EA027920B1

EA027920B1 - Композиция микобактериальных антигенов

Info

Publication number: EA027920B1
Application number: EA201390631A
Authority: EA
Inventors: Стефан Андре Жорж Годар; Амина Лаанан; Доминик Ингрид Лемуан
Original assignee: Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2017-09-29
Also published as: EA201390631A1; EP3593813A1; PT3023106T; US20130287809A1; KR20190022897A; AU2011343367A1; SI2651437T1; SI3023106T1; CO6751288A2; CA2819298A1; US9730992B2; US20190183998A1; UA110806C2; JP2013545783A; KR101951894B1; PL3023106T3; CO6751287A2; EA201390630A1; KR20130124525A; HRP20191843T1

Abstract

В изобретении представлена иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая М72-родственный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID No: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше, и значение рН указанной композиции находится в диапазоне от 7,0 до 9,0. Также предложена дозированная форма и применение указанной иммуногенной композиции в медицине.

Description

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим М72-родственный антиген и имеющим низкую ионную силу. Настоящее изобретение также относится к таким иммуногенным композициям, которые дополнительно содержат один или более иммуностимуляторов. Также описаны способы изготовления таких иммуногенных композиций и соответствующих наборов.

Предшествующий уровень техники

Туберкулез (ТВ) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией МусоЪас1егшт 1иЪегси1о818 и другими видами МусоЪас1егшт. Он является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света. Считается, что более чем 2 миллиарда людей инфицированы ТВ бациллами, причем каждый год наблюдается приблизительно 9,4 миллиона новых случаев ТВ и 1,7 миллиона смертей. У 10% людей, инфицированных ТВ бациллами, разовьется активный ТВ, причем каждый человек с активным ТВ инфицирует в среднем 10-15 других человек в год. В то время как ежегодные показатели коэффициента заболеваемости повсеместно достигли пика число смертей и случаев туберкулеза все еще возрастает ввиду роста населения (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о818 Рас18, 2010).

Белковые антигены МЛ72Г и М72 (описанные, например, в международной патентной заявке АО 2006/117240) или их фрагменты либо производные представляют собой белковые антигены, потенциально полезные для лечения или предупреждения туберкулеза.

Состав композиций белковых антигенов чрезвычайно важен для того, чтобы гарантировать поддержание иммуногенности. Иногда чтобы усилить иммунный ответ на какой-либо заданный антиген, используют иммуностимуляторы. Однако включение адъювантов в иммуногенную композицию усложняет процедуру приготовления компонентов, а также усложняет распределение и технологию изготовления данной композиции. Процедура приготовления каждого из адъювантных компонентов, а также антигенного компонента должна учитываться разработчиками рецептур. В частности, следует учитывать совместимость антигенного компонента с адъювантным компонентом. Это, в частности, относится к случаю, когда лиофилизированные антигены или антигенные препараты предполагается восстанавливать адъювантным препаратом. В таком случае важно, чтобы буфер адъювантного препарата подходил для антигена и чтобы иммуногенность или растворимость антигена не изменялась под действием адъюванта.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения впервые установили, что М72-родственные антигены особенно чувствительны к присутствию солей. Не будучи ограниченными теорией, полагают, что на М72родственные антигены пагубно воздействует явление, известное как высаливание, которое можно определить как выпадение в осадок белка из своего раствора в результате взаимодействия с такими солями, как хлорид натрия. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти антигены агрегируют и выпадают в осадок уже в концентрации хлорида натрия 150 мМ. Следовательно, стабильность иммуногенных композиций, содержащих М72-родственные антигены, неожиданно может быть улучшена путем уменьшения концентрации хлорида натрия.

Соответственно согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая М72-родственный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с δΕφ ΙΌ Νο: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше, и значение рН указанной композиции находится в диапазоне от 7,0 до 9,0.

Предпочтительно электропроводность композиции составляет 4 мСм/см или меньше.

Более предпочтительно электропроводность композиции составляет 3 мСм/см или меньше.

Предпочтительно концентрация солей в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.

Более предпочтительно концентрация хлорида натрия в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.

В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит неионное вещество, регулирующее тоничность.

Предпочтительно неионное вещество, регулирующее тоничность, представляет собой полиол.

Более предпочтительно полиол представляет собой сорбит, и концентрация сорбита составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).

Предпочтительно концентрация сахарозы составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).

В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более иммуностимуляторов.

Предпочтительно иммуностимулятор представляет собой сапонин и/или агонист ТЕК4 (То11подобный рецептор 4).

Предпочтительно иммуногенная композиция содержит 0821.

Предпочтительно агонист ТЕК4 представляет собой липополисахарид.

Более предпочтительно иммуногенная композиция по изобретению содержит 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А.

- 1 027920

В одном воплощении осмоляльность иммуногенной композиции по изобретению составляет 250750 мОсм/кг.

В одном воплощении значение рН указанной композиции находится в диапазоне от 7,5 до 8,5.

В еще одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению М72-родственный антиген состоит из последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности с 8ЕО ГО Νο: 1.

Предпочтительно М72-родственный антиген содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 3.

Более предпочтительно, М72-родственный антиген состоит из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО Νο: 3.

Согласно другому аспекту предложено применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении лекарственного препарата для профилактики, лечения или ослабления инфекции МусоЬасбегшш биЬегси1о818.

Предпочтительно предложено применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении лекарственного препарата для введения человеку.

Согласно еще одному аспекту предложена дозированная форма иммуногенной композиции по изобретению, где стандартная доза составляет от 50 мкл до 1 мл и содержит 5-50 мкг М72-родственного белка.

Предпочтительно стандартная доза представляет собой дозу для человека и содержит от 1 до 100 мкг 3Ό-ΜΡΕ (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А).

Предпочтительно стандартная доза представляет собой дозу для человека и содержит от 1 до 100 мкг 0821.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - кривая литической активности 0821.

Фиг. 2. - процентное содержание каждого родственного 3Ό-ΜΡΕ соединения (сопдепег) в разных композициях А8А.

Фиг. 3. - ЭБ8 (динамическое светорассеяние) иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями Ναί',Ί после хранения.

Фиг. 4. - нефелометрия иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 5. - антигенная стабильность иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 6а-6г. - ВЭЖХ-анализ (высокоэффективная жидкостная хроматография) иммуногенных композиций в сочетании с эксклюзионной (гель-проникающей) хроматографией (ЭХ) с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 7. - антигенность иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 8. - электропроводность стандартных растворов №С1.

Фиг. 9. - индукция СГО4 Т-клеточных ответов у мышей с использованием иммуногенных композиций по изобретению.

Фиг. 10. - индукция СГО8 Т-клеточных ответов у мышей с использованием иммуногенных композиций по изобретению.

Фиг. 11. - нефелометрия иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 12. - ЭБ8 иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 13. - антигенность иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Краткое описание идентификаторов последовательностей.

8Е0 ГО Νο: 1 - аминокислотная последовательность для белка М72.

8Е0 ГО Νο: 2 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок М72.

8Е0 ГО Νο: 3 - аминокислотная последовательность для белка М72 с двумя Ν-концевыми остатками

Ηΐδ.

8Е0 ГО Νο: 4 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок М72 с двумя Ν-концевыми остатками ΗΪ8.

8Е0 ГО Νο: 5 - аминокислотная последовательность для белка М(Ь72Г.

8Е0 ГО Νο: 6 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок МбЬ72Г.

8Е0 ГО Νο: 7 - аминокислотная последовательность для белка МбЬ72Г с шестью Ν-концевыми остатками Ηΐδ.

8Е0 ГО Νο: 8 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок МбЬ72Г с шестью Νконцевыми остатками Ηΐδ.

8Е0 ΙΌ Νο: 9 - нуклеотидная последовательность для СрС Олиго 1 (СрС 1826).

8Е0 ГО Νο: 10 - нуклеотидная последовательность для СрС Олиго 2 (СрС 1758).

- 2 027920 δΕΟ ГО Νο: 11 - нуклеотидная последовательность для СрС Олиго 3.

δΕΟ ГО N0: 12 - нуклеотидная последовательность для СрО Олиго 4 (СрО 2006).

δΕΟ ΙΌ Νο: 13 - нуклеотидная последовательность для СрО Олиго 5 (СрО 1686).

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения описана иммуногенная композиция, содержащая М72родственный антиген, где электропроводность композиции составляет 13 мСм/см или меньше. В частности, согласно настоящему изобретению описаны иммуногенные композиции, содержащие М72родственный антиген, где электропроводность данной иммуногенной композиции составляет 12 мСм/см или меньше, например 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность иммуногенной композиции составляет 2,5 мСм/см или меньше, как, например, 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше. В следующем конкретном воплощении электропроводность иммуногенной композиции составляет 1,5-2,5 мСм/см.

Во втором аспекте настоящего изобретения описана иммуногенная композиция, содержащая М72родственный антиген, где концентрация солей в указанной композиции составляет 130 мМ или меньше. В частности, описаны иммуногенные композиции, содержащие М72-родственный антиген, где концентрация солей в указанной композиции составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанной композиции составляет 35 мМ или меньше, как, например, 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше. В следующем конкретном воплощении концентрация солей в указанной композиции составляет 20-40 мМ, например 25-35 мМ.

В третьем аспекте настоящего изобретения описана иммуногенная композиция, содержащая М72родственный антиген, где концентрация хлорида натрия составляет 130 мМ или меньше. В частности, описаны иммуногенные композиции, содержащие М72-родственный антиген, где концентрация хлорида натрия составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше, 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 15 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация хлорида натрия в иммуногенной композиции составляет 10 мМ или меньше, например 7,5 мМ или меньше. Соответственно концентрация хлорида натрия в иммуногенной композиции составляет или 5 мМ, или меньше. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция, по существу, не содержит хлорида натрия. Под термином по существу, не содержит понимают, что концентрация хлорида натрия равна нулю или имеет очень близкое к нулю значение в мМ (как, например, 3 мМ или меньше, 2 мМ или меньше либо 1 мМ или меньше).

Соответственно концентрация СаС12 в иммуногенных композициях будет составлять 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше, 15 мМ или меньше либо 10 мМ или меньше.

Соответственно концентрация Μ§δΟ₄ в иммуногенных композициях будет составлять 80 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 10 мМ или меньше.

Соответственно общая концентрация ионов ΝΗ₄+, Мд²² и Са²' в иммуногенных композициях будет составлять 80 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 10 мМ или меньше.

Иммуногенные композиции по изобретению будут представлять собой водные препараты.

Электропроводность иммуногенной композиции по изобретению можно измерить, используя методы, известные в данной области, например, посредством специально предназначенного для этой цели кондуктометра или другого прибора, с помощью которого можно измерить электропроводность. Одним из подходящих приборов является 2с1а4/сг Ναηο Ζδ от Ма1уеги 1п81гитеи18 (Соединенное Королевство).

Используя известные методы и наборы, специалист может легко определить концентрацию как ионов натрия (№+), так и хлорид-ионов (С1^-). Например, натрий можно определить, используя такой набор, как набор для ферментативного определения натрия (номер по каталогу ΒΟ011ΕΛΕΕ) от Вю8ирр1у. Хлорид можно определить, используя такой набор, как набор для ферментативного определения хлорида (номер по каталогу ВО006ЕАЕБ) от Вю8ирр1у.

Туберкулез (ТВ) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией МусоЪас1егшт 1иЬегси1о45 и другими видами МусоЪас1егшт. Он является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света. Считается, что более чем 2 миллиарда людей инфицированы ТВ бациллами, причем каждый год наблюдается приблизительно 9,4 миллиона новых случаев ТВ и 1,7 миллиона смертей. У 10% людей, инфицированных ТВ бациллами, разовьется активный ТВ, причем каждый человек с активным ТВ инфицирует в среднем 10-15 других человек в год. В то время как ежегодные показатели коэффициента заболеваемости повсеместно достигли пика, число смертей и случаев туберкулеза все еще возрастает ввиду роста населения (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о818 БасК 2010).

МусоЪас1егшт 1иЪегси1о818 инфицирует индивидуумов через дыхательные пути. Альвеолярные макрофаги осуществляют захват этой бактерии, но она способна выживать и пролиферировать путем инги- 3 027920 бирования слияния фагосом с содержащими кислую среду лизосомами. Результатом является комплексный иммунный ответ с участием СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеток, в конечном счете, приводящий к образованию гранулемы. Важным для успешного действия МусоЬайетшт 1иЬетси1о515 как патогена является тот факт, что изолированная, но не уничтоженная бактерия может сохраняться в течение длительных периодов, в результате чего индивидуум остается восприимчивым к развитию впоследствии активного ТВ.

Менее чем у 5% инфицированных индивидуумов активный ТВ развивается в первые годы после инфекции. Гранулема может сохраняться в течение десятилетий, и считается, что она содержит живую МусоЬасЮпит 1иЬегси1о515 в состоянии покоя, лишенную кислорода и питательных веществ. Однако недавно предположили, что большинство бактерий в состоянии покоя локализовано в типах клеток, не являющихся макрофагами, распространенных по всему организму (ЬосЙ е1 а1., Ехрей Ορίη. ΒίοΙ. ТНег.. 2007, 7(11): 1665-1677). Развитие активного ТВ происходит при изменении баланса между врожденным иммунитетом хозяина и патогеном, например, в результате иммуносупрессорного события (Лпйет5оп Р., ТтепЙ5 ίη МютоЬю1оду, 2007, 15(1): 7-13; ЕН1ег5 8., Ыесйоп, 2009, 37(2): 87-95).

Также была предложена динамическая гипотеза, описывающая баланс между латентным ТВ и активным ТВ (Сатйапа Р-1, 1пЛаттаОоп & А11егду - Эгид ТагдеК 2006, 6: 27-39; Сатйапа Р-1, 1пГсс11оп, 2009, 37(2): 80-86).

Несмотря на то что инфекция может быть бессимптомной в течение значительного периода времени, активное заболевание чаще всего проявляется в виде острого воспаления легких, приводящего к утомляемости, уменьшению массы, лихорадке и постоянному кашлю. Отсутствие лечения обычно приводит к серьезным осложнениям и смерти.

Туберкулез, как правило, можно контролировать с использованием длительной терапии антибиотиками, несмотря на то что такое лечение является недостаточным для предупреждения распространения заболевания. Активно инфицированные индивидуумы могут в течение некоторого периода времени в основном не иметь симптомов, но быть заразными. Кроме того, несмотря на то что соблюдение схемы лечения является крайне необходимым, поведение пациента трудно отслеживать. Некоторые пациенты не завершают курс лечения, что может приводить к неэффективному лечению и к развитию лекарственной устойчивости.

ТВ с множественной лекарственной устойчивостью (ΜΌΚ.-ΤΒ) представляет собой форму, которая не отвечает на лекарственные средства первой линии. 3,3% всех случаев ТВ представляют собой ΜΌΚΤΒ, причем каждый год оценочно происходит 440000 новых случаев ΜΌΚ.-ΤΒ. ТВ с повышенной лекарственной устойчивостью (ΧΌΚ.-ΤΒ) встречается, когда помимо устойчивости к лекарственным средствам первой линии развивается устойчивость к лекарственным средствам второй линии. Наличие случаев практически неизлечимого ΧΌΚ.-ΤΒ подтверждено в 58 странах (Всемирная организация здравоохранения, ТиЬегси1о515 РасК 2010).

Даже при завершении полного курса лечения антибиотиками инфекция М. 1иЬегси1о515 у инфицированного индивидуума может не устраняться и может сохраняться в виде латентной инфекции, которая может реактивироваться. Для того чтобы контролировать распространение туберкулеза, крайне важны эффективная программа вакцинации и точная ранняя диагностика заболевания.

В настоящее время наиболее часто используемым способом индукции защитного иммунитета является вакцинация живыми бактериями. Наиболее часто используемой для этой цели микобактерией является РасШщ Са1теие-Сиепп (бацилла Кальметта-Герена) ЩСО), авирулентный штамм М. Ьоу15, который впервые разработали более 60 лет назад. Однако безопасность и эффективность РСС являются предметом дискуссии - защищая против тяжелого проявления заболевания у детей, ΒСΟ не предупреждает возникновение латентного ТВ или реактивацию легочного заболевания во взрослой жизни. Кроме того, в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты, население не вакцинируют этим агентом.

Показано, что некоторые белки, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции МусоЬайетшт, обеспечивают защитную эффективность в моделях вакцинации на животных. Тем не менее, вакцинация антигенами, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции, не может обеспечить оптимальный иммунный ответ на более поздних стадиях инфекции. Для адекватного контроля при латентной инфекции могут требоваться Т-клетки, которые являются специфичными в отношении определенных антигенов, экспрессируемых в это время. Постинфекционные вакцины, которые нацелены непосредственно на покоящиеся персистирующие бактерии, могут способствовать защите от реактивации ТВ, усиливая посредством этого контроль за ТВ или даже способствуя устранению инфекции. Поэтому вакцина, нацеленная на латентный ТВ, могла бы значительно и экономично снизить общие уровни зараженности ТВ.

Субъединичные вакцины на основе антигенов поздней стадии также можно использовать в комбинации с антигенами ранней стадии для получения многофазной вакцины. Альтернативно, антигены ранней и/или поздней стадии могли бы быть использованы для дополнения и улучшения вакцинации ΒСΟ (либо путем усиления ответа на ΒСΟ, либо путем разработки усовершенствованных рекомбинантных штаммов ΒСΟ).

Белковые антигены М(Ь72Г и М72 представляют собой белковые антигены, потенциально полезные для лечения или предупреждения туберкулеза. Показано, что М(Ь72Г обеспечивает защиту в ряде живот- 4 027920 ных моделей (см., например: Вгапй! е! а1., 1пГес!. 1ттип. 2004, 72(11): 6622-6632; 8ке1ку е1 а1., 1. 1ттипо1. 2004, 172: 7618-7628; Тзепоуа е! а1. 1пГес!. 1ттип. 2006, 74(4): 2392-2401; Кеей е! а1. ΡΝΑ8, 2009, 106(7): 2301-2306). М!Ь72Г также проходил клинические исследования (Уоп ЕксЬеп е! а1. 2009, Нитап Уассшек, 5(7): 475-482). М72 представляет собой улучшенный антиген, который включает единственную мутацию серина на аланин по сравнению с М!Ь72Г, что приводит к улучшенным характеристикам стабильности. Также было показано, что М72-родственные антигены полезны в модели латентного ТВ (международная патентная заявка 40 2006/117240).

Использованный в данном описании термин М72-родственный антиген относится к белку М72, приведенному в 8ЕО ГО Νο: 1, или его иммуногенному производному. Использованный в данном описании термин производное относится к антигену, который является модифицированным относительно эталонной последовательности. Иммуногенные производные настолько схожи с эталонной последовательностью, что сохраняют иммуногенные свойства эталонной последовательности и сохраняют способность обеспечения иммунного ответа, который должен генерироваться против эталонной последовательности. Производное, например, может содержать модифицированный вариант эталонной последовательности или, альтернативно, может состоять из модифицированного варианта эталонной последовательности.

Например, М72-родственный антиген может содержать меньше 1500 аминокислотных остатков, например меньше 1200 аминокислотных остатков, в частности меньше 1000 аминокислотных остатков, особенно меньше 800 аминокислотных остатков.

Т-клеточные эпитопы представляют собой короткие непрерывные участки аминокислот, которые распознаются Т-клетками (например, СГО4+ или СГО8+ Т-клетками). Идентификация Т-клеточных эпитопов может быть достигнута с помощью экспериментов по эпитопному картированию, которые известны специалисту в данной области (см., например, Раи1, Рипйатеп!а1 1ттипо1оду, 3гй ей, 243-247 (1993); Ве1вЬапЬ е! а1., ВюшГогтайск, 2005, 21(8ирр1. 1): Ϊ29-Ϊ37). В разнотипной аутбредной популяции, такой как люди, наличие различных типов НЬЛ (антиген лимфоцитов человека) означает, что специфические эпитопы могут не распознаваться всеми членами популяции. Исходя из решающего значения Тклеточного ответа при туберкулезе, чтобы максимизировать уровень распознавания и величину иммунного ответа, желательно, чтобы иммуногенное производное М72 содержало большинство интактных Тклеточных эпитопов (или соответственно все эпитопы).

Специалисту будет известно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в белке М72, приводящие к изменению, добавлению или делеции одной аминокислоты или малой процентной доли аминокислот, представляют собой иммуногенное производное, когда данное(ые) изменение(я) приводит(ят) к замене аминокислоты функционально аналогичной аминокислотой или к замене/делеции/вставке остатков, которые, по существу, не затрагивают иммуногенной функции.

Таблицы консервативных замен, дающих функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области. В общем случае, такие консервативные замены будут попадать в одну из групп аминокислот, определенную ниже, хотя в некоторых случаях могут быть возможны другие замены без существенного влияния на иммуногенные свойства антигена. Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются типичными консервативными заменами друг друга:

1) аланин (А), глицин (С);

2) аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (Ν), глутамин (О);

4) аргинин (К), лизин (К);

5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (У);

6) фенилаланин (Р), тирозин (Υ), триптофан (4);

7) серии (8), треонин (Т) и

8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, СгещШон Рго!е1и8, 1984).

Соответственно такие замены не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.

Иммуногенные производные также могут включать такие производные, где по сравнению с эталонной последовательностью вставлены дополнительные аминокислоты. Соответственно такие вставки не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Один из примеров вставок включает короткий участок остатков гистидина (например, 2-6 остатков) для облегчения экспрессии и/или очистки рассматриваемого антигена.

Иммуногенные производные включают такие производные, где по сравнению с эталонной последовательностью аминокислоты делетированы. Соответственно такие делеции не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.

Специалисту будет известно, что конкретное иммуногенное производное может содержать замены, делеции и вставки (или любую их комбинацию).

Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенную процентную долю аминокислотных остатков,

- 5 027920 которые являются одинаковыми (т.е. идентичны на 70%, возможно, идентичны на 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% в определенной области), при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или в указанной области при измерении с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем выравнивания вручную и визуального просмотра. Это определение также относится к последовательности, комплементарной тестируемой последовательности. Возможно, идентичность существует в области, которая имеет длину по меньшей мере 500 аминокислот, например, по меньшей мере 600 аминокислот или по меньшей мере 700 аминокислот. Соответственно сравнение выполняют в окне, соответствующем полной длине эталонной последовательности (при сравнении с производной последовательностью).

При сравнении последовательностей обычно одна последовательность действует в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы с алгоритмом для сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей далее рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности на основании параметров программы.

Термин окно сравнения, как он использован здесь, относится к сегменту, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом следующих один за другим положений, после оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по 8ιηίί1ι & \Уа1сгтап. Αάν. Αρρί. Ма1й. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания по №ей1етап & ^ииксй, 1. Μοί. Βίοί. 48: 443 (1970), способом поиска сходства по Реагкоп & Ыртап, Ргос. ΝαΙ'1. Асай. 8с! И8А, 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (САР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, РА8ТА и ТРА8ТА в Χνίκ^ηκίη Сепейск 8оП\уаге Раскаде, Сепейск Сотри1ег Сгоир, 575 8шеисе Иг., Майкоп, XVI) или с помощью выравнивания вручную и визуального просмотра (см., например, Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (приложение к АикиЬе1 е! а1., ейк. 1995)).

Одним из примеров полезного алгоритма является РГЬЕИР. РГЬЕИР формирует множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивных попарных выравниваний с целью выявления взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также производит построение древа или дендрограммы, показывающего(ей) соотношения между кластерами, используемые для выравнивания. Р1ЬЕНР использует упрощение метода прогрессивного выравнивания по Репд & ЭооШЙе, ί. Мо1. Ενοί., 35: 351-360 (1987). Используемый способ аналогичен способу, описанному в Шддшк & 8Ьагр, САВ1О8, 5: 151-153 (1989). Данная программа может выравнивать до 300 последовательностей включительно, каждая из которых имеет максимальную длину 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее сходных последовательностей с образованием кластера из двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают простым удлинением попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Окончательное выравнивание достигается серией прогрессивных попарных выравниваний. Программа работает путем указания специфических последовательностей и координат их аминокислот для областей сравнения последовательностей и путем указания параметров программы. Используя Р1ЬЕиР, эталонную последовательность сравнивают с другими тестируемыми последовательностями для определения соотношения процента идентичности последовательностей, применяя следующие параметры: вес разрыва по умолчанию (3,00), вес длины разрыва по умолчанию (0,10) и взвешенные концевые разрывы. РШЕНР может быть получен из пакета программ ССС для анализа последовательности, например, версии 7.0 (^еνе^еаиx е! а1., Мс. Ашйк Кек., 12: 387-395 (1984)).

Другим примером алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ВЬА8Т и ВЬА8Т 2.0, которые описаны в А1!ксйи1 е! а1., Мс. Ашйк Кек., 25: 3389-3402 (1977) и А1!ксЬи1 е! а1., ί. Мо1. Вю1., 215: 403-410 (1990) соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов с использованием ВЬА8Т общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (США) (веб-сайт: \у\у\у.псЫп1т.ш11.до\'/). Этот алгоритм на первом этапе включает идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (Н8Р) путем идентификации коротких слов длиной V в анализируемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют определенному положительному пороговому баллу Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т обозначает пороговый балл соседнего слова (А1!ксйи1 е! а1., выше). Эти изначальные совпадения соседних слов действуют в качестве затравок для инициации поисков с целью нахождения более длинных Н8Р, содержащих их. Совпадения слов удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательно- 6 027920 сти, пока кумулятивный балл выравнивания может возрастать. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей рассчитывают, используя параметры М (премиальный балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для вычисления кумулятивного балла в отношении аминокислотных последовательностей используют матрицу баллов. Удлинение совпадений слов в каждом направлении прекращается, когда кумулятивный балл выравнивания снижается на значение X от своего максимально достигнутого значения; кумулятивный балл снижается до нуля или меньше из-за накопления одного или более чем одного выравнивания остатков с отрицательным баллом или достигается конец любой из последовательностей. Параметры V, Т и X алгоритма ВЬА§Т определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ΒΕΆδΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) в качестве параметров по умолчанию используют длину слова (XV). равную 11; ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе ВЬАЗТР в качестве параметров по умолчанию используют длину слова, равную 3; ожидание (Е), равное 10; и выравнивания (В) по матрице баллов ВЬО§иМ62 (см. НсшкоГГ & НсшкоГГ Ргос. Ναΐΐ. Асаб. δοί. И8А, 89: 10915 (1989)), равные 50; ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм ВЬА§Т также производит статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Кат1ш & АЙ8сйи1, Ргос. №Г1. Асаб. 8с1. И8А, 90: 5873-5787 (1993)). Одним из критериев сходства, предоставляемых алгоритмом ВЬА§Т, является наименьшая суммарная вероятность (Ρ(Ν)), которая дает указание вероятности, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001.

В любом случае иммуногенные производные полипептидной последовательности будут, по существу, обладать такой же активностью, что и эталонная последовательность. Под по существу, такой же активностью подразумевают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и особенно по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе ίη νίίτο повторной стимуляции РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) или цельной крови специфическими антигенами (например, повторной стимуляции в течение периода времени от нескольких часов до двух недель включительно, как, например, до одних суток включительно, от 1 суток до 1 недели или от 1 до 2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством лимфопролиферации, продуцирования цитокинов в супернатанте культуры (с помощью ЕЬРЗА (твердофазный иммуноферментный анализ), СВА (суЮтейтс Ьеаб аггау) и т.д.) или определения параметров Т- и В-клеточных ответов путем внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с использованием антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как СИ3, СИ4, СИ8, 1Ь2 (интерлейкин-2), ТОТа (фактор некроза опухолей-альфа), ΙΡΝ§ (интерферон-гамма), СИ40Е, СГО69 и т.д.) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответственно под по существу, такой же активностью понимают по меньшей мере 50%, подходяще по меньшей мере 75% и особенно по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продуцирования ΙΡΝ-гамма.

Конкретные производные белка М72 включают производные, которые содержат дополнительные остатки Ηΐδ на Ν-конце (например, два остатка Ηΐδ, как приведено в §ЕЦ ΙΌ Νο: 3; или полигистидиновую метку из пяти или особенно шести остатков Ηΐδ, которые могут быть использованы для никельаффинной очистки). М(Ь72Г (8ЕЦ ГО Νο: 5), содержащий исходный остаток серина, который подвергнут мутации в М72, представляет собой другое производное М72, как и белки М(Ь72Г с дополнительными остатками Ηΐδ на Ν-конце (например, двумя остатками Ηΐδ или полигистидиновой меткой из пяти или особенно шести остатков Ηΐδ, которые могут быть использованы для никель-аффинной очистки).

Соответственно М72-родственный антиген будет содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с М72, как, например, по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 90%, особенно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 99%, например, состоять из нее. Возможно, М72-родственный антиген будет содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичности с М72, например, состоять из нее.

Типичные М72-родственные антигены будут содержать иммуногенное производное с 8ЕЦ ГО Νο: 1 или 3, имеющее незначительное число делеций, вставок и/или замен, например, состоять из него. Примерами являются таковые, имеющие делеции до 5 остатков включительно в 0-5 положениях, вставки до 5 остатков включительно в 0-5 положениях и замены до 20 остатков включительно.

Другими иммуногенными производными М72 являются производные, содержащие фрагмент §ЕЦ ГО Νο: 1 или 3, имеющий длину по меньшей мере 500 аминокислот, например, длину по меньшей мере 600 аминокислот или длину по меньшей мере 700 аминокислот, например, состоящие из него.

М72-родственные антигены могут быть получены способами, описанными ранее (νθ 2006/117240), способами, приведенными в разделе Примеры, или аналогичными им способами.

Иммуногенные композиции могут содержать один или более чем один другой антигенный компо- 7 027920 нент. Такие дополнительные антигенные компоненты сами по себе не должны быть чувствительны к присутствию солей в композиции.

Дополнительные антигенные компоненты могут быть предназначены для усиления или дополнения иммунных ответов, обусловленных М72-родственным антигеном в области предупреждения и терапии туберкулеза, или дополнительные антигены могут быть объединены с другими патогенами и предназначены для введения вместе с М72-родственным антигеном из соображений удобства. Если в композиции присутствует несколько антигенных компонентов, то они могут быть предложены в форме индивидуальных полипептидов или слитых белков. В некоторых случаях дополнительные антигенные компоненты могут быть предложены в виде полинуклеотида (или полинуклеотидов).

Хорошо известно, что растворы для парентерального введения должны иметь фармацевтически приемлемую осмоляльность, чтобы избежать деформации или лизиса клеток. Фармацевтически приемлемая осмоляльность обычно будет означать, что растворы будут иметь осмоляльность, приблизительно соответствующую изотоническому или слегка гипертоническому раствору. Соответственно иммуногенные композиции по настоящему изобретению будут иметь осмоляльность в диапазоне 250-750 мОсм/кг, например, осмоляльность может находиться в диапазоне 250-550 мОсм/кг, как, например, в диапазоне 280-500 мОсм/кг.

Осмоляльность можно измерить согласно методам, известным в данной области техники, например, путем применения имеющегося в продаже осмометра, например, модели 2020 ЛДуаисеД®, приобретаемой у ЛДуаисеД 1п51титеп15 1пс. (США).

Веществом, придающим изотоничность является соединение, которое является физиологически допустимым и придает подходящую тоничность композиции с целью предупреждения потока воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с данной композицией.

В общем случае в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют хлорид натрия (ЯаС1). Авторы настоящего изобретения впервые показали, что такие М72-родственные антигены особенно чувствительны к высаливанию, процессу, при котором белки в растворе агрегируют или коагулируют при нахождении в растворах, содержащих соль в высоких концентрациях. Поэтому предложены альтернативные средства, обеспечивающие придание иммуногенным композициям по изобретению фармацевтически приемлемой осмоляльности.

В конкретном воплощении предложены иммуногенные композиции, дополнительно содержащие неионное вещество, регулирующее тоничность. Необходимо, чтобы регулирующее тоничность неионное вещество, применяемое в иммуногенной композиции, само было фармацевтически приемлемым, например, подходящим для применения у людей, а также совместимым с М72-родственным антигеном и также совместимым с другими компонентами, такими как иммуностимулятор(ы).

В одном воплощении настоящего изобретения подходящими неионными веществами, регулирующими тоничность, являются полиолы, сахара (в частности, сахароза, фруктоза, декстроза или глюкоза) или аминокислоты, такие как глицин. В одном воплощении полиол представляет собой спирт сахаров, особенно спирт С_3-6сахаров. Типичные спирты сахаров включают глицерин, эритрит, треит, арабит, ксилит, рибит, сорбит, маннит, дульцит и идит. В конкретном примере этого воплощения подходящим неионным веществом, регулирующим тоничность, является сорбит. Специалисту будет известно, что соответствующую осмоляльность можно достичь посредством применения смеси разных веществ, регулирующих тоничность. В конкретном воплощении изобретения регулирующее тоничность неионное вещество в композициях по настоящему изобретению включает сахарозу и/или сорбит.

В одном воплощении подходящая концентрация полиола в иммуногенной композиции составляет от приблизительно 2,5 до приблизительно 15% (мас./об.), в частности от приблизительно 2,5 до приблизительно 10% (мас./об.), например от приблизительно 3 до приблизительно 7% (мас./об.), как, например, от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.). В конкретном примере этого воплощения полиолом является сорбит.

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит сахарозу и сорбит. В таких случаях иммуногенная композиция соответственно может содержать от приблизительно 2,5 до приблизительно 15% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 2,5 до приблизительно 15% (мас./об.) сорбита, в частности от приблизительно 2,5 до приблизительно 10% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 2,5 до приблизительно 10% (мас./об.) сорбита, например от приблизительно 3 до приблизительно 7% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 3 до приблизительно 7% (мас./об.) сорбита, как, например от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.) сорбита.

Значение рН иммуногенных композиций должно подходить для парентерального введения. Обычно значение рН будет находиться в диапазоне от 6,0 до 9,0. Соответственно значение рН будет находиться в диапазоне 7,0-9,0, в частности 7,25-8,75, например 7,5-8,5, в частности рН 7,75-8,25. Значение рН приблизительно 8,0 представляет особый интерес.

Значение рН можно регулировать применением буферов, включая, например Трис- или фосфатный буферы.

В конкретном воплощении изобретения иммуногенная композиция содержит один или более иммуностимуляторов.

- 8 027920

В одном воплощении иммуностимулятором может быть сапонин. Особенно подходящим сапонином для применения в настоящем изобретении является Οιιίΐ А и его производные. Οιιίΐ А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дерева Ош11а)а заропапа тойпа, и впервые был описан На1здаатб с1 а1. в 1974 г. (8аротп афиуайз, АтсЫу. Рит Фе дезат!е Упиз&гзсйипд, νοί. 44, 8ртт§ет Ует1ад, Ветйп, р. 243-254) как обладающий адъювантной активностью. Посредством ВЭЖХ были выделены очищенные фракции Οιιίί А с сохранением адъювантной активности без токсичности, связанной с Οιιίί А (^088/09336), например, 087 и 0821 (также известные как 0А7 и 0А21). 0821 является природным сапонином, выделенным из коры 0ш11а)а заропапа тойпа, который индуцирует С.П8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), ТЫ-клетки и преобладающий 1дО2а-антительный ответ. В контексте настоящего изобретения 0821 является предпочтительным сапонином.

В подходящей форме настоящего изобретения сапониновый адъювант в иммуногенной композиции представляет собой производное 0ш1 А заропапа тойпа, в частности иммунологически активную фракцию 0ш1 А, такую как 08-17 или 08-21, наиболее подходит 08-21.

Желательно, чтобы 0821 был предложен в менее реактогенной композиции, где он погашен экзогенным стерином, таким как, например, холестерин. Существует несколько конкретных форм менее реактогенных композиций, где 0821 погашен присутствием холестерина. В конкретном воплощении сапонин/стерин находится в форме липосомной структуры (такой, которая описана в \У0 96/33739, пример 1). В этом воплощении целесообразно, если липосомы содержат нейтральный липид, например фосфатидилхолин, который соответственно не является кристаллическим при комнатной температуре, например фосфатидилхолин яичного желтка, диолеоилфосфатидилхолин (Э0РС) или дилаурилфосфатидилхолин. Липосомы также могут содержать заряженный липид, что повышает стабильность структуры липосома0821 для липосом, состоящих из насыщенных липидов. В этих случаях количество заряженного липида составляет соответственно 1-20% мас./мас., например 5-10% мас./мас. Соотношение стерина и фосфолипида составляет 1-50% (моль/моль), наиболее подходит 20-25% (моль/моль).

Подходящие стерины включают β-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, эргокальциферол и холестерин. В одном конкретном воплощении иммуногенная композиция в качестве стерина содержит холестерин. Такие стерины хорошо известны в данной области, например холестерин описан в Мегск 1пбех, 11-е изд., с. 341 как стерин природного происхождения, обнаруженный в животном жире.

Когда активной сапониновой фракцией является 0821, соотношение О821:стерин обычно будет составлять порядка от 1:100 до 1:1 (мас./мас.), соответственно от 1:10 до 1:1 (мас./мас.) и особенно от 1:5 до 1:1 (мас./мас.). Соответственно имеется избыток стерина, при этом соотношение О821:стерин составляет по меньшей мере 1:2 (мас./мас.). В одном воплощении соотношение О821:стерин равно 1:5 (мас./мас.). Стерин предпочтительно представляет собой холестерин.

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит иммуностимулятор, который представляет собой агонист То11-подобного рецептора 4 (ТЬК4). Под агонистом ТЬК понимают компонент, который способен вызывать ответ путем передачи сигнала через ТЬК-опосредованный сигнальный путь либо в качестве прямого лиганда, либо опосредованно путем образования эндогенного или экзогенного лиганда (8аЬтое е1 а1., 1. 1ттипо1., 2003, р. 1630-5). Агонист ТЬК.4 способен вызывать ответ путем передачи сигнала через ТЬР4-опосредованный сигнальный путь. Подходящим примером агониста ТЬК4 является липополисахарид, соответственно нетоксичное производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3О-МРЬ).

3Э-МРЬ продается под названием МРЬ фирмой О1ахо8тййК1те Вю1ощса1з Ы.А. и во всем документе обозначается как МРЬ или 3Э-МРЬ, см., например, патенты США №№ 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094. 3Э-МРЬ стимулирует, главным образом, СЭ4+Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΡΝ-гамма (ТЫ). Он может быть получен согласно способам, раскрытым в ОВ 2220211 А. С химической точки зрения - это смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В композициях по настоящему изобретению можно использовать небольшие частицы 3П-МРЬ для приготовления иммуногенной композиции. Небольшие частицы 3П-МРЬ имеют такой размер частиц, что их можно стерильно фильтровать через фильтр 0,22 мкм. Такие способы приготовления описаны в \У0 94/21292. Целесообразно, если для приготовления иммуногенных композиций по настоящему изобретению используют порошкообразный 3П-МРЬ.

Другими агонистами ТЬК4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (АОР), как, например, описанные в \У0 98/50399 или патенте США № 6303347 (также описаны способы получения АОР) соответственно КС527 или КС529, или фармацевтически приемлемые соли АОР, которые описаны в патенте США № 6764840. Некоторые АОР представляют собой агонисты ТЬК4, а некоторые представляют собой антагонисты ТЬК4.

Другими подходящими агонистами ТЬК4 являются такие, которые описаны в \У0 2003/011223 и в \У0 2003/099195, как, например, соединения I, II и III, описанные на с. 4 и 5 в \У0 2003/011223 или на с. 3 и 4 в \У0 2003/099195, и в частности, соединения, описанные в \У0 2003/011223 как ЕК 803022, ЕК 803058, ЕК 803732, ЕК 804053, ЕК 804057, ЕК 804058, ЕК 804059, ЕК 804442, ЕК 804680 и ЕК 804764. Например, одним из подходящих агонистов ТЬК-4 является ЕК 804057.

В конкретном воплощении иммуногенная композиция содержит как сапонин, так и агонист ТЬК4.

- 9 027920

В конкретном примере иммуногенная композиция содержит Р821 и 3Ό-ΜΡΕ.

Агонист ТЬК-4, такой как липополисахарид, например ЗЭ-МРЬ, можно использовать в количестве от 1 до 100 мкг иммуногенной композиции на одну дозу для человека. ЗЭ-МРЬ можно использовать на уровне приблизительно 50 мкг, например от 40 до 60 мкг, подходяще от 45 до 55 мкг, или от 49 до 51 мкг, или 50 мкг. В следующем воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 3ΌМРЬ на уровне приблизительно 25 мкг, например от 20 до 30 мкг, целесообразно, если от 21 до 29 мкг, или от 22 до 28 мкг, или от 23 до 27 мкг, или от 24 до 26 мкг, или 25 мкг.

Сапонин, такой как Р821, можно использовать в количестве от 1 до 100 мкг иммуногенной композиции на одну дозу для человека. Р821 можно использовать на уровне приблизительно 50 мкг, например от 40 до 60 мкг, подходяще от 45 до 55 мкг, или от 49 до 51 мкг, или 50 мкг. В следующем воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит Р821 на уровне приблизительно 25 мкг, например от 20 до 30 мкг, подходяще от 21 до 29 мкг, или от 22 до 28 мкг, или от 23 до 27 мкг, или от 24 до 26 мкг, или 25 мкг.

Если в иммуногенной композиции присутствуют и агонист ТЬК4, и сапонин, тогда массовое соотношение агониста ТЕК4 и сапонина подходяще составляет от 1:5 до 5:1, подходяще от 1:2 до 2:1, например приблизительно 1:1. Например, если 3Ό-ΜΡΕ присутствует в количестве 50 или 25 мкг, то подходяще Р821 также может присутствовать в количестве 50 или 25 мкг соответственно на одну дозу иммуногенной композиции для человека. Некоторые иммуногенные композиции по настоящему изобретению содержат Р821 и 3Ό-ΜΡΕ в количестве от 1 до 100 мкг каждого на одну дозу для человека, например в количестве от 10 до 75 мкг каждого на одну дозу для человека. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению соответственно могут содержать Р821 и 3И-МРЬ в количестве от 15 до 35 мкг каждого на одну дозу для человека, например в количестве от 20 до 30 мкг каждого на одну дозу для человека.

В одном воплощении иммуностимулятором является агонист ТЬК9, например, как раскрыто в АО 2008/142133. В конкретном примере указанный агонист ТЬК9 представляет собой иммуностимуляторный олигонуклеотид, в частности олигонуклеотид, содержащий неметилированный мотив СрО. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в АО 96/02555, АО 99/33488 и И8 5865462. Подходящими агонистами ТЬК9 для применения в иммуногенных композициях, изложенных в данном описании, являются СрО-содержащие олигонуклеотиды, возможно содержащие два или более динуклеотидных мотивов СрО, разделенных по меньшей мере тремя, подходяще по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрО представляет собой цитозиновый нуклеотид, за которым следует гуаниновый нуклеотид.

В одном воплощении межнуклеотидной связью в олигонуклеотиде является фосфородитиоатная или возможно фосфоротиоатная связь, хотя также можно было бы использовать фосфодиэфирную и другие межнуклеотидные связи, в том числе олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в и8 5666153, И8 5278302 и АО 95/26204. Предусматриваются олигонуклеотиды, содержащие разные межнуклеотидные связи, например смешанные фосфоротиоатные и фосфодиэфирные. Можно использовать другие межнуклеотидные связи, которые стабилизируют олигонуклеотид.

Примеры СрО-содержащих олигонуклеотидов, подходящих для включения в иммуногенные композиции, изложенные в данном описании, имеют приведенные ниже последовательности. В одном воплощении эти последовательности содержат фосфоротиоат-модифицированные межнуклеотидные связи

ОЛИГО 1 (8ΕΘ Ю Νο: 9): ТСС АТС АСС ТТС СТО АСС ΤΤ (СрС 1826).

ОЛИГО 2 (8ΕΘ Ю Νο: 10): ТОТ ССС АСС СТО ССС САТ (СрС 1758).

ОЛИГО 3 (8ЕО Ю Νο: 11): АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС

АСС.

ОЛИГО 4 (8ΕΘ Ю Νο: 12): ТСС ТСС ΤΤΤ ТСТ ССТ ΤΤΤ СТО СТТ (СрС

2006).

ОЛИГО 5 (8ΕΘ Ю Νο: 13): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668).

Альтернативные СрО-содержащие олигонуклеотиды могут содержать приведенные выше последовательности, в которых имеются несущественные делеции или добавки.

В одном воплощении иммуностимулятором является токол. Токолы хорошо известны в данной области и описаны в ЕР 0382271. В конкретном воплощении токолом является альфа-токоферол или его производное, такое как сукцинат альфа-токоферола (также известное как сукцинат витамина Е).

Согласно настоящему изобретению также раскрыт способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадии:

а) лиофилизации М72-родственного антигена; и

б) растворения лиофилизированного М72-родственного антигена со стадии (а) с использованием водного раствора, причем электропроводность этого раствора составляет 13 мСм/см или меньше.

В некоторых воплощениях электропроводность водного раствора составляет 12 мСм/см или меньше, например 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность

- 10 027920 водного раствора составляет 2,5 мСм/см или меньше, например 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше.

Подходяще электропроводность водного раствора является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет электропроводность 13 мСм/см или меньше, как, например, 12 мСм/см или меньше, например 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность полученного раствора составляет 2,5 мСм/см или меньше, например 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше.

Также описан способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадии:

а) лиофилизации М72-родственного антигена; и

б) растворения лиофилизированного М72-родственного антигена со стадии (а) с использованием водного раствора, причем концентрация солей в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

В некоторых воплощениях концентрация солей в указанном водном растворе составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанном водном растворе составляет 35 мМ или меньше, например 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

Подходяще концентрация солей в водном растворе является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет концентрацию солей 130 мМ или меньше, как, например, 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в полученном растворе составляет 35 мМ или меньше, например 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

Помимо этого описан способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадии:

а) лиофилизации М72-родственного антигена; и

б) растворения лиофилизированного М72-родственного антигена со стадии (а) с использованием водного раствора, причем концентрация хлорида натрия в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

В некоторых воплощениях концентрация хлорида натрия в указанном водном растворе составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанном водном растворе составляет 35 мМ или меньше, например 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 15 мМ или меньше. Подходяще концентрация хлорида натрия в водном растворе составляет 5 мМ или меньше.

Подходяще концентрация хлорида натрия в водном растворе является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, концентрация хлорида натрия в полученном растворе составляет 130 мМ или меньше, как, например, 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация хлорида натрия в полученном растворе составляет 35 мМ или меньше, например 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

В одном воплощении водные растворы со стадии (б) (выше) содержат сапонин и/или агонист ТЬК4, например 0821 и/или 3Ό-ΜΡΤ. В следующем воплощении сапонин и/или агонист ТЬК4 находятся в липосомальной композиции. В одном воплощении водные растворы содержат агонист ТЬК4 и сапонин в липосомальной композиции и неионное вещество, регулирующее тоничность, которое изложено в данном описании, такое как полиол. В частности, водные растворы могут содержать сорбит. Также описан набор, содержащий:

а) лиофилизированный М72-родственный антиген; и

б) водный раствор, причем электропроводность данного раствора составляет 13 мСм/см или меньше.

В некоторых воплощениях электропроводность водного раствора составляет 12 мСм/см или меньше, например 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность водного раствора составляет 2,5 мСм/см или меньше, например 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше.

Помимо этого описан набор, содержащий:

- 11 027920

б) водный раствор, причем концентрация солей в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

Кроме того, описан набор, содержащий:

б) водный раствор, причем концентрация хлорида натрия в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

В некоторых воплощениях концентрация хлорида натрия в указанном водном растворе составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанном водном растворе составляет 35 мМ или меньше, например 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 15 мМ или меньше. Подходяще концентрация хлорида натрия в этом растворе равна 5 мМ или меньше.

Подходяще концентрация хлорида натрия в водном растворе является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет концентрацию хлорида натрия 130 мМ или меньше, как, например, 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация хлорида натрия в полученном растворе составляет 35 мМ или меньше, например 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

Наборы могут быть адаптированы для предоставления разовой дозы иммуногенной композиции, например разовой дозы для человека, или многократных доз иммуногенной композиции.

Водные растворы, используемые в наборах по изобретению, могут представлять собой любой из водных растворов, как определено здесь. В конкретном воплощении изобретения водный раствор содержит агонист ТЬК4 и/или сапонин в форме липосом. В конкретном воплощении агонист ТЬК4 представляет собой 3Ό-ΜΡΤ, а сапонин представляет собой 0521. Водные растворы, используемые в данном изобретении, могут содержать вещество, регулирующее тоничность, например полиол, такой как сорбит.

В отношении вышеупомянутых наборов и способов для приготовления иммуногенных композиций по изобретению можно отметить, что иммуностимулятор(ы) и вещество(а), регулирующее(ие) тоничность, если присутствуют, могут быть подвергнуты совместной лиофилизации с антигеном или содержаться в водном растворе, как будет желательно. Водный раствор может представлять собой просто воду для инъекций, а все другие компоненты иммуногенной композиции лиофилизированы совместно с антигеном. Обычно, по меньшей мере, некоторые иммуностимулятор(ы) и вещество(а), регулирующее(ие) тоничность, предложены в водном растворе, что особенно подходяще, если определенные компоненты плохо сочетаются с лиофилизацией, как, например, липосомы. В одном воплощении водный раствор содержит иммуностимулятор. Во втором воплощении водный раствор содержит вещество, регулирующее тоничность, например неионное вещество, регулирующее тоничность, такое как полиол, в частности сорбит. В третьем воплощении водный раствор содержит иммуностимулятор и вещество, регулирующее тоничность, такое как полиол, в частности сорбит.

Наборы также могут содержать инструкции по растворению лиофилизированного М72родственного антигена с использованием водного раствора.

Иммуногенные композиции по изобретению могут быть использованы в медицине, в частности, для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, такой как инфекция МусоЪас1егшт ЩЪегси1о818. Как правило, иммуногенные композиции будут предложены для введения людям, хотя они также могут быть полезны в ветеринарии, например для введения жвачным животным.

Предложено применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении лекарственного средства, в частности лекарственного средства для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, такой как инфекция МусоЪас1егшт ЩЪегси1о818.

Также описан способ профилактики, лечения или ослабления инфекции, вызванной микобактериями, такой как инфекция МусоЪас1егшт ЩЪегси1о818, включающий введение безопасного и эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

Иммуногенная композиция может быть предложена с целью лечения активного туберкулеза; профилактики активного туберкулеза, как, например, путем ее введения субъекту, который является неин- 12 027920 фицированным, или, альтернативно, субъекту, который имеет латентную инфекцию; лечения латентного туберкулеза; профилактики латентного туберкулеза, как, например, путем ее введения субъекту, который является неинфицированным; или предупреждения или замедления реактивации туберкулеза, особенно замедления реактивации ТВ, например, на месяцы, годы или даже на неограниченный период времени.

Термин активная инфекция относится к инфекции, например инфекции, вызываемой М. 1иЪегси1о515, с проявляющимися симптомами заболевания и/или поражениями, подходяще с проявляющимися симптомами заболевания.

Термины неактивная инфекция, скрытая инфекция или латентная инфекция относятся к инфекции, например инфекции, вызываемой М. 1иЪетси1о515, без проявляющихся симптомов заболевания и/или поражений, подходяще без проявляющихся симптомов заболевания. Подходяще субъект с латентной инфекцией будет представлять собой субъекта, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию, например по ΡΡΌ (очищенный от белка туберкулин) или анализам на основе Т-клеток, но который не демонстрирует симптомы заболевания и/или поражения, ассоциированные с активной инфекцией.

Термин первичный туберкулез относится к клинической форме заболевания, например проявлению симптомов заболевания, следующему непосредственно за инфекцией, например инфекцией, вызываемой М. 1иЪетси1о515. См. Нат5оп’5 Ргтс1р1е5 о£ 1п1егпа1 Мейюше, СНар1ег 150, рр. 953-966 (16Й1 ей, Вгаип\уа1й. е! а1, ей5., 2005).

Термины вторичный туберкулез или постпервичный туберкулез относятся к реактивации скрытой, неактивной или латентной инфекции, например инфекции, вызываемой М. 1иЪетси1о515 (см. Нат5оп'5 Ргтс1р1е5 о£ 1п1егпа1 Мейюше, СБар1ег 150, рр. 953-966 (16Й1 ей., Втаип№а1й, е! а1., ей5., 2005).

Термин реактивация туберкулеза относится к более позднему проявлению симптомов заболевания у индивидуума, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию (например, по туберкулиновой кожной пробе соответствено в анализе ίη νίϋΌ на основе Т-клеток), но не имеет очевидных симптомов заболевания. Подходяще, если индивидуум не будет подвергнут инфекции повторно. Положительный результат диагностического теста указывает на то, что индивидуум является инфицированным, однако этот индивидуум может иметь или не иметь ранее проявлявшихся активных симптомов заболевания, которые были подвергнуты лечению в достаточной степени для того, чтобы перевести туберкулез в неактивное или латентное состояние.

Подходяще иммуногенную композицию вводят субъекту, который является неинфицированным или который имеет латентную инфекцию микобактериями, такую как инфекция МусоЬасЮпиш 1иЪегси1о515.

Объем вводимой иммуногенной композиции может варьировать в зависимости от ряда других факторов, таких как конкретный способ доставки, например внутримышечный, подкожный или интрадермальный. Обычно объем, вводимый в виде одной инъекции (стандартной дозы) для человека, будет находиться в диапазоне от 50 мкл до 1 мл, как, например, от 100 до 750 мкл, особенно от 400 до 600 мкл, например приблизительно 500 мкл.

Количество М72-родственного антигена, содержащегося в разовой дозе, зависит от клинической необходимости, тем не менее разовая доза для человека обычно будет находиться в диапазоне от 1 до 100 мкг, как, например, от 5 до 50 мкг, например от 5 до 20 мкг. Разовая доза для человека может содержать приблизительно 10 мкг М72-родственного антигена.

Подходяще композиции по изобретению будут стабильными, это означает, что в процессе хранения при 25°С в течение 24 ч антигенность, измеренная методами, изложенными в данном описании, сохраняется по меньшей мере на 80% от антигенности до хранения. Желательно, чтобы антигенность была сохранена по меньшей мере на 85%, как, например, по меньшей мере на 90% и, в частности, по меньшей мере на 95% после хранения при 25°С в течение 24 ч. Что касается композиций, представляющих особый интерес, то сохранялось по меньшей мере 80% антигенности композиции, например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% и особенно по меньшей мере 95% после хранения при 30°С в течение 24 ч.

Далее настоящее изобретение будет описано посредством следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1. Приготовление адъювантной композиции А8А (сорбит).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и 0821 в липосомальной композиции, используя сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность. Все это готовили, как указано ниже.

А. Способ получения липосом.

Смесь липида ЩОРС), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли водный раствор (фосфатно-солевой буферный раствор [100 мМ ЫаС1, 50 мМ фосфат, рН 6,1]) и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90±10 нм, что измеряли посредством ΌΤδ. Затем липосомы подвергали сте- 13 027920 рильной фильтрации.

В. Композиция А8А.

Стадия 1. Разбавление концентрированных липосом.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ №-ь/1<-фосфатный буфер, рН 6,1, для получения концентрации фосфатного буфера в конечной композиции, равной 10 мМ (разведение в 10 раз). Затем добавляли 30%-ный (мас./об.) раствор сорбита в воде для инъекций (ΆΡΙ) для достижения концентрации 4,7% в конечной композиции, все это перемешивали в течение 15-45 минт при комнатной температуре. Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из БОРС, холестерина и 3Б-МРЬ в концентрациях 40, 10 и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 3Б-МРЬ в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. После этого смесь перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре.

Стадия 2. Добавление 0821.

Используя перистальтический насос, к разбавленным липосомам добавляли при перемешивании на магнитной мешалке 0821 в виде базового балк-продукта (Ъи1к Чоск) для достижения концентрации в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. Эту смесь перемешивали в течение 15-45 мин.

Состав конечной композиции А8А(сорбит): 2 мг БОРС, 500 мкг холестерина, 100 мкг 3Б-МРЬ/мл и 100 мкг 0821/мл. 4,7% сорбита и 5 мМ хлорид натрия и 10 мМ фосфат.

Стадия 3. Контроль рН на соответствие 6,1 ±0,1.

Стадия 4. Стерильная фильтрация.

Стерильную фильтрацию проводили, используя фильтр из полиэфирсульфона (РЕ8) от РАРЬ СогрогаРои.

Стадия 5. Хранение при температуре от 2 до 8°С.

Полученную адъювантную композицию, которая содержала 3-де-О-ацилированный МРЬ и 0821 в липосомальной композиции и сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность (обозначенную А8А (сорбит)), затем хранили при 4°С.

Пример 2. Приготовление адъювантной композиции А8А (150 мМ №С1).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и 0821 в липосомальной композиции, используя хлорид натрия в качестве вещества, регулирующего тоничность.

A. Способ получения липосом.

Смесь липида (БОРС), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А (3Б-МРЬ) в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли фосфатно-солевой буферный раствор (100 мМ №С1, 50 мМ фосфат, рН 6,1), и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90±10 нм, что измеряли посредством БЬ8. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации на РЕ8-мембране 0,22 мкм.

B. Композиция А8А.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ №-ь/1<-фосфатный буфер, рН 6,45, и 1,5М ΝαΟ для получения в конечной композиции концентрации фосфатного буфера, равной 10 мМ, и концентрации №С1, равной 150 мМ соответственно (разведение в 10 раз). Эту смесь перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из БОРС, холестерина и 3Б-МРЬ в концентрациях 40, 10 и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 3Б-МРЬ в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. После этого смесь перемешивали в течение 5-15 мин при комнатной температуре.

Стадия 2. Добавление 0821.

0821 в виде базового балк-продукта добавляли к разбавленным липосомам при перемешивании на магнитной мешалке для достижения концентрации в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре.

Стадия 3. Контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4. Стерильная фильтрация.

Состав конечной композиции А8А (150 мМ №С1): 2 мг БОРС, 500 мкг холестерина, 100 мкг 3-деО-ацилированного МРЬ, 100 мкг ф821 в 1 мл; 10 мМ фосфат и 150 мМ №С1.

Пример 3. Литическая активность 0821.

Известно, что 0821 лизирует эритроциты (РВС). Адъювантную композицию А8А (сорбит), приготовленную как в примере 1, тестировали, чтобы убедиться, что литическая активность 0821 погашена точно так же, как и у эквивалентной адъювантной композиции, содержащей 150 мМ №·ιθ (А8А (150 мМ

- 14 027920

ΝαΟ)).

Литическую активность Р821 измеряли в тесте на гемолиз с использованием эритроцитов (КВС) цыпленка. КВС центрифугировали при 550 д при 4°С. Супернатант отбрасывали. Осадок после центрифугирования осторожно ресуспендировали в РВ8(фосфатно-солевой буферный раствор) - буфере для достижения первоначального объема и повторяли эту же операцию до тех пор, пока цвет супернатанта более не был красным (в большинстве случаев 3 раза). Осадок после центрифугирования хранили при 4°С максимально в течение 3-4 суток, если его не использовали немедленно (и снова промывали в день использования), или разбавляли приблизительно в 10 раз в буфере, если использовали в тот же день.

Пробы Р821 в диапазоне доз для снятия зависимости готовили в А8А-буфере (в солевом или в сорбитсодержащем буфере, соответствующем тестируемому образцу А8А) для немедленного использования и готовили образцы адъюванта (содержащие 50 или 90 мкг эквивалента Р821, имея в виду 500 или 900 мкл эквивалентной композиции А8А). Конечный объем подводили до 900 мкл в стандартах и образцах, используя адекватный буфер (содержащий или не содержащий сорбит в качестве функционального элемента буфера тестируемого образца). Вследствие своей опалесценции А8А мешает определению оптической плотности (ΟΌ). Поэтому готовили контрольные пробы (Ыапкз) для А8А, и их ΟΌ вычитали из ΟΌ тестируемых образцов А8А. Эти контрольные пробы соответствовали такому же объему А8А, что и объем, тестируемый в образцах, но подведенному до 1 мл буфером. В эти контрольные пробы КВС не добавляли. Затем стандарты и образцы инкубировали с КВС (по 100 мкл разбавленных КВС добавляли к 900 мкл стандартов и образцов) в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ). Далее образцы центрифугировали в течение 5 мин при 900 д. После центрифугирования измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Определение литической активности проводили, используя испытание на предельное содержание.

1. Предел обнаружения (ЬОЭ) определяли как самую низкую концентрацию Р821, приводящую к тому, что значение ΟΌ было:

выше базового уровня (ΟΌ>0,1), приблизительно в три раза выше, чем ΟΌ для буфера (0 мкг Р821), на восходящем участке кривой, пределено для каждого теста.

2. Литическую активность Р821 в образцах адъюванта считали положительной, если ΟΌ для образца адъюванта превышала ОП_ЬОО.

Типичная зависимость для Р821

0321, мкг	Οϋ	0321 погашенный
0	0,029	ΝΑ
0,5	0,052	< Ι_Οϋ
0,6	0,073	< ЬОО
0,7	0,091	< ι_οϋ
0,8	0,096	< ι_οϋ
0,9	0,12	> 98,2%
1	0,195	> 98%
1,1	0,212	> 97,8%
1,2	0,348	> 97,6%
1,3	0,479	> 97,4%
1,4	0,612	> 97,2%
1,5	0,669	> 97%
2	1,139	> 96%
2,5	1,294	> 95%
3	1,391	> 94%
5	1,416	> 90%
Адъювант *	0,03	> 98,2%

* - тестируемый эквивалент 50 мкг ^821. Буфер, содержащий 150 мМ хлорид натрия. ΝΆ - не анализировали.

Вышеприведенные данные показаны графически на фиг. 1.

Предел обнаружения в этом анализе составляет 0,9 мкг Р821 и ΟΌ 0,12.

Было установлено, что гашение Р821 в адъювантной композиции, содержащей 150 мМ хлорид натрия, составляло более 98,2% для тестируемого эквивалента, содержащего 50 мкг Р821. В случае тестируемого эквивалента с 90 мкг делается заключение о более чем 99%.

Затем проводили сравнение гашения Р821, используя эквивалентную адъювантную композицию, содержащую сорбит и только 5 мМ хлорид натрия. Данные получали после хранения А8А при 4°С или в условиях ускоренного метода исследования стабильности (7 суток при 37°С). Что касается А8А в сорбите, стандартную кривую для Р821 получали в сорбитсодержащем буфере.

- 15 027920

Образец	Временная точка	1_СЮ	0821 погашенный
Адъювантная композиция ΑδΑ (150 мМ ЫаС1)	то	<1,4	> 97,2%
7 суток, 37°С	<0,9	> 98,2%
Адъювантная композиция ΑδΑ (сорбит, 5 мМ ЫаС!)	то	<2	> 97,8%
	7 суток, 37°С	<1	> 96%
	11 месяцев, 4°С	<2	> 97,8%

Тестируемый эквивалент 50 мкг РЗ21, за исключением * тестируемого эквивалента 90 мкг Р821.

Было сделано заключение, что в буфере с низким содержанием хлорида натрия гашение РЗ21 осуществлялось в достаточной степени.

Пример 4. МРЬ-родственные соединения.

С химической точки зрения 3Э-МРТ представляет собой смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А главным образом с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Каждая отдельная молекула 3ΏМРЬ называется родственным соединением (сопдепег). Важно, что комбинация таких родственных соединений (сопдепег сошрозйюп) остается постоянной без какого-либо изменения в процентном соотношении родственных соединений. Также важно, что используя любой буфер, можно получить комбинацию родственных соединений, аналогичную таковой в концентрированных липосомах, используемых для приготовления адъювантной композиции.

Как показано на фиг. 2, исследовали комбинацию родственных соединений в концентрированных 3Э-МРТ-липосомах (конц. липосомы ЫР07-217, первая колонка на фиг. 2), адъювантную композицию, содержащую 3Э-МРТ-липосомы и РЗ21 в 150 мМ №С1 буфере (адъювант - 150 мМ №С1 или АЗЛ (150 мМ №С1), вторая колонка) и адъювантную композицию, содержащую 3Э-МРТ-липосомы и РЗ21 в сорбите и 5 мМ ЖС1 буфере (адъювант - сорбит или АЗА (сорбит), колонки 3-7).

Также исследовали комбинацию родственных соединений в двух партиях адъюванта АЗА (сорбит) на 0-е сутки и через 7 суток после приготовления и выдерживания при 37°С, чтобы убедиться в отсутствии изменений со временем (см. последние четыре колонки на фиг. 2).

Относительное распределение тетра-, пента- и гексаацилированных МРЬ-родственных соединений в концентрированных липосомах или образцах АЗА (сорбит) определяли посредством 1Р-НРТС-Т1иодетекции (ион-парная ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией) (АНТ)). Получали производные как стандартов, так и образцов, используя данзилгидразин, который помещает Т1ио-активный хромофор на дисахаридный остов. Дериватизированные образцы анализировали на обращенно-фазовой С18-колонке, используя гидроксид тетрабутиламмония (ТВАОН) в качестве ион-парного реагента. Родственные соединения, содержащие одинаковое количество ацильных групп жирных кислот, элюировали отдельными группами (тетраацил, пентаацил и гексаацил). Распределение родственных соединений устанавливали, сравнивая площадь пика для каждой группы с общей площадью пика для всех МРЬ-родственных соединений.

На фиг. 2 показано процентное содержание каждого родственного соединения. Не было обнаружено никакой существенной разницы в комбинации родственных соединений в зависимости от буферов, используемых для адъювантов, и эта комбинация родственных соединений была одинаковой в течение долгого времени в сорбитсодержащем буфере.

Пример 5. Приготовление адъювантной композиции АЗА (сорбит-2).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и РЗ21 на уровне, сниженном по сравнению с Примером 1, в липосомальной композиции, используя сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность. Все это готовили, как указано ниже.

Адъювант готовили путем разведения 1:1 композиции АЗА(сорбит), приготовленной согласно Примеру 1, раствором, содержащим 10 мМ фосфат, 5 мМ ЖС1, 4,7% сорбита при рН 6,1.

Состав конечной композиции АЗА(сорбит-2): 1 мг ЭОРС, 250 мкг холестерина, 50 мкг 3Э-МРТ/мл и 50 мкг рЗ21/мл, 4,7% сорбита, 5 мМ хлорид натрия и 10 мМ фосфат.

Пример 6. Приготовление адъювантной композиции АЗА (сорбит-3).

А. Способ получения липосом.

Смесь липида (ЭОРС), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли водный раствор (фосфатно-солевой буферный раствор [100 мМ ЖС1, 50 мМ фосфат, рН 6,1]), и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90±10 нм, что измеряли посредством ЭЬЗ. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации.

- 16 027920

В. Композиция А8А.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ Иа₂/К-фосфатный буфер, рН 6,1, для получения концентрации фосфатного буфера в конечной композиции, равной 10 мМ (разведение в 10 раз). Затем добавляли 30%-ный (мас./об.) раствор сорбита в воде для инъекций (ЩИ) для достижения концентрации 4,7% в конечной композиции, все это перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре.

Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из ООРС, холестерина и 3Ό-ΜΡΕ в концентрациях 40, 10 и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 3ΌМРЬ в конечной композиции, равной 50 мкг/мл.

После этого смесь перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре.

Стадия 2. Добавление Ц821.

Используя перистальтический насос, 0821 в виде базового балк-продукта добавляли к разбавленным липосомам при перемешивании на магнитной мешалке для достижения концентрации в конечной композиции, равной 50 мкг/мл. Эту смесь перемешивали в течение 15 мин.

Состав конечной композиции А8А: 1 мг ЭОРС, 250 мкг холестерина, 50 мкг ЗИ-МРЬ/мл и 50 мкг 0821/мл, 4,7% сорбита, 2,5 мМ хлорид натрия и 10 мМ фосфат.

Стадия 3. Контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4. Стерильная фильтрация.

Стерильную фильтрацию проводили, используя фильтр из полиэфирсульфона (РЕ8) от РАЬЬ Согрогайои.

Полученную адъювантную композицию, которая содержала 3-де-О-ацилированный МРЬ и 0821 в липосомальной композиции и сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность (обозначенную А8А (сорбит-3)), затем хранили при 4°С.

Пример 7. Приготовление адъювантной композиции А8А (150 мМ ИаС1-2).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и 0821 на уровне, сниженном по сравнению с примером 2, в липосомальной композиции, используя хлорид натрия в качестве вещества, регулирующего тоничность. Все это готовили, как указано ниже.

A. Способ получения липосом.

Смесь липида ЩОРС), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А (3И-МРЕ) в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли фосфатно-солевой буферный раствор (100 мМ ИаС1, 50 мМ фосфат, рН 6,1), и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90±10 нм, что измеряли посредством ИЬ8. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации на РЕ8-мембране 0,22 мкм.

B. Композиция А8А.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ Иа₂/К-фосфатный буфер, рН 6,45, и 1,5М ИаС1 для получения в конечной композиции концентрации фосфата, равной 10 мМ, и концентрации ИаС1, равной 150 мМ соответственно (разведение в 10 раз). Эту смесь перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из ЭОРС, холестерина и 3И-МРЕ в концентрациях 40, 10 и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 3ΌМРЬ в конечной композиции, равной 50 мкг/мл. После этого смесь перемешивали в течение 5-15 мин при комнатной температуре.

Стадия 2. Добавление Ц821.

0821 в виде базового балк-продукта добавляли к разбавленным липосомам при перемешивании на магнитной мешалке для достижения концентрации в конечной композиции, равной 50 мкг/мл. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре.

Стадия 3. Контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4. Стерильная фильтрация.

Состав конечной композиции А8А (150 мМ ИаС1-2): 1 мг ИОРС, 250 мкг холестерина, 50 мкг 3-деО-ацилированного МРЬ, 50 мкг Ц821 в 1 мл, 10 мМ фосфат и 150 мМ ИаС1.

Пример 8. Приготовление белковых антигенов.

М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίδ (8ЕЦ ΙΌ Ио: 3).

Конструирование экспрессирующего вектора М72.

Плазмиду, кодирующую аминокислотную последовательность М(Ь72Г с дополнительной 6-Ηίδметкой на Ν-конце, получали путем последовательного тандемного соединения открытых рамок считы- 17 027920 вания (ОКБ), кодирующих С-концевой фрагмент М1Ъ32а, и ОКБ полноразмерного М1Ъ39а, за С-концом которого следовала Ν-концевая часть М1Ъ32а. Это осуществляли, используя специфичные к последовательности олигонуклеотиды, содержащие уникальные сайты рестрикции (ЕсоК1 и ЕсоКУ) и лишенные стоп-кодонов на С-концах (в случае С-концевого фрагмента М1Ъ32а и М1Ъ39а), для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) геномной ДНК из штамма Η37Κν М.1иЪегси1о818. Применяя этот вектор в качестве матрицы, вводили мутацию δе^706 на А1а посредством сайт-направленного мутагенеза. Наличие надлежащей ориентации вставок, а также мутации δе^706А1а подтверждали секвенированием ДНК.

Чтобы получить вектор, кодирующий М72, который имеет только 2 остатка Ηΐδ на Ν-конце, делетировали четыре Ηΐδ, применяя коммерческую систему сайт-направленного мутагенеза. После подтверждения последовательности М72-кодирующую последовательность вырезали из плазмиды с использованием ферментативной реакции, очищали гель-электрофорезом и лигировали в вектор рЕТ. Затем подтверждали последовательность рекомбинантной плазмиды. Эта плазмида кодирует М72 под контролем промотора Т7. Экспрессия Т7-РНК-полимеразы управляется геномным компонентом, управляющим экспрессией хозяина, и индуцируется с использованием системы на основе 1ас-оперона (1ас1) и 1РТО (изопропил-бета-О-тиогалактопиранозид) в качестве химического сигнала индукции. Экспрессирующая плазмида снабжена геном устойчивости к канамицину.

Плазмиду, кодирующую слитый белок М72 под контролем промотора Т7, переносили в штамм Е. сой ΗΜδ174 (ΌΕ3), используя метод электропорации. Проводили секвенирование обеих нитей последовательности, кодирующей М72-вставку и фланкирующие области, и было установлено, что они идентичны последовательности, определенной по исходной плазмидной конструкции.

Ферментация.

Флакон с осажденной центрифугированием рабочей затравкой подвергали оттаиванию при комнатной температуре. Выполняли предварительное разбавление путем смешивания рабочей затравки с 4,9 мл предкультуральной среды. Для инокуляции жидкой предкультуры, содержащей 400 мл предкультуральной среды, дополненной сульфатом канамицина (50 мг/л) и глюкозой (10 г/л), использовали 1 мл предварительно разбавленной затравки.

Состав предкультуральной среды

Ингредиент	Концентрация
КН₂РО₄	14,83 г/л
К2НРО4	1,65 г/л
(ΝΗ₄)₂δΟ₄	5,82 г/л
Дрожжевой экстракт	6,21 г/л
Глицерин, 87% (масс./масс.)	14,54 мл/л
Раствор металлов и солей⁽¹⁾: -РеС1₃ 6Н₂О - Мд8О₄7Н₂О Раствор микроэлементов⁽²⁾: -ΖηδΟ₄7Н₂О - ΜηδΟ₄Н₂О - ΟιιδΟ₄ 5Н₂О - СоС1₂ 6Н₂О	9,7 мл/л	3,3 г/л 58 г/л 116 мл/л	7,65 г/л 5,28 г/л 1,1 г/л 1,1 г/л
- Н3ВО3 - Ыа₂Мо0₄ 2Н₂О - НС1, 4 н.			0,3 г/л 2,64 г/л 6,2 мл/л
Раствор биотина и СаС1₂ ⁽²⁾: - биотин	0,97 мл/л	0,05 г/л
- СаС1₂ 2Н₂О		61,7 г/л
рН среды подводят до 6,5, используя раствор ЫаОН (25%). Среду фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

(1) рН подведен до 1,50 с использованием раствора НС1 (37%); раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм;

(2) раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

Предкультуру инкубировали в 2-литровой качалочной колбе при 30°С при встряхивании (200 КРМ (об/мин)) до достижения значения ОЭ_{650 нм} от 2 до 4 (приблизительная продолжительность инкубации 16

ч). На этой стадии 72-литровый (общий объем) ферментер, содержащий 45 л культуральной среды, дополненной канамицина сульфатом (34 мг/л), инокулировали, используя 52 мл жидкой предкультуры.

- 18 027920

Состав культуральной среды

Ингредиент	Концентрация
МдЗО₄7Н₂О	0,63 г/л
РеС1₃ 6Н₂О Раствор микроэлементов¹ ); -Ζη3Ο₄7Н₂О - МпЗО₄Н₂О -СиЗО₄5Н₂О - СоС1₂ 6Н₂О - Н3ВО3 - Ыа₂Мо0₄ 2Н₂О - НС1, 4 н.	0,056 г/л 1,91 мл/л	7,65 г/л 5,28 г/л 1,1 г/л 1,1 г/л 0,3 г/л 2,64 г/л 6,2 мл/л
НС1, 37%	0,40 мл/л
Дрожжевой экстракт	35 г/л

(ΝΗ₄)₂3Ο₄	2,10 г/л
КН₂РО₄	18,70 г/л
Глутамат натрия	2,5 г/л
Глицерин, 87%	0,276 мл/л
Глюкоза	20 г/л
Раствор биотина²);	0,22 мл/л
- биотин		1 г/л
СаС1₂ 2Н₂О	0,21 г/л
Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

(1) Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм;

(2) рН подведен до 11,0 с использованием раствора ЫаОН (25%); раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

В течение фазы роста рН поддерживали при 6,8±0,2 путем периодического добавления 25%-ного (об./об.) ΝΗ₄ΟΗ и 25%-ной (об./об.) Н₃РО₄. После инкубации в течение 16 ч при 30°С начинали периодическую подпитку, используя питательную среду.

Состав питательной среды

Ингредиент	Концентрация
МдЗО₄ 7Н₂О	1,98 г/л
РеС1₃6Н₂О Раствор микроэлементов⁽¹⁾: -ΖηδΟ₄ 7Н₂О - МпЗО₄Н₂О - СиЗО₄5Н₂О - СоС1₂ 6Н₂О - Н₃ВОз - Ыа₂Мо0₄ 2Н₂О - НС1, 4 н.	0,178 г/л 6,02 мл/л	7,65 г/л 5,28 г/л 1,1 г/л 1,1 г/л 0,3 г/л 2,64 г/л 6,2 мл/л
НС1, 37%	1,24 мл/л
Глутамат натрия	5 г/л
Дрожжевой экстракт	40 г/л
Глицерин, 87%	590 мл/л
Раствор биотина²);	2 мл/л

- биотин		1 г/л
СаС1₂ 2Н₂О	0,66 г/л
Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

(1) Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм;

(2) рН подведен до 11,0 с использованием раствора №ΟΙ I (25%);

раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

Температуру поддерживали при 30°С в течение еще 2 ч, затем повышали до 37°С до окончания ферментации. Устанавливали постоянный (75 л/мин) поток воздуха, и уровень растворенного кислорода поддерживали при насыщении, равном 17%, путем автоматического регулирования встряхивания и давления. По мере необходимости автоматически добавляли небольшие количества раствора пеногасителя. К тому моменту, когда величина ΟΌ_{650 нм} достигала значения 50 (±5), добавляли 1 мМ изопропил-бета-Όтиогалактопиранозид (ΙΡΤΘ), чтобы индуцировать экспрессию М72. Ферментация заканчивалась через 5

- 19 027920 ч от момента начала индукции. Клеточную культуру охлаждали до 15°С при легком встряхивании и центрифугировали (при 4°С), получая осажденные клетки, которые потом хранили при -20°С в аликвотах.

Выделение телец включения.

Осажденные центрифугированием клетки, собранные после ферментации, подвергали оттаиванию при комнатной температуре и разрушали в лизирующем буфере (10 мМ Трис, 50 мМ №С1, рН 8,0), используя гомогенизатор высокого давления. После этого клеточный лизат центрифугировали, и полученные осажденные клетки (или тельца включения, 1В) промывали буфером для промывки, содержащим мочевину, Трис и №С1. 1В солюбилизировали, используя буфер для солюбилизации, содержащий 8М мочевину, и фильтровали через мембранный фильтр 0,2 мкм. Этот отфильтрованный раствор сначала очищали анионообменной хроматографией, используя колонку О 8ерЬагоке Рак! Р1о\у (ф8РР). Элюирование М72 осуществляют раствором 6М мочевины, 20 мМ бис-Трис-пропана, 90 мМ №С1, рН 7,0.

Собранный М72 далее очищали хроматографией на гидроксиапатите (НА), используя для элюирования раствор 6М мочевины, 20 мМ бис-Трис-пропана, 250 мМ №С1, рН 7,0. Собранную фракцию концентрировали, используя мембранную кассету с размером пор 30 кДа, и проводили диафильтрацию против 20 мМ Трис, рН 7,5. Затем М72 стерилизовали через фильтр 0,22 мкм. После этого очищенный балкпродукт разливали на аликвоты и хранили при -70°С.

Пример 9. Исследование высаливания в композициях, содержащих М72 и соль в разных концентрациях, при рН 6,1, 7,5 и 8,5.

Исследовали влияние концентрации хлорида натрия и рН на стабильность антигена М72, что оценивали по размеру и антигенности.

Метод.

Очищенный балк-антиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίκ, 8Еф ГО Ж: 3, который получен в примере 8) разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в трех разных буферах (10 мМ фосфатном буфере при рН 6,1; 20 мМ Трис-буфере при рН 7,5 и 20 мМ Трис-буфере при рН 8,5), содержащих конечные концентрации хлорида натрия 0, 50, 150, 300 и 450 мМ.

Образцы анализировали незамедлительно (Т0), хранили в течение ночи при 4°С перед проведением анализа (Т0 О/Ν) или хранили при 25°С в течение 24 ч перед проведением анализа (Т24 ч 25°С).

ЭЬ8 проводили, используя Ма1уегп 2е1а51/ег Жпо Ζ8 от Ма1уегп 1п5!гитеп!к (Соединенное Королевство). Этот прибор работал с использованием длины волны лазера 633 нм и мощности 4 мВт. Детекцию рассеянного света проводили под углом 173° при температуре 22°С. Ζ-средний диаметр (Чау) и индекс полидисперсности (р1) рассчитывают, используя программное обеспечение прибора.

Нефелометрию проводили, используя ЖрЬе1оккап® Лксеп! от ТНегто р1ксНег 8с1епНйс. Анализ осуществляли на пропускающих УФ микропланшетах Сок!аг® от Согшпд 1пс. (США).

Антигенность определяли количественно посредством сэндвич-ЕЬ18Л, в котором антиген захватывается М72-специфичным поликлональным антителом кролика и после этого выявляется с использованием М72(М!Ь39)-специфичного моноклонального антитела мыши. Все измеренные значения приведены относительно ожидаемой антигенности очищенного балк-белка, использованного для приготовления тестируемых композиций.

Результаты.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 3-5.

Данные результаты впервые демонстрируют, что стабильность растворов, содержащих М72родственный антиген, чувствительна как к рН, так и к концентрации хлорида натрия. Влияние хлорида натрия на размер и антигенность антигена становится все более заметным по мере уменьшения значения рН.

Размер и антигенность антигена нестабильны при рН 6,1 даже в отсутствие хлорида натрия. Добавление 50 мМ хлорида натрия при рН 6,1 приводило к увеличению размера от 35 нм (0 мМ хлорид натрия при Т0) до 58 нм (Т0) или 79 нМ через 24 ч при 25°С.

Размер и антигенность антигена относительно стабильны в течение 24 ч при 25°С при рН 7,5 или 8,5, в частности, в отсутствие хлорида натрия или при концентрации хлорида натрия 50 мМ. Тем не менее, увеличение концентрации хлорида натрия до 150 мМ или больше вызывает очевидное увеличение размера антигена и снижение его антигенности.

Пример 10. Предотвращение высаливания в композициях, содержащих М72, иммуностимуляторы и сорбит, используемый в качестве вещества, регулирующего тоничность.

Для сравнения стабильности иммуногенных композиций, содержащих 150 мМ ЖС1, с композициями, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, применяется сорбит, проводили мониторинг ряда образцов с использованием ЭХ-ВЭЖХ (эксклюзионная хроматография - высокоэффективная жидкостная хроматография) и ЕЫ8Л.

Метод.

Готовили три разных лиофилизата так, чтобы при их объединении с соответствующими адъювантными композициями из примеров 5 и 7 можно было получить желаемое значение рН.

а) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίκ - целевой рН 8,5 в восстановленной вакцине.

- 20 027920

15,75%-ный (мас./об.) раствор сахарозы (приготовленный в воде для инъекций) добавляли в воду для инъекций для достижения концентрации сахарозы 6,3%. Затем добавляли 3%-ный (мас./об.) раствор Т\уееп80 (приготовленный в воде для инъекций) для достижения концентрации 0,025%. Далее добавляли 1М Трис-НС1-буфер, рН 8,8, для достижения 50 мМ концентрации Трис-буфера. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли очищенный балкантиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ, 8ЕО ΙΌ Νο: 3, который получен в примере 8) для достижения концентрации белка 25 мкг/мл. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре. Проверяли значение рН и обнаруживали, что оно составляло 8,8. В стеклянные флаконы емкостью 3 мл вносили по 0,5 мл полученной смеси, затем лиофилизировали.

б) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ - целевой рН 8,0 в восстановленной вакцине.

15,75%-ный (мас./об.) раствор сахарозы (приготовленный в воде для инъекций) добавляли в воду для инъекций для достижения концентрации сахарозы 6,3%. Затем добавляли 3%-ный (мас./об.) раствор Т\уееп80 (приготовленный в воде для инъекций) для достижения концентрации 0,025%. Далее добавляли 1М Трис-НС1-буфер, рН 8,8, для достижения 20 мМ концентрации трис-буфера. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли очищенный балкантиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ, 8ЕО ΙΌ Νο: 3, который получен в примере 8) для достижения концентрации белка 25 мкг/мл. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре. Проверяли значение рН и обнаруживали, что оно составляло 8,8.

В стеклянные флаконы емкостью 3 мл вносили по 0,5 мл полученной смеси, затем лиофилизировали.

в) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ - целевой рН 7,5 в восстановленной вакцине.

15,75%-ный (мас./об.) раствор сахарозы (приготовленный в воде для инъекций) добавляли в воду для инъекций для достижения концентрации сахарозы 6,3%. Затем добавляли 3%-ный (мас./об.) раствор Т\уееп80 (приготовленный в воде для инъекций) для достижения концентрации 0,025%. Далее добавляли 1 М трис-НС1-буфер, рН 8,8, для достижения 12,5 мМ концентрации трис-буфера. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли очищенный балкантиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ, 8ЕО ΙΌ Νο: 3, который получен в примере 8) для достижения концентрации белка 25 мкг/мл. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре. Проверяли значение рН и обнаруживали, что оно составляло 8,8.

Описанные выше лиофилизаты растворяли, используя по 625 мкл растворов адъювантов, приготовленных в примерах 5 и 7. После растворения в растворе адъювантов получали следующие иммуногенные композиции:

1) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ - А8А(150 мМ №С1-2) ρΗ 8,5 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т\уееп80.

500 мкг ВОРС,

125 мкг холестерина, мкг 3Ό-ΜΡΕ, мкг 0821,

150 мМ №С1, мМ фосфат, рН 8,5;

2) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ - Л8Л(150 мМ №С1-2) ρΗ 8,0 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т\уееп80,

500 мкг ВОРС,

125 мкг холестерина, мкг 3Ό-ΜΡΕ, мкг 0821,

150 мМ №С1, мМ фосфат, рН 8,0;

3) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίβ - А8А(150 мМ №С1-2) ρΗ 7,5 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы,

12,5 мМ Трис,

- 21 027920

0,02% (мас./об.) Т^ееп80,

500 мкг БОРС,

125 мкг холестерина, мкг 3В-МРЬ, мкг Р821,

150 мМ ЫаС1, мМ фосфат, рН 7,5;

4) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐ5 - А8А(сорбит-2) рН 8,5 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т^ееп80,

500 мкг ВОРС,

125 мкг холестерина, мкг 3В-МРЬ, мкг Р821, мМ №С1,

4,7% (мас./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 8,5;

5) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐ5 - А8А(сорбит-2) рН 8,0 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т^ееп80,

500 мкг БОРС,

4,7% (мас./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 8,0;

6) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐ5 - А8А(сорбит-2) рН 7,5 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы,

12,5 мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т^ееп80,

500 мкг БОРС,

4,7% (мас./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 7,5.

Анализ образцов.

Определяли характеристики восстановленных иммуногенных композиций, описанных выше, после хранения при 25 или 30°С (Т 0, 6 и 24 ч).

ЭХ-ВЭЖХ-анализ осуществляли путем введения на колонку ТО8ОН Т8К-0е15000Р^х1 (Ю (внутренний диаметр) 7,8 ммх30 см), уравновешенную 20 мМ Трис-буфером, рН 8,5, с детекцией в УФ при 210 нм и скоростью потока 0,5 мл/мин.

Антигенность определяли количественно посредством сэндвич-ЕЫ8А, в котором антиген захватывается М72-специфичным поликлональным антителом кролика и далее выявляется с использованием М72(МФ39)-специфичного моноклонального антитела мыши. Все измеренные значения приведены относительно ожидаемой антигенности очищенного балк-белка, использованного для приготовления тестируемых композиций.

Результаты.

Результаты показаны на фиг. 6а-6г и 7.

ЭХ-ВЭЖХ-профили стабильны после восстановления в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит, при каждом рН (т.е. рН 7,5; 8,0 и 8,5). Это можно противопоставить ЭХ-ВЭЖХ-профилям для иммуногенных композиций, содержащих 150 мМ №С1, которые демонстрируют очевидные изменения, наблюдаемые между исходным

- 22 027920 полученным профилем и профилями после хранения при 25 или 30°С. Это изменение становится более выраженным при снижении рН композиции с 150 мМ ЖС1.

Те же выводы можно сделать в отношении антигенности, проявление которой в значительной степени после восстановления остается стабильным в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит, при каждом рН (т.е. рН 7,5; 8,0 и 8,5) до 24 ч включительно при 30°С.

Пример 11. Определение электропроводности иммуногенных композиций по изобретению.

Измеряли электропроводность ряда иммуногенных композиций по настоящему изобретению и сравнивали с электропроводностью контрольных растворов хлорида натрия и иммуногенной композиции, содержащей традиционное количество хлорида натрия.

Метод.

Ряд стандартов, имеющих концентрации хлорида натрия 0, 75, 100, 150, 250 и 300 мМ, готовили из концентрированного раствора - 1500 мМ хлорида натрия путем разведения в воде для инъекций.

Иммуногенные композиции готовили, используя М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ согласно методикам, приведенным в примере 8. Для изучения вклада самого антигена и всех остальных компонентов в очищенном балк-продукте также готовили плацебо-лиофилизаты, не содержащие антигенного компонента.

Используя 2е1аз17ег Аню (Макет) и по 1,5 мл каждого образца в выгнутых (ϋ-образных) капиллярных ячейках, прикладывали напряжение 30-150 В (определяемое автоматически с помощью этого прибора) и определяли электропроводность.

Результаты.

Электропроводность стандартных растворов хлорида натрия

Стандартная кривая на основе этих данных приведена на фиг. 8.

Электропроводность тестируемых растворов

Описание	Конц-я хлорида натрия, мМ	Электро- проводность, мСм/см	Эквивалентная концентрация хлорида натрия, мМ
А5А(сорбит-2)	5	1,46	9
Плацебо рН 8,0 / А5А(сорбит-2)	5	1,95	14
М72 рН 8,0 / АЗА(сорбит-2)	5	1,96	14
Плацебо рН 8,5 / А5А(сорбит-2)	5	2,36	18
М72 рН 8,5 / АЗА(сорбит-2)	5	2,28	17
АЗА(150 мМ ЫаС1-2)	150	16	159
Плацебо рН 8,5 / А8А(150 мМ №С1-2)	150	14,8	147
М72 рН 8,5 / А8А(150 мМ ЫаС!-2)	150	15,3	152

Как можно видеть из приведенных выше данных, электропроводность растворов, в которых используют 150 мМ ЖС1, значительно выше, чем электропроводность растворов, в которых используют минимальное количество ЖС1.

Влияние антигена и любых компонентов в очищенном балк-продукте является минимальным, поскольку препараты плацебо имеют сопоставимую электропроводность по сравнению с содержащими М72-родственный антиген аналогами.

Пример 12. Иммуногенность тестируемых иммуногенных композиций по изобретению.

Цель этого примера заключалась в определении того, оказывают ли влияние изменения в составе композиции, связанные с уменьшением количества соли в иммуногенных композициях по изобретению для повышения стабильности белка, на иммуногенность ΐη νίνο.

Метод.

Проводили оценку четырех иммуногенных композиций:

1. М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ρΗ 8,5/АЗА (150 мМ ЖС1-2).

2. М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ρΗ 8,5/АЗА (сорбит-2).

3. М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ρΗ 8/АЗА (сорбит-2).

4. М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ρΗ 7,5/АЗА (сорбит-2).

Оценку иммуногенности этих антигенсодержащих композиций проводили на мышах С57ВЬ/6. Для каждой из этих четырех композиций 30 мышам С57ВЬ/6 3 раза на 0-е, 14-е и 28-е сутки вводили внутри- 23 027920 мышечно 1 мкг антигена в 50 мкл раствора адъюванта (полученного по методике, приведенной в примере 10). Выявленные М72-специфичные Т-клеточные ответы (как СЭ4, так и СЭ8) измеряли через 6 суток после последней иммунизации (66ΡΙΙΙ).

Для определения М72-специфичных клеточных ответов собирали лимфоциты периферической крови у 30 мышей/группа и объединяли в пулы (шесть пулов по пять мышей/группа). Проводили лизис эритроцитов, после чего клетки наносили на планшеты ιη уйго. Проводили повторную стимуляцию клеток ιη уйго, используя пул перекрывающихся пептидов (15-мерных пептидов с перекрыванием в 11 аминокислот, из расчета 1 мкг/мл/пептид), охватывающих последовательность М72 (без Ν-концевых остатков ΗΪ8). Клетки, остающиеся в среде (не стимулированные пептидами) использовали для определения фоновых ответов. Через 2 ч совместного культивирования с пулом пептидов в лунки добавляли брефелдин А (чтобы ингибировать экскрецию цитокинов), и клетки хранили в течение ночи при 4°С. После этого клетки окрашивали для выявления следующих маркеров: СЭ4, СЭ8, 1Й-2, ΙΡΝ-гамма и ΤΝΡ-альфа.

Результаты.

Каждая точка на фиг. 9 и 10 представляет собой соответственно М72-специфичный СЭ4 или СЭ8 Т-клеточный ответ (за вычетом фона) пула лимфоцитов периферической крови от пяти мышей через шесть суток после третьей иммунизации. Этот ответ выражают в виде процентной доли СЭ4 Т-клеток, продуцирующих ΙΡΝ-гамма, и/или ΙΡ-2, и/или ΤΝΡ-альфа в ответ на стимуляцию пулом пептидов М72. Черта соответствует среднему значению ответов для каждой группы.

Результаты, приведенные на фиг. 9 и 10, показывают, что сопоставимые СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы индуцируются после трех иммунизаций каждой из тестируемых композиций. Таким образом, можно следать вывод, что уменьшение количества солей, присутствующих в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, не оказывает негативного воздействия на индуцированные Т-клеточные ответы.

Пример 13. Исследование высаливания в композициях, содержащих М72 с СаС1₂ или Мц8О₄, при рН 6,1 и 8,0.

Для изучения влияния других солей на стабильность антигена М72 готовили растворы СаС12 или М§8О₄ в диапазоне концентраций и при разных уровнях рН. Для получения данных о стабильности использовали визуальный просмотр.

Метод.

Очищенный балк-антиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐ8, 8ЕР ΙΌ 3) разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в двух разных буферах (10 мМ сукцинатном буфере при рН 6,1 и 10 мМ трисбуфере при рН 8,0), содержащих определенные количества солей (0; 150 или 300 мМ №С1; 40, 80 или 160 мМ СаСР; 87,5, 175 или 430 мМ М§8О4).

Образцы анализировали сразу после приготовления.

Определяли электропроводность, используя кондуктометр от Мей1ег То1ейо и по 6 мл каждого образца в несиликонизированном стеклянном флаконе.

Результаты.

Груп- па	Соль	Буфер	рН (теор.)	Электро- проводность (мСм/см) (измерено)	рН (измерено)	Визуальное наблюдение
А	0 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	1,1	6,3	Прозрачный
В	№С1 150 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	13,4	6,1	Прозрачный
С	№С1 300 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	20,0	6,1	Прозрачный
ϋ	СаС1₂ 40 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	8,0	6,1	Опалесцирующий
Е	СаС1₂ 80 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	11,2	5,8	Опалесцирующий + большие частицы

- 24 027920

Р	СаС1₂ 160 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	20,2	5,8	Опалесцирующий + большие частицы
О	О 1 О) &	Сукцинат 10 мМ	6,1	7,7	6,1	Опалесцирующий
н	МдБО₄ 175 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	12,4	5,9	Опалесцирующий + очень большие частицы
1	Мд5О₄ 430 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	20,4	5,9	Опалесцирующий + очень большие частицы
й	0 мМ	Трис 10 мМ	8,0	0,463	8,0	Прозрачный
к	№С1 150 мМ	Трис 10 мМ	8,0	12,13	8,0	Прозрачный
1_	№С1 300 мМ	Трис 10 мМ	8,0	21,1	8,0	Прозрачный
м	СаС1₂ 40 мМ	Трис 10 мМ	8,0	6,7	8,1	Большие частицы
N	СаС1₂ 80 мМ	Трис 10 мМ	8,0	10,8	8,0	Опалесцирующий + большие частицы
О	СаС1₂ 160 мМ	Трис 10 мМ	8,0	19,7	8,0	Опалесцирующий + большие частицы
Р	Мд5О₄ 87,5 мМ	Трис 10 мМ	8,0	7,5	8,0	Большие частицы
О	Мд5О₄ 175 мМ	Трис 10 мМ	8,0	10,9	8,2	Опалесцирующий + очень большие частицы
к	Мд8О₄ 430 мМ	Трис 10 мМ	8,0	21,7	8,1	Опалесцирующий + очень большие частицы

Эти результаты демонстрируют, что растворы, содержащие М72-родственный антиген, могут быть чувствительны к другим по сравнению с хлоридом натрия солям. Видно, что влияние СаС1₂ или Мд8О₄является более четко выраженным, чем в случае хлорида натрия, в сопоставимых концентрациях или электропроводности.

Пример 14. Исследование высаливания в композициях, содержащих М!Ь72£ и соль в разных концентрациях, при рН 6,1, 7,5 и 8,5.

Исследовали влияние концентрации хлорида натрия и рН на стабильность антигена М!Ь72£, что оценивали по размеру.

Метод.

Очищенный балк-антиген (М!Ь72£ с 6 остатками Ηΐκ, 8ЕР ГО 7) разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в трех разных буферах (10 мМ фосфатном буфере при рН 6,1, 20 мМ Трис-буфере при рН 7,5 и 20 мМ Трис-буфере при рН 8,5), содержащих конечные концентрации хлорида натрия 0, 150 и 450 мМ.

Образцы хранили в течение 24 ч при 4 или 25°С перед проведением анализа.

Нефелометрию выполняли, используя №рйе1оккап® Аксеп! от Тйегто Пксйег 8с1еп!1Йс. Анализ проводили на пропускающих УФ микропланшетах Сок!аг® от Согшпд 1пс (США).

ЭЬ8 проводили, используя планшетный ридер Эупарго от \\’уаИ 1пк!гитеп!к. Этот прибор работал на длине волны лазера 830 нм и мощности 50 мВт. Детекцию рассеянного света проводили под углом 150° при температуре 22°С. Средний гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (р1) рассчитывают, используя программное обеспечение прибора.

Результаты.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 11 и 12.

Как ΌΕ8, так и нефелометрия демонстрируют общую тенденцию в отношении того, что М!Ь72£ является чувствительным к концентрации солей и рН, по аналогии с М72, как показано в предыдущих примерах. Таким образом, преимущества настоящего изобретения применимы к М72-родственным антигенам, а не только к последовательности самого М72.

Для ряда ОЬ8-образцов на данной контрольно-измерительной аппаратуре было невозможно определить конкретный размер частиц (отмечено как Νν на фиг. 12).

Пример 15. Предотвращение высаливания в композициях, содержащих М72, иммуностимуляторы и сорбит, используемый в качестве вещества, регулирующего тоничность.

Для сравнения стабильности иммуногенных композиций, содержащих 150 мМ №С1, с композициями, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, применяется сорбит, проводили мониторинг образцов с использованием альтернативного ЕЫ8А.

- 25 027920

Метод.

Лиофилизат готовили, как описано в примере 10 (конкретно, в способе (а)) так, чтобы при его объединении с соответствующими адъювантными композициями из примера 7 можно было получить рН 8,5.

Описанный выше лиофилизат растворяли, используя 625 мкл раствора адъювантов, приготовленного в примере 7. После растворения в растворе адъювантов получали следующие иммуногенные композиции:

(1) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίδ - А8А(150 мМ ЫаС1-2) рН 8,5 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т\уссп80.

500 мкг ВОРС,

125 мкг холестерина, мкг 3В-МРЬ, мкг 0821,

150 мМ №С1, мМ фосфат, рН 8,5;

(2) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηίδ - А8А(сорбит-2) рН 8,5 10 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (мас./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (мас./об.) Т\уссп80.

500 мкг ВОРС,

125 мкг холестерина, мкг 30-МРЬ, мкг Ц821, мМ №С1,

4,7% (мас./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 8,5.

Определяли характеристики растворенных иммуногенных композиций, описанных выше, после хранения при 30°С (Т24ч) и сравнивали со свежеприготовленным образцом (Т0).

Антигенность определяли количественно посредством непрямого сэндвич-ЕЫ8А, в котором антиген захватывается М72-специфичным поликлональным антителом кролика и далее выявляется с использованием М72(М1Ь39)-специфичного моноклонального антитела мыши. Кратко, планшет покрывали анти-М72 поликлональным антителом кролика в разведении 1/8000 в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8) по Дульбекко в течение ночи при 4°С, и после четырех промывок планшеты блокировали в течение 1 ч при 37°С, используя насыщающий буфер (РВ8; 0,1% Т\уссп 20, 1% В8А (бычий сывороточный альбумин)). По окончании стадии промывки в лунки первой колонки планшета вносили белковый стандарт (очищенный балк-продукт М72: 1950 мкг/мл), внутренний контроль (М72: 1768 мкг/мл) и образцы в концентрации приблизительно 0,25 мкг/мл, затем выполняют 2-кратное серийное разведение в насыщающем буфере (РВ8, 0,025% Т\\ееп 20) начиная от 1-й до 12-й лунки и инкубируют в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Затем по окончании стадии промывки иммунный комплекс инкубировали в течение 1 ч при 37°С вместе с мышиным моноклональным антителом против М72 в разведении 1/1000 в насыщающем буфере (РВ8, 0,025% Т\\ееп 20). После четырех промывок добавляли биотинилированное кроличье поликлональное антитело против антитела мыши в разведении 1/1000 в насыщающем буфере (РВ8; 0,025% Т\\ееп 20). После четырех промывок сигнал амплифицировали путем добавления комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена, разведенного 1/4000 в насыщающем буфере (РВ8; 0,025% Т\\ееп 20). После четырех промывок сигнал выявляли посредством дигидрохлорида ортофенилендиамина (ОРВА) в течение 15 мин при КТ, и реакцию останавливали добавлением 1 М НС1. Окрашивание пропорционально количеству связавшегося антитела против М72, и его измеряли при 490 и 620 нм. Все стадии промывки осуществляли, используя РВ8, 0,025% Т\\ееп 20.

Все измеренные значения приведены относительно ожидаемой антигенности очищенного балкбелка, использованного для приготовления тестируемых композиций.

Результаты.

Результаты показаны на фиг. 13. Ромбами отмечены конкретные значения измерений для каждого из трех тестируемых образцов, при этом линия указывает среднее значение.

После растворения восстановление антигена оказывается в значительной степени стабильным в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит, при рН 8,5 до 24 ч включительно при 30°С. Восстановление в А8А(сорбит-2) составляло 83,5% через 24 ч (Т0 соответствует 87,1%, и это означает, что сохранялось 95,9% относительной антигенности), в то время как восстановление в Λ8Λ(Ν;·ιΟ-2) составляло 54,5% через 24 ч (Т0 соответст- 26 027920 вует 81,0%, и это означает, что после хранения сохранялось только 67,3% относительной антигенности).

В заключение следует отметить, что в примерах 9, 10 и 15 впервые продемонстрировано пагубное воздействие рН и концентрации Ν;·ιί'.Ί на стабильность иммуногенных композиций, содержащих М72родственный антиген. Эта работа продолжена в примере 13 для демонстрации того, что и другие соли также могут оказывать пагубное воздействие на стабильность иммуногенных композиций, содержащих М72-родственный антиген, вместе с примером 14, демонстрирующим, что этот эффект также применим к М72-родственным последовательностям.

Изменение состава иммуногенных композиций с использованием неионного вещества, регулирующего тоничность, связано с проблемами антигенной стабильности. Кроме того, примеры 3, 4 и 12 демонстрируют, что удаление, по существу, всего №С1 из иммуногенной композиции и замена его на сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность, не оказывает пагубного воздействия на стимуляцию Тклеточных ответов.

Стабильность иммуногенных композиций является ключевым фактором, и могут потребоваться особые усилия при невозможности организации в отдельных местах хранения при низких температурах. За счет уменьшения присутствия солей в иммуногенных композициях авторам настоящего изобретения удалось уменьшить степень изменений, наблюдаемых при хранении иммуногенных композиций.

Во всем описании и формуле изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, слово содержать и такие варианты, как содержит и содержащий, будут пониматься как предназначенные для конкретизации наличия указанных целого, стадии, группы целых или группы стадий, а не исключения любого другого целого, стадии, группы целых или группы стадий.

Все упомянутые в данном описании документы, в том числе патенты и патентные заявки, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая М72-родственный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с 8ЕО ГО №: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше и значение рН указанной композиции находится в диапазоне от 7,0 до 9,0.
2. Иммуногенная композиция по п.1, где электропроводность композиции составляет 4 мСм/см или меньше.
3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где электропроводность композиции составляет 3 мСм/см или меньше.
4. Иммуногенная композиция по п.1, где концентрация солей в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.
5. Иммуногенная композиция по п.1, где концентрация хлорида натрия в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.
6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая неионное вещество, регулирующее тоничность.
7. Иммуногенная композиция по п.6, где неионное вещество, регулирующее тоничность, представляет собой полиол.
8. Иммуногенная композиция по п.7, где полиол представляет собой сорбит и где концентрация сорбита составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).
9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, где концентрация сахарозы составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).
10. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-9, дополнительно содержащая один или более иммуностимуляторов.
11. Иммуногенная композиция по п.10, где иммуностимулятор представляет собой сапонин и/или агонист ТЬК4 (То11-подобный рецептор 4).
12. Иммуногенная композиция по п.10 или 11, содержащая 0821.
13. Иммуногенная композиция по п.11 или 12, где агонист ТЬК4 представляет собой липополисахарид.
14. Иммуногенная композиция по любому из пп.10-13, содержащая 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А.
15. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-14, где осмоляльность составляет 250-750 мОсм/кг.
16. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-15, где значение рН указанной композиции находится в диапазоне от 7,5 до 8,5.
17. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-16, где М72-родственный антиген состоит из последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности с 8ЕО ГО №: 1.
18. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-16, где М72-родственный антиген содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО №: 3.

- 27 027920
19. Иммуногенная композиция по п.18, где М72-родственный антиген состоит из аминокислотной последовательности 8Ер ΙΌ Νο: 3.
20. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-19 в изготовлении лекарственного препарата для профилактики, лечения или ослабления инфекции Му^Ьа^епиш ШЬегсиЬзхз.
21. Применение иммуногенной композиции по п.20 в изготовлении лекарственного препарата для введения человеку.
22. Дозированная форма иммуногенной композиции по любому из пп.1-19, где стандартная доза составляет от 50 мкл до 1 мл и содержит 5-50 мкг М72-родственного белка.
23. Дозированная форма по п.22, где стандартная доза представляет собой дозу для человека и содержит от 1 до 100 мкг 3И-МРЬ (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А).
24. Дозированная форма по п.22 или 23, где стандартная доза представляет собой дозу для человека и содержит от 1 до 100 мкг Р821.