PT2651436E - Composição antigénica de micobactéria - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO ANTIGÉNICA DE MICOBACTÉRIA"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a composições imunogénicascompreendendo um antigénio relacionado com Rvll96 e possuindouma baixa força iónica. A presente invenção também se refere aessas composições imunogénicas que compreendem ainda um ou maisimunoestimulantes.

Antecedentes da Invenção A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa crónica provocadapor infeção com Mycobacterium tuberculosis e outras espécies deMycobacterium. É uma das principais doenças nos países emdesenvolvimento, bem como um problema crescente em áreasdesenvolvidas do mundo. Pensa-se que mais de 2 bilhões de pessoasestejam infetadas com bacilos da TB, com cerca de 9,4 milhões denovos casos de TB e 1,7 milhões de mortes a cada ano. 10% dosinfetados com bacilos da TB desenvolverão TB ativa, cada pessoacom TB ativa infetando uma média de 10 a 15 outros por ano.Embora as taxas de incidência anuais tenham atingido um picoglobalmente, o número de mortes e casos continua a aumentardevido ao crescimento populacional (Organização Mundial deSaúde, Tuberculosis Facts 2010) . A proteína micobacteriana Rvll96 (descrita, por exemplo,pelo nome Mtb39a em Dillon et ai., Infection and Immunity 199967(6): 2941-2950) ou os seus fragmentos ou derivados, sãoantigénios proteicos de potencial benefício para o tratamento ouprevenção da tuberculose. A Rvll96 é altamente conservada, com100% de identidade de sequência através das estirpes H37Rv, C,Haarlem, CDC1551, 94-M4241A, 98-R604INH-RIF-EM, KZN605, KZN1435,KZN4207, KZNR506, a estirpe Fll possuindo uma única mutaçãopontual Q30K. A Rvll96 é um componente dos antigénios proteicosde fusão Mtb72f e M72 (descritos, por exemplo, no pedido depatente internacional W02006/117240). A formulação de antigénios proteicos é extremamenteimportante, de modo a assegurar que a imunogenicidade é mantida.Os imunostimulantes são, por vezes, utilizados para melhorar aresposta imunitária desencadeada para qualquer antigénio.Contudo, a inclusão de adjuvantes numa composição imunogénicaaumenta a complexidade da preparação dos componentes, bem como acomplexidade da distribuição e formulação da composição. Deveser considerado pelos formuladores a preparação de cada doscomponentes adjuvantes, bem como do componente antigénico. Emparticular, deve ser considerada a compatibilidade do componenteantigénico com o componente adjuvante. Este é particularmente ocaso, onde se pretende que os antigénios liofilizados oupreparações antigénicas sejam reconstituídos com uma preparaçãode adjuvante. Nessa circunstância, é importante que o tampão dapreparação de adjuvante seja adequado para o antigénio e que aimunogenicidade ou solubilidade do antigénio não seja afetadapelo adjuvante.

Leroux-Roels et al., Clinical and Vaccine Immunology 201017(11):1763-1771 descrevem a vacina candidata para a tuberculoseMtb72f/AS02.

Nair et al., Journal of Immunology 2009 183(10)6269-6281 descrevem composições imunogénicas compreendendo PPE18 (tambémconhecido como Rvll96).

Skeiky et al., The Journal of Immunology, The AmericanAssociation of Immunologists, 2004 172(12)7618-7628 descrevem uma composição imunogénica compreendendo a proteína Mtb72F.

Sumário da invenção A presente requerente identificou pela primeira vez que osantigénios relacionados com Rvll96 são particularmente sensíveisà presença de sais. Sem estar limitado pela teoria, pensa-seque os antigénios relacionados com Rvll96 são negativamenteimpactados por um fenómeno conhecido como "precipitação porsais", o qual pode ser definido como a precipitação de umaproteína a partir da sua solução por interação com sais, talcomo cloreto de sódio. A presente requerente verificou que estesantigénios se agregam e precipitam a uma concentração decloreto de sódio tão baixa quanto 150 mM. Consequentemente, aestabilidade das composições imunogénicas compreendendoantigénios relacionados com Rvll96 pode ser surpreendentementemelhorada através de uma redução na concentração de cloreto desódio.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona umacomposição imunogénica compreendendo um antigénio relacionado com Rvll96, em que o antigénio relacionado com Rvll96 compreende uma sequência possuindo, pelo menos, 90% de identidade com a SEQ ID N2: 1 ou (b) um fragmento da SEQ ID N2: 1, o qual possui,pelo menos, 350 aminoácidos de comprimento, e em que a condut ividade da composição é 5 mS/cm ou inferior e o pH da composição está na gama de 7,0 a 9,0.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Curva de atividade lítica de QS21

Figura 2. Percentagem de cada congénere de 3D-MPL nas

diferentes formulações de ASA

Figura 3. Nefelometria de composições imunogénicas com pH e concentrações NaCl variados após armazenamentoFigura 4. DLS de composições imunogénicas com pH e concentrações de NaCl variados após armazenamentoFigura 5. DLS de composições imunogénicas com pH e concentrações de NaCl variados após armazenamentoFigura 6. Nefelometria de composições imunogénicas com pH e concentrações NaCl variados após armazenamentoFigura 7. Estabilidade antigénica de composições imunogénicas com pH e concentrações de NaClvariados após armazenamento

Figuras 8a-8d. Análise de SEC-HPLC de composições imunogénicascom pH e concentrações de NaCl variados apósarmazenamento

Figura 9. Antigenicidade de composições imunogénicas com pH e concentrações de NaCl variados apósarmazenamento

Figura 10. Condutividade de soluções padrão de NaCl

Figura 11. Indução de respostas de células T CD4 em murganhos utilizando composições imunogénicas da invenção

Figura 12. Indução de respostas de células T CD 8 em murganhos utilizando composições imunogénicas da invenção

Figura 13. Nefelometria de composições imunogénicas com pH e concentrações de NaCl variados após armazenamentoFigura 14. DLS de composições imunogénicas com pH e concentrações de NaCl variados após armazenamentoFigura 15. Antigenicidade de composições imunogénicas com concentrações de NaCl variadas após armazenamento

Breve descrição de identificadores de sequência SEQ ID N2: 1 Sequência de aminoácidos para a proteína Rvll96 de Mycobacterium tuberculosis H37RvSEQ ID Ns: 2 Sequência nucleotídica que codifica a proteína

Rvll96 de Mycobacterium tuberculosis H37RvSEQ ID Ns: 3 Sequência de aminoácidos para a proteína Rvll96 de Mycobacterium tuberculosis FllSEQ ID Ns: 4 Sequência nucleotídica que codifica a proteína

Rvll96 de Mycobacterium tuberculosis FllSEQ ID Ns: 5 Sequência de aminoácidos para a proteína M72 SEQ ID N2: 6 Sequência nucleotídica que codifica a proteína M72 SEQ ID N2 : 7 Sequência de aminoácidos para a proteína M72 com dois resíduos de His N-terminais SEQ ID N2: 8 Sequência nucleotídica que codifica a proteína M72com dois resíduos de His N-terminaisSEQ ID N2: 9 Sequência de aminoácidos para a proteína Mtb72f SEQ ID N2 : 10 Sequência nucleotídica que codifica a proteína

Mtb72f SEQ ID N2: 11 Sequência de aminoácidos para a proteína Mtb72fcom seis resíduos de His N-terminaisSEQ ID N2: 12 Sequência nucleotídica que codifica a proteína

Mtb72f seis resíduos de His N-terminaisSEQ ID N2: 13 Sequência nucleotídica para CpG Oligo 1 (CpG 1826) SEQ ID N2: 14 Sequência nucleotídica para CpG Oligo 2 (CpG 1758) SEQ ID N2: 15 Sequência nucleotídica para CpG Oligo 3 SEQ ID N2: 16 Sequência nucleotídica para CpG Oligo 4 (CpG 2006) SEQ ID N2: 17 Sequência nucleotídica para CpG Oligo 5 (CpG 1686)

Descrição detalhada da invenção

Num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona umacomposição imunogénica compreendendo um antigénio relacionadocom Rvll96, em que o antigénio relacionado com Rvll96 compreende(a) uma sequência possuindo, pelo menos, 90% de identidade com aSEQ ID N2: 1 ou (b) um fragmento da SEQ ID N2: 1, o qual possui,pelo menos, 350 aminoácidos de comprimento, o pH da referidacomposição está na gama de 7,0 a 9,0 e em que a condutividade dacomposição imunogénica é 5 mS/cm ou inferior, 4 mS/cm ou inferiorou 3 mS/cm ou inferior. Numa forma de realização particular, acondutividade da composição imunogénica é 2,5 mS/cm ou inferior,tal como 2,25 mS/cm ou inferior ou 2,0 mS/cm ou inferior. Numaforma de realização específica adicional, a condutividade dacomposição imunogénica é 1,5 a 2,5 mS/cm.

Em algumas formas de realização, a presente invençãoproporciona uma composição imunogénica, em que a concentração desais na referida composição é 40 mM ou inferior. Numa forma de realização particular, a concentração de sais na referidacomposição é 35 mM ou inferior, tais como 30 mM ou inferior ou25 mM ou inferior. Numa forma de realização específica adicional,a concentração de sais na referida composição é 20 a 40 mM, talcomo 25 a 35 mM.

Em algumas formas de realização, a presente invençãoproporciona uma composição imunogénica em que a concentração decloreto de sódio é 40 mM ou inferior, 30 mM ou inferior, 20 mMou inferior ou 15 mM ou inferior. Numa forma de realizaçãoparticular, a concentração de cloreto de sódio na composiçãoimunogénica é 10 mM ou inferior, tal como 7,5 mM ou inferior.Adequadamente, a concentração de cloreto de sódio na composiçãoimunogénica ou é igual ou inferior a 5 mM. Numa forma derealização específica adicional, a composição imunogénica éessencialmente livre de cloreto de sódio. Essencialmente livre,significa que a concentração de cloreto de sódio é igual oumuito próxima de zero mM (tais como 3 mM ou menos, 2 mM ou menosou 1 mM ou menos).

Adequadamente, a concentração de CaCl2 nas composições imunogénicas será 30 mM ou inferior, 20 mM ou inferior, 15 mM ouinferior ou 10 mM ou inferior.

Adequadamente, a concentração de MgS04 nas composições imunogénicas será 60 mM ou inferior, 40 mM ou inferior, 30 mM ouinferior, 20 mM ou inferior ou 10 mM ou inferior.

Adequadamente, a concentração total de iões NH4+, Mg2+ e Ca2+nas composições imunogénicas será 60 mM ou inferior, 40 mM ouinferior, 30 mM ou inferior, 20 mM ou inferior ou 10 mM ouinferior.

As composições imunogénicas da invenção serão preparaçõesaquosas. A condutividade de uma composição imunogénica da invençãopode ser medida utilizando técnicas conhecidas no campo técnico,por exemplo, utilizando um medidor de condutividade especificoou outro instrumento com a capacidade para medir acondutividade. Um instrumento adequado é o Zetasizer Nano ZS daMalvern Instruments (RU) . 0 especialista pode facilmente testar a concentração deambos os iões sódio (Na+) e cloreto (Cl-) utilizando técnicas ekits conhecidos. Por exemplo, o sódio pode ser determinadoutilizando um kit, tal como o Kit de Ensaio Enzimático de Sódio(Número de Catálogo: BQ011EAEL) da Biosupply. 0 cloreto pode serdeterminado utilizando um kit, tal como Kit de Ensaio Enzimáticode Cloreto (Número de Catálogo: BQ006EAEL) da Biosupply. A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa crónica provocadapor infeção com Mycobacterium tuberculosis e outras espécies deMycobacterium. É uma das principais doenças nos países emdesenvolvimento, bem como um problema crescente em áreasdesenvolvidas do mundo. Pensa-se que mais de 2 bilhões de pessoasestejam infetadas com bacilos da TB, com cerca de 9,4 milhões denovos casos de TB e 1,7 milhões de mortes a cada ano. 10% dosinfetados com bacilos da TB desenvolverão TB ativa, cada pessoacom TB ativa infetando uma média de 10 a 15 outros por ano.Embora as taxas de incidência anuais tenham atingido um picoglobalmente, o número de mortes e casos continua a aumentardevido ao crescimento populacional (Organização Mundial deSaúde, Tuberculosis Facts 2010). A Mycobacterium tuberculosis infeta indivíduos através davia respiratória. Os macrófagos alveolares engolfam a bactéria,mas esta é capaz de sobreviver e proliferar por inibição dafusão do fagossoma com lisossomas acidicos. Uma respostaimunitária complexa envolvendo células T CD4+ e CD8+ inicia-se,resultando em última análise na formação de um granuloma.Central para o sucesso da Mycobacterium tuberculosis como umpatogénio é o facto de que a bactéria isolada, mas nãoerradicada, pode persistir durante longos períodos, deixando umindivíduo vulnerável ao desenvolvimento posterior de TB ativa.

Menos de 5% dos indivíduos infetados desenvolvem a TB ativanos primeiros anos após a infeção. 0 granuloma pode persistirdurante décadas e pensa-se que contenha Mycobacteriumtuberculosis num estado de dormência, privada de oxigénio enutrientes. Contudo, foi sugerido recentemente que a maioria dasbactérias no estado de dormência estão localizadas nos tiposcelulares não macrófagos disseminados por todo o corpo (Lochtet al.r Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11):1665-1677). O desenvolvimento de TB ativa ocorre quando o equilíbrio entre aimunidade natural do hospedeiro e do patogénio se altera, porexemplo, em resultado de um evento imunossupressor (Anderson PTrends in Microbiology 2007 15 (1) :7 —13; Ehlers S Infection 200937(2): 87-95) .

Foi também proposta uma hipótese dinâmica que descreve oequilíbrio entre a TB latente e a TB ativa (Cardana P-JInflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-JInfection 2009 37 (2) :80-86) .

Embora uma infeção possa ser assintomática durante umperíodo de tempo considerável, a doença ativa manifesta-se mais geralmente como uma inflamação aguda dos pulmões, resultando emcansaço, perda de peso, febre e uma tosse persistente. Se nãofor tratada, resulta tipicamente em graves complicações e morte. A tuberculose pode ser controlada utilizando geralmenteantibioticoterapia prolongada, embora esse tratamento não sejasuficiente para impedir a disseminação da doença. Os indivíduosinfetados ativamente podem ser bastante assintomáticos, mascontagiosos, durante algum tempo. Além disso, embora sejacrítico o cumprimento do regime de tratamento, o comportamentodo doente é difícil de monitorizar. Alguns doentes não completamo curso do tratamento, o que pode levar a tratamento ineficaz eao desenvolvimento de resistência a fármacos. A TB resistente a multifármacos (MDR-TB) é uma forma quefalha na resposta a medicamentos de primeira linha. 3,3% detodos os casos de TB são MDR-TB, com uma estimativa de 440000novos casos de MDR-TB a ocorrerem a cada ano. A TB extensivamenteresistente a fármaco (XDR-TB) ocorre quando se desenvolve aresistência a medicamentos de segunda linha, além da resistênciaa medicamentos de primeira linha. A XDR-TB virtualmente nãotratável foi confirmada em 58 países (Organização Mundial deSaúde, Tuberculosis Facts 2010).

Mesmo se um curso completo de tratamento com antibióticosfor completado, a infeção com M. tuberculosis pode não sererradicada do indivíduo infetado e pode permanecer como umainfeção latente que pode ser reativada. De modo a controlar adisseminação da tuberculose, um programa de vacinação eficaz ediagnóstico precoce preciso da doença são de extrema importância.

Atualmente, a vacinação com bactérias vivas é o método maisamplamente utilizado para induzir imunidade protetora. AMycobacterium mais comum utilizada para esta finalidade é aBacillus Calmette-Guerin (BCG), uma estirpe avirulenta deM. bovis, a qual foi desenvolvida pela primeira vez à mais de60 anos. Contudo, a segurança e eficácia da BCG é uma fonte decontrovérsia - embora proteja contra a manifestação da doençagrave em crianças, a BCG não impede o estabelecimento de TBlatente ou a reativação de doença pulmonar na vida adulta. Alémdisso, alguns países, tal como os Estados Unidos, não vacinam apopulação geral com este agente. Têm-se mostrado que diversas das proteínas que sãofortemente expressas durante os estádios iniciais da infeção porMycobacterium proporcionam eficácia protetora em modelos devacinação animais. Contudo, a vacinação com antigénios que sãoaltamente expressos durante os estádios iniciais da infeção podemnão proporcionar uma resposta imunitária ótima para lidar comestádios posteriores da infeção. O controlo adequado durante ainfeção latente pode requerer células T, as quais sãoespecíficas para os antigénios particulares que são expressosnesse momento. As vacinas pós-exposição que visam diretamente asbactérias persistentes dormentes podem auxiliar na proteçãocontra a reativação da TB, melhorando desse modo o controlo daTB ou até possibilitando a eliminação da infeção. Uma vacina quevisa a TB latente poderia, assim, reduzir significativa eeconomicamente as taxas globais de infeção por TB.

As vacinas de subunidades baseadas em antigénios de estádiotardio poderiam também ser utilizadas em combinação comantigénios de estádio precoce para proporcionar uma vacinamultifásica. Em alternativa, poderiam ser utilizados antigénios de estádio precoce e/ou tardio para complementar e melhorar avacinação com BCG (reforçando a resposta da BCG ou através dodesenvolvimento de estirpes de BCG recombinantes avançadas). 0 antigénio proteico Rvll96 é de potencial beneficio parao tratamento ou prevenção da tuberculose. 0 Rvll96 é descrito,por exemplo, pelo nome Mtb39a em Dillon et al., Infection andImmunity 1999 67(6): 2941-2950). A proteína Rvll96 é altamente conservada, com 100% de identidade de sequência através dasestirpes H37Rv, C, Haarlem, CDC1551, KZN605, KZN1435 e KZN4207, a estirpe Fll possuindo uma única mutação pontual (Q30K).

Os antigénios proteicos Mtb72f e M72 são proteínas defusão compreendendo Rvll96 e são de potencial benefício para otratamento ou prevenção da tuberculose. O Mtb72f mostrouproporcionar proteção em vários modelos animais (ver, porexemplo: Brandt et al., Infect. Immun. 2004 72 (11) :6622-6632;

Skeiky et al., J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Tsenova et al.,

Infect. Immun. 2006 74 (4) : 23 92-24 01; Reed et al., PNAS 2009 106(7) :2301-2306) . O Mtb72f foi também o objeto de investigaçõesclínicas (Von Eschen et al., 2009 Human Vaccines 5(7) :475-482) . M72 é um antigénio melhorado, o qual incorpora uma única mutaçãoserina para alanina relativamente a Mtb72f, resultando emcaracterísticas de estabilidade melhoradas. Os antigénios relacionados com M72 mostraram também ser de valor num modelo deTB latente (pedido de patente internacional W02006/117240).

Como aqui utilizada, a expressão "antigénio relacionadocom Rvll96" refere-se à proteína Rvll96 proporcionada naSEQ ID Ns: 1 ou um seu derivado imunogénico, a qual é umasequência compreendendo (a) uma sequência possuindo, pelo menos,90% de identidade com a SEQ ID Ns: 1 ou (b) um fragmento da SEQ ID N2 : 1, o qual possui, pelo menos, 350 aminoácidos decomprimento. Os derivados imunogénicos são suficientementesemelhantes à sequência de referência para reterem aspropriedades imunogénicas da sequência de referência epermanecerem capazes de permitir que seja desencadeada umaresposta imunitária contra a sequência de referência. Umderivado pode, por exemplo, compreender (a) uma sequênciapossuindo, pelo menos, 90% de identidade com a SEQ ID N2: 1 ou(b) um fragmento da SEQ ID N2: 1, o qual é, pelo menos,350 aminoácidos de comprimento ou, em alternativa, podeconsistir de (a) uma sequência possuindo, pelo menos, 90% deidentidade com a SEQ ID N2: 1 ou (b) um fragmento daSEQ ID N2: 1, o qual possui, pelo menos, 350 aminoácidos decomprimento. O antigénio relacionado com Rvll96 pode, por exemplo,conter menos do que 1000 resíduos de aminoácidos, tal como menosdo que 900 resíduos de aminoácidos, em particular, menos do que800 resíduos de aminoácidos.

Os epitopos de células T são extensões contíguas curtas deaminoácidos, os quais são reconhecidos por células T (e. g.,células CD4+ ou CD8 + ) . A identificação de epitopos de células Tpode ser obtida por experiências de mapeamento de epitopos, asquais são conhecidas pelo especialista na técnica (ver, porexemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (1993);Beiβbarth et al. , Bioin format ics 2005 21 (Supl. 1) : Í29-Í37) .Numa população diversa não consanguínea, tal como humanos,diferentes tipos de HLA significam que os epitopos particularespodem não ser reconhecidos por todos os elementos da população.Em resultado do envolvimento crucial da resposta de células T natuberculose, para maximizar o nível de reconhecimento e escala de resposta imunitária, um derivado imunogénico de Rvll96 é,desejavelmente, um que contém a maioria (ou, adequadamente,todos) os epitopos de células T intactos.

As tabelas de substituição conservativa que proporcionamaminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas natécnica. Em geral, essas substituições conservativas irão cairdentro de um dos agrupamentos de aminoácidos especificadosabaixo, apesar de, em algumas circunstâncias, poderem serpossíveis outras substituições, sem afetar substancialmente aspropriedades imunogénicas do antigénio. Os seguintes oito gruposcontêm, cada, aminoácidos que são tipicamente substituiçõesconservativas uns com os outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R), Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, e. g., Creighton, Proteins 1984).

Adequadamente, essas substituições não ocorrem na região deum epitopo e não têm, assim, um impacto significativo naspropriedades imunogénicas do antigénio.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", nocontexto de duas ou mais sequências polipeptídicas, referem-se aduas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas outêm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos que são os mesmos (i. e., 70% de identidade, opcionalmente 75%, 80%,85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade ao longo de uma regiãoespecificada), quando comparadas e alinhadas para correspondênciamáxima ao longo de uma janela de comparação ou região designadacomo medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparaçãode sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Estadefinição também se refere ao complemento de uma sequência deteste. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma regiãoque possui, pelo menos, 500 aminoácidos de comprimento, taiscomo, pelo menos, 600 aminoácidos ou, pelo menos,700 aminoácidos. Adequadamente, a comparação é realizada aolongo de uma janela que corresponde ao comprimento total dasequência de referência (em oposição à sequência do derivado).

Para a comparação de sequências, uma sequência atua como asequência de referência, com a qual as sequências de teste sãocomparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação desequências, a sequência de teste e de referência são inseridasnum computador, são concebidas coordenadas de subsequência, senecessário, e são concebidos parâmetros de programa de algoritmode sequência. Podem ser utilizados parâmetros de programapredefinidos ou podem ser concebidos parâmetros alternativos. Oalgoritmo de comparação de sequências, calcula então apercentagem de identidades de sequência para as sequências deteste relativas à sequência de referência, com base nosparâmetros de programa.

Uma "janela de comparação", como aqui utilizado, refere-sea um segmento no qual uma sequência pode ser comparada com umasequência de referência do mesmo número de posições contíguasapós as duas sequências serem alinhadas otimamente. Os métodosde alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. 0 alinhamento ótimo de sequências para comparaçãopode ser conduzido, e. g., pelo algoritmo de homologia local deSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmode alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443 (1970), pela pesquisa para método de similaridade dePearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), porimplementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT,FASTA e TFASTA no Pacote Wisconsin Genetics Software, GeneticsComputer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI) ou por alinhamentomanual e inspeção visual (ver, e. g., Current Protocols inMolecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).

Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP produz umalinhamento de sequência múltiplo a partir de um grupo desequências relacionadas utilizando alinhamentos de pares,progressivos, para mostrar relações e percentagem de identidadede sequência. Este também traça uma árvore ou dendogramamostrando as relações de agrupamento utilizadas para produzir oalinhamento. O PILEUP utiliza uma simplificação do método dealinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol.35:351-360 (1987). O método utilizado é semelhante ao métododescrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). O programapode alinhar até 300 sequências, cada, de um comprimento máximode 5000 nucleótidos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamentomúltiplo começa com o alinhamento de pares das duas sequênciasmais semelhantes, produzindo um agrupamento de duas sequênciasalinhadas. Este agrupamento é depois alinhado para a seguintesequência ou agrupamento mais relacionado de sequênciasalinhadas. Dois agrupamentos de sequências são alinhados por umaextensão simples do alinhamento de pares de duas sequênciasindividuais. O alinhamento final é obtido por uma série dealinhamentos de pares, progressivos. O programa é executado por conceção de sequências específicas e as suas coordenadas deaminoácidos para regiões de comparação de sequência e porconceção dos parâmetros de programa. Utilizando o PILEUP, umasequência de referência é comparada com outras sequências deteste para determinar a relação de percentagem de identidade desequência utilizando os seguintes parâmetros: peso da lacunapredefinido (3,00), peso do comprimento de lacuna predefinido(0,10) e lacunas finais pesadas. O PILEUP pode ser obtido apartir do pacote de software de análise de sequência GCG, e. g.,versão 7.0 (Devereaux et al. , Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)).

Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar apercentagem de identidade de sequência e similaridade desequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, os quais sãodescritos em Altschul et al., Nuc. Acid Res. 25:3389-3402 (1977)e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990),respetivamente. O software para realizar análises de BLAST estádisponível publicamente através do National Center forBiotechnology Information (sítio da internet emwww.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve, em primeirolugar, identificar pares de sequência de pontuação elevada(HSP) por identificação de palavras curtas de comprimento W nasequência de pesquisa, a qual combina ou satisfaz algumapontuação T de limite de valor positivo quando alinhada com umapalavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T éreferido como o limite de pontuação de palavra na vizinhança(Altschul et al., supra). Estes acertos de palavras na vizinhançainiciais atuam como sementes para iniciar pesquisas paraencontrar HSP mais longas contendo-as. Os acertos de palavrassão estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequênciapara tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo podeser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências nucleotidicas, os parâmetros M(pontuação de retribuição para um par de resíduoscorrespondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade pararesíduos desemparelhados; sempre < 0) . Para sequências deaminoácidos, é utilizada uma matriz de pontuação para calcular apontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cadadireção é interrompida quando: a pontuação de alinhamentocumulativo cai pela quantidade X a partir do seu valor obtidomáximo; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido àacumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuaçãonegativa; ou é atingido o final de qualquer sequência. Osparâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam asensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN(para sequências nucleotidicas) utiliza por defeito umcomprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10,M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequênciasde aminoácidos, o programa BLASTP utiliza por defeito umcomprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e a matrizde pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff &amp; Henikoff, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa(E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística dasimilaridade entre duas sequências (ver, e. g. , Karlin &amp;Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Umamedida de semelhança proporcionada pelo algoritmo BLAST é aprobabilidade de menor soma (P(N)), a qual proporciona umaindicação da probabilidade pela qual uma correspondência entreduas sequências de nucleótidos ou aminoácidos iria ocorrer poracaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante auma sequência de referência se a probabilidade de menor soma numacomparação do ácido nucleico de teste para o ácido nucleico de referência é menos do que cerca de 0,2, de um modo maispreferido, menos do que cerca de 0,01 e, de um modo muitopreferido, menos do que cerca de 0,001.

Em qualquer caso, os derivados imunogénicos de umasequência polipeptidica terão essencialmente a mesma atividadeque a sequência de referência. Essencialmente a mesma atividadesignifica, pelo menos, 50%, adequadamente, pelo menos, 75% e,especialmente, pelo menos, 90% de atividade da sequência dereferência num ensaio de reestimulação in vitro de PBMC ousangue total com antigénios específicos (e. g., reestimulaçãodurante um período de entre diversas horas até duas semanas, taiscomo até um dia, 1 dia a 1 semana ou 1 a 2 semanas) que mede aativação das células por meio de linfoproliferação, produção decitocinas no sobrenadante da cultura (medido por ELISA, CBA,etc.) ou caracterização de respostas de células T e B porcoloração intra e extracelular (e. g., utilizando anticorposespecífico para marcadores imunes, tais como CD3, CD4, CD8, IL2,TNF-alfa, IFN-gama, CD40L, CD69 etc.), seguido por análise comum citómetro de fluxo. Adequadamente, essencialmente a mesmaatividade significa, pelo menos, 50%, adequadamente, pelo menos,75% e, especialmente, pelo menos, 90% de atividade da sequênciade referência num ensaio de produção de proliferação de células Te/ou IFN-gama.

Adequadamente, o antigénio relacionado com Rvll96compreenderá, tal como consiste de, uma sequência possuindo,pelo menos, 90% com a SEQ ID N2 1, especialmente, pelo menos,95%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelo menos, 99%.

Um exemplo específico de um antigénio relacionado comRvll96 é Rvll96 de Mycobacterium tuberculosis estirpe H37Rv, como proporcionado na SEQ ID N2: 1. Consequentemente, numa formade realização da invenção, o antigénio relacionado com Rvll96 éuma proteína compreendendo a SEQ ID Ns: 1. Numa segunda forma derealização da invenção, o antigénio relacionado com Rvll96 é umaproteína consistindo da SEQ ID Ns: 1.

Um exemplo adicional de um antigénio relacionado com Rvll96é Rvll96 de Mycobacterium tuberculosis estirpe Fll, comoproporcionado na SEQ ID Ns: 3. Numa forma de realização dainvenção, o antigénio relacionado com Rvll96 é uma proteínacompreendendo a SEQ ID Ns: 3. Numa segunda forma de realizaçãoda invenção, o antigénio relacionado com Rvll96 é uma proteínaconsistindo da SEQ ID Ns: 3.

Outros derivados imunogénicos de Rvll96 são aqueles quecompreendem, tal como consistem de, um fragmento da SEQ ID N2: 1,o qual é, pelo menos, 350 aminoácidos de comprimento.

Os antigénios relacionados com Rvll96 podem ser preparadospor métodos descritos anteriormente (e. g. , Dillon et al.,Infection and Immunity 1999 67(6): 2941-2950; documentoW02006/117240), aqueles proporcionados nos Exemplos, ou métodosanálogos a estes.

As composições imunogénicas podem compreender um ou maiscomponentes antigénicos adicionais. Esses componentes antigénicosadicionais não necessitam por si só de ser sensíveis à presençade sais na composição.

Os componentes antigénicos adicionais podem ser destinadosa fortalecer ou complementar as respostas imunes solicitadaspelo antigénio relacionado com Rvll96 no campo da prevenção e terapia da tuberculose ou os antigénios adicionais poderiam serassociados com outros patogénios e serem destinados paraadministração com o antigénio relacionado com Rvll96 por razõesde conveniência. Quando vários componentes antigénicos estãopresentes dentro da formulação, estes podem ser proporcionadosna forma de polipéptidos individuais ou proteínas de fusão. Emalgumas circunstâncias, os componentes antigénicos adicionaispodem ser proporcionados como um polinucleótido (oupolinucleótidos).

Os derivados imunogénios particulares da proteína Rvll96incluem proteínas de fusão compreendendo uma sequência possuindo,pelo menos, 90% de identidade com a SEQ ID N2: 1, especialmente,pelo menos, 95%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelomenos, 99%.

As proteínas de fusão exemplificativas contendo uma proteínaRvll96 incluem: M72 (SEQ ID N2: 5) e as suas variantes, tal comoaquelas com resíduos de His adicionais no N-terminal (e. g. ,dois resíduos de His, como proporcionado na SEQ ID N2: 7; ou umacauda de poli-histidina de cinco ou, particularmente, seisresíduos de His, a qual pode ser utilizada para purificação porafinidade de níquel); Mtb72f (SEQ ID N2: 9), a qual contém oresíduo de serina original que foi mutado em M72, como são asproteínas Mtb72f com resíduos de His adicionais no N-terminal(e. g., dois resíduos de His; ou uma cauda de poli-hist idina decinco ou, particularmente, seis resíduos de His, os quais podemser utilizados para purificação por afinidade de níquel). É bem conhecido que, para a administração parentérica, assoluções devem ter uma osmolalidade farmaceuticamente aceitávelpara evitar a distorção ou lise celular. Uma osmolalidade farmaceuticamente aceitável significará geralmente que assoluções terão uma osmolalidade que é, aproximadamente, isotónicaou ligeiramente hipertónica. Adequadamente, as composiçõesimunogénicas da presente invenção terão uma osmolalidade na gamade 250 a 750 mOsm/kg, por exemplo, a osmolalidade pode estar nagama de 250 a 550 mOsm/kg, tal como na gama de 280 a 500 mOsm/kg. A osmolalidade pode ser medida de acordo com técnicasconhecidas no campo técnico, tal como pela utilização de umosmómetro disponível comercialmente, por exemplo, o Advanced®Modelo 2020 disponível de Advanced Instruments Inc. (EUA).

Um "agente de isotonicidade" é um composto que é toleradofisiologicamente e confere uma tonicidade adequada para umaformulação para impedir o fluxo líquido de água através dasmembranas celulares que estão em contacto com a formulação.

Geralmente, o cloreto de sódio (NaCl) é utilizado como umagente de tonicidade. A presente requerente mostrou pela primeiravez que os antigénios relacionados com Rvll96 são particularmentesensíveis a "precipitação por sais", um processo pelo qual asproteínas em solução se agregam ou coagulam quando em soluçõescontendo elevadas concentrações de sal. Consequentemente, sãoproporcionados meios alternativos para garantir que ascomposições imunogénicas da invenção têm uma osmolalidadefarmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização particular, são proporcionadascomposições imunogénicas compreendendo ainda um agente detonicidade não iónico. Um agente de tonicidade não iónico parautilização numa composição imunogénica irá ele próprio necessitarde ser farmaceuticamente aceitável, e. g., adequado para utilização em humanos, bem como ser compatível com o antigéniorelacionado com Rvll96 e compatível ainda com outros componentes,tal como o(s) imunostimulante(s).

Numa forma de realização da presente invenção, os agentesde tonicidade não iónicos adequados são polióis, açúcares (emparticular, sacarose, frutose, dextrose ou glicose) ouaminoácidos, tal como glicina. Numa forma de realização, o poliolé um álcool de açúcar, especialmente em álcool de açúcar C3-6.Os álcoois de açúcar exemplificativos incluem glicerol,eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, sorbitol,manitol, dulcitol e iditol. Num exemplo específico desta formade realização, um agente de tonicidade não iónico adequado ésorbitol. 0 especialista reconhecerá que uma osmolalidadeapropriada pode ser obtida através da utilização de uma misturade diferentes agentes de tonicidade. Numa forma de realizaçãoparticular da invenção, o agente de tonicidade não iónico nascomposições da invenção incorpora sacarose e/ou sorbitol.

Numa forma de realização, uma concentração adequada depoliol dentro da composição imunogénica está entre cerca de 2,5e cerca de 15% (p/v), em particular, entre cerca de 2,5 e cercade 10% (p/v), por exemplo, entre cerca de 3 e cerca de 7% (p/v),tal como entre cerca de 4 e cerca de 6% (p/v) . Num exemploespecífico desta forma de realização, o poliol é sorbitol.

Noutra forma de realização, a composição imunogénicacompreende sacarose e sorbitol. Nessas circunstâncias acomposição imunogénica pode, adequadamente, conter entre cercade 2,5 e cerca de 15% (p/v) de sacarose e entre cerca de 2,5 ecerca de 15% (p/v) de sorbitol, em particular, entre cerca de2,5 e cerca de 10% (p/v) de sacarose e entre cerca de 2,5 e cerca de 10% (p/v) de sorbitol, por exemplo, entre cerca de 3 e cerca de 7% (p/v) de sacarose e entre cerca de 3 e cerca de 7% (p/v) de sorbitol, tais como entre cerca de 4 e cerca de 6%(p/v) de sacarose e entre cerca de 4 e cerca de 6% (p/v) desorbitol. O pH das composições imunogénicas deve ser adequado paraadministração parentérica. Adequadamente, o pH estará na gama de7,25 a 8,75, tal como 7,5 a 8,5, em particular, pH 7,75 a 8,25.Um pH de cerca de 8,0 é de particular interesse. O pH pode ser controlado pela utilização de tampões,incluindo, por exemplo, tampões Tris ou fosfato.

Numa forma de realização particular da invenção, acomposição imunogénica compreende um ou mais imunostimulantes.

Numa forma de realização, o imunostimulante pode ser umasaponina. Uma saponina particularmente adequada para utilizaçãona presente invenção é Quil A e os seus derivados. Quil A é umapreparação de saponina isolada da árvore Sul-Americana Quillajasaponaria Molina e foi primeiro descrita por Dalsgaardet al.r em 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamteVirusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p 243-254)como tendo atividade adjuvante. As frações purificadas de Quil Aforam isoladas por HPLC, as quais retêm a atividade adjuvantesem a toxicidade associada a Quil A (documento WO88/09336), porexemplo, QS7 e QS21 (também conhecidos como QA7 e QA21) . QS21 éuma saponina natural derivada da casca de Quillaja saponariaMolina, a qual induz células T citotóxicas CD8+ (CTL), célulasThl e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante. QS21 é umasaponina preferida no contexto da presente invenção.

Numa forma adequada da presente invenção, o adjuvante desaponina dentro da composição imunogénica é um derivado desaponaria Molina Quil A, em particular, uma fraçãoimunologicamente ativa de Quil A, tais como QS17 ou QS21,adequadamente, QS21.

Desejavelmente, a QS21 é proporcionada numa composiçãomenos reatogénica onde é terminada com um esterol exógeno, talcomo colesterol, por exemplo. Existem diversas formasparticulares de composições menos reatogénicas em que QS21 éterminada com colesterol. Numa forma de realização especifica,a saponina/esterol está na forma de uma estrutura de lipossoma(tal como descrito no documento W096/33739, Exemplo 1) . Nestaforma de realização, os lipossomas contêm, adequadamente, umlipido neutro, por exemplo, fosfatidilcolina, a qual é,adequadamente, não cristalina à temperatura ambiente, porexemplo, fosfatidilcolina de gema de ovo,dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) ou dilaurilfosfatidilcolina. Oslipossomas também podem conter um lipido carregado que aumenta aestabilidade da estrutura lipossoma-QS21 para lipossomascompostos por lipidos saturados. Nestes casos, a quantidade delipido carregado é, adequadamente, 1-20% p/p, tal como 5-10%. Arazão de esterol para fosfolipido é 1-50% (mol/mol),adequadamente, 20-25%.

Os esteróis adequados incluem β-sitosterol, estigmasterol,ergosterol, ergocalciferol e colesterol. Numa forma de realizaçãoparticular, a composição imunogénica compreende colesterol comoesterol. Estes esteróis são bem conhecidos na técnica, porexemplo, o colesterol é divulgado no índice Merck, 11a Ed., página 341, como um esterol de ocorrência natural encontrado emgordura animal.

Quando a fração de saponina ativa é QS21, a razão deQS21:esterol será tipicamente na ordem de 1:100 a 1:1 (p/p) ,adequadamente, entre 1:10 a 1:1 (p/p) e, especialmente, 1:5 a1:1 (p/p). Adequadamente está presente excesso de esterol, arazão de QS21:esterol sendo, pelo menos, 1:2 (p/p). Numa formade realização, a razão de QS21:esterol é 1:5 (p/p). O esterol é,adequadamente, colesterol.

Noutra forma de realização, a composição imunogénicacompreende um imunostimulante que é um agonista do recetor tipoToll 4 (TLR4) . "Agonista de TLR" significa um componente que écapaz de provocar uma resposta de sinalização através de uma viade sinalização de TLR, como um ligando direto ou indiretamenteatravés da produção de ligando endógeno ou exógeno (Sabroe et al.J Immunol 2003 pl630-5). Um agonista de TLR4 é capaz de provocaruma resposta de sinalização através de uma via de sinalização deTLR-4. Um exemplo adequado de um agonista TLR4 é umlipopolissacárido, adequadamente, um derivado não tóxico delipido A, particularmente, monofosforil lipido A ou, maisparticularmente, monofosforil lipido A 3-de-O-acilado (3D-MPL). O 3D-MPL é vendido sob o nome MPL pela GlaxoSmithKlineBiologicals N.A. e é referido em todo o documento como MPL ou3D-MPL, ver, por exemplo, Patente US N2 4436727; 4877611; 4866034e 4912094. O 3D-MPL promove principalmente respostas de células TCD4+ com um fenótipo IFN-gama (Thl). O 3D-MPL pode ser produzidode acordo com os métodos divulgados no documento GB2220211A.Quimicamente é uma mistura de monofosforil lipido A 3-de-O-acilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Nas composições da presente invenção pode ser utilizado 3D-MPL de partícula pequenapara preparar a composição imunogénica. 0 3D-MPL de partículapequena tem um tamanho de partícula de tal modo que este podeser filtrado de modo estéril através de um filtro de 0,22 um.Essas preparações são descritas no documento W094/21292. De ummodo adequado, é utilizado 3D-MPL em pó para preparar ascomposições imunogénicas da presente invenção.

Outros agonistas de TLR4 que podem ser utilizados sãofosfatos de alquilglucosaminida (AGP) tal como aqueles divulgadosno documento WO98/50399 ou Patente US N2 6303347 (são tambémdivulgados processos para preparação de AGP), adequadamente,RC527 ou RC529 ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGP, comodivulgado na Patente US N2 6764840. Alguns AGP são agonistas deTLR4 e alguns são antagonistas de TLR4.

Outros agonistas de TLR4 adequados são como descritos nodocumento W02003/011223 e no documento W02003/099195, tais comoo composto I, composto II e composto III divulgados nas páginas4-5 do documento W02003/011223 ou nas páginas 3-4 do documentoW02003/099195 e, em particular, aqueles compostos divulgados nodocumento W02003/011223, como ER803022, ER803058, ER803732,ER804053, ER804057m ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 eER804764. Por exemplo, um agonista de TLR-4 adequado é ER804057.

Numa forma de realização particular, a composiçãoimunogénica compreende uma saponina e um agonista de TLR4. Numexemplo específico, a composição imunogénica compreende QS21 e3D-MPL.

Um agonista de TLR-4, tal como um lipopolissacárido, talcomo 3D-MPL, pode ser utilizado em quantidades entre 1 e 100 ug por dose humana da composição imunogénica. 0 3D-MPL pode serutilizado a um nível de cerca de 50 ug, por exemplo, entre 40 a60 ug, adequadamente, entre 45 a 55 ug ou entre 49 e 51 ug ou50 ug. Numa forma de realização adicional, a dose humana dacomposição imunogénica compreende 3D-MPL a um nível de cerca de25 ug, por exemplo, entre 20 a 30 ug, adequado, entre 21 a 29 ugou entre 22 a 28 ug ou entre 23 e 27 ug ou entre 24 e 26 ug, ou25 ug.

Uma saponina, tal como QS21, pode ser utilizada emquantidades entre 1 e 100 ug por dose humana da composiçãoimunogénica. A QS21 pode ser utilizada a um nível de cerca de50 ug, por exemplo entre 40 a 60 ug, adequadamente, entre 45 a55 ug ou entre 49 e 51 ug ou 50 ug. Numa forma de realizaçãoadicional, a dose humana da composição imunogénica compreendeQS21 a um nível de cerca de 25 ug, por exemplo, entre 20 a30 ug, adequado entre 21 a 29 ug ou entre 22 a 28 ug ou entre 23e 27 ug ou entre 24 e 26 ug, ou 25 ug.

Quando estão presentes ambos os agonistas de TLR4 e saponinana composição imunogénica, então a razão de peso do agonista deTLR4 para saponina está, adequadamente, entre 1:5 a 5:1,adequadamente, entre 1:2 a 2:1, tal como cerca de 1:1. Porexemplo, quando o 3D-MPL está presente a uma quantidade de 50 ugou 25 ug, então, adequadamente, a QS21 também pode estarpresente numa quantidade de 50 ug ou 25 ug, respetivamente, pordose humana da composição imunogénica. Determinadas composiçõesimunogénicas da presente invenção compreendem QS21 e 3D-MPL, auma quantidade de entre 1 e 100 ug de cada por dose humana, talcomo a uma quantidade de entre 10 e 75 ug de cada por dosehumana. As composições imunogénicas da presente invenção podem,adequadamente, compreender QS21 e 3D-MPL, a uma quantidade entre 15 e 35 ug de cada por dose humana, tal como a uma quantidade deentre 20 e 30 ug de cada por dose humana.

Numa forma de realização, o imunostimulante é um agonistade TLR9, por exemplo, como definido no documento WO2008/142133.Num exemplo especifico, o referido agonista de TLR9 é umoligonucleótido imunoestimulador, em particular, um oligonucleótido contendo um motivo CpG não metilado. Essesoligonucleótidos são bem conhecidos e são descritos, porexemplo, nos documentos WO96/02555, W099/33488 e US 5865462. Os agonistas de TLR9 adequados para utilização nas composiçõesimunogénicas aqui descritas são CpG contendo oligonucleótidos,opcionalmente contendo dois ou mais motivos CpG dinucleotidicosseparados por, pelo menos, três, adequadamente, pelo menos, seisou mais nucleótidos. Um motivo CpG é um nucleótido citosinaseguido por um nucleótido guanina.

Numa forma de realização, a ligação internucleótido nooligonucleótido é fosforoditioato ou, eventualmente, uma ligaçãofosforotioato, embora ligações fosfodiéster e outras ligaçõesinternucleótidicas também pudessem ser utilizadas, incluindooligonucleótidos com ligações internucleótidicas mistas. Métodospara produzir oligonucleótidos fosforotioato ou fosforoditioatosão descritos nos documentos US 5666153, US 5278302 e WO95/26204.Estão contemplados oligonucleótidos compreendendo diferentesligações internucleotidicas, e. g., fosfodiésteres fosforotioato, mistas. Podem ser utilizados outras ligaçõesinternucleotidicas que estabilizem o oligonucleótido.

Os exemplos de oligonucleótidos CpG adequados para inclusãonas composições imunogénicas aqui descritas têm as seguintes sequências. Numa forma de realização, estas sequências contêmligações internucleotidicas modificadas por fosforotioato.

OLIGO 1 (SEQ ID N2 : 9): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID N2: 10): TCT CCC AGO GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID N2 : 11): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC

ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID N2 : 12): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID N2 : 13): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Os oligonucleótidos CpG alternativos podem compreender assequências acima na medida em que estas têm deleções ou adiçõesa estas, inconsequentes.

Numa forma de realização, o imunostimulante é um tocol. Ostocóis são bem conhecidos na técnica e são descritos no documentoEP 0382271. Numa forma de realização particular, o tocol éalfa-tocoferol ou um seu derivado, tal como succinato dealfa-tocoferol (também conhecido como succinato de vitamina E).

As composições imunogénicas de acordo com a invenção podemser utilizadas na medicina, em particular, para a profilaxia,tratamento ou melhoria da infeção por micobactérias, tal comoinfeção por Mycobacterium tuberculosis. As composiçõesimunogénicas são geralmente proporcionadas para administração ahumanos, apesar destas também poderem ser de valor na medicinaveterinária, tal como para administração a bovinos. É proporcionada a utilização de uma composição imunogénicade acordo com a invenção, no fabrico de um medicamento, emparticular, um medicamento para a profilaxia, tratamento oumelhoria de infeção por micobactérias, tal como infeção porMycobacterium tuberculosis. A composição imunogénica pode ser proporcionada com oobjetivo de: - tratar tuberculose ativa; profilaxia de tuberculose ativa, tal como por administração a um indivíduo que não está infetado ou,em alternativa, um indivíduo que tem infeção latente; - tratar tuberculose latente; profilaxia de tuberculose latente, tal como por administração a um indivíduo que não está infetado; ou - prevenir ou retardar a reativação da tuberculose,especialmente o retardamento da reativação da TB, porexemplo, durante um período de meses, anos ou mesmoindefinidamente. A expressão "infeção ativa" refere-se a uma infeção, e. g.,infeção por M. tuberculosis, com sintomas e/ou lesões de doençamanifestados, adequadamente, com sintomas de doençamanifestados.

As expressões "infeção inativa", "infeção dormente" ou"infeção latente" referem-se a uma infeção, e. g., infeção porM. tuberculosis, sem sintomas e/ou lesões de doença manifestados,adequadamente, sem sintomas de doença manifestados. Um indivíduocom infeção latente será, adequadamente, um que acusa positivopara infeção, e. g., por ensaios baseados em PPD ou células T, mas os quais não demonstraram os sintomas e/ou lesões de doença,os quais estão associados a uma infeção ativa. A expressão "tuberculose primária" refere-se a doençaclinica, e. g., manifestação de sintomas de doença, diretamenteapós infeção, e. g. , infeção por M. tuberculosis. Ver, Harrison'sPrinciples of Intern Medicine, Capitulo 150, p. 953-966 (16a ed.,Braunwald, et al., eds., 2005).

As expressões "tuberculose secundária" ou "tuberculosepós-primária" referem-se à reativação de uma infeção dormente,inativa ou latente, e. g. , infeção por M. tuberculosis. Ver,Harrison's Principles of Intern Medicine, Capitulo 150, p.953-966 (16a ed., Braunwald, et al., eds., 2005). A expressão "reativação da tuberculose" refere-se àmanifestação posterior de sintomas de doença num indivíduo queacusa positivo para infeção (e. g., num teste cutâneo detuberculina, adequadamente, num ensaio baseado em células Tin vitro) mas não tem sintomas de doença aparentes.Adequadamente, o indivíduo não terá sido novamente exposto ainfeção. O teste de diagnóstico positivo indica que o indivíduoestá infetado, contudo, o indivíduo pode ou não ter manifestadoanteriormente sintomas ativos de doença que foram tratados osuficiente para conduzir a tuberculose a um estado inativo oulatente.

Adequadamente, uma composição imunogénica é administrada aum indivíduo que não está infetado ou que tem uma infeçãolatente por micobactérias, tal como infeção por Mycobacteriumtuberculosis . 0 volume da composição imunogénica administrada podevariar dependendo de vários outros fatores, tal como a via dedistribuição específica, e. g. , intramuscular, subcutânea ouintradérmica. Tipicamente, o volume administrado numa únicainjeção (a dose unitária) para um humano será na gama de 50 uL a1 mL, tais como 100 uL a 750 uL, especialmente, 400 a 600 uL,por exemplo, cerca de 500 uL. A quantidade de antigénio relacionado com Rvll96 contidonuma dose única é dependente das necessidades clínicas, mas umadose humana única será, tipicamente, na gama de 1 a 100 ug, talcomo 5 a 50 ug, por exemplo, 5 a 20 ug. Uma dose única humanapode conter cerca de 10 ug de antigénio relacionado com Rvll96.

Adequadamente, as composições da invenção serão estáveis,nas quais se entende que, durante o armazenamento a 25 °C,durante um período de 24 horas, a antigenicidade como medidapelas técnicas aqui descritas permanece, pelo menos, 80% daantigenicidade antes do armazenamento. Desejavelmente, aantigenicidade permanecerá, pelo menos, 85%, tal como, pelomenos, 90% e, em particular, pelo menos, 95% após o armazenamentoa 25 °C durante um período de 24 horas. Para composições departicular interesse, pelo menos, 80% da antigenicidade dacomposição, tal como, pelo menos, 85%, pelo menos, 90% e,especialmente, pelo menos, 95% permanecem após o armazenamento a30 °C durante um período de 24 horas. A presente invenção será agora descrita adicionalmente pormeio dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de composição de adjuvante ASA(sorbitol)

Foi preparada uma composição de adjuvante, a qualcompreendem monofosforil lipido A 3-de-0-acilado e QS21 numaformulação lipossomal utilizando sorbitol como um agente detonicidade. Esta foi preparada como se segue: A. Método de preparação de lipossomas:

Uma mistura de lipido (DOPC), colesterol e monofosforillipido A 3-de-0-acilado em solvente orgânico foi seca sob vácuo.Uma solução aquosa (solução salina tamponada com fosfato [100 mMde NaCl, 50 mM de Fosfato, pH 6,1]) foi depois adicionada orecipiente agitado até todo o lipido estar em suspensão. Estasuspensão foi depois pré-homogeneizada com misturador de elevadocisalhamento e, depois, homogeneizada a elevada pressão até otamanho do lipossoma ser reduzido para cerca de 90 nm ± 10 nm,medido por DLS. Os lipossomas foram, depois, filtrados de modoestéril. B. Formulação ASA:

Passo 1: Diluição de lipossomas concentradas 100 mM de tampão fosfato Na2/K, pH 6,1, quando diluído10 vezes, foi adicionado a água para injeção, para atingir umaconcentração de tampão fosfato de 10 mM na formulação final. Foi depois, adicionada uma solução de sorbitol a 30% (p/v) em água para injeção (WFI) para atingir uma concentração de 4,7% naformulação final - esta foi agitada durante 15 a 45 minutos, àtemperatura ambiente.

Os lipossomas concentrados (constituídos por DOPC,colesterol e 3D-MPL a 40 mg/mL, 10 mg/mL e 2 mg/mL respetivamente) foram depois adicionados à mistura para atingiruma concentração de 100 ug/mL de 3D-MPL na formulação final. A mistura foi subsequentemente agitada durante 15 a45 minutos, à temperatura ambiente.

Passo 2: Adição de QS21

Utilizando uma bomba peristáltica, foi adicionado stockagregado de QS21 aos lipossomas diluídos sob agitação magnética,para atingir uma concentração de 100 ug/mL na formulação final.A mistura foi agitada durante 15 a 45 minutos. A formulação ASA (sorbitol) final continha 2 mg de DOPC,500 ug de colesterol, 100 ug de 3D-MPL/mL e 100 ug de QS21/mL,sorbitol a 4,7% e 5 mM de cloreto de sódio e 10 mM de fosfato.

Passo 3: O pH foi verificado para ser 6,1±0,1

Passo 4: Filtração estéril A filtração estéril foi realizada utilizando um filtro depoliétersulfona (PES) da PALL Corporation.

Passo 5; Armazenamento a +2 °C a +8 °C. A composição de adjuvante obtida, a qual compreendeu MPL3 de-O-acilado e QS21 numa formulação lipossomal e contendosorbitol como um agente de tonicidade (designado ASA (sorbitol)),foi depois armazenada a 4 °C.

Exemplo 2: Preparação de composição de adjuvante ASA (150 mM de NaCl)

Foi preparada uma composição de adjuvante, a qualcompreendeu monofosforil lipido A 3-de-0-acilado e QS21 numaformulação lipossomal utilizando cloreto de sódio como um agentede tonicidade. A. Método de preparação de lipossomas:

Uma mistura de lipido (DOPC), colesterol e monofosforillipido A 3-de-0-acilado (3D-MPL) em solvente orgânico foi secasob vácuo. Foi depois adicionada solução salina tamponada comfosfato (100 mM de NaCl, 50 mM de fosfato pH 6,1) e o recipienteagitado até todo o lipido estar em suspensão. Esta suspensão foidepois pré-homogeneizada com misturador de elevado cisalhamentoe, depois, homogeneizada a elevada pressão até o tamanho doslipossomas ser reduzido para cerca de 90 nm ± 10 nm, medido porDLS. Os lipossomas foram, depois, filtrados de modo estéril numamembrana PES de 0,22 um. B. Formulação ASA:

Passo 1: Diluição de lipossomas concentrados 100 mM de tampão fosfato Na2/K pH 6,1, quando diluído10 vezes, e NaCl 1,5 M, foram adicionados a água para injeção,para atingir respetivamente concentrações 10 mM de fosfato e150 mM deNaCl na formulação final. Esta mistura foi agitadadurante 5 minutos, à temperatura ambiente. Os lipossomasconcentrados (constituídos por DOPC, colesterol e 3D-MPL a40 mg/mL, 10 mg/mL e 2 mg/mL, respetivamente) foram depoisadicionados à mistura para atingir uma concentração de 100 ug/mLde 3D-MPL na formulação final. A mistura foi subsequentementeagitada durante 5 a 15 minutos à temperatura ambiente.

Passo 2: Adição de QS21

Foi adicionado stock agregado de QS21 aos lipossomasdiluídos, sob agitação magnética, para atingir uma concentraçãode 100 ug/mL na formulação final. A mistura foi agitada àtemperatura ambiente.

Passo 3: O pH foi verificado para ser 6,1±0,1

Passo 4: Filtração estéril A filtração estéril foi realizada utilizando um filtro depoliétersulfona (PES) de PALL Corporation.

Passo 5; Armazenamento a +2 °C a +8 °C A composição final de ASA (150 mM de NaCl) foi 2 mg deDOPC, 500 ug de colesterol, 100 ug de MPL 3-de-O-acilado, 100 ugde QS21 por 1 mL, com 10 mM de fosfato e 150 mM de NaCl.

Exemplo 3: Atividade Lítica de QS21 A QS21 é conhecida por lisar glóbulos vermelhos (RBC). Acomposição de adjuvante ASA (sorbitol) preparada como noExemplo 1 foi testada para garantir que a atividade litica deQS21 foi parada do mesmo modo como observado com a composiçãode adjuvante equivalente compreendendo 150 mM de NaCl (ASA(150 mM de NaCl)). A atividade litica de QS21 foi medida por ensaio de hemóliseutilizando glóbulos vermelhos de galinha (RBC). Os RBC foramcentrifugados a 550 g, a 4 °C. O sobrenadante foi descartado. Osedimento foi ressuspenso cuidadosamente em tampão PBS paraatingir o volume inicial e a mesma operação foi repetida até osobrenadante deixar de ser vermelho (geralmente 3 vezes). Osedimento foi armazenado a 4 °C durante 3 a 4 dias no máximo, senão utilizado diretamente (e lavado novamente no dia em que éutilizado) ou foi diluído cerca de 10 vezes em tampão, seutilizado no mesmo dia.

Uma curva de gama de dose de QS21 foi preparada em tampãoASA (em sal ou em tampão sorbitol após a amostra de ASA sertestada) extemporaneamente e foram preparadas as amostras deadjuvantes (contendo um equivalente de 50 ug ou 90 ug de QS21significando o equivalente de 500 uL ou 900 uL de ASA). O volume final foi ajustado para 900 uL nos padrões e amostras com tampãoadequado (contendo ou não sorbitol como uma função do tampão daamostra testada). Devido à sua opalescência, a ASA interfere coma densidade ótica (OD). Os "brancos" de ASA foram assim preparados e a sua OD foi subtraída da OD de amostras testadas deASA. Esses brancos corresponderam ao mesmo volume de ASA que ovolume testado em amostras, mas ajustado para 1 mL com tampão.Não foram adicionadas RBC a estes brancos. Os padrões e amostrasforam depois incubados com RBC (100 uL de RBC diluídos,adicionados a 900 uL de padrões e amostras) durante 30 minutos, àtemperatura ambiente (t.a.). As amostras foram depoiscentrifugadas 5 minutos, a 900 g. A densidade ótica a 540 nm foimedida após a centrifugação. A determinação da atividade lítica foi realizada por um teste de limite. 1. O limite de deteção (LOD) foi definido como a concentração mais baixa de QS21 que leva a uma OD:

Mais elevada do que o nível de base (OD>0,1)

Cerca de três vezes mais elevada do que o tampão da OD(a QS21 a "0 ug")

Na parte ascendente da curvaDeterminada para cada teste. 2. A atividade lítica de QS21 foi considerada positivanas amostras de adjuvante se a OD para a amostra de adjuvantefoi maior do que a ODlod .

Exemplo da curva de QS21

*equivalente de 50 ug de QS21 testado. 150 mM de tampãocloreto de sódio.

Os dados acima são mostrados graficamente na Figura 1. O Limite de Deteção neste ensaio é a 0,9 ug de QS21 e OD de 0,12 . A terminação da QS21 numa composição de adjuvantecompreendendo 150 mM de cloreto de sódio foi estimada ser mais que 98,2% para o equivalente de 50 ug de QS21 testado. No caso deum equivalente de 90 ug testado, a conclusão é mais que 99%. A terminação da QS21 foi depois comparada com uma composiçãode adjuvante equivalente compreendendo sorbitol e apenas cloretode sódio 5 mM. Os dados foram produzidos após armazenamento daASA a 4 °C ou após estabilidade acelerada (7 dias a 37 °C). Paraa ASA em sorbitol, a curva padrão de QS21 foi realizada numtampão contendo sorbitol.

Equivalente de 50 ug de QS21 testado exceto * equivalentede 90 ug de QS21 testado.

Foi concluído que a QS21 foi terminada adequadamente numtampão cloreto de sódio inferior.

Exemplo 4: Congéneres de MPL.

Quimicamente, 3D-MPL é uma mistura de monofosforil lípido A3-de-0-acilado com principalmente 4, 5 ou 6 cadeias aciladas.Cada molécula de 3D-MPL separada é denominada um congénere. Éimportante que a composição de congénere permaneça constante, semdesvio entre a proporção de congéneres. É também importante quequalquer tampão utilizado permita que a composição de congénereseja a mesma que nos lipossomas concentrados utilizados parapreparar a composição de adjuvante.

Como mostrado na Figura 2, a composição congénere foiexaminada em lipossomas concentrados de 3D-MPL (Lipossomas conc.LIP07-217, primeira coluna da Figura 2), numa composição deadjuvante compreendendo lipossomas de 3D-MPL e QS21 num tampão150 mM de NaCl (150 mM de Adjuvante NaCl, ou ASA (150 mM deNaCl), segunda coluna) e numa composição de adjuvantecompreendendo lipossomas de 3D-MPL e QS21 num sorbitol e tampão5 mM de NaCl (Adjuvante Sorbitol, ou ASA (sorbitol) ,colunas 3-7) . A composição de congénere foi também examinada em dois lotesde adjuvante ASA (sorbitol) no dia 0 e 7 dias após a preparaçãoe manutenção, a 37 °C, para garantir que não houve evolução aolongo do tempo (ver as quatro colunas finais da Figura 2). A distribuição relativa de congéneres tetra-, penta- ehexa-acilados de MPL em amostras de lipossomas concentrados ouASA (sorbitol) foi determinada por deteção IP-HPLC-Fluo (ARD).Os padrões e as amostras foram derivatizados comdansil-hidrazina, a qual introduz um cromofóro Fluo-ativo naestrutura principal dissacaridica. As amostras derivatizadas foram analisadas numa coluna de fase inversa C18 utilizandohidróxido de tetrabutilamónio (TBAOH) como um reagente de pariónico. Os congéneres contendo os mesmos números de grupos deacilo gordos foram eluídos em grupos distintos (tetra-acilo,penta-acilo e hexa-acilo). A distribuição de congéneres édeduzida comparando a área do pico de cada grupo com a área dopico total de todos os congéneres de MPL. A Figura 2 mostra a percentagem de cada congénere. Não foiverificada diferença significativa na composição de congénereentre tampões de adjuvantes, e a composição de congénere foiconsistente ao longo do tempo no tampão sorbitol.

Exemplo 5: Preparação de composição de adjuvante de ASA (sorbitol - 2)

Foi preparada uma composição de adjuvante, a qual compreendeu monofosforil lípido A 3-de-0-acilado e QS21, a umnível reduzido relativo ao Exemplo 1, numa formulação lipossomalutilizando sorbitol como um agente de tonicidade. Esta foipreparada como se segue: 0 adjuvante foi preparado por diluição 1:1 de ASA(sorbitol), preparado de acordo com o Exemplo 1, com uma soluçãocontendo 10 mM de fosfato, 5 mM de NaCl, sorbitol a 4,7%, apH 6,1. A formulação final de ASA (sorbitol - 2) continha 1 mg deDOPC, 250 ug de colesterol, 50 ug de 3D-MPL/mL e 50 ug deQS21/mL, sorbitol a 4,7%, 5 mM de cloreto de sódio e 10 mM de fosfato.

Exemplo 6: Preparação de composição de adjuvante de ASA (sorbitol - 3)

Foi preparada uma composição de adjuvante, a qual compreendeu monofosforil lipido A 3-de-0-acilado e QS21, a umnível reduzido relativo ao Exemplo 1, numa formulação lipossomalutilizando sorbitol como um agente de tonicidade. Esta foipreparada como se segue: A. Método de preparação de lipossomas:

Uma mistura de lipido (DOPC), colesterol e monofosforillipido A 3-de-0-acilado em solvente orgânico foi seca sob vácuo.Uma solução aquosa (solução salina tamponada com fosfato [100 mMde NaCl, 50 mM de Fosfato pH 6,1]) foi depois adicionada e orecipiente agitado até todo o lipido estar em suspensão. Estasuspensão foi depois pré-homogeneizada com misturador de elevadocisalhamento e, depois, homogeneizada a elevada pressão até otamanho dos lipossomas ser reduzido para cerca de 90 nm ± 10 nm,medido por DLS. Os lipossomas foram, depois, filtrados de modoestéril. B. Formulação de ASA:

Passo 1: Diluição de lipossomas concentrados 100 mM de tampão fosfato Na2/K pH 6,1, quando diluído10 vezes, foi adicionado a água para injeção para atingir uma concentração de 10 mM de tampão fosfato na formulação final. Umasolução de sorbitol a 30% (p/v) em água para injeção (WFI) foi depois adicionada para atingir uma concentração de 4,7% naformulação final - esta foi agitada durante 15 a 45 minutos, àtemperatura ambiente.

Os lipossomas concentrados (constituídos por DOPC,colesterol e 3D-MPL, a 40 mg/mL, 10 mg/mL e 2 mg/mL respetivamente) foram depois adicionados à mistura para atingiruma concentração de 50 ug/mL de 3D-MPL na formulação final. A mistura foi, subsequentemente, agitada durante 15 a45 minutos, à temperatura ambiente.

Passo 2: Adição de QS21

Utilizando uma bomba peristáltica, foi adicionado stockagregado de QS21 aos lipossomas diluídos, sob agitação magnética,para atingir uma concentração de 50 ug/mL na formulação final. Amistura foi agitada durante 15 minutos. A formulação de ASA final continha 1 mg de DOPC, 250 ug decolesterol, 50 ug de 3D-MPL/mL e 50 ug QS21/mL, sorbitol a 4,7%e 2,5 mM de cloreto de sódio, 10 mM de fosfato.

Passo 3; O pH foi verificado para ser 6,1±0,1

Passo 4: Filtração estéril A filtração estéril foi realizada utilizando um filtro depoliétersulfona (PES) da PALL Corporation.

Passo 5: Armazenamento a +2 °C a +8 °C. A composição de adjuvante obtida, a qual compreendeu MPL3-de-0-acilado e QS21 numa formulação lipossomal e contendosorbitol como um agente de tonicidade (designado ASA(sorbitol-3)), foi depois armazenada a 4 °C.

Exemplo 7: Preparação de composição de adjuvante de ASA (150 mM de NaCl - 2)

Foi preparada uma composição de adjuvante, a qual compreendeu monofosforil lipido A 3-de-0-acilado e QS21, a umnível reduzido relativo ao Exemplo 2, numa formulação lipossomalutilizando sorbitol como um agente de tonicidade. Esta foipreparada como se segue: A. Método de preparação de lipossomas:

Uma mistura de lipido (DOPC), colesterol e monofosforillipido A 3-de-0-acilado (3D-MPL) em solvente orgânico foi secosob vácuo. Foi depois adicionada solução salina tamponada comfosfato (100 mM de NaCl, 50 mM de Fosfato pH 6,1) e o recipienteagitado até todo o lipido estar em suspensão. Esta suspensão foidepois pré-homogeneizada com misturador de elevado cisalhamentoe, depois homogeneizada a pressão elevada até o tamanho doslipossomas ser reduzido para cerca de 90 nm ± 10 nm, medido porDLS. Os lipossomas foram, depois, filtrados de modo estéril numamembrana PES de 0,22 um. B. Formulação de ASA:

Passo 1: Diluição de lipossomas concentrados 100 mM de tampão fosfato Na2/K pH 6,45, quando diluído10 vezes, e NaCl 1,5 M, foram adicionados a água para injeção,para atingir respetivamente concentrações de 10 mM de fosfato e150 mM de NaCl na formulação final. Esta mistura foi agitadadurante 5 minutos, à temperatura ambiente. Os lipossomasconcentrados (constituídos por DOPC, colesterol e 3D-MPL a40 mg/mL, 10 mg/mL e 2 mg/mL respetivamente) foram depoisadicionados à mistura para atingir uma concentração de 50 ug/mLde 3D-MPL na formulação final. A mistura foi subsequentementeagitada, durante 5 a 15 minutos, à temperatura ambiente.

Passo 2: Adição de QS21

Foi adicionado stock agregado de QS21 aos lipossomasdiluídos, sob agitação magnética, para atingir uma concentraçãode 50 ug/mL na formulação final. A mistura foi agitada, àtemperatura ambiente.

Passo 3: O pH foi verificado para ser 6,1±0,1

Passo 4: Filtração estéril A filtração estéril foi realizada utilizando um filtro depoliétersulfona (PES) de PALL Corporation.

Passo 5; Armazenamento a +2 °C a +8 °C A composição final de ASA (150 mM de NaCl - 2) foi 1 mg deDOPC, 250 ug de colesterol, 50 ug de MPL 3-de-O-acilado, 50 ugde QS21 por 1 mL, 10 mM de fosfato e 150 mM de NaCl.

Exemplo 8: Investigação de "precipitação por sais" em composições compreendendo Rvll96 com diferentes concentrações desal a pH 6,1, 7,5 e 8,5.

Foi investigado o impacto da concentração de cloreto desódio e pH na estabilidade do antigénio Rvll96, como avaliadopor tamanho. Método A proteína Rvll96 (SEQ ID N2: 1) foi obtida de CorixaCorporation e foi diluída para uma concentração de 100 ug/mL emtrês tampões diferentes (10 mM de tampão fosfato a pH 6,1, 20 mMde tampão Tris a pH 7,5 e 20 mM de tampão Tris a pH 8,5) contendoconcentrações de cloreto de sódio finais de 0, 150 e 450 mM.

As amostras foram armazenadas durante 24 horas, a 4 °C ou25 °C, antes da análise.

Foi realizada nefelometria utilizando um Nepheloskan®Ascent, disponível de Thermo Fischer Scientific. A análise foirealizada em microplacas Costar® transparentes UV disponíveis deCorning Inc (EUA). A DLS foi realizada utilizando um Leitor de Placas Dynaproda Wyatt Instruments. 0 instrumento foi operado utilizando umcomprimento de onda laser de 830 nm e energia de 50 mW. Adispersão da luz foi detetada a 150°, a uma temperatura de 22 °C.O diâmetro hidrodinâmico médio e índice de polidispersidade (pi)são calculados pelo software do instrumento.

Resultados

As verificações desta experiência são apresentadas nasFiguras 3 e 4. A nefelometria demonstra uma tendência geral de clarezaeliminada com a concentração de sal crescente, indicando queRvll96 é sensível à concentração de sal.

Para a maioria das amostras de DLS, a instrumentação foiincapaz de determinar um tamanho de partícula específico(mostrado como NV na Figura 4). Não obstante, onde foram obtidosdados comparáveis (i. e., pH 8,5 com 0 ou 150 nM de NaCl) , éclaro que a concentração de cloreto de sódio tem impacto notamanho de partícula medido em composições imunogénicas deRvl19 6.

Exemplo 8: Preparação de Antigénios Proteicos M72 com dois resíduos de His N-terminais (SEQ ID N2: 7)

Construção do Vetor de Expressão de M72

Um plasmídeo que codifica para a sequência de aminoácidosde Mtb72f com uma cauda de 6-His adicional no N-terminal foiproduzido pela ligação sequencial em tandem das grelhas deleitura aberta (ORF) que codificam o fragmento C-terminal deMtb32a para a ORF de comprimento total de Mtb39a, seguido noC-terminal com a parte N-terminal de Mtb32a. Isto foi realizadoutilizando oligonucleótidos específicos de sequência contendosítios de restrição únicos (EcoRI e EcoRV) e desprovidos doscodões de terminação nas extremidades C-terminais (no caso dofragmento C-terminal de Mtb32a e Mtb39a) para reação de cadeiade polimerase (PCR) de ADN genómico a partir da estirpe H37Rv deM. tuberculosis. Utilizando este vetor como molde, uma mutaçãode Ser706 para Ala foi realizada por mutagénese dirigida a sítio.A orientação apropriada de inserções, bem como a mutação deSer706Ala foram verificadas por sequenciação de ADN.

De modo a obter o vetor que codifica para M72, o qual temapenas 2 resíduos de His no N-terminal, foram eliminadas quatroHis, utilizando um sistema de mutagénese dirigida a sítiocomercial. Após verificação de sequência, a sequência quecodifica M72 foi excisada do plasmídeo por reação enzimática,purificada em gel e ligada num vetor pET. 0 plasmídeorecombinante foi, depois, verificado para a sequência. Esteplasmídeo codifica para M72 sob o controlo de um promotor T7. aexpressão da ARN polimerase T7 é conduzida a partir de umintegrante genómico no hospedeiro de expressão e é induzida utilizando um sistema baseado em operão lac (lacl) e um sinal deindução química IPTG. 0 plasmídeo de expressão é proporcionadocom resistência a canamicina. 0 plasmídeo que codifica para a proteína de fusão M72 sob ocontrolo de um promotor T7 foi transformado na estirpe HMS174(DE3) de E. coli, utilizando um método de eletroporação. Asequência de codificação da inserção de M72 e as regiõesflanqueadoras foram sequenciadas em ambas as cadeias e foiverificado que eram idênticas à sequência determinada a partirda construção plasmídica original.

Fermentação

Um frasquinho de sementeira de trabalho sedimentada foidescongelado à temperatura ambiente. Foi preparada uma pré-diluição, misturando a sementeira de trabalho com 4,9 mL demeio de pré-cultura. Foi utilizado 1 mL da pré-diluição parainocular o líquido pré-cultura, o qual consiste de 400 mL demeio de pré-cultura suplementado com 50 mg/L de sulfato decanamicina e 10 g/L de glicose.

Composição do meio de pré-cultura

(Continuação)

(1) pH ajustado para 1,50 com solução de HC1 (37%); asolução é filtrada através de 0,22 um (2) A solução é filtrada através de 0,22 um A pré-cultura foi incubada num balão de agitação de 2 litrosa 30 °C, sob agitação (200 RPM) até a OD6so nm ter atingido umvalor entre 2 e 4 (tempo de incubação aproximado: 16 horas).Neste estádio, um fermentador de 72 litros (volume total)contendo 45 litros de meio de cultura suplementado com 34 mg/Lde sulfato de canamicina foi inoculado com 52 mL de liquido depré-cultura.

Composição do meio de cultura

(1) A solução é filtrada através de 0,22 um (2) pH ajustado para 11,0 com solução de NaOH (25%); asolução é filtrada através de 0,22 um

Durante a fase de crescimento, o pH foi mantido a 6,8 ± 0,2por adição periódica de NH4OH a 25% (v/v) e H3P04 a 25% (v/v) .

Após a incubação durante 16 horas, a 30 °C, foi iniciada aalimentação descontinua com meio de alimentação.

Composição do meio de alimentação

(1) A solução é filtrada através de 0,22 um (2) pH ajustado para 11,0 com solução de NaOH (25%); asolução é filtrada através de 0,22 um

A temperatura foi mantida a 30 °C durante mais 2 horas,depois, aumentada para 37 °C, até ao final da fermentação. Ofluxo de ar foi definido constantemente a 75 L/min e o oxigéniodissolvido mantido a 17% de saturação por controlo deretroalimentação da agitação e pressão. Pequenas quantidades desolução antiespuma foram adicionadas automaticamente sob demanda.Quando a OD6so nm atingiu um valor de 50 (±5) , foi adicionado 1 mM de Isopropilbeta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), de modo a induzira expressão de M72. A fermentação terminou após 5 horas daindução do ponto temporal ter começado. A cultura celular foiarrefecida para 15 °C sob agitação ligeira e centrifugada (a4 °C) , para obter sedimentos celulares, os quais foram, depois,armazenados a -20 °C em aliquotas.

Isolamento de Corpos de Inclusão

Os sedimentos celulares recolhidos da colheita foramdescongelados à temperatura ambiente e rompidos em tampão delise (10 mM de Tris, 50 mM de NaCl, pH 8,0) com um homogeneizadorde elevada pressão. Depois, o lisado celular foi centrifugado eos sedimentos celulares resultantes (ou corpos inclusão, IB)foram lavados com tampão de lavagem contendo ureia, Tris e NaCl.Os IB foram solubilizados com tampão de solubilização contendo8 M de ureia e filtrados através de uma membrana de 0,2 um. Estasolução filtrada foi purificada primeiro por cromatografia depermuta iónica utilizando uma coluna Q Sepharose Fast Flow(QSFF). A eluição de M72 ocorre com uma solução ureia 6 M, 20 mMde propano bis-Tris, 90 mM de NaCl, pH 7,0. A M72 recolhida foi ainda purificada por cromatografia dehidroxiapatita (HA) , a partir da qual esta é eluida com uma solução de ureia 6 M, 20 mM de propano bis-Tris, 250 mM de NaCl,pH 7,0. A fração recolhida foi concentrada com uma cassetemembranar de 30 kDa e diafiltrada contra 20 mM de Tris, pH 7,5.A M72 foi depois esterilizada através de um filtro de 0,22 um. 0agregado purificado foi depois colocado em alíquotas e armazenadoa -70 °C.

Exemplo 10: Investigação de "precipitação por sais" em composições compreendendo M72 com diferentes concentrações desal, a pH 6,1, 7,5 e 8,5.

Foi investigado o impacto da concentração de cloreto desódio e pH na estabilidade do antigénio M72, como avaliado portamanho e antigenicidade. Método O antigénio agregado purificado (M72 com dois resíduos deHis N-terminais, SEQ ID N2: 7, como preparado no Exemplo 9) foi diluído para uma concentração de 100 ug/mL em três tampõesdiferentes (10 mM de tampão de fosfato a pH 6,1, 20 mM de tampãoTris a pH 7,5 e 20 mM de tampão Tris a pH 8.5) contendoconcentrações de cloreto de sódio finais de 0, 50, 150, 300 e 450 mM.

As amostras foram analisadas imediatamente (T0), armazenadasde um dia para o outro, a 4 °C antes da análise (T0 O/N) ouarmazenadas a 25 °C durante 24 horas antes da análise (T24h25 °C).

Foi realizada DLS utilizando um Malvern Zetasizer Nano ZS daMalvern Instruments (RU). 0 instrumento foi operado utilizando umcomprimento de onda de laser de 633 nm e energia de 4 mW. Foidetetada luz dispersa a 173° a uma temperatura de 22 °C. 0diâmetro Z-médio (Zav) e índice de polidispersidade (pi) sãocalculados pelo software do instrumento.

Foi realizada neflometria utilizando um Nepheloskan® Ascent,disponível de Thermo Fischer Scientific. A análise foi realizadaem microplacas Costar® transparentes UV, disponíveis de CorningInc (EUA). A antigenicidade foi quantificada por um ELISA em sanduíche,no qual o antigénio é capturado por anticorpo policlonal decoelho específico para M72 e subsequentemente revelado por umanticorpo monoclonal de murganho específico para M72(Mtb39) .Todos os valores medidos são apresentados relativamente àantigenicidade esperada com base na proteína agregada purificadautilizada para preparar as formulações testadas.

Resultados

As verificações desta experiência são apresentadas nasFiguras 5 a 7.

Os resultados demonstram pela primeira vez que a estabilidade de soluções contendo um antigénio relacionado comRvll96, especificamente M72, é sensível ao pH e à concentraçãode cloreto de sódio. 0 impacto do cloreto de sódio no tamanho doantigénio e antigenicidade é tanto mais notável quanto o pH émais baixo. 0 tamanho do antigénio e antigenicidade não são estáveis apH 6,1, mesmo na ausência de cloreto de sódio. A adição de 50 mMde cloreto de sódio a pH 6,1 conduziu a um aumento no tamanho de35 nm (0 mM de cloreto de sódio no TO) até 58 nm (TO) ou 79 nmapós 24 horas a 25 °C. O tamanho do antigénio e antigenicidade são relativamenteestáveis ao longo de 24 horas, a 25 °C, a pH 7,5 ou 8,5, emparticular na ausência de cloreto de sódio ou a uma concentraçãode cloreto de sódio de 50 mM. Contudo, aumentar a concentraçãode cloreto de sódio para 150 mM ou mais resulta num aumentoclaro no tamanho do antigénio e redução na antigenicidade.

Consequentemente, os benefícios da presente invençãoestendem-se às sequências contendo antigénios relacionados comRvll96 e não apenas à própria sequencia do antigénio Rvll96.

Exemplo 11: Prevenção da "precipitação por sais" emcomposições compreendendo M72, imunostimulantes e utilizandosorbitol como um agente de tonicidade

De modo a comparar a estabilidade de composiçõesimunogénicas contendo 150 mM de NaCl com composições utilizandosorbitol como um agente de tonicidade, várias amostras forammonitorizadas utilizando SEC-HPLC e ELISA. Método

Foram preparados três diferentes bolos de liofilização, detal modo que quando combinados com as formulações de adjuvantesapropriadas dos Exemplos 5 e 7 o pH desejado seria obtido: (a) M72 com dois resíduos de His N-terminais - pH alvo 8,5em vacina reconstituída

Foi adicionada solução de sacarose a 15,75% (p/v) (preparadaem água para injeção) a água para injeção para atingir umaconcentração de sacarose de 6,3%. Foi depois adicionada soluçãode Tween80 a 3% (p/v) (preparada em água para injeção) paraatingir uma concentração de 0,025%. Foi depois adicionado tampãoTris-HCl 1 M, pH 8,8 para atingir uma concentração de tampãoTris de 50 mM. A mistura foi agitada magneticamente durante5 minutos, à temperatura ambiente. Foi depois adicionadoantigénio agregado purificado (M72 com dois resíduos de HisN-terminais, SEQ ID N2: 7, como preparado no Exemplo 9) paraatingir uma concentração de proteína de 25 ug/mL. A mistura foiagitada magneticamente durante 10 minutos, à temperaturaambiente. O pH foi verificado e verificou-se ser 8,8.

Foram cheios 0,5 mL da mistura obtida em frasquinhos devidro de 3 mL, depois, liofilizados. (b) M72 com dois resíduos de His N-terminais - pH alvo 8,0em vacina reconstituída

Foi adicionada solução de sacarose a 15,75% (p/v) (preparadaem água para injeção) a água para injeção para atingir umaconcentração de sacarose de 6,3%. Foi depois adicionada soluçãode Tween80 a 3% (p/v) (preparada em água para injeção) para atingir uma concentração de 0,025%. Foi depois adicionado tampãoTris-HCl 1 M, pH 8,8 para atingir uma concentração de tampãoTris de 50 mM. A mistura foi agitada magneticamente durante5 minutos, à temperatura ambiente. Foi depois adicionadoantigénio agregado purificado (M72 com dois resíduos deHis N-terminais, SEQ ID N2: 7, como preparado no Exemplo 9) paraatingir uma concentração de proteína de 25 ug/mL. A mistura foiagitada magneticamente durante 10 minutos, à temperaturaambiente. O pH foi verificado e verificou-se ser 8,8.

Foram cheios 0,5 mL da mistura obtida em frasquinhos devidro de 3 mL, depois, liofilizados. (c) M72 com dois resíduos de His N-terminais - pH alvo 7,5em vacina reconstituída

Foi adicionada solução de sacarose a 15,75% (p/v) (preparadaem água para injeção) a água para injeção para atingir umaconcentração de sacarose de 6,3%. Foi depois adicionada soluçãode Tween80 a 3% (p/v) (preparada em água para injeção) para atingir uma concentração de 0,025%. Foi depois adicionado tampãoTris-HCl 1 M, pH 8,8 para atingir uma concentração de tampãoTris de 50 mM. A mistura foi agitada magneticamente durante 5minutos, à temperatura ambiente. Foi depois adicionado antigénio agregado purificado (M72 com dois resíduos de His N-terminais,SEQ ID N2: 7, como preparado no Exemplo 9) para atingir umaconcentração de proteína de 25 ug/mL. A mistura foi agitadamagneticamente durante 10 minutos, à temperatura ambiente. O pHfoi verificado e verificou-se ser 8,8.

Foram cheios 0,5 mL da mistura obtida em frasquinhos devidro de 3 mL, depois, liofilizados.

Os bolos liofilizados descritos acima foram reconstituídoscom 625 uL das soluções de adjuvantes preparadas nos Exemplos 5e 7. Após reconstituição com solução de adjuvante, foram obtidasas seguintes composições imunogénicas:

(i) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA (150 mM de NaCl - 2) pH 8,5 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v40 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS21150 mM de NaCl10 mM de fosfatopH 8,5 (ii) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA (150 mMde NaCl - 2) pH 8,0 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v16 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS21150 mM de NaCl10 mM de fosfatopH 8,0 (iii) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA (150 mMde NaCl - 2) pH 7,5 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v12,5 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS21150 mM de NaCl10 mM de fosfatopH 7,5 (iv) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA(sorbitol - 2) pH 8,5 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v40 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS215 mM de NaClSorbitol a 4,7% p/v10 mM de fosfatopH 8,5 (v) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA(sorbitol - 2) pH 8,0 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v16 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS215 mM de NaClSorbitol a 4,7% p/v10 mM de fosfatopH 8,0

(vi) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA (sorbitol - 2) pH 7,5 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v12,5 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS215 mM de NaClSorbitol a 4,7% p/v10 mM de fosfatopH 7,5

Análise da Amostra

As composições imunogénicas reconstituídas descritas acimaforam caracterizadas após armazenamento a 25 °C ou 30 °C (T0, T6he T24h) . A análise SEC-HPLC foi realizada por injeção num TOSOH TSK-Gel5000Pwxl (ID 7,8 mm x 30 cm) equilibrado em 20 mMde tampão Tris pH 8,5, deteção por UV a 210 nm e caudal0,5 mL/min. A antigenicidade foi quantificada por um ELISA de sanduícheno qual o antigénio é capturado por um anticorpo policlonal decoelho específico para M72 e, subsequentemente, revelado por umanticorpo monoclonal de murganho específico para M72(Mtb39).

Todos os valores medidos foram apresentados relativos àantigenicidade esperada com base na proteína agregada purificadautilizada para preparar as formulações testadas.

Resultados

Os resultados são mostrados nas Figuras 8a-8d e 9.

Os perfis de SEC-HPLC são estáveis após reconstituição emcomposições com baixo teor de sal utilizando sorbitol como umagente de tonicidade a cada pH (i. e., pH 7,5, 8,0 e 8,5). Istopode ser contrastado com os perfis de SEC-HPLC para composiçõesimunogénicas contendo 150 mM de NaCl, as quais mostramalterações claras entre o perfil inicial obtido e aquele após oarmazenamento, a 25 °C ou 30 °C. Esta evolução torna-se maisintensa quando o pH da composição de 150 mM de NaCl é diminuído.

Podem ser retiradas as mesmas conclusões, em termos deantigenicidade, com recuperações permanecendo em grande parteestáveis após reconstituição em composições com baixo teor desal utilizando sorbitol como um agente de tonicidade a cada pH(i. e., pH 7,5, 8,0 e 8,5) até 24 h, a 30 °C.

Exemplo 12: Determinação da condutividade para composiçõesimunogénicas da invenção. A condutividade de uma gama de composições imunogénicas deacordo com a presente invenção foi medida e comparada com acondutividade de soluções de cloreto de sódio de controlo e com uma composição imunogénica contendo uma quantidade convencionalde cloreto de sódio. Método

Foi preparada uma gama de padrões possuindo concentraçõesde cloreto de sódio de 0, 75, 100, 150, 250 e 300 mM a partir deuma solução stock de cloreto de sódio 1500 mM por diluição emágua para injeção.

As composições imunogénicas foram preparadas utilizando M72com dois resíduos de His N-terminais de acordo com osprocedimentos proporcionados no Exemplo 9. Para investigar acontribuição do próprio antigénio e quaisquer materiaisresiduais no agregado purificado, foram também preparados bolosde liofilização de placebo, excluindo o componente antigénico.

Utilizando um Malvern Zetasizer Nano e 1,5 mL de cadaamostra em células capilares dobradas, foi aplicada uma voltagemde 30 a 150 V (determinada automaticamente pelo instrumento) edeterminada a condutividade.

Resultados

Condutividade de soluções padrão de cloreto de sódio

(Continuação)

É proporcionada uma curva padrão, com base nestes dados, naFigura 10.

Condutividade de soluções de teste

(Continuação)

Como se pode obsevar a partir dos dados acima, acondutividade de soluções que utilizam 150 mM de NaCl ésignificativamente maior do que aquela das soluções que fazemutilização mínima de NaCl. O impacto do antigénio e quaisquer componentes no agregadopurificado é mínimo, uma vez que as preparações de placebo têmcondutividade comparável ao seu antigénio relacionado com Rvll96contendo correspondentes.

Exemplo 13: Teste da imunogenicidade de composições imunogénicas da invenção. O objetivo deste Exemplo foi determinar se as alterações naformulação para reduzir a quantidade de sal em composiçõesimunogénicas da invenção, com vista a melhorar a estabilidade daproteína, tiveram impacto ou não na imunogenicidade in vivo. Método

Foram avaliadas quatro composições imunogénicas:

1. M72 com dois resíduos de His N-terminais pH 8,5/ASA (150 mM de NaCl - 2)

2. M72 com dois resíduos de His N-terminais pH 8,5/ASA (sorbitol - 2)

3. M72 com dois resíduos de His N-terminais pH 8/ASA (sorbitol - 2)

4. M72 com dois resíduos de His N-terminais pH 7,5/ASA (sorbitol - 2) A imunogenicidade destas composições contendo antigénio foiavaliada em murganhos C57BL/6. Para cada das quatro composições,30 murganhos C57BL/6 foram injetados 3 vezes intramuscularmente,nos dias 0, 14 e 28 com 1 ug de antigénio em 50 uL de solução de adjuvante (preparada pelo procedimento proporcionado noExemplo 11) . As respostas de células T específicas para M72induzidas (CD4 &amp; CD8) foram medidas 6 dias após a últimaimunização (6dPIII).

Para a determinação de respostas celulares específicas paraM72, foram recolhidos e agrupados linfócitos de sangue periféricode 30 murganhos/grupo (seis conjuntos de cinco murganhos/grupo).Foi realizada uma lise de glóbulos vermelhos antes de plaquearas células in vitro. As células foram novamente estimuladas invitro com um conjunto de péptidos em sobreposição (péptidos 15mero com uma sobreposição de 11 aminoácidos, a 1 ug/mL/péptido)cobrindo a sequência de M72 (sem os resíduos de His N-terminais). As células que permaneceram no meio (nenhumaestimulação peptídica) foram utilizadas para determinar as respostas de fundo. Duas horas após a co-cultura com oagrupamento de péptidos, foi adicionada brefeldina A aos poços(para inibir a excreção de citocina) e as células foramarmazenadas, de um dia para o outro, a 4 °C. As células foram,subsequentemente, coradas para os seguintes marcadores: CD4, CD8, IL-2, IFN-gama e TNF-alfa.

Resultados

Cada ponto de dados nas Figuras 11 e 12 representa aresposta de células T CD4 ou CD8 especifica para M72 subtraídaao fundo, respetivamente, de um agrupamento de linfócitos desangue periférico de cinco murganhos seis dias após a terceiraimunização. A resposta é expressa como a percentagem de célulasT CD4 produzindo IFN-gama e/ou IL-2 e/ou TNF-alfa em resposta àsimulação com o agrupamento de péptido M72. A barra representa amediana das respostas para cada grupo.

Os resultados na Figura 11 e 12 mostram que são induzidasrespostas de células T CD4 e CD8 comparáveis após trêsimunizações com cada das formulações de teste. Consequentemente,pode concluir-se que uma redução na quantidade de sais presentesnas composições imunogénicas da presente invenção não conduz aum comprometimento nas respostas de células T induzidas.

Exemplo 14: Investigação da "precipitação por sais" emcomposições compreendendo M72 com CaCl2 ou MgSQ4 a pH 6,1 e 8,0.

Para investigar o impacto de outros sais na estabilidade deantigénio M72, foram preparadas soluções com uma gama de concentrações de CaCl2 ou MgS04 e a diferentes níveis de pH. Ainspeção visual foi utilizada como uma leitura de estabilidade. Método 0 antigénio agregado purificado (M72 com dois resíduos deHis N-terminais, SEQ ID N2 : 7) foi diluído para uma concentraçãode 100 ug/mL em dois tampões diferentes (10 mM de tampãosuccinato a pH 6,1 e 10 mM de tampão Tris a pH 8,0) contendoquantidades específicas de sais (0 mM; 150 mM ou 300 mM; deNaCl; 40 mM, 80 mM ou 160 mM de CaCl2; 87,5 mM, 175 mM ou 430 mMde MgS04) .

As amostras foram analisadas diretamente após preparação.

Utilizando um medidor de condutividade Mettler Toledo e6 mL de cada amostra num frasquinho de vidro siliconizado, foideterminada a condutividade.

Resultados

(Continuação)

(Continuação)

Os resultados demonstram que soluções contendo um antigéniorelacionado com Rvll96 podem ser sensíveis a sais que não ocloreto de sódio. 0 impacto do CaCl2 ou MgS04 parece ser maispronunciado do que para o cloreto de sódio a concentrações oucondutividade comparáveis.

Exemplo 15: Investigação de "precipitação por sais" emcomposições compreendendo Mtb72f com diferentes concentrações desal a pH 6,1, 7,5 e 8,5. 0 impacto da concentração de cloreto de sódio e pH naestabilidade do antigénio Mtb72f, como avaliado por tamanho, foiinvestigado. Método 0 antigénio agregado purificado (Mtb72f com 6 resíduosde his, SEQ ID N2: 11) foi diluído para uma concentração de100 ug/mL em três tampões diferentes (10 mM de tampão de fosfatoa pH 6,1, 20 mM de tampão Tris a pH 7,5 e 20 mM de tampão Tris apH 8,5) contendo concentrações finais de cloreto de sódio de 0,150 e 450 mM.

As amostras foram armazenadas durante 24 horas, a 4 °C ou25 °C, antes da análise.

Foi realizada nefelometria utilizando um Nepheloskan®Ascent, disponível de Thermo Fischer Scientific. A análise foirealizada em microplacas Costar® transparentes UV disponíveis deCorning Inc (EUA). A DLS foi realizada utilizando um Leitor de Placas Dynaproda Wyatt Instruments. 0 instrumento foi operado utilizando umcomprimento de onda laser de 830 nm e energia de 50 mW. Adispersão da luz foi detetada a 150°, a uma temperatura de 22 °C.O diâmetro hidrodinâmico médio e índice de polidispersidade (pi)são calculados pelo software do instrumento.

Resultados

As verificações desta experiência são apresentadas nasFiguras 13 e 14. A DLS e a nefelometria demonstram uma tendência geral deque a Mtb72f é sensível à concentração de sal e pH, de um modosemelhante à M72, como mostrado em exemplos anteriores.Consequentemente, os benefícios da presente invenção aplicam-sea antigénios relacionados com Rvll96 e não apenas à própriasequência de Rvll96.

No caso de várias amostras de DLS, a instrumentação foiincapaz de determinar um tamanho de partícula específico(mostrado como NV na Figura 14).

Exemplo 16: Prevenção de "precipitação por sais" em composições compreendendo M72, imunostimulantes e utilizandosorbitol como um agente de tonicidade

De modo a comparar a estabilidade de composiçõesimunogénicas contendo 150 mM de NaCl com composições utilizando sorbitol como um agente de tonicidade, as amostras forammonitorizadas utilizando um ELISA alternativo. Método 0 bolo de liofilização foi preparado como descrito noExemplo 11 (especificamente método (a) ) de tal modo que quandocombinado com as formulações de adjuvante apropriadas doExemplo 7, seria obtido um pH de 8,5. 0 bolo de liofilização descrito acima foi reconstituído com625 uL das soluções de adjuvante, preparadas no Exemplo 7. Apósreconstituição com solução de adjuvante, foram obtidas asseguintes composições imunogénicas:

(i) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA (150 mM de NaCl - 2) pH 8,5 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v40 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS21150 mM de NaCl10 mM de fosfatopH 8,5 (ii) M72 com dois resíduos de His N-terminais - ASA(sorbitol - 2) pH 8,5 10 ug de antigénio (20 ug/mL)

Sacarose a 5% p/v40 mM de TrisTween80 a 0,02% p/v500 ug de DOPC125 ug de colesterol25 ug de 3D-MPL25 ug de QS215 mM de NaClSorbitol a 4,7% p/v10 mM de fosfatopH 8,5

As composições imunogénicas reconstituídas descritas acimaforam caracterizadas após armazenamento a 30 °C (T24h) ecomparadas com uma amostra preparada extemporaneamente (T0). A antigenicidade foi quantificada por um ELISA de sanduícheindireto no qual o antigénio é capturado por um anticorpopoliclonal de coelho específico para M72 e, subsequentemente,revelado por um anticorpo monoclonal de rato específico paraM72(Mtb39). Resumidamente, a placa é revestida com anticorpopoliclonal de coelho anti-M72 à diluição de 1/8000 em SoluçãoSalina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, de um dia para ooutro, a 4 °C e, após quatro lavagens, as placas foram bloqueadasdurante 1 h, a 37 °C, com tampão de saturação (PBS, Tween 20 a0,1%, BSA a 1%) . Após o passo de lavagem, o padrão de proteína(agregado purificado de M72: 1950 ug/mL), controlo interno (M72: 1768 yg/mL) e amostras foram carregados em poços da primeiracoluna da placa a uma concentração de, aproximadamente, 0,25 yg/mL e, depois, é realizada uma diluição em série duasvezes no tampão de saturação (PBS, Tween 20 a 0,025%) do poço 1ao 12 e incubados 1 h 30, a 37 °C. Após o passo de lavagem, ocomplexo imune é depois incubado 1 h, a 37 °C, com anticorpomonoclonal de rato anti-M72 a uma diluição de 1/1000 em tampãode saturação (PBS, Tween 20 a 0,025%). Após quatro lavagens, foiadicionado um anticorpo policlonal anti-rato de coelho biotinilado a uma diluição de 1/1000 em tampão de saturação(PBS, Tween 20 a 0,025%) . Após quatro lavagens, o sinal foiamplificado por adição de Estreptavidina-Peroxidase de Rábano-Silvestre diluídos a 1/4000 em tampão de saturação (PBS,Tween 20 a 0,025%) . Após quatro lavagens, o sinal foi reveladopor dicloridrato de orto-fenilenodiamina (OPDA) durante 15 min,à t.a. e a reação é parada por adição de HC1 1 Μ. A coloração éproporcional à quantidade de ligação do anticorpo anti-M72 e émedida a 490 nm e 620 nm. Todos os passos de lavagem foramrealizados utilizando PBS, Tween 20 a 0,025%.

Todos os valores medidos são apresentados relativos àantigenicidade esperada com base na proteína agregada purificadautilizada para preparar as formulações testadas.

Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 15. Os losangosindicam as medições específicas para cada das três amostras deteste, com uma linha indicando o valor médio. A recuperação do antigénio é bastante estável após areconstituição em composições com baixo teor de sal utilizandosorbitol como um agente de tonicidade a pH 8,5 até 24 h, a 30 °C.A recuperação em ASA (sorbitol-2) foi 83,5% após 24 horas(TO 87,1%, significando que 95,9% da antigenicidade relativafoi mantida), enquanto a recuperação em ASA (NaCl-2) foi 54,5%após 24 horas (TO 81,0%, significando que apenas 67,3% daantigenicidade relativa foi mantida após armazenamento).

Em resumo, o Exemplo 8 demonstra, pela primeira vez, oimpacto negativo resultante do pH e concentração de NaCl naestabilidade de composições imunogénicas contendo um antigéniorelacionado com Rvll96. O Exemplo 14 estende este trabalho paramostrar que outros sais também podem ter um impacto negativo naestabilidade de composições imunogénicas contendo um antigéniorelacionado com Rvll96, com os Exemplos 10, 11, 12, 15 e 16demonstrando que o efeito é também aplicável a outras sequências. A reformulação das composições imunogénicas com um agentede tonicidade não iónico aborda os problemas de estabilidade deantigénio. Além disso, os Exemplos 3, 4, 13 e 16 demonstram que aremoção de substancialmente todo o NaCl da formulação imunogénicae a sua substituição com sorbitol como um agente de tonicidadenão tem um impacto negativo na estimulação de respostas decélulas T. A estabilidade de composições imunogénicas é crucial e podeser particularmente desafiante quando em locais isolados, onde arefrigeração pode não estar facilmente acessível. Reduzindo apresença de sais nas composições imunogénicas, a presenterequerente foi capaz de reduzir a extensão das alteraçõesobservadas quando as composições imunogénicas são armazenadas.

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Met Vai Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu lie Asn Ser Ala Arg Met 1 5 10 15

Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu Vai Ala Ala Ala Gin Met Trp 20 25 30

Asp Ser Vai Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gin Ser35 40 45

Vai Vai Trp Gly Leu Thr Vai Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly50 55 60

Leu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Vai Ala Trp Met Ser Vai Thr 65 70 75 80

Ala Gly Gin Ala Glu Leu Thr Ala Ala Gin Val Arg Val Ala Ala Ala 85 90 95

Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala100 105 110

Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly115 120 125

Gin Asn Thr Pro Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met130 135 140

Trp Ala Gin Asp Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala 145 150 155 160

Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr 165 170 175

Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu Gin Ala Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser180 185 190

Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gin Leu Met Asn Asn Val Pro Gin Ala Leu195 200 205

Gin Gin Leu Ala Gin Pro Thr Gin Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu210 215 220

Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val Ser Pro His Arg Ser Pro Ile Ser Asn 225 230 235 240

Met Vai Ser Met Ala Asn Asn His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Val 245 250 255

Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala260 265 270

Ala Ala Ala Gin Ala Val Gin Thr Ala Ala Gin Asn Gly Val Arg Ala275 280 285

Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly290 295 300

Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val 305 310 315 320

Pro Gin Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gin Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg 325 330 335

Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly340 345 350

Gin Met Leu Gly Gly Leu Pro Val Gly Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly355 360 365

Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met370 375 380

Pro His Ser Pro Ala Ala Gly385 390

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Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val lie Ala100 105 110

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Val Ala Ala Ala Gin Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser 165 170 175

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Ala Ala Ser

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Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gin Leu Ser Gin Gly Gly Gin Gly15 10 15

Phe Ala lie Pro lie Gly Gin Ala Met Ala lie Ala Gly Gin lie Arg20 25 30

Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val His lie Gly Pro Thr Ala Phe Leu35 40 45

Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gin Arg50 55 60

Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly lie Ser Thr Gly Asp 65 70 75 80

Val lie Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro lie Asn Ser Ala Thr Ala Met 85 90 95

Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Val lie Ser Val Thr100 . 105 110

Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala115 120 125

Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro130 135 140

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Val Ala Ala Ala Gin Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser 165 170 175

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Trp lie Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Tyr195 200 205

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Val Pro Pro Pro Val lie Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met lie Leu 245 250 255 lie Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gin Asn Thr Pro Ala He Ala Val Asn260 265 270

Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gin Asp Ala Ala Ala Met Phe275 280 285

Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe290 295 300

Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu Gin Ala 305 310 315 320

Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gin Leu Met 325 330 335

Asn Asn Val Pro Gin Ala Leu Gin Gin Leu Ala Gin Pro Thr Gin Gly340 345 350

Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val Ser Pro355 360 365

His Arg Ser Pro lie Ser Asn Met Val Ser Met Ala Asn Asn His Met370 375 380

Ser Met Thr Asn Ser Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser Ser Met 385 390 395 400

Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gin Ala Val Gin Thr Ala 405 410 415

Ala Gin Asn Gly Val Arg Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly420 425 430

Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala435 440 445

Ser Vai Gly Ser Leu Ser Vai Pro Gin Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gin450 455 460

Ala Vai Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser 465 470 475 480

Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gin Met Leu Gly Gly Leu Pro Vai Gly 485 490 495

Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Vai Leu Arg Vai500 505 510

Pro Pro Arg Pro Tyr Vai Met Pro His Ser Pro Ala Ala Gly Asp He515 520 525

Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro Ala Leu530 535 540

Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gin Val Gly Pro Gin Val Val 545 550 555 560

Asn lie Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr 565 570 575

Gly He Val He Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn His Val580 585 590

He Ala Gly Ala Thr Asp He Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser Gly Gin595 600 605

Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gin Asp Val Ala610 615 620

Val Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala He Gly 625 630 635 640

Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Met Gly Asn Ser Gly 645 650 655

Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala Leu660 665 670

Gly Gin Thr Val Gin Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu Thr675 680 685

Leu Asn Gly Leu lie Gin Phe Asp Ala Ala lie Gin Pro Gly Asp Ser690 695 700

Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gin Val Val Gly Met Asn Thr705 710 715 720

Ala Ala Ser

<210> 10<211> 2172<212> ADN <213> Sequência Artificial<220> <223> Sequência de codificação para fusão Mtb72f<400> 10 atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60 atcgggcagg cgatggcgat cgcgggccag atccgatcgg gtggggggtc acccaocgtt 120 catatcgggc ctaccgcctt cctcggcttg ggtgttgtcg acaacaacgg caacggcgca 180 cgagtccaac gcgtggtcgg gagcgctccg gcggcaagtc tcggcatctc caccggcgac 240 gtgatcaccg cggtcgacgg cgctccgatc aactcggcca ccgcgatggc ggacgcgctt 300 aacgggcatc atcccggtga cgtcatctcg gtgacctggc aaaccaagtc gggcggcacg 360 cgtacaggga acgtgacatt ggccgaggga cccccggccg aattcatggt ggatttcggg 420 gcgttaccac cggagatcaa ctccgcgagg atgtacgccg gcccgggttc ggoctcgctg 480gtggccgcgg ctcagatgtg ggacagcgtg gcgagtgacc tgttttcggc cgcgtcggcg 540tttcagtcgg tggtctgggg tctgacggtg gggtcgtgga taggttcgtc ggcgggtctg 600atggtggcgg cggcctcgcc gtatgtggcg tggatgagcg tcaccgcggg gcaggccgag 660ctgaccgccg cccaggtccg ggttgctgcg gcggcctacg agacggcgta tgggctgacg 720gtgcccccgc cggtgatcgc cgagaaccgt gctgaactga tgattctgat agcgaccaac 780ctcttggggc aaaacacccc ggcgatcgcg gtcaacgagg ccgaatacgg cgagatgtgg 840gcccaagacg ccgccgcgat gtttggctac gccgcggcga cggcgacggc gacggcgacg 900ttgctgccgt tcgaggaggc gccggagatg accagcgcgg gtgggctcct cgagcaggcc 960gccgcggtcg aggaggcctc cgacaccgcc gcggcgaacc agttgatgaa caatgtgccc 1020caggcgctgc aacagctggc ccagcccacg cagggcacca cgccttcttc caagctgggt 1080ggcctgtgga agacggtctc gccgcatcgg tcgccgatca gcaacatggt gtcgatggcc 1140aacaaccaca tgtcgatgac caactcgggt gtgtcgatga ccaacacctt gagctcgatg 1200ttgaagggct ttgctccggc ggcggccgcc caggccgtgc aaaccgcggc gcaaaacggg 1260gtccgggcga tgagctcgct gggcagctcg ctgggttctt cgggtctggg cggtggggtg 1320gccgccaact tgggtcgggc ggcctcggtc ggttcgttgt cggtgccgca ggcctgggcc 1380gcggccaacc aggcagtcac cccggcggcg cgggcgctgc cgctgaccag cctgaccagc 1440gccgcggaaa gagggcccgg gcagatgctg ggcgggctgc cggtggggca gatgggcgcc 1500agggccggtg gtgggctcag tggtgtgctg cgtgttccgc cgcgacccta tgtgatgccg 1560cattctccgg cagccggcga tatcgccccg ccggccttgt cgcaggaccg gttcgccgac 1620ttccccgcgc tgcccctcga cccgtccgcg atggtcgccc aagtggggcc acaggtggtc 1680 aacatcaaca ccaaactggg ctacaacaac gccgtgggcg ccgggaccgg catcgtcatc 1740gatcccaacg gtgtcgtgct gaccaacaac cacgtgatcg cgggcgccac cgacatcaat 1800 gcgttcagcg tcggctccgg ccaaacctac ggcgtcgatg tggtcgggta tgaccgcacc 1860caggatgtcg cggtgctgca gctgcgcggt gccggtggcc tgccgtcggc ggcgatcggt 1920ggcggcgtcg cggttggtga gcccgtcgtc gcgatgggca acagcggtgg gcagggcgga 1980acgccccgtg cggtgcctgg cagggtggtc gcgctcggcc aaaccgtgca ggcgtcggat 2040 tcgctgaccg gtgccgaaga gacattgaac gggttgatcc agttcgatgc cgcgatccag 2100cccggtgatt cgggcgggcc cgtcgtcaac ggcctaggac aggtggtcgg tatgaacacg 2160 gccgcgtcct ag 2172

<210> 11<211> 729<212> PRT <213> Sequência Artificial<220> <223> Fusão Mtb72f com 6 resíduos de his adicionais<400> 11

Met His His His His His His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gin Leu15 10 15

Ser Gin Gly Gly Gin Gly Phe Ala lie Pro lie Gly Gin Ala Met Ala20 25 30 lie Ala Gly Gin lie Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val His lie35 40 45

Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn50 55 60

Gly Ala Arg Val Gin Arg Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu 65 70 75 80

Gly lie Ser Thr Gly Asp Val lie Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro lie 85 90 95

Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly100 105 110

Asp Val lie Ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr115 120 125

Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Asp130 135 140

Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu lie Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly 145 150 155 160

Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Gin Met Trp Asp Ser Val 165 170 175

Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gin Ser Val Val Trp180 185 190

Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp lie Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val195 200 205

Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gin210 215 220

Ala Glu Leu Thr Ala Ala Gin Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu 225 230 235 240

Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val lie Ala Glu Asn Arg 245 250 255

Ala Glu Leu Met lie Leu lie Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gin Asn Thr260 265 270

Pro Ala lie Ala Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gin275 280 285

Asp Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr290 295 300

Ala Thr Leu Leu Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly 305 310 315 320

Gly Leu Leu Glu Gin Ala Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala 325 330 335

Ala Ala Asn Gin Leu Met Asn Asn Val Pro Gin Ala Leu Gin Gin Leu340 345 350

Ala Gin Pro Thr Gin Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu355 360 365

Trp Lys Thr Val Ser Pro His Arg Ser Pro lie Ser Asn Met Val Ser370 375 380

Met Ala Asn Asn His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Val Ser Met Thr 385 390 395 400

Asn Thr Leu Ser Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala 405 410 415

Gin Ala Val Gin Thr Ala Ala Gin Asn Gly Val Arg Ala Met Ser Ser420 425 430

Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala435 440 445

Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Gin Ala450 455 460

Trp Ala Ala Ala Asn Gin Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro 465 470 475 480

Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gin Met Leu 485 490 495

Gly Gly Leu Pro Val Gly Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu500 505 510

Ser Gly Val Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met Pro His Ser515 520 525

Pro Ala Ala Gly Asp lie Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp Arg Phe530 535 540

Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gin 545 550 555 560

Val Gly Pro Gin Val Val Asn lie Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn 565 570 575

Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly lie Val lie Asp Pro Asn Gly Val Val580 585 590

Leu Thr Asn Asn His Val lie Ala Gly Ala Thr Asp lie Asn Ala Phe595 600 605

Ser Val Gly Ser Gly Gin Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp610 615 620

Arg Thr Gin Asp Val Ala Val Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu 625 630 635 640

Pro Ser Ala Ala lie Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val 645 650 655

Ala Met Gly Asn Ser Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro660 665 670

Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Gin Thr Val Gin Ala Ser Asp Ser Leu675 680 685

Thr Gly Ala Glu Glu Thr Leu Asn Gly Leu lie Gin Phe Asp Ala Ala690 695 700 lie Gin Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gin705 710 715 720

Val Val Gly Met Asn Thr Ala Ala Ser 725

<210> 12<211> 2190<212> ADN <213> Sequência Artificial<22 0> <223> Sequência de codificação para fusão M72 com 6 resíduos dehis adicionais <4 0 0> 12 atgcatcacc atcaccatca cacggccgcg tccgataact tccagctgtc ccagggtggg 60 cagggattcg ccattccgat cgggcaggcg atggcgatcg cgggccagat ccgatcgggt 120 ggggggtcac ccaccgttca tatcgggcct accgccttcc tcggcttggg tgttgtcgac 180 aacaacggca acggcgcacg agtccaacgc gtggtcggga gcgctccggc ggcaagtctc 240 ggcatctcca ccggcgacgt gatcaccgcg gtcgacggcg ctccgatcaa ctcggccacc 300 gcgatggcgg acgcgcttaa cgggcatcat cccggtgacg tcatctcggt gacctggcaa 360 accaagtcgg gcggcacgcg tacagggaac gtgacattgg ccgagggacc cccggccgaa 420 ttcatggtgg atttcggggc gttaccaccg gagatcaact ccgcgaggat gtacgccggc 480 ccgggttcgg cctcgctggt ggccgcggct cagatgtggg acagcgtggc gagtgacctg 540 ttttcggccg cgtcggcgtt tcagtcggtg gtctggggtc tgacggtggg gtcgtggata 600 ggttcgtcgg cgggtctgat ggtggcggcg gcctcgccgt atgtggcgtg gatgagcgtc 660 accgcggggc aggccgagct gaccgccgcc caggtccggg ttgctgcggc ggcctacgag 720 acggcgtatg ggctgacggt gcccccgccg gtgatcgccg agaaccgtgc tgaactgatg 780attctgatag cgaccaacct cttggggcaa aacaccccgg cgatcgcggt caacgaggcc 840gaatacggcg agatgtgggc ccaagacgcc gccgcgatgt ttggctacgc cgcggcgacg 900gcgacggcga cggcgacgtt gctgccgttc gaggaggcgc cggagatgac cagcgcgggt 960gggctcctcg agcaggccgc cgcggtcgag gaggcctccg acaccgccgc ggcgaaccag 1020ttgatgaaca atgtgcccca ggcgctgcaa cagctggccc agcccacgca gggcaccacg 1080ccttcttcca agctgggtgg cctgtggaag acggtctcgc cgcatcggtc gccgatcagc 1140aacatggtgt cgatggccaa caaccacatg tcgatgacca actcgggtgt gtcgatgacc 1200aacaccttga gctcgatgtt gaagggcttt gctccggcgg cggccgccca ggccgtgcaa 1260accgcggcgc aaaacggggt ccgggcgatg agctcgctgg gcagctcgct gggttcttcg 1320ggtctgggcg gtggggtggc cgccaacttg ggtcgggcgg cctcggtcgg ttcgttgtcg 1380gtgccgcagg cctgggccgc ggccaaccag gcagtcaccc cggcggcgcg ggcgctgccg 1440ctgaccagcc tgaccagcgc cgcggaaaga gggcccgggc agatgctggg cgggctgccg 1500gtggggcaga tgggcgccag ggccggtggt gggctcagtg gtgtgctgcg tgttccgccg 1560cgaccetatg tgatgccgca ttctccggca gccggcgata tcgccccgec ggcettgtcg 1620caggaccggt tcgccgactt ccccgcgctg cccctcgacc cgtccgcgat ggtcgcccaa 1680gtggggccac aggtggtcaa catcaacacc aaactgggct acaacaacgc cgtgggcgcc 1740gggaccggca tcgtcatcga tcccaacggt gtcgtgctga ccaacaacca cgtgatcgcg 1800ggcgccaccg acatcaatgc gttcagcgtc ggctccggcc aaacctacgg cgtcgatgtg 1860gtcgggtatg accgcaccca ggatgtcgcg gtgctgcagc tgcgcggtgc cggtggcctg 1920ccgtcggcgg cgatcggtgg cggcgtcgcg gttggtgagc ccgtcgtcgc gatgggcaac 1980agcggtgggc agggcggaac gccccgtgcg gtgcctggca gggtggtcgc gctcggccaa 2040accgtgcagg cgtcggattc gctgaccgçrt gccgaagaga cattgaacgg gttgatccag 2100ttcgatgccg cgatccagcc cggtgattcg ggcgggcccg tcgtcaacgg cctaggacag 2160gtggtcggta tgaacacggc cgcgtcctag 2190

<210 > 13<211> 20<212> ADN <213> Sequência Artificial<22 0> <223> Cpg Oligo 1 - CpG 1826<4 0 0> 13 tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 14<211> 18<212> ADN <213> Sequência Artificial<22 0> <223> CpG Oligo 2 - CpG 1758<400> 14 tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 15<211> 30<212> ADN <213> Sequência Artificial<22 0> <223> CpG Oligo 3<400> 15 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30

<210 > 16<211> 24<212> ADN <213> Sequência Artificial<22 0> <223> CpG Oligo 4 - CpG 2006<4 0 0> 16 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 17<211> 20<212> ADN <213> Sequência Artificial<220> <223> CpG Oligo 5 - CpG 1686<400> 17 tccatgacgt tcctgatgct 20

Lisboa, 2 de junho de 2016

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição imunogénica compreendendo um antigéniorelacionado com Rvll96, em que o antigénio relacionado comRvll96 compreende (a) uma sequência possuindo, pelo menos,90% de identidade com a SEQ ID N2: 1 ou (b) um fragmento daSEQ ID N2 : 1, o qual possui, pelo menos, 350 aminoácidos decomprimento e em que a condutividade da composição é 5 mS/cmou inferior e em que o pH da referida composição está nagama de 7,0 a 9,0.
2. 2. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que a condutividade da composição é 4 mS/cm ou inferior.
3. 3. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 2, emque a condutividade da composição é 3 mS/cm ou inferior.
4. 4. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de sais na referida composição é 40 mM ou inferior.
5. 5. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração de cloreto de sódio na referidacomposição é 40 mM ou inferior.
6. 6. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, compreendendo ainda um agente detonicidade não iónico, o qual é um poliol.
7. 7. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 6, em que o poliol é sorbitol e em que a concentração de sorbitolé entre cerca de 4 e cerca de 6% (p/v).
8. 8. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a concentração de sacarose éentre cerca de 4 e cerca de 6% (p/v).
9. 9. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo ainda um ou mais imunostimulantes.
10. 10. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 9, em que a composição imunogénica compreende QS21.
11. 11. Composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 9 ou 10, em que a composição imunogénica compreende monofosforil lipido A 3-de-O-acilado.
12. 12. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a osmolalidade é 250 a 750 mOsm/kg.
13. 13. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a composição é proporcionadacomo uma dose unitária de entre 50 uL e 1 mL.
14. 14. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 13, em que a dose unitária contém 1 a 100 ug de proteínarelacionada a Rvll96.
15. 15. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 13 ou14, em que a dose unitária é uma dose humana e contém entre1 e 100 ug de 3D-MPL.
16. 16. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que a dose unitária é uma dosehumana e contém entre 1 e 100 ug de QS21.
17. 17. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o pH da referida composição está na gama de 7,25 a 8,75.
18. 18. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o pH da referida composição está na gama de 7,5 a 8,5.
19. 19. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o antigénio relacionado com Rvll96 compreende uma sequência possuindo, pelo menos, 90%de identidade com a SEQ ID Ns: 1.
20. 20. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 19, emque o antigénio relacionado com Rvll96 compreende asequência de aminoácidos da SEQ ID Ns: 1.
21. 21. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o antigénio relacionado com Rvll96 compreende um fragmento da SEQ ID N2: 1, o qual possui, pelo menos, 350 aminoácidos de comprimento.
22. 22. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que o antigénio relacionado comRvll96 contém menos do que 1000 resíduos de aminoácidos.
23. 23. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, para utilização em medicina.
24. 24. Composição imunogénica para utilização de acordo areivindicação 23, para administração a um humano.