在第-9天及第-3天在尾巴根部及背部2个位点处经皮下/皮内(SC/ID)注射300μL含有2mg/mL II型牛胶原(Elastin Products，Owensville，Missouri)的不完全弗罗因德氏佐剂(Difco，Detroit，MI)。

通过在0.01N乙酸中制备4mg/mL溶液来制备胶原。通过人工混合乳化等体积的胶原及不完全弗罗因德氏佐剂直至此材料的珠粒当置于水中时保持其形状为止。每一动物每次接受300μL混合物，在背部上分为3个皮下位点。

4.2.2.2.研究

在研究第1天，关节炎发作且将动物随机分配至治疗组中。随机化后，用方案编号、组编号及动物编号标记所有笼。在踝关节肿胀已明显确立且有两侧疾病的良好证据后，随机分配至每一组中。

每天(QD)通过口服(PO)途径用媒剂(0.5％(w/v)甲基纤维素)或以0.5％(w/v)甲基纤维素制备的活性化合物将患有确立的II型胶原关节炎的动物治疗13天。在关节炎第1天开始口服给药且每天持续给药(QD，间隔24h)直至第13天。动物在关节炎第14天处死。

4.2.2.3.关节炎的临床评价

通过测定动物两踝的直径来评估关节炎的严重程度。自第0天开始每天用Digitrix II测微尺(Fowler&NSK)进行踝的卡尺测定。使用值舍入为千分之一英吋的一踝进行基线测定。通过与基于一系列体重的大鼠的历史值比较将测定确认为临床上正常的(0.260-0.264英吋)。然后对两个踝实施基线测定，且只要踝是临床上正常的(具有所有踝骨的良好定义且无炎症证据)，则这样的值属于该动物。动物在第14天处死。

4.2.2.4.化合物、剂量及结果

单独及以组合测试不同剂量的化合物，此列于下表II中。

表II：在CIA第二模型中所测试的化合物及剂量

(＊＝p≤0.05ANOVA，相对于媒剂对照)

4.2.2.5.结论

踝直径测定表明，施用式I(25mg/kg)与式II(3mg/kg)化合物的组合提供的作用强于式I化合物(25mg/kg)单独或式II化合物(3mg/kg)单独获得的作用，如图2及下表III中所显示。

表III：在用本文所公开的化合物治疗后大鼠CIA模型中踝直径(英吋)的演化。

实施例5.药动学研究

5.1.体外代谢研究

比较式II的[¹⁴C]-化合物在小鼠、大鼠、狗及人类肝细胞中的代谢的研究清楚地证明，式II化合物在所有物种中都稳定，且确认代谢程度在所有物种中都较低，其中24h后存在至少80％的式II化合物，如图3所显示。

表IV显示式II化合物在人类及动物物种肝细胞中的放射测定代谢特征，在人类及动物物种肝细胞中呈现一种主要代谢物(式I化合物，11％)及两种次要代谢物(未经表征，＜1.0％，在色谱图上可见)。

表IV：式II化合物的体外代谢特征

5.2.体内研究

5.2.1.动物中的单一剂量药物动力学

在多个用式II化合物给药的动物物种中实施药物动力学研究以测定式I化合物的暴露以及其表观末端半衰期(T_1/2)(若可能)。

5.2.1.1.方案

5.2.1.1.1.动物

使Sprague-Dawley大鼠(雄性，200-250g)、CD1小鼠(雄性，25-30g)、比格犬(Beagle dog，雄性，9-10kg)、哥廷根小型猪(minipig，雄性，10-15kg)及新西兰白兔(New Zealand White rabbit，雄性，3-5kg)适应至少7天，然后治疗且保持在12hr光照/黑暗循环中(07h00-19h00)。

将温度维持在约22℃下，且随意提供食物及水。

5.2.1.1.2.药物动力学研究

将式I化合物于0.5％甲基纤维素中配制且以单一食道管饲以介于15mg/kg至180mg/kg之间的剂量在5mL/kg或10mL/kg的给药体积下给3或6只动物口服给药。

将式II化合物于0.5％甲基纤维素中配制且以单一食道管饲以介于15mg/kg至45mg/kg之间的剂量在5mL/kg或10mL/kg的给药体积下给3只动物(或3只小鼠/时间点)给药。

经由颈静脉(狗、小型猪)、耳血管(兔)、心脏穿刺(小鼠)或眼窝后静脉窦(大鼠)且使用肝素锂作为抗凝血剂在24h时段收集血液样本。将全血样本离心且在分析之前将所得血浆样本储存在-20℃下。

5.2.1.1.3.血浆中化合物水平的量化

通过LC-MS/MS方法来测定式I化合物及式II化合物的血浆浓度，其中对于所有物种式I及式II的定量限都≤10.0ng/mL。

5.2.1.1.4.药物动力学参数的测定

使用统计分析包(WinNonLin(Pharsight，Sunnyvale，California：CA 94086，USA)来计算药物动力学参数。

5.2.1.2.结果

5.2.1.2.1.施用单独式I化合物后的结果

使用上文所述的方案，测定如下表V所显示的AUC及表观末端半衰期。

表V：施用本发明式I化合物后不同物种中的暴露及表观末端半衰期

表V中所呈现的结果显示式I化合物当单独给药时易于吸收，且因此在体内暴露。

5.2.1.2.2.单独施用式I化合物后的结果

施用式II化合物后，在小鼠(2.1h)及兔(4.6h)中测定式I化合物的表观末端消除半衰期。

5.2.2.人类中的单一剂量药物动力学

5.2.2.1.方案

在高脂肪高热量早餐(FDA建议：高脂肪(占餐总热量含量的约50％)及高热量(约800卡路里(calory)至1000卡路里)后使个体接受胶囊形式的单一剂量(10mg、25mg、50mg、100mg或200mg)的式II化合物。实施例性测试餐是两个奶油煎蛋、两条腌肉、两片奶油土司(toast)、四盎司(ounce)炸薯饼及八盎司全乳。可对此测试餐作出取代，只要该餐提供来自蛋白质、碳水化合物及脂肪的相似热量且具有相当餐体积及粘度。

在72h收集系列血液样本以使用经验证的液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)方法来测定式II及式I化合物的血浆浓度，其中定量限为1.00ng/mL。使用统计分析包(WinNonLin(Pharsight，Sunnyvale，California：CA 94086，USA)来评价PK参数。

5.2.2.2.血浆消除结果

测定式II化合物及式I化合物的平均血浆浓度-时间曲线。

式II化合物随时间的消除呈现两相曲线且平均表观末端消除半衰期为约5-8h。

相比之下，式I化合物的血浆消除呈现单相曲线且平均表观末端消除半衰期介于21h至27h之间。

5.2.2.3.式II及式I化合物的暴露

为了显示两种化合物的比较暴露，计算式I化合物及式II化合物的AUC。AUC值表示给药后化合物在物种中的总暴露。在图4中这样的值则表示为式I化合物的AUC∶式II化合物的AUC的比率。自此比率可明确看出，在人类中施用式II化合物后式I化合物的暴露与在治疗等效剂量的动物中所见的暴露相比显著不同。不欲受限于理论，相信此差异与在不同物种中表观末端半衰期的差异相关。

表VI：施用式II化合物时所测定的[式I]∶[式II]暴露的比率(表示为AUC)

物种	式I	式II	I/II比率
				小鼠(30mg/kg)	11.4	7.3	1.56
大鼠(45mg/kg)	13.3	33.3	0.40
				狗(15mg/kg)	10.6	44.9	0.24
小型猪(30mg/kg)	16.7	19.1	0.88
				兔(20mg/kg)	10	26	0.38
人类(10mg)	2.89	0.128	22.58
				人类(25mg)	7.22	0.331	21.81
人类(50mg)	14.6	0.735	19.86
				人类(100mg)	26.9	1.69	15.92
人类(200mg)	57.6	4.5	12.8

5.2.3.人类中的重复给药药物动力学

5.2.3.1.方案

个体在标准早餐后接受呈胶囊形式的重复剂量(25mg、50mg及100mg BID或200mg、300mg及450mg QD)的式II化合物达10天。

在第1天和第10天在12h(BID方案)或24h(QD方案)收集系列血液样本以使用经验证的液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)方法来测定式II及式I化合物的血浆浓度，其中对于两个式的定量限都为1.00ng/mL。使用统计分析包(WinNonLin(Pharsight，Sunnyvale，California：CA 94086，USA)来评价PK参数。

5.2.3.2.血浆消除结果

测定式II化合物及式I化合物的平均血浆浓度-时间曲线。

式II化合物随时间的消除呈现两相曲线且平均表观末端消除半衰期为约4-11h。

相比之下，式I化合物的血浆消除呈现单相曲线且平均表观末端消除半衰期介于22h至27h之间。

5.2.3.3.式II及式I化合物的暴露

为了显示两种化合物的比较暴露，计算式I化合物及式II化合物的AUC。AUC值表示重复给药后化合物的稳态暴露。式I化合物的AUC∶式II化合物的AUC的比率呈现于表VII中。

表VII：重复施用式II化合物时所测定的式II及式I的暴露(表示为AUC，μg.h/mL)

5.2.4.结论

式I化合物在体外在所有物种中呈现极相似特征。然而，出乎意料的是，在体内此特征在人类与其他动物物种之间极不同，人类中的表观末端半衰期是其他动物物种的至少3倍。此较长表观末端半衰期使得式I化合物在人类中蓄积，此可提供众多种剂量方案频率，具体而言低频率剂量方案，且更具体而言每天一次至每两周一次，最具体而言每天一次至每周一次。

5.3.靶标抑制

在健康志愿者中每天以200mg QD及100mg BID给药式II化合物。

然后测定所得式II及式I的水平且绘制成其各自IC₅₀的倍数(图5)，这样的IC₅₀如通过以上实施例3.4中所述的全血分析测定。

单独式II及式I在CIA大鼠模型中都有活性。令人惊奇的是，如图4中所显示，式II化合物的施用与2种活性物质式I及式II相关。不希望受限于理论，相信式II提供对靶标的快速抑制，且然后式I化合物稳定形成且蓄积，因此使得经过几乎24h药物水平大于IC₅₀值，如图6中超过IC₅₀的累积倍数所显示。这尤其出乎意料，这是由于自大鼠、小鼠及兔中的模型未曾预测到该特征，在该模型中并未出现该蓄积。

表VIII：比率计算为[化合物的血液循环剂量，表示为ng/mL]/[相同化合物在IC₅₀量下的循环剂量]

一般结论

本申请中所提供的数据表明，尽管式I化合物在生物化学分析中呈现针对JAK1及JAK2的相似的体外效能，但与生理学条件更接近的体外全血选择性分析(Saharinen等人2000Mol.Cell.Biol.，20(10)，3387)显示本发明式I化合物呈现针对JAK1的选择性是JAK2的10倍。此外，与可在其他物种中自体外数据或体内数据所预期者相比，本发明式I化合物在人类中显示出乎意料的体内特征。具体而言，式I化合物在人类中呈现介于21h至27h之间的显著较长的表观末端半衰期，这是本领域技术人员未曾预测到的，这可能有利于低频率剂量方案且增加患者依从性。具体而言，若患者错过一次给药，则可能降低不遵从性的影响。

实施例6其他方案

6.1.热力学溶解度

在室温下于玻璃瓶中制备存于0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)中的1mg/mL测试化合物溶液。

在室温下于旋转器驱动STR 4(Stuart Scientific，Bibby)中以速度3.0使样本旋转24h。

24hr后，将800μL样本转移至埃彭道夫管中并以14000rpm离心5min。然后将200μL样本的上清液转移至MultiscreenR Solubility板(Millipore，MSSLBPC50)中且通过真空歧管将上清液过滤(10-12″Hg)至洁净Greiner聚丙烯V形底96孔板(目录编号为651201)中。将5μL滤液稀释至在含有标准曲线的板(Greiner，目录编号为651201)中孵育所使用的95μL(F20)相同缓冲液中。

在DMSO中制备化合物的新标准曲线，其始于10mM DMSO储备溶液，然后于DMSO中将其稀释2倍(5000μM)，且然后于DMSO中进一步稀释至19.5μM。然后将3μL始于5000μM的稀释系列转移至97μL乙腈缓冲液混合物(50/50)中。最终浓度范围为2.5-150μM。

使用密封垫(MA96RD-04S，Kinesis，Cambs，PE19 8YX，UK)将板密封且于室温下在LCMS(来自Waters的ZQ 1525)上在最佳条件下使用Quanoptimize测定样本以确定分子的适当质量。

在流速为1mL/min的LCMS上分析样本。溶剂A是15mM氨且溶剂B是乙腈。在阳离子喷雾下在来自Waters的XBridge C₁₈3.5μM(2.1×30mm)柱上运行样本。溶剂梯度具有2min的总运行时间且介于5％B至95％B之间。

通过Masslynx软件包分析峰面积且相对于标准曲线绘制样本的峰面积以获得化合物的溶解度。

溶解度值以μM或μg/mL报告。

6.2.水溶解度

6.2.1.水溶解度2％DMSO程序

从于DMSO中的10mM储备溶液开始，在DMSO中制备连续稀释的化合物。将稀释系列转移至F形底部的96NUNC Maxisorb板(目录编号为442404)中且在室温下添加0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)。

最终浓度介于200μM至2.5μM之间，呈5个相等稀释等级。最终DMSO浓度不超过2％。将200μM芘添加至各96孔板的拐角点处且在显微镜上用作校正Z轴的参照点。

密封分析板并在37℃下孵育1hr，同时以230rpm振荡。然后在白光显微镜下扫描板，在每个浓度下产生沉淀的单独图像。分析沉淀物并将其转化为绘制于图表上的数值。化合物似乎完全溶解的第一浓度是下文所报告的浓度，然而，实际浓度将介于此浓度与比此浓度高一个稀释等级的浓度之间。

以μg/mL形式报告根据此方案测定的溶解度值。

6.2.2.水溶解度3％DMSO程序

从于DMSO中的10mM储备溶液开始，在DMSO中制备连续稀释的化合物。将稀释系列转移至F形底部的96NUNC Maxisorb板(目录编号为442404)中且在室温下添加0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)。

最终浓度将介于300μM至18.75μM之间，呈5个相等稀释等级。最终DMSO浓度不超过3％。将200μM芘添加至各96孔板的拐角点处且在显微镜上用作校正Z轴的参照点。

密封分析板并在37℃下孵育1h，同时以230rpm振荡。然后在白光显微镜下扫描板，在每个浓度下产生沉淀的单独图像。分析沉淀物并使用软件工具将其转化为可绘制于图表上的数值。化合物似乎完全溶解的第一浓度是所报告的浓度；然而，实际浓度将介于此浓度与比此浓度高一个稀释等级的浓度之间。

以μg/mL形式报告根据此方案测定的溶解度值。

6.3.血浆蛋白结合(平衡透析)

在DMSO中5倍稀释于DMSO中的10mM化合物的储备溶液。将此溶液进一步稀释于刚解冻的人类、大鼠、小鼠或狗血浆(BioReclamation INC)中，其最终浓度为10μM且最终DMSO浓度为0.5％(在PP-Masterblock 96孔(Greiner，目录编号为780285)中，5.5μL存于1094.5μL血浆中)。

制备具有插入物的Pierce Red Device板(ThermoScientific，目录编号为89809)且在缓冲液室中填充750μL PBS且于血浆室中填充500μL加标血浆。在37℃下将板孵育4h，同时以230rpm振荡。在孵育后，将两室中液体的120μL转移至96孔圆底、PP深孔板(Nunc，目录编号为278743)中的360μL乙腈中并使用铝箔盖密封。混合样本并置于冰上30min。然后在4℃下以1200rcf将此板离心30min且将上清液转移至96v形底PP板(Greiner，651201)上用以在LCMS上分析。

使用Kinesis，Cambs，PE19 8YX，UK的密封垫(MA96RD-04S)将板密封且于室温下在LCMS(来自Waters的ZQ 1525)上在最佳条件下使用Quanoptimize测定样本以确定分子的适当质量。

在流速为1mL/min的LCMS上分析样本。溶剂A是15mM氨且溶剂B是乙腈。在阳离子喷雾下在来自Waters的XBridge C₁₈ 3.5μM(2.1×30mm)柱上运行样本。溶剂梯度具有2min的总运行时间且介于5％B至95％B之间。

将缓冲液室及血浆室中的化合物的峰面积视为100％化合物。自这样的结果推导出结合至血浆的百分比且将其报告为结合至血浆的百分比。

通过显微镜检查最终测试浓度的化合物在PBS中的溶解性以显示是否观察到沉淀。

6.4.微粒体稳定性

6.4.1.微粒体稳定性，1h孵育程序

在96深孔板(Greiner，目录编号为780285)中的182mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中将存于DMSO中的10mM化合物储备溶液稀释1000倍并在37℃下预孵育。

将40μL去离子水添加至聚丙烯Matrix 2D条形码标记的储存管(ThermoScientific)的孔中并在37℃下预孵育。

在182mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)工作储备溶液并在使用前将其放置于冰上。在去离子水中制备含有MgCl₂、葡萄糖-6-磷酸酯及NADP+的辅因子并在使用前将其放置于冰上。

制备含有目标物种(人类、小鼠、大鼠、狗)的肝微粒体(Xenotech)、前文所述的G6PDH及辅因子的最终工作溶液且在室温下将此混合物孵育不超过20min。

向Matrix管中的40μL预热水中添加30μL预热化合物稀释液并添加30μL微粒体混合物。最终反应浓度是3μM化合物、1mg微粒体、0.4U/mL GDPDH、3.3mM MgCl₂、3.3mM葡萄糖-6-磷酸酯及1.3mM NADP+。

为测定在零时刻化合物的剩余百分比，在添加微粒体混合物前向孔中添加MeOH或MeCN(1∶1)。用Matrix Sepra密封件(Matrix，目录编号为4464)将板密封并振荡数秒以确保所有组份都完全混合。

在37℃、300rpm下孵育未终止的样本，且在孵育1hr后使用MeOH或MeCN(1∶1)终止反应。

在终止反应后，混合样本并将其于冰上放置30min以沉淀蛋白质。然后在1200rcf下在4℃下将板离心30min且将上清液转移至96v形底PP板(Greiner，651201)中用以在LCMS上分析。

使用Kinesis，Cambs，PE19 8YX，UK的密封垫(MA96RD-04S)将这样的板密封且于室温下在LCMS(来自Waters的ZQ 1525)上在最佳条件下使用Quanoptimize测定样本以确定母体分子的适当质量。

以1mL/min的流速在LCMS上分析样本。根据所用终止溶液，溶剂A是15mM氨且溶剂B是甲醇或乙腈。在阳离子喷雾下在来自Waters的XBridge C₁₈ 3.5μM(2.1×30mm)柱上运行样本。溶剂梯度具有2min的总运行时间且介于5％B至95％B之间。

将0时刻时母体化合物的峰面积视为剩余100％。自0时刻计算孵育1hr后的剩余百分比且将其计算为剩余百分比。通过显微镜检查最终测试浓度的化合物在缓冲液中的溶解度且报告结果。

关于微粒体稳定性的数据表示为60min后剩余化合物总量的百分比。

6.4.2.微粒体稳定性，30min孵育程序

在96深孔板(Greiner，目录编号为780285)中的105mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中将于DMSO中的10mM化合物储备溶液稀释至6μM并在37℃下预热。

在105mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中将700U/ml的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH，Roche，10127671001)工作储备溶液稀释700倍。在105mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中将含有0.528M MgCl₂.6H₂O(Sigma，M2670)、0.528M葡萄糖-6-磷酸酯(Sigma，G-7879)及0.208MNADP+(Sigma，N-0505)的辅因子混合物稀释8倍。

制备含有目标物种(人类、小鼠、大鼠、狗......)的1mg/ml肝微粒体(Provider，Xenotech)、0.8U/ml G6PDH及辅因子混合物(6.6mM MgCl2、6.6mM葡萄糖-6-磷酸酯、2.6mMNADP+)的工作溶液。在室温下，将此混合物预孵育15min但不能超过20min。

预孵育之后，以相等量一起添加化合物稀释液及含有微粒体的混合物并以300rpm孵育30min。对于第0min的时间点而言，向化合物稀释液中添加2体积甲醇，然后添加微粒体混合物。孵育期间的最终浓度为：3μM测试化合物或对照化合物、0.5mg/ml微粒体、0.4U/mlG6PDH、3.3mM MgCl₂、3.3mM葡萄糖-6-磷酸酯及1.3mM NaDP+。

在孵育30min之后，使用2体积甲醇终止反应。

在两个时间点中，混合样本，离心且收获上清液以用于在LC-MS/MS上进行分析。仪器反应(即峰高)可参照零时间点样本(100％)以测定剩余化合物的百分比。在分析设计中包含标准化合物心得安(Propanolol)及维拉帕米(Verapamil)。

关于微粒体稳定性的数据表示为30min后剩余化合物总量的百分比。

肝细胞稳定性(100μM式II的[¹⁴C]-化合物在不同物种的肝细胞悬浮液中孵育24h后式II化合物及其主要代谢物的浓度(总放射活性％))

6.5. Caco2渗透性

如下文所述实施双向Caco-2分析。Caco-2细胞自欧洲动物细胞培养物收集中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，目录编号为86010202)获得且在24孔Transwell板(Fisher TKT-545-020B)中进行21天的细胞培养后使用。

将2×10⁵个细胞/孔接种于由DMEM+GlutaMAXI+1％NEAA+10％FBS(FetalCloneII)+1％Pen/Strep组成的平板培养基中。每2-3天更换培养基。

在含有25mM HEPES(pH 7.4)的翰克司(Hanks′)平衡盐溶液中制备测试化合物及参照化合物(普萘洛尔(propranolol)及罗丹明(rhodamine)123或长春碱，所有化合物都是自Sigma购得)且以10μM的浓度将其添加至Transwell板总成的顶室(125μL)或底侧室(600μL)中，其中最终DMSO浓度为0.25％。

将50μM荧光黄(Sigma)添加至所有孔中的供体缓冲液中以通过监测荧光黄渗透性来平均细胞层的完整性。因荧光黄(LY)不能自由渗透磷亲脂性障壁，故高程度的LY转运表明细胞层的完整性较差。

在37℃下于轨道振荡器中以150rpm振荡孵育1小时后，自顶室(A)及基底室(B)二者中取出70μL等分样本并将其添加至96孔板中含有分析性内标(0.5μM卡马西平(carbamazepine))的100μL 50∶50乙腈∶水溶液中。

使用Spectramax Gemini XS(Ex 426nm及Em 538nm)在含有来自底侧及顶侧的150μL液体的洁净96孔板中测定荧光黄。

通过高效液相色谱/质谱(LC-MS/MS)测定样本中的化合物浓度。

根据以下关系计算表观渗透率(P_app)值：

P_app＝[化合物]_{受体最终浓度}×V_受体/([化合物]_{供体初始浓度}×V_供体)/T_孵育×V_供体/表面积×60×10^-6cm/s

V＝室体积

T_inc＝孵育时间。

表面积＝0.33cm²

使用P_app B＞A/P_app A＞B的比率计算流出比来指示来自顶室表面的主动流出。

使用下列分析接受标准：

普萘洛尔：P_app(A＞B)值≥20(×10^-6cm/s)

罗丹明123或长春碱：P_app(A＞B)值＜5(×10^-6cm/s)，其中流出比≥5。

荧光黄渗透率：≤100nm/s

6.6.败血性休克模型

注射脂多糖(LPS)会诱导向周围快速释放可溶肿瘤坏死因子(TNF-α)。使用此模型来分析有希望的体内TNF释放阻断剂。

以预期给药物量(一次，po)治疗每组6只BALB/cJ雌性小鼠(20g)。30分钟后，腹膜内注射LPS(15μg/kg；大肠杆菌(E.Coli)血清型0111：B4)。90分钟后，使小鼠安乐死并收集血液。使用市售ELISA试剂盒确定循环TNFα含量。使用地塞米松(5μg/kg)作为参照消炎化合物。

6.7. MAB模型

MAB模型允许快速评价治疗剂对RA样炎症性反应的调节(Khachigian LM.NatureProtocols(2006)2512-2516：Collagen antibody-induced arthritis)。对DBA/J小鼠静脉内注射针对胶原II的mAb混合剂。一天后，开始化合物处理(媒剂：10％(v/v)HPβCD)。三天后，小鼠接受腹膜内LPS注射(50μg/小鼠)，从而导致炎症快速发作。继续进行化合物治疗直至mAb注射后10天为止。通过测定爪肿胀并记录各爪的临床评分来对炎症实施读取。呈现四肢的累积临床关节炎评分以显示炎症的严重性。使用0-4的量表对各肢体应用评分系统，其中4是最严重炎症。

0无症状

1一类关节(例如踝或腕)轻微、但明显充血且肿胀、或限于个别脚趾的显著充血及肿胀(不管受侵袭脚趾的数量为多少)

2两类或更多类关节中度充血及肿胀

3整个爪(包含脚趾)严重充血及肿胀

4肢体中多处关节出现最大炎症

6.8.肿瘤学模型

Wernig等人，Cancer Cell 13，311，2008及Geron等人，Cancer Cell 13，321，2008阐述了证实小分子对JAK2引发的骨髓组织增殖性疾病的效能的体内模型。

6.9.小鼠IBD模型

Wirtz等人2007阐述了证实小分子对IBD的效能的体外及体内模型。

6.10.小鼠哮喘模型

Nials等人，2008；Ip等人2006；Pernis等人，2002；Kudlacz等人，2008阐述了证实小分子对哮喘的效能的体外及体内模型。

最后意见

本领域技术人员将了解，前述说明是示例性及解释性的，且意欲阐述本发明及其优选实施例。通过常规实验，本领域技术人员将意识到在不背离本发明的精神下可作出明显修改及变化。因此，本发明并不意欲通过以上说明来定义，而通过权利要求书及其等效物来定义。

本说明书引用的所有出版物(包含(但不限于)专利及专利申请)都以引用方式并入本文中作为参考，如同充分陈述的已特定地及个别地指明将各个出版物以引用方式并入本文中一样。

根据前述说明，本领域技术人员可对本发明的组合物及方法作出各种修改及改变。在随附权利要求书的范围内的所有这样的修改都意欲包含于本文中。

应理解，诸如各种化合物的差示细胞渗透能力等因素可促成体外生物化学及细胞分析中的化合物活性间的差异。

如本申请中所给出及阐述的本发明化合物的至少某些化学名称可通过使用市售化学品命名软件程序自动生成，但未经独立验证。实施此功能的代表性程序包含由OpenEye Software公司出售的Lexichem命名工具及由MDL公司出售的Autonom Software工具。在所指示化学名称及所绘的结构不同的情况下，以所绘的结构为准。

本文所显示的化学结构是使用或/DRAW制作的。在本文结构中的碳、氧或氮原子上出现的任何空缺化合价都表示存在氢原子。当结构中存在对称中心但该对称中心未显示特定立体化学时，结构涵盖与对称结构相关的两个对映异构体。

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Claims

1.式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或溶剂合物的药学上可接受的盐

用于制备治疗以下疾病的药物的用途：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

2.根据权利要求1的化合物的用途，其中所述的药物每周一次施用。

3.根据权利要求1的化合物在治疗类风湿性关节炎中的用途。

4.根据权利要求1的化合物在治疗炎症性肠病中的用途。

5.根据权利要求1的化合物在治疗克罗恩氏病和/或结肠炎中的用途。

6.根据权利要求1的化合物在治疗关节黏连性脊椎炎、银屑病和/或银屑病性关节炎中的用途。

7.用于权利要求1至5中任意一项的化合物与另一治疗剂组合的用途。

8.根据权利要求7的化合物的用途，其中所述的又一治疗剂是类风湿性关节炎治疗剂。

9.包含式I化合物：

和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物用于制备治疗以下疾病的药物的用途：炎症性病症、自体免疫疾病、增殖性疾病、过敏、移植排斥、涉及软骨代谢损伤的疾病、先天性软骨畸形和/或与IL6或干扰素分泌过多相关的疾病。

10.根据权利要求9的组合物用途，其中所述的药物每周一次施用。

11.根据权利要求9的药物组合物的用途，其中药物组合物另外包含另一治疗剂。

12.根据权利要求11的药物组合物的用途，其中所述的另一治疗剂是类风湿性关节炎治疗剂。

13.根据权利要求11的药物组合物的用途，其中所述的另一治疗剂是式II：

14.根据权利要求13的药物组合物的用途，其中式I/式II的比率是1/5至1/20。

15.根据权利要求13的药物组合物的用途，其中式I/式II的比率是1/5至1/10。

16.根据权利要求9至14中任意一项的药物组合物用于治疗类风湿性关节炎的用途。

17.根据权利要求9至14中任意一项的药物组合物用于治疗炎症性肠病的用途。

18.根据权利要求9至14中任意一项的药物组合物用于治疗克罗恩氏病和/或结肠炎的用途。

19.根据权利要求9至14中任意一项的药物组合物用于治疗关节黏连性脊椎炎、银屑病和/或银屑病性关节炎的用途。